Роль фосфорилирования в регуляции изоформ PHF10 - субъединицы ремоделирующего хроматин комплекса PBAF тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Симонов Юрий Петрович

• Симонов Юрий Петрович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Симонов Юрий Петрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация хроматина

1.1.1. Нуклеосомы

1.1.2. Взаимодействие нуклеосом в хроматине

1.2. Модификации хвостов гистонов

1.3. Участие нуклеосом в регуляции экспрессии генов

1.4. Классификация ремоделирующих комплексов

1.5. Семейство ремоделирующих комплексов SWI/SNF

1.5.1. Типы SWI/SNF комплексов

1.6. Особенности субъединичного состава PBAF, BAF и GBAF

1.6.1. Доменная организация и основные свойства субъединиц PBAF

1.6.2. Структура PBAF

1.6.3. Роль PBAF в регуляции транскрипции

1.6.4. Роль PBAF/BAF комплексов в стволовых клетках и участие субъединиц комплекса в онкотрансформации

1.7. Общие принципы регуляции белков

1.7.1. Фосфорилирование белков

1.7.2. Убиквитинилирование белков

1.7.3. Регуляция работы SWI/SNF комплекса с помощью модификаций

1.7.4. PHF10 — субъединица комплекса PBAF

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы и материалы

2.1.1. Реактивы и ферменты

2.1.2. Антитела

2.1.3. Приготовление буферных растворов

2.1.4. Бактериальные штаммы и клеточные культуры

2.1.5. Питательные среды для эукариотических и бактериальных культур

2.1.6. Дополнительное оборудование

2.1.7. Плазмидные конструкции, клонирование

2.1.1. Пептиды

2.2. Методы

2.2.1. Получение стабильных линий

2.2.2. Экспрессия рекомбинантных белков

2.2.3. Оценка количества РНК

2.2.4. Работа с белками

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Количество белка РОТ10 не коррелирует с уровнем РНК в клетках

3.2. РОТ10 — самая нестабильная субъединица PBAF комплекса

3.3. Изоформы РОТ 10 по-разному фосфорилированы

3.4. Фосфорилирование изоформ является универсальным для различных клеточных линий

3.5. Изоформы РОТ10 имеют разную стабильность

3.6. Изоформы РОТ10 деградируют в ядре в составе комплекса PBAF

3.7. Деградация изоформ PHF10 зависит от убиквитинилирования

3.8. За убиквитинилирование изоформ РОТ10 ответственна Р-ТгСР лигаза

3.9. Серины, входящие в состав Р-ТгСР дегронов, подвержены фосфорилированию в двух из четырех изоформах РОТ10

3.10. За фосфорилиование серинов Х-кластера ответственна СК-1 киназа

3.11. Фосфорилирование серинов Х-кластера и дегронов Р-ТгСР в линкерном домене изоформ PHF10-Ss препятствует их деградации

3.12. Анализ взаимодействий между Р-ТгСР и РОТ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Список сокращений AMP - Adenosine monophosphate, аденозинмонофосфат

AMPK - AMP-Activated Protein Kinase, АМФ-активируемая протеинкиназа (АМФК) ARID - AT-rich interaction domain. белковый домен, который связывается с ДНК ATCC - American Type Culture Collection, американская коллекция типовых культур ATM - Ataxia Telangiectasia Mutated: киназа, участвующая в репарации ДНК и контроле клеточного цикла

ATP - Adenylyltransferase, аденилилтрансфераза

Aktl - Серин/треониновая протеинкиназа, участвующая в регуляции выживания клеток BAF - BRG1/BRM-Associated Factors, белковый комплекс

BAF200, BAF180, BRD7, PHF10 (BAF45A) - Субъединицы, специфичные для комплекса PBAF

BAF250A, BAF250B, BAF45D, BAF45C, BCL11A, BCL11B - Субъединицы комплексов BAF и PBAF

BRG1 (SMARCA4) - ATP-зависимый хроматин-ремоделирующий фермент BRM (BRAHMA) - Основная субъединица SWI2/SNF2-™ra ATPазы комплекса ремоделирования хроматина (CRC)

CDK - Cyclin-Dependent Kinase: циклин-зависимая киназа, регулирующая клеточный цикл CK-1/2 - Casein Kinase 1/2, казеин киназа 1/2

CRC - Chromatin-Remodeling Complex, ремоделирующий хроматин комплекс

DHR3 - Транскрипционный фактор у дрозофилы, участвующий в регуляции развития

DOI - Digital Object Identifier: цифровой идентификатор объекта

E1, E2, E3 - Компоненты системы убиквитинилирования, отвечающие за активацию,

конъюгацию и лигирование убиквитина к целевым белкам

E3RS (IkappaB / beta-TrCP) - E3 убиквитин лигаза, специфичная для IkappaB

EMBO - European Molecular Biology Organization, Европейская организация молекулярной

биологии

ERK5 - Extracellular Signal-Regulated Kinase 5. Это один из членов семейства митоген-активируемых протеинкиназ (MAP киназ), которые участвуют в передаче сигналов от рецепторов на поверхности клетки к ядру

GFP - Green Fluorescent Protein: зелёный флуоресцентный белок

GSK-3P - Glycogen synthase kinase-3 beta: гликогенсинтазкиназа-3 бета, киназа, участвующая в регуляции метаболизма и транскрипции HBV - Hepatitis B virus: вирус гепатита B

HECT, RING, U-бокс - Домены в убиквитин-лигазах, определяющие их активность и специфичность

HEK293T - Human Embryonic Kidney 293 CRL-3216 из коллекции ATCC

HMG - High mobility group, группа с высокой подвижностью

HMT - Histone methyltransferase, гистон метилтрансфераза

IKK - IkB Kinase: киназа, активирующая NF-kB путём фосфорилирования IkB

Jak/Stat - Путь сигнальной трансдукции, участвующий в иммунном ответе и клеточном росте

Mdm2 - murine double minute 2: Белок, регулирующий активность p53

NF-kB, IL1, TNF - Факторы, участвующие в воспалительном ответе и иммунной регуляции NF-kappaB/Rel - Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B Семейство транскрипционных факторов, участвующих в иммунном ответе

NFAT - Nuclear Factor of Activated T-cells: фактор транскрипции в активированных Т-клетках

NLS - Nuclear Localization Signal: сигнал ядерной локализации, участвующий в транспорте белков в ядро

PBAF - Polybromo-associated BAF: разновидность комплексов BAF

PDSM - phosphorylation-dependent sumoylation motif, сумоилирующий мотив, зависимый от фосфорилирования

PHD - plant homeodomain, плант-гомеодомен

PHF10 - PHD finger protein 10, субъединица комплекса PBAF

PMCID - PubMed Central Identifier: идентификатор статьи в архиве PubMed Central

PMID - PubMed Identifier: идентификатор статьи в архиве PubMed

PcG - Polycomb Group: группа белков, участвующих в подавлении генов

RTK - Receptor Tyrosine Kinase: рецепторная тирозин киназа, участвующая в передаче

сигналов

SAYP - Субъединица комплекса PBAF у дрозофилы, аналог PHF10

SCF P-TrCP - Комплекс убиквитин-лигазы, участвующий в деградации белков

SCF - SKP1-Cullin-F-box: комплекс убиквитин-лигазы, участвующий в деградации белков

SUMO1 - Small ubiquitin-related modifier 1: малый убиквитин-зависимый модификатор

SV40 - Simian Virus 40: вирус обезьян

SWI/SNF - SWItch/Sucrose Non-Fermentable, семейство комплексов, ремоделирующих хроматин

Ser/Thr-specific kinases и Tyr-specific kinases - Серин/треонин- и тирозин-специфические

киназы соответственно, участвующие в фосфорилировании белков

WD40 - Домен, участвующий в белок-белковых взаимодействиях

p38 - MAP киназа, участвующая в воспалительном ответе и стрессовых реакциях

P-TrCP - Beta-Transducin Repeat Containing Protein: Белки, содержащие бета-трансдуциновые

повторы

ВАК - Высшая аттестационная комиссия ДАН - Доклады Академии Наук ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота ПТМ - Посттрансляционные модификации ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - Рибонуклеиновая кислота: молекула, участвующая в синтезе белков СК1 - Casein Kinase 1, казеин киназа 1 мРНК - Мессенджерная (матричная) РНК

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль фосфорилирования в регуляции изоформ PHF10 - субъединицы ремоделирующего хроматин комплекса PBAF»

Актуальность темы

Транскрипция генов эукариот зависит от пространственной организации хроматина. Участки генома, находящиеся в течение клеточного цикла в конденсированном состоянии, называются гетерохроматином, а активно транскрибирующиеся области - эухроматином. Ремоделирующие хроматин комплексы способны реструктурировать хроматин из одного состояния в другое и создавать доступные для транскрипции локусы. Такие комплексы состоят из большого количества субъединиц, а изменение их субъединичного состава определяет специфичность связывания комплекса с хроматином и ремоделируемые им гены. Необходимая селективность и точность механизмов работы хроматин-ремоделирующих комплексов достигается за счет посттрансляционных модификаций (ПТМ) субъединиц модуля. ПТМ изменяют поверхностный заряд субъединиц комплекса, что ведет к изменению белок-белковых взаимодействий и, как следствие, к конформационным изменениям, которые влияют на функции комплекса и его связывание с хроматином. Комплекс PBAF млекопитающих относится к семейству хроматин-ремоделирующих комплексов SWI/SNF, осуществляющих реструктуризацию хроматина за счет энергии гидролиза АТФ, и имеет четыре уникальные специфические субъединицы, образующих модуль связывания всего комплекса с хроматином.

Одной из специфических субъединиц хроматин-ремоделирующего комплекса PBAF является субъединица PHF10. PHF10 - эволюционно консервативный белок, экспрессирующийся в клетках млекопитающих в виде четырех различных изоформ: Pl, Ps, Sl и Ss. Первая буква в названии изоформы ответственна за С-конец белка (P - обозначает наличие PHD доменов на C-конце, S - обозначает SUMO домен на C - конце), вторая буква ответственна за N-конец белка (s - short, без удлинения, l - long, удлиненный на 47 амино кислот N-конец). Показана важность изоформ PHF10 в развитии организмов, в частности, в

6

активации специфических генов при дифференцировке нейрональных и миелоидных клеток и поддержании их стабильно высокой транскрипции в уже дифференцированных нейронах и нейтрофилах. Также было показано, что РОТ10 является коактиватором транскрипционного фактора MYC, имеющего повышенную экспрессию в большинстве онкотрансформированных клеток.

Как и некоторые другие субъединицы комплекса РВЛБ, изоформы РОТ10 подвержены посттрансляционным модификациям, в частности фосфорилированию. Данная работа посвящена изучению регуляции изоформ РОТ10 с помощью фосфорилирования.

Степень разработанности темы

На данный момент показано, что РВЛБ является одним из ключевых комплексов, регулирующих экспрессию генов в процессе развития организма. Достаточно хорошо изучен субъединичный состав комплекса РВЛБ. Показано, что смена субъединиц влияет на работу всего комплекса и определяет специфичность связывания комплекса с хроматином.

Известно, что скорость смены субъединичного состава комплекса зависит от стабильности субъединицы. Так же известно, что фосфорилирование белка является одной из самых распространенных модификаций, которая очень часто влияет на стабильность белка.

Влияние посттрансляционных модификаций на стабильность субъединиц PBAF комплекса изучено мало. Модификации РОТ10 также изучены недостаточно и не известны механизмы стабилизации и деградации белка через ПТМ. Основные работы, проведенные по этой теме, описаны в обзоре литературы.

Цели и задачи

Целью данной работы является изучение стабильности и фосфорилирования изоформ РОТ10 - субъединицы ремоделирующего хроматин комплекса РВЛБ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

задачи:

1. Определить время полужизни субъединиц РВЛБ комплекса и изоформ РОТ10;

2. Определить путь деградации изоформ РОТ10;

3. Изучить характер фосфорилирования для каждой изоформы РОТ10 и картировать сайты фосфорилирования РОТ10;

4. Определить киназу или киназы, ответственные за фосфорилирование РОТ10;

5. Определить влияние фосфорилирования на стабильность изоформ РОТ10. Научная новизна

В данной работы мной были получены абсолютно новые данные о влиянии фосфорилирования на стабильность изоформ РОТ10. Здесь также изучены стабильность субъединиц комплекса РВЛБ. Был показан кластерных характер фосфорилирования РОТ10. Было определено время полужизни белка РОТ10 и его отдельных изоформ в зависимости от фосфорилирования и показан механизм стабилизации некоторых изоформ РОТ10 за счет фосфорилирования. В ходе этого исследования был изучен механизм деградации РОТ10, определена убиквитин-лигаза Р-ТгСР, участвующая в деградации изоформ, и был выявлен неканонический дегрон в составе последовательности РОТ10, фосфорилирование которого способствует стабилизации изоформ РОТ10.

Таким образом, было показано, что РОТ10 является одной из наиболее регулируемых субъединиц комплекса РВЛБ, что может оказывать влияние на функционирование всего комплекса.

Теоретическая и практическая значимость

В данной работе был исследован механизм деградации РОТ10. Определен путь деградации РОТ10 через убиквитинилирование с участием убиквитин

лигазы Р-ТгСР. В составе PHF10 выявлены неканонические дегроны, ответственные за взаимодействие с Р-ТгСР. Было показано, что белок РОТ10 подвержен сложной регуляции с помощью фосфорилирования. Обнаружен принципиально новый механизм стабилизации изоформ РОТ10 за счет фосфорилирования.

Понимание процесса регуляции работы субъединицы комплекса ведет к пониманию принципа работы и регуляции всего хроматин-ремоделирующего PBAF комплекса. Исходя из сложности регуляции РОТ10 можно судить о важности этого белка в работе всего комплекса. Данные, представленные в работе, расширяют представление о белках, осуществляющих ремоделирование хроматина и вносят важный вклад в понимание фундаментальных механизмов регуляции экспрессии генов.

В работе изучена регуляция работы субъединицы РОТ10 комплекса РВДБ, результаты исследований могут быть использованы в разработке новых подходов к лечению заболеваний, связанных с нарушением транскрипции генов.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования, методов молекулярной биологии, биохимии и генной инженерии.

Основными методами, использующимися в данной работе, были клонирование генно-инженерных конструкций, мутагенез последовательностей, работа с бактериальными культурами и эукариотическими культурами, вестерн-блоттинг, полимеразная цепная реакция (ПЦР), киназный эссей, коиммунопреципитация.

Основные положения, выносимые на защиту

1. РОТ10 — самая нестабильная субъединица РВДБ комплекса ремоделирующего хроматин;

2. Изоформы РОТ10 содержат неканонические Р-ТгСР дегроны и деградация РОТ10 происходит с помощью полиубиквитинилирования Р-ТгСР убиквитин-

лигазой и последующего протеолиза 26S протеасомой;

3. Каждая изоформа РОТ10 имеет уникальный характер фосфорилирования, состоящий из нескольких кластеров. Серины 297, 301, 327 и 331 являются ключевыми для фосфорилирования Х-кластера изоформ;

4. Фосфорилирование ключевых аминокислот X—кластера изоформ РОТ10-S осуществляется казеин киназой 1 (СК1) посредством каскадного механизма;

5. Время полужизни изоформ РОТ10 зависит от характера фосфорилирования. Фосфорилирование Х-кластера способствует избирательной стабилизации изоформ.

Личный вклад

В рамках данной работы автор выполнил ключевые эксперименты, включая все вестерн-блот анализы для определения стабильности субъединиц PBAF комплекса и различных изоформ РОТ10. Автор также занимался ведением клеточных культур и проведением количественных анализов экспрессии. В частности, была оценена корреляция между уровнями экспрессии белка Phf10 и экспрессией Mts1/S100A4 в клеточных линиях человека, что подчеркивает его непосредственную роль в выполнении экспериментальной части исследования.

Часть экспериментов, включая иммунопреципитации и киназные эссеи, была спланирована и осуществлена совместно с Виктором Татарским. Автор выражает особую благодарность Виктору за его поддержку и помощь в проведении этих технически сложных экспериментов.

Следует отметить значительный вклад Дмитрия Щербинина, который провел молекулярное моделирование взаимодействий между WD40-доменом и фосфорилированными, а также нефосфорилированными пептидами РОТ10, относящимися к линкерному домену. Понимание молекулярных механизмов этих взаимодействий было критически важно для проекта.

Особая благодарность адресована научному руководителю автора, Наталье Сошниковой, за её руководство и поддержку на всех этапах

исследования.

Степень достоверности и апробация результатов

Полученные результаты находятся в соответствии с результатами, полученными другими авторами. Основные результаты работы докладывались на:

1. Международный форум V Съезд биохимиков России (Дагомыс, 4-9 октября 2016)

2. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2017»

Публикации

Основные результаты по теме диссертации изложены в 6 печатных изданиях 4 из которых изданы в журналах, рекомендованных ВАК, 2 — в тезисах докладов.

Статьи

1. Н.В. Сошникова, Ю.П. Симонов, А.В. Бречалов, Т.Н. Портцева, Е.В. Панкратова и С.Г. Георгиева, "Уровень белка PHF10 - субъединицы хроматинремоделирующего комплекса PBAF - коррелирует с экспрессией Mts1/S100A4 в линиях раковых клеток человека" Доклады Академии наук, vol. 467, no. 1, pp. 162-164, Март. 2016, doi: 10.1134/S1607672916020228.

2. V. V. Tatarskiy, Y. P. Simonov, D. S. Shcherbinin, A. V. Brechalov, S. G. Georgieva, and N. V. Soshnikova, "Stability of the PHF10 subunit of PBAF signature module is regulated by phosphorylation: role of в-TrCP," Sci Rep, vol. 7, no. 1, p. 5645, Jul. 2017, doi: 10.1038/s41598-017-05944-3.

3. Yu. P. Simonov, V. V. Tatarskiy, S. G. Georgieva, and N. V. Soshnikova, "Contact Inhibition of Proliferation Is Accompanied by Expression of the PHF10D Subunit of the Chromatin Remodeling Complex PBAF in Mouse and Human Cell Lines," Dokl Biochem Biophys, vol. 513, no. S1, pp. S18-S22, Dec. 2023, doi: 10.1134/S1607672923700667.

4. Soshnikova NV, Simonov YP, Feoktistov AV, Khamidullina AI, Yastrebova MA, Bayramova DO, Tatarskiy VV, Georgieva SG. "New Approach for Studying of Isoforms and High-Homology Proteins in Mammalian Cells," Int J Mol Sci, vol. 24, no. 15, p. 12153, Jul. 2023, doi: 10.3390/ijms241512153.

Тезисы докладов

1. N.V. Soshnikova, Victor V. Tatarskiy Jr, Yuriy P. Simonov, Dmitriy S. Shcherbinin, Sofia G. Georgieva. Stability of the PHF10 subunit of PBAF signature module is regulated by phosphorylation: role of в-TrCP and CK1.. EMBO Conference: Wnt meeting. 14-17 September 2016. Brno, Chez Republic.

2. Ю.П. Симонов, В.В. Татарский, С.Г. Георгиева, Н.В. Сошникова. Изучение переключения экспрессии изоформ белка PHF10- субъединицы ремоделирующего комплекса PBAFb процессе развития головного мозга мыши, ActaNature, 4-8 октября 2016. Сочи - Дагомыс, Россия.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов и 1 приложения. Полный объём диссертации составляет 140 страницу, включая 30 рисунков и 10 таблиц. Список литературы содержит 216 наименования.

Глава 1. Обзор литературы

Практически все клетки одного организма несут одинаковую генетическую информацию, однако клетки разных тканей отличаются фенотипически и функционально. Эти особенности определяются экспрессией генов, специфической для каждого типа клеток. Во время экспрессии генов информация, закодированная в гене, реализуется в виде функционального продукта этого гена - белка. Регуляция экспрессии генов позволяет клетке приобретать структурные и функциональные особенности, лежащие в основе дифференцировки, морфогенеза и адаптивности организма. В экспрессии гена выделяют несколько последовательных стадий: транскрипция (синтез РНК), сплайсинг и процессинг РНК, трансляция и пострансляционное модифицирование белка. Процесс транскрипции включает в себя инициацию, элонгацию и терминацию. В основном синтез мРНК регулируется на стадии инициации транскрипции [1]. Инициация транскрипции — это сложно регулируемый процесс, который во многом зависит от физической доступности гена и участка, содержащего промотор.

Генетическая информация в ядре эукариотической клетки организована в высоко консервативный ДНК-белковый комплекс, хроматин, который поддерживает и контролирует жизненно важные функции организма. Выделяют хроматин двух типов: эухроматин и гетерохроматин. ДНК, кодирующая гены, подвергающиеся активной транскрипции, менее плотно упакована и ассоциирована с РНК-полимеразой. Этот тип хроматина называют эухроматином. ДНК, которая кодирует неактивные гены, более конденсирована и находится в тесно ассоциированном со структурными белками состоянии, называется гетерохроматином.

1.1.Организация хроматина

Хроматин — это нуклеопротеид, который является основой для хромосом. До сорока процентов хроматина составляют гистоновые белки [2]. Гистоны организуются в нуклеосомы. Именно нуклеосома лежит в основе организации

хроматина.

1.1.1. Нуклеосомы

Нуклеосомы сочетают в себе и структурную и регуляторную функции. Состав нуклеосом и возможные его изменения играют важную роль в жизни клетки.

Все нуклеосомы устроены схожим образом: в состав каждой входит октамер из четырех типов гистонов: Н2Л, Н2В, Н3 и Н4 [2]. Каждый октамер состоит из четырех пар одинаковых гистонов. Канонические гистоны включаются в хроматин исключительно в S-фазе, их экспрессия регулируется клеточным циклом, и они транскрибируются с нескольких генов, обычно организованных в кластеры. Пример организации нуклеосомы показан на Рис. 1.1-1.

Рис. 1.1-1. (А) Структура нуклеосомы вид спереди и сбоку. Гистоны изображены светло-серым цветом, ДНК изображена темно серым цветом с розовым. Синим обозначены базовые аминокислоты, которые находятся на расстоянии 7 А от ДНК. (Б) Схематичное изображение нуклеосомы [3]

Гистон Н1, который так же называют линкерный гистон, соединяется с нуклеосомой ДНК и участвует в образовании 30 нм фибриллы [4]

Изменение нуклеосом ведет к изменению структуры хроматина, а, как следствие, к изменению паттернов экспрессии белков и клеточных генетических

программ. Эти изменения могут касаться реструктурирования нуклеосом: удаление, перемещение, замена всей нуклеосомы или отдельных гистонов; или посттрансляционных модификаций гистонов в составе нуклеосом.

Разнообразие гистонов позволяет поддерживать разные состояния хроматина. Большинство гистонов синтезируются в S фазе для быстрого связывания новосинтезированной ДНК. Кроме того, замена канонических S-фазных гистонов различными вариантами может проходить на других стадиях клеточного цикла. Подобная замена может приводить к специфическому маркированию хроматина. Разные гистоны характерны для разных участков ДНК в различные моменты клеточного цикла. Н3.3 и H2ABBD активирует транскрипцию, Н2АХ ответственен за репарацию ДНК, Н2А — экспрессия генов и сегрегация хроматина.

1.1.2. Взаимодействие нуклеосом в хроматине Между соседними нуклеосомами помещается линкерный участок ДНК (10-50 п.о.). Последовательно расположенные нуклеосомы образуют 10нм фибриллы. Эти нити, сворачиваясь, образуют 30-нм фибриллы [5], которые, организуются в петельные домены (300нм). Петельные домены организуются в конденсированные хромосомы. Взаимодействие между двумя нуклеосомами или между нуклеосомой и ДНК во многом зависит от модификаций нуклеосом. Положение нуклеосомы на ДНК вносит существенный вклад в экспрессию соответствующего гена [6]. Сразу после открытия нуклеосомы рассматривались только как строительные блоки хроматина. Однако позже стало понятно, что нуклеосомы активно участвуют в регуляции экспрессии генов.

1.2. Модификации хвостов гистонов Немаловажную роль в размещении нуклеосом вдоль нити ДНК играют аминокислотные хвосты гистонов, которые выходят из ядра нуклеосомы, минуя ДНК. Полипептидные цепи гистоновых хвостов подвержены ковалентным модификациям. Модификации основных форм гистонов способствую изменению структуры хроматина. Модификации гистонов могут изменять заряд специфических остатков, влияя на взаимодействие гистона с другими гистонами

15

или с ДНК. Модификации также могут служить в качестве сигналов для привлечения различных факторов транскрипции, ремоделеров хроматина и взаимодействующих с ДНК белков, которые управляют различными функциями соседних участков ДНК.

Ферменты, которые узнают модификации гистонов, называют ридерами, а ферменты, которые осуществляют модификации гистонов, - райтерами.

В качестве различных посттрансляционных модификаций (ПТМ) могут выступать ацетилирование, метилирование фосфорилирование, АДФ-рибозилирование, сумоилирование, убиквитинилирование и другие (Рис. 1.2-1).

Например, для лизина определен целый спектр различного типа ацилирований: формилирование [7]; пропионилирование [8]; бутирилирование [8]; кротонилирование [9]; 2-гидроксиизобутирилирование [10]; в-гидроксибутирилиро [11]; сукцинилирование [12]; малонилирование [12]; глутарилирование [13]; и бензоилирование [14]

Основные модификации для Н3 — это ацетилирование остатков лизина 9, 14, 18, 23 и 56; метилирование остатка лизина 2 и аргинина 4, 9, 27, 36, и 79; а также фосфорилирование серинов 10, 28 и треонинов 3 и 11. Гистон Н4 в основном модифицируется ацетилированием лизинов 5, 8, 12 и 16; метилированием аргинина 2 и лизина 20; а также фосфорилированием серина 1.

Различные участки хроматина маркированы разными модификациями гистонов. Для гетерохроматина специфичны такие модификации, как Н3К9те2, Н3К9те3 и Н3К27те3 [15].

О Ацетилирование Метилирование Q Фосфорилирование

Деиминирование ф Убиквитилирование

Рис. 1.2-1. Наиболее распространенные модификации гистонов (URL: https://www.abcam.com/en-it/technical-resources/guides/epigenetics-guide/histone-modifications).

Хроматин, помеченный H3K4me3 и AcH3, значительно коррелируют с транскрипционно активными генами в то время, как метка H3K9acK14ac и H3K27me3 ассоциируется с активными промоторами генов [16], [17].

Одна модификация может приводить к изменению гистона и его окружения. Эта концепция лежит в основе перекрестного взаимодействия между различными модификациями [18].

Метилирование гистонов осуществляется гистонметилтрансферазами (HMTs), которые ковалентно модифицируют специфические остатки лизина и аргинина путем переноса метильных групп из S-аденозил-L-метионина. Метилтрансфераза белок Dot1 (также известный, как KMT4) является

эволюционно консервативным ферментом, который катализирует метилирование гистона Н3 в лизине 79 [19].

Dot1 и триметилирование Н3К79 было обнаружено в транскрибированных областях активных генов [20]. Исследования СЫР-сЫр (иммунопреципитация хроматина в сочетании с экспрессией генов микрочипами) показали, что метилирование Н3К79те2 / те3 сильно коррелирует с активностью генов.

Метилирование Н3К9 рекрутирует гетерохроматиновый белок 1 (НР1) и приводит к сборке компактного или "закрытого" хроматина вокруг ДНК, что приводит к подавлению экспрессии гена [21], [22]. Одинаковые модификации в разных позициях могут по-разному функционировать, так в геноме делящихся дрожжей модификации метилирования Н3К9 концентрируется в области гетерохроматина, в то время как метилирование Н3К4 локализуется в областях эухроматина [23], [24], [25]. Схожим образом метилирование Н3К9 в геномах млекопитающих характеризует отдельные гетерохроматиновые или молчащие эухроматиновые области, в которых отсутствует РНК-полимераза II [26], [27].

Ацетилирование Н3 (Н3ас) и метилирования Н3К4 (Н3К4те) определяют зоны хроматина, с которых проходит стабильная экспрессия [28]. Поли-бромодомены, существующие у субъединицы РВАБ комплекса ВАБ180, различают положение и ацетилирование хвоста гистона Н3[29]. Бромодомен представляет собой эволюционно консерватиный белковый модуль, характерный для многих субъединиц хроматин-ремоделирующего комплекса РВАБ [30]. Бромодомен связывается с ацетил-лизином [31], [32]. За счет этого взаимодействия на промотор генов привлекается весь комплекс РВАБ.

Ацетилирование Н3 и модификации Н3К4те1 вне промоторных областей коррелируют с зонами энхансеров в разных типах клеток [33], [34], [35]. Модификации гистонов Н3К4те1, Н3К4те3 и Н3К27ас одинаково распределены в районе промоторов одинаковых генов разных клеток, но разным образом распределены около энхансеров и за счет этого достигается разные паттерны экспрессии генов [36]. Модификации Н3К4те3 и Н3К27те3 локализуются в регионах, называемых "бивалентными доменами" в

эмбриональных стволовых клетках, которые функционируют при дифференцировке [37]. Несмотря на то, что ЮО метилирование характерно для гетерохроматина, некоторые активные промотеры также обогащены H3K9me3

[38]. В тоже время гистоны H3K36me3 обнаружены у 3' концов активных генов

[39].

Обнаружено, что моно- и триметилирование Ш00 имеют четкое распределение по всему геному. H4K20me3 ассоциирован с гетерохроматином, в то время как гистонами H4K20me1 обогащены промоторные или кодирующие области активных генов [40], [41], [42].

Гистоны H2BK5me1 ассоциируются с активными промоторами ниже начала транскрипции (TSS) (Рис. 1.2-2) [39].

Рис. 1.2-2. Наиболее распространенные модификации гистонов и их распределение относительно старта транскрипции (Position relative to TSS) [39]

Участки генома богатые Н3К27те3 коррелируют с репрессированными генами и встречаются на участках, занятых белками поликомб-группы (PcG), которые являются транскрипционными репрессорами [17], [43], [44]. Участки богатые Н3К27те1 чаще встречаются у активных генов, чем у нетранскрибирующихся [39].

Метилирование Н3К79 участвует в регуляции теломерного глушения,

клеточного развития, клеточного цикла, репарации ДНК и регуляции транскрипции [45].

1.3. Участие нуклеосом в регуляции экспрессии генов

Нуклеосомная организация хроматина влияет на плотность упаковки ДНК, но в то же время нуклеосома может закрывать доступ белков (например, участникам репликации или транскрипции) к ДНК. Удаление (уменьшение количества) нуклеосом наблюдается на всех активных промоторах, однако ни на одном из них удаление не является полным, что свидетельствует о существовании равновесия между удалением хромосом и их восстановлением [46]. С одной стороны, это серьезная проблема, т.к. возникает потребность в ресурсе на перемещение нуклеосом. С другой — эта особенность открывает возможность негативного регулирования экспрессии генов. Вездесущие ги стоны экранируют большую часть нити ДНК, оставляю доступными для белков (транскрипции, репликации, репарации) только целевые зоны. Таким образом снижается вероятность ошибки начала транскрипции и белки репарации быстрее найдут место повреждения ДНК. Этот механизм подтверждается в некоторых исследованиях: например, была показана отрицательная корреляция между обогащением промоторов нуклеосомами и скоростью транскрипции [47].

Модификации гистонов распознаются другими комплексами, работающими с ДНК. Скоординированная работа этих комплексов обеспечивает реализацию генетических программ на уровне хроматина. В зависимости от связывания ответственного за метилирование белка, обе модификации могут распространяться по геному вне зависимости от последовательностей ДНК, что приводит к репрессии генов только в модифицированных областях [48], [49], [50].

Варианты гистонов отличаются аминокислотной последовательностью. Замена вариантов гистонов осуществляется ремоделирующими хроматин комплексами. Экспрессия гистонов очень точно настроена и коррелирует с клеточным циклом. Также известно, что во время транскрипции нуклеосомы удаляются с участков транскрибируемых генов, это было показано с помощью

21

экспрессии гистонов с флуоресцентной меткой (GFP) [51]. Этот эксперимент показал скорость смены гистонов. Гистоны H3 и H4 нелегко заменить. В то время, как гистоны H2A и H2B показали высокую скорость замены [52]. Считается, что для правильного размещения нуклеосом в области активной репликации необходимо ацелирование лизинов 5 и 12 N-концевого хвоста гистона H4 [53]. Однако есть гистоны, которые не подлежат этой регулировке, эти варианты гистонов экспрессируются с так называемых одиночных генов. Эти гистоны экспрессируются всегда, даже после завершения клеточного цикла. Для дополнительного уплотнения хроматина существует линкерный гистон H1, у высших эукариот обнаружено восемь изоформ [54].

Еще в 2004 году было известно положение только нескольких нуклеосом, тем не менее, уже было показано, что в зонах активных генов и в активных регуляторных элементах концентрация нуклеосом снижена по всему геному Saccharomyces cerevisiae in vivo. Также установлено, что при быстром митотическом росте уровень заполняемости нуклеосом обратно пропорционален скорости инициирования транскрипции в промоторе. Кроме этого, уже были найдены некоторые специфические особенности разных гистонов. Например, было показано уменьшение концентрации H3 и H4 гистонов в кодирующих областях наиболее сильно транскрибируемых генов Saccharomyces cerevisiae. Была открыта еще одна интересная особенность распределения нуклеосом по геному: изменения в транскрипции, вызванные тепловым шоком или сменой источника углерода, сопровождаются повышение концентрации нуклеосом в областях репрессированных промоторов и снижению в областях промоторов генов, которые стали активными [47], [55].

1.4. Классификация ремоделирующих комплексов

Структура хроматина существенно влияет на экспрессию генов. Процессы, меняющие структуру хроматина и приводящие к изменениям в экспрессии генов, называются эпигенетическими. На настоящий момент выделяют два тесно связанных между собой эпигенетических процесса: ковалентные модификации гистонов и ДНК и АТФ-зависимое ремоделирование хроматина.

22

Под ремоделированием хроматина понимают любое изменение взаимодействия ДНК с гистонами:

• разборка хроматина перед репликацией,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Симонов Юрий Петрович, 2024 год

Список литературы

[1] G. M. Cooper., The Cell, 2nd edition. 2000. [Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9839/

[2] M. A. Ricci, C. Manzo, M. F. Garc??a-Parajo, M. Lakadamyali, and M. P. Cosma, "Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo," Cell, vol. 160, no. 6, pp. 1145-1158, 2015, doi: 10.1016/j.cell.2015.01.054.

[3] C. Jiang and B. F. Pugh, "Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics.," Nat Rev Genet, vol. 10, no. 3, pp. 161-72, Mar. 2009, doi: 10.1038/nrg2522.

[4] P. J. J. Robinson and D. Rhodes, "Structure of the '30 nm' chromatin fibre: A key role for the linker histone," Current Opinion in Structural Biology. 2006. doi: 10.1016/j.sbi.2006.05.007.

[5] G. Längst and P. B. Becker, "Nucleosome mobilization and positioning by ISWI-containing chromatin-remodeling factors.," J Cell Sci, vol. 114, no. Pt 14, pp. 2561-2568, 2001.

[6] T. J. Richmond and C. A. Davey, "The structure of DNA in the nucleosome core," Nature, vol. 423, no. 6936, pp. 145-150, 2003, doi: 10.1038/nature01595.

[7] T. Jiang, X. Zhou, K. Taghizadeh, M. Dong, and P. C. Dedon, "N-formylation of lysine in histone proteins as a secondary modification arising from oxidative DNA damage," Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, doi: 10.1073/pnas.0606775103.

[8] Y. Chen et al., "Lysine propionylation and butyrylation are novel post-translational modifications in histones," Molecular and Cellular Proteomics, 2007, doi: 10.1074/mcp.M700021-MCP200.

[9] M. Tan et al., "Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification," Cell, 2011, doi: 10.1016/j.cell.2011.08.008.

[10] L. Dai et al., "Lysine 2-hydroxyisobutyrylation is a widely distributed active histone mark," Nat Chem Biol, 2014, doi: 10.1038/nchembio.1497.

[11] Z. Xie et al., "Metabolic Regulation of Gene Expression by Histone Lysine P-Hydroxybutyrylation,"Mol Cell, 2016, doi: 10.1016/j.molcel.2016.03.036.

[12] Z. Xie et al., "Lysine succinylation and lysine malonylation in histones," in Molecular and Cellular Proteomics, 2012. doi: 10.1074/mcp.M111.015875.

[13] M. Tan et al., "Lysine glutarylation is a protein posttranslational modification regulated by SIRT5," CellMetab, 2014, doi: 10.1016/j.cmet.2014.03.014.

[14] H. Huang et al., "Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2," Nat Commun, 2018, doi: 10.1038/s41467-018-05567-w.

[15] P. V Kharchenko et al., "Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster," Nature, 2011, doi: 10.1038/nature09725.

[16] L. Tserel et al., "Genome-wide promoter analysis of histone modifications in human monocyte-derived antigen presenting cells," BMC Genomics, 2010, doi: 10.1186/1471-2164-11-642.

[17] T. Y. Roh, S. Cuddapah, K. Cui, and K. Zhao, "The genomic landscape of histone modifications in human T cells," Proc Natl Acad Sci US A, 2006, doi: 10.1073/pnas.0607617103.

[18] S. L. Berger, "The complex language of chromatin regulation during transcription," Nature. 2007. doi: 10.1038/nature05915.

[19] M. S. Singer et al., "Identification of high-copy disruptors of telomeric silencing in Saccharomyces cerevisiae," Genetics, 1998.

[20] H. H. Ng, D. N. Ciccone, K. B. Morshead, M. A. Oettinger, and K. Struhl, "Lysine-79 of histone H3 is hypomethylated at silenced loci in yeast and mammalian cells: A potential mechanism for position-effect variegation," Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, doi: 10.1073/pnas.0437846100.

[21] A. J. Bannister et al., "Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain," Nature, 2001, doi: 10.1038/35065138.

[22] M. Lachner, D. O'Carroll, S. Rea, K. Mechtler, and T. Jenuwein, "Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins," Nature, 2001, doi: 10.1038/35065132.

[23] K. I. Noma, C. D. Allis, and S. I. S. Grewal, "Transitions in distinct histone H3

methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries," Science (1979), 2001, doi: 10.1126/science .1064150.

[24] P. J. Verschure et al., "In Vivo HP1 Targeting Causes Large-Scale Chromatin Condensation and Enhanced Histone Lysine Methylation," Mol Cell Biol, 2005, doi: 10.1128/mcb.25.11.4552-4564.2005.

[25] K. Ayyanathan et al., "Regulated recruitment of HP1 to a euchromatic gene induces mitotically heritable, epigenetic gene silencing: A mammalian cell culture model of gene variegation," GenesDev, 2003, doi: 10.1101/gad.1102803.

[26] A. H. F. M. Peters et al., "Partitioning and Plasticity of Repressive Histone Methylation States in Mammalian Chromatin," Mol Cell, 2003, doi: 10.1016/S1097-2765(03)00477-5.

[27] J. C. Rice et al., "Histone Methyltransferases Direct Different Degrees of Methylation to Define Distinct Chromatin Domains," Mol Cell, 2003, doi: 10.1016/S1097-2765(03)00479-9.

[28] C. Yan and D. D. Boyd, "Histone H3 Acetylation and H3 K4 Methylation Define Distinct Chromatin Regions Permissive for Transgene Expression," Mol Cell Biol, 2006, doi: 10.1128/mcb.00311-06.

[29] R. Chandrasekaran and M. Thompson, "Polybromo-1-bromodomains bind histone H3 at specific acetyl-lysine positions," Biochem Biophys Res Commun, 2007, doi: 10.1016/j.bbrc.2007.01.193.

[30] P. J. Horn and C. L. Peterson, "The bromodomain: a regulator of ATP-dependent chromatin remodeling?," Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 2001. doi: 10.2741/horn.

[31] L. Zeng and M. M. Zhou, "Bromodomain: An acetyl-lysine binding domain," FEBSLett, 2002, doi: 10.1016/S0014-5793(01)03309-9.

[32] Z. Charlop-Powers, L. Zeng, Q. Zhang, and M. M. Zhou, "Structural insights into selective histone H3 recognition by the human Polybromo bromodomain 2," Cell Res, 2010, doi: 10.1038/cr.2010.43.

[33] N. D. Heintzman et al., "Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome," Nat Genet, 2007,

doi: 10.1038/ng1966.

[34] T. Y. Roh, S. Cuddapah, and K. Zhao, "Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping," Genes Dev, 2005, doi: 10.1101/gad.1272505.

[35] T. Y. Roh, G. Wei, C. M. Farrell, and K. Zhao, "Genome-wide prediction of conserved and nonconserved enhancers by histone acetylation patterns," Genome Res, 2007, doi: 10.1101/gr.5767907.

[36] N. D. Heintzman et al., "Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression," Nature, 2009, doi: 10.1038/nature07829.

[37] B. E. Bernstein et al., "A Bivalent Chromatin Structure Marks Key Developmental Genes in Embryonic Stem Cells," Cell, 2006, doi: 10.1016/j.cell.2006.02.041.

[38] S. L. Squazzo et al., "Suz12 binds to silenced regions of the genome in a cell-type-specific manner," Genome Res, 2006, doi: 10.1101/gr.5306606.

[39] A. Barski et al., "High-Resolution Profiling of Histone Methylations in the Human Genome," Cell, 2007, doi: 10.1016/j.cell.2007.05.009.

[40] G. Schotta et al., "A silencing pathway to induce H3-K9 and H4-K20 trimethylation at constitutive heterochromatin," Genes Dev, 2004, doi: 10.1101/gad.300704.

[41] H. Talasz, H. H. Lindner, B. Sarg, and W. Helliger, "Histone H4-lysine 20 monomethylation is increased in promoter and coding regions of active genes and correlates with hyperacetylation," Journal of Biological Chemistry, 2005, doi: 10.1074/jbc.M505563200.

[42] C. R. Vakoc, M. M. Sachdeva, H. Wang, and G. A. Blobel, "Profile of Histone Lysine Methylation across Transcribed Mammalian Chromatin," Mol Cell Biol, 2006, doi: 10.1128/mcb.01529-06.

[43] L. A. Boyer et al., "Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells," Nature, 2006, doi: 10.1038/nature04733.

[44] T. I. Lee et al., "Control of Developmental Regulators by Polycomb in Human Embryonic Stem Cells," Cell, 2006, doi: 10.1016/j.cell.2006.02.043.

[45] F. Van Leeuwen, P. R. Gafken, and D. E. Gottschling, "Dot1p modulates silencing in yeast by methylation of the nucleosome core," Cell, 2002, doi: 10.1016/S0092-8674(02)00759-6.

[46] H. Boeger, J. Griesenbeck, J. S. Strattan, and R. D. Kornberg, "Nucleosomes unfold completely at a transcriptionally active promoter," Mol Cell, 2003, doi: 10.1016/S1097-2765(03)00231-4.

[47] B. E. Bernstein, C. L. Liu, E. L. Humphrey, E. O. Perlstein, and S. L. Schreiber, "Global nucleosome occupancy in yeast," Genome Biol, 2004, doi: 10.1186/gb-2004-5-9-r62.

[48] J. D. Robin et al., "Telomere position effect: Regulation of gene expression with progressive telomere shortening over long distances," Genes Dev, 2014, doi: 10.1101/gad.251041.114.

[49] S. C. R. Elgin and G. Reuter, "Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila," Cold Spring Harb Perspect Biol, 2013, doi: 10.1101/cshperspect.a017780.

[50] P. N. C. B. Audergon et al., "Restricted epigenetic inheritance of H3K9 methylation," Science (1979), 2015, doi: 10.1126/science.1260638.

[51] V. Jackson, "In Vivo Studies on the Dynamics of Histone-DNA Interaction: Evidence for Nucleosome Dissolution during Replication and Transcription and a Low Level of Dissolution Independent of Both," Biochemistry, 1990, doi: 10.1021/bi00455a019.

[52] H. Kimura and P. R. Cook, "Kinetics of core histones in living human cells: Little exchange of H3 and H4 and some rapid exchange of H2B," Journal of Cell Biology, 2001, doi: 10.1083/jcb.153.7.1341.

[53] S. B. Smith S, "Stepwise assembly of chromatin during DNA replication in vitro.," EMBO J, 1991, doi: 10.1007/s00018-014-1748-3.

[54] S. Kimmins and P. Sassone-Corsi, "Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells," Nature. 2005. doi: 10.1038/nature03368.

[55] C. K. Lee, Y. Shibata, B. Rao, B. D. Strahl, and J. D. Lieb, "Evidence for nucleosome depletion at active regulatory regions genome-wide," Nat Genet,

2004, doi: 10.1038/ng1400.

[56] C. D. Curtis, R. B. Davis, K. G. Ingram, and C. T. Griffin, "Chromatin-remodeling complex specificity and embryonic vascular development," Cellular and Molecular Life Sciences, 2012, doi: 10.1007/s00018-012-1023-4.

[57] S. Khorasanizadeh, "The Nucleosome: From Genomic Organization to Genomic Regulation," Cell. 2004. doi: 10.1016/S0092-8674(04)00044-3.

[58] C. Muchardt and M. Yaniv, "When the SWI/SNF complex remodels...the cell cycle.," Oncogene, vol. 20, no. 24, pp. 3067-3075, 2001, doi: 10.1038/sj.onc.1204331.

[59] C. Müller and a Leutz, "Chromatin remodeling in development and differentiation.," Curr Opin Genet Dev, vol. 11, no. 2, pp. 167-174, 2001, doi: 10.1016/S0959-437X(00)00175-1.

[60] D. C. Hargreaves and G. R. Crabtree, "ATP-dependent chromatin remodeling: Genetics, genomics and mechanisms," Cell Res, 2011, doi: 10.1038/cr.2011.32.

[61] W. Wang, Y. Xue, S. Zhou, A. Kuo, B. R. Cairns, and G. R. Crabtree, "Diversity and specialization of mammalian complexes," Genes Dev, vol. 4, no. 17, pp. 2117-2130, 1996, doi: 10.1101/gad.10.17.2117.

[62] N. Mashtalir et al., "Modular Organization and Assembly of SWI/SNF Family Chromatin Remodeling Complexes," Cell, 2018, doi: 10.1016/j.cell.2018.09.032.

[63] "SWI/SNF Infobase-An exclusive information portal for SWI/SNF remodeling complex subunits," PLoS One, 2017, doi: 10.1371/journal.pone.0184445.

[64] J. Chen and T. K. Archer, "Regulating SWI/SNF Subunit Levels via ProteinProtein Interactions and Proteasomal Degradation : BAF155 and BAF170 Limit Expression of BAF57 Regulating SWI / SNF Subunit Levels via Protein-Protein Interactions and Proteasomal Degradation : BAF155 and BA," Mol Cell Biol, vol. 25, no. 20, pp. 9016-9027, 2005, doi: 10.1128/MCB.25.20.9016-9027.2005.

[65] D. H. Sohn et al., "SRG3 interacts directly with the major components of the SWI/SNF chromatin remodeling complex and protects them from proteasomal degradation," Journal of Biological Chemistry, 2007, doi:

10.1074/jbc.M610563200.

[66] M. L. Phelan, S. Sif, G. J. Narlikar, and R. E. Kingston, "Reconstitution of a core chromatin remodeling complex from SWI/SNF subunits," Mol Cell, 1999, doi: 10.1016/S1097-2765(00)80315-9.

[67] K. Goljanek-Whysall, G. F. Mok, A. F. Alrefaei, N. Kennerley, G. N. Wheeler, and A. Münsterberg, "myomiR-dependent switching of BAF60 variant incorporation into Brg1 chromatin remodeling complexes during embryo myogenesis," Development (Cambridge), 2014, doi: 10.1242/dev.108787.

[68] L. Mohrmann and C. P. Verrijzer, "Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes," Biochimica et Biophysica Acta - Gene Structure and Expression. 2005. doi: 10.1016/j.bbaexp.2004.10.005.

[69] L. Mohrmann, K. Langenberg, J. Krijgsveld, A. J. Kal, A. J. R. Heck, and C. P. Verrijzer, "Differential Targeting of Two Distinct SWI/SNF-Related Drosophila Chromatin-Remodeling Complexes," Mol Cell Biol, 2004, doi: 10.1128/mcb.24.8.3077-3088.2004.

[70] J. Masliah-Planchon, I. Bièche, J.-M. Guinebretière, F. Bourdeaut, and O. Delattre, "SWI/SNF Chromatin Remodeling and Human Malignancies," Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease, 2015, doi: 10.1146/annurev-pathol-012414-040445.

[71] Y. M. Moshkin, L. Mohrmann, W. F. J. van Ijcken, and C. P. Verrijzer, "Functional Differentiation of SWI/SNF Remodelers in Transcription and Cell Cycle Control," Mol Cell Biol, 2007, doi: 10.1128/mcb.01257-06.

[72] G. E. Chalkley et al., "The Transcriptional Coactivator SAYP Is a Trithorax Group Signature Subunit of the PBAP Chromatin Remodeling Complex," Mol Cell Biol, 2008, doi: 10.1128/MCB.02217-07.

[73] A. V Brechalov, S. G. Georgieva, and N. V Soshnikova, "Mammalian cells contain two functionally distinct PBAF complexes incorporating different isoforms of PHF10 signature subunit," Cell Cycle. 2014. doi: 10.4161/cc.28922.

[74] N. E. Vorobyeva et al., "Transcription coactivator SAYP combines chromatin remodeler Brahma and transcription initiation factor TFIID into a single

supercomplex," Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, doi: 10.1073/pnas.0901801106.

[75] J. Lessard et al., "An Essential Switch in Subunit Composition of a Chromatin Remodeling Complex during Neural Development," Neuron, vol. 55, no. 2, pp. 201-215, 2007, doi: 10.1016/j.neuron.2007.06.019.

[76] C. Kadoch et al., "Proteomic and bioinformatic analysis of mammalian SWI/SNF complexes identifies extensive roles in human malignancy," Nat Genet, 2013, doi: 10.1038/ng.2628.

[77] P. Filippakopoulos et al., "Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family," Cell, 2012, doi: 10.1016/j.cell.2012.02.013.

[78] J. Yuan, K. Chen, W. Zhang, and Z. Chen, "Structure of human chromatin-remodelling PBAF complex bound to a nucleosome," Nature, vol. 605, no. 7908, pp. 166-171, May 2022, doi: 10.1038/s41586-022-04658-5.

[79] R. Archacki et al., "Arabidopsis SWI/SNF chromatin remodeling complex binds both promoters and terminators to regulate gene expression," Nucleic Acids Res, vol. 45, no. 6, pp. 3116-3129, 2016, doi: 10.1093/nar/gkw1273.

[80] J. Hsieh and F. H. Gage, "Epigenetic control of neural stem cell fate," Current Opinion in Genetics and Development. 2004. doi: 10.1016/j.gde.2004.07.006.

[81] J. Hsieh and F. H. Gage, "Chromatin remodeling in neural development and plasticity," Current Opinion in Cell Biology. 2005. doi: 10.1016/j.ceb.2005.09.002.

[82] N. V. Soshnikova et al., "A novel chromatin-remodeling complex variant, dcPBAF, is involved in maintaining transcription in differentiated neurons," Front Cell Dev Biol, vol. 11, Nov. 2023, doi: 10.3389/fcell.2023.1271598.

[83] L. Ho et al., "An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency," Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, doi: 10.1001/jama.1985.03360200040010.

[84] R. Banerjee et al., "Non-targeted metabolomics of Brg1/Brm double-mutant cardiomyocytes reveals a novel role for SWI/SNF complexes in metabolic

homeostasis," Metabolomics, 2015, doi: 10.1007/sll306-015-0786-7.

[85] B. G. Wilson and C. W. M. Roberts, "SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer," Nature Reviews Cancer. 2011. doi: 10.1038/nrc3068.

[86] A. H. Shain and J. R. Pollack, "The Spectrum of SWI/SNF Mutations, Ubiquitous in Human Cancers," PLoS One, 2013, doi: 10.1371/journal.pone.0055119.

[87] J. A. Biegel, T. M. Busse, and B. E. Weissman, "SWI/SNF chromatin remodeling complexes and cancer," Am J Med Genet C Semin Med Genet, 2014, doi: 10.1002/ajmg.c.31410.

[88] B. Weissman and K. E. Knudsen, "Hijacking the chromatin remodeling machinery: Impact of SWI/SNF perturbations in cancer," Cancer Research. 2009. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-2166.

[89] I. Versteege et al., "Truncating mutations of hSNF5/INI1 in aggressive paediatric cancer," Nature, 1998, doi: 10.1038/28212.

[90] L. Li et al., "Concurrent loss of INI1, PBRM1, and BRM expression in epithelioid sarcoma: Implications for the cocontributions of multiple SWI/SNF complex members to pathogenesis," Hum Pathol, 2014, doi: 10.1016/j.humpath.2014.06.027.

[91] G. Papp et al., "SMARCB1 protein and mRNA loss is not caused by promoter and histone hypermethylation in epithelioid sarcoma," Modern Pathology, 2013, doi: 10.1038/modpathol.2012.190.

[92] A. Klochendler-Yeivin, L. Fiette, J. Barra, C. Muchardt, C. Babinet, and M. Yaniv, "The murine SNF5/INI1 chromatin remodeling factor is essential for embryonic development and tumor suppression," EMBO Rep, 2000, doi: 10.1093/embo-reports/kvd129.

[93] M. J. Smith et al., "Loss-of-function mutations in SMARCE1 cause an inherited disorder of multiple spinal meningiomas," Nat Genet, 2013, doi: 10.1038/ng.2552.

[94] I. Varela et al., "Exome sequencing identifies frequent mutation of the SWI/SNF complex gene PBRM1 in renal carcinoma," Nature, 2011, doi: 10.1038/nature09639.

[95] K. Misumi et al., "Intrahepatic cholangiocarcinoma frequently shows loss of BAP1 and PBRM1 expression, and demonstrates specific clinicopathological and genetic characteristics with BAP1 loss," Histopathology, 2017, doi: 10.1111/his.13127.

[96] M. Li et al., "Inactivating mutations of the chromatin remodeling gene ARID2 in hepatocellular carcinoma," Nat Genet, 2011, doi: 10.1038/ng.903.

[97] E. Hodis et al., "A landscape of driver mutations in melanoma," Cell, 2012, doi: 10.1016/j.cell.2012.06.024.

[98] G. Manceau et al., "Recurrent inactivating mutations of ARID2 in non-small cell lung carcinoma," Int J Cancer, 2013, doi: 10.1002/ijc.27900.

[99] K. C. Wiegand et al., "ARID1A mutations in endometriosis-associated ovarian carcinomas.," N Engl J Med, 2010, doi: 10.1056/NEJMoa1008433.

[100] Y. Gui et al., "Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cell carcinoma of the bladder," Nat Genet, 2011, doi: 10.1038/ng.907.

[101] K. C. Wiegand et al., "Loss of BAF250a (ARID1A) is frequent in high-grade endometrial carcinomas," Journal of Pathology, 2011, doi: 10.1002/path.2911.

[102] S. Seo, "The SWI/SNF chromatin remodeling protein Brg1 is required for vertebrate neurogenesis and mediates transactivation of Ngn and NeuroD," Development, 2004, doi: 10.1242/dev.01548.

[103] G. Liu et al., "BRM promoter polymorphisms and survival of advanced non-small cell lung cancer patients in the princess Margaret cohort and CCTG BR.24 trial," Clinical Cancer Research, 2017, doi: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1640.

[104] S. Glaros, G. M. Cirrincione, C. Muchardt, C. G. Kleer, C. W. Michael, and D. Reisman, "The reversible epigenetic silencing of BRM: Implications for clinical targeted therapy," Oncogene, 2007, doi: 10.1038/sj.onc.1210514.

[105] B. Kahali et al., "The silencing of the SWI/SNF subunit and anticancer gene BRM in Rhabdoid tumors," Oncotarget, 2014, doi: 10.18632/oncotarget.1945.

[106] A. N. Karnezis et al., "Dual loss of the SWI/SNF complex ATPases SMARCA4/BRG1 and SMARCA2/BRM is highly sensitive and specific for small cell carcinoma of the ovary, hypercalcaemic type," Journal of Pathology,

2016, doi: 10.1002/path.4633.

[107] D. N. Reisman, J. Sciarrotta, W. Wang, W. K. Funkhouser, and B. E. Weissman, "Loss of BRG1/BRM in human lung cancer cell lines and primary lung cancers: correlation with poor prognosis.," Cancer Res, 2003.

[108] N. Yamamichi et al., "Frequent loss of Brm expression in gastric cancer correlates with histologic features and differentiation state," Cancer Res, 2007, doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-2601.

[109] E. Herpel et al., "SMARCA4 and SMARCA2 deficiency in non-small cell lung cancer: immunohistochemical survey of 316 consecutive specimens," Ann Diagn Pathol, 2017, doi: 10.1016/j.anndiagpath.2016.10.006.

[110] E. Gunduz et al., "Genetic and epigenetic alterations of BRG1 promote oral cancer development.," Int J Oncol, 2005.

[111] M. Endo et al., "Alterations of the SWI/SNF chromatin remodelling subunit-BRG1 and BRM in hepatocellular carcinoma," Liver International, 2013, doi: 10.1111/liv.12005.

[112] S. Heeb0ll et al., "SMARCC1 expression is upregulated in prostate cancer and positively correlated with tumour recurrence and dedifferentiation," Histol Histopathol, 2008.

[113] S. Savas and G. Skardasi, "The SWI/SNF complex subunit genes: Their functions, variations, and links to risk and survival outcomes in human cancers," Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2018. doi: 10.1016/j.critrevonc.2018.01.009.

[114] R. A. Sturm, G. Das, and W. Herr, "The ubiquitous octamer-binding protein Oct-1 contains a POU domain with a homeo box subdomain.," Genes Dev, 1988, doi: 10.1101/gad.2.12a.1582.

[115] A. G. Stepchenko, "The nucleotide sequence of mouse OCT-1 cDNA," Nucleic Acids Research. 1992. doi: 10.1093/nar/20.6.1419.

[116] N. N. Luchina, I. V Krivega, and E. V Pankratova, "Human Oct-1L isoform has tissue-specific expression pattern similar to Oct-2," Immunol Lett, 2003, doi: 10.1016/S0165-2478(02)00179-7.

[117] E. V Sytina and E. V Pankratova, "[Oct-1 transcription factor-plasticity and polyfunctionality]," Molekuliarnaia biologiia, 2003.

[118] I. D. Krylova, T. N. Portseva, S. G. Georgieva, A. G. Stepchenko, and E. V Pankratova, "[The new isoform of Oct-1 transcription factor is transcribed from alternative promoter].," Molekuliarnaia biologiia, 2013, doi: 10.7868/S0026898413040083.

[119] F. Bentrari, A. Chantome, A. Knights, J. F. Jeannin, and A. Pance, "Oct-2 forms a complex with Oct-1 on the iNOS promoter and represses transcription by interfering with recruitment of RNA PolII by Oct-1," Nucleic Acids Res, 2015, doi: 10.1093/nar/gkv829.

[120] N. E. Vorobyeva, J. V Nikolenko, E. N. Nabirochkina, A. N. Krasnov, Y. V Shidlovskii, and S. G. Georgieva, "SAYP and Brahma are important for 'repressive' and 'transient' Pol II pausing," Nucleic Acids Res, 2012, doi: 10.1093/nar/gks472.

[121] C. Choudhary et al., "Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions," Science (1979), 2009, doi: 10.1126/science.1175371.

[122] K. S. Fritz, J. J. Galligan, M. D. Hirschey, E. Verdin, and D. R. Petersen, "Mitochondrial acetylome analysis in a mouse model of alcohol-induced liver injury utilizing SIRT3 knockout mice," in Journal of Proteome Research, 2012. doi: 10.1021/pr2008384.

[123] S. Zhao et al., "Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation," Science (1979), 2010, doi: 10.1126/science.1179689.

[124] A. G. Beck-Sickinger and K. Mörl, "Posttranslational Modification of Proteins. Expanding Nature's Inventory. By Christopher T. Walsh.," Angewandte Chemie International Edition, 2006, doi: 10.1002/anie.200585363.

[125] H. L. Schubert, R. M. Blumenthal, and X. Cheng, "1 Protein methyltransferases: Their distribution among the five structural classes of adomet-dependent methyltransferases," Enzymes (Essen), 2006, doi: 10.1016/S1874-6047(06)80003-X.

[126] S. I. S. Grewal and J. C. Rice, "Regulation of heterochromatin by histone methylation and small RNAs," Current Opinion in Cell Biology. 2004. doi: 10.1016/j.ceb.2004.04.002.

[127] J. Nakayama, J. C. Rice, B. D. Strahl, C. D. Allis, and S. I. S. Grewal, "Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly," Science (1979), 2001, doi: 10.1126/science.1060118.

[128] W. Xu et al., "Global profiling of crotonylation on non-histone proteins," Cell Research. 2017. doi: 10.1038/cr.2017.60.

[129] M. W. G. De Bolster, "Glossary of terms used in bioinorganic chemistry (IUPAC Recommendations 1997)," Pure and Applied Chemistry, 1997, doi: 10.1351/pac199769061251.

[130] G. Manning, G. D. Plowman, T. Hunter, and S. Sudarsanam, "Evolution of protein kinase signaling from yeast to man," Trends in Biochemical Sciences. 2002. doi: 10.1016/S0968-0004(02)02179-5.

[131] S. B. Quintaje and S. Orchard, "The Annotation of Both Human and Mouse Kinomes in UniProtKB/Swiss-Prot," Molecular & Cellular Proteomics, 2008, doi: 10.1074/mcp.R700001 -MCP200.

[132] B. E. Kemp, D. B. Bylund, T. S. Huang, and E. G. Krebs, "Substrate specificity of the cyclic AMP-dependent protein kinase.," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 72, no. 9, pp. 3448-3452, 1975, doi: 10.1073/pnas.72.9.3448.

[133] R. B. Pearson and B. E. Kemp, "Protein Kinase Phosphorylation Site Sequences and Consensus Specificity Motifs: Tabulations," Methods Enzymol, 1991, doi: 10.1016/0076-6879(91)00127-1.

[134] Y. J. D. Daile P Carnegie PR, "Synthetic substrate for cyclic AMP-dependent protein kinase," Nature, 1975.

[135] L. A. Pinna and M. Ruzzene, "How do protein kinases recognize their substrates?," Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1996. doi: 10.1016/S0167-4889(96)00083-3.

[136] J. V Olsen et al., "Global, In Vivo, and Site-Specific Phosphorylation Dynamics in Signaling Networks," Cell, 2006, doi: 10.1016/j.cell.2006.09.026.

[137] P. Kumar et al., "Multisite phosphorylation disrupts arginine-glutamate salt bridge networks required for binding of cytoplasmic linker-associated protein 2 (CLASP2) to end-binding protein 1 (EB1)," Journal of Biological Chemistry, 2012, doi: 10.1074/jbc.M111.316661.

[138] R. Schweiger and M. Linial, "Cooperativity within proximal phosphorylation sites is revealed from large-scale proteomics data," Biol Direct, 2010, doi: 10.1186/1745-6150-5-6.

[139] H. Van Attikum and S. M. Gasser, "The histone code at DNA breaks: A guide to repair?," Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2005. doi: 10.1038/nrm1737.

[140] A. T. Y. Lau et al., "Phosphorylation of histone H2B serine 32 is linked to cell transformation," Journal of Biological Chemistry, 2011, doi: 10.1074/jbc.M110.215590.

[141] D. N. Chadee et al., "Increased Ser-10 phosphorylation of histone H3 in mitogen-stimulated and oncogene-transformed mouse fibroblasts," Journal of Biological Chemistry, 1999, doi: 10.1074/jbc.274.35.24914.

[142] H. S. Choi et al., "Phosphorylation of histone H3 at serine 10 is indispensable for neoplastic cell transformation," Cancer Res, 2005, doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-0197.

[143] Y. Wei, C. A. Mizzen, R. G. Cook, M. A. Gorovsky, and C. D. Allis, "Phosphorylation of histone H3 at serine 10 is correlated with chromosome condensation during mitosis and meiosis in Tetrahymena," Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, doi: 10.1073/pnas.95.13.7480.

[144] D. M. Sauvé, H. J. Anderson, J. M. Ray, W. M. James, and M. Roberge, "Phosphorylation-induced rearrangement of the histone H3 NH2-terminal domain during mitotic chromosome condensation," Journal of Cell Biology, 2000, doi: 10.1083/jcb.145.2.225.

[145] A.-E. de la Barre, "Core histone N-termini play an essential role in mitotic chromosome condensation," EMBO J, 2000, doi: 10.1093/emboj/19.3.379.

[146] Y. Wei, L. Yu, J. Bowen, M. A. Gorovsky, and C. David Allis, "Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation,"

Cell, 1999, doi: 10.1016/S0092-8674(00)80718-7.

[147] M. M. Gromiha, R. Nagarajan, and S. Selvaraj, "Protein structural bioinformatics: An overview," in Encyclopedia of Bioinformatics and Computational Biology: ABC of Bioinformatics, 2018. doi: 10.1016/B978-0-12-809633-8.20278-1.

[148] N. J. Maclaine and T. R. Hupp, "The regulation of p53 by phosphorylation: a model for how distinct signals integrate into the p53 pathway.," Aging, 2009, doi: 10.18632/aging. 100047.

[149] J. C. Ferreon, C. W. Lee, M. Arai, M. A. Martinez-Yamout, H. J. Dyson, and P. E. Wright, "Cooperative regulation of p53 by modulation of ternary complex formation with CBP/p300 and HDM2," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 106, no. 16, pp. 6591-6596, 2009, doi: 10.1073/pnas.0811023106.

[150] H. Inuzuka et al., "Phosphorylation by Casein Kinase I promotes the turnover of the Mdm2 oncoprotein via the SCF0-TRCP ubiquitin ligase," Cancer Cell, 2010, doi: 10.1016/j.ccr.2010.06.015.

[151] M. Yada et al., "Phosphorylation-dependent degradation of c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7," EMBO Journal, 2004, doi: 10.1038/sj.emboj.7600217.

[152] M. Karin and Y. Ben-Neriah, "Phosphorylation Meets Ubiquitination: The Control of NF-kB Activity," Annu Rev Immunol, 2000, doi: 10.1146/annurev.immunol. 18.1.621.

[153] J. R. Burke, A. J. Deshong, J. G. Pelton, and S. M. Rubin, "Phosphorylation-induced conformational changes in the retinoblastoma protein inhibit E2F transactivation domain binding," Journal of Biological Chemistry, vol. 285, no. 21, pp. 16286-16293, 2010, doi: 10.1074/jbc.M110.108167.

[154] D. Gao, H. Inuzuka, A. Tseng, R. Y. Chin, A. Toker, and W. Wei, "Phosphorylation by Akt1 promotes cytoplasmic localization of Skp2 and impairs APCCdh1-mediated Skp2 destruction," Nat Cell Biol, 2009, doi: 10.1038/ncb1847.

[155] H. Okamura et al., "Concerted dephosphorylation of the transcription factor

NFAT1 induces a conformational switch that regulates transcriptional activity," Mol Cell, 2000, doi: 10.1016/S1097-2765(00)00053-8.

[156] J. D. Nardozzi, K. Lott, and G. Cingolani, "Phosphorylation meets nuclear import: A review," Cell Communication and Signaling. 2010. doi: 10.1186/1478-811X-8-32.

[157] R. Lin, P. Beauparlant, C. Makris, S. Meloche, and J. Hiscott, "Phosphorylation of IkappaBalpha in the C-terminal PEST domain by casein kinase II affects intrinsic protein stability.," Mol Cell Biol, 1996, doi: 10.1128/mcb.16.4.1401.

[158] "A Conserved Docking Motif for CK1 Binding Controls the Nuclear Localization of NFAT1," Mol Cell Biol, 2004, doi: 10.1128/mcb.24.10.4184-4195.2004.

[159] Y. Kato, R. Tapping, S. Huang, and M. Watson, "Bmk1/Erk5 is required for cell proliferation induced by epidermal growth factor," Nature, vol. 395, no. October, pp. 713-716, 1998, doi: 10.1038/27234.

[160] S. Kamakura, T. Moriguchi, and E. Nishida, "Activation of the Protein Kinase ERK5 / BMK1 by Receptor," Biochemistry, vol. 274, no. 37, pp. 26563-26571, 1999.

[161] S. Meloche and J. Pouyssegur, "The ERK1/2 mitogen-activated protein kinase pathway as a master regulator of the G1- to S-phase transition," Oncogene, vol. 26, no. 22, pp. 3227-3239, 2007, doi: 10.1038/sj.onc.1210414.

[162] Y. Kato, "BMK1/ERK5 regulates serum-induced early gene expression through transcription factor MEF2C," EMBO J, vol. 16, no. 23, pp. 7054-7066, 1997, doi: 10.1093/emboj/16.23.7054.

[163] X. Y. Wu and T. Li, "A casein kinase II phosphorylation site in AtYY1 affects its activity, stability, and function in the ABA response," Front Plant Sci, 2017, doi: 10.3389/fpls.2017.00323.

[164] X. Zeng et al., "A dual-kinase mechanism for Wnt co-receptor phosphorylation and activation," Nature, 2005, doi: 10.1038/nature04185.

[165] U. Knippschild et al., "The role of the casein kinase 1 (CK1) family in different signaling pathways linked to cancer development," Onkologie. 2005. doi:

10.1159/000087137.

[166] F. Bernassola, M. Karin, A. Ciechanover, and G. Melino, "The HECT Family of E3 Ubiquitin Ligases: Multiple Players in Cancer Development," Cancer Cell. 2008. doi: 10.1016/j.ccr.2008.06.001.

[167] M. H. Glickman and A. Ciechanover, "The Ubiquitin-Proteasome Proteolytic Pathway: Destruction for the Sake of Construction," Physiol Rev, 2002, doi: 10.1152/physrev.00027.2001.

[168] D. Komander, "The emerging complexity of protein ubiquitination," Biochem Soc Trans, 2009, doi: 10.1042/BST0370937.

[169] K. Zientara-Rytter and S. Subramani, "The Roles of Ubiquitin-Binding Protein Shuttles in the Degradative Fate of Ubiquitinated Proteins in the Ubiquitin-Proteasome System and Autophagy," Cells, 2019, doi: 10.3390/cells8010040.

[170] A. Hershko and A. Ciechanover, "The ubiquitin system," Annual Rev Biochem., vol. 67, pp. 425-479, 1998, doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.425.

[171] Z. J. Chen and L. J. Sun, "Nonproteolytic Functions of Ubiquitin in Cell Signaling," Molecular Cell. 2009. doi: 10.1016/j.molcel.2009.01.014.

[172] K. Haglund, S. Sigismund, S. Polo, I. Szymkiewicz, P. P. Di Fiore, and I. Dikic, "Multiple monoubiquitination of RTKs is sufficient for their endocytosis and degradation," Nat Cell Biol, 2003, doi: 10.1038/ncb983.

[173] D. Mukhopadhyay and H. Riezman, "Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling," Science. 2007. doi: 10.1126/science.1127085.

[174] J. D. Schnell and L. Hicke, "Non-traditional functions of ubiquitin and ubiquitin-binding proteins," Journal of Biological Chemistry. 2003. doi: 10.1074/jbc.R300018200.

[175] R. Dunn and L. Hicke, "Multiple Roles for Rsp5p-dependent Ubiquitination at the Internalization Step of Endocytosis," Journal of Biological Chemistry, 2001, doi: 10.1074/jbc.M104113200.

[176] X. Luo et al., "Wwp2 targets SRG3, a scaffold protein of the SWI/SNF-like BAF complex, for ubiquitination and degradation," Biochem Biophys Res Commun,

2014, doi: 10.1016/j.bbrc.2013.12.089.

[177] T. Y. Low, M. Peng, R. Magliozzi, S. Mohammed, D. Guardavaccaro, and A. J. R. Heck, "A systems-wide screen identifies substrates of the SCFsupßTrCP/sup ubiquitin ligase," Sci Signal, 2014, doi: 10.1126/scisignal.2005882.

[178] Y. Xu et al., "Role of CK1 in GSK3B-mediated phosphorylation and degradation of Snail," Oncogene, 2010, doi: 10.1038/onc.2010.77.

[179] B. T. Nasipak et al., "Opposing calcium-dependent signalling pathways control skeletal muscle differentiation by regulating a chromatin remodelling enzyme," Nat Commun, 2015, doi: 10.1038/ncomms8441.

[180] C. Simone, S. V. Forcales, D. A. Hill, A. N. Imbalzano, L. Latella, and P. L. Puri, "p38 pathway targets SWI-SNF chromatin-remodeling complex to muscle-specific loci," Nat Genet, 2004, doi: 10.1038/ng1378.

[181] S. V Forcales et al., "Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex," EMBO Journal, 2012, doi: 10.1038/emboj.2011.391.

[182] L. Wang et al., "Erratum: CARM1 Methylates Chromatin Remodeling Factor BAF155 to Enhance Tumor Progression and Metastasis (Cancer Cell (2014) 25 (21-36))," Cancer Cell. 2016. doi: 10.1016/j.ccell.2016.06.013.

[183] H. Cui et al., "Phosphorylation of the chromatin remodeling factor DPF3a induces cardiac hypertrophy through releasing HEY repressors from DNA," Nucleic Acids Res, 2015, doi: 10.1093/nar/gkv1244.

[184] X. Li, J. Liu, and T. Gao, " -TrCP-Mediated Ubiquitination and Degradation of PHLPP1 Are Negatively Regulated by Akt," Mol Cell Biol, 2009, doi: 10.1128/mcb.00681-09.

[185] S. M. Soond, P. A. Townsend, S. P. Barry, R. A. Knight, D. S. Latchman, and A. Stephanou, "ERK and the F-box protein ßTRCP target STAT1 for degradation," Journal of Biological Chemistry. 2008. doi: 10.1074/jbc.M800384200.

[186] G. Wu, G. Xu, B. A. Schulman, P. D. Jeffrey, J. W. Harper, and N. P. Pavletich, "Structure of a ß-TrCP1-Skp1-ß-catenin complex: Destruction motif binding and lysine specificity of the SCFß-TrCP1 ubiquitin ligase," Mol Cell, 2003, doi:

10.1016/S1097-2765(03)00234-X.

[187] J. Zhong et al., "SCFB-TRCP targets MTSS1 for ubiquitination-mediated destruction to regulate cancer cell proliferation and migration," Oncotarget, 2013, doi: 10.18632/oncotarget.1446.

[188] B. R. Keppler and T. K. Archer, "Ubiquitin-dependent and ubiquitin-independent control of subunit stoichiometry in the complex," Journal of Biological Chemistry, 2010, doi: 10.1074/jbc.M110.173997.

[189] N. E. Vorobyeva et al., "SAYP interacts with DHR3 nuclear receptor and participates in ecdysone-dependent transcription regulation," Cell Cycle, 2011, doi: 10.4161/cc.10.11.15727.

[190] V. V Panov et al., "Transcription co-activator SAYP mediates the action of STAT activator," Nucleic Acids Res, 2012, doi: 10.1093/nar/gkr1165.

[191] V. Krasteva, G. R. Crabtree, and J. A. Lessard, "The BAF45a/PHF10 subunit of SWI/SNF-like chromatin remodeling complexes is essential for hematopoietic stem cell maintenance," Exp Hematol, 2017, doi: 10.1016/j.exphem.2016.11.008.

[192] A. V Brechalov, M. E. Valieva, S. G. Georgieva, and N. V Soshnikova, "PHF10 isoforms are phosphorylated in the PBAF mammalian chromatin remodeling complex," Mol Biol, vol. 50, no. 2, pp. 278-283, 2016, doi: 10.1134/S0026893316010039.

[193] Yu. P. Simonov, V. V. Tatarskiy, S. G. Georgieva, and N. V. Soshnikova, "Contact Inhibition of Proliferation Is Accompanied by Expression of the PHF10D Subunit of the Chromatin Remodeling Complex PBAF in Mouse and Human Cell Lines," Dokl Biochem Biophys, vol. 513, no. S1, pp. S18-S22, Dec. 2023, doi: 10.1134/S1607672923700667.

[194] G. M. Viryasova, E. A. Golenkina, V. V. Tatarskii, I. I. Galkin, G. F. Sud'ina, and N. V. Soshnikova, "An optimized permeabilization step for flow cytometry analysis of nuclear proteins in myeloid differentiation of blood cells into neutrophils," MethodsX, vol. 6, pp. 360-367, 2019, doi: 10.1016/j.mex.2019.02.011.

[195] N. Nishimoto et al., "Heterocomplex formation by Arp4 and -actin is involved in the integrity of the Brg1 chromatin remodeling complex," J Cell Sci, 2012, doi: 10.1242/jcs.104349.

[196] K. Hu et al., "Targeting the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C)-bromodomain containing 7 (BRD7) pathway for human osteosarcoma," Oncotarget, 2014, doi: 10.18632/oncotarget.1816.

[197] S. R. Hann and R. N. Eisenman, "Proteins encoded by the human c-myc oncogene: differential expression in neoplastic cells," Mol Cell Biol, vol. 4, no. 11, pp. 2486-2497, 1984, doi: 10.1128/mcb.4.11.2486-2497.1984.

[198] M. W. King, J. M. Roberts, and R. N. Eisenman, "Expression of the c-myc proto-oncogene during development of Xenopus lavis," Mol.Cell. Biol., vol. 6, no. 12, pp. 4499-4508, 1986.

[199] B. Lüscher and R. N. Eisenman, "C-Myc and C-Myb Protein Degradation: Effect of Metabolic Inhibitors and Heat Shock," Mol Cell Biol, vol. 8, no. 6, pp. 25042512, 1988, doi: 10.1128/mcb.8.6.2504-2512.1988.

[200] G. Ramsay, G. I. Evan, and J. M. Bishop, "The protein encoded by the human proto-oncogene c-myc," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 81, no. 24 I, pp. 77427746, 1984, doi: 10.1073/pnas.81.24.7742.

[201] H. Aberle, A. Bauer, A. Kispert, and R. Kemler, "Haberle et al. [11]," Lunar and Planetary Science Conference, vol. 16, no. 13, pp. 55-56, 2011.

[202] K.-J. Shin et al., "A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression," 2006. [Online]. Available: www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0606179103

[203] S. A. Stewart et al., "Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells," RNA, vol. 9, no. 4, pp. 493-501, Apr. 2003, doi: 10.1261/rna.2192803.

[204] S. Y. Fuchs, V. S. Spiegelman, and K. G. S. Kumar, "The many faces of ß-TrCP E3 ubiquitin ligases Reflections in the magic mirror of cancer," Oncogene, vol. 23, no. 11 REV. ISS. 1, pp. 2028-2036, 2004, doi: 10.1038/sj.onc.1207389.

[205] G. Wu, G. Xu, B. A. Schulman, P. D. Jeffrey, J. W. Harper, and N. P. Pavletich,

"Structure of a beta-TrCP1-Skp1-beta-catenin complex: destruction motif binding and lysine specificity of the SCF(beta-TrCP1) ubiquitin ligase.," Mol Cell, vol. 11, no. 6, pp. 1445-56, Jun. 2003, doi: 10.1016/s1097-2765(03)00234-x.

[206] S. Cohen, H. Achbert-Weiner, and A. Ciechanover, "Dual Effects of IkB Kinase P-Mediated Phosphorylation on p105 Fate: SCF p-TrCP -Dependent Degradation and SCF p-TrCP -Independent Processing," Mol Cell Biol, vol. 24, no. 1, pp. 475486, Jan. 2004, doi: 10.1128/MCB.24.1.475-486.2004.

[207] C. Liu, Y. Kato, Z. Zhang, V. M. Do, B. A. Yankner, and X. He, "P-Trcp couples P-catenin phosphorylation-degradation and regulates Xenopus axis formation," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 96, no. 11, pp. 62736278, May 1999, doi: 10.1073/pnas.96.11.6273.

[208] D. Frescas and M. Pagano, "Deregulated proteolysis by the F-box proteins SKP2 and P-TrCP: tipping the scales of cancer," Nat Rev Cancer, vol. 8, no. 6, pp. 438449, Jun. 2008, doi: 10.1038/nrc2396.

[209] C.-L. Chen et al., "Bromodomain-containing protein 7 (BRD7) as a potential tumor suppressor in hepatocellular carcinoma," Oncotarget, vol. 7, no. 13, pp. 16248-16261, Mar. 2016, doi: 10.18632/oncotarget.7637.

[210] W. Xia et al., "BAF180 Is a Critical Regulator of p21 Induction and a Tumor Suppressor Mutated in Breast Cancer," Cancer Res, vol. 68, no. 6, pp. 16671674, Mar. 2008, doi: 10.1158/0008-5472.CAN-07-5276.

[211] Q. Ding et al., "Degradation of Mcl-1 by P-TrCP Mediates Glycogen Synthase Kinase 3-Induced Tumor Suppression and Chemosensitization," Mol Cell Biol, vol. 27, no. 11, pp. 4006-4017, Jun. 2007, doi: 10.1128/MCB.00620-06.

[212] N. Popov, C. Schulein, L. A. Jaenicke, and M. Eilers, "Ubiquitylation of the amino terminus of Myc by SCFP-TrCP antagonizes SCFFbw7-mediated turnover," Nat Cell Biol, vol. 12, no. 10, pp. 973-981, Oct. 2010, doi: 10.1038/ncb2104.

[213] S.-J. Kwon et al., "ATM-mediated phosphorylation of the chromatin remodeling enzyme BRG1 modulates DNA double-strand break repair," Oncogene, vol. 34,

no. 3, pp. 303-313, Jan. 2015, doi: 10.1038/onc.2013.556.

[214] C. Muchardt, J. C. Reyes, B. Bourachot, E. Leguoy, and M. Yaniv, "The hbrm and BRG-1 proteins, components of the human SNF/SWI complex, are phosphorylated and excluded from the condensed chromosomes during mitosis.," EMBO J, vol. 15, no. 13, pp. 3394-402, Jul. 1996.

[215] K. S. J. Foster, W. J. McCrary, J. S. Ross, and C. F. Wright, "Members of the hSWI/SNF chromatin remodeling complex associate with and are phosphorylated by protein kinase B/Akt," Oncogene, vol. 25, no. 33, pp. 46054612, Aug. 2006, doi: 10.1038/sj.onc.1209496.

[216] J. Chen and T. K. Archer, "Regulating SWI/SNF Subunit Levels via ProteinProtein Interactions and Proteasomal Degradation: BAF155 and BAF170 Limit Expression of BAF57,"Mol Cell Biol, vol. 25, no. 20, pp. 9016-9027, Oct. 2005, doi: 10.1128/MCB.25.20.9016-9027.2005.

Приложение

Табл. 2. Подробная информация о субъединицах SWI/SNF для разных организмов: человека, мыши, плодовой мухи, круглого червя и дрожжей

S. No. Subunit name Type of subunit BAF (human) PBAF (human) BAF (mouse) PBAF (mouse) BAP (fruit fly) PBAP (fruit fly) BAF (round worm) PBAF (round worm) SWI/SNF (yeast) RSC (yeast)

1 ATPase Core BRG1/BRM BRG1 BRG1/BRM BRG1 Brm Brm SWSN-4 SWSN-4 SNF2 STH1

2 BAF47/INI1/Snr1/SNF5 /SFH1 Core BAF47 BAF47 BAF47 BAF47 Snr1 Snr1 SNFC-5 SNFC-5 SNF5 SFH1

3 ARID domain containing subunit Signature BAF250A/B BAF200 BAF250A/B BAF200 Osa Bap170 LET-526 SWSN-7 SWI1 RSC9

4 BAF155/Moira/SWI3/R SC8 Core BAF155 BAF155 BAF155 BAF155 Moira Moira SWSN-1 SWSN-1 SWI3 RSC8

5 BAF170/Moira/SWI3/R SC8 Core BAF170 BAF170 BAF170 BAF170 Moira Moira SWSN-1 SWSN-1 SWI3 RSC8

6 BAF60/Bap60/SWP73/ RSC6 Accessory BAF60A/B/C BAF60A/B/C BAF60A/B/C BAF60A/B/C Bap60 Bap60 SWSN-2.1/SWSN-2.2 SWSN-2.1/SWSN-2.2 SWP73 RSC6

7 Actin Accessory ß-actin ß-actin ß-actin ß-actin Act5C Act5C ARP7 ARP7

8 Actin-related protein Accessory BAF53A/B BAF53A/B BAF53A/B BAF53A/B Bap55 Bap55 SWSN-6 SWSN-6 ARP9 ARP9

9 Polybromo-1/Polybromo/RSC1/2/4 PBAF specific Polybromo-1 Polybromo-1 Polybromo PBRM-1 RSC1/2/4

10 Bromodomain containing protein Signature BRD9 BRD7 BRD9 BRD7 CG7154 CG7154 SWSN-9 SWSN-9

11 BAF45/D4/SAYP Signature BAF45B/C/D BAF45A BAF45B/C/D BAF45A D4 SAYP DPFF-1 PHF-10

12 BAF57/Bap111 Accessory BAF57 BAF57 BAF57 BAF57 Bap111 Bap111 SWSN-3 SWSN-3

13 BCL7 BAF specific BCL7A/B/C BCL7A/B/C BCL7-like BCL-7

14 BCL11 BAF specific BCL11A/B BCL11A/B CG9650

15 SS18/SS18L1 BAF specific SS18/SS18L1 SS18/SS18L1 CG10555 ZK973.9

16 GLTSCR1 BAF specific GLTSCR1 GLTSCR1 CG11873 MIG-38

17 SWP82 yeast specific swi/snf SWP82

18 SNF6 yeast specific swi/snf SNF6

19 SNF11 yeast specific swi/snf SNF11

20 TAF14 yeast specific swi/snf TAF14

21 RTT102 yeast specific RTT102 RTT102

22 RSC3 yeast specific RSC RSC3

23 RSC30 yeast specific RSC RSC30

24 RSC58 yeast specific RSC RSC58

25 RSC7 yeast specific RSC RSC7

26 HTL1 yeast specific RSC HTL1

27 RSC14 yeast specific RSC RSC14

Табл. 3. Количество субъединиц BAF и PBAF из 20 видов, включенных в информационную базу SWI/SNF

Вид Название Общее название Количество субъединиц BAF Количество субъединиц PBAF Общее количество генов, кодирующих субъединицы BAF/PBAF

Primates Homo sapiens Human 26 15 30

Pan troglodytes Chimpanzee 26 15 30

Rodents Mus musculus Mouse 26 15 30

Rattus norvegicus Rat 26 15 30

Cavia porcellus Guinea Pig 25 15 29

Laurasiatheria Bos taurus Cattle 26 15 30

Canis lupus familiaris Dog 26 15 30

Pteropus vampyrus Large flying fox 26 15 30

Afrotheria Loxodonta africana African elephant 26 15 30

Other mammals Monodelphis domestica Grey short-tailed opossum 24 13 28

Birds & Reptiles Gallus gallus Chicken 25 15 29

Anolis carolinensis Green anole 24 14 28

Amphibia Xenopus tropicalis Tropical clawed frog 26 15 30

Fishes Danio rerio Zebra fish 23 15 33

Other Eukaryotes Branchiostoma floridae Florida lancelet 14 9 14

Insecta Drosophila melanogaster Fruit fly 14 11 17

Anopheles gambiae African malaria mosquito 16 11 18

Nematode Caenorhabditis elegans Round worm 13 11 16

Other Eukaryotes Aplysia californica California sea hare 12 10 14

Fungi Saccharomyces cerevisiae Baker's yeast 12 17 26

Total 436 276 522

Табл. 4. Домены основных субъединиц SWI/SNF-подобных комплексов млекопитающих.

Субединица Ген (alias) Расчетный молекулярный вес (kDa) Тип комплекса SWI/SNF Домен Функция

BRG1 SMARCA4 184.5 Core subunit ATPase/bromo ATPase and helicase catalytic subunit

BRM SMARCA2 181 BAF-specific core subunit ATPase/bromo ATPase and helicase catalytic subunit

BAF47 SMARCB1 (bSNFS, mini) 44 Core subunit SNF5 Unknown

BAF155 smircci (sms) 123 Core subunit Chromo/SANT/BRCT Unknown

BAF170 SMARCC2 133 Core subunit Chromo/SANT/BRCT Unknown

BAF250a ARID1A (SMARCF1) 242 BAF-specific core subunit ARID DNA binding

BAF250b ARID1B 236 BAF-specific core subunit ARID DNA binding

BAF200 ARID2 197 PBAF-specific core subunit ARID DNA binding

BAF57 SMARCE1 47 BAF/PBAF HMG Unknown

BAF45a PHF10 56 PBAF Zinc finger RING Unknown

BAF45b/c/d DPF1/3/2 42.5/43/44 BAF/PBAF Zinc finger RING Unknown

BAF53a/b ACTL6A/B 47.5/47 BAF/PBAF Actin Chromatin/nuclear matrix

association Enhance ATPase activity

P-actin ACTS 41.5 BAF/PBAF Actin Unknown

BAF60a/b/c SMARCD1/2/3 58/59/55 BAF/PBAF SWIB/MDM2 Unknown

BCL7A/B/C BCL7A/B/C 23/23/23.5 BAF Unknown Unknown

BCL11A/B BCL11A/B 91/95.5 BAF Zinc finger_C2H2 Unknown

BRD9 BRD9 67 BAF Bromo Bind acetylated H3

SYT SSI 8 46 BAF Unknown Transcriptional coactivator

BAF180 PBRM1 193 PBAF BAH/HMG/Bromo Unknown

BRD7 BRD1 74 PBAF Bromo Unknown

Табл. 5. Примеры соответствия киназ и их целевых последовательностей

Киназа Полное название фермента Таргетная последовательность

PKA Protein kinase A или cAMP-dependent protein kinase R-R-X-S/T-Ф

CDK Cyclin-dependent kinase S/T-P-X-K/R

ERK2 Extracellular-regulated kinase-2 P-X-S/T-P

CK1 Casein kinase-1 pS-X-X-S/T

CK2 Casein kinase-2 SAD/E-X-E/D

GSK3 Glycogen synthase kinase-3 S-X-X-X-pS

CaMK2 Calmodulin-dependent protein kinase-2 R-X-X-S

ABL Abelson murine leukaemia virus tyrosine kinase l/V/L-Y-X-X-P/F

EGFR Epidermal growth factor receptor E-E-E-Y-F

Src Rous sarcoma virus tyrosine kinase E-E-FY-E/G-X-F

IRK Insulin receptor tyrosine kinase Y-M-M-M

PKB/AKT Protein kinase B R-X-R-X-X

PKD Protein kinase D 1У1-Х-Р-Х-Х-ВЯ

PIM1-3 Proviral integration site kinases 1-3 R-X-R-X-X-БЯ

Табл. 6. Составы буферных растворов

Название буфера Состав

Лизис буфер для клеток - 10 мМ HEPES (pH 7.9), - 5 мМ MgCl2, - 0.5% нонидет P-40, - 0.45 M NaCl, - 1 мМ DTT, - PIC, - 1% PhIC

ТВ буфер - 10 мМ Pipes (пиперазин-Ы,№-бис(2-этансульфоновая кислота)) - 55 мМ MnCl2 (хлорид марганца) - 15 мМ CaCl2 (хлорид кальция) - 250 мМ KCl (хлорид калия)

LB буфер - 200 мМ Tris-HCl, pH = 6.8, - 4% SDS, - 40% Глицерол, - ~0,01% Бромфенол синий, - 100 мМ DTT

FLB буфер - 40 мМ Tris-HCl, pH = 7,8, - 100 мМ NaCl, - 2,5 мМ Mga2, - 1 мМ DTT, - PIC, - PhIC

Буфер для Ш ДНК-полимеразы Коммерчески доступный буфер (Евроген, Россия)

буфер №500 - 25 мМ Трис-HCl (pH=7,9), - 5 мМ Mga, - 10% глицерин, - 100 мМ NaCl, - 0,1% NP-40

буфер №100 - 25 мМ Трис-HCl (pH=7,9), - 5 мМ MgCl2, - 10% глицерин, - 100 мМ NaCl, - 0,1% NP-40

Трис-глициновый буфер - Трис-HCl, pH = 8.8 — 0,05 M, - Глицин —10 %, - SDS — 4 %, - ЭДТА — 0,004 M, - Дитиотреитол (DDT) — 0.1 M, - Бромфеноловый синий — 0,1 %

Трис-ацетатный буфер 50x - Трис 8.8 242,2 г/л,

- ЭДТА 18.62 г/л,

- Уксусная кислота (ледяная) 89,6 мл/л,

- mQ вода - остальной объем до 1л

Буфер для нанесения - Трис-HCl, pH = 8.8, 0,05 M,

- Глицин - 10 %,

- SDS - 4%,

- ЭДТА 0,004М,

- Дитиотреитол (DDT) 0,1 M,

- Бромфеноловый синий 0,1 %

Буфер для Вестерн - 0,048М Трис-HCl, pH = 8.8,

блотинга - 0,039 мМ Глицин,

- 10% (л/л) Спирт этиловый

RIPA буфер - 10 мМ Трис-HCl, pH=8.0

- 150 мМ NaCl

- 1mM EDTA

- 0.5mM EGTA

- 1% Triton X-100

- 0.1% Sodium Deoxycholate

- 0.1% SDS

PBS - 137 мМ NaCl (хлорид натрия)

- 2.7 мМ KCl (хлорид калия)

- 10 мМ Na2HPO4 (фосфат натрия,

двухосновный)

- 1.8 мМ KH2PO4 (фосфат калия,

одноосновный)

Табл. 7. Объемы PEI и ДНК для трансфекции

Объем PEI/DNA 2ul 4ul 6ul 8ul

1ug DNA=1ug PEI=2ul DNA=1ug PEI=4ul DNA=1ug PEI=6ul DNA=1ug PEI=8ul

0,5ug DNA=0,5ug nPEI=2ul DNA=0,5ug PEI=4ul DNA=0,5ug PEI=6ul DNA=0,5ug PEI=8ul

0,25ug DNA=0,25ug PEI=2ul DNA=0,25ug PEI=4ul DNA=0,25ug PEI=6ul DNA=0,25ug PEI=2.5ul

Табл. 8. Параметры электропорации

Параметр Значение

Напряжение 1,8 кВ

Электрический заряд 25 ^F

Сопротивление 200 Ом

Нормальное время импульса 3,9-4,6 мс

Табл. 9. Состав реакционной смеси для ПЦР

Реагент Концентрация в стоке Объем стока в реакционную смесь Концентрация в реакционной среде

KAPA HiFi Fidelity Buffer (2мМ ) 5x 10мкл 1x

dNTP's 10мМ 1.5 мкл 300 мкМ

Pr. Forw 10мкМ 1.5 мкл 0.3 мкМ

Pr. Rev 10мкМ 1.5 мкл 0.3 мкМ

Фермент полимераза 1 U/мкл 1 мкл 0.02 U/мкл

Дополнительный MnCl2 50мМ 1мкл 1мМ

ДНК 1 мкл

Вода mQ 32.5 мкл

Табл. 10. Анализ лучших конформаций пептидов

RMSD Vina SYBYL Extension N,C-position

Peptidel

P, model2 9,l28 -5,8 -74,288 +

P, model3 5,874 -5,7 22,656 +

A, model2 9,405 -6,5 -l36,402 +

A, model3 3,965 -6,5 -25l,53 + +

A, model4 ll,738 -6,5 -l85,76 +-

E, model3 8,658 -5,5 -32,764 +

E, model4 8,428 -5,4 -92,636

E, model5 9,l9 -5,3 53,576 +

E, model7 8,428 -5,3 -92,636 + +

Normal, model3 9,053 -6,4 -229,03 +

Normal, model6 5,l7l -6,2 -l69,l3 + +

Peptide2

A, modell 8,42 -6,6 -49,722 +

A, model2 8,067 -6,4 -87,2l + +

E, modell 5,986 -5,8 -39,4l4 + +

E, model2 6,602 -5,7 -27,972 + +

E, model3 6,98l -5,7 -25,036 + +