Оптимизация процесса биосинтеза арахидоновой кислоты грибами Mortierella alpina из глицерин-содержащих субстратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Миронов Алексей Александрович

• Миронов Алексей Александрович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Миронов Алексей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая активность и практическая значимость

полиненасыщенных жирных кислот

1.2. Арахидоновая кислота (АК)

1.3. Механизмы накопления липидов и биосинтеза АК у микроорганизмов

1.4. Продуценты АК

1.5. Условия культивирования, необходимые для получения АК

1.6. Способы получения АК

1.7.Способы выделения и очистки АК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы культивирования M. alpina

2.3. Аналитические методы

2.3.1. Метод определения биомассы

2.3.2. Определение концентрации глицерина

2.3.3. Определение жирнокислотного состава липидов методом Султановича

2.3.4. Определение жирнокислотного состава липидов модифицированным методом Льюиса

2.3.5. Определение коэффициента (Kja) массопередачи по кислороду в колбах

2.3.6. Анализ содержания азота

2.4. Методы расчета технологических параметров ферментации

2.5. Условия испытания препарата АК в качестве элиситора на томатах и картофеле

2.6. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оптимизация метода выделения смеси эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК из мицелия M. alpina

3.2. Глицерин-содержащие субстраты в качестве источника углерода и энергии

для роста M. alpina, липидогенеза и интенсивного синтеза АК

3.2.1. Биосинтез АКM. alpina на среде с очищенным глицерином

3.3. Разработка метода увеличения доли АК в липидахM. alpina

3.4. Влияние физических факторов на биосинтез АК

3.4.1. Влияние аэрации на ростM. alpina LPM-301, биосинтез липидов и АК

3.4.2. Влияние pH на ростM. alpina, биосинтез липидов и АК

3.4.3. Влияние температуры на ростM. alpina, биосинтез липидов и АК

3.5. Влияния растительных масел на биосинтез АКM. alpina

3.5.1 Влияние инкубации биомассы на содержания АК у штаммаM. alpina LPM-301

выращенного на двухсубстратной среде

3.6. Проведение ферментацийM. alpina LPM-301 в оптимальных условиях

3.7. Испытания АК в качестве элиситора на томатах и картофеле

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация процесса биосинтеза арахидоновой кислоты грибами Mortierella alpina из глицерин-содержащих субстратов»

Актуальность исследования

В последние десятилетия активно развивается промышленное производство микробных масел в качестве источников полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) (Abedi, Sahari, 2014; Ochsenreither et al., 2016). Одной из наиболее ценных ПНЖК является арахидоновая кислота (5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновая кислота) (АК) которая входит в состав клеточных мембран и является первичным предшественником эйкозаноидов, синтезируемых из œ6 ПНЖК (Buczynski et al., 2009; Smith et al., 2011; Каратеев, Алейникова, 2016; Ratledge, 2004; Ward, Singh, 2005; Dyal, Narine, 2005). АК присутствует в небольших количествах в животных жирах, печени, яичном желтке, рыбе, однако её содержание в этих источниках не удовлетворяло растущей рыночной потребности, что привело к развитию микробиологического производства АК (Abedi, Sahari, 2014; Zhi-Kui et al., 2014; Mamani et al., 2019).

Микробные масла (липиды) с высоким содержанием АК входят в состав детского питания и БАДов; используются в производстве косметики и лекарственных препаратов (Ward, Singh, 2005; Mamani et al., 2019). Широко освещено использование эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК в качестве средств защиты растений от фитопатогенов (Озерецковская, 1994; Ильинская и др., 1998; Eroshin, Dedyukhina, 2002; Dedyukhina et al., 2014). По прогнозам мировой объём рынка АК-содержащих липидов достигнет 410 тыс. тонн к 2025 году и спрос будет продолжать расти (Mamani et al., 2019).

Традиционно самыми активными продуцентами АК считаются грибы рода Mortierella (Dyal, Narine 2005; Дедюхина и др., 2011; Mamani et al., 2019; Zhang, et al., 2021). Сотрудниками ИБФМ РАН были селекционированы штаммы Mortierella alpina - продуценты липидов с высоким содержанием АК (Ерошин и др., 1996; Eroshin et al., 1996).

Следует отметить, что классическими углеродными субстратами для биосинтеза липидов с высоким содержанием АК являются сахара. В связи с этим, для повышения рентабельности производства, большое значение приобретает поиск принципиально новых и дешевых источников углерода и энергии для биосинтеза АК (Дедюхина и др., 2016).

Одним из наиболее перспективных источников углерода для разработки микробиологических процессов получения практически ценных метаболитов являются глицерин-содержащие отходы (ГСО) производства биодизеля. На основе ГСО уже разработаны процессы биосинтеза:

1. Спиртов (Papanikolaou et al., 2008; Liu et al., 2012);

2. Полигидроксибутирата (Mothes et al., 2007);

3. Еормового белка (Juszczyk et al., 2013);

4. Еарбоновых килот (Otto et al., 2012; Фатыхова, 2011; Rymowicz et al., 2010; Förster et al., 2007; Kamzolova et al., 2011; Morgunov et al., 2013; Morgunov and Kamzolova, 2015);

5. Ряда ПHЖK за исключением AK (Dobrowolski et al., 201б; Papanikolaou et al., 2017).

Большая потребность AK в различных отраслях народного хозяйства делает актуальной проблему разработки конкурентной ресурсосберегающей биотехнологии получения липидов с высоким содержанием AK из глицерин-содержащих субстратов.

Степень разработанности темы исследования

Основная часть исследований по изучению биосинтеза липидов с высоким содержанием AK проводится на представителях вида Mortierella alpina (секция Mortierella alpina, подрод Mortierella, род Mortierella, семейство Mortierellaceae, порядок Mucorales, подкласс Zygomycetes, класс Phycomycetes, подотдел Mortierellomycotina, отдел Zygomycota) (Dyal, Narine, 2005; Дедюхина и др., 2011; Samadlouie et al., 2014; Kikukawa et al., 2018). У представителей M. alpina отсутствуют аллергенные, патогенные и токсичные свойства (Streekstra, 1997). Липиды полученные из биомассы M. alpina имеют статус Generally Recognized As Safe (GRAS) присвоенный Food and Drug Administration (FDA) СШЛ.

Для культивирования Mortierella alpina применяются преимущественно среды, включающие глюкозу в качестве источника углерода и энергии (Bajpai et al., 1991; Stredanska et al., 1993; Akimoto et al., 2000; Eroshin et al., 2000; Zhu et al., 2003; Hwang et al., 2005; Zhu et al., 200б; Higashiyma, 200б; Barclay 200б, 2007; Kyle, 2007; Streekstra, Brocken, 200В; Jin et al., 200В; Peng et al., 2010; Ji et al., 2014; Nie et al., 2014; Li et al., 2015). В качестве источника азота используются такие органические субстраты как соевая мука, дрожжевой и кукурузный экстракты, мясные пептоны. Некоторые продуценты способны к росту и биосинтезу AK на средах с неорганическими источниками азота (Eroshin et al., 2000; Ерошин и др., 2002; Ochsenreither et al., 201б; Mamani et al., 2019).

Грибы Mortierella alpina способны использовать очищенный глицерин в качестве углеродного субстрата для биосинтеза AK. По имеющимся данным чувствительность к глицерину является штаммовым отличием у M. alpina (Петухова и др., 2007, 2010, 2013б; Винтер и др., 2011; Hou et al., 200В; Dedyukhina et al., 2012).

В лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ PAH была проведена одна из первых работ по изучению биосинтеза AK M. alpina на средах с очищенным глицерином (Винтер и др., 2011; Dedyukhina et al., 2012). Вместе с тем возможности регуляции биосинтеза AK у грибов оставались невыясненными. Среди факторов, оказывающих влияние на синтез ПHЖK у мицелиальных грибов, в литературе наибольшее внимание уделяется природе и

концентрации углеродного субстрата. Показано, что необходимым условием интенсивного синтеза липидов и АК кислоты является лимитирование роста продуцента недостатком азота. Известно, что условия культивирования микроорганизмов оказывают существенное влияние на синтез липидов и их жирнокислотный состав. Поскольку реакции десатурации жирных кислот требуют присутствия молекулярного кислорода, логично предположить, что степень аэрации должна оказывать существенное влияние на биосинтез полиненасыщенных жирных кислот у микроорганизмов. Исследованию влияния аэрации на биосинтез липидов у мицелиальных грибов посвящен ряд публикаций, однако информация была противоречива (Higashiyama et al., 1999, 2002; Kendrick, Ratledge. 1992). Данные о влиянии рН на биосинтез АК у мицелиальных грибов в литературе отсутствовали.

В литературе отсутствуют сведения об использовании ГСО в качестве источника углерода и энергии для биосинтеза АК. Данные об использовании растительных масел для биосинтеза АК противоречивы. Имеются данные, что грибы M. alpina способны синтезировать липиды с высоким содержанием АК на средах, содержащих растительные масла, животные жиры и отходы их производства (гидрофуз, шрот, соапсток, жирные кислоты) (Петухова и др., 2013в; Singh, Ward, 1997; Akimoto et al., 2000;; Slany et al., 2020; Ghobadi et al., 2021). Вместе с тем имеются сведения, что в присутствии экзогенных липидов, биогенез одноклеточными грибами клеточных липидов de novo подавляется (Papanikolau et al., 2011аб; Kendrick, Ratledge 1996).

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение закономерностей биосинтеза липидов с высоким содержанием АК грибами M. alpina из глицерин-содержащих субстратов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность применения глицерин-содержащих субстратов в качестве источника углерода и энергии для синтеза липидов с высоким содержанием АК у M. alpina;

2. Подобрать условия для метаболизации (взаимопревращения) внутриклеточных жирных кислот с целью увеличения доли АК в липидах M. alpina;

3. Исследовать влияние добавок растительных масел на биосинтез АК;

4. Подобрать оптимальные условия культивирования продуцентов (аэрация, pH, температура) для увеличения содержания АК;

5. Оптимизировать метод выделения из мицелия M. alpina смеси эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК;

6. Исследовать влияние метиловых эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК на устойчивость томатов и картофеля к фитопатогенам.

Научная новизна работы

Доказано, что глицерин-содержащие субстраты и растительные масла пригодны для микробиологического получения арахидоновой кислоты в условиях глубинного культивирования.

Впервые показана принципиальная возможность применения глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива в качестве углеродного субстрата для биосинтеза АК с использованием грибов M. alpina.

Выявлены особенности воздействия лимитирующих рост компонентов (азот или углерод) на рост, липидогенез и интенсивность биосинтеза АК у штаммов M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995. Штамм M. alpina LPM-301 использовался как основной объект исследований, был селекционирован в лаборатории физиологии микроорганизмов как активный продуцент арахидоновой кислоты и обладающий уникальным свойством активно синтезировать липиды в период логарифмической фазы роста (Eroshin et al., 2000; Ерошин и др., 2002). Штамм M. alpina NRRL-A-10995 использовался как объект сравнения и был получен из коллекции культур ARS (Agricultural Research Service) (США).

Установлен процесс метаболизации внутриклеточных жирных кислот в условиях инкубации (выдерживания; англ. aging technology) отфильтрованного мицелия M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-1095. Метаболизация приводит к значительному изменению липидного состава клеток.

Впервые изучено влияние экзогенных жирных кислот в составе растительных масел на рост, синтез липидов и АК M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995. Установлено, что использование растительных масел в качестве добавочных субстратов в среду с очищенным глицерином приводит к увеличению содержания биомассы и усилению биосинтеза липидов, при этом жирнокислотный состав внутриклеточных липидов коррелирует с составом используемых масел. Биосинтез АК в присутствии экзогенных жирных кислот подавляется. Применение метода инкубации в оптимальных условиях для мицелия M. alpina LPM-301 выращенного двухсубстратных средах приводил к значительному увеличению содержания АК. Полученные результаты позволяют сделать предположение о метаболизации экзогенных жирных кислот M. alpina в процессе инкубации.

Впервые показано, что накопление АК у грибов M. alpina зависит от значения рН среды, оптимальный биосинтез наблюдался при рН 6,0-7,0 и необратимо ингибировался при рН 3,0.

Аэрация не оказывала существенного влияния на рост, биосинтез липидов и АК у штаммов-продуцентов.

В условиях непрерывного культивирования на среде с очищенным глицерином установлено, что оптимальная температура для биосинтеза АК от общего содержания липидов у M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 была ниже (20-22 и 20 °C, соответственно), чем для накопления АК в расчете на 1 л среды (26 и 28 °С, соответственно).

Научно-практическое значение

Оптимизирован метод Льюиса (Lewis et al., 2000) не требующий использования ацетилхлорида для выделения смеси эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК из мицелия M. alpina.

Подобраны оптимальные условия культивирования (pH, аэрация, температура) штаммов M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 в ферментере, обеспечивающие высокий биосинтез АК на очищенном глицерине (1,1 г/л и 0,7 г/л, соответственно).

Показана биотехнологическая значимость использования ГСО для биосинтеза АК продуцентами M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995. Содержание АК достигало 0,2 г/л среды и составляло 70 % для M. alpina LPM-301 и 57 % для M. alpina NRRL-A-10995 от уровня, полученного на очищенном глицерине.

Установлена перспективность метода инкубации биомассы штаммов-продуцентов в оптимальных условиях, что приводит к метаболизации внутриклеточных жирных кислот и увеличению доли АК в липидах и биомассе M. alpina.

На базе установки лабораторных ферментеров был отработан процесс биосинтеза арахидоновой кислоты грибами Mortierella alpina LPM-301 путем подбора оптимальных условий. Культивирование проводилось в 10 л ферментере АНКУМ 2М с рабочим объёмом 7 л. Было установлено, что использование непрерывного культивирования при pH 6,0, температуре 26 °, двухсубстратной среды (очищенный глицерин и рапсовое масло) с последующей инкубацией наработанной биомассы позволяет получать 5,09-5,60 г/л липидов с содержанием АК 66,6 % от липидов.

Полученные результаты позволяют рекомендовать использование очищенного глицерина, растительных масел и глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива для микробиологического производства АК в условиях глубинного культивирования.

Личный вклад автора

Личный вклад автора заключался в анализе данных литературы, планировании экспериментов и проведении исследований, обработке результатов, подготовке публикаций, представлении результатов экспериментов на конференциях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Доказана возможность биосинтеза штаммами M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 липидов с высоким содержанием АК из очищенного глицерина и глицерин-содержащих отходов производства биодизельного топлива в условиях глубинного культивирования. Показана обратная корреляция между биосинтезом липидов, накоплением биомассы и биосинтезом АК при повышении концентрации углеродного субстрата в питательной среде.

2. Установлено, что инкубация биомассы штаммов-продуцентов в условиях отсутствия источников углерода приводит к метаболизации внутриклеточных жирных кислот и увеличению доли АК от общего содержания липидов. Выдерживание отфильтрованного мицелия в оптимальных условиях увеличивает содержание АК у M. alpina LPM-301 в расчете на 1 л среды в 1,6-2,0 раза от начального уровня.

3. Выявлено, что в условиях глубинного культивирования, присутствие экзогенных жирных кислот подавляет биосинтез АК у M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995. Показана эффективность применения метода инкубации отфильтрованного мицелия M. alpina LPM-301 выращенного в ферментере на глицерин-содержащей среде с добавкой рапсового масла, что позволяет получать 3,4-3,7 г/л целевого продукта.

4. Подобраны оптимальные условия (pH, аэрация и температура) культивирования штаммов для накопления АК. При непрерывном культивировании в ферментере в оптимальных условиях содержание АК у штамма M. alpina LPM-301 составило 1,1 г/л, у штамма M. alpina NRRL-A-10995 0,7 г/л.

5. Показана эффективность использования метиловых эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК как иммуностимулятора сельскохозяйственных растений для защиты от фитопатогенов.

Степень достоверности и апробация работы

Работа выполнена в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов и в лаборатории физиологии микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук - обособленного подразделения Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук». Работы, связанные с изучением влияния температуры на биосинтез АК у M. alpina NRRL-A-10995 в режиме непрерывного культивирования, выполнены в лаборатории биосинтеза ферментов ИФБМ РАН и в Университете естественных наук (г. Вроцлав, Польша) под руководством проф. В. Римовича.

Полученные результаты, заключение и выводы, сформулированные в диссертации, отвечают целям и задачам работы. Достоверность результатов исследований подтверждена применением современных методов, адекватных подходов, компьютерных программ для обработки данных и использованием сертифицированного оборудования для измерения.

Часть работы выполнена при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе "УМНИК" по теме: "Разработка технологии микробиологического получения арахидоновой кислоты из глицерин-содержащих субстратов", 2014-2015 (руководитель гранта).

Основные материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: на международных школах конференциях «Биология - наука XXI века» (Пущино, РФ, 2013, 2014, 2015, 2017), на региональных научно-практических конференциях «Молодежные научно-инновационные проекты Московской области» (поселок Дубровицы, РФ, 2013), на Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, РФ, 2015, 2016, 2019).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 16 работ, в том числе 5 статей в журналах рекомендуемых ВАК для защиты кандидатских диссертаций.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений, списка используемой литературы, списка работ опубликованных по теме диссертации. Работа изложена на 119 страницах, содержит 28 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 219 наименований, из них 175 - публикации в иностранных изданиях.

Благодарности

Автор искренне признателен сотрудникам, способствующим выполнению данной работы: д.б.н. Вайнштейну М.Б., д.б.н. Минкевичу И.Г., Чистяковой Т.И., Зиновкиной Л.Д., а так же всем сотрудникам лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов и лаборатории физиологии микроорганизмов.

Отдельно автор благодарит своего наставника и учителя, ныне покойную, к.б.н. Э.Г. Дедюхину.

Автор выражает признательность к.б.н Леонтьевской Н.В., благодаря помощи которой рукопись диссертации была приведена к стройному логическому завершению.

Автор искренне признателен заведующему установкой лабораторных ферментеров Кошелеву А.В. и к.б.н. Немашкалову В.И. за предоставление материально-технических баз для проведения ферментаций.

Автор выражает огромную благодарность к.б.н. Самойленко В.А. за его значимую помощь на финальных этапах работы

Автор также выражает благодарность к.б.н. Камзоловой Светлане Владиславовне за значимые замечания и важные советы при написании диссертации.

Автор особо признателен своему научному руководителю - д.б.н. Моргунову Игорю Григорьевичу за неоценимый вклад в работу над кандидатской диссертацией.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биологическая активность и практическая значимость полиненасыщенных жирных кислот

Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) представлены жирными кислотами с 1620 или более атомами углерода. В общепринятой номенклатуре принято разделение ПНЖК на две основные группы: ав (n-6) и а3 (n-3) ненасыщенные жирные кислоты. Принадлежность к той или иной группе зависит от положения первой двойной связи, считая от метилового конца цепи жирной кислоты.

Согласно номенклатуре IUPAC, основными а3 ПНЖК являются а-линоленовая кислота (АЛК) (18:3 Д9,12,15), эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) (20:5 А5,8,11,14,17), докозагексаеновая кислота (ДГК) (22:6 Д4,7,10,13,16,19), докозапентаеновая кислота (ДНК) (22:5 Д7,10,13,16,19) и стеаридоновая кислота (СДК) (18:4 А6,9,12,15). Группа а6 кислот включает в себя линолевую кислоту (ЛК) (18:2 Д9,12), у-линоленовую кислоту (ГЛК) (18:3 Д6,9,12), арахидоновую кислоту (АК) (20:4 Д5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновую), дигомо-у-линоленовую кислоту (ДГЛК) (20:3 Д8,11,14) (Abedi, Sahari, 2014).

ПНЖК регулируют широкий спектр гомеостатических и воспалительных процессов, связанных с многочисленными заболеваниями, либо напрямую, либо путем превращения в локально действующие биологически активные метаболиты. Ряд ПНЖК (в основном, 20-ти углеродные кислоты) являются предшественниками эйкозаноидов, включающих в себя простагландины, тромбоксаны, лейкотриены и др. (Каратеев, Алейникова, 2016; Buczynski et al., 2009). В связи с этим, ПНЖК являются крайне востребованными соединениями для производства лекарственных препаратов (Ward, Singh, 2005).

Наиболее важные биологические функции ПНЖК заключаются в следующем:

1. ПНЖК придают мембранам свойства гибкости, текучести и выборочной проницаемости (Ward, Singh, 2005);

2. Ингибируют синтез липопротеина низкой плотности и ускоряют его элиминацию (Steffens,Wirth, 2005);

3. Уменьшают уровень тромбоцитов, продлевают время кровотечения и снижают артериальное давление (Steffens, Wirth, 2005);

4. ПНЖК а3 оказывают положительное действие при заболеваниях, не связанных с болезнями сердца или кровеносных сосудов. Они включают в себя: кожные заболевания, астму, артрит, нефрит, красную волчанку и рассеянный склероз (Kelley et al., 1985; Lands, 1986; Kremer et

al., 1988; Bates et al., 1989; Steffens,Wirth, 2005); ПНЖК являются основными и очень важными компонентами мембранных фосфолипидов (Li, Hu, 2009);

5. В головном мозге и сетчатке людей выявлена высокая концентрация ДГК, которая важна для нормальной работы мозга и зрительной системы (Li, Hu, 2009);

6. Способствуют мембранной текучести (мембранной упорядоченности), которая влияет на функцию мембранных рецепторов, таких как родопсин (Li, Hu, 2009);

7. Регулируют мембранно-связанные ферменты (№+/К+-АТФ-аза) и участвуют в сигнальной трансдукции посредством воздействия на инозитолфосфаты, диацилглицерин и протеинкиназу C (Li, Hu, 2009);

8. ДГК непосредственно влияет на биосинтез нейротрансмиттера, сигнальную трансдукцию и поглощение серотонина, связывание ^-адренергических и серотониновых рецепторов и активность моноаминоксидазы (Li, Hu, 2009);

9. Регулируют синтез эйкозаноидов (Li, Hu, 2009);

10. Выполняют важную функцию в профилактике сердечно-сосудистых заболеваний и рака; воспалительных, тромботических и аутоиммунных заболеваний; ишемической болезни сердца и гипертонии; диабета 2 типа, заболевания почек; ревматоидного артрита; язвенного колита; болезни Крона; хронической обструктивной болезни легких (Abedi, Sahari, 2014).

Учитывая пользу ПНЖК, Агентство питания Американской кардиологической ассоциации рекомендует употреблять рыбу, по крайней мере, два раза в неделю, либо 500 мг ш3 кислот в качестве БАДа в день. Идеальным отношением ш6/ш3 кислот в диете считается 1/5-10 (Krauss et al., 2000; Kris-Etherton et al., 2002; Aleksandra et al., 2009; Kitessaa, Young, 2011). В составе детского питания должно содержаться не менее 0,2 % ДГК от суммы жирных кислот и не менее 0,35 % АК.

ЛК и ГЛК содержатся в больших количествах в растениях, в то время как у людей и других млекопитающих отсутствуют пути их синтеза, что делает их важными компонентами рациона (White, 2008). Хотя организм людей способен синтезировать такие ПНЖК как АК, ДГК и ЭПК, из ЛК и АЛК в качестве предшественников, эффективность их синтеза у людей очень низкая, поэтому получение этих кислот с пищей более предпочтительно. У млекопитающих отсутствуют Д-12- и Д-15-десатуразы, поэтому они не могут синтезировать ЛК и АЛК из олеиновой кислоты (ДХ18:0. Синтез ПНЖК из ЛК и АЛК у людей и многих других эукариот начинается с Д-6-десатуразы, которая вводит двойную связь между атомами углерода 6 и 7 ЛК и АЛК, создавая ГЛК и СДК, соответственно. Эти две жирные кислоты затем удлиняются путем введения двух атомов углерода через специфическую Д-6-элонгазу для создания ДГЛК и ЭТК. Впоследствии эти жирные кислоты десатурируются до АК и ЭПК благодаря Д5 -

десатуразе. Через Д17-десатуразу ГЛК, ДГЛК и АК могут быть преобразованы в СДК, ЭТК и ЭПК, соответственно. В некоторых водорослях и простейших используется другой путь, называемый альтернативным Д8-путём. В этом пути АЛК сначала удлиняется специфической Д9-элонгазой до эйкозадиеновой кислоты (ЭДК; 20:2 омега-6), а затем превращается в эйкозатриеновую кислоту (ЭТК; 20:3 омега-3) Д8-элонгазой. Наконец, у некоторых низших эукариот, в Д6-пути, Д4-десатураза превращает ДПК в ДГК. В ДГК-аккумулирующих микроорганизмах, синтез ДГК представляет собой простой биохимический процесс, при котором ЭПК удлиняется с помощью специфической Д5-элонгазы до ДПК, которая затем превращается в ДГК под действием Д4-десатуразы (Ward, Singh, 2005; Abedi, Sahari, 2014; Ochsenreither et al., 2016).

В жирах пресноводных и морских рыб преобладают триглицериды ненасыщенных жирных кислот, и как следствие, такие жиры представляют собой жидкую форму (Тютюнников, 1992). Поэтому рыбы, особенно рыбы, обитающие в холодных водоёмах, являются прекрасным источником ПНЖК а3 группы, в первую очередь, ДГК и ЭПК, наиболее важных а3 кислот в рационе человека. Морская рыба - лучший источник а3 незаменимых жирных кислот, в пресноводной - соотношение а6/а3 ПНЖК сдвигается к а6 группе. Однако существует ряд рисков при использовании рыбьего жира в качестве компонента диеты (Ward, Singh, 2005).

Жиры млекопитающих - в основном твёрдые за счёт преобладания триглицеридов насыщенных жирных кислот (Тютюнников, 1992). За исключением жировой ткани, тканей головного и костного мозга жиры млекопитающих содержат по большей части а6 ненасыщенные жирные кислоты. При этом, в отличие от рыбы, мясо содержит ДПК, которая играет очень важную роль в профилактике атеросклероза и коронарных болезней сердца. В яичном желтке преобладают а6 ПНЖК, также в небольших количествах содержатся ЭПК, ДГК и АЛК (Abedi, Sahari, 2014).

Подробная информация о природных источниках основных ПНЖК указана в таблицах 1

и 2.

Известно, что ДГК и АК необходимы для развития нервной системы и остроты зрения новорожденных. Как правило, дети получают их из материнского молока (Granot et al., 2016). Но если молоко матери заменено коровьим молоком, у новорожденных возникает недостаток этих ПНЖК, вызванный их отсутствием в коровьем молоке. Таким образом, АК и ДГК должны присутствовать в детском питании для обеспечения нормального развития ребёнка (Beligon et al., 2016).

Тривиальное название Систематическое название N минус аббревиатура, сокращение Традиционные источники

Линолевая кислота цис-9, цис-12-октадекадиеновая кислота 18:2n-6 (ЛК) Растительные масла

у-линоленовая кислота цис-6, цис-9, цис-12-октадекатриеновая кислота 18:3n-6 (ГЛК) Примула вечерняя, масло семян огуречника и чёрной смородины

дигомо-у-линоленовая кислота цис-8, цис-11, цис-14-эйкозатриеновая кислота 20:3n-6 (ДГЛК) Минорный компонент в животных тканях

Арахидоновая кислота цис-5, цис-8, цис-11, цис-14-эйкозатетраеновая кислота 20:4n-6 (АК) Животные жиры, печень, яичный желток, рыба

Докозатетраеновая кислота цис-7, цис-10, цис-13, цис-16-докозатетраеновая кислота 22:4n-6 Минорный компонент в животных тканях

Докозапентаеновая кислота(кислота Осбонда) цис-4,цис-7,цис-10, цис- 13,цис-16-докозапентаеновая кислота 22:5n-6 Минорный компонент в животных тканях

Источник: Fats and fatty acids in human nutrition. Report of an expert consultation. 10-14 November 2008. Geneva. Paper 91 [Электронный ресурс] -URL: http://www.fao.org/3Za-i1953e.pdf

Тривиальное название Систематическое название N минус аббревиатура, сокращение Традиционные источники

а-Линоленовая кислота цис-9,цис- 12-цис- 15-октадека-триеновая кислота 18:3n-3 (АЛК) Льняное масло, перилловое масло, рапсовое масло, соевое масло

Стеаридоновая кислота цис-6,цис-9, цис-12, цис 15-окта-декатетраеновая кислота 18:4n-3 (СДК) Рыбное масло, трансгенное соевое масло, масло семян чёрной смородины, конопляное масло

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Миронов Алексей Александрович, 2022 год

Источники углерода

При получении липидов с высоким содержанием АК в качестве источника углерода в основном используются сахара (Bajpai et al., 1991; Stredanska et al., 1993; Akimoto et al., 2000; Eroshin et al., 2000; Zhu et al., 2003; Hwang et al., 2005; Zhu et al., 2006; Higashiyma, 2006; Barclay

2006, 2007; Kyle, 2007; Streekstra, Brocken, 2008; Jin et al. 2008; Peng et al., 2010; Ji et al., 2014; Nie et al., 2014; Li et al., 2015). Имеются данные, что этанол стимулирует образование АК у продуцентов (Jin et al., 2007, 2008, 2009). В частности, показано, что дробная добавка этанола к растущей культуре M. alpina ME-1 (3 и 2 % на 5 и 7 сутки роста, соответственно) повышала образование АК в 1,7 раз (до 19,8 г/л) (Jin et al., 2008).

Высказывается предположение, что этанол, благодаря быстрому превращению в ацетил-КоА, обеспечивает дополнительный приток НАДФН, необходимый для липогенеза.

В литературе имеются сведения о способности микромицетов рода Mortierella использовать очищенный глицерин в качестве субстрата для роста и синтеза липидов с высоким содержанием АК (Петухова и др., 2007, 2010, 2013б; Винтер и др., 2011; Hou et al., 2008; Dedyukhina et al., 2012). Петуховой и др. (2006) получены препараты биомассы M. alpina 18-1, обогащенной АК. M. alpina 18-1 выращивали на твердых овсяных средах, содержащих различные добавки (глицерин, сульфат магния, сульфат цинка, цитрат натрия); максимальное содержание АК (63,6-68,7 % от суммы жирных кислот) отмечено при использовании овсяной среды с глицерином (1 %) и сульфатом цинка (0,01 %) или сульфатом магния (0,01 %), соответственно (Петухова и др., 2006). Необходимо отметить, что чувствительность к глицерину у M. alpina варьируется в зависимости от используемого штамма (Петухова и др.,

2007, 2010, 2013б; Винтер и др., 2011; Hou et al., 2008; Dedyukhina et al., 2012).

Имеются данные, что грибы M. alpina способны синтезировать липиды с высоким содержанием АК на средах, содержащих растительные масла, животные жиры и отходы их производства (гидрофуз, шрот, соапсток, жирные кислоты) (Петухова и др., 2013в; Singh, Ward, 1997; Akimoto et al., 2000;; Slany et al., 2020; Ghobadi et al., 2021). Петуховой и др. (2013в) обнаружено, что на овсяной среде с 1 % гидрофуза, а также на глицерин-содержащей среде со смесью овсяной крупы и шрота (1:1) мутант M. alpina ГР-1 накапливает 25-27 % липидов с содержанием АК на уровне 63-65 %. Этот же мутант прекрасно растет на овсяной среде в присутствии 2 % соапстока (отход производства подсолнечного масла) и накапливает липиды с высоким содержанием АК (56 % от суммы жирных кислот), в то время как на агаризованной среде с пивной дробиной в качестве субстрата содержание АК не превышает 40 % от суммы жирных кислот (Шараева и др., 2014; Петухова и др., 2014). Вместе с тем имеются сведения,

что в присутствии экзогенных липидов, биогенез одноклеточными грибами клеточных липидов de novo подавляется (Papanikolau et al., 2011аб; Kendrick, Ratledge 1996).

В последнее десятилетие ГСО рассматриваются в качестве перспективных субстратов для получения практически ценных соединений (Василов, 2007; Дебабов, 2008; Дирина и др., 2008; Камзолова и др., 2008; Плетнев, 2009; Фатыхова, 2011; Dobrowolski et al., 2016; Papanikolaou et al., 2017).

В 2016 году объём производства биодизельного топлива в Европе достиг 25 млн. т (Pradima et al., 2017). Согласно Директиве ЕС от 2003 г. по использованию зеленых источников энергии, к 2030 г. доля биотоплива в автомобильном секторе должна быть доведена до 25 % (Himmel et al., 2007).

Для производства биодизельного топлива используются различные растительные масла, а также животные жиры. При производстве 1 тонны биодизеля образуется 100 кг неочищенного глицерина. Цены на ГСО производства биодизеля варьируется от 0,06 долл. до 0,11 долл. США за фунт (Nicol et al., 2012).

На основе ГСО уже разработаны технологии получения карбоновых кислот (пировиноградной, янтарной, лимонной), 1,3-пропандиола, полигидроксибутирата, биомассы, обогащенной незаменимыми аминокислотами, и др. На момент проведения исследований отсутствовала информация об эффективном биосинтезе АК грибами M. alpina, культивируемыми на ГСО.

Следует отметить, что концентрация источников углерода влияет на биосинтез АК. Так имеются сведения, что у некоторых штаммов M. alpina подавляется биосинтез липидов и АК при содержании глюкозы в питательной среде больше 140 г/л (Zhu et al., 2003). Соотношение углерода к азоту (C/N) в среде, лучшее для биосинтеза АК различными продуцентами рода Mortierella, варьируется в широком диапазоне (от 5 до 60) (Koike et al., 2001; Jang et al., 2005; Barclay et al., 2006, 2007).

Источники азота и других макроэлементов

В качестве источников азота используются различные соли азотной кислоты: NaNO3, KNO3, соли аммония и мочевина (Singh, Ward, 1997; Eroshin et al., 2000; Jang et al., 2005; Hwang et al., 2005; Zhu et al., 2006; Dedyukhina et al., 2012). При культивировании штамма M. alpina LPM-301 на средах с глюкозой и нитратом калия или мочевиной в качестве единственных источников азота образование АК достигало 4,5 и 4,2 г/л, соответственно (Eroshin et al., 2000).

В качестве источников фосфора и калия в среды вносят KH2PO4, К2НРО4 и Na2HPO4 (Singh, Ward 1997; Eroshin et al., 2000; Zhu et al., 2006; Dedyukhina et al., 2012).

Витамины

В качестве источников ростовых факторов для продуцентов АК можно использовать соевую муку, мясной, кукурузный, дрожжевой экстракт (Park et al., 1999; Higashiyama et al., 2002; Higashiyama, 200б; Ho et al., 2007; Sakuradani et al., 2009).

Имеются данные, что глутамат может стимулировать синтез АК у M. alpina, однако механизм его действия не ясен (Lan et al., 2002; Yu et al., 2003).

Температура

Анализ литературных данных показывает, что из физических факторов наибольшее влияние на биосинтез общих липидов и АК оказывает температура. Установлено, что увеличение степени ненасыщенности жирных кислот в липидах мембран является адаптивной реакцией микроорганизмов на понижение температуры окружающей среды. Было установлено, что активности A-б- и A-5-десатураз, участвующих в синтезе АК, возрастают при снижении температуры и, следовательно, культивирование продуцентов при пониженной температуре способствует синтезу АК (Dyal, Narine, 2005; Kendrick, Ratledge, 1992; Akimoto et al. 2000; Shiraishi, Kawashima, 2007). Однако следует иметь в виду, что при понижении температуры может усиливаться синтез жирных кислот более ненасыщенных, чем АК. В ряде исследований было показано, что оптимальным температурным режимом для биосинтеза АК (C20:4) грибами рода Mortierella является 25-28 °С, тогда как при понижении температуры синтезировалась преимущественно эйкозапентаеновая кислота (C20:5) (Shimizu et al., 1989; Lindberg and Molin, 1993; Sakuradani et al., 2005). Следовательно, оптимальный режим температуры должен быть подобран для каждого штамма-продуцента индивидуально.

pH среды

Согласно данным литературы рН среды, как правило, не оказывает существенного влияния на биосинтез липидов у мицелиальных грибов (Dyal, Narine, 2005; Дедюхина и др., 2011). Данные о влиянии рН на биосинтез АК Mortierella alpina в литературе на момент проведения исследований отсутствовали.

Аэрация

Имеющаяся в литературе информация относительно влияния аэрации на биосинтез ненасыщенных жирных кислот мицелиальными грибами довольно противоречива.

Исследования, проведенные с грибами Entomophthora exitalis, показали, что концентрация кислорода не оказывала заметного влияния на синтез АК и других ПНЖК (Kendrick, Ratledge, 1992). С другой стороны, имеются данные, что увеличение концентрации кислорода в газовой смеси, подаваемой в ферментер, до 25 % повышало на 60 % содержание АК в расчете на 1 л среды у M. alpina (Higashiyama et al., 1999). Следует отметить, что перспективность использования данного приема при промышленном производстве АК требует экономического обоснования.

Знание физиолого-биохимических закономерностей сверхсинтеза липидов с высоким содержанием АК, путей и механизмов образования кислоты позволили разным научным группам предложить конкретные методы получения продукта с помощью специально селекционированных штаммов-продуцентов.

1.6. Способы получения АК

Как правило, при микробиологическом получении АК используется метод глубинного культивирования в периодических условиях. Однако имеются данные об эффективности приема проточного культивирования грибов M. alpina, при котором питательная среда подается в ферментер с постоянной скоростью, а слив культуральной жидкости проводят периодически, по мере достижения установленного объема (Eroshin et al., 2000). Культивирование на поверхности твердой среды грибов M. alpina для промышленного получения АК считается малоэффективным (Mamani et al.,2019).

В ряде публикаций отмечается, что условия для роста грибов и синтеза АК различны. Поскольку биосинтез АК, как правило, происходит в стационарную фазу роста периодических культур, очень распространенным приемом является двухстадийное культивирование продуцентов, при котором в первую фазу устанавливаются режимы температуры, рН и аэрации, благоприятные для роста мицелия, а во вторую фазу - для синтеза АК (Jin et al., 2008, 2009; Li et al., 2015).

Обращает внимание тот факт, что у многих штаммов M. alpina доля АК в липидах возрастает в период стационарной фазы (при недостатке углеродного субстрата) за счет метаболизации других внутриклеточных жирных кислот (Shinmen et al., 1989; Eroshin et al., 2000; Jin et al., 2009; Nie et al., 2014). Предложен прием трехфазного культивирования штамма M. alpina ME-1, при котором в последнюю фазу мицелий переносили в физиологический раствор на 36 час с целью увеличения доли АК в липидах (Nie et al., 2014).

Имеются сведения о возможности получения интенсивного синтеза АК (63-65 % от липидов) штаммами M. alpina методом твердофазной ферментации на средах, содержащих овсяную муку, глицерин и отходы производства подсолнечного масла (гидрофуз и шрот) (Петухова и др., 2013а,б).

Для сокращения времени ферментации предложен метод циклического периодического культивирования, при котором культуру сливают из ферментера через 5 суток роста, оставляя 10 % объема, а затем заливают свежую среду; таким образом, экономится время на выращивание инокулята и обработку ферментера (Ji et al., 2014).

Во многих процессах промышленного получения АК используется метод культивирования продуцентов с дробным внесением углеродного субстрата, который позволяет избежать катаболитной репрессии в присутствии высоких концентраций глюкозы (Hwang et al., 2005; Zhu et al., 2006; Streekstra, Brocken, 2008).

Сотрудниками ИБФМ РАН одними из первых был разработан способ получения АК (Eroshin et al., 2000). В качестве продуцента использовали специально селекционированный природный штамм M. alpina LPM-301, источника углерода - глюкозу, а источника азота -нитрат калия. При периодическом культивировании M. alpina LPM-301 в течение 8 суток в ферментере с рабочим объемом 100 л содержание АК достигало 60,4 % от суммы липидов и 18,8 % от биомассы (табл. 4).

Китайскими учеными описан аналогичный метод получения АК (54,5 % от суммы липидов и 20,9 % - от сухой биомассы) с использованием M. alpina M-6, выращиваемого в среде с глюкозой (Zhu et al., 2006) (табл. 4).

Streekstra, Brocken (2008) был разработан двухстадийный процесс получения грибного масла с высоким содержанием АК (до 60 % от суммы жирных кислот). В работе использовался штамм M. alpina CBS 168.95, который выращивали в условиях глубинного культивирования на комплексной среде, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и минеральные соли (табл. 4). Первый этап включал в себя культивирование в условиях избытка глюкозы в течение 6-8 суток; второй этап инкубацию в условиях дефицита углеродного субстрата в течение короткого периода времени, за счет чего происходила метаболизация внутриклеточных жирных кислот и увеличение содержания АК до 60 %.

При выращивании мутантного штамма M. alpina SAM2239, неспособного синтезировать эйкозапентаеновую (C20:5) кислоту, удалось получить 5,5 г/л липидов с 75 % содержанием АК. (табл. 4). Комплексная питательная среда для культивирования штамма содержала глюкозу, соевую муку и неорганические соли. Штамм выращивали в условиях глубинного

культивирования в течение 3 суток при 24 °С, а затем, для стимулирования биосинтеза АК, температуру понижали до 12 °С. (Akimoto, 2000).

1.7. Способы выделения и очистки АК

Методы выделения и очистки липидов с высоким содержанием АК детально описаны в обзорных статьях Mamani et al. (2019) и Ward, Singh (2005). На основе этих статей можно выделить основные стадии:

1. Отделение биомассы от культуральной жидкости путем центрифугирования или фильтрования. Полученную биомассу промывают водой, сушат и измельчают;

2. Экстракция липидов из влажной или высушенной биомассы с использованием органических растворителей, таких как гексан, хлороформ, этанол, метанол и петролейный эфир. Использование влажной биомассы может усложнить экстракцию из-за образования трех фаз: твердые вещества, растворитель и водные мицеллы;

3. Выпаривание растворителя из раствора. На этом этапе чаще всего образуется «сырое» грибное масло, которое может содержать частицы биомассы, лецитины и свободные жирные кислоты;

4. Рафинирование масла классическим щелочным методом (Bijl,Wolf, 2004). Полученный после этой стадии продукт соответствует нормам FDA для использования в пищевых и фармацевтических целях (Ward, Singh, 2005).

Хорошо востребованы натриевые соли жирных кислот с высоким содержанием АК выделяемые из грибного масла Mortierella alpina для производства детского питания. Производство состоит из трех этапов: во-первых, масло, богатое АК, омыляется до свободных жирных кислот с использованием воды и гидроксида натрия при температуре 50-80 °С в атмосфере азота. Добавляют разбавленную серную кислоту для восстановления свободных жирных кислот в органическую фазу; водная фаза несет остаточный глицерин. Во-вторых, свободные жирные кислоты снова превращают в натриевые соли путем добавления гидроксида натрия и, наконец, для создания конечной формы добавляют другие ингредиенты (антиоксиданты, фосфаты, мальтодекстрины, аскорбаты, цитраты и казеинаты); полученную смесь высушивают (Vandamme, Revuelta, 2016; Mamani et al., 2019).

Для защиты АК и других ПНЖК от окисления в конечные продукты добавляют комплекс витаминов; т.к. некоторые витамины действуют как стабилизаторы и антиоксиданты,

защищающие структуру АК от деградации. Например при производстве БАДов в форме капсул с микробным маслом добавляют 500 ppm витамин Е (Katano, Kawashima, 2015).

Для качественного и количественного определения липидного состава Mortierella alpina, применяют различные методы экстракции и переэтерификации жирных кислот с последующим анализом жирнокислотного состава методом газовой хроматографии (Folch et al., 1957; Султанович и др., 1982; Lewis et al., 2000). Эфиры жирных кислот так же успешно применяются в диетпитании, фармацевтике, косметике, сельском хозяйстве (Ward, Singh, 2005; Dedyukhina et al., 2011).

В дальнейшем, при необходимости, АК можно выделить из грибного масла в высокоочищенном виде (95-99%). Существует несколько промышленных способов получения высокоочищенной АК, которые включают в себя следующие методы (Yamauchi et al., 2005; Vali, Sheng, 2003; Shimada et al., 1997):

1. Гидролиз липидов до свободных жирных кислот;

2. Комплексообразование насыщенных кислот с мочевиной или фракционирование липидов низкотемпературной обработкой;

3. Селективную этерефикацию ПНЖК микробными липазами;

4. Экстракцию АК из смеси жирных кислот низкополярным растворителем с последующим выпариванием растворителя из раствора.

Отдельно неоходимо упомянуть способ выделения и очистки АК разработанный Yuan et al. (2007) который позволяет получать АК с чистотой 99 %. После предварительной этерификации жирных кислот метанолом и отделения насыщенной фракции мочевиной используется высокоэффективная жидкостная хроматография с препаративной колонкой C18 (метанол и вода в качестве подвижных фаз) для выделения эфира АК.

До 2012 года в нашей лаборатории для выделения метиловых эфиров жирных из биомассы штаммов-продуцентов использовался метод Султановича (1982). Однако, в связи с тем, что ацетилхлорид в 2010 г. был включен в РФ в список прекурсоров, мы были вынуждены разработать новый метод метанолиза, за основу был взят метод экстракции липидов из биомассы с использованием смеси метанол-хлористоводородная кислота-хлороформ (Lewis et al., 2000).

На момент проведения исследований производство АК в РФ отсутствовало. В настоящее время на рынке присутствуют несколько препаратов АК отечественного производства («ОберегЪ», «Проросток») для использования в сельском хозяйстве. Вместе с тем за рубежом АК содержащие микробные масла применяются в первую очередь для производства детского питания, БАДов, фармпрепаратов, косметики (Ratledge, 2004; Ward, Singh, 2005; Mamani et al.,

2019). Отсутствие в РФ производства микробных пищевых масел с высоким содержанием АК может быть связано с низкой рентабельностью используемых технологий, что диктует необходимость развития отечественного производства АК.

Как уже было сказано, классическими углеродными субстратами для биосинтеза липидов с высоким содержанием АК являются сахара. В связи с этим, для повышения рентабельности производства, большое значение приобретает поиск принципиально новых и дешевых источников углерода и энергии для биосинтеза АК.

В последнее десятилетие глицерин и ГСО производства биодизеля рассматриваются в качестве перспективных субстратов для процессов микробиологического получения практически ценных соединений. На момент начала данной работы не были разработаны эффективные процессы получения АК при использовании очищенного глицерина в качестве углеродного субстрата, а данные о биосинтезе кислоты грибами M. alpina из ГСО в литературе отсутствовали.

Из физических факторов наиболее изучено влияние температуры на синтез ПНЖК, имеются редкие публикации относительно влияния аэрации и совершенно не исследовано действие кислотности среды на биосинтез АК.

При изучении биосинтеза АК из ГСО возникло предположение об ингибирующем влиянии экзогенных жирных кислот на синтез АК продуцентами. В связи с этим представляло интерес исследовать влияние добавок растительных масел к глицерин-содержащей среде на биосинтез АК у M. alpina.

Таким образом, представляло интерес оптимизировать условия культивирования продуцентов для получения липидов с высокой долей АК в среде с глицерин-содержащими субстратами. Ставилась задача подобрать условия для метаболизации внутриклеточных жирных кислот с целью увеличения доли АК в липидах M. alpina для увеличения эффективности технологического процесса и, как следствие, снижения затрат на производство.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты исследования

Штамм M. alpina LPM-301 использовался как основной объект исследований, был ранее селекционирован в лаборатории физиологии микроорганизмов как активный продуцент арахидоновой кислоты и обладающий уникальным свойством активно синтезировать липиды в период логарифмической фазы роста (Eroshin et al., 2000; Ерошин и др., 2002). ШтаммM. alpina NRRL-A-10995 использовался как объект сравнения и был получен из коллекции культур ARS (Agricultural Research Service) (США).

В лабораторных условиях культуры хранили на скошенном сусло-агаре при температуре + 4 оС, пересевали один раз в 3 месяц.

В работе использовали ГСО, полученные из Греции (Pythia Institute of Biotechnology, Thessaloniki, Греция). ГСО содержали: 60,0 % глицерина и 39,9 % жирных кислот, метанол и воду в следовых количествах.

В работе использовали растительные масла: рапсовое, содержащее почти равные количества олеиновой и линолевой кислот (46,4 и 43,5 %, соответственно); подсолнечное с преобладанием линолевой кислоты (67,7 %); оливковое с преобладанием олеиновой кислоты (75,8 %) и льняное с преобладанием а-линоленовой кислоты (55,4 %).

2.2. Методы культивирования M. alpina

Посевной материал получали при выращивании штаммов M. alpina в следующих условиях:

1. Выращивание посевного материала для опытов, проводимых в колбах, осуществляли в два этапа:

- посев штаммов на скошенный сусло-агар продолжительность выращивания 5 суток при температуре 28 оС;

- посев M. alpina методом «смыва» с сусло-агара в 2 колбы на 750 мл с 100 мл глюкозо-минеральной среды и культивирование при температуре 28 °С и pH 6,0 в течение 3 суток на качалке при 180-200 об/мин.

2. Выращивание посевного материала для ферментера осуществляли в три этапа:

- посев на скошенный сусло-агар, продолжительность выращивания 5 суток при температуре 28 оС;

- посев M. alpina методом «смыва» с сусло-агара в 2 колбы на 750 мл с 100 мл глюкозо-минеральной среды (первичный инокулюм) и культивирование при температуре 28 °С и pH 6,0 в течение 3 суток на качалке при 180-200 об/мин;

- посев по 10 мл первичного инокулюма в одну - три колбы с 200 мл минеральной среды с глицерином в качестве источника углерода и энергии. Выращивали при температуре 28 °С и pH 6,0 в течение 3 суток на качалке при 180-200 об/мин.

Выращивание инокулюма проводили в 750-мл колбах на качалке (180-200 об/мин) с 200 мл минеральной среды, содержащей (г/л): очищенный глицерин, 15 или глюкоза, 30; KNO3, 1,5; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 1,5; MgSO^^O ,0,15; CaCh^^O, 0,12; дрожжевой экстракт (Difco), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4 X4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CUSO4 X5H2O, 3,9.

Для изучения биосинтеза АК на очищенном глицерине в качестве источника углерода проводили периодическое культивирование в колбах, объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды. Состав сред был следующий (г/л): глицерин (25, 50, 87, 113, 135), KNO3, 1,5; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 1,5; MgSO4^7^O, 0,15; CaChx6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4*4^O, 0,2; ZnSO4*7^O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Культивирование проводилось при рН 6,0 и температуре 28 оС в течение 7 и 14 суток, на качалке (180-200 об/мин). Постоянное значение рН в процессе культивирования поддерживали добавлением 5 % H2SO4 или 5 % NaOH.

Для изучения биосинтеза АК на среде с ГСО грибы выращивали в периодических условиях в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды. Состав сред был следующий (г/л): ГСО (5, 10, 15, 20, 25, 30) или очищенный глицерин (10); KNO3, 1,5; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 1,5; MgSO4x7H2O, 0,15; CaCl2x6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Культивирование проводилось при рН 6,0 и температуре 28 ° в течение 7 и 14 суток, на качалке (180-200 об/мин). Постоянное значение рН в процессе культивирования поддерживали добавлением 5 % H2SO4 или 5 % NaOH.

Для разработки метода увеличения доли АК в липидах M. alpina использовали способ инкубации отфильтрованной биомассы, выращенной на глицерин-содержащих средах.

Условия культивирования продуцентов. Грибы выращивали в периодических условиях в 750-мл колбах, содержащих 100 мл среды следующего состава (г/л): очищенный глицерин, 30,0 или ГСО, 10,0; KNO3, 1,5; K2HPO4, 1,5; KH2PO4, 2,0; MgSO^ 7H2O, 0,15; СаС^бВД, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Культивирование проводилось при рН 6,0 и температуре 28 °С в течение 7 суток, на качалке (180-200 об/мин). Постоянное значение рН в процессе культивирования поддерживали добавлением 5 % H2SO4 или 5 % NaOH. При выращивании продуцентов на очищенном глицерине, начальная концентрация глицерина в среде была 30 г/л; дробные добавки глицерина делали по мере его потребления. Условия инкубации биомассы

Биомассу продуцентов отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через бумажный фильтр, промывали дистиллированной водой и инкубировали в разных условиях:

1. В чашках Петри в эксикаторе. Собранная биомасса помещалась в пустые чашки Петри (толщина слоя биомассы 1,5-2,0 см) и инкубировалась при комнатной температуре (20 °С) в эксикаторе в течение 4, 7 и 14 суток и при температуре 8, 20, 28 °С в течение 7 дней.

2. В жидкой среде в стационарных условиях. Собранная биомасса помещалась в 750-мл содержащих 100 мл ростовой среды без источников углерода. Инкубация проводилась в стационарных условиях в течение 7 суток при 20 °.

3. В жидкой среде на качалке. Собранная биомасса помещалась в 750-мл содержащих 100 мл ростовой среды без источников углерода. Инкубация проводилась на качалке (180-200 об/мин) в течение 7 дней при 20 ° .

Влияние аэрации на рост M. alpina LPM-301, синтез липидов и АК исследовали в 750-мл колбах, содержащих 50, 100, 150, 200 мл следующего состава (г/л): глицерин, 30; KNO3, 1,5; K2HPO4, 1,5; KH2PO4, 2,0; MgSO4x7^O, 0,15; CaCl2x6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4 X7H2O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Начальная концентрация глицерина в среде 30 г/л; дробные добавки глицерина делали по мере его потребления. Культивирование проводили на качалке (220 об/мин) при 28 оС. Постоянное значение рН в процессе культивирования поддерживали добавлением 5 % H2SO4 или 5 % NaOH. Культуру выращивали в течение 4 и 7 суток. Для определения коэффициента массопередачи по кислороду (Kla) использовали метод окисления сульфита.

Влияние рН на ростM. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995, синтез липидов и АК исследовали в 750-мл колбах, содержащих 100 мл следующего состава (г/л): глицерин, 30; KNO3, 1,5; K2HPO4, 1,5; KH2PO4, 2,0; MgSO4*7^O, 0,15; CaChx6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4 x7H2O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Начальная концентрация глицерина в среде 30 г/л; дробные добавки глицерина делали по мере его потребления. Культивирование проводили на качалке (180-200 об/мин) при 28 оС. Грибы выращивали при рН 6.0 в течение 7 суток, затем устанавливали рН на уровне 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 8,0 и продолжали культивирование еще 7 суток. Постоянное значение рН в процессе культивирования поддерживали добавлением 5 % H2SO4 или 5 % NaOH.

Влияние температуры на рост M. alpina LPM-301, синтез липидов и АК исследовали в условиях непрерывного культивирования продуцента в 10-л ферментере АНКУМ-2М (Россия) с рабочим объемом 7 л на среде. Питательная среда содержала (г/л): глицерин, 40; KNO3, 1,5; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 1,5; MgSO4x7H2O, 0,15; CaChx6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Среду подавали в ферментер непрерывно со скоростью 40 мл/час; культуральную жидкость (1 л) сливали, когда объем среды в ферментере достигал 7 л. Удельная скорость роста в процессе культивирования изменялась от 0,0057 до 0,0067 ч-1. Культуру выращивали в периодическом режиме при температуре 28оС в течение 3 сут, затем включали проток среды. Температуру (20, 22, 24, 26 или 28 ± 0.1оС) устанавливали после достижения стационарного состояния режима ферментера. Значения рН (6,0) и рО2 (20-50 % от насыщения) поддерживали автоматически.

Влияние температуры на рост M. alpina NRRL-A-10995, синтез липидов и АК исследовали в условиях непрерывного культивирования продуцента в 2-л ферментере с рабочим объемом 0,75 л на ферментационной установке KF-108 (Пущино, Россия) лаборатории биосинтеза ферментов. Питательная среда содержала (г/л): глицерин, 60,0; KNO3,1,5; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 1,5; MgSO4x7H2O, 0,15; CaChx6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт (Difco), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CuSO4 x5H2O, 3,9. Среду подавали в ферментер непрерывно со скоростью 5 мл/ч; культуральную жидкость (120 мл) сливали, когда объем среды в ферментере достигал 750 мл. Удельная скорость роста в процессе культивирования изменялась от 0,0067 до 0,0079 ч-1. Культуру выращивали в периодическом режиме при температуре 24 ° в течение 4 сут, затем включали проток среды.

Температуру (20, 22, 24, 26, 28 ± 0.1оС) устанавливали после достижения стационарного состояния режима ферментера. Значения рН (6,0) и рО2 (10-50 % насыщения) поддерживали автоматически. Эксперимент повторяли при той же скорости разбавления в ферментере объемом 5 л (BIOSTAT B-PLUS, Sartorius, Германия) с рабочим объемом 2 л в Университете естественных наук г. Вроцлав, Польша.

При исследовании влияния добавок растительных масел использовали питательную среду следующего состава (г/л): глицерин, 30,0; растительное масло (подсолнечное, оливковое, льняное), 10,0; KNO3, 1,5; K2HPO4, 1,5; KH2PO4, 2,0; MgSO4x7H2Ü, 0,15; CaCl2x6H2Ü, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CuSO4x5H2O, 3,9. Начальная концентрация глицерина в среде 30 г/л; дробные добавки глицерина делали по мере его потребления. Культивирование грибов проводили при температуре 24 оС в течение 7 суток на качалке (180-200 об/мин) в процессе роста pH среды поддерживали на уровне 6,0 периодическим внесением 5 % H2SO4 или 5 % NaOH.

Для отработки процесса биосинтеза АК M. alpina LPM-301 в оптимальных условиях провели ряд ферментаций в условиях проточного культивирования. Выращивание штамма проводилось в 10-л ферментере АНКУМ-2М с рабочим объемом 7 л. Питательная среда содержала г/л: глицерин, 40; KNO3, 1,5; KH2PO4, 2,0; K2HPO4, 1,5; MgSO4 X7H2O, 0,15; CaCl2x6H2O, 0,12; дрожжевой экстракт "Difco" (США), 5,0; рапсовое масло, 10,0; микроэлементы (мг/л): FeSO4x7H2O, 14,9; MnSO4x4H2O, 0,2; ZnSO4x7H2O, 8,1; CUSO4X5H2O, 3,9. Среду подавали в ферментер непрерывно со скоростью 40 мл/час; культуральную жидкость (1 л) сливали, когда объем среды в ферментере достигал 7 л. Удельная скорость роста в процессе культивирования изменялась от 0,0057 до 0,0067 ч-1. Культуру выращивали в периодическом режиме при температуре 26оС в течение 3 суток, затем включали проток среды и продолжали культивирование еще 7 суток. Значения рН (6,0) и рО2 (20-50 % от насыщения) поддерживали автоматически. Наработанную биомассу инкубировали в оптимальных условиях.

Для контроля отсутствия заражения пробы из колб и ферментеров регулярно оценивались методом фазово-контрастной микроскопии и высевались на скошенный сусло-агар и в пробирки с мясо-пептонным бульоном.

2.3. Аналитические методы 2.3.1. Метод определения биомассы

Биомассу определяли весовым методом. 100 мл культуральной жидкости фильтровали через бумажный фильтр; мицелий высушивали при 70 °С до постоянного веса.

2.3.2. Определение концентрации глицерина

В процессе культивирования периодически отбирали пробы из среды для определения концентрации остаточного глицерина. При необходимости делали дробные добавки, эквивалентные потреблённому глицерину.

Глицерин анализировали методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия), используя колонку (200*0,3 см) с сорбентом Reoplex-400 (15%), нанесенным на Chromaton N-AW (0,16-0,20 мм) в изотермическом режиме (200 °С). В качестве газа-носителя использовали аргон. Концентрацию глицерина рассчитывали при помощи калибровочной кривой, используя стандартные растворы с известной концентрацией данного соединения (рис. 3).

и

я

я

Я

о* Я Я

Ч U

я Я Я я Ej Н Я

Qj

Я Я

о

а

Площадь пика (S), мм2

Рисунок 3. Калибровочная кривая для определения концентрации глицерина в среде

2.3.3. Определение жирнокислотного состава липидов методом Султановича

При модификации метода Льюиса, в качестве стандартов использовали образцы метиловых эфиров жирных кислот выделенных методом Султановича (Султанович и др., 1982; Lewis et al., 2000)

45 -i

10 -5 -

О -I-1-1-1-1-1-1

0 100 200 300 400 500 600

Метод Султановича включает прямую этерификацию жирных кислот и переэтерификацию сложных эфиров жирных кислот метанолом в присутствии ацетилхлорида непосредственно в биомассе и последующий хроматографический анализ метиловых эфиров жирных кислот.

Реагенты. Метанол. Перегнанный ацетилхорид. Внутренний стандарт (гептадекановая кислота, растворенная в хлороформе). Гексан.

Методика.

Биомассу высушивали до постоянного веса в сушильном шкафу при 70 °С. Навеску абсолютно сухой биомассы (около 100 мг) помещали в круглодонную колбу со шлифом и добавляли 0,2 мл перегнанного ацетилхлорида. Затем осторожно, по каплям (во избежание разбрызгивания) вносили 0,5 мл метанола. В реакционную смесь добавляли 0,1 мл раствора стандарта, затем 1 мл метанола и помещали в песочную баню (80 °С) до полного выпаривания (4-5 ч). Для экстракции метиловых эфиров жирных кислот в колбочку вносили 0,2-0,5 мл гексана и тщательно перемешивали с помощью капилляра. Экстракт сливали в эппендорф и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 6 минут. Метиловые эфиры жирных кислот анализировали газожидкостной хроматографией на хроматографе СЬгош-5 (Чехославакия) с пламенно-ионизационным детектором на стеклянной колонке (200х0.3 см) с 15 % Яеор1ех-400, нанесенным на СЬоша1;оп N-AW (0,16-0,20 мм), при температуре 200°С. В качестве газа носителя использовали аргон. Содержание липидов рассчитывали как сумму жирных кислот. Идентификацию жирных кислот проводили с помощью калибровочного графика (рис. 4). Известно, что при ГЖХ метиловых эфиров жирных кислот в условиях изотермического режима для каждой группы кислот (насыщенные, моно-, ди-, три-, тетра- ненасыщенные) существует линейная зависимость между числом углеродных атомов в молекуле кислоты и логарифмом удерживаемого объема (времени удерживания) (Кейтс, 1975).

2.3.4. Определение жирнокислотного состава липидов модифицированным

методом Льюиса

Для определения жирнокислотного состава липидов применяли модифицированную нами методику Льюиса: образцы биомассы высушивали при 70 °С до постоянного веса и подвергали прямой трансэтерификации при 80 °С в течение 3 ч в смеси метанол: соляная кислота: хлороформ (10:1:1, об./об.).

Реагенты. Раствор соляной кислоты в метаноле, 10 %-ный (5 мл соляной кислоты смешивали с 45 мл метанола). Внутренний стандарт (гептадекановая кислота, растворенная в хлороформе). Обезвоженный хлороформ. Гексан. Дистиллированная вода.

Методика. В круглодонную колбу со шлифом вносили навеску лиофилизированной биомассы (200 ± 20 мг) и добавляли 100 мкл внутреннего стандарта. Далее добавляли 10 мл 10 %-ного раствора соляной кислоты в метаноле. Затем вносили 1 мл обезвоженного хлороформа. Полученную смесь кипятили в круглодонных колбах с подключенным обратным холодильником при температуре 80 °С в течение 3 часов. Далее к смеси добавляли 7 мл гексана и 3 мл воды, в результате получали двухфазный раствор, верхний слой которого, содержащий смесь метиловых эфиров жирных кислот в гексане, отделяли в делительной воронке; оставшийся водный раствор дважды экстрагировали гексаном (7 мл). Объединенные гексановые экстракты метиловых эфиров жирных кислот обезвоживали, пропуская через слой прокаленного сульфата натрия, а затем выпаривали на роторном испарителе под вакуумом при 60 ° .

Рисунок 4. Калибровочные кривые для идентификации жирных кислот. Кислоты: 1 -насыщенные; 2 - моноеновые; 3 - диеновые; 4 - триеновые; 5 - тетраеновые.

Полученные метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом ГЖХ на хроматографе Chrom-5 (Чехословакия), используя колонку (200x0,3 см) с сорбентом Reoplex-400 (15 %), нанесенным на Chromaton N-AW (0,16-0,20 мм) в изотермическом режиме (180 X). В качестве газа-носителя использовали аргон; скорость газа-носителя 30 мл/мин. Метиловые эфиры жирных кислот идентифицировали, используя стандартные смеси (Serva, Германия). Идентификацию жирных кислот проводили с помощью калибровочного графика (рис. 4.).

Содержание липидов рассчитывали как сумму жирных кислот. В качестве внутреннего стандарта применяли гептадекановую кислоту.

2.3.5. Определение коэффициента (К1а) массопередачи по кислороду в колбах

В основе метода лежит реакция окисления сульфита натрия в сульфат в присутствии ионов тяжелого метала в качестве катализатора. Реагенты

1. Раствор Na2SO3, 0,6 N. Растворяли 37,8 г безводной соли Na2SO3 в 1 л водопроводной воды и деаэрировали аргоном;

2. Раствор №^203, 0,Ш. Растворяли 24,8 г Ш^203 в 1 л дистиллированной воды;

3. Раствор 12, 0,Ш. Растворяли 12,7 г йода кристаллического и 40 г йодистого калия в 600-700 мл дистиллированной воды, затем доводили объем до 1 литра;

4. Раствор CuSO4x5H2O, 0,00Ш. Растворяли 2,42 г сернокислой меди в 30-40 мл дистиллированной воды, доводили объем до 100 мл. Расход составляет 10 мл на 1 л раствора сульфита натрия;

5. Раствор крахмала картофельного растворимого, 0,5%. 0,5 г крахмала суспендировали в 20мл дистиллированной воды и при перемешивании суспензию выливали в 50 мл горячей дистиллированной воды. Затем доводили объем остывшего до комнатной температуры раствора да 100 мл и фильтровали бумажный фильтр.

Методика

В работе использовалась качалка ГОС-1-и c режимом термостатирования 28 °С и частотой привода 220 об/мин. Раствор сульфита натрия разбавляли питательной средой в 10 раз, добавляли раствор сернокислой меди из расчета 1/100, об./об. и разливали в 750 мл колбы по 50, 100, 150, 200 мл. Через 2 минуты из колб отбирали первоначальную пробу для анализа (проба до аэрации). Колбы помещали на качалку и включали привод. Отбор и анализ проб в процессе аэрации проводили через каждые 10 минут. После часовой аэрации систему привод качалки отключали.

Анализ проб проводился методом йодометрического титрования. Каждая проба титровалась не менее трех раз. Для этого в три подготовленные колбы отбирать по 1 мл испытуемой пробы и сразу же добавляли по 10 мл 0,Ш 12, осторожно перемешивая.

Колбы накрывали и ставили на 10 минут в темное место для полного завершения реакции между сульфитом и йодом. Затем титровали непрореагированный йод раствором гипосульфита до желтой окраски. После чего добавляли 1 каплю крахмала и продолжали

титрование до обесцвечивания раствора (титрование производили при перемешивании магнитной мешалкой).

Из трехкратного титрования вычисляли средний результат, показывающий усредненный объем гипосульфита, пошедшего на титрование каждой пробы.

Все результаты сводились в таблицу и оформлялись графиком зависимости количества гипосульфита, пошедшего на титрование пробы от времени. Сульфитное число рассчитывали по формуле:

М = 48 (Пх - П0)Л, где М - моль О2/л*мин, 48 - коэффициент пересчета, учитывающий объём титруемой пробы на 1 л раствора, Пх - По -разность объемов в мл гипосульфита пошедшего на титрование в процессе ее аэрации и до аэрации, t - время аэрации в минутах.

Величину К1а рассчитывают по формуле К1а = М/С*

где С*- концентрация растворенного кислорода, равновесная с газовой фазой.

По таблице растворимости кислорода для 1 л раствора сульфита натрия принимали равной 1,7*10-4 моль, соответственно:

К1а = М/0,17 мин-1.

2.3.6. Анализ содержания азота

Содержание нитрат-ионов определяли потенциометрическим методом с помощью ионоселективного электрода «Эком-КОз». Метод анализа заключается в измерении величины равновесного потенциала ионоселективного электрода, погруженного в раствор анализируемого иона. Потенциал измеряют относительно электрода сравнения с помощью иономера (Экотест-120, ИЭЛРАН НПП ЭКОНИКС).

Электрод «Эком-КО3» и электрод сравнения погружали в раствор и измеряли значение равновесного потенциала. После каждого измерения электроды промывали дистиллированной водой и осушали фильтровальной бумагой.

Калибровка рН-иономера «Экотест-120». Для приготовления стандартного раствора растворяли 10,1 г КК03 в 1 литре дистиллированной воды. Остальные стандартные растворы готовили последовательным десятикратным разведением основного раствора. Измерения проводили в порядке возрастания концентрации N03 при использовании ионоселективного пленочного электрода «Эком-КО3». Перед измерением электрод выдерживали в дистиллированной воде 10-20 минут. Полученные при калибровке данные отображены в таблице 5.

Концентрация KNO3 в растворе, моль/дм3 Показания рН-иономера, мВ Концентрация N0^, мг/л

10-1 293,3 6191

10-2 245,1 619,1

10-3 189,7 61,9

2.4. Методы расчета технологических параметров ферментации

Выход биомассы от потребленного глицерина по массе (УХ/£, %) рассчитывали по формуле:

Ух/з = (Х/£) х 100,

где X — биомасса, г/л; £ — потребленный глицерин, г/л.

Выход липидов от потребленного глицерина по массе (Уь/б, %) рассчитывали по формуле:

Уиз = (Ь/£) х 100,

где Ь —липиды, г/л; £ — потребленный глицерин, г/л.

Выход биомассы от потребленного глицерина по энергии (лх/б, %) рассчитывали по формуле:

Лх/з = (Ов/Оз) х Ух/£,

где Ов — энергосодержание биомассы, кДж/г; О — энергосодержание глицерина,

кДж/г.

Энергосодержание глицерина (О) принято равным 17,96 кДж/г (Минкевич, 2005). Энергосодержание биомассы (Ов, кДж/г) рассчитывали по формуле (Минкевич, 2005): Ов = 15.1 + 0.28 /ь,

где /ь — содержание липидов в биомассе, %.

Выход липидов от потребленного глицерина по энергии (ль, %) рассчитывали по формуле:

Ль = (О/Оз) х Уих

где ОЬ — энергосодержание липидов, кДж/г. Используется значение Оь = 42.56 кДж/г (МткеуюЬ е1 а1., 2010)

Аналогичным образом рассчитывали выход АК от потребленного глицерина по массе и энергии. Энергосодержание АК принято равным 38,72 кДж/г (Minkevich е1 а1., 2010).

2.5. Условия испытания препарата АК в качестве элиситора

на томатах и картофеле

Рабочий раствор АК-препарата содержал 0,3-0,5 мг смеси метиловых эфиров жирных кислот с содержанием АК 66,6 %, 0,002 мг бутилокситолуола в качестве антиоксиданта и 0,002 мг Tween 20 в 10 л воды. Семена томатов сорта 'Трибовский" протравливали раствором АК-препарата в течение 5-10 мин, затем высевали в сосуды на питательную среду. Выросшие растения в фазе нескольких листьев опрыскивали суспензией конидиоспор возбудителя фитофтороза Phytophthora infrestans (50 тыс. конидиоспор/мл). После инфицирования растения помещали на сутки во влажную камеру. Степень подавления развития фитофтороза определяли на 6-е сутки. Эталоном служил фунгицид поликарбацин. Повторность опыта 3-ех кратная. Процент развития болезни определяли микроскопически, подсчитывая число слоев клеток, в которые проникли гифы патогена. Параллельно исследовали действие АК-препарата при инфицировании растений томатов до и сразу же после обработки АК-препаратом.

При испытании действия АК-препарата на устойчивость картофеля к ризоктониозу клубни картофеля сорта "Любимец" предварительно инфицировали склероциями гриба Rhizoctonia solani (не менее 10 склероций/клубень), затем погружали на 2-3 мин в раствор АК-препарата. Обработанные клубни выдерживали при относительной влажности 90-95 % и температуре 21-23 °С в течение 1-3 суток, после чего проводили оценку прорастания склероций. Повторность опытов 3-ех кратная. В качестве эталона использовали титусим в концентрации 0,5 % по д.в.

Биологическую эффективность действия АК-препарата определяли по формуле:

B = (P - P1)/P*100, где B - биологическая эффективность %, P и P1 развитие болезни в контроле и опыте, соответственно, %.

2.6. Статистическая обработка результатов

Все эксперименты и измерения проводили в трёх повторностях. Для статистической обработки результатов использовали программу «Microsoft Excel 2013». В качестве критерия достоверности использовали t-критерий Стьюдента. Критический уровень значимости (р) для проверки статистических критериев устанавливали 0,05.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оптимизация метода выделения смеси эфиров жирных кислот с высоким

содержанием АК из мицелия M. alpina

Классическим методом выделения липидов из биомассы микроорганизмов является метод Фолча (Folch et al., 1957), который заключается в экстракции липидов из биомассы смесью хлороформ-метанол (2:1) с последующим гидролизом липидов и метилированием жирных кислот. Этот метод довольно трудоемок, требует предварительного разрушения клеток механической гомогенизацией или обработки ультразвуком и используется в основном при исследовании фракционного состава липидов. Для анализа жирнокислотного состава липидов разработаны методы прямой этерификации биомассы с выделением смеси метиловых (или этиловых) эфиров жирных кислот. В частности, был предложен экспресс-метод выделения метиловых эфиров жирных кислот с использованием ацетилхлорида (Султанович и др., 1982). Этот метод действительно очень точен, прост и не трудоемок; однако, в связи с тем, что ацетилхлорид в 2010 г. был включен в РФ в список прекурсоров, мы были вынуждены разработать новый метод метанолиза, применительно к нашим образцам биомассы, обеспечивающий получение смеси метиловых эфиров жирных кислот с высоким содержанием АК. За основу был взят метод экстракции липидов из биомассы с использованием смеси метанол-хлористоводородная кислота-хлороформ (10:1:1, об./об.) и последующей прямой трансэтерификацией в течение 60 или 120 мин (Lewis et al., 2000).

В ходе выполнения работы были изучены следующие параметры метанолиза: состав реакционной смеси, время, температура и способ алкоголиза (нагревание на водяной бане с обратным холодильником или выпаривание на песочной бане). Эксперименты проводили на образцах лиофилизированной биомассы M. alpina LPM-301, жирнокислотный состав которых был определен методом Султановича. Полученные результаты представлены в таблице 6. Лучшие результаты получены при использовании смеси (10 % HCl в метаноле + 10 % хлороформ) и нагревании при 80 оС 3 часа на водяной бане. Этот метод метанолиза обеспечивает экстракцию липидов (% от биомассы), АК (% от липидов и биомассы) в количестве 76,0 %, 104,0 %, 79,0 % от уровня, полученного при использовании ацетилхлорида. Внесение гексана в реакционную смесь отрицательно сказывается на экстракции липидов и АК. Выпаривание при 80 °С 3 часа в песочной бане также отрицательно сказывается на экстракции липидов и АК.

Таблица 6. Влияние метода метанолиза жирных кислот на выход липидов и АК (% от уровня, полученного при использовании ацетилхлорида)

Показатели Экстракция в водяной бане, 80 °С, 3 ч Экстракция в песочной бане, 80оС, 3 ч

10 % HCl в метаноле 10 % ИС1 в метаноле + 10 % хлороформа 10 % HCl в метаноле + 10 % гексана 10 % HCl в метаноле

Липиды, % от биомассы 61,0±6,0 76,0±7,0 42,0±2,1 43,0±4,2

АК, % от липидов 100,0±1,5 104,0±2,0 51, 0± 1,5 49,0±1,5

АК, % от биомассы 61,0±3,0 79,0±3,4 21,0±2,0 21,0±1,5

3.2. Глицерин-содержащие субстраты в качестве источника углерода и энергии для роста M. alpina, липидогенеза и интенсивного синтеза АК

В задачу данного раздела работы входило изучение возможности использования малоизученных субстратов - очищенного глицерина и глицерин-содержащих отходов биодизеля для синтеза АК у грибов M. alpina и выявление особенностей воздействия лимитирующих рост компонентов.

3.2.1. Биосинтез АК M. alpina на среде с очищенным глицерином

Как было отмечено в "Обзоре литературы" на момент проведения исследований в качестве перспективного, дешевого и возобновляемого субстрата для микробиологических процессов рассматривался глицерин (Chi et al., 2007; Papanikolaou et al., 2008; Fakas et al., 2009б; Rymowicz et al., 2010; Дирина и др., 2008). Показана принципиальная возможность синтеза АК микромицетами рода Mortierella при росте на средах с очищенным глицерином в условиях глубинного культивирования (Hou et al., 2008; Dedyukhina et al., 2012) и при твердофазной ферментации на овсяной крупе при добавлении 1-4 % глицерина (Петухова и др., 2010; 2013).

Известно, что необходимым условием интенсивного синтеза липидов у микроорганизмов является избыток в среде источника углерода и энергии и лимитирование роста недостатком минеральных компонентов (азота, фосфора, ионов металлов). Следует отметить, что концентрация источников углерода влияет на биосинтез АК. Так имеются сведения, что у некоторых штаммов M. alpina подавляется биосинтез липидов и АК при содержании глюкозы в питательной среде больше 140 г/л (Zhu et al., 2003). Соотношение углерода к азоту (C/N) в среде, лучшее для биосинтеза АК различными продуцентами рода Mortierella, варьируется в широком диапазоне (от 5 до 60) (Koike et al., 2001; Jang et al., 2005; Barclay et al., 2006, 2007).

Штаммы M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 выращивали в периодическом режиме в колбах, при рН 6,0 и температуре 28 °С в течение 7 и 14 суток. Среда содержала постоянную концентрацию нитрата калия (1,5 г/л) и различные концентрации глицерина (от 25 до 135 г/л). Отношение углерода к азоту (C/N) варьировалось от 46 до 253. Данные о росте штаммов M. alpina на средах с различными концентрациями глицерина течение 7 суток представлены на рисунке 5.

Как видно из рисунка 5, в вариантах с концентрацией глицерина 25 и 50 г/л (C/N 46 и 95) рост штаммов был лимитирован недостатком глицерина (концентрация остаточного глицерина

на 7-е сутки составляла лишь 1,2-2,1 г/л). В этих условиях полного потребления азота не наблюдалось; остаточная концентрация ионов N03 на 7-е сутки роста составляла 42-61 % от исходного количества (табл. 7). Во всех остальных вариантах рост грибов был лимитирован недостатком азота; на 7-е сутки роста отмечены лишь следовые количества азота; концентрация остаточного глицерина варьировала от 11 до 68 г/л (табл. 7).

25

20

1 15 -&

W

W «

g

2 10 S

W

20 40 60 80 100 120 140 160 Глицерин, г/л

•M. alpina LPM-301

•M. alpina NRRL-A-10995

Рисунок 5. Влияние содержания глицерина на ростM. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995.

5

0

0

Выявлена обратная корреляция между синтезом липидов и АК при изменении концентрации глицерина и соотношения C/N в среде (рис. 6). При содержании глицерина 25 г/л (C/N 46) биомасса M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 на 7-е сутки роста характеризовалась наименьшим количеством липидов (6,2-6,4 %) и максимальной долей АК (39,3-57,6 % от массы липидов). При повышении концентрации глицерина до 87 г/л (C/N 162) и переходе к лимиту азота содержание липидов возросло до 16,4-22,8 %. При этом доля АК в липидах у обоих штаммов снизилась до 24,4-24,7 %. Повышенное содержание доли АК в условиях дефицита углеродного субстрата может быть связано с ролью АК в качестве резервного источника углерода и энергии (Shirashi, 2007; Ho, Chen, 2008). Дальнейшее увеличение соотношения C/N в среде не оказывало существенного влияния на синтез липидов и АК у исследуемых штаммов.

70

60

50

,АК 40

ы 30

ип

и Л 20

10

0

M. alpina LPM-301

25

50 75 100 Глицерин, г/л

125

■Липиды

■АК

-

ч и п и Л

150

70 60 50 40 30 20 10 0

0

M. alpina NRRL-A-10995

25

50 75 100 Глицерин, г/л

125 150

Липиды

АК

Рисунок 6. Синтез липидов и АК 7-суточными культурами M. alpina на средах различной концентрацией глицерина

0

Следует обратить внимание на то, что наиболее высокий выход АК на 7-е сутки роста отмечен в момент перехода от лимита глицерина к лимиту азота (глицерин 87 г/л; C/N 162). У штамма M. alpina LPM-301 он составляет: 24,4 % от липидов; 5,56 % от биомассы; 1,07 г/л. У штамма M. alpina NRRL-A-10995: 24,7 % от липидов; 4,04 % от биомассы; 0,72 г/л (табл. 7). Эти результаты превышают известные в литературе данные о синтезе АК (24,8-25,1 % от липидов; 1,0-3,2 % от биомассы), видами Mortierella, выращенными на среде с очищенным глицерином (Hou et al., 2008).

Такие же изменения в синтезе липидов и АК в зависимости от содержания глицерина в среде отмечены у 14-суточных культур (табл. 8). С увеличением концентрации глицерина до 113 и 135 г/л доля липидов в биомассе обоих штаммов возросла до 25,6-31,1%. Содержание АК в липидах M. alpina NRRL-A-10995 и LPM-301 было наибольшим (52,0 и 50,9 %, соответственно) в условиях лимитирования роста глицерином (C/N 46) и затем снижалось (до 25,1 и 24,5 %, соответственно) с переходом к лимиту азота (C/N 253).

Обратная корреляция между содержанием липидов и долей в них ПНЖК отмечалась ранее у грибов пор. Zygomycetes (Dyal, Narine 2005; Chen, Chang 1996; Papanikolaou et al., 2004; Fakas et al., 2009б; Chatzifragkou et al., 2011). Было высказано предположение, что грибы, образующие небольшое количество ПНЖК, вынуждены синтезировать значительное количество липидов для обеспечения уровня ПНЖК, необходимого для функционирования клеточных мембран (Chatzifragkou et al., 2011).

Таблица 7. Влияние концентраций глицерина и отношения углерода к азоту на содержание биомассы, синтез липидов и АК 7-суточными культурами Mortierella alpina

Параметры M. alpina LPM-301 M. alpina NRRL-A-10995

Глицерин, г/л

25 50 87 113 135 25 50 87 113 135

Отношение C/N

46 95 162 211 253 46 95 162 211 253

Лимит глицерина Лимит азота Лимит глицерина Лимит азота

Биомасса, г/л 3,90±0,08 9,50±0,19 19,20±0,38 21,00±0,42 17,60±0,35 4,90±0,10 12,10±0,24 17,70±0,35 14,50±0,29 11,90±0,24

Липиды, % от биомассы 6,40±0,13 9,30±0,19 22,80±0,46 21,80±0,44 20,50±0,41 6,20±0,12 14,70±0,29 16,40±0,33 15,80±0,32 14,10±0,28

АК, % от липидов 57,60±1,15 53,10±1,06 24,40±0,49 19,80±0,40 17,90±0,36 39,3±0,79 35,40±0,71 24,70±0,49 21,50±0,43 18,50±0,37

АК, % биомассы 3,69±0,07 4,94±0,10 5,56±0,11 4,32±0,09 3,67±0,07 2,44±0,05 5,20±0,10 4,04±0,08 3,39±0,07 2,61±0,05

АК, г/л 0,15±0,01 0,47±0,01 1,07±0,02 0,91± 0,02 0,65±0,01 0,12±0,01 0,63± 0,02 0,72±0,02 0,49±0,01 0,31± 0,01

Остаточный глицерин, г/л 1,2 1,7 11,0 28,3 65,0 1,5 2,1 12,6 30,0 68,0

Остаточная концентрация Ш3-, % от начального уровня 58,0 42,0 сл сл сл 61,0 45,0 сл сл сл

Параметры M. alpina LPM-301 M. alpina NRRL-A-10995

Глицерин, г/л

25 50 87 113 135 25 50 87 113 135

Отношение С/К

46 95 162 211 253 46 95 162 211 253

Лимит глицерина Лимит азота Лимит глицерина Лимит азота

Биомасса, г/л 2,5±0,1 5,6±0,1 11,2±0,2 18,7±0,3 25,7±0,5 3,7±0,1 9,5±0,1 14,0±0,2 21,5±0,3 21,2±0,5

Выход биомассы, % (Ух/з) 10,4±0,2 11,2±0,2 13,1±0,2 16,8±0,3 23,1±0,5 15,4±0,2 19,0±0,2 16,4±0,2 19,5±0,3 19,9±0,4

Липиды, % от биомассы 3,4±0,07 3,30±0,07 12,7±0,25 28,6±0,57 31,1±0,6 6,40±0,07 11,70±0,07 20,90±0,25 25,60±0,57 22,50±0,62

Липиды, г/л 0,08±0,01 0,18±0,01 1,42±0,03 5,35±0,11 7,99±0,16 0,24 ± 0,01 1,11± 0,01 2,92±0,03 5,50±0,11 4,77±0,16

Выход липидов, % (У/з) 0,33±0,01 0,36±0,01 1,65±0,03 4,81±0,10 7,17±0,14 1,00±0,01 2,22±0,01 3,41±0,03 4,98±0,10 4,47±0,14

АК, % от липидов 50,9±1,0 45,5±0,9 40,2±1,0 33,0±0,7 24,5±0,5 52,0±1,0 50,8±0,9 46,4±1,0 24,9±0,6 25,1±0,49

АК, % от биомассы 1,73±0,03 1,50±0,03 5,11±0,13 9,27±0,19 7,62±0,15 3,33±0,03 5,94±0,03 9,69±0,13 6,37±0,19 5,65±0,15

АК, г/л 0,04±0,01 0,08±0,01 0,57±0,02 1,73±0,03 1,96±0,04 0,12±0,01 0,56±0,01 1,36±0,02 1,37±0,04 1,20± 0,04

Выход АК, % сад 0,17±0,01 0,16±0,01 0,85±0,02 1,55±0,03 1,76±0,03 0,50±0,01 1,12±0,01 1,58±0,02 1,24±0,03 1,13±0,04

Как видно из таблицы 8, переход от лимита глицерина (C/N 46) к лимиту азота (C/N 253) привел к увеличению плотности биомассы на 14-е сутки у обоих штаммов от 2,5-3,7 до 21,2-25,7 г/л. Таким образом, концентрации глицерина до 135 г/л не оказывали ингибирующего влияния на рост штаммов. Данные литературы относительно влияния глицерина на рост микроорганизмов противоречивы, в частности, высокие концентрации ОПБ (до 134 г/л) не оказывали влияния на рост Mortierella isabellina, тогда как рост АК-синтезирующих грибов M. alpina и M. zychae ингибировался уже при 60 г/л очищенного глицерина (Papanikolaou et al., 2008; Hou et al., 2008).

При переходе от лимита глицерина к лимиту азота выход биомассы от потребленного глицерина (YX/S) у M. alpina LPM-301 увеличился от 10,4 до 23,1 % и незначительно возрос у штамма NRRL-A-10995 (от 15,4 до 19,9 %) (табл. 8). Для сравнения, максимальный выход биомассы у M. isabellina составлял 15 % и снижался при высоких концентрациях неочищенного глицерина (Papanikolaou et al., 2008).

Как видно из таблицы 8, выход липидов от потребленного глицерина (YL/s) у штаммов M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 возрастал при переходе от лимита глицерина к лимиту азота и достигал максимального значения (7,17 и 4,98 %, соответственно) при отношении C/N в среде 211-253. Эти результаты сопоставимы с данными литературы, полученными для грибов M. isabellina, Cunninghamella echinulata и Zygorhynchus moelleri, выращенными на ОПБ (6-15 %) (Fakas et al., 2009ab; Chatzifragkou et al., 2011). Поскольку энергосодержание микробных липидов в 2,6 раз выше, чем у глицерина, максимальный теоретический выход липидов из глицерина (при условии, что вся энергия глицерина переходит в липиды) не может быть выше 38 % (Minkevich et al., 2010). Этот показатель, рассчитанный на основе биохимических реакций, составляет 30 % (Ratledge, 1988). Возможно, низкая эффективность превращения глицерина в липиды Zygomycetes может быть связана с нарушением регуляции ферментов первичного окисления глицерина (глицерол-киназы и глицерол-3-фосфат-дегидрогеназы) (Chatzifragkou et al., 2009).

Кроме АК (C20:4) в липидах преобладали пальмитиновая (C16) (6,1-28,4 %), стеариновая (Ci8) (2,6-16,6 %), олеиновая (C^0 (10,9-26,0 %) и линолевая (C^2) (8,9-17,8 %) кислоты (табл. 9). Снижение доли АК (C20:4) (в 2 раза) в липидах обоих штаммов при содержании глицерина 135 г/л и лимите по азоту (C/N 253) сопровождалось значительным снижением отношения олеиновой к стеариновой кислоте (С18:1/С18) и уменьшением в 2 раза отношения у-линоленовой к линолевой (С18:3/С18:2).

Таблица 9. Жирные кислоты-предшественники АК в составе липидов 14-суточных культур M. alpina выращенных на средах с различной концентрацией глицерина

Кислоты M. alpina LPM-301 M. alpina NRRL-A-10995

Глицерин, г/л

25 50 87 113 135 25 50 87 113 135

Отношение C/N

46 95 162 211 253 46 95 162 211 253

Лимит глицерина Лимит азота Лимит глицерина Лимит азота

C16 11,4±0,2 6,1±0,1 12,7±0,2 28,4±0,5 23,8±0,4 11,1±0,2 13,9±0,2 14,8±0,3 19,8±0,4 20,1±0,4

C18 3,9±0,1 7,50±0,15 6,10±0,12 сл сл 2,60±0,05 4,50±0,09 6,4±0,1 7,2±0,1 16,6±0,3

C18:1 14,2±0,2 20,3±0,4 14,2±0,2 15,6±0,3 26,0±0,5 11,3±0,2 10,9±0,2 12,3±0,2 22,5±0,4 11,4±0,2

C18:2 11,3±0,2 12,3±0,2 11,0±0,2 15,4±0,3 17,8±0,3 9,2±0,1 8,9±0,1 9,5±0,1 12,4±0,2 13,5±0,2

7-C18:3 3,1±0,1 4,1±0,1 2,7±0,1 3,5±0,1 3,1±0,1 8,4±0,1 5,9±0,1 5,5±0,1 4,8±0,1 5,9±0,1

C20:3 сл 0,6±0,1 0,3±0,1 0,9±0,1 1,0±0,1 1,3±0,1 сл сл 2,9±0,1 3,4±0,1

C20:4 50,9±1,0 45,5±0,9 40,2±1,02 33,0±0,6 24,5±0,4 52,0±1,0 50,8±1,0 46,4±0,9 24,9±0,5 25,1±0,5

C18:1/C18 3,64 2,71 2,33 сл сл 4,34 2,42 1,92 3,12 0,69

C18:2/C18:1 0,79 0,61 0,77 0,98 0,68 0,81 0,81 0,77 0,54 1,18

C18:3/C18:2 0,27 0,33 0,25 0,23 0,17 0,91 0,66 0,58 0,38 0,43

Отношение линолевой к олеиновой (С 18:2/С 18:1) кислоте изменялось незначительно, возможно это связано с тем, что низкая активность А-9-и А-6-десатураз лимитирует синтез АК у данных штаммов в условиях лимита азота (табл. 9).

В таблице 10 обобщены данные о накоплении АК у M. alpina при оптимальной концентрации глицерина и соотношении C/N. У штамма M. alpina LPM-301 на 7-е сутки роста наиболее высокая продукция АК в расчете на 1 л среды установлена при переходе от лимита углерода к лимиту азота; на 14-е сутки роста в условиях лимита азота. У штамма M. alpina NRRL-A-10995 на 7-е и 14-е сутки наиболее высокая продукция в расчете на 1 л среды установлена при переходе от лимита углерода к лимиту азота.

Таблица 10. Образование АК у M. alpina на средах с оптимальными концентрациями

глицерина

Параметры M. alpina LPM-301 M. alpina NRRL-A-10995

7 суток 14 суток 7 суток 14 суток

Глицерин, г/л 87 135 87 87

C/N 162 253 162 162

АК, % от липидов 24,4±0,4 25,1±0,4 24,7±0,49 46,4±1,0

АК, % от биомассы 5,56±0,11 7,62±0,15 4,04±0,08 9,69±0,13

АК, г/л 1,07±0,01 1,96±0,04 0,72±0,01 1,36±0,02

Таким образом, показано, что штаммы Mortierella alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 способны использовать очищенный глицерин в качестве единственного источника углерода и энергии для роста, синтеза липидов и биосинтеза АК. Наблюдалась обратная корреляция между синтезом АК и накоплением липидов. Выяснено, что условия лимитирования роста компонентами среды (углеродом или азотом) для оптимального биосинтеза АК от суммы липидов и в расчете АК на 1 л среды отличаются. Показано, что лимитирование культур источником азота не оказывало ингибирующего влияния на рост штаммов-продуцентов. На основании полученных данных можно сделать заключение, что оптимальный режим культивирования для синтеза АК должен включать лимитирование роста грибов недостатком азота при низких концентрациях остаточного глицерина. Подобные условия можно создать при дробном внесении глицерина в среду.

Основной причиной, тормозящей развитие микробиологического производства АК-содержащих липидов, является их высокая стоимость, обусловленная в значительной степени использованием дорогостоящих субстратов. В связи с вышесказанным, первостепенное значение приобретает применение для производства АК возобновляемых и дешевых углеродных субстратов.

В предыдущем разделе работы было показано, что штаммы-продуценты АК M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 способны использовать очищенный глицерин в качестве единственного источника углерода и энергии для синтеза липидов и АК. Неочищенный глицерин, образуемый в больших количествах в качестве побочного продукта при производстве биодизельного топлива, имеет очень низкую стоимость, поскольку его хранение и очистка требуют значительных финансовых затрат. В связи с этим, ГСО рассматриваются в качестве перспективного дешевого и возобновляемого углеродного субстрата для микробиологических процессов.

В первой серии опытов исследовали влияние концентрации ГСО (5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л) на рост штаммов и биосинтез АК M. alpina LPM-301 и NRRL-A-10995 при периодическом культивировании в колбах в течение 7 суток. Согласно данным литературы, максимальное накопление биомассы у различных видов рода Mortierella при росте на ГСО варьировало от 6,0 до 8,5 г/л (Papanikolaou et al., 2008; Chatzifragkou et al., 2011). Используемый в наших экспериментах образец ГСО содержал кроме глицерина большое количество жирных кислот, которые также могут ассимилироваться грибами в качестве источника углерода и энергии.

Накопление биомассы у M. alpina NRRL-A-10995 и M. alpina LPM-301 возрастало при увеличении концентрации ГСО и достигало максимальных значений 20,5 и 15,6 г/л при 30 г/л ГСО, соответственно (рис. 7).

Содержание липидов в биомассе штаммов M. alpina LPM-301 и NRRL-A-10995 возрастало с увеличением концентрации ГСО и достигало максимального значения 33,3 и 31,9 % от биомассы, соответственно, на среде с 30 г/л ГСО (рис. 8). Максимальное содержание липидов в пересчете на 1 л среды составляло 5,1-6,5 г/л.

Следует отметить, что на среде с 30 г/л ГСО практически полностью подавлялся синтез АК: только следовые количества АК (ниже 0,1%) были определены в липидах. Ингибирующее действие относительно низких концентраций ГСО на синтез АК может быть связано с наличием большого количества жирных кислот в субстрате. Имеются сведения о подавлении

экзогенными жирными кислотами активности десатураз и элонгаз, участвующих в биосинтезе ПНЖК у мицелиальных грибов (Kendrick, Ratledge 1996).

«

W

W «

я

о S

W

25 п

20 -

15 -

10 -

5

5 10 15 20 25 30 Глицерин-содержащие отходы, г/л

•M. alpina LPM-301 -ш-M. alpina NRRL-A-10995

35

Рисунок 7. Влияние концентрации ГСО на рост M. alpina при периодическом культивировании в колбах в течение 7 суток

Доля АК в липидах M. alpina LPM-301 и NRRL-A-10995 имела максимальное значение 28,7 и 14,2 % липидов, соответственно, на среде с 5 г/л ГСО. В расчете на 1 л среды наибольшее содержание АК наблюдалось при концентрации ГСО 10 г/л и обеспечивало продукцию АК 0,2 г/л у обоих штаммов (рис. 8). Для дальнейших исследований была выбрана концентрация ГСО 10 г/л.

Ч 40

30

20

M. alpina LPM-301 Липиды ш АК

40

в

30 ч

и п и

ч н

- 20

- 10

0 5 10 15 20 25 30 35 Глицерин-содержащие отходы, г/л

40

I 30 о и

»о

то20

А 10 -

п и Л

M. alpina NRRL-A-10995

♦ Липиды U АК

40

30

20

10

0 5 10 15 20 25 30 35 Глицерин-содержащие отходы , г/л

0

0

д10

0

0

0

Рисунок 8. Влияние концентрации ГСО на синтез липидов и АК у M. alpina.

В таблице 1 1 представлены сравнительные данные синтеза липидов и состава жирных кислот у M. alpina на средах с ГСО и очищенным глицерином (по 10 г/л). На средах с ГСО штаммы M. alpina LPM-301 и M. alpina NRRL-A-10995 отличались более высоким содержанием липидов (в 2,0-2,6 раза) и более высокой долей линолевой кислоты (C18:2) (в 4,7 и 4,5 раза, соответственно) по сравнению с культурами, выращенными на среде с очищенным глицерином. В липидах штаммов-продуцентов выращенных на ГСО присутствовала чуждая виду M. alpina а-линоленовая кислота (a-C18:3). Содержание арахидоновой кислоты (C20:4) от суммы липидов при культивировании продуцентов на средах с ГСО было значительно меньше, чем на очищенном глицерине (в 2,9-4,8 раз). Однако это не занижает перспективность использования ГСО для получения АК, так как в связи с более высокой долей липидов, концентрация АК в расчете на 1 л среды составляла 70 % для M. alpina LPM-301 и 57 % для M. alpina NRRL-A-10995 (от уровня, полученного на очищенном глицерине).

Таблица 11. Сравнительный анализ липидного состава у M. alpina на двух средах в условиях периодическом культивировании в колбах в течение 7 суток

Показатели Состав отходов M. alpina LPM-301 M. alpina NRRL-A-10995

ГСО глицерин ГСО глицерин

Биомасса, г/л 0 4,9+0,1 6,0+0,2 6,3+0,1 5,8+0,2

Липиды, % от биомассы 33,9±0,6 20,6±0,4 8,0±0,2 21,0±0,5 10,1±0,2

Cía 12,70±0,20 14,80±0,30 6,45±0,13 16,70±0,02 10,10±0,02

C18 18,00±0,36 следы 5,25±0,11 16,70±0,33 4,10±0,08

C18:1 11,3±0,2 28,7±0,5 12,3±0,2 16,0±0,3 9,7±0,2

C18:2 49,2±0,9 27,5±0,5 5,9±0,1 33,8±0,7 7,5±0,2

7"Ci8:3 следы 2,1±0,1 2,7±0,1 2,2±0,1 3,7±0,1

a-C18:3 8,3±0,1 2,2±0,1 0 0,3±0,1 0

C20:4 0 20,9±0,4 62,2±1,2 12,4±0,2 59,8±1,2

АК, % от биомассы 0 4,3±0,1 5,0±0,1 3,2±0,1 6,04±0,12

АК, г/л 0 0,21±0,01 0,30±0,01 0,20±0,01 0,35±0,01

В следующей серии опытов исследовали накопление биомассы, синтез липидов и АК в динамике роста штаммов M. alpina на средах с 10 г/л ГСО. Выявлена прямая корреляция между

синтезом липидов и АК в динамике роста грибов (рис. 9). Максимальное накопление АК в липидах M. alpina LPM-301 и NRRL-A-10995 происходит на 4-7 сутки роста грибов, а при более продолжительном культивировании доля АК в липидах резко снижается.

25 20 15

4 10

5

с

я , Ч 5

M. alpina LPM-301

Липиды

5 10

Время, сутки

АК

12

10

.ц

8 "й

«

6 сс я

м

4 =