Разработка метода получения полиненасыщенных жирных кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат технических наук Рахматуллина, Юлия Рашитовна

• Рахматуллина, Юлия Рашитовна
• кандидат технических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат технических наук Рахматуллина, Юлия Рашитовна

ВВЕДЕНИЕ.

1 Литературный обзор.

1.1 Строение, номенклатура и распространение полиненасыщенных жирных кислот.

1.2 Биологические функции и области применения арахидоновой кислоты.

1.3 Источники получения арахидоновой кислоты.

1.3.1 Альтернативные источники получения арахидоновой кислоты

1.3.2 Скрининг продуцентов арахидоновой кислоты.

1.3.3 Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и основы его регуляции у микроорганизмов.

1.3.4 Промышленное производство арахидоновой кислоты.

1.4 Производство арахидоновой кислоты с помощью Mortierella alpina

1.4.1 Глубинное культивирование.

1.4.2 Поверхностное культивирование.

1.5 Генетическая модификация продуцентов ПНЖК и их использование для получения ценных продуктов путем трансформации экзогенных липидов.

1.6 Выделение и очистка.

1.6.1 Методы разделения полиненасыщенных жирных кислот.

1.6.2 Экстракция липидов и/или жирных кислот.

1.6.3 Концентрирование полиненасыщенных жирных кислот и их разделение.

1.6.4 Другие потенциально полезные методы концентрирования и очистки полиненасыщенных жирных кислот.5S

2. Объекты, материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Материалы исследования.

2.3. Методы исследования.

2.3.1 Хранение микроорганизма.

2.3.2 Изучение влияний условий культивирования на биосинтез арахидоновой кислоты у выбранного штамма.

2.3.3 Определение ТТХ-редуктазной активности.

2.3.3.1 Определение ТТХ-редуктазной активности в стандартных условиях.

2.3.3.2 Исследование ТТХ-редуктазной активности.

2.3.3.2.1 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от времени.

2.3.3.2.2 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от температуры.

2.3.3.2.3 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от рН

2.3.3.2.4 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от концентрации ингибитора.

2.3.4. Выделение продуктов биосинтеза.

2.3.5. Идентификация продуктов биосинтеза и трансформации.

2.3.5.1 Тонкослойная хроматография.

2.3.5.2 Хроматомасс-спектрометрия.

2.3.6 Исследование влияния низких концентраций метиловых эфиров ПНЖК на всхожесть семян.

2.3.7 Математическая обработка результатов опытов.

3 Результаты и обсуждение.

3.1 Исследование влияние состава среды на рост и липидообразование гриба при поверхностном культивировании.

3.1.1 Поиск основного твердого субстрата.

3.1.2. Поиск добавок к овсяной среде.

3.1.2.1 Влияние углеводородов.

3.1.2.2 Влияние растительных масел и олеата натрия.

3.1.2.3 Влияние глюкозы и глицерина.

3.1.2.4 Влияние цитрата натрия.

2+ 2+

3.1.2.5 Влияние ионов Zn и Mg'T.

3.2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности мицелия с содержанием арахидоновой кислоты в липидах при росте гриба на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка.

3.2.1 Влияние условий на восстановление ТТХ 7- и 18-суточными мицелиями гриба.

3.2.2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности и содержания арахидоновой кислоты в липидах 18 - 23-ти суточных мицелиев, полученных на овсяных средах с различными добавками.

3.3 Исследование динамики роста и состава липидов на перспективной среде.

3.4 Исследование синтеза эйкозапентаеновой кислоты грибом Mortierella alpina.

3.4.1 Двухстадийный синтез при разных температурах.

3. 4.2 Синтез в условиях повышенной солености.

3.4.3 Трансформация льняного масла в эйкозапентаеновую кислоту

3.5 Принципиальная схема получения ПНЖК.

3.5.1 Различные способы выделения целевого продукта.

3.5.2 Принципиальная технологическая схема получения арахидоновой кислоты культивированием гриба Mortierella alpina на плотной овсяной среде.

3.6 Исследование биологической активности препаратов ПНЖК.

3.6.1 Проращивание семян редиса.

3.6.2 Проращивание семян пшеницы.

3.6.3 Проращивание семян гороха.

3.6.4 Проращивание семян фасоли.

3.6.5 Проращивание семян свеклы.

3.6.6 Проращивание семян моркови.

3.6.7 Проращивание семян капусты.

3.6.8 Проращивание семян огурцов.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода получения полиненасыщенных жирных кислот»

Актуальность работы. Полиненасыщенные жирные кислоты представляют собой уникальный класс органических веществ, играющих важную роль в биологических системах. Исследования последних четырех десятилетий вскрыли широкий спектр их функций в живых организмах. ПНЖК подвергаются биотрансформации липоксигеназами или циклооксигеназами, что приводит к образованию многочисленных низкомолекулярных регуляторов процессов, протекающих в клетках, тканях и организме в целом. Одной из самых важных ПНЖК является АК, которая выступает в роли непосредственного предшественника серии простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Основными областями применения АК являются: фармакология (предшественник различных лекарственных и профилактических препаратов применяемых при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, печени и др.); косметическая промышленность (средства по уходу за кожей); пищевая промышленность (обогащение различных продуктов питания, в том числе искусственных детских молочных смесей и др.); сельское хозяйство (высокоэффективный стимулятор роста и защитных реакций растений) и др. В настоящее время основным источником получения АК являются липидные экстракты из печени свиньи и других органов животных, что делает их крупномасштабное производство неэффективным (содержание АК оставляет не более 0,2% в пересчете на сухую массу). В течение последних двадцати лет значительные успехи были достигнуты в области биотехнологического получения АК с помощью низших грибов и морских водорослей, которые в ряде случаев позволили осуществить ее промышленное производство. Однако существующие на сегодняшний день биотехнологии получения АК далеки от совершенства, поскольку ее выход в лабораторных условиях в лучших случаях составляет 13 г/л (Япония), а в среднем у различных исследователей около 6-10 г/л (Россия, США, Польша и др.). В связи с этим создание эффективных отечественных биотехнологий получения АК и других ПНЖК является актуальной задачей.

Цель работы. Разработка эффективного метода получения ПНЖК на основе гриба Mortierella alpina (18-1) и исследование направлений их практического использования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: поиск и подбор компонентов питательной среды для эффективного культивирования гриба; исследование динамики накопления биомассы, АК и других ПНЖК на подобранной среде; поиск экспресс-метода контроля за биосинтезом АК in vivo; поиск условий биосинтеза других ценных ПНЖК; обоснование принципиальной технологической схемы получения ПНЖК в оптимальных условиях; исследование рострегулирующей активности ПНЖК.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), с региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета», 2005-2006 гг.).

Научная новизна. Разработан метод экспресс-анализа содержания арахидоновой кислоты в мицелии гриба Mortierella alpina (18-1) в процессе культивирования на плотной овсяной среде. Найдены условия, позволяющие эффективно осуществлять биосинтез ПНЖК. В этих условиях исследована динамика состава ПНЖК в процессе культивирования. Научно обоснована принципиальная технологическая схема производства ПНЖК с помощью гриба М. alpina (18-1) на плотной овсяной среде. Показана принципиальная возможность получения практически ценной эйкозапентаеновой кислоты на основе изученного штамма М. alpina.

Практическая значимость. Разработан метод получения ПНЖК с помощью гриба М. alpina на твердой овсяной среде с выходом АК 15,3 г/кг среды. Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 240901 «Биотехнология» в УГНТУ.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на 55, 56, 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (2004-2006), V

Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), III Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 15-31 декабря 2005), IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005- 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи и материалы докладов 7 конференций.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов (глава 3), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 161 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 12 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Рахматуллина, Юлия Рашитовна

Заключение

Увеличение спроса на АК а также другие ПНЖК привело к разрыву между современным уровнем их производства из традиционных источников (растения, рыбы, млекопитающие) и потребностью в них рынка. Подобная ситуация стимулировала поиск альтернативных источников их получения, таких как водоросли, грибы и бактерии.

Наиболее перспективным источником АК в настоящее время являются грибы рода Mortierella. Однако, несмотря на значительные успехи в области получения АК с помощью различных штаммов Mortierella alpina приведшие в ряде случаев к промышленному их использованию, ненасыщенность рынка этим продуктом обусловлена его стоимостью. Поэтому весьма актуальным является поиск способов понижения стоимости липидов содержащих АК получаемых биотехнологическими путем и популяризация продуктов обогащенных ею. Основными направлениями в этой области являются: поиск новых штаммов продуцентов и создание мутантов на основе уже имеющихся синтетиков АК, поиск дешевых субстратов и оптимизация условий культивирования найденных продуцентов, поиск активаторов и ингибиторов десатураз, сокращение этапов и совершенствование методов выделения и концентрирования микробных липидов, содержащих АК.

Настоящая работа была направлена на поиск условий эффективного культивирования низшего фикомицета Mortierella alpina (18-1) на плотной питательной среде с целью повышения выхода арахидоновой кислоты. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: поиск и подбор компонентов питательной среды для эффективного культивирования гриба; исследование динамики накопления биомассы, АК и других ПНЖК на подобранной среде; поиск экспресс-метода контроля за биосинтезом АК in vivo; поиск условий биосинтеза других ценных ПНЖК; обоснование принципиальной технологической схемы получения ПНЖК в оптимальных условиях; исследование рострегулирующей активности ПНЖК.

2. Объекты, материалы и методы исследования

В данном разделе рассмотрены основные объекты, материалы и методы, а также физико-химические и спектральные характеристики (масс спектры) соединений используемых или полученных в ходе выполнения экспериментальных исследований. Приведены результаты математической оценки качества проведенных экспериментов.

2.1. Объекты исследования

Объектом исследования служил гриб Mortierella alpina (18-1) из коллекции микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

Основные признаки данного штамма представлены в таблице 2.1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Рахматуллина, Юлия Рашитовна, 2007 год

1. Бартон Д.Н. Общая органическая химия Т.П. М.: Химия. 1986.- 736 с.

2. Ratledge С. Single cell oils—have they a biotechnological future? // Trends Biotechnol. 1993. - Vol. 11. - P. 278-284

3. Shimizu S., Shinmen Y., Kawashima H. Production of C-20 polyunsaturated fatty acids by fungi// Proceeding of World Conference on Biotechnology for the Fats and Oils Industry. 1987. - AOCS, Champaign, IL. -P. 1000-1006

4. Gunstone F. D., Harwood J. L., Padley F. B. Occurrence and characteristics of oils and fats// The Lipid Handbook (Editors, F D Gunstone, J L Harwood and F В Padley), Chapman and Hall, London. 1994. - P. 47-223

5. Westhuizen J.P.J., Kock J.L.F., Botha A. The distribution of the w3 and w6 series of cellular long - chain fatty acids in fungi// Systematic and Appl. Microbiol. - 1994. - Vol. 17. - P. 327-345

6. Ahlgren G., Gustafsson I. В., Boberg M. Fatty acid content and chemical composition of freshwater microalgae// J. Phycol. 1992. - Vol. 28.- P.37-50

7. Dunstan G. A., Volkman J. K., Jeffrey S. W. Biochemical composition of microalgae from the green algal classes Chlorophyceae and Prasinophyceae. 2. Lipid classes and fatty acids// J. Exp. Marine Biol. Ecol. -1992.-Vol. 161.-P.115- 134

8. Blomquist G. J., Borgeson С. E., Vundla M. Polyunsaturated fatty acids and eicosanoids in insects// Insect Biochem. 1991. - Vol. 21. - P.99 - 106

9. Allman M. A. Plant sources of n-З fatty acids// J. Food. 1995. -Aust., Vol. 47. -P.14-I7.

10. Yongmanitchai W., Ward 0. P. Omega-3 fatty acids: Alternative sources of production// Proc. Biochem. 1989. - Vol. 9. - P. 117 — 125

11. Ratledge C. Technological Advances in Improved and Alternative Sources of Lipids (Kamel B. S. and Kakuda Y. eds) // Blackie Acad. 1994. - P. 235-291

12. Botha A., Paul I., Roux С. e t.s. An isolation procedure for arachidonic acid producing Mortierella species // Kluwer Acad. Publ. 1999. -Antonie van Leeuwenhoek. - Vol. 75. - P. 253-256

13. Панькина И. О., Конова И. В. Жирные кислоты фитофторовых грибов при их росте на различных средах// Микробиол. 1996. - Т.65, №2. -С.177-181

14. Zittelli С. G., Lavista F., Bastianini A., Rodolfi L Production of eicosapentaenoic acid by Nannochloropsis sp. Cultures on outdoor tubular photobioreactors // J. Biotechnol. 1999. -Vol. 70. - P. 299-312

15. German J.B., Dillard C.J., Whelan J. Symposium: Biological Effects of Dietary Arachidonic Acid—Introduction//). Nutr. 1996. - Vol. 126. - P. 1076-1080

16. Варфоломеев, С. Д. Простагландины- молекулярные биорегуляторы / С. Д. Варфоломеев, А. Т. Мевх; ред. И. В. Березин. М.: Изд-во МГУ. - 1985. - 307 с.

17. Гуннько В., Андреева С. Биологически активные вещества в косметических средствах по уходу за кожей лица // Провизор. 2002. - №12. - С.65-72

18. Кульнев А.И., Соколова Е. А. Многоцелевые стимуляторы защитных реакций, роста и развития растений. Пущино // ОНТИ ПНЦ РАН.- 1997.- 100 с.

19. Eroshin V. К., Dedyukhina E. G. Effect of lipids from Mortierella hygrophila on plant resistance to phytopathogens // World J. of Microbiol. & Biotechnol. 2002. - Vol. 18. - P. 165-167

20. Devane W. A., Hanus L. A., Breuer R. G. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. 1992. -№258.-P. 1946-1949

21. Stella N., Schweitzer P., D. Piomelli. A second endogenous cannabinoid that modulates long-term potential // Nature. 1997. - № 388. - P. 773-778

22. Carlson S. E., Werkman S. H., Peeples J. M. Arachidonic acid status correlates with first year growth in preterm infants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. -№90.-P. 1073-1077

23. O'Conner D. L., Hall R., Adamkin D. Growth and development in preterm infants fed long-chain polyunsaturated fatty acids: A prospective, randomized controlled trial // Pediatrics. 2001. - № 108. - P. 359-371

24. Birch E. E., Garfield S., Hoffman D. R. A randomized controlled trial of early dietary supply for long-chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants // Develop. Med. Child Neurol. 2000. - № 42. - P. 174-181

25. Smith W. L., Borgeat P. Biochemistry of Lipids and Membranes147

26. Vance D. E and Vance J. E. // Benjamin Cummings, Redwood City, CA, USA. -1985.-P. 325-360

27. Grammatikos S.I, Subbaiah P.V., Victor T.A. e t.s. Diverse effects of essential (n-6 and n-3) fatty acids on cultured cells // Cytotechnology. 1994. -Vol. 15.-P. 31-50

28. Chow C.K. Fatty acids in meats and meat products. Fatty acids in foods and their health implications // New York: Marcel Dekker, Inc. 1992. - P. 65-93

29. Панькина О.И., Конова И.В. Рост зигомицетов и образование жирных кислот при культивировании на углеводородных субстратах // Микробиология. 1998. - Т.67. - № 6. - С.748-753

30. Владимиров В. А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник Рос. Академии мед. Наук. 1998 . - №7. - С. 43-51

31. Ерошин К., Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.Н. и др. Исследование синтеза арахидоновой кислоты грибами рода Mortierella: микробиологический метод селекции продуцентов арахидоновой кислоты// Микробиол. 1996. - Т. 65, Вып. 1. - С. 31-36

32. Igbal G., Valivety R. Polyunsaturated fatty acids, part 1: Occurrence, biological activities and applications// Tibtech October. 1997. - Vol. 15. - P. 401-409

33. Bajpai P., Bajpai P.K., Arachidonic acid production by microorganisms // Biotechnol. Appl. Biochem. 1992. - Vol. 15. - P. 1-10

34. Shinmen Y., Shimizu S., Akimoto D. Production of arachidonic acid by Mortierella fungi. Selection of a potent producer and optimization of culture conditions for large-scale production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. -Vol.31.-P. 11-16

35. Certik M., Sakuradani E., Shimizu S. Desaturase-defective fungalmutants: useful tools for the regulation and overproduction of polyunsaturated fatty acids // Tibtech December. 1998. - Vol. 16. - P.500-505

36. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhina E. G. e t.s. Arachidonic acid production by Mortierella alpina with grown-coupled lipid synthesis// Proc. Biochem. 2000. - Vol. 35. - P. 1171-1175

37. Streekstra H. On the safety of Mortierella alpina for the production of food ingredients, such as arachidonic acid// J. Biotechnology. 1997. - Vol. 56. -P. 153-165

38. Singh A., Ward O. P. Production of high yields of arachidonic in a fed-batch system by Mortierella alpina ATCC 32222 // Appl. Vicrob. Biotechnol. -1997.-Vol. 48.-P. 1-5

39. Jang H.-D., Lin Y.-Y., Yang S.-S. Polyunsaturated fatty acid production with Mortierella alpina by solid substrate fermentation // Bot. Bull. Acad. Sin. 2000. - №41. - P.41-48

40. Желифонова В. П., Зинченко Г. А., Белов А. П. и др. Исследование состава липидов Mortierella hygrophila продуцента арахидоновой кислоты // Прикл. биохим. и микробиол. - 1994. - Т. 30. -Вып. 4-5.-С. 610-616

41. Kamisaka Y.; Noda N., Sakai Т. e t.s. Lipid bodies and lipid body formation in an oleaginous fungus, Mortierella ramanniana var. angulisporal/ Biochim. Et. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1438. - P. 185-198

42. Eroshin V.K., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., e t.s. Arachidonic-acid production by species of Mortierella II World J. Microbiol. Biotechnol. -1996.-Vol. 12.-P. 91-96

43. Totani N., Watanabe A., Oba K. An improved method of arachidonic acid production by Mortierella alpinall J. Jpn. Oil Chem. Soc. 1987. - Vol. 36. -328-331

44. Ward 0. Microbial production of long-chain PUFAs// INFORM. -Vol. 6.- 1995.-P. 683-688

45. Tadao Y., ed. Advances in Polyunsaturated Fatty// Acids Reserch. -1993. Vol. 1025. - International Congress Series, Excerpta Medica, Tokyo

46. Ohlrogge J. B. Design of new plant products: engineering of fatty acid metabolism // J. Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P.821-826

47. Reddy A. S., Thomas T. L. Expression of a cyanobacterial delta6-desaturase gene results in gamma-linolenic acid production in transgenic plants// J. Nat. Biotechnol. 1996. - Vol. 14. - P. 639-642

48. Ratledge C. Biotechnology of oils and fats in industrial Applications of Single Cell Oils (Kyle D.J. and Ratledge C., eds) // American Oil Chemists Society, Champaign, IL, USA. 1992. - P. 1 - 15

49. Folch J., Lees M. and Stanley G. M. A simple method for the isolation and purifications of total lipids from animal tissues// J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 226.-P. 497-509

50. Medina R. A., Gimenez G. A., Camacho G. F. Concentration and purification of stearidonic, eicosapentaenoic, and docosahexaenoic acids from cod liver oil and the marine microalga Jsochrysis galbana II J. Am. Oil Chem. Soc. -1995.-Vol. 72.-P. 575-583

51. Галанина JI. А., Соловьева H. JI., Конова И. В. Образование эйкозаполиеновых кислот Pythium debarianum при культивировании на различных средах// Микробиол. 1999. - Т. 68, №4. - С. 473^179

52. Napier J.A. Transgenic plants for the production of pharmaceutical fatty acids// Bundesgesundheitsbl Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz. -2000.-Vol. 43.-P. 99-103

53. Budziszewski G. J., Croft К. P. C., Hildebrand D. F. Uses of biotechnology in modifying plant lipids// J. Am. Oil Chem. Soc. 1996. - Vol.15031.-P. 557-569

54. Панькина И. О., Конова И. В. Липидные характеристики Phytophthora cryptogea I/ Микробиол. 1996. - Т.65, №2. - С.182-188

55. Gertik М., Berhan S., Sajbidor J. Lipid production and fatty acid composition of select strain belonging to Mucoralesll Acta Biotechnol. 1993. -Vol. 13.-P.193-196

56. Cohen Z., Didi S., Heimer Y. M. Overproduction of y-linolenic and eicosapentaenoic acids by algae// J. Plant Physiol. 1992. - Vol. 98. - P. 569-572

57. Kyle D., Behrens P., Bingham S. Biotechnology for the Fats and Oils Industry// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA. (Applewhite T. H., ed.).- 1988.-P. 117-121

58. Kyle D. J., Sicotte V. J. and Reeb S. E. Industrial Applications of Single Cell Oils// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (Kyle D. J. and Ratledge C., eds). -1992. P. 287-300

59. Yazawa K., Watanabe K., Ishikawa C., Kondo K. and Kimura S. Industrial Applications of Single Cell Oils// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (Kyle D. J. and Ratledge C., eds).- 1992. P. 29-51

60. Ratledge C. Biotechnology of oils and fats in Microbial Lipids// Academic Press (Ratledge C. and Wilkinson S. G., eds). 1992. - Vol. 2. - P. 567 -668

61. Certik M. and Shimizu S. Recent Research Developments in Oil Chemistry // Transworld Research Network, Trivandrum, India. (Pandalai, S. G., ed.)- 1998.-Vol. 2.-P. 89-103

62. Zhu M., Yu L.J., Liu Z., Xu H.B. // Letters in Applied Microbiology. -2004. V.39. - P.332-335

63. Shimizu S. and Jareonkitmongkol S. Biotechnology in Agriculture and Forestry // Springer-Verlag. 1995. - Vol. 33. - P. 308-325151

64. Napier J. A., Hey S. J., Lacey D. J. and Shewry P. R. Identification of a Caenorhabditis elegans D6 fatty acid desaturase by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae II J. Biochem. 1998. - Vol. 330. - P. 611-614

65. Shimizu S., Akimoto K., Sugano M. and Yamada H. Essential Fatty Acids and Eicosanoids // AOCS Press, Champaign, USA (Sinclair, A. and Gibson, R.,eds).-1993.-P. 31-41

66. Botha A., Paul I., Roux С., Kock J. L. F., Coetzee D. J., Strauss T. and Maree C. An isolation procedure for arachidonic acid producing Mortierella species II Kluwer Acad. Publ. 1999. - Antonie van Leeuwenhoek. - Vol. 75. -P. 253-256

67. Hempenius R. A., Van-Delft J. M., Prinsen M., Lina B. A. Preliminary safety assessment of an arachidonic acid-enriched oil derived from Mortierella alpina: summary of toxicological data //Food Chem. Toxicol.-1997.-№ 35.-P. 573-581

68. Koskelo E. K., Boswell K., Carl L., Lanoue S., Kelly C., Kyle D. High levels of dietary arachidonic acid triglyceride exhibit no subchronic toxicity in rats // Lipids. -1997. № 32. - P.397-405

69. Streekstra H. On the safety of Mortierella alpina for the production of food ingredients, such as arachidonic acid // J. Biotechnol. 1997. - № 56. - P. 153-165

70. Burns R. A., Wibert G. J,. Diersen-Schade D. A, Kelly С. M. Evaluation of single-cell sources of docosahexaenoic acid and arachidonic acid: 3-month rat oral safety study with an in utero phase // Food Chem. Toxicol. 1999. -№37.-P. 23-36

71. Whitaker A., Long P. A. Fungal pelleting // Process Biochem. 1973. - № 8. - P. 27-31

72. Vardar F. Problems of mass transfer and momentum transfer in large152fermenters // Process Biochem. 1983. - № 18. - P. 21-23

73. Clark D. S. Submerged citric acid fermentation of ferrocyanide treated beet molasses: morphology of pellets of Aspergillus niger // J. Microbiol. -1962.-№8.-P. 133-136

74. Metz В., Kossen N. W. F., Van Suizdum J. C. The rheology of mold suspensions // Biochem. Eng. 1979. - № 11. - P. 103

75. Hosobuchi M., Fukui F., Matsukawa H., Suzuki Т., Yoshikawa H. Morphology control of preculture during production of ML-236B, a precursor of pravastatin sodium, by Penicillium citrinum // J. Ferment. Bioeng. 1993. - № 76. -P. 476-481

76. Smith J. J., Lilly M. D., Fox R. I. The effect of agitation on the morphology and penicillin production of Penicillium chrysogenum // Biotechnol. Bioeng. 1990. -№35. -P. 1011-1023

77. Byrne G. S., Ward 0. P. Effect of nutrition on pellet formation by Rhizopus arrhizus //Biotechnol. Bioeng.-1989.-№ 33.-P. 912-914

78. Lindberg, A. M., Molin G. Effect of temperature and glucose supply on the production of polyunsaturated fatty acids by fungus Mortierella alpina CBS343.66 in fermentor cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - № 39. -P. 450-455.

79. Higashiyama K., Yaguchi Т., Akimoto K., Fujikawa S., Shimizu S. Enhancement of arachidonic acid production by Mortierella alpina 1S-4 // J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. - № 75. - P. 1501-1505

80. Park E. Y., Koike Y., Higashiyama K., Fujikawa S., Okabe M. Effectof nitrogen source on mycelial morphology and arachidonic acid production in cultures of Mortierella alpine // J. Biosci. Bioeng. 1999. - № 88. - P. 61-67

81. Totani N., Hyodo K., Ueda T. A study on new nitrogen source for cultivation of genus Mortierella // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 2000. - № 49. - P. 479485

82. Totani N., Hyodo K., Ueda T. Minerals essential for growth of the filamentous fungus, Mortierella alpine // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 2000. - № 49. -P. 487-493

83. Kyle D. J. Arachidonic acid and methods for the production and use thereof. PCT Patent W096/21037. 1996

84. Higashiyama K., Yaguchi Т., Akimoto K., Fujikawa S., Shimizu S. Effects of mineral addition on the growth morphology of and arachidonic acid production by Mortierella alpina 1S-4 // J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. - № 75. -P. 1815-1819

85. Wynn J.P., Hamid A.A., Midgley M., Ratledge C. // Wold J. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 14. - P. 145

86. Krishnaiah M.M. Scale-up strategies for solid state fermentation systems. // Process Biochemistry. 1992. - № 27. - P. 259-273

87. Mitchell D.A., Grenfield P.F. & Doelle H.W. A model substrate for solid state fermentation. Biotechnology Letters. 1986. - V.6. - P. 827-832

88. Bajpai P.K., Bajpai P. & Ward, O.P. Production of arachidonic acid by Mortierellu a@na ATCC 32222. // Jownal of Indtrstriul Microbiology. 1991. -V.8.-P. 179-186

89. Давлетбаев И.М., Петухова Н.И., Зорин B.B. Скрининг низших грибов потенциальных продуцентов незаменимых полиненасыщенных жирных кислот// Баш. Хим. Ж.- 2003.- Т. 10.- С. 50

90. Totani N., Watanabe A., Oba К. An improved method of arachidonic154acid production by Mortierella alpina // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 1987. - Vol. 36. -328-331

91. Melnik B. and Plewing G. Octob. Baby food containing -y-linolenic acid, dihomo-y-linolenic acid, or PGE, for atopy prophyxis. European patent EP 391,218.- 1990

92. Ratledge C., Rangasamy D. Compartmentation of ATP:Citrate Lyase in Plants and Plant Physiology, April 2000, Vol. 122, pp. 1225-1230

93. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. /Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Регистран Г.И. Под общ.ред. Грачевой И.М. // М.: Элевар. - 2003. - 554 с.

94. Jareonkitmongkol S., Sakuradani Е., Shimizu S. A Novel А5-Desaturase-Defective Mutant of Mortierella alpina 1S-4 and Its Dihomo-y-Linolenic Acid Productivity // Vol. 59, No. 12 Applied and Environmental Microbiology, 1993, p. 4300-4304

95. Shimizu S, Shinmen Y, Kawashima H, Akimoto K, Yamada H (1988a) Fungal mycelia as a novel source of eicosapentaenoic acid: activation of enzyme(s) involved in eicosapentaenoic acid production at low temperature. Biochem Biophys Res Commun 150:335-341

96. Shimizu, S., H. Kawashima, Y. Shinmen, K. Akimoto, and H. Yamada. 1988. Production of eicosapentaenoic acid by Mortierella fungi. J. Am. Oil Chem. Soc. 65:1455-1459.

97. Wynn J. P., Hamid A. A., Li Y. and Ratledge C. Biochemical events leading to the diversion of carbon into storage lipids in the oleaginous fungi155

98. Mucor circinelloides and Mortierella alpina // Microbiology (2001), 147, 28572864

99. Wynn J. P., Aidil bin Abdul Hamida and Ratledge C. The role of malic enzyme in the regulation of lipid accumulation in filamentous fungi // Microbiology {1999), 145,1911-1917

100. Wynn J.P. and Ratledge C. Evidence that the rate-limiting step for the biosynthesis of arachidonic acid in Mortierella alpina is at the level of the 18: 3 to 20: 3 elongase II Microbiology (2000), 146,2325-2331

101. Parker-Barnes J. M., Das Т., Bobik E., Leonard A. E., Thurmond J. M. Identification and characterization of an enzyme involved in the elongation of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids // PNAS, 2000, vol. 97, 158284-8289

102. Zebrafish cDNA Encoding Multifunctional Fatty Acid Elongase Involved in Production of Eicosapentaenoic (20:5n-3) and Docosahexaenoic (22:6n-3) Acids //Mar. Biotechnol. 6, 251-261,2004

103. Jareonkitmongkol S, Kawashima H, Shirasaka N, Shimizu S, Yamada H (1992a) Production of dihomo-7-linolenic acid by a A5-desaturase-defective mutant of Mortierella alpina 1S-4. // Appl Environ Microbiol 58:2196 2200

104. Jareonkitmongkol S, Shimizu S, Yamada H (1992b) Fatty acid desaturation-defective mutant of an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4. // J Gen Microbiol 138:997 1002

105. Jareonkitmongkol S, Shimizu S, Yamada H (1993) Occurrence of two nonmethylene-interrupted A5-polyunsaturated fatty acids in a A6-desaturase-defective mutant of the fungus Mortierella alpina 1S-4. // Biochim Biophys Acta1561167:137 141

106. Автореферат диссертации кандидата технических наук Давлетбаева И.М. Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и их производных Уфа, 2002 - 24с.

107. Нага A. and Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent // Anal. Biochem. 1978. - Vol. 90. -P. 420^26.

108. Ahlgren G. and Merino L. Lipid analysis of freshwater microalgae: A method study// Arch. Hydrobwi. 1991. - Vol. 121. -P. 295-306.

109. Nagle N. and Lemke, P., (1990) Appl. Biochem. Bioiechnol. 24/25, 355-361 Production of methyl ester fuel from microalgae.

110. Schlenk H. Urea inclusion compounds of fatty acids// Progress in the Fats and other Lipids. -1954. Vol. 2. - P. 243-267.

111. Swern, D, Fatty Acids. Their Chemistry, Properties, Production, and Uses, Markley, К S (ed.). New York: Interscience Publishers Techniques of separation. Urea complexes. -1964. Part 3. - 2nd edition. - P. 2309-2358.

112. Smith A.E. The crystal structure of the urea-hydrocarbon complexes// Acta Cry si. -1952. Vol. 5. P. 224-235.

113. Abu-Nasr A.M. and Holman R.T., J. Highly unsaturated fatty acids. II Fractionation by urea inclusion compounds// Am. Oil Chem. .Sue. 1954. Vol. 31. P. 16-31.

114. Ratnayake W.M.N., Olsson В., Matthews D. and Ackman R.G., Preparation of omega-3 PUFA concentrates from fish oils via urea complexation// Fat Sci. Technol. 1988. - Vol. 10. P. 381-386.

115. Gruger E.H. Jr., Methods of separation of fatty acids from fish oils with emphasis on industrial applications// 11th Annual Conference of Pacific Fisheries Technologists, Gerhart, OR, March. 1960. - Vol. 27-28. - P. 31^10.

116. Robles Medina A., Gimenez Gimenez A., Molina Grima E. and157

117. Garcia Sanchez, J.L., Obtencion de concentrados de acidos grasos poliinsaturados por el metodo de los compuestos de inclusion de urea// Grasas у Aceiles- 1995. Vol. 42. P. 174-182.

118. Iverson J.L., Weik R-W., Correlation of fatty acid structure with preferential order of urea complex formation// J. Am. Oil Chem. Soc. 1967. Vol. 50. P. 1111-1118.

119. Haagsma N., Van Gent C.M., Luten J.B., De Jong R.W. and van Doom E. Preparation of an to-3 fatty acid concentrate from cod liver oil// J. Am. Oil Chem. Soc.- 1988.-Vol. 59. P. 117-118.

120. Traitler H., Wille H.J. and Studer A. Fractionation of blackcurrant seed oil// J. Am. Oil Chem. Soc.- 1988/- Vol. 65.- P. 755-760.

121. Wille H.J., Traitler H. and Kelly M. Production of polyenoic fish oil fatty acids by combined urea fractionation and industrial scale preparative HPLC// Revue Francaise des corps gran. 1987. - Vol. 34. - P. 69-73.

122. Domart C., Miyauchi D.T. and Sumerwell W.N. The fractionation of marine-oil fatty acids with urea// J. Am. Oil Chem. Soc. 1955. - Vol. 32. - P. 481-483.

123. Amitabha Ghosh, Anita Ghosh, Mominal Hoque, Jyotirmoy Dutta. Fatty acids of boal fish oil by urea fractionation and gas-liquid chromatography // Journal of the Science of Food and Agriculture. Volume 27, Issue 2 , Pages 159 -164

124. Shukla V. Recent advances in the high performance liquid chromatography of lipids// Prog. Lipid Res. 1988. - Vol. 27. - P. 5-38.

125. Scholfield C.R. Silver nitrate-high performance liquid chromatography of fatty methyl esters// J. Am. Oil Chem. Soc. 1979. - April. -P. 510-511.

126. Hartley F.R Thermodynamic data for olefin and acetylene complexes oftransition metals// Chem. Rev. 1973. - Vol. 73. - P. 163-190.

127. Aveldano M.I., van Roollins M. and Horrocks L.A. Separation and quantitation of free fatly acids and fatty acid methyl esters by reverse phase high pressure liquid chromatography // J. Lipid Res. 1983. - Vol. 24. - P. 83-93.

128. Henke H. and Schubert J. HPLC of fatty acid esters of mono- and polyhydric alcohols, part 1: Analytical separation// .J. High Resol. Chromat. & Chromat. Comm. 1980. - Vol. 3. - P. 69-78.

129. Privett O.S. Preparation of polyunsaturated fatty acids from natural sources // Progress in the Chemistry of bats and Other Lipids. Holmnan R.T. (ed.). - 1968. - Vol. 9, Chapter 11, part 3, Pergamon Press. - P. 409-452.

130. Schlenk H. Crystallization of fatty acids// J. Am. Oil Chem. Soc. -1961.-Vol. 38.-P. 728-736.

131. Shinowara G.Y. and Brown J.B. Studies on the chemistry of the fatty acids. VI The application of crystallization methods to the isolation of arachidonic acid, with a comparison of the properties// J. Biol. Chem. 1940. -Vol. 134. - P. 331-340.

132. Markley K.S. Interscience Publishers Technique of separation A Distillation, salt solubility, low-temperature crystallization // Fatty Acids, Their Chemistry, Properties, Production, and Uses, Markley, KS (ed.), 2nd edition. Part 3,1964.-P. 1983-2123.

133. Teramoto M., Matsuyama H., Ohnishi N., Uwagawa S. and Nakai K. Extraction of ethyl and methyl esters of polyunsaturated fatty acids with aqueous silver nitrate solutions.// Ind. Eng. Chem. Res. 1994. -Vol. 33. -P. 341-345.159

134. Shantha N.C and Ackman R.G. Silica gel thin-layer chromatographic method for concentration of longer-chain polyunsaturated fatty acids from food and marine lipids// Can. Inst. Sci. Technol. J. 1991. - Vol. 24. - P. 156-160.

135. Hardy R. and Keay J.N. The isolation of the polyunsaturated acids of the fish oils as their methyl esters by preparative scale gas chromatography// J. Chormatog. 1967. - Vol. 27. -P. 474-479.

136. Wrigth S.W., Kuo E.Y., Corey E.J. An effective process for the isolation of docosahexaenoic acid in quantity from cod liver oil// J. Org. Chem. -1987. Vol. 52. - P. 4399-4401.

137. Corey EJ. and Wright S.W. Convenient method for the recovery of eicosapentaenoic acid from cod liver oil// J. Org. Chem. 1988. - Vol. 53. - P. 5980-5981.

138. Gaiday N.V., Imbs A.B., Kuklev D.V. and Latyshev N.A. Separation of natural polyunsaturated fatty acids be means of iodolactonization.// J. Am. Oil. Chem. Soc. 1991.-Vol. 68. P. 230-233.

139. Hayastii K., and Kishimura H. Separation of eicosapenlaenoic acid-enriched triglycerides by column chromatography on silicic acid// Bull. Fac. Fish. Hokkaido Umv. 1993. - Vol. 44. - P. 24-31.

140. Moffat C.F., McGill A.S., Hardy Ft. and Anderson I. The production offish oils enriched in polyunsaturated fatty acid-containing triglycerides// J. Am. Oil Chem. Soc. 1993. - Vol. 70. - P. 133-138.

141. MRS Lipid Analysis Unit Электронный ресурс.: Режим доступа: www.lipid.co.uk, свободный. Загл. с экрана. Яз. англ.

142. Lipid bank Электронный ресурс.: Copyright1999-2002 International Medical Center of Japan / Japan Science and Technology Corporation all rights reserved. Режим доступа: http://lipid.bio.m.u-tokvo.ac.ip, свободный. Загл. с экрана. Яз. англ.

143. Дудка И. А., Вассер С. П. и др. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка. - 1982. - С. 432—438.

144. Халабуда Т. В. Грибы рода Mortierella Coemans. М.: Наука, 1973.-С. 9-96.

145. А.С. 968072. СССР, МКИ С 12 Q 1/100. / Султанович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. Способ количественного определения жирно-кислотного состава липидов микроорганизмов. //Б.И. - 1982. - №39. С. 223.

146. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика// М.:Мир. 1991. - С.543.

147. Практикум по физиологии растений: учеб. пособие для педвузов /Под ред. В.Б. Иванова. 2-е изд., испр. - Академия : : 2004 144 с (Высшее образование)

148. Гмурман В. Е. Теория вероятностей и математическая статистика// М.: ВШ. 1998. -479 С.

149. Shimizu S, Shinmen Y, Kawashima H, Akimoto К, Yamada H Fungal mycelia as a novel source of eicosapentaenoic acid: activation of enzyme(s) involved in eicosapentaenoic acid production at low temperature. Biochem Biophys Res Commun 150:335 341

150. Shimizu Sakayu Conversion of linseed oil to an eicosapentaenoic acid-containing oil by Mortierella alpina 1S-4 at low temperature // Appl Microbiol Biotechnol (1989) 32:1-4

151. Dosanjhi BS, Higgs DA, Plotnikoff MD, Markert JR, Buckley JT (1988) Preliminary evaluation of canola oil, pork lard and marine lipid singly and in combination as supplemetal dietary lipid source for juvenile fall chinook salmon. Aquaculture 68:325-343