Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Каньшина, Анжелика Владимировна

• Каньшина, Анжелика Владимировна
• кандидат ветеринарных наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Каньшина, Анжелика Владимировна

1.ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

2.1.1.Классификация вируса РРСС.

2.1.2.0рганизация генома вируса РРСС, структурные и неструктурные белки.

2.1.3.Вариабельность вируса РРСС.

2.2. Особенности иммунитета при РРСС.

2.2.1.Клеточный иммунитет.

2.2.2.Гуморальный иммунитет.

• 2.3. Диагностика заболевания РРСС.

2.3.1.Обнаружение антигена вируса РРСС.

2.3.2.0бнаружение антител, специфичных к вирусу РРСС.

2.4. Критерии для стандартизации методов исследования в применении к диагностическим тестам по обнаружению антител.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней»

Актуальность темы. Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС) - вирусное заболевание, которое характеризуется главным образом серьезными расстройствами функции репродуктивной системы у свиноматок и поражением органов дыхания у поросят (42).

В качестве этиологического агента заболевания идентифицирован вирус, который классифицирован как представитель семейства Arteriviridae (27,114). Проведение молекулярно-биологических исследований вируса РРСС показало, что он представлен двумя генетически различными группами: североамериканской и западноевропейской (61).

Репродуктивно-респираторный синдром свиней впервые был зарегистрирован в США в 1987 году, а затем в Европе в 1990 году (62). С тех пор данное заболевание отмечалось в большинстве стран мира (6а,22,23,24,26,33,36,49). По приблизительным оценкам в США и Европе инфицировано свинопоголовье 50% ферм. Свиноводческим хозяйствам это заболевание приносит большой ущерб, потери годовой продукции достигают 20% (33).

В связи с этим остаются актуальными проблемы своевременной диагностики заболевания РРСС. Быстрая постановка диагноза в случае возникновения болезни обеспечивает проведение в сжатые сроки соответствующих мероприятий по ликвидации и предотвращению дальнейшего распространения заболевания.

Диагноз на заболевание РРСС ставят на основании комплекса показателей с использованием эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабораторных методов. Диагностическое значение этих методов различно и зависит от характера течения болезни. При этом необходимо, чтобы клинический диагноз был подтвержден лабораторными методами, так как заболевание имеет широкий спектр проявлений и обычно осложняется различными секундарными инфекциями (25,33).

Существующие методы лабораторной диагностики, такие как непрямая реакция иммунофлуоресценции (НРИФ), реакция нейтрализации

РН), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) (16,29,44,50,92,101,125,132,134) используются в практике, однако у каждого из этих методов есть свои недостатки и главным из них является необходимость использования нативного вирусного антигена. Получение вируса РРСС связано с определенными трудностями из-за малого его накопления в культуральных системах и в силу своих биологических особенностей он разрушается при очистке. В связи с этим представляется актуальным и целесообразным использовать в реакциях в качестве стандартного антигена рекомбинантный белок, к преимуществам которого относится неинфекционность, стабильность, известный химический состав, отсутствие посторонних белков и нуклеиновых кислот.

Для использования в ИФА самым подходящим рекомбинантным белком является нуклеокапсидный протеин (rNC), так как, во-первых, наибольшее количество вырабатываемых антител в организме при заражении вирусом РРСС образуется на нуклеокапсидный белок (44).). Во-вторых, нуклеокапсидный белок имеет общие эпитопы для антител, полученных на вирус РРСС как европейской, так и американской геногрупп (42,92). И, в третьих, исследования ряда авторов показали перспективность использования иммуноферментных тест-систем на основе этого рекомбинантного белка для диагностики РРСС (44,45,127). Поэтому разработка метода диагностики РРСС с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса РРСС является актуальной задачей для практической ветеринарии.

Цели и задачи исследования. Основная цель наших исследований заключалась в разработке непрямого варианта иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка (rNC) для выявления антител к вирусу РРСС.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать тест-систему для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) на основе прямого сэндвич-варианта ИФА;

- оптимизировать условия постановки прямого блокирующего варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней;

- разработать тест-систему на основе непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) методом последовательных разведений и оптимизировать условия постановки реакции для выявления антител методом одного разведения;

- определить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) по сравнению с ИФА наборов фирмы IDEXX (США) и фирмы HIPRA (Испания), определить корреляцию между результатами этих тестов;

- применить разработанную тест-систему на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для исследования сывороток крови на наличие антител к вирусу РРСС после заражения и иммунизации животных разными вакцинами.

Научная новизна исследований. Впервые в России разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА с применением рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для обнаружения антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней.

Предложена тест-система на основе прямого сэндвич-варианта ИФА для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) и выявления антигена вируса РРСС.

Оптимизирован блокирующий вариант ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней.

Показана корреляция между результатами выявления антител с помощью тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с применением рекомбинантного белка rNC и коммерческих наборов ИФА фирмы IDEXX (США) и фирмы HIPRA (Испания).

Проведен анализ данных, полученных при иммунологическом мониторинге свинопоголовья на наличие антител к вирусу РРСС с использованием разработанной тест-системы ИФА на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC).

Практическая значимость исследований. На основании проведенных исследований разработаны иммуноферментные тест-системы для обнаружения антигена или антител к вирусу РРСС.

Полученные результаты использованы при подготовке следующих методик, которые комиссионно испытаны, одобрены ученым советом и утверждены директором института:

Методика выявления и титрования антигена вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в прямом сэндвич варианте ИФА» (утверждена 5.11.2000г.);

Методика выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в прямом блокирующем варианте иммуноферментного анализа» (утверждена 5.11.2000г.);

Методика выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного протеина (rNC)» (утверждена 5.11.2000г.);

Методические рекомендации по выделению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) с использованием альвеолярных макрофагов свиней» (утверждены 5.11.2000г.);

Методика выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней по одному разведению в непрямом варианте иммуноферментного анализа с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного протеина (rNC)» (утверждена 5.12.2001г.).

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научной конференции «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (Владимир,2000г.), на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1997-2002гг.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 123 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 13 рисунками. Список используемой литературы включает 139 источников, из которых 121 иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту:

Тест-система на основе прямого сэндвич-варианта ИФА для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) и выявления антигенов вируса РРСС.

Тест-система на основе непрямого варианта ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней методом одного разведения.

Результаты сравнения тест-системы на основе непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) с наборами ИФА фирмы IDEXX (США) и фирмы HIPRA (Испания).

Результаты использования разработанных тест-систем для определения антител к вирусу РРСС в сыворотках крови зараженных и вакцинированных свиней и для ретроспективной диагностики заболевания свиней РРСС.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1997-2002гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, к.б.н. В.Г. Андрееву и сотрудникам института: д.в.н. Т.З. Байбикову, д.в.н. B.J1. Узюмову, к.б.н. С.В.Безбородовой, Н.С. Мудрак, А.А. Луговскому, к.в.н.

В.Ф. Ковалишину, С.А. Кукушкину, глав.техн. О.Г. Андреевой, А.Б. Смирнову, Ю.В. Зинковскому, - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы и оформлении диссертации.

Особую благодарность автор выражает доктору P.Cordioli (Институт зоопрофилактики г. Брешия (Италия)) за любезно предоставленные моноклональные антитела 4D8 и 4D5.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Каньшина, Анжелика Владимировна

6. ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) и выявления антигена вируса РРСС в различных вируссодержащих пробах на основе прямого сэндвич-варианта ИФА.

2. Оптимизированы условия постановки прямого блокирующего варианта ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней, обеспечивающие специфичность на уровне 96.4% и чувствительность на уровне 95.3% в сравнении с IDEXX-ИФА.

3. Разработана иммуноферментная тест-система для определения титра антител к вирусу РРСС в сыворотках крови переболевших и вакцинированных свиней методом последовательных разведений на основе непрямого варианта ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC).

4. Оптимизированы условия постановки непрямого варианта ИФА с использованием рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней методом одного разведения (1:40). Корреляция между результатами разработанного непрямого варианта ИФА и IDEXX-ИФА составила 0.89, чувствительность и специфичность по отношению к IDEXX-ИФА равнялись 97.7% и 93.1%, соответственно.

5. Установлено, что сенсибилизированный на планшет рекомбинантный нуклеокапсидный белок при температуре 4-8°С сохраняет активность в течение 12 месяцев (срок наблюдения). Разработанная тест-система на основе непрямого варианта ИФА при использовании одного планшета позволяет в течение рабочего дня исследовать на наличие антител к вирусу РРСС 10 проб сывороток крови методом последовательных разведений или 92 пробы методом одного разведения.

6. Показано, что разработанная тест-система на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка позволяет выявлять антитела к вирусу РРСС в сыворотках крови от зараженных животных через 14 дней и позже.

7. Установлено, что разработанная тест-система на основе непрямого варианта ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного нуклеокапсидного белка (rNC) позволяет выявлять антитела к вирусу РРСС в сыворотках крови вакцинированных животных не ранее 21 дня.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Тест-система на основе прямого сэндвич-варианта ИФА для оценки активности рекомбинантного нуклеокапсидного белка и выявления антигена вируса РРСС с помощью моноклональных антител»;

Прямой блокирующий вариант ИФА для выявления антител к вирусу РРСС в сыворотках крови свиней с использованием моноклональных антител»;

Тест-система на основе непрямого варианта ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного белка rNC для определения уровня антител к вирусу РРСС в сыворотках крови вакцинированных и переболевших свиней».

Полученные результаты использованы при подготовке 5 методик, которые комиссионно испытаны, одобрены ученым советом и утверждены директором института.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Каньшина, Анжелика Владимировна, 2004 год

1. Байбиков Т.З., Дудникова Н.С., Курман И.Я. и др. Эпизоотология, диагностика специфическая профилактика репродуктивно-респираторного синдрома свиней // Соврем, аспекты вет. патол. ж-ных: Матер, конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ-Владимир,1998-С.85-92.

2. Дудникова Н.С., Пыльнов В.А., Гусева Е.В. и др. Выделение вируса РРСС и его адаптация к перевиваемой линии клеток MARC-145 // Ветеринария.-2002.-№6.-С.23-25.

3. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика иммуноферментного анализа.-М.: Высш. школа, 1991.-288с.

4. Каменский Л.С. Статистическая обработка лабораторных и клинических данных.-М.: Медицина, 1964.-252с.

5. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных: Метод, пособие / Сост. Б.Г. Орлянкин.-М.,1998.-64с.

6. Мищенко В.А., Авилов В.М., Захаров В.М. и др. Репродуктивно-респираторный синдром свиней "синее ухо" // Ветеринария.-1994.-№9.-С.22-24.

7. Мищенко В.А. Состояние и перспективы исследований по репродуктивно-респираторному синдрому свиней // Акт. вопр. вет. вирусол.: Матер, науч.-практ. конф. ВНИИВВиМ "Классическая чума свиней-неотложные проблемы науки и практики"-Покров,1995.-С.148-151.

8. Мищенко В.А., Гусева Е.В. Экологические особенности вируса РРСС // Пробл. инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф. ВНИИЗЖ. -Владимир,1997.-С.100.

9. Орлянкин Б.Г., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И. и др. Диагностика и специфическая профилактика РРСС II Ветеринария.-2000.-№10.-С.16-19.

10. Панин А.П., Душук Р.В. Новое заболевание свиней, характеризующееся репродуктивно-респираторным синдромом // Ветеринария.-1994.-№6.-С.56-59.

11. Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике.-М.: Медицина, 1975.-152с.

12. Albina Е., Leforban Y., Baron Т. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus // Am. Assoc. Swine Pract. Newsl.-1992.-V.4.-P.30-31.

13. Andreyev V.G., Scherbakov A.V., Pylnov V.A. et.al. Genetic heterogeneity of PRRSV in Russia II 3rd Int. Symp. on PRRS and Aujeszk/s Dis.-Ploufragan, France,1999.-P.211-212.

14. Bautista E.M., Choi C.S., Molitor T.W. Cell-mediated immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus // Int. Symp.PRRS.-1995.-V.2.-P.54.

15. Bautista E.M., Choi C.S., Sumstad R. et. al. Lymphocyte proliferation response to porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) II Conf.Res.Workers Anim. Dis.-1994.-V.75.-P.83.

16. Bautista E.M., Meulenberg J.M.M., Choi C.S. PRRSV-specific cell responses in infected and vaccinated pigs // Proc.lnt.Pig.Vet.Soc.-1996.-V.14.-P.63.

17. Benfield D.A., Collins J.E., Jenny A.L. et.al. Porcine reproductive and respiratory syndrome II Disease of Swine.-7th ed.-Ames, Jowa,1992.-P.756-762.

18. Benfild D.W., Nelson E., Collins J.E. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (ATCC VR2332) // J.Vet.Diagn.lnvest.-1992.-V.4.-P.127-133.

19. Blaha Th. The "colorful" epidemiology of PRRS // Vet.Res.-2000.-V.31,№1.-P.77-83.

20. Botner A. Diagnosis of PRRS // Vet.Microbiol.-1997.-V.55.-P.295-301.

21. Botner A., Nielsen J., Bille-Hansen V. Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a Danish swine herd and experimental infection of pregnant gilts with the virus // Vet.Microbiol.-1994.-V.40.-P.351-360.

22. Cavanangh D. Nidovirales: a new order comprisinq coronaviridae and arteriviridae//Arch. Virol.-1997.-V.142.-P.629-633.

23. Choi C., Christianson W., Collins J. et. al. Antibody-dependent enhancement of SIRS virus replication //Am.Assoc.Swine Pract.Newsl.-1992.-V.4.-P.30.

24. Cho H.J., McNab В., Dubuc C. et. al. Comparative study of serological methods for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus II Can.J.Vet.Res.-1997.-V.61,№3.-P.161-166.

25. Cho H.J., Entz S.C., Magar R. et. al. Performance of ELISA antigens prepared from 8 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with homologous and heterologous antisera // Can.J.Vet.Res.-1997.-V.61,№4.-P.299-304.

26. Christianson W.T., Choi C.S., Collins J.E. et. al. Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus-infection in midgestation sows and fetuses // Can. J.Vet.Res.-1993.-V.57.-P.262-268.

27. Christianson W.T., Collins J.E., Benfield D.A. et. al. Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows // Am.J.Vet.Res.-1992.-V.54,№4.-P.485-488.

28. Christianson W.T., Joo H.S. Porcine reproductive and respiratory syndrome: a review//Swine Healt and Productions994.-V.2-P. 10-28.

29. Christopher-Hennings J., Nelson E.A., Nelson J.K. et. al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in boar semen by PCR // J. Clin. Microbiol.-1995.-V.33,№7.-P. 1730-1734.

30. Collins J.E., Benfield D.A., Christianson W.T. et. al. Swine infertility and respiratory syndrome (mystery swine disease) // MN Swine Conf. for Vet.-1991.-V.9,№15-17.-P.200-205.

31. Collins J., Dee S., Halbur P. et. al. Laboratory diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection // Swine Health and Production.-1996.-V.4.-P.33-35.

32. Conzelmann K.K., Visser N. Van Woensel P. et. al. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group //Virology.-1993.-V.193,№1.-P.329-339.

33. Cordioli P., Sala G., Brocchi E. et. al. Diagnostic use of monoclonal antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus // Proc.14th Int.Pig Vet.Soc.Cong.-Bologna, Italy,1996.-P.86.

34. Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H. et. al. Biochemical and molecular analysis of structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (a review) // 3rd lnt.Symp. on PRRS and Aujeszk/s Dis.-Ploufragan, France, 1999.-P.23-32.

35. Dea.S., Sawyer N., Alain R. et. al. Ultrastructural characteriatics and morphogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus propagated in the highly permissive MARC-145 cell clone // Adv.Exp.Med.Biol.-1995.-V.380.-P.95-98.

36. Denac H., Moser C., Tratschin J.D. et. al. An indirect ELISA for the detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen // J.Virol.Methods.-1997.-V.65,№2.-P.169-181.

37. Dewey C., Rajic A. Passive immunity due to PRRS in vaccinated and unvaccinated sow herds //Vet.Res.-2000.-V.31,№1.-P.44-45.

38. Drew T.W. Comparative serology of porcine reproductive and respiratory syndrome in eight European laboratories, using immunoperoxidase monolayer assay and enzyme-linked immunosorbent assay II Rev.Sci.Tech.OlE.-1995.-V.14,№3.-P.761-775.

39. De Vries A.A.F., Post S.M., Raamsman M.J.B. et. al. The two major envelope proteins of equine arteritis virus associate into disulfide-linked heterodimeres // J.Virol.-1995.-V.69.-P.4668-4674.

40. Edwards S., Robertson I.В., Wilesmith J. et. al. PRRS (blue-eared pig disease) in Great Britain //Am.Assoc.Swine Pract.Newsl.-1992.-V.4.-P.32-36.

41. Frey M., Ecrnisse K., Lsndgraf J. et. al. Diagnostic testing for SIRS virus at the National Veterinary Service Laboratories (NVSL) // Am.Assoc.Swine Pract.Newsl.-1992.-V.4.-P.31.

42. Gagnon C.A., Dea S. Differentiation between porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restriction fragment length polymorphism of their ORFs 6 and 7 genes // Can.J.Vet.Res.-1998.-№62.-P.110-116.

43. Gilbeit S.A., Larochelle R., Magar R. et. al. Typing of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by a multiplex PCR assay // J.CIin.Microbiol.-1997.-V.35,№1 .-P.264-267.

44. Gonin P., Pirzadeh В., Gagnon C.A. et. al. Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein // J.Vet.Diagn.lnvest.-1999.-V.11,№1.-P.20-26.

45. Harrison S.C., Skehel J.J., Wiley D.C. Virus structure /Fields Virology/-Ed. Fields B.N., Knipr D.M., Howley P.M.-3rd ed.-Philadelphia, PA.1996.-P.71-72.

46. Hayhow C.S. Development of antigen capture ELISA for detection of Enterovirus in commercial turkeys //Avian Diseases.-1993.-V.37.-P.375-379.

47. Hesse R., Couture L., Lau S. et. al. Pathogenicity of a Nebraska isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in nursing piglets // 73th Conf.Res.Work Anim.Dis.-1992.-V.11,№9-10.-P.42.

48. Houben S., Van Reeth K., Pensaert M.B. Pattern of infection with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus on swine farms in Belgium // J.Vet.Med.B.-1995.-V.42.-P.209-215.

49. Joo H.S., Park B.K., Dea S.A. et.al. Indirect fluorescent lg M antibody response of pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus //Vet. Microbiol.-1997.-V.55.-P.303-307.

50. Kapur V., Elam M.R., Pawlovich T.M. et. al. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States // J.Gen.Virol.-1996.-V.77,№6.-P. 1271-1276.

51. Keffaber K.K. Reproductive failure of unknown etiology II Am.Assoc.Swine Pract. Newsl.-1989.-V. 1 .-P. 1 -9.

52. Kim H.S., Kwang J., Yoon I.J. et. al. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopuletion of MA-104 cell line//Arch. Virol.-1993.-V.133.-P.477-483.

53. Kono Y., Kanno Т., Shimizu M. et. al. Nested PCR for detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in pigs // J.Vet.Med.Sci.-1996.-V.58,№10.-P.941-946.

54. Kwang J., Kim H.S., Joo H.S. Cloning, expression, and sequence analysis of the ORF4 gene of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus MN-1 b II J.Vet.Diagn.lnvest.-1994.-V.6,№3.-P.293-296.

55. Lager K.M., Mengeling W.L., Ackermann M.R. Pulmonary lesions in fetuses exposed in utero to porcine reproductive and respiratory syndrome virus // J.Vet.Diagn.lnvest.-1994.-V.6.-P.480-483.

56. Legeay O., Bounaix S., Denis M. et. al. Development of a RT-PCR test coupled with a microplate colorimetric assay for the detection of a swine Arterivirus (PRRSV) in boar semen // J.Virol.Methods.-1997.-V.68,№1.-P.65-80.

57. Loemba H.D., Mounir S., Mardassi H. et. al. Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus //Arch.Virol.-1996.-V.141.-P.751-761.

58. Magar R., Larochelle R., Robinson Y. et. al. Immunohistochemical detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using colloidal gold II Can. J. Vet. Res.-1993.-V.57.-P.300-304.

59. Magar R., Larochelle R., Nelsen E.A. et. al. Differential reactivity of a monoclonal antibody to the membrane protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus // Can.J.Vet.Res.-1996.-V.59.-P.232-234.

60. Mardassi H., Mounir S., Dea S. Molecular analysis of the ORFs 3 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, Quebec reference strain // Arch.Virol.-1995.-V.140.-P. 1405-1418.

61. Mardassi H., Massi В., Dea S. Intracellular syntesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus // Virology.-1996.-V.221.-P.98-112.

62. Melitor T.W., Choi C.S., Leitner G. et. al. Modulation of host immune responses following porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection // Vet.lmmunol.lmmunopathol. (In press).

63. Meng X-J., Paul P.S., Halbur P.G. et.al. Sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low high virulence United States of porcine reproductive• and respiratory syndrome virus // J.Gen.Virol.-1995.-V.76.-P.3181-3188.

64. Meng X-J., Paul P.S., Halbur P.G. Molecular cloning and nucleotide sequencing of З'-terminal genomic RNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus // J.Gen.Virol.-1994.-V.75,№7.-P.1795-1801.

65. Meng X-J., Paul P.S., Halbur P.G. et.al. Phylogenetic analysis of the putative

66. M (ORF6) and N (ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A. and Europe // Arch.Virol.-1995.-V.140.-P.745-755.

67. Meng X-J., Paul P.S., Halbur P.G. et.al. Sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low high virulence United States of porcine reproductive and respiratory syndrome virus // J.Gen.Virol.-1995.-V.76.-P.3181-3188.

68. Mengeling W.L., Lager K.M., Vorwald A.C. Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome //J.Vet.Diagn.lnvest.-1995.-V.7.-P.3-16.

69. Mengeling W.L., Vorwald A.V., Lager K.M. et. al. Comparison among strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for their ability to cause reproductive failure // Am.J.Vet.Res.-1996.-V.57.-P.834-839.

70. Meredith M.J. Review of porcine reproductive and respiratory syndrome // Proceedings of the Information Center of pig disease. Cambridge,1992.-P.32-55.

71. Meulenberg Y.Y.M. PRRSV, the virus. Review article // 3rd Int.Symp.on PRRS and Aueszk/s Dis.-Ploufragan,France,1999.-P.17-22.

72. Meulenberg Y.Y.M., De Meijer E.J., Moormann R.J.M. Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved junction sequence // J.Gen.Virol.-1993.-V.74.-P.1697-1701.

73. Meulenberg Y.Y.M., Hulst M., De Meijer E.J. et. al. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS) is related to LDVand EAV // Virology.-1993.-V. 192.-P.62-72.

74. Meulenberg Y.Y.M., Petersen-den Besten A. Identification and characterization of a sixth structural protein of Lelystad virus: the glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles // Virology.-1996.-V.225.-P.44-51.

75. Meulenberg Y.Y.M., Petersen-den Besten A., De Kluyver E. et. al. Characterizatiom of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus // Virology.-1995.-V.206.-P. 155-163.

76. Meulenberg Y.Y.M., Petersen-den Besten A., De Kluyver E. et. al. Molecular Characterization of Lelystad virus //Vet.Microbiol.-1997.-V.55.-P. 197-202.

77. Meulenberg Y.Y.M., Van Nieuwstadt A.P., Van Essen-Zandbergen A. et. al. Localization and fine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies

78. VoroIogy.-1998.-V.252,№1 .-P.106-114.

79. Morrison R.B., Collins J.E., Harris L. et. al. Serologic evidence incriminating a recently isolated virus (ATCC VR-2332) as the cause of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) //J.Vet.Diagn.lnvest.-1992.-V.4.-P.186-188.

80. Murphy F.A. Fundamental virology.-Philadelphia,1996.-P.15-57.

81. Murphy F.A., Fauquet C.M., Bishop D.H.L. et. al. Virus taxonomy the classification and nomenclature of vuruses: 6-th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.-Vienna,1995.

82. Murtaugh M.P., Elam M.R., Kakach L.T. Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus // Arch.Virol.-1995.-V. 140,№8.-P. 1451-1460.

83. Murtaugh M.P., Faaberg K.S., Lager J. et. al. Genetic varuation in the PRRS virus //Adv.Exp.Med.Biol.-1998.-V.440.-P.787-794.

84. Nelsen E.A. Christopher-Hennings J.T., Benfield D.A. Serum immune responses to the proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus // J.Vet.Diagn.lnvest.-1994.-V.6.-P.410-415.

85. Nelsen C.J., Murtaugh M.P., Faaberg K.S. Porcine reproductive and % respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents //

86. J.Virol.-1999.-V.73,№1.-P.270-280.

87. Offise International des Epizooties (OIE). Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases II Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines.-3rd ed.-Paris,1996.-P.8-15.

88. Ohlinger V., Haas В., Sallmuler A. et. al. In vivo and in vitro studies on the immunobiology of PRRS II Assoc.Swine Pract.Newsl.-1992.-V.4,№4.-P.24.

89. Ohlinger V., Ahl R., Haas B. The German experience with the swineinfertility and respiratory syndrome (SIRS) // MN Swine Conf.for Vet.-1991.-V.9,№17.-P.98-114.

90. Park B.K., Yoon I.J., Joo H.S. Pathogenesis of plague variants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pregnant sows // Am.J.Vet.Res.-1996.-V.57.-P.320-323.

91. Pirzadeh В., Dea S. Monoclonal antibodies to the ORF5 product of porcine reproductive and respiratory syndrome virus define linear neutralizing determinants // J.Gen.Virol.-1997.-V.78,№8.-P.1867-1873.

92. Plagemann P.G.W., Moennig V. Lactate dehydrogenase-elevating virus, equine arteritis virus, and simian hemorrhagic fever virus: a new group of positive-stranded RNA viruses //Adv. Virus Res.-1992.-V.41.-P.99-192.

93. Plagemann P.G.W. Lactate dehydrogenase-elevating virus and related viruses // Fields virology/ Ed.Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M.-3rd ed.-Philadelphia,Pa,1996.-P.1105-1120.

94. Proteinas recombinantes de PRRSV, kits de diagnostico у vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes : Междунар.заявка 95/31550 PCT, МПК6 C12N15/40 /Plana Duran J., Casal Alvarez J.I., Climent Sanchez J.

95. Plana Duran J., Climent I., Sarraseca J. et. al. Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain Olot/91. Involvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection // Virus Genes.-1997.-V.14.-P.19-29.

96. Plana Duran J., Mourino M., Viaplana E et. al. Vew strategies in the development of PRRS vaccines. Subunit vaccines and self-limiting vectors, based on defective coronavirus //Vet.Res.-2000.-V.31,№1.-P.41-42.

97. Pol J.M., Wagenaar F. Morfogenesis of Lelystad virus in porcine lung alveolar macrophages//Am. Assoc. Swine Pract. Newsl.-1992.-V.4.-P.29.

98. Rodriguez M.J., Sarraseca J., Garcia J. et. al. Epitope mapping of the nucleocapsid protein of European and North American isolates of porcinereproductive and respiratory syndrome virus // J.Gen.Virol.-1997.-V.78,№9.-P.2269-2278.

99. Rossow K.D., Bautista E.M., Goyal S.M. et. al. Experimental porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in one-, four-, and 10* week-old pigs // J.Vet.Diagn.lnvest.-1994.-V.6.-P.3-12.

100. Rossow K.D., Laube K.L., Goyal S.M. et. al. Fetal microscopic lesions in porcine reproductive and respiratory syndrome virus-induced abortion // Vet.Pathol.-1996.-V.33.-P.95-99.

101. Rossow K.D. Porcine reproductive and respiratory syndrome (review article) //Vet. Pathol.-1998.-V.35.-P.1-20.

102. Snijder E.J., Van Tol H., Petersen K.W. et. al. Identification of a novel structural protein of arteriviruses // J.Virol.-1999.-V.73.-P.6335-6345.

103. Sorensen K.J., Botner A., Madsen E.S. et al. Evaluation of a blocking ELISA for screening of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus //Vet. Microbiol.-1997.-V.56,№1-2.-P.1-8.

104. Stevenson G.W., Van Alstine W.G., Kanitz C.L. Characterization of infection with endemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in a swine herd // J.Am.Vet.Med.Assoc.-1994.-V.204.-P. 1938-1942.

105. Van Nieuwstadt A.P., Meulenberg Y.Y.M., Van Essen-Zaubergen A. et. al. Proteins encoded by open reading frames 3 and 4 of fhe genome of Lelystad virus (Arteriviridae) are structural proteins of the virion II J.Virol.-1996.-V.70.-P.4767-4772.

106. Van Woensel P., Van Der Wouw J., Visser N. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by the polymerase chain-reaction // J.Virol.Methods.-1994.-V.47.-P.273-278.

107. Wensvoort G., Terpstra C., Pol Y.M.A. et. al. Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus//Vet.Quart.-1991.-№13.-P. 121-130.

108. Wensvoort G., de Kluyver E.P., Luijtze E.A. et. al. Antigenic comparison of Lelystad virus from Europe and North America // 12th Int.Pig Vet.Soc.Congr.Proc.-1992.-P.113.

109. Wootton S.K., Nelson E.A., Joo D. Antigenic structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus // Clin.Diagn.Lab.lmmunol.-1998.-V.5.-P.773-779.

110. Wrigt P.F. International standarts for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection II Rev.Sci.Tech.OIE.-1998.-V.17,№2.-P.527-534.

111. Wrigt P.F., Nilsson E., Van Rooij E.M.A. et. al. Standartisation and validation of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease diagnosis // Rev.Sci.Tech.OIE.-1993.-V.12,№2.-P.435-450.

112. Yang L., Yoon K.J., Li Y. et. al. Antigenic and genetic variations of the 15 kD nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates // Arch.Virol.-1999.-V.144,№3.-P.525-546.

113. Yoon K.J., Wu L.L., Zimmerman J.J. et. al. Antibody dependet enhancement of porcine reproductive and respiratory syndrome infection in pigs //Viral. lmmunol.-1995.-V.9.-P.51-63.

114. Yoon I.J., Joo H.S., Christianson W.T. et. al. An indirect fluorescent antibody test for the detection of antibody to swine infertility and respiratory syndrome virus in swine sera //J.Vet. Diagn.lnvest.-1992.-V.4.-P.144-147.

115. Yoon I.J., Joo H.S., Christianson W.T. et. al. Persistent and contact infection in nursery pigs experimentally infected with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus // Swine Health Prod.-1993.-V.4.-P.5-8.

116. Yoon I.J., Joo H.S., Goyal S.M. et. al. A modified serum neutralization test for the detection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera II J.Vet.Diagn.lnvest.-1994.-V.6.-P.289-292.

117. Yoon K.J., Zimmerman J.J., Swenson S.L. et. al. Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus infection // J.Vet.Diagn.lnvest.-1995.-V.7,№3.-P.305-312.