Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Шкаева, Мария Александровна

• Шкаева, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шкаева, Мария Александровна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Биологические особенности цирковируса свиней второго типа.

2.2. Методы выделения и культивирования ЦВС-2.

2.3. Патологии, обусловленные ЦВСцирковирусные болезни).

2.4. Диагностика, профилактика и меры борьбы с ЦВС-2.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.•.

4.1. Получение и характеристика рекомбинантного антигена ORF2 ЦВС-2.

4.1.1. Создание генноинженерных конструкций для экспрессии генов нуклеокапсидного белка ORF

ЦВС-2 в клетках насекомых.

4.1.2. Очистка и иммунохимическая характеристика рекомбинатного нуклеокапсидного ORF2 белка.

4.2. Выбор и характеристика конъюгата.

4.3. Разработка непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа.

4.3.1. Отработка условий постановки ИФА.

4.3.2. Оптимизация условий проведения ИФА при исследовании проб в одном разведении.

4.3.3. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы.

4.4. Разработка технологии изготовления ИФА-набора для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа («ЦИРКО-СЕРОТЕСТ»).

4.4.1. Получение и характеристика положительного и отрицательного контролей для ИФА-набора.

4.4.2. Определение стабильности специфических компонентов ИФА-набора при хранении.

4.4.3. Оптимизация комплектации ИФА-набора и разработка инструкции по его применению.

4.4.4. Контроль воспроизводимости результатов, полученных с помощью ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ».

4.5. Применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» для эпизоотологического мониторинга цирковирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа»

Цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) является возбудителем болезни поросят, впервые зарегистрированной в Канаде в 1991 году, и в связи с поражением различных систем организма названной «синдромом послеотъем-ного мультисистемного истощения» (СПМИ). Болезнь характеризуется проявлением комплекса клинических признаков, включающих потерю веса, отставание в росте, одышку, диарею, желтуху и пневмонию. В естественных условиях СПМИ чаще отмечают у поросят 6-15 недельного возраста, у которых регистрируют наибольший отход, при этом пик заболеваемости приходится на 10-ти недельный возраст. У инфицированных животных вирус обнаружен в клетках лимфоидной системы (макрофагах, дендритных клетках, Т- и В- лимфоцитах), являющихся клетками-мишенями для ЦВС-2 (Орлянкин Б.Г. и др., 2002; Clarck E.G., 1997; Allan G.M. et al., 1998; Mankertz A. et al., 2000; O'Connor B. et a.l, 2001 и др.). Интенсивное размножение вируса в клетках иммунной системы приводит их к гибели и развитию иммунодефицитного состояния. У таких животных создаются условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами (Segales J. et al., 2004). В настоящее время ЦВС-2 широко распространен практически во всех странах мира и рассматривается как один из основных (первичных) патогенов, вызывающих поражения легких и развитие респираторных болезней свиней (Орлянкин Б.Г. и др., 2005; Halbur R.G., 1998).

ЦВС-2 представляет собой ДНК-содержащий вирус, относящийся к роду Circovirus семейства Circoviridae, к которому принадлежат вирус анемии цыплят (типовой вирус), ЦВС первого типа (ЦВС-1), являющийся нецитопато-генным контаминантом перевиваемой культуры клеток почек поросят; а также цирковирусы попугаев и голубей. В 1999 г. сообщалось о выделении от носителей из Японии и Западной Африки первого цирковируса человека (Hironori М. et al., 1999; Mushahwar I.K. et al., 1999).

Экономический ущерб, наносимый свинокомплексам болезнями, ассоциированными с ЦВС-2, может быть значительным, что связано с потерями от недополучения продукции и высокой смертностью поросят послеотъемного периода (Sato К. et al., 2001; Harding J.C., 2004). Кроме того, в связи с возрастающим интересом в плане использования свиней в качестве доноров, ЦВС-2 может также представлять собой потенциальную угрозу здоровью людей при передаче через орган, ткань или клеточную трансплантацию (Сатина Т.А., 2003).

Распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах различных стран мира оценивают по обнаружению вирус-специфических антител в сыворотке крови свиней методами иммуноферментного анализа (ИФА), непрямой имму-нофлюоресценции (РИФ) и выявлению вируса, вирусного антигена или вирусной ДНК в тканях и органах поросят методами электронной микроскопии, гибридизации in situ, полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также иммуногисто-химически (Onuki A. et al., 1999; Choi С. et al., 2000; Larochelle R. et al., 2000; Sibila M. et al., 2004; Racine S. et al., 2004 и др.). В нашей стране в ЗАО «НПО НАРВАК» и в ФГУ «ВНИИЗЖ» для обнаружения ЦВС-2 разработан и используется метод ПЦР (Кукушкин С.А. и др., 2005), однако этот метод достаточно трудоемок, требует дорогостоящей аппаратуры и квалифицированного персонала. В этой связи использование ИФА представляется наиболее эффективным методом мониторинга цирковирусной инфекции в популяции свиней на территории РФ.

Известно, что одним из перспективных подходов к созданию иммуно-ферментных тест систем для серологических исследований является использование в качестве антигенов рекомбинантных белков. В геноме ЦВС-2 присутствуют две большие открытые рамки считывания ORF1 и ORF2, при этом ORF2 кодирует структурный белок вириона с молекулярной массой около 30 кД, который индуцирует синтез основной массы антител при инфицировании животных (Meehan В.М. et al., 1997; Truong С. et al., 2001). Таким образом, данный белок является самым подходящим антигеном для использования в ИФА.

В мире уже существуют аналогичные разработки иммуноферментных тест-систем (Walker I.W. et al, 2000; Nawagitgul P. et al, 2002; Blanchard P. et al., 2003; Changming L. et al., 2004), однако к началу наших исследований ни одна из них не обрела форму завершенного ИФА-набора, выпускаемого на регулярной основе.

Цель работы. Разработка иммуноферментной тест-системы и технологии производства ИФА-набора для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа в сыворотках крови животных.

Основные задачи исследований:

1. Разработать технологию, получить и охарактеризовать рекомбинантный нуклеокапсидный белок ORF2 цирковируса свиней второго типа.

2. Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в сыворотках крови животных.

3. Определить диагностическую ценность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к ЦВС-2 в сравнении с методом аналогичной направленности.

4. На основе иммуноферментной тест-системы разработать технологию производства ИФА-набора. Для этого определить стабильность компонентов набора при хранении, разработать его оптимальную комплектацию и инструкцию по применению.

5. Провести испытание ИФА-набора по выявлению антител к ЦВС-2 в практических условиях с использованием сывороток крови свиней полученных от животных различных половозрастных групп.

6. Провести эпизоотологический мониторинг ЦВС-2 в отдельных свиноводческих хозяйствах РФ.

Научная новизна работы.

Разработана технология получения и очистки рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа. На основе полученных и иммунохими-чески охарактеризованных специфических реагентов разработан метод непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа в сыворотке крови свиней. Оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови свиней, взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью ИФА и РИФ.

На основе иммуноферментной тест-системы разработана оптимальная комплектация и технология производства ИФА-набора. Установлена возможность длительного хранения компонентов ИФА-набора и его диагностическая эффективность в лабораторных исследованиях, направленных на выявление антител к ЦВС-2.

Практическая значимость исследований.

На основании результатов исследований разработан и внедрен в ветеринарную практику России диагностический ИФА-набор «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» который целесообразно использовать при проведении массовых скрининговых исследований свинопоголовья для эпизоотологического мониторинга ЦВС-2. На изготовление и применение ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» разработана нормативно-техническая документация, утвержденная в установленном порядке (ТУ 9388-010-42418073-04).

Впервые проведены серологические исследования и получены данные о распространении ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ. Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по получению рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа, разработке иммуноферментной тест-системы и созданию на ее основе ИФА-набора для выявления антител к ЦВС-2;

• результаты испытаний ИФА в экспериментальных и практических условиях;

• результаты эпизоотологического мониторинга ЦВС-2 в популяции свиней на территории Российской Федерации.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 1-м Всероссийском совещании директоров ветеринарных лаборато-I рий субъектов Российской Федерации (г.Брянск, 2004); научно-производственных совещаниях сотрудников ЗАО «НПО НАРВАК» (г. Москва, 2003 - 2005 гг.); межлабораторном совещании сотрудников Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (г. Москва, 2006 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы и одна принята в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, щ списка цитированной литературы и приложения. Материалы диссертации ил

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Шкаева, Мария Александровна

6. выводы

1. Разработана технология получения рекомбинантного белка ORF2 цирковируса свиней второго типа. Установлено, что гены нуклеокапсидного белка ЦВС-2 эффективно экспрессировались в эукариотической системе экспрессии, при этом выход рекомбинантного продукта составил 0,05-0,11% от клеточной биомассы.

2. Установлено, что очищенный металлоаффинной хроматографией рекомбинантный белок ORP2 обладает выраженными антигенными свойствами, и может быть использован в качестве антигена в иммуноферментной тест-системе.

3. С использованием рекомбинантного белка ORP2 и моноклональных антител к у - цепям IgG свиньи разработан метод непрямого твердофазного ИФА, предназначенный для выявления антител к ЦВС-2. При исследовании сывороток крови свиней установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к реакции непрямой иммунофлюо-ресценции составила 96,2%, специфичность - 95,4%. Результаты ИФА и РИФ совпадали в 95,7% случаев, коэффициент корреляции результатов составил 0,88, Р< 0,05.

4. На основе иммуноферментной тест-системы разработана технология производства ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» и Инструкция по его применению. Установлено, что указанный набор пригоден для практического применения в течение одного года при хранении в режиме 4-8°С.

5. Показана высокая эффективность разработанного ИФА-набора * «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ» при проведении массовых скрининговых исследований сывороток крови свиней на наличие антител к ЦВС-2 в лабораторных и производственных условиях. Преимуществами указанного набора является экспресс-ность, воспроизводимость результатов (г = 0,9) и возможность их автоматического учета.

6. На основании серологического мониторинга в 20 свиноводческих хозяйствах различных регионов Российской Федерации, проведенного с помощью ИФА-набора «ЦИРКО-СЕРОТЕСТ», установлено широкое распространение ЦВС-2 в популяции свиней различных половозрастных групп. При этом показано, что 26% положительных проб содержали также антитела к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке технологии изготовления и применения ИФА-набора вошли в следующие нормативные документы:

- Технические условия (ТУ) № 9388-010-42418073-04 «Набор реагентов для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) им-муноферментным методом "ЦИРКО-СЕРОТЕСТ"», согласованы с Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 27.07.2005;

- Инструкция по применению набора реагентов для выявления антител к цирковирусу свиней второго типа (ЦВС-2) иммуноферментным методом "ЦИРКО-СЕРОТЕСТ", утверждена Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 27.07.2005.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шкаева, Мария Александровна, 2006 год

1. Баландина М.В. Разработка технологии производства набора реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней им-муноферментным методом. Дисс. канд. биол. наук, М., 2006, 121 с.

2. Верховский О.А. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных. Дисс.докт. биол. наук, М., 1998, 259 с.

3. Канынина А.В. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Автореф. дисс.канд. вет. наук, Владимир, 2004, 23с.

4. Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Ковалишин В.Ф., Тимина A.M., Яковлева А.С. Пролиферативно-некротизирующая пневмония свиней.// Ветеринария,- 2005.- №9.- С. 17-20

5. Мотовски А. Цирковирусни инфекции при свинетете // Веет. Мед.-2000.-Т.6, №4.-С.91-97.

6. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Современные представления о цирковирусах свиней//Сельскохозяйственная биология.-2002.-№6.-С.29-37.

7. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.Н., Непоклонов Е.А. Цирковирусная инфекция свиней. //Животноводство России.-2003.-С.24-25

8. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.Н., Непоклонов Е.А. Цирковирусная инфекция свиней.//Ветеринария, -2002. №11 .-С. 48-51.

9. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Инфекционные респираторные болезни свиней // Ветеринария, 2005.- №11. - С. 3-6.

10. Сатина Т.А. Цирковирусные инфекции свиней. Обзор литературы.// ФГУ ВНИИЗЖ, Владимир,- 2003,-С.58-71.

11. Albina Е., Truong G., Hutet Е. et al. An experimental Model of Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome (PMWS) in growing piglets //J.Comp.Pathol.2001.-V.125.-P.292-303.

12. Allan G., Meehan В., Todd D. et al. Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes //Vet.Rec.-1998.- V.142, №17.- P.467-468.

13. Allan G.M, McNeilly F, Cassidy J.P, et al. Pathogenesis of porcine circovi-rus experimental infection of colostrums deprived pigs and examination of pig foetal material .//Vet. Microbiol.- 1995.- V.44.-P. 49-64

14. Allan G.M. Porcine circivirus: Epidemiology and pathogenesis // Pig.J.-1996.-V.37.-P.14-19.

15. Allan G.M., Ellis J.A. Porcine circoviruses: a review // J.Vet.Diagn.Invest.-2000.-V.12, № 1.-P.13-14.

16. Allan G.M., Kennedy S., McNeilly F. et al. Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus //J.Comp.Pathol.-1999.-V.121, №1.-P. 1-11.

17. Allan G.M., Mackie D.P., McNair I. Et al. Production, priminary characterization and applicarions of monoclonal antibodies to porcine circovirus// Vet.Immunol.Immunopathol. 1994. - V.43, №4.-P. 357-371.

18. Allan G.M., McNeilly F., Cassidy J.P. et al. Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrums deprived piglets and examination of pig fetal material //Vet.Microbiol. 1995. - V.44, №1.- P.49-64.

19. Allan G.M., McNeilly F., Foster J.C. et al. Infection of leucocyte cell cul-4k tures derived from different species with pig circovirus //Vet.Microbiol-1994.1. V.41, №3 P. 267-279.

20. Allan G.M., McNeilly F., Kennedy S. et al. Immunostimulation, PCV-2 and PMWS //Vet.Rec.-2000.-V. 147, №6.-P. 170-171.

21. Allan G.M., McNeilly F., Kennedy S. et al. Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe//J.Vet.Diagn. Invest.- 1998.-V.10, № 1.-P.3-10.

22. Allan G.M., McNeilly F., Meehan B.M. et al. Isolation and characterization of circoviruses from pigs with wasting syndromes in Spain, Denmark and Northern Ireland // Vet.Microbiol.-1999.-V.66, №2.-P. 115-123.

23. Allan G.M., Phenix K.V., Todd D., et al. Some biological and physico-chemical proterties of porcine circovirus // J.Vet.Med.Ser.B.-1994. V.41, №1.-P. 17-26.

24. Bikour MH, Cornaglia E, Weber JM, Elazhary Y. Antigenic characterization of an H3N2 swine influenza virus isolated from pigs with proliferative and necrotizing pneumonia in Quebec//Can. J.Vet. Res. -1994.-V.58, №4.-P.287-90.

25. Bogdan J., West K., Clark E. et al. Association of porcine circovirus 2 with reproductive failure in pigs: a retrospective study, 1995-1998//Can.Vet.J.-2001. -V.42, №7.-P.548-550.

26. Borel N., Burgi E., Kiupel M. et al. Three cases of postwearing multisystemic wasting syndrome (PMWS) due to porcine circovirus type 2 (PCV) in Switzerland // Schweiz.Arch.Tierheild.-2001-V.143, №5. -P.249-255.

27. Bruderer U., Deusinger M., Schurch U., Lang A.B.- Analyses of affinity distributions within polyclonal populations of antigen- specific antibodies//J.Im-munol. Meth.,-1992.- V. 151.- P. 164.

28. Buhk H.J. Tischer.I., Koch M.A. Cloning and sequencing of the porcine cir-covirus PCV genom // Zbl. Bakteriol.Microbiol.Hyg.Ser.A., Meet. Abstr.-1985.-P.260-465.

29. Buhk H.J., Blab I., Tischer.I. Replication of negative stand DNA of the singe-stranded porcine circovirus genome //Abstr.Joint Meeting of Section Virol. And Virus Group of Soc.Gen.Microbiol.-1988.-P.54.

30. Chae C. A review of porcine circovirus 2- associated syndromes and diseases // Vet. Journal 2005- 169 (3).-P.326-336.

31. Carrasco L., Segales J., Bautista M. et al. Infestinal chlamydial infection concurrent with post weaning multisystemic wasting syndrome in pigs // Vet.Rec.-2000. -V.146, №1. -P.21-23.

32. Changming L., Takeshi I., Tetsuo N., Susumu U. Development of an ELISA Based on the Baculovirus-Expressed Capsid Protein of Porcine Circovirus Type 2 as Antigen //J.Vet.Med.Sci.-2004-V.66, №3. P. 237-242.

33. Choi C., Chae C. Colocalization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2 in porcine dermatitis and nefrology syndrome by doublelabeling technique // Vet. Pathol. -2001.-V.38.-P.436-441.

34. Choi C., Chae C. Distribution of porcine parvovirus in porcine circivirus 2 -infected pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome as shown by in-situ hybridization // J. Сотр. Pathol. -2000. V. 123, №4. -P.302-305.

35. Choi C., Chae C. In-situ hybridization for the detection of porcine circovirus in pigs with postwearning multisystemic wasting syndrome //J.Comp.Pathol.-1999.-V.121, №3.-P.265-270.

36. Choi C., Chae C., Clark E.G. Porcine postwearning multisystemic wasting syndrome in Korean pig: detection of porcine circovirus 2 infection by immunohis-tochemistry and polymerase chain reaction. // J. Vet. Diagn. Invest.-2000. V.12, №2.-P.151-153.

37. Choi Y.K., Goyal S.M., Joo H.S. Retrospective analysis of etiologic agents associated with respiratory diseases in pigs. //Can.Vet.J. -2003.-V. 44.-P. 735-737.

38. Clark E.G. Post-weaning multisystemic wasting syndrome //Proc. Am. Assoc. Swine Proct.-1997.-P.499-501.

39. Clark E.G., Harding J.C. Circovirus-an emerging swine pathogen //ISU Swine Disease Conf.Proc.-1997.-P.63-64.

40. Cutlip B.C., Mengeling W.L. Experimentally induced infection of neonatal swine with porcine parvovirus //Am.J.Vet.Res.-1975.-V.36-P.l 179-1182.

41. Daft В., Nordhausen R.W., Latimer K.S. et al. Interstitial pneumonia and lymphadenopathy associated with circoviral infection in a six-week-oid pig// 39th Meeting of the Am.Assoc.Vet.Lab.Diagn.-1996.-P.32-39.

42. Darwich L., Segales J., Mateu E. Phathogenesis of postweaning multisystemic wasting syndrome caused by Porcine circovirus 2: an immune riddle.//Arch Virol.- 2004.-V. 149.-P. 857-874.

43. Drolet R., Thibault S., D'Allaire S. et al. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS): an overview of the disease // Swine Health Prod.-1997.-V.7-P.241-245.

44. Edwards S., Sands J.J. Evidence of circovirus infection in British pigs // Vet. Rec.-1994.-V.134, № 26.-P.680-681.

45. Ellis D., Krakowka S., Lairmore m., et al. Reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets.// J.Vet.Diagn.Invest.-1999.-V.11.-P.3-14.

46. Ellis J, Clark E, Haines D, West K, Krakowka S, Kennedy S, Allan GM. Porcine circovirus-2 and concurrent infections in the field.// Vet Microbiol. -2004.- Feb 4;98(2).-P.159-163.

47. Ellis J., Hassard L., Clark E. et al. Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome //Can.Vet.J. 1998.-V.39, № 1.-P.44-51.

48. Ellis J.A., Allan G.M. The natural history of porcine circoviruses 7/ MERIAL-PMWS Symposium. Medbourne, 2000. - P. 3-19.

49. Ellis J.A., Bratanich A., Clark E.G. et al. Coinfection by porcine circoviruses and porcine parvovirus in pigs with naturally acquired postwearning multi-systemic wasting syndrome // J. Vet. Diagn. Invest.-2000.-V.12, №l.-P.21-27.

50. Ellis JA, Krakowa S, Allan G, Clark E, Kennedy S. The clinical scope of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection has expanded since 1987: an alternative perspective.// Vet Pathol. -1999.-V.36, №3.-P. 262-265.

51. Gassmann M., Focher F., Buhk H.J. et al. Replication of single-stranded porcine circovirus DNA by DNA polimerase-alpha and polimerase-delta //Biochem.biophys.Acta.-1988.-V.951 .-P. 280-289.

52. Goryo M., Suwa Т., Matsumoto S. et al. Serial propagation and purification of chicken anaemia agent in MDCC-MSB1 cell line//Avian Pathol.-1987.- V.16.-P. 149-163.

53. Haaijman J.J., Coolen J., Deen C. et al. Monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins: preparation and evaluation procedures.//Reviews on Immunoassay Technology, Ed. S.B.Pal.- The Macmillan Press LTD.-1988.-P. 59-93.

54. Halbur PG, Paul PS, Vaughn EM, Andrews JJ. Experimental reproduction of pneumonia in gnotobiotic pigs with porcine respiratory coronavirus isolate AR310.//J Vet Diagn Invest.-1993.-V.5, №2.-P. 184-188.

55. Hamel A.L., Lin L.L., Nayar G.P. Nucleotide sequence of porcine circovirusassociated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs // L.Virol. -1998.-V.72, № 6.-P.5262-5267.

56. Hamel A.L., Lin L.L.,Sachvie C. et al. PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus //Can. J.Vt. Res.-2000.-V.64, №l.-P.44-52.

57. Harding J.C. Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS): preliminary epidemiology and clinical presentation // 28th AASP.-1997.-P503-504.

58. Harding J.C. The clinical expression and emergence of porcine circovirus 2. //Vet. Microbiol. -2004-V.98, №4, -P. 131-135.

59. Harding J.C., Clark E.G., Strokappe J.H. et al. Post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS): epidemiology and clinical presentation//Swine Health

60. Prod.-1998.-№6.-P.249-254.

61. Harding J.C.S, Clark E.G., Strokappe J.H., Willson P.I., Ellis J.A. Postweaning multisystemic wasting syndrome: Epidemiology and clinical presentation. //Swine Health Prod. -1998.- V.6.- P. 249-254.

62. Harding J.C.S. Clark E.G. Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)//Swine Health and Prod. -1987.-№5.-P.201-203.

63. Hasegawa M., Shioya H., Yuyama Y. et al. Pigs confirmed to be infected with porcine circovirus 2 as ealy as 1988//J.Japan.Vet.Med.Assn.-2001.-V.54, №10.-P. 757-760.

64. Hines R.K., Lukert P.D. Porcine circovirus as a cause of congenital tremors in newborn pigs //Proc.Am.Assoc.Swine Pract.-1994.-P.344-345.

65. Hinrichs U. et al. Klinische und pathomorphologische Erscheinungsformen des porzinen Dermatitis-Nephropathie Syndroms //Amtstierarzticher Dienst.-2000.-Bd.l.-S.553-555.

66. Huedepohl В., Thacker B. Porcine circovirus: a review //Iowa State ► Univ. Vet.-1998.-V.60.№2.-.P.92-97.

67. Hulsen J. Porcine reproductive and respiratory syndrome round table discussion //Tijgschr. Diergeneesk.-2000.-V. 125, № 14.-P. 457-459.

68. Ignjatovic J. Circoviridae: new viruses of pigs, parrots and chickens// Austral. Vet. J.-1995.-V.72, № 1.-P.40.

69. Illanes O., LopezA., Miller L. et al. Lesions associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs from Prince Edward Island, Canada // J. Vet. Diagn. Invest.-2000.-V.12, №2.- P.146-150.

70. Johnson C.S., Direksin K., Joo H.S. Pathogenicity of porcine circovirus type 2 in latetrm swine fetuses //Proc. Of the 16th IPVS Cong.-Melbourne, Australia, 2000.-P.400.

71. Khilko S. N., Kirasova M. A., Kiseleva E.K., Tikhonenko Т. I. Comparison of adenoviral hexon polypeptides (monomers) and of native hexson (trimers) by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis.//Acta.Microbiol.Hungarica,-1990.-V. 37.-P. 233-245.

72. Kim J., Chae C. Differentiation of porcine circovirus 1 and 2 in formalin-wax-fixed paraffin-embedded tissues from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by in situ hybridization //Res. Vet.Sci.-2001 .-V.70.-P.265-269.

73. Kiss I., Kecskemeti S., Tuboly T. et al. New pig disease in Hugary: postweaning multisystemic wasting syndrome caused by circovirus (short communication) //Acta.Vet.Hung.-2000.-V.48,№ 4.-P.469-475.

74. Kiupel M. et al. Cellular localization of porcine circovirus in postveaning pigs with chronic wasting disease // Europ.J.Vet.Pathol.-1999.-V.5.-P.77-82.

75. Kiupel M., Stevenson G.W., Mittal S.K. et al. Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana // Vet. Pathol. 1998.-V.35,№4.-P.303-307.

76. Krakowka S., Ellis J.A., McNeilly F. et all. Activation of the immune system is the pivotal event in the production of wasting disease in pigs infected with porcine circovirus-2 (PCV-2) //Vet.Pathol.-2001.-V.38, № 1.-P.31-42.

77. Kyhse-Andersen J.- Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose.// J. Biophys.Biochem.Meth.-1984.-V.10.-P. 203-209.

78. Labarqe G.G., Nauwynck H.J., Mesu A.P., Pensaert M.B. Seroprevalence of porcine circovirus types 1 and 2 in the Belgian pig population // Vet. Q.- 2000.-V.22.-P. 234-236. Erratum in: Vet Q (2001), 23:56

79. Larochelle R., Antaya M., Morin M. et al. Typing of porcine circovirus in clinical specimens by multiplex PCR //J.Virol.Methods.-1999.-V.80,№l.-P.69-75.

80. Larochelle R., Bielanski A., Muller P. Et al. PCR detection and evidence ofshedding of porcine circovirus type 2 in boar semen//J.Clin.Microbiol.-2000.-V.38, №12.- P.4629-4632.

81. Larochelle R., Morin M., Antaya M. et al. Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR // Vet. Rec.-1999.-V.145, №5.-P. 140-142.

82. LeCann P., Albina E., Madec F. et al. Piglet wasting disease //Vet.Rec.-1997.-V.141,№ 25.-P.660.

83. Liu Q., Tikoo S.K., Babiuk L.A. Nuclear localization of the ORF2 protein encoded by porcine circovirus type2 //Virology.-2001.-V.285, № 1.-P.91-99.

84. Liu Q., Wang L., Willson P. et al. Quantitative, competitive PCR analysis of porcine circovirus DNA in serum from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome // J.Clin. Microbiol.-2000.-V.38, № 9.-P.3474-3477.

85. Liu Q., Willson P., Attoh-Poku S. et al. Bacterial expression of an immunologically reactive PCV2 ORF 2 fusion protein //Protein Expr.Purif.-2001.-V.21., №1.-P.l 15-120.

86. Lukert P.D., Allan G.M. Porcine Circovirus //Diseases of Swine.-8th ed.-Ames, Iowa USA, -1999.-P.119-124.

87. Magar R, Larochelle R, Thibault S, Lamontagne L. Experimental transmission of porcine circovirus type 2 (PCV2) in weaned pigs: a sequential study.// J.Comp.Pathol.-2000.-V. 123, №4.-P. 258-269.

88. Magar R, Robinson Y, Dubuc C, Larochelle R. Isolation and experimental oral transmission in pigs of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate.//Adv Exp Med Biol. -1995.-V.380.-P.139-144.

89. Mahe D., Blanchard P., Truo.ng C. et al. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immu-norelevant epiotopes //J.Gen.Virol.-2000.-V.81, №7.- P.1815-1824.

90. Mankertz A., Blaess G., Mankertz J. et al. Analysis of transcription and replication of porcine circovirus PCV // IXth Int.Congr.Virol.-1993.-P.76.

91. Mankertz A., Domingo M.,Folch J.M. et al. Characterisation of PCV-2 isolated from Spain, Germany and France// Virus Res.-2000.-V.66, №1,- P. 65-77.

92. Mankertz A., Mankertz J., Wolf K. et al. Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus //J.Gen.Virol.-1998.-V.79, № 2.-P381-384.

93. Mankertz J., Buhk H.J., Blaess G. et al. Transcription analysis of porcine circovirus (PCV) //Virus Genes.-1998.-V. 16, №3.-P. 267-276.

94. Mankertz J., Persson F., Mankertz A., et al. Mapping and characterization of the origin of DNA replication of porcine circovirus //J.Virol.-1997.-V.71., №3.-P. 2562-2566.

95. McNeilly F., Allan G.M., Foster J.C. et al. Effect of porcine circivirus infection on porcine alveolar macrophage function //Vet.Immunol.Immunopathol.-1996.-V.49,№4.-P.295-306

96. McNeilly F., McNair I., Mackie D.P. et al. Production, characterisation and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus 2//Arch. Virol. -2001.-V.146, № 5.- P.909-922

97. Meehan B.M., Creelan J.L., McNulty M.S. et al. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circovirus // J.Gen.Virol. 1997.- V.78, №1.-P.221-227.

98. Meehan B.M., McNeilly F., McNair I. Et al. Isolation and characterization of porcine circovirus 2 from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome // Arch. Virol,-2001 .-V. 146, №4.-P.835-842.

99. Meehan B.M., McNeilly F., Todd D. et al. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs //J.Gen.Virol.-1998.-V.79, №9-P. 2171-2179.

100. Miyata Hironori, Tsunoda Hiroaki, Kazi Aslamuzzaman et al. Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus //J.Virol.-1999.-V.73,№ 5.-P.3582-3586.

101. Morozovl., Sirinarumitr Т., Sorden S. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome // J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36, №9.- P. 2535-2541.

102. Mushahwar I.K., Erker J.C., Muerhoff A.S.et al. Molecular and biophysical characterization of TTR virus: evidence for a new virus family infecting humans //Proc.Natl.Acad.Sci.USA-1999.-V.96, №6.-P.3177-3182.

103. Nawagitgul P., Harms P.A.„ Morozov I., Thacker В J., Sorden S.D., Chal-^ ermpol Lekcharoensuk C., Paul P.S. Modified Indirect Porcine Circovirus

104. PCV) Type 2-Based and Recombinant Capsid Protein (0RF2)-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Detection of Antibodies to PCV//Clin. Diagn. Lab.Immunol.- 2002- V.9, №1.- P. 33^10.

105. Nawagitgul P., Morozov I., Bolin S.R. et al. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsidprotein //J.Gen.Virol.-2000.-V.81, №9.- P.2281-2287.

106. Nayar G.P., Hamel A., Lin L. Detection and characterization of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs.//Can. Vet. J.-1997.-V.3 8, №6.-P.385-386.

107. Niagro F.D., Forsthoefel A.N., Lawther R.P. et al. Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes; intermediates between the geminiviruses and plant circoviruses //Arch.Virol.-1998.-V.143, №9.-P.l 723-1744.

108. O'Connor В., Gauvreau H., West K. et al. Multiple porcine circovirus 2- associated abortions and reproductive failure in multisite swine production unit //Can. Vet J.-2001.-V.42,N7.-P.551-553.

109. Ohlinger V.F., Schmidt U., Pesch S. Studies on patogenetic aspects of the post weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) // Proc. Of 16th IVPS Congr. -Melborne, Australia, 2000. P.577.

110. Onuki A., Abe K., Togashi K. et al. Detection of porcine circovirus from lesions of a pig with wasting disease in Japan // J.Vet.Med.Sci.-1999.-V.61, №10.-P. 1119-1123.

111. Otaki Y., Nunoya Т., Tajima M. et al. Depression of vaccinal immunity to Mareks disease by infection with chicken anaemia agent//Avian Pathol.-1988.-V.17.-P.333-347.

112. Ouardani M., Wilson L., Jette R. Et al. Multiplex PCR for detection and typing of porcine circoviruses //J. Clin. Microbiol.-1999.-V.37, №12.- P. 3917-3924.

113. Pallares F.J., Halbur P.G., Opriessnig T. et al. Porcine circovirus type 2 (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) // J. Vet. Diagn. Invest.- 2002,-V. 14, №6.-P. 515-519.

114. Pesch S., Schmidt U., Ohlinger V.F. Proliferative necrotizing pneumonia: a result of co-infection with porcine reproductive and respiratory disease virus (PRRS) and porcine circovirus type 2 (PCV2). // Pig Progress -2000.-№9.-P.28-29.

115. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G., Metal chelate affinitychroma-tography, a new approach to protein fractionation.//Nature-1975.-V.258.-P.598-599.

116. Rodriguez-Arrioja G.M., Segales J., Balasch M, Rosell C. Quintana J., Folch J.M., Plana-Duran J., Mankertz A., Domingo M. Serum antibodies to pocine circovirus type 1 and type 2 in pigs with and without PMWS. //Vet. Rec.-2000.-V.146.-P. 762-764.

117. Rodriguez-Arrioja G.M., Segales J., Rosell C. et al. Aujeszky's disease virus infection concurrent with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs //Vet.rec.-1999.-V. 144, № 6.-P. 152-153.

118. Rosell C., Segales J., Domingo M. Hepatitis and staging of hepatic damage in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2 //Vet.Pathol.-2000.-V.37, №6.-P.687-692.

119. Rosell С., Segales J., Domingo M. Hepatitis and staging of hepatic damage in pigs naturally infected with porcine circovirus type 2// Vet.Pathol.-2000.-V.37, № 6.- P. 687-692.

120. Rosell C., Segales J., Plana-Duran J. et al. Pathological, immunohistochemi-cal, and in-situ hybridization studies of natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs //J.Comp. Pathol. -1999.-V.120, №1.- P.59-78.

121. Rovira A., Balasch M., Segales J. et al. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porsine circovirus 2// J.Virol.-2002.-V.76.-P.3232-3239.

122. Sanchez R.E., Meerts P., Nauwynck H.J., Pensaert M.B., Change of porcine circovirus 2 target cells in pigs during development from fetal to early postnatal life.//Vet.Microbiol.-2003.-V. 95.- P. 15-25.

123. Sato K., Akachi S. et al. Pathological findings of pigs infected with porcine circovirus type 2 // J.Japan Vet.Med.Assn.-2001.-V.54, №1.- P. 13-17.

124. Sato K., Shibahara Т., Ishikawa et al. Evidence of porcine circovirus infection in pigs with wasring disease syndrome from 1985 to 1999 in Hokkaido, Japan// J.Vet.Med.Sci.-2000.-V.62, №6.- P.627-633.

125. Segales J. et al. Porcine circovirus is present in cases of porcine dermatitis and nephropathy syndrome//15thInt.Pig.Vet.Proc.-Birmingham, 1998.-P.215.

126. Segales J., Alonso F., Rossell C. et al. Changes in peripheral blood leukocyte population in pins with natural postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)//Vet.Immunol.Lmmunopathol.-2001.-V.30,№l-2.-P.37-44.

127. Segales J., C.Rosell and M.Domingo Pathological findings associated with naturally acquired porcine circovirus type 2 associated disease. //Vet.Microbiol.-2004.-V. 98, №4.-P. 137-149.

128. Segales J., Domingo M. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome: a porcine circovirus type 2 infection disease //MERIAL-PMWS Symposium.-Melbourne, 2000.-P.21-31.

129. Segales J., Domingo M. Postweaning multisystemik wasting syndrome (PMWS) in pigs. A review//Vet. Q 2002-V.24.- P. 109-124.

130. Segales J., Sitjar M., Domingo M. etal. First report of post-weaning multi-systemic wasting syndrome in pigs in Spain //Vet.Rec.-1997.-V.141, №23.-P.600-601.

131. Shibahara Т., Sato K., Ishikawa Y. Pprcine circovirus induces В Lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome //J.Vet.Med.Sci.-2000.-V.62, №11.-P.l 125-1131.

132. Shibahara Т., Sato K., Ishikawa Y., Kadota K. Porcine circovirus induces В lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome.// J.Vet.Med.Sci.-2000.- V.62.- P.l 125-1131.

133. Sirinarumitr Т., Sorden S.D., Morozov I. et al. Double in situ hybridization for simultaneous detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and porcine circovirus (PCV)//J.Vet.Diagn.Invert.-2001.-V.13,№ 1.-P.68-71.

134. Smith W.J., Thomson J.R., Done S. Dermatitis/nephropathy syndrome of pigs//Vet.Rec.-l 993 .-V.132.-P.47.

135. Stevenson G.W., Kiupel M., Mittal S.K. et al. Ultrastructure of porcine circovirus in persistently infected PK-15 cells //Vet.Pathol.-1999.-V.36, №5.-P. 368378.

136. Stevenson G.W., Kiupel M., Mittal S.K. et al. Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors//J.Vet.Diagn.Invest.-2001.-V.13,№l.-P.57-62.

137. Thomson J.R. et al. A study of paseurella multocida as a possible etiolodical agent in porcine immune complex glomerulonephritis and dermatitis syndrome //15th Int.Pig. Vet.Soc.Cong.Proc.-Birmingham,-1998.-P.396.

138. Thomson JR, Maclntyre N, Henderson LE, Meikle CS, Detection of Pas-teurella multocida in pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome.// Vet.Rec.-2001.-V.149.-P. 412-417.

139. Tischer I., Bode L., Peters D. et al. Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine population of different breeding faims//Arch.Virol.-1995.-V. 140, № 4.-P.737-743.

140. Tischer I., Buhk H.J. Viral DNA from cells infected with porcine circovirus //Zbl.Bakt.Microbiol.Hyg.Ser.A.-1988.-Bd.27.-S.280-287.

141. Tischer I., Mield W., Wolff D. et al. Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus //Arch. Virol.-1986.-V.91, № 3-4.-P.271-276.

142. Tischer I., Mields W., Wolff D. et al.: Studies on the pathogenicity of porcine circovirus.// Arch.Virol. 1986.- V. 91.- P.271-276

143. Tischer I., Peters D., Rasch R. et al. Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence //Arch.Virol.-1987.-V.96, № 1-2.-P. 39-57.

144. Tischer I., Rasch R., Tochterman G. Characterization of papovirus- and pi-cornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines // Zentralbl. Bacterid., Microbiol, und Hygiene, Reihe А,- 1974.- V. 226.-P.153-167.

145. Tischer I., Rasch R., Tochtermann G. Characterization of papovavirus and picornavirus - like particles in permanent pig kidney cell lines// Zbl.Bakteriol. Mikrobiol.Hyg.Ser. A.-1974.-Bd.226.-S. 153-167.

146. Todd D., Creelan J.L., Meehan B.M. et al. Investigation of the transfection capability of cloned tandemly-repeated chicken anaemia virus DNA fragment // Arch.Virol.-1996.-V. 141.- P.1523-1534.

147. Todd D., Niagro F.D., Ritchie B.W. et al. Comparison of three animal viruses with circular singlestranded DNA genomes //Arch.Virol.-1991-V.l 17, №1-2.-P.129-135.

148. Truong С., Mahe D., Blanchard P. et al. Identification of an immunorelevent ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection //Arch.Virol.-2001.-V. 146, №6. -P. 1197-1211.

149. Vyt P., Labargue G., Pensaert H. et al. Prevalens of porcine circovirus types ^ 1 and 2 in the Belgian pig population //Proc.of the 16th IPVS Congr.-Melboume,1. Australia, -2000.-P.627.

150. Walker I.W., Konoby C.A., Jewhurst V.A. et al. Development and application of a competitive anzyme-linked immunosorbent assay for the detection of serum antibodies to porcine circovirus type 2 //J.Vet. Diagn. Invest.-2000.-V. 12, №5,- P.400-405.

151. Wellenberg G.J., Pesch S., Berndsen F.W. et al. Isolation and characterization of porcine circovirus type 2 from pigs showing signs of post-wearning multisystemic wasting syndrome in the Netherland //Vet. Q.-2000.-V.22, №3.-P.167-172.

152. West K.W., Bystrom J., Wojnarowicz C. et al. Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus-2 // J. Vet. Diagn. Invest.-1999.-V.11, № 6. P.530-532.

153. Патент Fr. 9808777. Int C17:A 61 К 39/23, A 61 P 31/12, 37/04. Vaccin circovirus et parvovirus porcine / Allan G., Meehan В., Ellis J., et al. Date de mise a la disposition du public de la demande: 21.01.00. Bulletin 00/03.