Разработка технологии производства набора реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Баландина, Марина Владимировна

• Баландина, Марина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Баландина, Марина Владимировна

• 1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС): общая характеристика болезни.

2.2. Биологические особенности вируса ТГС.:.

2.3. Особенности иммунитета при ТГС.

2.4. Методы лабораторной диагностики и средства специфической профилактики ТГС.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Вирусный антиген.

3.2. Моноклональные антитела.

3.3. Испытуемые пробы биологического материала.

3.4. Получение конъюгата МкА 6С7 с пероксидазой хрена.

3.5. Методы иммуноферментного анализа. 3.6. Реакция нейтрализации вируса.з.

4 3.7. Коммерческие ИФА-наборы.

3.8. Электрофорез в ПААГ-ДСН.

3.9. Иммуноблоттинг.

3.10. Статистическая обработка результатов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Разработка непрямого варианта твердофазного ИФА на основе моноклональных антител для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней.^

4.1.1. Получение и характеристика иммунологических реагентов, предназначенных для использования в ИФА.

4.1.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу ТГС. л 4.1.3. Оценка диагностических параметров разработанной иммуноферментной тест-системы.

4.1.3.1. Определение антител к вирусу ТГС в сыворотке крови животных.

4.1.3.2. Определение антител к вирусу ТГС в молозиве иммунных свиноматок.

4.1.3.3. Оценка возможности тест-системы дифференцировать антитела к вирусу ТГС от антител к РКВС.

4.2. Разработка технологии изготовления ИФА-набора для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней «ТГС-СЕРОТЕСТ». ^

4.2.1. Определение стабильности специфических компонентов ИФА-набора при хранении.

4.2.2. Разработка оптимальной комплектации ИФА-набора и инструкции по его применению.

4.2.3. Применение ИФА-набора «ТГС-СЕРОТЕСТ» в практических условиях.

4.2.4. Контроль воспроизводимости результатов, полученных с помощью ИФА - набора «ТГС-СЕРОТЕСТ».

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии производства набора реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом»

Трансмиссивный гастроэнтерит свиней (ТГС) - высококонтагиозная инфекционная болезнь, возбудителем которой является РНК-содержащий вирус (ВТГС), относящийся к роду Coronavirus семейства Coronaviridae. Наиболее восприимчивыми являются новорожденные поросята до 2-х недельного возраста, уровень летальности среди которых может достигать 100%. С момента своего открытия (L.P.Doyle, L.M.Hutchings, 1946) и до 80-х годов прошлого столетия ТГС был широко распространен во многих странах мира с развитым свиноводством и причинял значительный экономический ущерб, исчисляемый десятками млн. долларов в год (П.И.Притулин с соавт., 1976; А.И.Собко, Е.А.Краснобаев, 1987; А.П.Старчеус, 1990; В.Н.Сюрин с соавт., 1998; L.J.Saif, 1990, 1996; D.Shoup с соавт., 1997 и др.). При этом частота вспышек заболевания возрастала в крупных свиноводческих хозяйствах. При возникновении заболевания в ранее благополучных хозяйствах погибали почти все поросята до 2-недельного возраста, в стационарно неблагополучных хозяйствах гибель поросят к отъему составляла 10-20% (В.А.Сергеев, 1993; L.J Saif & R.Wesley, 1992 и др.).

С появлением (1984) и распространением природного делеционного мутанта ВТГС - респираторного коронавируса свиней (РКВС), в европейских странах значительно сократились вспышки трансмиссивного гастроэнтерита свиней и циркуляция вируса ТГС (В.А.Сергеев с соавт., 1989; D.J. Garwes et al., 1988; H.W.Moon, 1994; T.S.Mor et al., 1998; L.Kim et al., 2000; R.D.Wesley, K.M.Lager, 2003 и др.). Однако, несмотря на то, что в настоящее время случаи заболевания ТГС являются спорадическими, по данным МЭБ, они периодически регистрируются в Европе, Северной Америке и Азии. В США при циркуляции в популяции свиней РКВС, проблема специфической профилактики ТГС не потеряла своей актуальности (L.J.Saif, 1999, 2004). Это в полной мере относится и к нашей стране, несмотря на то, что использование современных средств диагностики и вакцинопрофилактики позволило оздоровить и значительно снизить число неблагополучных по ТГС свиноводческих хозяйств (Т.И.Алипер, 2002).

В связи с тем, что ТГС может протекать в форме эпизоотии, важное значение имеет наличие современных методов лабораторной диагностики болезни, основанных как на идентификации антигена, так и на выявлении вирус-специфических антител.

Для определения вируса ТГС в клинических образцах в настоящее время используются методы иммуноферментного анализа (ИФА) в «сэндвич» варианте на основе моноклональных антител (МкА), полимеразная цепная реакция (ПЦР) и иммуноэлектронная микроскопия (L.J.Saif et al., 1977; S.Bernard et al., 1986; A.P.Van Nieuwstadt et al., 1988; I.Lanza et al., 1995; L.Enjuanes & B.A.M.Van der Zeijst, 1995; D.Paton et al., 1997; R.D. Woods, 1997; L.Kim et al., 2000; R.Chen et al., 2004; L.Rodak et al., 2005 и др.).

Для серологических исследований на ТГС, согласно стандартам МЭБ (2004), используют реакцию нейтрализации (РН), непрямой и конкурентный варианты ИФА (http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A 00098.htm). Причем в последние годы именно ИФА приобрел большое практическое значение для обнаружения ВТГС-специфических антител в сыворотке крови свиней, и за рубежом уже существуют соответствующие коммерческие ИФА-наборы (K.Sestak с соавт., 1999; S.Carman с соавт., 2002 и др.). В нашей стране проводились и проводятся научно-исследовательские работы по созданию и внедрению в практику подобных тест-систем (Т.И.Алипер с соавт., 1988; А.И.Собко с соавт., 1990; О.М.Стрижакова с соавт., 1995; О.А. Верховский с соавт., 1998 и др.), однако ни одна из них не обрела форму завершенного ИФА-набора, выпускаемого на регулярной основе.

Цель работы. Разработка иммуноферментной тест-системы и технологии производства ИФА-набора для выявления антител к вирусу ТГС в биологических жидкостях организма животных.

Основные задачи исследований:

1. Разработать методику постановки, учета и интерпретации результатов непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу ТГС в биологических жидкостях организма животных.

2. Оптимизировать условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови свиней, взятых в одном разведении.

3. Определить диагностическую ценность разработанной иммунофер-ментной тест-системы для выявления антител к вирусу ТГС в сравнении с методами аналогичной направленности.

4. Разработать технологию производства и применения ИФА-набора с определением стабильности его компонентов при хранении.

5. Провести испытание ИФА-набора по выявлению антител к вирусу ТГС в практических условиях с использованием сывороток крови свиней полученных от иммунных и неиммунных животных различных половозрастных групп.

Научная новизна работы.

Разработан принцип и определены условия адсорбции очищенного вируса ТГС с помощью моноклональных антител в лунках полистироловых микропанелей.

На основе иммунохимически охарактеризованных специфических реагентов разработан метод непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу ТГС в биологических жидкостях организма свиней и оптимизированы условия его проведения при исследовании сывороток крови животных взятых в одном разведении. В сравнительных исследованиях показана высокая чувствительность и специфичность разработанного теста и установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью разноплановых методов оценки ВТГС - специфического гуморального иммунного ответа.

Разработана оптимальная комплектация и технология производства ИФА-набора. Установлена возможность длительного хранения компонентов ИФА-набора и его диагностическая эффективность в лабораторных исследованиях, направленных на выявление антител к вирусу ТГС. Практическая значимость исследований.

На основании результатов исследований разработан и внедрен в ветеринарную практику диагностический ИФА-набор «ТГС-СЕРОТЕСТ», который целесообразно использовать при проведении массовых скрининговых исследований свинопоголовья для эпизоотологического мониторинга коро-навирусной инфекции и контроля эффективности вакцинных препаратов. Кроме того, данный набор может служить дополнительным средством ретроспективной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

На изготовление и применение ИФА-набора «ТГС-СЕРОТЕСТ» разработана нормативно-техническая документация, утвержденная в установленном порядке.

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты экспериментов по разработке иммуноферментной тест-системы и созданию на ее основе ИФА-набора для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней;

• результаты испытаний ИФА в экспериментальных и практических условиях.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научной конференции «Актуальные проблемы патологии животных, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2003); 1-м Всероссийском совещании директоров ветеринарных лабораторий субъектов Российской Федерации (г.Брянск, 2004); научно-производственных совещаниях сотрудников ЗАО «НПО НАРВАК» (г. Москва, 2003-2005 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано три научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 10 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 183 источника (29 отечественных и 154 зарубежных авторов).

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Баландина, Марина Владимировна

6. выводы

1. Разработан принцип и определены условия сенсибилизации лунок полистироловых микропанелей очищенным вирусом ТГС с помощью моно-клональных антител 1Е11. Установлено, что оптимальная иммобилизирую-щая концентрация МкА составляет 10 мкг/мл, а очищенного вирусного антигена - 60 мкг/мл.

2. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в биологических жидкостях организма животных и оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови свиней, взятых в одном разведении (1:50). Определен критерий дифференциации положительных и отрицательных результатов ИФА (Ксв.) равный 20.

3. При исследовании сывороток крови свиней установлено, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к реакции нейтрализации составила 98,46%, специфичность - 94,02%. Результаты ИФА и РН совпадали в 96,8% случаев, коэффициент корреляции результатов составил 0,9, Р < 0,05. При исследовании молозива иммунных свиноматок совпадение результатов двух методов зарегистрировано в 92,16% случаев, при г = 0,82, Р < 0,05. Показано, что данная тест-система, как и РН, не позволяет дифференцировать антитела к ВТГС от антител к респираторному коронавирусу свиней.

4. Установлено, что при исследовании сывороток крови свиней диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к референтному ИФА-набору ТСЕУ/ЯСУ-АЬ Е1А (Зуапоуа, Швеция) составила 97,2%, специфичность - 88,6%, совпадаемость результатов - 90,7%. В сравнительных исследованиях установлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью двух методов (г = 0,86, Р < 0,05).

5. На основе иммуноферментной тест-системы разработана технология производства ИФА-набора «ТГС-СЕРОТЕСТ» и Инструкция по его применению. Установлено, что указанный набор пригоден для практического применения в течение одного года при хранении в режиме 4-8°С.

6. Показана высокая эффективность ИФА-набора при проведении массовых скрининговых исследований сывороток крови свиней на наличие антител к вирусу ТГС в лабораторных и производственных условиях. Преимуществами указанного набора является экспрессность, воспроизводимость результатов (г = 0,9) и возможность их автоматического учета.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы исследований по разработке технологии изготовления и применения ИФА-набора вошли в следующие нормативные документы:

- Технические условия (ТУ) № 9388-001-42418073-05 «Набор реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней им-муноферментным методом "ТГС-СЕРОТЕСТ"», согласованы с Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 12.08.2005;

- Инструкция по применению набора реагентов для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом "ТГС-СЕРОТЕСТ", утверждена Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ 12.08.2005.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Баландина, Марина Владимировна, 2006 год

1. Алипер Т.И. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней: разработка методов лабораторной диагностики и средств специфической профилактики. Дисс. доктора биол. наук, М., 2001,350 с.

2. Алипер Т.И., Рухадзе Г.Г., Сергеев В.А., Щеглова Е.Ю. Разработка тест-систем иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Вопр. вирусол., 1988, №4, 440444.

3. Антитела. Методы./ Под ред. Д.Кэтти.- М., Мир, 1991, 287с.

4. Верховский O.A. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных. Дисс.докт. биол. наук, М., 1998, 259 с.

5. Душук Р.В. Трансмиссивный гастроэнтерит свиней. М., 1981, 56, ВНИИ-ТЭИСХ.

6. Каньшина A.B. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Автореф. дисс.канд. вет. наук, Владимир, 2004, 23с.

7. Касюк И.И., Мельникова Л.А., Осидзе Д.Ф., Пантюшенко Н.Т., Николаева Н.П., Антонюк В.П. Иммунная реакция и «лактогенный иммунитет» при пероральной вакцинации свиноматок против трансмиссивного гастроэнтерита. С.-х. биология, 1984, 7, 116-117.

8. Понд У.Д., Хауит К.А. Биология свиньи. Москва, Колос, 1983, 161-170.

9. Притулин П.И. Диагностика болезней свиней на комплексах. М., 1977.

10. Притулин П.И. Инфекционные гастроэнтероколиты свиней. М., 1975.

11. Рухадзе Г.Г., Алипер Т.И., Сергеев В.А. Какой быть вакцине против вирусных гастроэнтеритов: проблемы и перспективы. Вопросы вирусоло-гии,1998,4: 5-16.

12. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Урожай, Киев, 1993, 119-158.

13. Н.Сергеев В.А., Гурбанов С.М., Непоклонов Е.А., Курносов А.Н. Суспензионное культивирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Вопр. вирусологии 1989,1,103-106.

14. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных. М., 1983,233-235.

15. Сергеев В.А., Рухадзе Г.Г, Алипер Т.Н. Особенности иммунитета и стратегия вакцинопрофилактики вирусных инфекций. Вопросы вирусологии,1988, 4: 28-35.

16. Сергеев В.А., Рухадзе Г.Г., Алипер Т.И. и др. Получение концентрированного очищенного препарата вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и изучение его антигенных свойств.- Вопр. вирусологии, 1987, 6, 718724.

17. Сергеев В.А., Рухадзе Г.Г., Алипер Т.И. Респираторный коронавирус свиней. Вест, с.-х .науки.-1989.-№8-с.96-100.

18. Собко А.И. Иммунитет при трансмиссивном гастроэнтерите свиней. С.-х. биология, 1984, 8, 111-118.

19. Собко А.И., Краснобаев Е.А. Вирусные диареи свиней. ВНИИТЭИ агро-пром, М., 1987, 56.

20. Собко А.И., Старчеус А.П., Синицин В.А. Иммуноферментный метод диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Ветеринария, 1990, 2, 37-39.

21. Старчеус А.П. Лабораторная диагностика вирусных гастроэнтеритов свиней. Автореф. дисс.доктора вет. наук. Украинский НИ вет. институт. Киев, 1990, 42с.

22. Сюрин В.Н., Самуйленко А .Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Инфекционный гастроэнтерит свиней. В кн.: Вирусные болезни животных. Москва, 1998, 165-183.

23. Тихоненко Т.И. Генно-инженерные и биотехнологические подходы к созданию субъединичных противовирусных вакцин. Усп. совр. биол., 1985, 1: 3-19.

24. Федоров Ю.Н. Факторы иммунологической защиты у овец в системе мать- плод- новорожденный.- Дисс. доктора биол. наук, М., 1984, с.209.

25. Федорова Е.С., Непоклонов Е.А., Гальнбек Т.В. Культуральные свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТВС). Бюллетень ВИЭВ, 1985,60,29-32.

26. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и патологии. Иммунология, 1997, 5, 4-7.

27. Холод В.М. Иммуноглобулины молозива и пассивный иммунитет новорожденных животных. С.-х. Биология, 1983, 6, 127-132.

28. Ястребов А.С. Вирусные гастроэнтериты свиней (распространение, диагностика и специфическая профилактика). Автореф. дис. доктора вет.наук., Минск, 1999, 33с.

29. Almazan F, Galan С, Enjuanes L. The nucleoprotein is required for efficient coronavirus genome replication. J Virol,2004, Nov;78 (22): 12683-8.

30. Almuzan F., Gonzalez J.M., Penzes Z., Izeta A., Culvo E., Plana-Duran J., Enjuanes L. Engineering the largest RNA virus genome as an infections bacterial artificial chromosome. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 5516-5521.

31. Aynaud J.M.; Nguyen T.D.; Bottreau E.; Brun A.; Vannier P. 1985. Transmissible gastroenteritis (TGE) of swine: Survivor selection of TGE virus mutants in stomach juice of adult pigs. J. Gen. Virol. 66:1911-1917.

32. Bachmann P.A.; Haniche Т.; Danner K.; Bibrack B. 1972. Epidemiology of TGE in the pig. Zentralbl Veterinarmed (B) 19:166-174.

33. Bailey M, Haverson K, Miller B, Jones P, Sola I, Enjuanes L, Stokes CR. Effects of infection with transmissible gastroenteritis virus on concomitant immune responses to dietary and injected antigens. Clin Diagn Lab Immunol. 2004; 11(2): 337-43.

34. Ballesteros M.L., Sanchez C.M., Enjuanes L. (1997) Two amino acid changes at the N-terminal of the of transmissible gastroenteritis Coronavirus spike protein result in the loss of enteric tropism. Virology, 227: 378-388.

35. Barman N.N., Sarma D.K., Pensaert M. Detection of swine rotavirus and transmissible gastroenteritis virus in piglets with diarrhoea by sandwich ELISA. Indian J.Anim.Sci.,1998, 68, 886-887.

36. Benfield D.A., Jackwood D.J., Bae I. et al. Detection of transmissible gastroenteritis virus using cDNA probes.- Arch. Virol., 1991, 116:91-106.

37. Bernard S.; Lantier I.; Laude H.; Aynaud J.M. Detection of transmissible gastroenteritis Coronavirus antigens by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique. Am. J. Vet. Res, 1986, 47:2441-2444.

38. Berzofsky J.A. and Berkower I.J. Immunogenicity and antigen structure. In: Fundamental Immunology. Ed. by W.E.Paul.- Raven Press, New York, 1993, 235-282.

39. Bohl E.H., Saif L.J. 1975. Passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine: Immunoglobulin characteristics of antibodies in milk after inoculating virus by different routes. Infect. Immun. 11:23-32.

40. Bohl E.H.; Frederick G.T.; Saif LJ. 1975. Passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine: Intramuscular injection of pregnant swine with a modified live-virus vaccine. Am. J. Vet. Res. 36:267-271.

41. Brian DA, Baric RS. Coronavirus genome structure and replication. CurrTop Microbiol Immunol.,2005, 287:1-30.

42. Britton P.; Mawditt K. L; Page K. W. 1991. The cloning and sequencing of the virion protein genes from a British isolate of porcine respiratory Coronavirus: Comparison with transmissible gastroenteritis virus genes. Virus Res. 21:181198.

43. Brown T.T. 1981. Laboratory evaluation of selected disinfectants as viricidal agents against porcine parvovirus, Pseudorabies virus, and transmissible gastroenteritis virus. Am. J. Vet. Res. 42:1033-1036.

44. Bruderer U., Deusinger M., Schurch U., Lang A.B.- Analyses of affinity distributions within polyclonal populations of antigen- specific antibodies.- J. Immunol. Meth., 1992, 151, 164.

45. Callebaut P.; Enjuanes L; Pensaert M. 1996. An adenovirus recombinant expressing the spike glycoprotein of porcine respiratory Coronavirus is immunogenic in swine. J. Gen. Virol. 77:309-313.

46. Cartwright S.F. 1968. Transmissible gastroenteritis of swine (TGE). Br. Vet. J. 124:410-413.

47. Chen R, Huang W, Lin Z, Zhou Z, Yu H, Zhu D. Development of a novel realtime RT-PCR assay with LUX primer for the detection of swine transmissible gastroenteritis virus. J Virol Methods. 2004, 122(1):57-61

48. Chu R.M.; Li N.J.; Glock R. D.; Ross R.F. 1982. Application of peroxidase staining technique for detection of transmissible gastroenteritis virus in pigs. Am. J. Vet. Res. 43:77-81.

49. Costantini V, Lewis P, Alsop J, Templeton C, Saif LJ. Respiratory and fecal shedding of porcine respiratory Coronavirus (PRCV) in sentinel weaned pigs and sequence of the partial S-gene of the PRCV isolates. Arch Virol. 2004 May; 149 (5): 957-74.

50. Cough P.M., Jorgenson R.D. 1983. Identification of porcine transmissible gastroenteritis virus in house flies (Musca domestica Linneaus). Am. J. Ve.t Res. 44:2078-2082.

51. Cox E., Pensaert M.B., Callebaut P. Intestinal protection against challenge with transmissible gastroenteritis virus of pigs immune after infection with the porcine respiratory Coronavirus. Vaccine, 1993,11:267-272.

52. Crouch C.F. Vaccination against rota- and coronaviruses in cattle and pigs: enhancement of lactogenic immunity.- Vaccine, 1985, 3, 284-291.

53. Delmas B. And Laude H. 1991. Carbohydrate-induced conformational changes strongly modulate the antigenicity of Coronavirus TGIV glycoprotein S and M. Virus Res., 20, 107-120.

54. Delmas B.; Gelfi J.; L'Haridon R.; Vogel L.K.; Sjestrem H.; Noren 0.; Laude H. 1992. Aminopeptidase N is a major receptor for the enteropathogenic Coronavirus TGEV. Nature. 357:417-420.

55. Delmas, B.; Rasschaert. D.; Godet, M.; Gelfi, J.; Laude. H. 1990. Four major antigenic sites of the Coronavirus transmissible gastroenteritis virus are located on the amino-terminal half of spike glycoprotein S. J. Gen. Virol. 71:13131324.

56. O.Derbyshire B., Nagy E., Reddy S., Tuboly T. Transmissible gastroenteritis in swine. Development of a recombinant virus vaccine. Agri-food, Res. Ontario, 1995, 18, 12-14.

57. Doyle L.P., Hutchings L.M. A tansmissible gastroenteritis in pigs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1946, 108:257-259.

58. Eijuanes L., Brian, D., Cavanagh D.e.a. Family Coronaviridae. In: Virus Taxonomy, Seventh report of the ICTV. San Diego, California USA,2000: 835849.

59. Enjuanes L, Sola I, Alonso S, Escors D, Zuniga S. Coronavirus reverse genetics and development of vectors for gene expression. Curr Top Microbiol Immunol. 2005;287:161-97

60. Enjuanes L., Van der Zeijst B.A.M. Molecular basis of transmissible gastroenteritis virus epidemiology. In The Coronaviridae. Ed. S.G. Siddell. New York: Plenum Press, 1995,337-376.

61. Escors D, Capiscol C, Enjuanes L. Immunopuriflcation applied to the study of virus protein composition and encapsidation. ,2004, Aug;l 19(2):57-64.

62. Frederick G.T.; Bohl E.H.; Cross R.F. 1976. Pathogenicity of an attenuated strain of transmissible gastroenteritis virus for newborn pigs. Am. J. Vet. Res. 37:165-169.

63. Furuuchi S., Shimizu Y. and Kumagai T. Multiplication of low and high cell culture passaged strains of transmissible gastroenteritis virus in organs of newborn piglets. Vet.Microbiol., 1979, -3:169-178.

64. Furuuchi S.; Shimizu M.; Shimizu Y. 1978. Field trials on transmissible gastroenteritis live virus vaccine in newborn piglets. Natl. Inst. Anim. Health Q., (Tokyo)^: 135-142.

65. Furuuchi S.; Shimizu Y.; Kumagai T. 1976. Vaccination of newborn pigs with an attenuated strain of transmissible gastroenteritis virus. Am. Vet. Res., 37:1401-1404.

66. Garwes D.J.; Stewart F.; Cartwright S.F.; Brown I. Differentiation of porcine Coronavirus from transmissible gastroenteritis virus. Vet. Ree,1988, 122:86-87

67. Godet M.: Rasschaert D.; Laude H. 1991. Processing and antigenicity of entire and anchor-free spike glycoprotein S of Coronavirus TGEV expressed by recombinant baculuvirus. Virology, 185:732-740.

68. Godet M.; Grosclaude J.; Delmas B.; Laude H. 1994. Major receptor-binding and neutralization determinants are located within the same domain of the transmissible gastroenteritis virus (coronavirus) spike protein. J. Virol. 68:8008-8016.

69. Godet M.; L'Haridon R.; Vautherot J.-F.; Laude H. 1992. TGEV corona virus ORF4 encodes a membrane protein that is incorporated into virions. Virology 188:666-675.

70. Gomez N., Wigdorovitz A., Castanon S., Gil F, Ordas R., Borca M.V., Escribano J.M., Oral immunogenicity of the plant derived spike protein from swine-transmissible gastroenteritis coronavirus. Arch. Virol., 2000, 145, 1725-1732.

71. Haaijman J.J., Coolen J., Deen C. et al. Monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins: preparation and evaluation procedures. In: Reviews on Immunoassay Technology, Ed. S.B.Pal.- The Macmillan Press LTD, 1988, 59-93.

72. Haas B.; Ahí R.; Bohm R.; Strauch D. Inactivation of viruses in liquid manure. Rev. Sci. Tech. Off Int. Epiz, 1995,14:435-445.

73. Halbur P.; Paul P.; Vaughn E. 1994. Virulent porcine respiratory coronavirus isolates exist in the United States. Proc. Int. Congr. Pig. Vet. Soc. 13:70.

74. Halbur P.G.; Paul P.S.; Vaughn E.M.; Andrews J.J. 1993. Experimental reproduction of pneumonia in gnotobiotic pigs with porcine respiratory coronavirus isolate AR310. J. Vet. Diagn. Invest. 5:184-188.

75. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. (1995) Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science, 268: 714-716.

76. Harada K., Kumagai T, Sasahara J., 1963. Cytopathogenicity of transmissible gastroenteritis virus in pigs. Natl. Inst. Anim. Health Q., 3:166-167.

77. Harada K.; Kaji T.; Kumagai T.; Sasahara J. 1968. Studies on transmissible gastroenteritis in pigs. IV. Physicochemical and biological properties of TGE virus. Natl. Inst. Anim. Health Q (Tokyo) 8:140-147.

78. Henning E.R., Thomas P.C. Comparison of intramuscular and oral modified live virus TGE vaccines. Vet. Med. Small. Anim. Clin., 1981,76:1789-1792.

79. Horzinek M.C; Lutz H.; Pedersen N.C. 1982. Antigenic relationships among homologous structural polypeptides of porcine, feline, and canine coronavi-ruses. Infect. Immun. 37:1148-1155.

80. Jabrane A., Girard C., Elazhary Y. Pathogenicity of porcine respiratory Coronavirus isolated in Quebec. Can. Vet.J., 1994,35:86-92.

81. Jones T., Pritchard G., Paton D. Transmissible gastroenteritis of pigs. Vet. Ree., 1997,141, 427-428.

82. Jung K, Chae C. Effect of temperature on the detection of porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus in fecal samples by reverse transcription-polymerase chain reaction. J Vet Diagn Invest. 2004; 16(3): 237-9.

83. Kaji T, Shimizu Y. 1978. Passive immunization against transmissible gastroenteritis virus in piglets of ingestions of milk of sows inoculated with attenuated virus. Natl. Inst. Anim. Health Q. (Tokyo) 18:43-52.

84. Kemeny L.J.; Wiltsey V.L; Riley J.L. 1975. Upper respiratory infection of lac-tating sows with transmissible gastroenteritis virus following contact exposure to infected piglets. Cornell. Vet. 65:352-362.

85. Khilko S. N., Kirasova M. A., Kiseleva E.K., Tikhonenko T. I. Comparison of adenoviral hexon polypeptides (monomers) and of native hexson (trimers) by SDS-polyacrilamide gel electrophoresis. Acta Microbiologica Hungarica, 1990,37, 233-245.

86. Komania H., Makabet T., Fukusho A., Shimizu Y. Isolation of transmissible gastroenteritis virus from feces of cliarrheic pigs in roller culture of CPK cells in the presence of trypsin. Jap. J. Vet. Sei., 1986,48, 1245-1248.

87. Kyhse-Andersen J.- Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from Polyacrylamide to nitrocellulose.- J. Biophys. Biochem. Meth., 1984, 10, 203-209.

88. Laemmli U.K.- Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.- Nature, 1970, 227,680-685.

89. Lai M.M.C., Cavanagh. The molecular biology of coronaviruses. Adv. Virus Res., 1997,48, 1-100.

90. Lai M.M.C., Holmes K.V. Coronaviridae:the viruses and their replication. In: Field virology. Philadelphia USA,2001.1: 1163-1185.

91. Lamphear BJ, Jilka JM, Kesl L, Welter M, Howard JA, Streatfield SJ. A corn-based delivery system for animal vaccines: an oral transmissible gastroenteritis virus vaccine boosts lactogenic immunity in swine. Vaccine. 2004; 22 (19): 2420-4.

92. Lanza I.; Shoup D.I.; Saif L.J. 1995. Lactogenic immunity and milk antibody isotypes to transmissible gastroenteritis virus in sows exposed to porcine respiratory Coronavirus during pregnancy. Am. J. Ve.t Res. 56:739-748.

93. Laude H.; Gelfi J.; Lavenant L; Charley B. 1992. Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the Coronavirus transmissible gastroenteritis virus. J. Virol. 66:743-749.

94. Laude H.; Rasschaert D.; Ddams B.; Godet M.; Gelfi J.; Charley B. 1990. Molecular biology of transmissible gastroenteritis. Vet. Microbiol. 23:147-154.

95. Laude H.; Van Reeth K.; Pensaert M. 1993. Porcine respiratory Coronavirus: Molecular features and virus-host interactions. Vet. Res. 24:125-150.

96. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G. and Smith-Gill S.J. Epitopes on protein antigens: Misconceptions and realities.- Cell, 1990, 61, 553-556.

97. Lee K.M.; Moro M.; Baker J.A. 1954. Transmissible gastroenteritis in pigs. Am. J. Vet. Res. 15:364-372.

98. Liu C., Kokuho T., Kubota T., Watanabe S., Inumaru S., Yokomizo Y. & Onodera T. (2001). A sérodiagnostic ELISA using recombinant antigen of swine transmissible gastroenteritis virus nucleoprotein. J. Vet. Med. Sei., 63, 1253-1256.

99. Manopo I, Lu L, He Q, Chee LL, Chan SW, Kwang J. Evaluation of a safe and sensitive Spike protein-based immunofluorescence assay for the detection of antibody responses to SARS-CoV. J. Immunol. Methods, 2005, Jan; 296 (1-2):37-44.

100. Mason H.S., Bali J.M., Shi J-J., Jiang X., Estes M.K., Arntzen C.J. 1996. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93: 53355340

101. Matisheck P.; Emerson W.; Searl R.C. 1982. Results of laboratory and field tests of TGE vaccine. Vet. Med. Small. Anim. Clin. 77:262-264.

102. McClurkin A.W.; Stark S.L.; Norman J. 0. 1970. Transmissible gastroenteritis (TGE) of swine: The possble role of dogs in the epizootiology of TGE. Can. J. Comp. Med. 34:347-349.

103. McGoldrick A., Lowings J.P., Paton D.J. Characterisation of a recent virulent transmissible gastroenteritis virus from Britain a deletion ORF 3a. Arch. Virol., 1999, 144, 763-770.

104. McGoldrick A., Lowings J.P., Paton D.J. Characterization of a recent virulent transmissible gastroenteritis virus from Britain a deletion ORF 3a. Arch. Virol., 1999, 144, 763-770.

105. Moon H.W. 1978. Mechanisms in the pathogenesis of diarrhea: A review. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172:443-448.

106. Moon H.W. Pathophysiology of viral diarrhoea. In: Viral infections of the gastrointestinal tract. Marcel. Dekker. Inc. New York, 1994, 27-52.

107. Moon H.W.; Norman J.O.; Lambert G. 1973. Age dependent resistance to TGE of swine. I. Clinical signs and some mucosal dimensions in the small intestine. Can. J. Comp. Med. 37:157-166.

108. Mor T.S., Gomez-Lim M.A., Palmer K.E. Perspective: edible vaccines a concept coming of age. Trends Microbiol., 1998, 6, 449-453.

109. Nelson L.D., Kelling C.L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of transmissible gastroenteritis virus antibody in swine sera.- Am. J. Vet. Res., 1984,45:1654-1657.

110. Nitte K. H., Walther C. 1976. Age-dependent susceptibility of pigs to infection with the virus of transmissible gastroenteritis. Proc. Int. Congr. Pig. Vet. Soc. 4:K3.

111. Nöda M., Koide F., Asagi M., Inaba Y. Physicochemical properties of transmissible gastroenteritis virus hemagglutinin. Arch. Virol., 1988, 99, 163-172.

112. Nöda M.; Yamashita H.; Koide F.; Kadoi K.; Omori T.; Asagi M.; Inaba Y. 1987. Hemagglutination with .transmissible gastroenteritis virus. Arch. Virol. 96:109-115.

113. O'Connor J.B., Brian D.A. The major product of porcine transmissible gastroenteritis Coronavirus gene 3b is an integral membrane glycoprotein of 31 kDa. Virology, 1999,256, 152-161.

114. O'Toole D.; Brown I.; Bridges A.; Cartwright S.F.1989. Pathogenicity of experimental infection with"pneumotropic" porcine Coronavirus. Res. Vet. Sci.47:23-29.

115. Pabst R., Binns R.M. The immune system of the respiratory tract in pigs. Vet. Immunol. Immunopathol, 1994,43, 151-156.

116. Paton D, Ibata G, Sands J, McGoldrick A. Detection of transmissible gastroenteritis virus by RT-PCR and differentiation from porcine respiratory Coronavirus. J. Virol. Methods,1997, 66: 303-309

117. Pedersen N.C.; Ward J.; Mengeling W.L. 1978. Antigenic relationship of the feline infectious peritonitis virus to coronaviruses of other species. Arch. Virol. 58:45-53.

118. Pensaert M., Callebaut P., Vergote J. Isolation of a porcine respiratory, non-enteric Coronavirus related to transmissible gastroenteritis.- Vet. Q., 1986, 8:257-261.

119. Pensaert M.B. 1989. Transmissible gastroenteritis virus (respiratory variant). In Virus Infections of Porcines. Ed. M. B. Pensaert. Amsterdam: Elsevier Science, 154-165.

120. Pensaert M.B. Immunity in TGE of swine after infection and vaccination. In Viral Enteritis in Humans and Animals. Ed. F. Bricout and R. Scherrer. IN-SERM (Paris),1979, 90:281-293.

121. Posthumus W.P., Lenstra J.A., Schaaper W.M. et al. Analysis and simulation of a neutralizing epitope of transmissible gastroenteritis virus. J. Virol., 1990, 64: 3304-3309.

122. Posthumus W.P.; Lenstra J.A.; Schaaper W.M. Van Nieuwsradt A.P., En-juanes L. Meloen R.H. 1990. Analysis and simulation of a neutralizing epitope of transmissible gastroenteritis virus. J. Virol. 64:3304-3309.

123. Poul P.S., Zhu X.L., Vaughan E. Current strategies for the development of effication vaccines for transmissible gastroenteritis in swine. Proc. U.S. Anim. Health Ass. Ann. Meet., 1998,92,429-443.

124. Pritchard G.C. Transmissible gastroenteritis in endemically infected breeding herds of pigs in East Anglia, 1981-1985. Vet. Ree., 1987, 120:226-230.

125. Rasschaert D.; Duarte M.; Laude H. 1990. Porcine respiratory coronavirius differs from transmissible gastroenteritis virus by a few genomic deletions. J Gen. Virol. 71:2599-2607.

126. Risco C; Anton I.M.; Enjuanes L.; Carrascosa J.L.1996. The transmissible gastroenteritis Coronavirus contains a spherical core shell consisting of M and N proteins. J. Virol., 70; 4773-4777.

127. Rodak L, Smid B, Nevorankova Z, Valicek L, Smitalova R. Use of monoclonal antibodies in blocking ELISA detection of transmissible gastroenteritis virus in faeces of piglets. : J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health. 2005; 52(3): 105-11.

128. Roth J.A.- Immune system. In: A.D.Leman, B.E.Straw, W.L.Mengeling et al. (Eds.), Diseases of Swine, 7th edn. Iowa State Univ. Press, Ames, 1992, 2139.

129. Rottier P.J.M., Siddell S.G., Spaan W.J.M., Taguchi F. W., Talbot P. Family Coronaviridae. In: Virus Taxonomy. Seventh report of the ICTV. Academic Press, 2000, 835-849.

130. Rukhadze G.G., Aliper T.I. & Sergeev V.A. (1989). Isolation of peplomer glycoprotein E2 of transmissible gastroenteritis virus and application in enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., 27, 1754-1758.

131. Saif L. J. Coronavirus immunogens. Vet. Microbiol., 1993, 37, 285297

132. Saif L.J. Comparative aspects of enteric viral infections. In: Viral diarrhoeas of man and animals. CRC Press., Boca Raton, 1990, 9-31.

133. Saif L.J. Enteric viral infection of swine. In: Proc. 15th IPVS congress, Birmingham, 1998, 1,57-61.

134. Saif L.J. Mucosal immunity: an overview and studies of enteric and respiratory Coronavirus infection in a swine model of enteric disease.- Vet.Immunol. Immunopathol, 1996, 54,163-169.

135. Saif L.J., Bohl E.H. 1983. Passive immunity to transmissible gastroenteritisivirus: Intramammary viral inoculation of sows. Ann. NY Acad. Sei. 409:708723.

136. Saif L.J., Bohl E.H., 1979. Passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine: immunoglobulin classes of milk antibodies after oral-intranasal inoculations of sows with a live low cell culture-passaged virus. Am. J. Vet. Res. 40:115-117.

137. Saif L.J.; Bohl E.H.; Kohler E.M.; Hughes J.H. 1977.1mmune electron microscopy of transmissible gastroenteritis virus and rotavirus (reovirus-like agent) of swine. Am. J. Vet. Res. 38:13-20.

138. Saif L.J.; Van Cott J.L.; Brim T.A. Immunity to transmissible gastro* enteritis virus and porcine respiratory Coronavirus infections in swine. Vet. Immunol. immunopathol, 1994,43:89-97.

139. Saif L.J.; Wesley R.D. Transmissible gastroenteritis and porcine respiratory Coronavirus. In: Disesases of Swine. Iowa State Univ. Press., 1999, 295-325.

140. Saif LJ. Animal Coronavirus vaccines: lessons for SARS. Dev Biol (Basel). 2004; 119:129-40.

141. Sanchez C.M., Gebauer F., Sune C., Mendez A., Dopazo J., Enjuanes L. 1992. Genetic evolution and tropism of transmissible gastroenteritis coronavi-ruses. Virology 190:92-105.

142. Sestak K., Meister R.K., Hayes J.R. et al. Active immunity and T-cell populations in pigs intraperitoneally inoculated with baculovirus-expressed transmissible gastroenteritis virus structural proteins.- Vet. Immunol. Immunopathol, 1999, 70, 203-221.

143. Shepherd R.'W.; Gall D.G.; Butler D.G.; Hamilton J.R. Determinates of diarrhea in viral enteritis: The role of ion transport and epitelial epithelial changes in the ileum in transmissible gastroenteritis in piglets. Gastroenterology, 1979,76:20-24.

144. Shibley G.P., Salsbury D.L., Djurickovic S.M., Johnson G. Application of an intramammary route of vaccination against transmissible gastroenteritis in swine. Vet. Med. Small. Anim. Clin., 1973, 68:59-61.

145. Shoup D.I., Jackwood D.J., Saif L.J. Active and passive immune responses to transmissible gastroenteritis virus (TGEV) in swine inoculated with recombinant baculovirus-expressed TGEV spike (S) glycoprotein vaccines. Am. J. Vet. Res., 1997, 58:242-250.

146. Siddell S.G. The coronaviridae: An introduction. In the coronaviridae. Ed. S. G. Siddell. New York: Plenum Press, 1995,1-10.

147. Simkins R.A., Weilnau P.A., Van Cott J. et al. Competition ELISA, using monoclonal antibodies to the TGEV S protein, for serologic differentiation of pigs infected with TGEV or porcine respiratory Coronavirus. Am. J. Vet. Res., 1993, 54:254-259.

148. Sprino P.J., Ristic M. Intestinal, pulmonary, and serum antibody responses of feeder pigs exposed to transmissible gastroenteritis virus by oral and oralintranasal routes of inoculation. Am. J. Vet. Res, 1982, 43:255-261.

149. Stepanek J.; Mensik J.; Franz J.; Hornich M. Epizootiology, diagnosis and prevention of viral diarrhoea in piglets under intensive husbandry conditions. Proc. 21st World Vet. Congr., Moscow, 1979, 6:43.

150. Stokes C.R., Bailey M., Wilson A.D. Immunology on the porcine gastrointestinal tract. Vet. Immunol. Immunopathol., 1994,43, 143-150.

151. Tizard I.R. Veterinary immunology. An introduction. W.B. Saunders Company, Phyladelphia, 2000, 222-234.

152. Torres J.M.; Alonso С; Ortega A.; Mittal S.; Graham F., Enjuanes L. Tro-pism of human adenovirus type 5-based vectors in swine and their ability to protect against transmissible gastroenteritis Coronavirus. J. Virol, 1996, 70:3770-3780.

153. Tresnan D.B., Levis R., Holmes K.V., Feline aminopeptidase-N serves as a receptor fur feline, canine, porcine, and human coronaviruses in serogroup I. J. Virol,1996, 70:8669-8674.

154. Tuboly Т., Yu W., Bailey A., Degrandis S., Du S., Frickson L., Nagy E. Im-munogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants. Vaccine, 2000, 18, 2023- 2028.

155. Tuboly Т., Nagy E., Dennis J.R., Derbyshire J.B. Iminunogenicity of the S protein of transmissible gastroenteritis virus expressed in baculovirus. Arch. Virol., 1994, 137:55-67.

156. Tuboly T., Nagy E., Derbyshire J.B. Passive protection of piglets by recombinant baculovirus induced transmissible gastroenteritis virus specific antibodies. Can. J. Vet. Res., 1995, 59:70-72.

157. Van Nieuwstadt A.P.; Cornelissen J.B.; Zetstra T. Comparison of two methods for detection of transmissible gastroenteritis virus in feces of pigs with experimentally induced infection. Am. J. Vet. Res,1988,49:1836-1843

158. Vaughn E.M., Haiburg P.G., Paul P.S. Sequence comparison of porcine respiratory Coronavirus isolates reveals heterogeneity in the S, 3, and 3-1 genes. J. Virol,1995, 69:3176-3184.

159. Vaughn E.M.; Paul P.S. Antigenic and biological diversity among transmissible gastroenteritis virus isolates of swine. Vet. Microbiol., 1993, 36, 333-347.

160. Wesley R. D.; Woods R. D.; Cheung A. K. Genetic analysis of porcine respiratory Coronavirus, an attenuated variant of transmissible gastroenteritis virus. J. Virol,1991, 65:3369-3373.

161. Wesley R.D., Woods R. Protective immunity against TGE induced by porcine respiratory Coronavirus (PRCV). Proc. Amer. Assoc. Swine Pract., 1995, 26,361-363.

162. Wesley R.D.; Woods R.D.; Hill H.T.; Biwer J.D. Evidence for a porcine respiratory Coronavirus, antigenically similar to transmissible gastroenteritis virus, in the United States. J. Vet. Diagn. Invest,1990, 2:312-317.

163. Wesley RD, Lager KM. Increased litter survival rates, reduced clinical illness and better lactogenic immunity against TGEV in gilts that were primed as neonates with porcine respiratory Coronavirus (PRCV). Vet Microbiol. 2003; 95(3):175-86.

164. Wiseman B.S., Harris D. L., Curran B.Y. Elimination transmissible gastroenteritis virus from a herd affected with the enzootic form of the disease. Proc. 19th Amer. Assoc. Swine Pract., 1988, 19, 145-149.

165. Woods R. D.; Cheville N. F.; Gallagher J. E. Lesions in the small intestine of newborn pigs inoculated with porcine, feline, and canine coronaviruses. Am. J. Vet. Res, 1981, 42:1163-1169.

166. Zhang XW, Yap YL, Danchin A. Testing the hypothesis of a recombinant origin of the SARS-associated Coronavirus. Arch Virol. 2005, Jan;150 (1): 1-20.