Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Литвинова, Наталия Алексеевна

• Литвинова, Наталия Алексеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Литвинова, Наталия Алексеевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

*N

"Т

1.1. Система посттрансляционной модификации SUMO

1.1.1. Метаболический путь системы SUMO. Белок-модификатор SUMO и его изоформы

1.1.2. SUMO-специфические протеиназы (SENP)

1.1.3. Биологические функции системы SUMO

1.1.4. Участие системы SUMO в регуляции транскрипции

1.1.5. Действие системы SUMO в обеспечении стабильности генома

1.1.6. Белки, взаимодействующие с SUMO нековалентным образом

1.1.7. Регулирование SUMO модификации

1.2. SUMO-протеиназы

1.2.1. Семейство SUMO-протеиназ

1.2.2. Структура SUMO-протеиназ

1.2.3. Субстратная специфичность SUMO-протеиназ

1.2.4. Регуляция SUMO протеиназ

1.3. Клеточная роль SUMO-протеиназ

1.4. Использование SUMO-протеиназы в биотехнологии

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.1. Используемые штаммы

2.1.2. Реактивы, растворы

2.1.3. Создание штаммов-продуцентов

2.1.4. Создание системы клеточных банков

2.1.5. Культивирование штаммов-продуцентов

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Создание штаммов-продуцентов БЦМО-протеиназ

2.2.2. Создание системы клеточных банков промышленного штамма — продуцента, и их характеризация

2.2.3. Разработка схемы промышленного культивирования штамма -продуцента ЦЬР - протеиназы

2.2.4. Разработка схемы выделения и очистки фермента

2.2.5. Исследование стабильности фермента ULP - протеиназы при хранении

2.2.6. Технологическая схема производства фермента «Дрожжевая ULP1-

протеиназа»

2.2.7. Спецификация критериев качества на продукт «Дрожжевая ИЬР1 — протеиназа»

2.2.8. Экономическая эффективность процесса производства фермента ЦЬР1-протеиназа

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка промышленной технологии производства рекомбинантного препарата ULP - протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В современном мире развитие биотехнологии и научные открытия в области энзимологии сделали ферментные препараты одними из самых активных участников многих технологий. Использование ферментов позволяет значительно ускорять технологические процессы, увеличивать выход готовой продукции, повышать ее качество, экономить ценное сырье. Высокоэффективной технологией является получение ферментных препаратов с использованием рекомбинантных ДНК в бактериях E.coli, В. Siibtilis, и дрожжах S.cerevisiae ввиду их низкой стоимости и безопасности [1,2].

Принципиально новым подходом к получению иммунобиологических препаратов с улучшенными характеристиками является внедрение методов гидролитического расщепления гибридных белков при производстве терапевтических лекарственных средств [3].

Ферменты семейства ULP - протеиназ являются необходимым элементом в универсальной технологии получения различных рекомбинантных гибридных белков с тэгом SUMO [4], так как обладают способностью расщеплять различные гибридные белки с высокой точностью и эффективностью [5].

Одним из вариантов применения ULP — протеиназ - является технология производства безметионинового интерферона из гибридного белка -предшественника рекомбинантного SUMO IFN. На международном рынке в настоящее время существует несколько фирм-производителей, выпускающих фермент ULP - протеиназу. Однако, продукт, выпускаемый каждой компанией, имеет свои отличительные особенности. Для процесса производства безметионинового интерферона необходима ULP протеиназа, обладающая специфической активностью для конкретного белка - SUMO IFN. Специфическая активность коммерческих протеиназ в отношении данного белка SUMO IFN может сильно отличаться от данных, заявленных в спецификации. Поэтому использование коммерческой протеиназы не гарантирует расщепление SUMO IFN

и получение белка безметионинового интерферона и создает необходимость разработки и получения собственного фермента.

В России в данный момент практически отсутствуют компании, которые занимаются производством субстанций ферментных препаратов, отвечающих всем требованиям качества, обладающих необходимыми характеристиками, высокой специфичностью и активностью в отношении заданных белков, поэтому разработка высокоэффективной технологии получения таких препаратов является актуальной задачей

Цель и задачи исследований. Целью данного исследования являлась разработка промышленной технологии получения фермента ULP — протеиназы для протеолитического процессинга гибридных белков при биотехнологическом производстве лекарственных средств.

Для выполнения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать штаммы - продуценты ферментов семейства ULP - протеиназ.

2. Оценить специфичность действия полученных ферментов на целевой белок SUMO - интерферон и отобрать наиболее эффективный продуцент.

3. Подобрать условия культивирования штамма - продуцента и очистки фермента.

4. Разработать технологическую схему и стандартизировать процесс получения ULP - протеиназы.

5. Разработать технические условия на продукт и обосновать его применение при промышленном производстве безметионинового интерферона.

Научная новизна. Впервые были сконструированы штаммы - продуценты ULP - и SENP - протеиназ на основе штамма - реципиента BL21 (DE3), был разработан метод и определена специфическая активность очищенных ферментов ULP - и SENP - протеиназ в отношении гибридного белка — предшественника SUMO интерферона. Разработана технология промышленного культивирования штаммов - продуцентов протеиназ, экспрессирующих фермент внутриклеточно в растворимом виде. Изучено влияние схемы дезинтеграции клеток на выход целевого фермента. Разработана технология хроматографической очистки

фермента, обеспечивающая чистоту конечного продукта 96-98%, подобран компонентный состав, обеспечивающий стабильность фермента в течение 2,5 лет.

Практическая значимость. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, позволяют выбрать и охарактеризовать фермент SUMO - протеиназу, обладающую необходимой активностью и специфичностью в отношении целевого гибридного белка. Фермент ULP - протеиназа используется для получения субстанции безметионинового интерферона альфа-2-b на производственной площадке ООО «Фармапарк». Разработан нормативный документ - ТУ на производство фермента ULP1 — протеиназа, продукт внесен в производственный регламент процесса получения субстанции безметионинового интерферона на площадке ООО «Фармапарк».

Личный вклад соискателя. Штаммы - продуценты ULP2, SENP1, SENP7 были созданы автором совместно с к.б.н. Шукуровым P.P. Штамм - продуцент ULP1 протеиназы был предоставлен лабораторией экспрессии генов эукариотических систем ФГУП «ГосНИИгенетика» под руководством к.б.н. Д.Г. Козлова, за что им выражается глубокая благодарность. Автором проведена оценка характеристик штаммов-продуцентов и выбор лучшего штамма для дальнейших исследований, создан мастер - банк и рабочий банк штаммов -продуцентов и проведена его характеризация, проведена разработка способа промышленного культивирования, подбор условий, оптимизация и валидация процессов. Исследование и подбор условий проведения хроматографической очистки фермента проведены автором совместно с C.B. Селищевым. Автором была оценена стабильность и активность фермента во времени.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма: от науки к промышленности» (Черногория, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2013).

Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 3 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на _ страницах,

включает 52 рисунка, 23 таблицы и 4 листа приложений. Список литературы содержит 173 источника, в том числе 158 иностранных авторов. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, описания практического использования результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка литературы и приложений.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Протеиназы семейства ULP, экспрессируемые созданными штаммами, проявляют специфическую активность в отношении гибридного белка -предшественника SUMO IFN, процессируя его С-концевую последовательность по пептидной связи между сайтами Gly-Gly и Lys .

2. Промышленная технология получения ULP - протеиназы, включающая культивирование штамма - продуцента в ферментере в объеме 15 л среды, очистку с использованием аффинного сорбента обеспечивает выпуск кондиционного продукта с производительностью не менее 180 мг белка с одного производственного цикла в течение 6 суток.

3. Использование ULP - протеиназы обеспечивает протеолитический процессинг гибридного белка в соотношении фермент: субстрат 1:3500 в технологии производства безметионинового интерферона.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Система посттрансляционной модификации SUMO

Во многих случаях после окончания процесса трансляции клеточные белки подвергаются посттрансляционной модификации, которая обеспечивает клетке дополнительный контроль над активностью белка, его локализацией и стабильностью.

Наиболее известными среди посттрансляционных белков-модификаторов являются убиквитин и ряд убиквитин-подобных белков. Убиквитин и убиквитин-подобные белки обладают общей пространственной структурой, известной как (3-grasp (убиквитин-подобная), и консервативной ферментативной стратегией активации и связывания с субстратом [6]. Одним из убиквитин-подобных белков является белок SUMO (Small Ubiquitin-Related Modifier - небольшой убиквитин-подобный модификатор), который связывается с множеством белков у всех видов живых существ, в том числе у Saccharomyces cerevisiae [7-10], Arabidopsis thaliana [11,12] и humans [13,14].

Соответственно, белок SUMO и его взаимодействие с другими белками влияют на многочисленные клеточные процессы.

В настоящее время посттрансляционная модификация внутриклеточных белков, связанная с их взаимодействием с SUMO, считается важнейшим регуляторным механизмом, который обеспечивает обратимое управление активностью, стабильностью и локализацией белков в клетке. Ферменты, которые были выделены и изучены в ходе многочисленных исследований, осуществляют процессинг, конъюгацию и деконъюгацию белка SUMO с высокой селективностью.

Модификация белком SUMO обычно изменяет свойства модифицированного целевого белка, воздействуя — либо положительно, либо отрицательно — на его взаимодействия с другими клеточными факторами. Как следствие, система SUMO способствует регуляции многочисленных биологических путей, начиная от

цитоплазматического транспорта до репрессии транскрипционной активности и поддержания стабильности генома, путем ее влияния на рекомбинацию и репарацию ДНК.

Как уже было указано выше, SUMO принадлежит к семейству структурно родственных белков, из которых наиболее видным членом является убиквитин [15,16]. Эти белки работают по одному общему принципу, который предполагает их ковалентное присоединение к субстрату.

Для присоединения модификатора к субстрату используется определенный ферментативный механизм, который осуществляет конъюгацию консервативного карбокси (С)-концевого диглицинового остатка SUMO и аминогруппы субстрата, как правило, представляющей собой внутренний остаток лизина.

Таким образом, убиквитин-подобные белки изменяют свойства или реакционную способность модифицированного субстрата и вызывают ряд ответных реакций; часто узнавание модификатора SUMO происходит при помощи специфических областей взаимодействия эффекторного белка.

Реакция конъюгация требует затрат энергии и является легко обратимой; комплекс специализированных ферментов обеспечивает избирательность и динамическое регулирование прямой и обратной реакции. Таким образом, модификация членами убиквитиного семейства может сравниваться с любым другим видом посттрансляционной модификации белка, такой как фосфорилирование или ацетилирование.

Функциональные последствия модификации являются многообразными и комплексными [17-20], и, несмотря на то, что связывание белка-модификатора SUMO с белком-субстратом может иметь различные физиологические последствия, основной молекулярной функцией белка SUMO является управление взаимодействием между модифицированными белками и другими клеточными протеинами.

1.1.1. Метаболический путь системы SUMO. Белок-модификатор

SUMO и его изоформы

Белок SUMO был идентифицирован в ряде исследовательских работ в различных организмах и условиях и потому получил много альтернативных названий, таких как сентрин, Ubll, Piel, Gmpl и Smt3 [21].

Подобно убиквитину, белок SUMO продуцируется в форме незрелого белка-предшественника с расширением на С-конце, который должен быть процессирован для высвобождения зрелого С-концевого диглицинового мотива необходимого для конъюгации с целевым белком-субстратом.

Несмотря на общее структурное сходство SUMO и убиквитина, аминокислотная последовательность и поверхностные свойства SUMO сильно отличаются от убиквитина. Белок SUMO несет неструктурированное расширение на амино (Ы)-конце, что не характерно для других убиквитин-подобных модификаторов.

Кроме того, у высших эукариот имеются несколько паралогов SUMO, последовательности которые существенно отличаются (Рисунок 1).

suvo-1 шв,.,

suvo-2 мо,., ,екжт*..

S'JVM MSE.., .ЕКРШК... .TKN.DHIHLmGQDGSWQFKimT^LBKUlKAVCSR^LSKRQrRFaFDC^PIhlTDTPAQLmD^

SUV0-4 Ен»БКРТББУК«.,«TEmOíflíHLmGQIX'SWQFKIKRQTPLSmimCBPRGLSVKQrBFRFG^QPISGTDKPAQLEireOE^

Рисунок 1. Сравнение последовательностей паралогов SUMO дрожжей и

млекопитающих

Консенсус последовательности на N-конце Smt3, SUMO-2 и SUMO-3, подвергаемые модификации SUMO, участвующие в формировании цепочки поли-SUMO, и пролин-90, который предотвращает обработку в SUMO-4, выделены жирным шрифтом. Расщепляемые С-концевые расширения Smt3 и SUMO-1, -2 и -3 указаны курсивом.

В то время как дрожжевые клетки экспрессируют только одну форму SUMO, кодируемую геном SMT3 (suppressor of the mitotic fidelity gene 3), клетки млекопитающих кодируют четыре изоформы - SUMO-1, -2, -3, -4 (см. Таблица 1).

Таблица 1. Компоненты системы SUMO у млекопитающих и дрожжей

Компонент системы SUMO Видовая принадлежность организма

Млекопитающие S. cerevisiae S. рот be

1 2 3 4

Белок-модификатор SUMO-1 SUMO-2 SUMO-3 SUMO-4a Smt3 Pmt3

Активирующий фермент (El) Sael (Aosl)/Sae2 (Uba2) Aosl/Uba2 Rad31/Fub2

Конъюгирующий фермент (Е2) Ubc9 Ubc9 Hus5

Лигаза (ЕЗ)—SP-RING PIAS1 PIAS3 PI ASxa □ (ARIP3) PIASxPD(Mizl) PIASy Mms21 (Nse2) Sizl (Ulll) Siz2 (Nfil) Mms21 Zip3 Plil Nse2

Лигаза (ЕЗ) -прочие RanBP2 (Nup358) Pc2b HDAC4b RSUMEC

Протеиназа (SENP) SENP1 (SuPr-2) SENP2 (AXAM2, SMT3IP2) SENP3 (SSP3, SMT3IP1) SENP 5 SENP6 (SUSP1, SSP1) SENP7 DESI1 DESI2 USPL1 Ulpl (Nibl) Ulp2 (Smt4) Ulpl Ulp2

Альтернативные названия отдельных ферментов приведены в скобках, а. Эта изоформа SUMO, скорее всего, не конъюгирует in vivo.

b. Эти факторы действуют в качестве субстрат-селективных усилителей реакции сумоилирования и их классификация как классических ЕЗ ферментов все еще является предметом дискуссий.

c. Этот фактор выступает в качестве общего усилителя SUMO-конъюгации и стимулирует модификацию модельных субстратов in vitro, но его субстрат-специфическая активность ЕЗ еще должна быть подтверждена.

Уникальный остаток пролина в положении 90 предотвращает процессинг SUMO-4, что делает маловероятным способность этого белка конъюгировать in vivo [22]. Его биологическое значение по-прежнему является предметом дискуссий, но, скорее всего, SUMO-4 может выполнять специализированные функции с помощью нековалентных взаимодействий с белками.

Аминокислотные последовательности SUMO-2 и -3 почти идентичны, но они существенно отличаются от SUMO-1, с которым имеют только 50% идентичности. Функциональные различия между SUMO-1 и SUMO-2 или -3 обусловлены их внутриклеточной локализацией, изменением уровня экспрессии и модели конъюгации в ответ на клеточный стресс, а также различиями в их взаимодействии с эффекторными белками и специфическими SUMO-протеиназами [23,24].

В дальнейшем, термин SUMO будет служить в качестве общего термина применимо ко всем изоформам млекопитающих, а также дрожжевых белков; тип изоформы будет указываться только там, где это необходимо.

Подобно убиквитину, SUMO, как правило, присоединяется к лизину, образуя, таким образом, амид (изопептидную) связь с субстратом. SUMO может быть конъюгировать с одним аминокислотным остатком лизина (моно-сумоилирование), с несколькими остатками лизина одного белка (мульти-сумоилирование) или с SUMO, который уже конъюгирован с белком, образуя SUMO цепь (поли-сумоилирование). Подобно убиквитину, SUMO может образовывать полимерные цепи in vitro и in vivo [25]. У млекопитающих, это в первую очередь относится к SUMO-2 и -3, которые, как и дрожжевой белок Smt3, несут мотивы, способные конъюгировать с SUMO на N-концевых областях (см. ниже).

Несмотря на то, что цепи поли-SUMO выявлены у дрожжей и млекопитающих [26-29], их биологическая функция остается неясной. В дрожжах, они могут вносить вклад в структурную целостность комплекса во время мейоза [30].

По аналогии с убиквитиновой системой, присоединение белка-модификатора SUMO к целевому белку проводится каскадом ферментов, осуществляющих энергозависимую активацию, транспорт и субстрат-селективную конъюгацию белка-модификатора (Рисунок 2).

Рисунок 2. Процессинг, конъюгация и деконъюгация белка-мюдификатора SUMO. SUMO изображен символически в виде серого леденца. Высоко-энергетическая тиоэфирная связь между С-концом зрелого SUMO и ферментами El (Aosl/Uba2) или Е2 (Ubc9) представлена волнистой

линией (~).

Процесс присоединения SUMO к белкам требует затраты АТФ и, как правило, включает три фермента: гетеродимерный SUMO-активирующий фермент (Е1), который активирует карбокси (С)-концевую карбоксильную группу SUMO и далее образует тиоэфирные связи с С-концом SUMO; SUMO

конъюгирующий фермент (Е2), а также один из нескольких SUMO-лигаз (ЕЗ) [31] (Рисунок 2).

В противоположность этому, деконъюгация SUMO достигается за один шаг, который не требует затрат энергии. Тем не менее, разнообразие SUMO-специфических протеиназ сопоставимо с разнообразием лигаз, что предполагает аналогичные уровни сложности в регулировании процессов SUMO конъюгации и деконъюгации.

1.1.2. SUMO-специфическис протеиназы (SENP)

Расщепление С-конца белка-модификатора SUMO служит двум разным целям (Рисунок 3): с одной стороны, прекурсоры SUMO необходимо преобразовать в зрелые SUMO путем удаления С-концевого расширения, что, очевидно, требует расщепления линейной пептидной связи и также называется С-концевой гидролазной активностью.

С другой стороны, удаление SUMO из белков-мишеней или обработка цепей поли-SUMO, т.е. осуществление реакции деконъюгации требует расщепления изопептидной связи или изопептидазной активности.

На рисунке За показаны карбоксильные (С)-концы Smt3 S.cerevisiae и четыре изоформы SUMO млекопитающих с диглицинновым мотивом, выделены зеленым цветом. Сайт расщепления прекурсора SUMO для образования зрелой формы SUMO обозначен стрелкой.

Химическая структура С-концевого хвоста SUMO-2 показана более подробно; сайт расщепления выделен оранжевым цветом, место расщепления пептидной связи также указанно стрелкой.

На рисунке ЗЬ показана химическая структура связи между терминальным глицином SUMO и лизином субстрата; сайт расщепления протеиназы SUMO выделен оранжевым цветом, расщепляемая изопептидная связь указана стрелкой.

а

Smt3 . . . REQIGGATY SUMOl...QEQTGGHSTV SUM02. . - QGQTGGVY SUM03...QQQTGGVPESSLAGHSF

Cleavage lite

b

SUMO

^NH Gty

:ptide

О N О

H II H II

-■yS-YV^

; о •

Target protein

¡

Рисунок 3. Активность SUMO-протеиназы по отношению к прекурсорам SUMO (а) и модифицированным SUMO белкам-мишеням(Ь).

У людей существует шесть так называемых "sentrin-специфических протеиназ" (SENPs): SENP1-3 и SENP5-7 [23,32]. Белки обладают различной специализацией по видам активности не только в отношении созревания SUMO или деконъюгации, но и в отношении различных изоформ SUMO (см. ниже). Их внутриклеточная локализация указывает на наличие непересекающихся функций, а последствия удаления или молчания отдельных протеиназ SENP дают основания предполагать, что их вклад для динамического регулирования процесса модификации SUMO может быть, по крайней мере, так же важен, как и вклад SUMO-лигаз ЕЗ.

В S.cerevisiae существуют две SUMO-протеиназы SENP - Ulpl и Ulp2 (также называемая Smt4) которые различны по своей локализации и функциям [33,34]. Ulpl отвечает за расщепление предшественника SUMO и локализуется в ядерных порах. Клетки S.cerevisiae, несущие делецию ulpl, нежизнеспособны и не выживают даже при сопутствующей экспрессии зрелой формы SMT3. Это указывает на то, что отсутствие процессинга предшественников SUMO не является основной причиной нежизнеспособного фенотипа. SUMO-протеиназа Ulp2 локализуется в ядре.

Таким образом, две изопептидазы Ulpl и Ulp2 существуют для взаимодействия с различными субстратами и не могут скомпенсировать отсутствие друг друга. Ниже будет более подробно рассмотрена структура, функции и регулирование протеиназ-SUMO.

1.1.3. Биологические функции системы SUMO

Система модификации белков SUMO играет важную роль в большинстве живых организмов.

Делеционные мутанты по белку-модификатору SUMO или по активирующему ферменту El или конъюгирующему ферменту Е2 нежизнеспособны у почкующихся дрожжей и показывают тяжелые дефекты роста у дрожжей, размножающихся делением. Удаление конъюгирующего фермента Ubc9 у мышей приводит к летальному исходу на ранней стадии эмбрионального развития.

Тем не менее, до сих пор неясно, осуществляет ли белок SUMO некую единую основную функцию. Также нет и единого механизма, который мог бы объяснить все эффекты, оказываемые SUMO на целевые белки. Как и другие посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, SUMO система участвует в регуляции из множества различных биологических путей [35-41].

Несмотря на разнообразие функций системы SUMO, в настоящее время уже начинают формироваться несколько общих принципов механизма действия. Очевидно, что SUMO наиболее часто действует путем модуляции взаимодействия его целевых белков-мишеней с другими клеточными факторами. Во многих случаях SUMO обеспечивает дополнительный сайт связывания для другого белка, тем самым вызывая ряд нижеследующих эффектов или ориентирует субстрат в определенном месте в клетке. Кроме того, SUMO может предотвратить белок-белковые взаимодействия, блокируя взаимодействие сайтов связывания. Модификация целевого белка частицей SUMO вследствие внутримолекулярного взаимодействия этого целевого белка с фрагментами SUMO индуцирует его

конформационные изменения. Как следствие, SUMO модификации могут влиять на внутриклеточную локализацию белка-мишени, его ферментативную активность, стабильность или взаимодействия с другими белками или ДНК. Некоторые аспекты функций системы SUMO, которые изучены к настоящему времени, рассмотрены ниже.

1.1.4. Участие системы SUMO в регуляции транскрипции

Регуляторное влияние на экспрессию генов в клетках млекопитающих, пожалуй, наиболее изученная область функций белка-модификатора SUMO, так как многие из целевых белков системы SUMO оказались транскрипционными факторами. Во многих, но не во всех случаях, модификация SUMO вызывает репрессию транскрипции, в результате чего после мутации сайтов сумоилирования в белках-мишенях происходит гиперактивация транскрипции [35,42].

Например, было показано, что линейная конъюгация SUMO с Gal4 ДНК-связывающим доменом, оказывает отрицательное воздействие на транскрипцию, при условии, что родственные последовательности ДНК представлены в промоторной области гена-репортера [43].

Существует несколько различных механизмов, посредством которых SUMO может репрессировать транскрипцию; тип механизма, по-видимому, зависит от соответствующего целевого белка.

Например, некоторые транскрипционные факторы после модификации SUMO поглощаются ядерными телами PML, что делает их недоступными для активации транскрипции. Тела PML - это ядерные белковые агрегаты, которые распределены между хроматином. Эти ядерные структуры называют телами PML, так как ген PML имеет важное значение для их формирования. Тела PML имеют размер 0,2-1,0 мкм, присутствуют в большинстве клеточных ядер млекопитающих, обычно в количестве 1-30 тел на ядро, в зависимости от типа клеток, клеточного цикла и стадии дифференцировки. Последние исследования

свидетельствуют, что тела PML являются структурно и функционально неоднородными и обладают динамичной структурой.

В других случаях было показано, что сумоилирование активирует деятельность гистондезацетилазы гистонов, что вызывает репрессию транскрипции хроматина с помощью модификации в соответствующем промоторе. Кроме того, было обнаружено, что сумоилирование самих гистондезацетилаз гистонов повышает их репрессивную активность. Также известно, что транскрипционный корепрессор Daxx является мишенью для модификации SUMO и требует для своей активации сумоилирования нескольких факторов транскрипции, хотя дальнейшие взаимодействия, приводящие к репрессии пока неясны [44].

Наконец, белки PIAS (SUMO-лигазы) сами при взаимодействии с модифицированными SUMO транскрипционными факторами, могут играть роль в подавлении транскрипции, независимо от их ЕЗ деятельности [45,46].

1.1.5. Действие системы SUMO в обеспечении стабильности генома

Еще одной областью метаболизма, на которую система SUMO оказывает сильное влияние, является поддержание стабильности генома [36,39,40].

Этот аспект функции SUMO был изучен наиболее широко у низших эукариот. Легкость генетических манипуляций в дрожжевой системе позволила провести исследование фенотипов дрожжевых мутантов дефицитных по компонентам системы SUMO, которое показало важность белка модификатора SUMO для защиты от нестабильности генома: ubc9ts и mms21 мутанты, чувствительны к действию ДНК-повреждающих агентов и спонтанно накапливают промежуточные ненормальные рекомбинации ДНК во время репликации [47-50]; ulp2 мутанты характеризуются чувствительностью к повреждениям ДНК, потерей плазмиды и дефектами, возникающими при расхождении хромосом [51]; и в zip3 мутантах обнаруживаются синаптонемные

комплексы с ненормальной структурой, тем самым, доказывая роль SUMO в процессе мейоза [52].

С другой стороны, глобальный анализ SUMO-конъюгатов методом масс-спектрометрии [53-57] позволил определить многие потенциальные цели для модификации SUMO, касающиеся метаболизма ДНК, такие как геликазы (SGS1), топоизомеразы и факторы рекомбинации (Rad52). В некоторых случаях модификации конкретного белка-мишени могут быть отнесены к конкретному явлению в естественных условиях. Так, например, модификация SUMO топоизомеразы II связана с точностью передачи хромосомы [58-61]; было показано, что модификация SUMO фактора Rad52, регулирует процесс рекомбинации в локусах рибосомной ДНК [62] и сумоилирование белка репликации PCNA препятствует ассоциации рекомбинации фактора Rad51 с репликационной вилкой с помощью антирекомбинантной геликазы Srs2 [63,64].

Чаще, однако, последствия модификации SUMO для конкретного целевого белка остаются неясными, и целевые белки, ответственные за многие эффекты мутантов по компонентам системы SUMO, - факторам конъюгации или деконъюгации - на данный момент не определены.

1.1.6. Белки, взаимодействующие с SUMO нековалентным образом

Белковая частица SUMO является партнером для взаимодействия в многочисленных дву-гибридных системах. В некоторых случаях это происходит благодаря ковалентной модификации целевого белка, но также существуют и нековалентные взаимодействия. В отличие от ковалентного связывания при нековалентном взаимодействии связывание не зависит от присутствия в SUMO С-концевых глицинов [65].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Литвинова, Наталия Алексеевна, 2014 год

9. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Monsan P. Characterization of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase (DSRS) and identification of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity / Monchois V., Remaud-Simeon M., Russell R.R., , Willemot R.M. // Appl Microbiol Biotechnol. - 1997. - №48 (4). - P. 465-72.

2. Meyer T. Characterization of an extensin-modifying metalloprotease: N-terminal processing and substrate cleavage pattern of Pectobacterium carotovorum Prtl // Appl Microbiol Biotechnol.-2014. - P. 156-162.

3. Способ получения коллагеназы / Ефимова Н.П., Николаева A.M., Колпакова Е.Г. // Патент РФ № 2180002. - 2002

4. Miiller S. SUMO, ubiquitin's mysterious cousin / Mtiller S, Hoege C, Pyrowolakis G, Jentsch S.//Nat Rev Mol Cell Biol.- 2001.- P.202-10.

5. Raymond J. SUMO fusion technology for enhanced protein expression and purification in prokaryotes and eukaryotes / Raymond J. Peroutka I R, Orcutt SJ, Strickler JE, Butt TR. // Methods Mol Biol. - 2011. - Vol. 10,- P. 967-978.

6. Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins // Nature. - 2009. -P. 422-429.

7. Panse, V. G. A proteome-wide approach identifies sumoylated substrate proteins in yeast / Panse, V. G., Hardeland, U., Werner, Т., Kuster, B. Hurt, E. J. // Biological Chemistry. - 2004. - Vol. 279. - P. 346-351.

8. Wohlschlegel J. A. Global analysis of protein sumoylation in Saccharomyces cerevisiae / Wohlschlegel J. A., Johnson, E. S., Reed, S. I.,Yates, J. R. // Biological Chemistry. - 2004. - Vol. 279. - P. 662-668.

9. Hannich, J. T. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae // Biological Chemistry. - 2005. - Vol. 280 - P.4102-4110.

10. Wykoff, D. D. Identification of sumoylated proteins by systematic immunoprecipitation of the budding yeast proteome/ Wykoff D. D., O'Shea, E. K. // Molecular Cell Proteomic. - 2005. - Vol. 4. - P. 73-83.

ll.Elrouby, N. Proteome-wide screens for small ubiquitin-like modifier (SUMO) substrates identify Arabidopsis proteins implicated in diverse biological processes / Elrouby, N. Coupland, G.// Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107. - P. 1741517420.

12. Miller, M. J. Proteomic analyses identify a diverse array of nuclear processes affected by small ubiquitin-like modifier conjugation in Arabidopsis. / Miller, M. J., Barrett-Wilt, G. A, Hua, Z. Vierstra, R. D. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 2010. -Vol.107. - P. 16512-16517.

13. Matic, I. Site-specific identification of SUMO-2 targets in cells reveals an inverted SUMOylation motif and a hydrophobic cluster SUMOylation motif // Mol. Cell. - 2010. - Vol. 39. - P. 641-652.

14. Bruderer, R. Purification and identification of endogenous poly SUMO conjugates/ EMBO Reproductional.- 2011. - Vol. 12. - P. 142-148.

15. Plechanovova, A. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4 // Nature Structural Molecular Biology. - 2011. - Vol. 18. - P. 1052-1059.

16. Plechanovova, A. Structure of a RING E3 ligase and ubiquitin-loaded E2 primed for catalysis / Plechanovova, A., Jaffray, E. G., Tatham, M. H., Naismith, J. H. Hay, R. T. // Nature. - 2012. - Vol. 489. - P. 115-120.

17. Abed M. Degringolade, a SUMO-targeted ubiquitin ligase, inhibits Hairy/Groucho-mediated repression // EMBO. - 2011. - Vol. 30. - P. 1289-1301.

18. Yin, Y. SUMO-targeted ubiquitin E3 ligase RNF4 is required for the response of human cells to DNA damage // Genes Development. - 2012. - Vol. 26.- P. 1196-1208.

19. Galanty, Y. RNF4, a SUMO-targeted ubiquitin E3 ligase, promotes DNA double-strand break repair / Galanty, Y., Belotserkovskaya, R., Coates, J. Jackson, S. P. // Genes Dev. - 2010. - Vol. 26. - P. 1179-1195.

20. Dou, H. Regulation of DNA repair through deSUMOylation and SUMOylation of replication protein A complex / Dou, H., Huang, C., Singh, M., Carpenter, P. B. Yeh, E. T. //Mol. Cell.- 2010. - Vol. 39. - P. 333-345.

21. Johnson, E. S. Protein modification by SUMO // Annu. Rev. Biochem.-2010.-Vol.200473. - P. 355-382.

22. Owerbach, D. A proline-90 residue unique to SUMO-4 prevents maturation and sumoylation / Owerbach, D., McKay, E. M., Yeh, E. T., Gabbay, K. H., Bohren, K. M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - Vol. 337. - P. 517-520.

23. Mukhopadhyay, D. Modification in reverse: the SUMO proteases / Mukhopadhyay D., Dasso, M. // Trends Biochem. - 2007. - Sci. 32. - P. 286-295.

24. Saitoh, H. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3 / Saitoh, H. Hinchey, J. // J. Biol. Chem. - 2000. -Vol. 275.-P. 6252-6258.

25. Vertegaal, A. C. Small ubiquitinrelated modifiers in chains // Biochem. Soc. Trans. -2007. - Vol. 35. - P. 1422-1423.

26. Bylebyl, G. R. The SUMO isopeptidase Ulp2 prevents accumulation of SUMO chains in yeast / Bylebyl, G. R., Belichenko, I., Johnson, E. S. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 44113^14120.

27. Matic, I. In vivo identification of human small ubiquitin-like modifier polymerization sites by high accuracy mass spectrometry and an in vitro to in vivo strategy / Matic, I., van Hagen, M., Schimmel, J., Macek, B., Ogg, S. C., Tatham, M. H., Hay, R. T., Lamond, A. I., Mann, M., and Vertegaal, A. C. // Mol. Cell. Proteomics. -2008.-Vol. 7.-P. 132-144.

28. Tatham, M. H. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9 // Tatham, M. H., Jaffray, E., Vaughan, O. A., Desterro, J. M., Botting, C. H., Naismith, J. H., Hay, R. T. // J. Biol. Chem. -2001. - Vol. 276. - P. 35368-35374.

29. Windecker, H. Architecture and assembly of poly-SUMO chains on PCNA in Saccharomyces cerevisiae / Windecker, H. Ulrich, H. D. // J. Mol. Biol. - 2008. -Vol. 376 -P. 221-231

30. Cheng, C. H. SUMO modifications control assembly of synaptonemal complex and polycomplex in meiosis of Saccharomyces cerevisiae / Cheng, C. H., Lo,

Y. H., Liang, S. S., Ti, S. C., Lin, F. M, Yeh, C. H., Huang, H. Y., and Wang, T. F. // Genes Dev. - 2006. - Vol. 20. - P. 2067-2081.

31. Saitoh, H. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3 / Saitoh, H. Hinchey, J. // J. Biol. Chem. 2000. -Vol. 275.-P. 6252-6258.

32. Hay, R. T. SUMO-specific proteases: a twist in the tail // Trends Cell Biol. - 2007. - Vol. 17. - P. 370-376.

33. Li, S. J. The yeast ULP2 (SMT4) gene encodes a novel protease specific for the ubiquitin-like Smt3 protein / Li, S. J. and Hochstrasser, M. // Mol. Cell. Biol. -2000. - Vol.20. - P. 2367-2377.

34. Li, S. J. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Li, S. J. Hochstrasser, M. // Nature. - 1999. - Vol. 398. - P. 246-251.

35. Girdwood, D. W. SUMO and transcriptional regulation / Girdwood, D. W., Tatham, M. H., and Hay, R. T. // Semin. Cell Dev. Biol. - 2004. - Vol.15. - P. 201210.

36. Muller, S. SUMO: a regulator of gene expression and genome integrity / Muller, S., Ledl, A., Schmidt, D. // Oncogene. - 2004. - Vol. 23. - P. 1998-2008.

37. Melchior, F. SUMO: ligases, isopeptidases and nuclear pores / Melchior, F., Schergaut, M., Pichler, A. // Trends Biochem. Sci. - 2003. - Vol. 28. - P. 612-618.

38. Ulrich, H. D. Mutual interactions between the SUMO and ubiquitin systems: a plea of no contest //Trends Cell Biol. - 2005. - Vol. 15. - P. 525-532.

39. Seeler, J. S. SUMO, the three Rs and cancer / Seeler, J. S., Bischof, O., Nacerddine, K., Dejean, A. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 2007. - Vol. 313. - P. 49-71.

40. Watts, F. Z. The role of SUMO in chromosome segregation // Chromosoma. - 2007. - Vol. 116. - P. 15-20.

41. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms // Genes Dev. - 2004. - Vol. 18- P. 2046-2059.

42. Gill, G. Something about SUMO inhibits transcription // Curr. Opin. Genet. Dev.-2005.-Vol. 15.-P. 536-541.

43. Ross, S. SUMO-1 modification represses Sp3 transcriptional activation and modulates its subnuclear localization / Ross, S., Best, J. L., Zon, L. I., and Gill, G. // Mol. Cell. - 2002. - Vol. 10. - P. 831-842.

44. Lin, D. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors / Lin, D. Y., Huang, Y. S., Jeng, J. C., Chang, C. C., Chao, T. T., Ho, C. C., Chen, Y. C., Lin, T. P., Fang, H. I. et al. // Mol. Cell. - 2006. - Vol. 24. - P. 341-354.

i i

45. Palvimo, J. J. PIAS proteins as regulators of small ubiquitin-related j modifier (SUMO) modifications and transcription // Biochem. Soc. Trans. - 2007. -Vol. 35.-P. 1405-1408.

46. Sharrocks, A. D. PIAS proteins and transcriptional regulation-more than just SUMO E3 ligases // Genes Dev. - 2006. - Vol. 20. - P. 754-758.

47. Andrews, E. A. Nse2, a component of the Smc5-6 complex, is a SUMO ligase required for the response to DNA damage / Andrews, E. A., Palecek, J., Sergeant, J., Taylor, E, Lehmann, A. R., Watts, F. Z. // Mol. Cell. Biol. - 2005. - Vol. 25. - P. 185-196.

48. Potts, P. R. Human MMS21/NSE2 is a SUMO ligase required for DNA repair / Potts, P. R. Yu, H. // Mol. Cell. Biol. - 2005. - Vol. 25. - P. 7021-7032.

49. Zhao, X. A SUMO ligase is part of a nuclear multiprotein complex that affects DNA repair and chromosomal organization / Zhao, X. Blobel, G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102. - P. 4777-4782.

50. Branzei, D. The DNA damage response during DNA replication / Branzei, D. Foiani, M. // Curr. Opin. Cell Biol. -2005. - Vol. 17. - P. 568-575.

51. Kagey, M. H. The polycomb protein Pc2 is a SUMO E3 / Kagey, M. H., Melhuish, T. A., Wotton, D. // Cell. - 2003. - Vol. 113. - P. 127-137.

52. Wotton, D. Pc2 and SUMOylation / Wotton, D. Merrill, J. C. // Biochem. Soc. Trans. - 2007. - Vol. 35. - P. 1401-1404.

53. Denison, C. A proteomic strategy for gaining insights into protein sumoylation in yeast / Denison, C., Rudner, A. D., Gerber, S. A., Bakalarski, C. E., Moazed, D., Gygi, S. P. // Mol. Cell. Proteomics. - 2005. - Vol. 4. - P. 246-254.

54. Panse, V. G. A proteome - wide approach identifies sumoylated substrate proteins in yeast / Panse, V. G., Hardeland, U., Werner, T., Kuster, B., and Hurt, E. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. -P. 41346-41351.

55. Vertegaal, A. C. A proteomic study of SUMO-2 target proteins / Vertegaal, A. C., Ogg, S. C., Jaffray, E., Rodriguez, M. S., Hay, R. T., Andersen, J. S., Mann, M., and Lamond, A. I. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 33791-33798.

56. Wohlschlegel, J. A. Global analysis of protein sumoylation in Saccharomyces cerevisiae / Wohlschlegel, J. A., Johnson, E. S., Reed, S. I., and Yates, J. R. 3rd. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 45662-45668.

57. Zhou, W Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae Induction of protein sumoylation by cellular stresses / Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 32262-32268.

58. Takahashi, Y., SIZ1/SIZ2 control of chromosome ransmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II / Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. // Genetics. - 2006. - Vol. 172. - P. 783-794.

59. Bachant, J. The SUMO-1 isopeptidase Smt4 is linked to centromeric cohesion through SUMO-1 modification of DNA topoisomerase II / Bachant, J., Alcasabas, A., Blat, Y., Kleckner, N„ and Elledge, S. J. // Mol. Cell. - 2002. - Vol. 9. -P. 1169-1182.

60. Azuma, Y. SUMO-2/3 regulates topoisomerase II in mitosis / Azuma, Y., Arnaoutov, A., Dasso, M. // J. Cell Biol. - 2003. - Vol. 163. - P. 477-487.

61. Liu, L. F. Mechanism of action of camptothecin / Liu, L. F., Desai, S. D., Li, T. K., Mao, Y., Sun, M., Sim, S. P. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 922. - P. 1-10.

62. Torres-Rosell, J. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus / Torres-Rosell, J., Sunjevaric, I., De Piccoli, G., Sacher, M., Eckert-Boulet, N., Reid, R., Jentsch, S., Rothstein, R., Aragon, L., Lisby, M. // Nat. Cell Biol. - 2007. - Vol. 9. - P. 923-931.

63. Papouli, E. Crosstalk between SUMO and ubiquitin on PCNA is mediated by recruitment of the helicase Srs2p / Papouli, E., Chen, S., Davies, A. A., Huttner, D., Krejci, L., Sung, P, Ulrich, H. D. // Mol. Cell. - 2005. - Vol. 19. - P. 123-133.

64. Pfander, B. SUMOmodified PCNA recruits Srs2 to prevent recombination during S phase / Pfander, B., Moldovan, G. L., Sacher, M., Hoege, C., Jentsch, S. // Nature. - 2005. - Vol. 436. - P. 428-433.

65. Hannich, J. T. Defining the SUMOmodified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae / Hannich, J. T., Lewis, A., Kroetz, M. B., Li, S. J., Heide, H., Emili, A., Hochstrasser, M. // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 4102-4110.

66. Kerscher, O. SUMO junction-what's your function? New insights through SUMO-interacting motifs // EMBO. - 2007. - Rep. 8. - P. 550-555.

67. Johnson, E. S. Cell cycle-regulated attachment of the ubiquitinrelated protein SUMO to the yeast septins / Johnson, E. S. Blobel, G. // J. Cell Biol. - 1999. -Vol. 147.-P. 981-994.

68. Bernier-Villamor, V. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAPl / Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. // Cell. - 2002. -Vol. 108.-P. 345-356.

69. Hietakangas, V. PDSM, a motif for phosphorylation- dependent SUMO modification / Hietakangas, V., Anckar, J., Blomster, H. A., Fujimoto, M., Palvimo, J. J., Nakai, A., Sistonen, L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. - Vol. 103. - P. 45-50.

70. Yang, S. H., An extended consensus motif enhances the specificity of substrate modification by SUMO. Yang, S. H., Galanis, A., Witty, J., and Sharrocks, A. D. // EMBO J. - 2006. - Vol. 25. - P. 5083-5093.

71. Prudden, J. SUMOtargeted ubiquitin ligases in genome stability / Prudden, J., Pebernard, S., Raffa, G., Slavin, D. A., Perry, J. J., Tainer, J. A., McGowan, C. H., Boddy, M.N. //EMBO J.-2007.-Vol. 26.-P. 4089-4101.

72. Sun, H. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins / Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. // EMBO J. - 2007. - Vol. 26. - P. 4102-4112.

73. Uzunova, K. Ubiquitindependent proteolytic control of SUMO conjugates. Uzunova, K., Gottsche, K. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - P. 34167-34175.

74. Xie, Y. The yeast HEX3-SLX8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation / Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. - 282. - P. 34176-34184.

75. Tong, H. Crystal structure of murine/human Ubc9 provides insight into the variability of the ubiquitin-conjugating system / Tong, H., Hateboer, G., Perrakis, A., Bernards, R, Sixma, T. K. //J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P. 21381-21387.

76. Desterro, J. M. SUMO-1 modification of I-B-inhibits NF-B activation / Desterro, J. M., Rodriguez, M. S., Hay, R. T. // Mol. Cell. - 1998. - Vol. 2. - P. 233239.

77. Bossis, G. SUMO: regulating the regulator // Cell Div. - 2006. - P. 13.

78. Guo, B. Signalling pathways and the regulation of SUMO modification. Guo, B., Yang, S. H., Witty, J., Sharrocks, A. D. // Biochem. Soc. Trans. - 2007. - Vol. 35.-P. 1414-1418.

79. Roscic, A. Phosphorylation- dependent control of Pc2 SUMO E3 ligase activity by its substrate protein HIPK2 / Roscic, A., Moller, A., Calzado, M. A., // Mol. Cell. - 2006. - Vol. 24. - P. 77-89.

80. Johnson, E. S. An E3-like factor that promotes SUMO conjugation to the yeast septins // Cell. - 2001. - Vol. 106. - P. 735-744.

81. Boggio, R A mechanism for inhibiting the SUMO pathway / Boggio, R., Colombo, R., Hay, R. T., Draetta, G. F., Chiocca, S. // Mol. Cell. - 2004. - Vol.16. - P. 549-561.

82. Bossis, G. Regulation of SUMOylation by reversible oxidation of SUMO conjugating enzymes // Mol. Cell. - 2006. - Vol. 21. - P. 349-357.

83. Kurepa, J., The small ubiquitin- like modifier (SUMO) protein modification system in Arabidopsis. Accumulation of SUMOl and -2 conjugates is

increased by stress / Kurepa, J., Walker, J. M., Smalle, J., Gosink, M. M., Davis, S. J., Durham, T. L., Sung, D. Y., and Vierstra, R. D. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. -P. 6862-6872

84. Christopher M. Function and regulation of SUMO proteases / Christopher M. H, Nicole R. W Mark Hochstrasser // Molecular Cell Biology. - Vol. 13. - P. 755767

85. Gong, L., Millas, S., Maul, G. G. & Yeh, E. T. Differential regulation of sentrinized proteins by a novel sentrin-specific protease. J. Biol. Chem. 275, 3355-3359 (2000).

86. Yeh, E. T. Ubiquitin-like proteins: new wines in new bottles / Yeh, E. T., Gong, L. Kamitani, T. // Gene. - 2000. - Vol. 248. - P. 1-14.

87. Shin, E. J. DeSUMOylating isopeptidase: a second class of SUMO protease //EMBO. - 2012. -Vol. 13.-P. 339-346

88. Schulz, S. Ubiquitin-specific protease-like 1 (USPL1) is a SUMO isopeptidase with essential, non-catalytic functions // EMBO. - 2012. - Rep. 13. - P. 930-938.

89. Komander, D. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases / Komander, D., Clague, M. J. Urbe, S. // Nature Rev. Mol. Cell Biol. -2009. - Vol. 10. - P. 550-563.

90. Iyer, L Novel predicted peptidases with a potential role in the ubiquitin signaling pathway / Iyer, L. M., Koonin, E. V. Aravind, L. // Cell Cycle. - 2004. - Vol. 3.P. 1440-1450.

91. Mendoza, H. M. NEDP1, a highly conserved cysteine protease that deNEDDylates cullins // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 25637-25643.

92. Gan-Erdene, T. Identification and characterization of DEN 1, a deneddylase of the ULP family // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 28892-28900.

93. Wu, K. DEN1 is a dual function protease capable of processing the C terminus ofNedd8 and deconjugating hyper-neddylated CULl. // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278. - P. 28882-28891.

94. Mossessova, E. Ulpl-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast / Mossessova, E. Lima, C. D. // Mol. Cell. - 2000. - Vol. 5. - P. 865-876.

95. Reverter, D. A basis for SUMO protease specificity provided by analysis of human Senp2 and a Senp2-SUMO complex // Structure. - 2004. - Vol. 12. - P. 15191531.

96. Reverter, D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates/ Reverter, D., Lima, C. D. // Nature Struct. Mol. Biol. - 2006. - Vol. 13. - P. 1060-1068.

97. Shen, L. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond//Nature Struct. Mol. Biol. - 2006.-Vol. 13.-P. 1069-1077.

98. Shen, L. The structure of SENP1-SUMO-2 complex suggests a structural basis for discrimination between SUMO paralogues during processing / Shen, L. N., Dong, C., Liu, H., Naismith, J. H., Hay, R. T. // Biochem. J. - 2006. - Vol. 397. - P. 279-288.

99. Huang, D. T. Breaking up with a kinky SUMO // Nature Struct. Mol. Biol. -2006.-Vol. 13.-P. 1045-1047.

100. Li, S. The Ulpl SUMO isopeptidase: distinct domains required for viability, nuclear envelope localization, and substrate specificity / Li, S. J. Hochstrasser, M J. Cell Biol.-2003.- Vol. 160.-P. 1069-1081.

101. Kroetz, M. B Essential role of nuclear localization for yeast Ulp2 SUMO protease function / Kroetz, M. B., Su, D. Hochstrasser, M. // Mol. Biol. Cell. - 2009. -Vol. 20.-P. 2196-2206.

102. Gong, L. Characterization of a family of nucleolar SUMO-specific proteases with preference for SUMO-2 or SUMO-3 // J. Biol. Chem. - 2006 . - Vol. 281.-P. 15869-15877.

103. Hang, J. Association of the human SUMO-1 protease SENP2 with the nuclear pore//J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277.-P. 19961-19966.

104. Nishida, T. A novel mammalian Smt3-specific isopeptidase 1 (SMT3IP1) localized in the nucleolus at interphase / Nishida, T., Tanaka, H. Yasuda, H. // Eur. J. Biochem. - 2000. - Vol. 267. - P. 6423-6427.

105. Mukhopadhyay, D. SUSP1 antagonizes formation of highly SUM02/3-conjugated species // J. Cell Biol. - 2006. - Vol. 174. - P. 939-949.

106. Lima, C. D. Structure of the human SENP7 catalytic domain and poly-SUMO deconjugation activities for SENP6 and SENP7 // J. Biol. Chem. - 2008. - Vol. 283.-P. 32045-32055.

107. Alegre, K. O. Swapping small ubiquitin-like modifier (SUMO) isoform specificity of SUMO proteases SENP6 and SENP7 // J. Biol. Chem. - 2011. - Vol. 286. -P. 36142-36151.

108. Bylebyl, G. R. The SUMO isopeptidase Ulp2 prevents accumulation of SUMO chains in yeast / Bylebyl, G. R., Belichenko, I. Johnson, E. S. // J. Biol. Chem. -2003.-Vol. 278.-P. 44113-44120.

109. Takahashi, Y. Yeast Ulpl, an Smt3-specific protease, associates with nucleoporins / Takahashi, Y., Mizoi, J., Toh, E. A. Kikuchi, Y. // J. Biochem. - 2000. -P. 128723-725.

110. Elmore, Z. C. SUMO-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulpl //BMC Biol. -2011. -Vol. 9.-P. 74.

111. Panse, V. G. Unconventional tethering of Ulpl to the transport channel of the nuclear pore complex by karyopherins / Panse, V. G., Kuster, B., Gerstberger, T. Hurt, E. // Nature Cell Biol. - 2003. - Vol. 5. - P. 21-27 .

112. Kolli, N. Distribution and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes // Biochem. J. - 2010. - Vol. 430. - P. 335-344.

113. Di Bacco, A. The SUMO-specific protease SENP5 is required for cell division // Mol. Cell. Biol. - 2006. - Vol. 26. - P. 4489-4498.

114. Hattersley, N. The SUMO protease SENP6 is a direct regulator of PML nuclear bodies / Hattersley, N., Shen, L., Jaffray, E. G. Hay, R. T. // Mol. Biol. Cell. -2011.-Vol. 22.-P. 78-90.

115. Nishida, T. Characterization of a novel mammalian SUMO-1/ Smt3-specific isopeptidase, a homologue of rat axam, which is an axin-binding protein promoting P-catenin degradation / Nishida, T., Kaneko, F., Kitagawa, M. Yasuda, H. // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 39060-39066 (2001).

116. Kim, K. I. A new SUMO-1-specific protease, SUSP1, that is highly expressed in reproductive organs. // J. Biol. Chem. - 2000. — Vol. 275. — P. 14102— 14106.

117. Kadoya, T. Desumoylation activity of Axam, a novel Axin-binding protein, is involved in downregulation of P-catenin // Mol. Cell. Biol. - 2002. - Vol. 22. - P. 3803-3819.

118. Zhu, S. Protection from isopeptidase-mediated deconjugation regulates paralog-selective sumoylation of RanGAPl // Mol. Cell. - 2009. - Vol. 33. - P. 570580.

119. Xu, Z. Mapping residues of SUMO precursors essential in differential maturation by SUMO-specific protease, SENP1 // Biochem. J. - 2005. - Vol. 386 - P. 325-330.

120. Suh, H. Y. Crystal structure of DeSI-1, a novel deSUMOylase belonging to a putative isopeptidase superfamily // Proteins. - 2012. - Vol. 80. - P. 2099-2104.

121. Cheng, J. SUMO-specific protease 1 is essential for stabilization of HIFla during hypoxia / Cheng, J., Kang, X., Zhang, S. Yeh, E. T. // Cell. - 2007. - Vol. -131. -P. 584-595.

122. Bawa-Khalfe, T. Induction of the SUMO-specific protease 1 transcription by the androgen receptor in prostate cancer cells / Bawa-Khalfe, T., Cheng, J., Wang, Z. & Yeh, E. T. // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - P. 37341-37349.

123. Lee, M. H. NF-kB induction of the SUMO protease SENP2: a negative feedback loop to attenuate cell survival response to genotoxic stress / Lee, M. H., Mabb, A. M., Gill, G. B., Yeh, E. T. Miyamoto, S. // Mol. Cell. - 2011. - Vol. 43. - P. 180191.

124. Kuo, M. L. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3 / Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C. Sherr, C. J. // Cell Cycle. - 2008. - Vol. 7. - P. 3378-3387.

125. Huang, C. SENP3 is responsible for HIF-1 transactivation under mild oxidative stress via p300 de-SUMOylation // EMBO J. - 2009. - Vol. 28. - P. 27482762.

126. Yan, S. Redox regulation of the stability of the SUMO protease SENP3 via interactions with CHIP and Hsp90 // EMBO - 2010. - Vol. 29. - P. 3773-3786.

127. Baldwin, M. L. The yeast SUMO isopeptidase Smt4/Ulp2 and the polo kinase Cdc5 act in an opposing fashion to regulate sumoylation in mitosis and cohesion at centromeres / Baldwin, M. L., Julius, J. A., Tang, X., Wang, Y. Bachant, J. // Cell Cycle. - 2009. - Vol. 8. - P. 3406-3419.

128. Golebiowski, F. System-wide changes to SUMO modifications in response to heat shock // Sci Signal. - 2009. - Vol. 2. - P. 24.

129. Pinto, M. P. Heat shock induces a massive but differential inactivation of SUMO-specific proteases // Biochim. Biophys. Acta. - 2012. - Vol. 1823. - P. 19581966.

130. Truong, K., Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification of El Cys domain inhibits El Cys domain enzymatic activity // J. Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287. -P. 15154-15163.

131. Xu, Z. Molecular basis of the redox regulation of SUMO proteases: a protective mechanism of intermolecular disulfide linkage against irreversible sulfhydryl oxidation // FASEB J. - 2008. - Vol. 22. - P. 127-137.

132. Kang, X. SUMO-specific protease 2 is essential for suppression of polycomb group protein-mediated gene silencing during embryonic development // Mol. Cell. -2010. - Vol. 38. - P. 191-201.

133. Strunnikov A. V. Saccharomyces cerevisiae SMT4 encodes an evolutionarily conserved protease with a role in chromosome condensation regulation / Strunnikov, A. V., Aravind, L. Koonin, E. V. // Genetics. - 2001. - Vol. 158. - P. 95107.

134. Schwartz, D. C. The Ulp2 SUMO protease is required for cell division following termination of the DNA damage checkpoint / Schwartz, D. C., Felberbaum, R. Hochstrasser, M. // Mol. Cell. Biol. - 2007. - Vol. 27. - P. 6948-6961.

135. Lee, M. T. The SUMO isopeptidase Ulp2p is required to prevent recombination-induced chromosome segregation lethality following DNA replication stress / Bakir, A. A., Nguyen, K. N. Bachant, J. PLoS // Genet. - 2011. - Vol. 7 - P. 1001355.

136. Bachant, J. The SUMO-1 isopeptidase Smt4 is linked to centromeric cohesion through SUMO-1 modification of DNA topoisomerase II / Bachant, J., Alcasabas, A., Blat, Y., Kleckner, N. Elledge, S. // J. Mol. Cell. - 2002. - Vol. 9. - P. 1169-1182 (2002).

137. Bergink, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair // Nature. - 2009. - Vol. 458. - P. 461-467.

138. Mukhopadhyay, D. The SUMO protease SENP6 is essential for inner kinetochore assembly / Mukhopadhyay, D., Arnaoutov, A. Dasso, M //J. Cell Biol. -2010. - Vol. 188. - P. 681-692.

139. Panse, V. G. Formation and nuclear export of preribosomes are functionally linked to the small-ubiquitin-related modifier pathway // Traffic. - 2006. -Vol. 7.-P. 1311-1321.

140. Haindl, M. The nucleolar SUMO-specific protease SENP3 reverses SUMO modification of nucleophosmin and is required for rRNA processing / Haindl, M., Harasim, T., Eick, D. Muller, S. // EMBO. - 2008. - Vol. 9. - P. 273-279.

141. Yun, C. Nucleolar protein B23/nucleophosmin regulates the vertebrate SUMO pathway through SENP3 and SENP5 proteases // J. Cell Biol. - 2008. - Vol. 183.-P. 589-595.

142. Finkbeiner, E., The SUMO system controls nucleolar partitioning of a novel mammalian ribosome biogenesis complex // EMBO J. - 2011. - Vol. 30. - P. 1067-1078.

143. Savkur, R. S. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease //Nucleic Acids Res. - 1998. - Vol. 26. - P. 4508-^1515.

144. Grisendi, S., Nucleophosmin and cancer / Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B. & Pandolfi, P. P. // Nature Rev. Cancer. - 2006. - Vol. 6. P. 493-505.

145. Harder, Z., Sumol conjugates mitochondrial substrates and participates in mitochondrial fission // Curr. Biol. - 2004. - Vol. 14/ - P. 340-345.

146. Zunino, R. The SUMO protease SENP5 is required to maintain mitochondrial morphology and function / Zunino, R., Schauss, A., Rippstein, P., Andrade-Navarro, M. McBride, H. M. // J. Cell Sei. - 2007. - Vol. 120. - P. 1178— 1188.

147. Zunino, R. Translocation of SenP5 from the nucleoli to the mitochondria modulates DRP1-dependent fission during mitosis // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284. -P. 17783-17795.

148. Mullen, J. R. Genetic evidence that polysumoylation bypasses the need for a SUMO-targeted Ub ligase / Mullen, J. R., Das, M. Brill, S. J. // Genetics. - 2011. -Vol. 187.-P. 73-87.

149. Wang, Z. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation // Mol. Cell. Biol. - 2009. - Vol. 29. - P. 1694-1706.

150. Zhou, W., Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae // Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279. - P. 32262-32268.

151. Felberbaum, R. Desumoylation of the endoplasmic reticulum membrane VAP family protein Scs2 by Ulpl and SUMO regulation of the inositol synthesis pathway / Felberbaum, R., Wilson, N. R., Cheng, D., Peng, J. Hochstrasser, M. // Mol. Cell. Biol. - 2012. - Vol. 32. - P. 64-75.

152. Christopher M. Function and regulation of SUMO proteases / Christopher M. Hickey, Nicole R. Wilson M. Hochstrasser // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2012. -Vol. 12.-P. 755-66.

153. Черепанов П.А., Михайлова Т.Г., Черепанов П.П. Способ получения рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2Ь, рекомбинантная плазмида и штамм продуцент для его осуществления // Патент РФ №2242516. -2002.

154. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды // М.: Мир. - 1987. -С. 411.

155. Ищенко А. М., Митрофанов Е. В., Симбирцев А. С., Шалаева О. Н., Батарин В. И., Лисицкая В. И., Вахитов Т. Я., Петров Л. Н., Свентицкий Е. Н. Штамм escherichia coli Ы21 (de3)[payc-et-(hifn-2b)-iaci]-npoflyueHT рекомбинантного человеческого альфа-2Ь интерферона и способ его культивирования // Патент РФ №2303063. - 2007.

156. Синичкина С.А., Пустошилова Н.М., Масычева В.И., Лебедев Л.Р., Коробко В.Г. Способ получения рекомбинантного фактора некроза опухолей -бета человека // Патент РФ № 2132385. - 1999

157. Гавриков А.В. Зависимость процедуры выделения и очистки рекомбинантного интерферона альфа-2Ь человека от условий его накопления в клетках штамма-продуцента в ходе регулируемого культивирования / Гавриков А.В., Рязанов И.А., Калужский В.Е., Машко С.В. // Биотехнология. - 2006. - №5. -С. 37-43.

158. Шемякин И.Г., Анисимова В.А., Митрофанова Г.Н. Рекомбинантная плазмидная днк рдти 23, способ получения рекомбинантной плазмидной днк рдти 23 и штамм бактерий Escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк рдти 23 - продуцент слитого белка дтил 2 // Патент РФ №2077585. — 1997.

159. Европейская фармакопея, 7-е изд. // М.: Ремедиум. - 2011.

160. Сидорук К. В., Губайдуллин И. И., Богуш В. Г., Козлов Д. Г. Способ получения протеиназы ULP 275 // Патент РФ № 2451076. - 2012.

161. Стратонова Н.В., Разработка промышленного способа культивирования штамма -продуцента гибридного белка - предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа - 2 b / Стратонова Н.В., Леонов B.C., Литвинова Н.А. // Ветеринарная медицина. - 2012. - №3-4. - С. 2223.

162. Афиногенов Г.Е., Доморад А.А., Шамолина И.И., Краснова М.В. Способ хранения микроорганизмов // Патент РФ №2008348. - 1994

163. John G.Day Cryopreservation and freeze drying protocols // Humana Press Inc, - 2007.-P. 135-150.

164. Шлегель Г. Микробиология // M: Мир. - 2003. - С.45-108.

165. Литвинова Н.А. Разработка технологии промышленного культивирования штамма E.coli - продуцента фермента ULP — протеиназы, осуществляющего протеолитический процессинг SUMO - интерферона, гибридного белка - предшественника альфа - интерферона / Н.А.Литвинова, Н.В.Стратонова, В.С.Леонов, Р.А.Хамитов // Биотехнология. - 2013. - № 5. - С.60-70.

166. Mossessova Е. Ulpl-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast / Mossessova E., Lima C.D. // Mol. Cell. - 2000. - Vol. 5. - P. 865-876.

167. Маниатис Т., Молекулярное клонирование / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // М:Мир. - 1984.

168. Козлов Д. Г., Яковенко А. Р., Тезов В. А. Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека // Патент РФ№ 2453604. - 2012.

169. Хамитов Р.А., Скрыпин В.И., Литвинова Н.А., Леонов B.C., Стратонова Н.В. Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения // Патент РФ № 2473683. - 2013.

170. Егоров. Н. С. Промышленная микробиология. // Москва. - 1989, - С. 149-167.

171. Studier F.W. Use of Т7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes / Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J. Dubendorff J.W. // Methods in Enzymology. - 1990. - Vol. 185. - P. 60-89.

172. Makrides, S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli // Microbiol. Reviews. - 1996. - Vol. 60. P. 512-538.

173. Литвинова H.A. Создание промышленной технологии выделения и очистки фермента ULP-протеиназа, осуществляющего гидролиз гибридного белка-предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа / Литвинова Н.А., Селищев С.В., Жученко М.А. // Жизнь без опасностей. Здоровье. Профилактика. Долголетие. - 2013.- № 4. - С. 90-94.

I I

I