Разработка и применение ПЦР-технологий для молекулярно-генетической диагностики герпесвирусов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат биологических наук Евсегнеева, Жанна Витальевна

• Евсегнеева, Жанна Витальевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Евсегнеева, Жанна Витальевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Характеристика герпесвирусов человека и основных клинических

проявлений инфекции

1.1. Структура и организация вирусного генома

1.2. Репродукция вирусных частиц

1.3. Основные клинические формы герпесвирусных инфекций

1.4. Герпесвирусные инфекции в неонатологии и педиатрии 21 Глава 2. Методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции

2.1. Электронная микроскопия

2.2. Цитологический метод

2.3. Серологические методы

2.3.1. Иммунофлюоресцентный метод

2.3.2. Иммуноферментный метод

2.4. Вирусологический метод

2.5. Молекулярно-биологические методы

2.5.1. Мультипраймерная ПЦР

2.5.2. ПЦР в режиме реального времени

2.5.3. ПЦР in situ

2.6. Заключение 36 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. Быстрый культуральный метод

3.2. Серологические методы диагностики

3.2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

3.2.2. Авидность антител

3.2.3. Реакция иммунопреципитации

3.3. Молекулярно-генетические методы

3.3.1. Полимеразная цепная реакция

3.3.2. Проведение мультипраймерной ПЦР

3.3.3. Проведение ПЦР в режиме реального времени

3.3.4. Проведение ПЦР in situ

3.4. Статистическая обработка данных

Глава 4. Результаты и обсуждение исследований

4.1. Разработка и сравнительный анализ молекулярно-генетических методов диагностики герпесвирусов

4.1.1. Мультипраймерная ПЦР 5

4.1.2. Сравнение методов пробоподготовки и эффективности выделения нуклеиновых кислот из различных клинических образцов

4.1.3. ПЦР в режиме реального времени

4.1.4. Модифицированный методом ПЦР in situ

4.1.4.1. Выявление ДНК вируса простого герпеса методом

ПЦР in situ

4.1.4.2. Сравнительный анализ выявления вируса простого герпеса и цитомегалоаируса в материалах аутопсии

4.2. Выявление прямых и серологических маркеров вируса простого герпеса и цитомегалоаируса у новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию

4.2.1. Сравнительный анализ методов диагностики прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегалоаируса у новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию

4.2.2. Динамика выявления прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегаловируса у новорожденных детей в течение первого года жизни

4.2.3. Изучение параметров гуморального иммунитета у новорожденных детей в сыворотке крови серологическими методами

4.3. Разработка алгоритма лабораторной диагностики врожденной цитомегаловирусной инфекции у детей с клиническими признаками внутриутробного инфицирования

4.3.1. Определение прямых и серологических маркеров

цитомегаловирусной инфекции у детей в неонатальном периоде

4.3.1.1. Частота выявления цитомегаловируса у новорожденных детей разных групп исследования на первых неделях жизни ПЦР и быстрым культуральным методом

4.3.1.2. Сравнительный анализ выявления цитомегаловируса у обследованных новорожденных детей на первых неделях жизни быстрым культуральным методом

4.3.1.3. Изучение показателей иммунитета у новорожденных детей разных групп на первых неделях жизни

4.3.2. Частота выявления цитомегаловируса у новорожденных детей на протяжении первого года жизни

4.3.2.1. Сравнительный анализ частоты выявления прямых маркеров цитомегаловируса в различных клинических образцах

4.3.2.2. Сравнительный анализ частоты выявления цитомегаловируса в клинических образцах методом ПЦР и быстрым культуральным методом

4.3.2.3. Изучение прямых маркеров цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием в динамике

4.3.2.4. Сравнительный анализ выявления маркеров цитомегаловируса серологическими и прямыми методами у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием на протяжении первого года жизни

4.4. Сравнительный анализ диагностики герпесвирусов с использованием ПЦР и быстрого культурального метода

4.4.1. Сравнительный анализ эффективности ПЦР и быстрого культурального метода при исследовании цельной крови новорожденных детей на присутствие вируса простого герпеса 1 и 2 типов

4.4.2. Сравнительный анализ чувствительности выявления вируса простого герпеса в культуре клеток двумя лабораторными методами - ПЦР и быстрым культуральным методом 97 ВЫВОДЫ 98 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АГ - антиген АТ - антитело

БКМ - быстрый культуральный метод

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВЗВ - Варицелла-Зостер вирус

ВИГ 1 и 2 - вирус простого герпеса 1 и 2 типа

ВПК - внутренний положительный контроль

ВУИ - внутриутробная инфекция

ГГ - генитальный герпес

ГВ - герпесвирусы

ГВИ - герпесвирусная инфекция

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) ИА - индекс авидности

ШИШ - инфекции, передаваемые половым путём

ИФА - иммуноферментный анализ

тИФА - твёрдофазный иммуноферментный анализ

КО - контрольный образец

КОЧ - контрольный образец человека

МКА - моноклональные антитела

НК - нуклеиновая кислота

НД - новорожденные дети

ННД - недоношенные новорожденные дети

OK (ОКО) - отрицательный контрольный образец

ОРИТ - отделение реанимации и интенсивной терапии

ОТ - обратная транскриптаза

ПК (ПКО) - положительный контрольный образец

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР in situ - полимеразная цепная реакция in situ

мПЦР - мультипраймерная ПЦР

ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

РНИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции

РНК - рибонуклеиновая кислота

СМЖ - спинномозговая жидкость

УВК - универсальный внутренний контроль

ЦМВ - цитомегаловирус

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

ЦНС - центральная нервная система

ЦПД - цитопатическое действие

ЭБВ - Эпштейн-Барр вирус

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и применение ПЦР-технологий для молекулярно-генетической диагностики герпесвирусов»

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Герпесвирусная инфекция (ГВИ) представлена группой ДНК-вирусов, широко распространенных в человеческой популяции. Наиболее существенное социальное и эпидемиологическое значение имеют вирусы простого герпеса 1 и 2-го типа (ВПГ 1 и ВПГ 2); цитомегаловирус (ЦМВ) и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). Герпесвирусная инфекция человека, как причина смертельных исходов при вирусных заболеваниях, занимает одно из главных мест [22,29,36,46]. В связи с ростом заболеваемости ГВИ репродуктивной части населения, многообразием клинических проявлений, в которых преобладают бессимптомные формы течения, определенными трудностями в диагностике и терапии Европейское региональное бюро ВОЗ включило ГВИ в группу болезней, которые определяют будущее инфекционной патологии [22].

Наибольшую угрозу для здоровья представляют герпетические нейроинфекции (летальность достигает 20%) [64,80,147,194], офтальмогерпес (почти у половины больных приводит к развитию катаракты или глаукомы) [72,133,196] и генитальный герпес (ГГ) [75,81,86,89,108,142]. Следует отметить и возможную роль вирусов герпеса в развитии неопластических процессов, неблагоприятное влияние на течение беременности и родов [74,91], патологию новорожденных и др. [7,17,44]. Первичное заражение беременных женщин ГВИ может приводить к неблагоприятным исходам беременности, внутриутробному инфицированию (ВУИ) плода и тяжелым осложнениям новорожденных вплоть до их гибели. В связи с разнообразием и неспецифичностью клинических проявлений, а также неоднозначностью протекания инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных, лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций представляет собой актуальную проблему.

Герпес новорожденных возникает в результате ВУИ преимущественно ВПГ 2 [95,120,122]. Заболевание протекает тяжело с распространенными поражениями кожи, слизистых оболочек полости рта, глаз, центральной нервной системы (ЦНС) и внутренних органов (печень, легкие) [66]. Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) широко распространена в человеческой популяции и, при первичном

заражении беременных женщин может приводить к неблагоприятным исходам беременности [101,127]. Недоношенные новорожденные дети (ННД) с низкой массой тела представляют группу высокого риска по развитию герпесвирусной инфекции. Диагностика герпесвирусных инфекций у новорожденных детей (НД) часто представляет собой сложную задачу из-за отсутствия четко выраженной специфической клинической симптоматики и в связи с особенностями иммунной системы [99].

Возникновение сочетанных ГВИ, увеличение частоты появления штаммов с нетипичными клиническими проявлениями заставляет искать новые подходы для быстрой и дифференциальной диагностики. В настоящее время в медицинской практике для диагностики ГВИ применяются иммуноферментные методы, дифференциальное определение штаммов которыми невозможно, а реакция организма на внедрение вируса оценивается по уровню вырабатываемых антител к вирусу. Применяемые методы определения титров противогерпетических антител являются только косвенным свидетельством активности процесса и специфического иммунного ответа, в то время как для понимания этиологии, стадии и течения процесса врачи должны располагать сведениями о наличии или отсутствии самих герпесвирусов или их антигенов. Классически герпесвирусы (ГВ) обнаруживали культуральным методом, однако указанная методика требует специальных условий проведения и длительна по времени.

Поэтому в последние годы в клинической лабораторной диагностике всё большее внимание уделяется молекулярно-генетическим технологиям в выявлении ГВИ [192], в особенности полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ее разновидностям: ПЦР в режиме реального времени (ПЦР РВ), мультипраймерной ПЦР (мПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией (ПЦР ОТ), ПЦР in situ, методу NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification), секвенированию нуклеиновых кислот; гибридизационному анализу и технологиям биочипов [5,13,21,48,52,61,97,165,166,185]. Наиболее широкое применение указанные подходы получили в современной медицине, особенно при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний [1,21,52,168]. Генодиагностика

становится составной частью современной лабораторной медицины. ПЦР-технологии позволяют оперативно провести прямое определение присутствия, оценки количества и локализации герпесвирусов в различных клинических образцах (слюна, кровь, моча, ткани и др.), высокоспецифичны и высокочувствительны, что важно для современной клинической медицины.

В практиктической работе неонатологи, педиаторы, акушеры-гинекологи и другие специалисты, анализируя различные клинические образцы от взрослых и детей, часто наблюдают смешанное инфицирование несколькими инфекционными агентами различной природы. Уникальные возможности для такого анализа представляет собой мультипраймерный ПЦР (мПЦР) [78,79,87,119,196]. Поэтому разработка отечественных наборов для мПЦР-анализа герпетической инфекции (в частности, ВПГ, ЦМВ и ЭБВ) в различных клинических образцах и их клиническая апробация представляет собой актуальную задачу.

Традиционные методы ПЦР дают качественную информацию о наличии инфекционного агента с чувствительностью не менее 103 - 104 геномэкв/мл. Для ряда инфекций и в частности мониторинга лечения необходима количественная оценка вирусной нагрузки: вирус иммунодефицита человека, вирусы гепатита и герпеса. Высокая инфицированность ННД ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. Количественный анализ вирусоносительства необходим при оценке эффективности проводимой лекарственной терапии, в частности, беременных женщин, новорожденных и детей различных возрастных групп. Разработка и практическое применение современных генетических подходов в выявлении и количественной оценке содержания в различных биологических жидкостях (кровь, слюна, моча) таких важнейших вирусов, как ВПГ, ЦМВ и ЭБВ, даст возможность правильной и быстрой постановки диагноза и проведения мониторинга адекватной лекарственной терапии. В частности было показано, что содержание у беременных ЦМВ в количестве свыше 105 геномов на мл значительно увеличивает вероятность внутриутробного поражения плода вирусом

[100]. К тяжелым поражениям плода, иногда с летальным исходом, приводит сочетанное заражение новорожденного ВПГ и ЦМВ [54,62,136,140,147,167]. Поэтому разработка и клиническая апробация набора реагентов ПЦР РВ для качественного и количественного определения ДНК ВПГ и ДНК ЦМВ представляется актуальной.

На клеточном и тканевом уровне информация о пространственном распределении выявляемых генетических элементов получается с использованием технологий нерадиоизотопного гибридизационного анализа (например, FISH на хромосомах) и ПЦР in situ. ПЦР in situ - информативный и точный метод, открывающий новые возможности в диагностике ГВИ, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определённым тканям при изучении отпечатков органов, в частности у мёртворождённых детей, при патологоанатомических исследованиях [104,150].

Разработка и применение высокочувствительных и высокоспецифичных молекулярно-генетических методов в диагностике ГВИ даст возможность определить место и роль указанных подходов в общей системе клинической лабораторной диагностики, определить преимущества и недостатки по сравнению с традиционными методами исследования, возможность оперативной постановки точного диагноза, что чрезвычайно важно для неонатологии и педиатрии. Поэтому представляется актуальным применение и клиническая апробация разработанных диагностических подходов в педиатрической практике и неонатологии.

Целью работы явилась разработка и клиническая апробация молекулярно-генетических технологий для диагностики герпесвирусных инфекций и сравнительная оценка их возможностей с традиционными методами.

Задачи исследования.

1. Разработка и клиническая апробация набора реагентов мультипраймерной ПЦР для одновременного выявления ДНК вируса простого герпеса, цитомегаловируса и вируса Эпштейн-Барра в одной пробе.

2. Оптимизация компонентов реакции и клиническая апробация наборов реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса и цитомегаловируса методами ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени для оценки вирусной нагрузки.

3. Проведение сравнительного анализа возможностей и характеристик ПЦР технологий, иммуноферментного и быстрого культурального методов.

4. Оценка динамики изменения маркеров цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни, находящихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

5. Поиск неинвазивного клинического материала для выявления внутриутробной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей.

Научная новизна.

1. Проведена разработка, оптимизация компонентов и условий проведения реакций для мультипраймерного ПЦР, ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени для диагностики герпесвирусных инфекций и последующая клиническая апробация наборов.

2. Впервые разработан и практически использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции на основании использования молекулярно-генетических и вирусологических методов для выявления герпесвирусной инфекции.

3. Проведен сравнительный анализ разработанных молекулярно-генетических методов с традиционными, включающими иммуноферментный анализ и вирусологическое исследование быстрым культуральным методом.

4. Показаны возможности количественной оценки вирусной нагрузки методом ПЦР в режиме реального времени.

5. Проведена апробация модифицированного метода ПЦР in situ для выявления ДНК ВПГ, ДНК ЦМВ и сравнительный анализ данной модификации с быстрым культуральным методом и стандартной ПЦР.

Практическая значимость.

1. Использование быстрых, высокочувствительных и высокоспецифичных ПЦР-технологий дает возможность оперативной постановки диагноза, выявления внутриклеточной локализации инфекционного агента и количественной оценки вирусной нагрузки, что особенно важно для неонатологической и педиатрической практики.

2. Лабораторный скрининг прямых маркеров герпесвирусных инфекций недоношенных новорожденных детей предпочтительнее проводить по моче, так как в ней вирусные частицы накапливаются в больших количествах, а получение биологического материала проводится неинвазивным способом.

3. Для постановки лабораторного диагноза внутриутробного инфицирования герпесвирусной инфекцией у недоношенных новорожденных детей и детей раннего возраста наиболее оптимальным является сочетание ПЦР и быстрого культурального методов. Серологические тесты применяются в качестве дополнительных для уточнения фазы течения заболевания.

4. Использование современных молекулярно-генетических технологий в диагностике герпесвирусных инфекций новорожденных в неонатальном периоде позволяет найти этиологическое объяснение причин врожденных дефектов и снизить смертность детей в раннем возрасте.

5. Внедрение в практику предложенного алгоритма лабораторной диагностики цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей позволит быстро установить диагноз и уменьшить количество осложнений.

Внедрение результатов исследования.

Полученные результаты используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ № 8 и ДГКБ № 13 г. Москвы. Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ, кафедры неонатологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ, аспирантов и ординаторов кафедры кожных и венерических болезней РУДН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Отечественный мультипраймерный набор для ПЦР-анализа с одновременным выявлением ДНК вирусов простого герпеса, Эпштейн-Барра и цитомегаловируса перспективен для проведения скрининговых обследований населения.

2. Метод ПЦР in situ по чувствительности не уступает стандартному ПЦР, а использование указанной технологии наиболее целесообразно для изучения патогенеза инфекции и установления внутриклеточной локализации вирусной ДНК.

3. Определение количества ДНК ВПГ и ДНК ЦМВ с использованием метода ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить оценку вирусной нагрузки и осуществлять выбор адекватной лекарственной терапии.

4. Маркеры цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей с сочетанной врожденной патологией выявляются достоверно чаще, чем у доношенных новорожденных. Проведение трехкратного вирусологического обследования на наличие цитомегаловирусной инфекции в разные сроки первого года жизни повышает эффективность диагностики.

5. Молекулярно-генетические, вирусологические и серологические методы диагностики герпесвирусных инфекций у недоношенных новорождённых детей рационально применять комплексно согласно разработанному алгоритму.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Характеристика герпесвирусов человека и основных клинических проявлений инфекции.

Герпесвирусы (ГВ) были впервые идентифицированы в 1924 году; с тех пор с помощью биологических и иммунохимических методов описано более 100 представителей семейства Herpesviridae, представленных структурно однородной группой сравнительно больших вирусов, из которых для человека наибольшую патогенность имеют ВПГ 1, ВПГ 2, вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса (ВЗВ), ЦМВ, ЭБВ, вирус герпеса человека 6-го типа (ВГЧ 6), вирус герпеса человека 7-го типа. В 1999 году появились публикации об идентифицировании вируса герпеса человека 8-го типа [46]. Семейство Herpesviridae разбито по основным биологическим свойствам на три подсемейства: Alfaherpesvirinae (в частности ВПГ 1, ВПГ 2 и ВЗВ), Betaherpesvirinae (ЦМВ, ВГЧ 6, ВГЧ 7 и ВГЧ 8) и Gammaherpesvirinae (ЭБВ).

1.1 Структура и организация вирусного генома.

Размер вирионов у герпесвирусов колеблется от 100 до 300 нм. Для них характерна сферическая форма и наличие 4 структурных компонентов: сердцевины, капсида, внутренней оболочки (tegument), внешней оболочки (envelope) (рис.1). Сердцевина содержит линейную двунитчатую вирусную ДНК, молекулярная масса которой варьирует от 80 - 100 х 106 дальтон (вирус простого герпеса) до 145 х 106 дальтон (цитомегаловирус человека) [191]. В составе вирионов обнаружено более 30 белков (гликопротеидов), семь из которых (gB, gC, gD, gE, gF, gG и gX) находятся на поверхности и вызывают образование вируснейтрализующих антител [149]. Шесть гликопротеидов входят в состав капсида. Капсид имеет форму икосаэдра, каждая грань которого является равносторонним треугольником и построена из 15 капсомеров, имеющих форму полых цилиндров. Всего в состав нуклеокапсида входит 162 капсомера. Капсиды без оболочки практически не обладают инфекционной активностью [16]. Многие десятки белков, в том числе тимидинкиназа, являются неструктурными и образуются в ходе жизненного цикла вируса. Среди других белков, характерных

для ГВ, следует назвать ДНК-полимеразу и белок, связанный с ДНК [184]. Наружная мембрана вируса является модифицированной цитоплазматической мембраной клетки хозяина.

ДНК; вируса

Тегумеят Кшсвд

Рисунок 1. Строение вириона вируса простого герпеса.

ДНК вириона представляет собой линейную двухспиральную молекулу, которая скручена в форме «тороида» и покрыта белковой структурой. Геном ВПГ составляет примерно 150000 п.н., а соотношение Сг+С/А+Т составляет: 68 % у ВПГ -1 и 69 % у ВПГ -2 [139]. Что касается ЦМВ, то наиболее изучены два штамма АО 169 и То\упе, длина генома которых составляет 229000 и 354 000 пар нуклеиновых оснований соответственно [82]. СЬее с соавторами установили, что содержание (л+С пар нуклеотидов составляет 57%. Особенность генома ЦМВ заключается в том, что он содержит относительно большее число семейств родственных генов, имеющих тенденцию к образованию кластеров [82]. Определены, по меньшей мере, девять таких семейств, большинство из которых кодирует известные или предполагаемые по нуклеотидной последовательности гликопротеины [116]. Наличие кластеров, составляющих около 26 % нуклеотидной последовательности, может частично объяснить относительно большой размер вирусного генома ЦМВ: ДНК приблизительно на 50 % больше, чем у других представителей ГВ [175].

Хотя ЭБВ и был первым герпесвирусом, для которого стала известна полная нуклеотидная последовательность ДНК, функциональное значение организации

генома лучше выяснено на примере ВПГ (рис.2). Геном ВПГ подразделяется на два ковалентно связанных компонента: обозначенные как L (long) - 82 % вирусной ДНК и S (short) - 18 %. Каждый компонент состоит из уникальных последовательностей UL и Us, которые ограниченны прямыми терминальными и внутренними инвертированными повторяющимися последовательностями. Указанные последовательности, возможно, связаны с механизмом длительной латентной инфекции [7]. За счёт инвертированных повторов, L и S сегменты могут находиться в четырех положениях относительно друг друга и формировать четыре изомера ДНК генома [146].

и. а в L в pi 1С US с а

1 Loncf (L) ш Short (S)

Г Н

Рисунок 2. Схема организации генома вируса простого герпеса.

На рисунке 2 горизонтальными линиями обозначены уникальные последовательности, а в виде прямоугольников повторы. Стрелки внутри прямоугольника позволяют различать прямые и инвертированные повторы. Буквами обозначены серии крупных повторов. Длинными вертикальными черточками обозначены концевые последовательности, а концевые повторы как «а» последовательности. ДНК ВПГ содержит около 90 генов, причем вирусные белки кодируются приблизительно 84 генами, подразделяющимися на подгруппы генов: а, Р,у. Геном ВПГ содержит три сайта начала репликации (origin), которые названы в зависимости от места расположения в геноме: Long (oriL) или Short (oriS). OriL находится в UL сегменте в единственной копии, oriS располагается в повторяющихся участках Us сегмента, который присутствует в геноме в двух копиях. Оба oriL [189] и oriS [176] являются палиндромными участками, содержащими AT богатый центральный участок, фланкированный

инвертированными повторяющимися последовательностями, которые содержат многочисленные сайты связывания.

1.2. Репродукция вирусных частиц.

Члены подсемейства Alphaherpesvirinae характеризуются относительно коротким репродуктивным циклом, быстрым распространением по клеточной культуре, эффективным разрушением зараженных клеток и способностью существовать в латентной форме, преимущественно в ганглиях. Для вирусов подсемейства Betaherpesvirinae репродуктивный цикл идёт долго, и заражение распространяется по культуре клеток медленно. Зараженные клетки часто увеличиваются в размере (цитомегалия), легко возникает и поддерживается персистентная инфекция в культуре. Вирус может поддерживаться в латентной форме в секреторных железах, лимфоретикулярных клетках, почках и других тканях. In vitro, все вирусы подсемейства Gammaherpesvirinae способны реплицироваться в лимфобластоидных клетках, некоторые могут вызывать литическую инфекцию в эпителиоидных клетках и фибробластах. Вирусы этой группы специфичны, либо к Т-, либо к В-лимфоцитам. В лимфоцитах инфекционный процесс иногда останавливается на прелитической или литической стадии, т.е. продуктивное потомство отсутствует. Латентный вирус часто обнаруживается в лимфоидной ткани [16]. В экспериментах показано, что за 18 часов ВПГ и более чем за 70 часов ЦМВ проходят сложный жизненный путь, который включает следующие этапы: адсорбция и слияние с мембраной клетки хозяина; раздевание и разрушение вириона; проникновение в клетку; синтез ДНК, белков и сборка вирусных частиц; выход вирусных частиц из клетки [144,162].

Специфические особенности репродуктивного цикла и действия вируса на клетки ниже будут рассмотрены на примере ВПГ, как наиболее изученного вируса (больше всего работ опубликовано по Alphaherpesvirinae [16,180]). Прикрепление ВПГ и проникновение вируса в клетку-мишень происходит в результате взаимодействий между поверхностными белками вируса и рецепторами клетки. В этом процессе принимают участие, по крайней мере, 5 гликопротеидов оболочки вируса: gB, gC, gD и гетеродимер gH-gL. На первом этапе происходит

прикрепление вируса к клеточной мембране, которое происходит путем связывания поверхностного белка вируса gB или gC с гепарин-сульфатом мембраны клетки [111,130]. Далее вирусный гликопротеид gD взаимодействует с одним из клеточных рецепторов HVEM (herpes virus entry mediator) [173].

Следующий этап - слияние оболочки вируса и мембраны клетки. В пенетрации клеточной мембраны и слиянии оболочки вируса и мембраны клетки-мишени принимают участие вирусные гликопротеиды gB, gD и гетеродимер gH-gL. Взаимодействие gD с одним из рецепторов HVEM ведет к реаранжировке белков на поверхности оболочки вируса. В результате gB и гетеродимер gH-gL образуют перемычку между клеточной мембраной и вирионной оболочкой. Через образовавшуюся пору в клетку проникают капсид с белками тегумента [172,173]. Синтез продуктов вирусных генов строго регулируется и представляет собой последовательный каскад событий [115]. Эти процессы протекают в ядре клетки-хозяина с участием вирусных белков и ферментов, а также в процесс вовлекаются различные клеточные белки. В течение первых часов после заражения вирусом включаются механизмы ингибирования клеточной транскрипции и трансляции [186], таким образом, общая скорость синтеза клеточных белков необратимо снижается и далее следует период синтеза вирусных белков [130]. В процессе экспрессии вирусных генов синтезируется более 80 белков ВПГ. Синтезируются два вида вирусных белков: неструктурные белки, необходимые для репликации вирусной ДНК, и структурные белки, входящие в состав вириона.

Экспрессия поздних генов происходит после репликации вирусной ДНК [179]. Через 2-4 часа после проникновения вируса в клетку начинается экспрессия IE генов. Клеточная РНК-полимераза II участвует в транскрипции всех вирусных генов, продукты вирусных генов могут изменять активность и структуру РНК-полимеразы [77]. Главным характерным отличием а-генов от других генов вируса простого герпеса является присутствие множественных сайтов связывания транскрипционных факторов [129]. По мере развития герпетической инфекции, в зараженных клетках наблюдается появление внутриядерных включений, которые рассматриваются некоторыми исследователями

как места сборки вируса. Выход вирусных частиц из клетки происходит между 15 и 18 часами от начала репродукции и сопровождается разрушением плазматической мембраны и лизисом клетки. Вирионы, попадая в межклеточное пространство, способны инфицировать окружающие клетки [7].

1.3. Основные клинические формы герпесвирусных инфекций.

Клинические проявления, характер течения герпесвирусной инфекции разнообразны и зависят от ряда факторов [27,28,47]. В таблице 1 представлены основные клинические формы герпесвирусных инфекций [36].

Таблица 1.

Основные клинические формы герпесвирусных инфекций

Герпесвирусы человека Обозначение Основные заболевания, ассоциированные с Данным типом герпесвирусов

Вирус простого герпеса 1-го типа ВПГ 1 Лабиальный герпес Герпес кожи и слизистых Офтальмогерпес Генитальный герпес Герпетические энцефалиты Пневмониты

Вирус простого герпеса 2-го типа ВПГ 2 Генитальный герпес Неонатальный герпес

Вирус Варицелла- Зостер (вирус опоясывающего герпеса) взв Ветряная оспа Опоясывающий герпес

Вирус Эпштейна-Барр ЭБВ Инфекционный мононуклеоз Нозофарингеальная карцинома Лимфома Беркита

Цитомегаловирус ЦМВ Врождённые поражения ЦНС Ретинопатии Пневмопатии Гепатиты

Вирус герпеса человека 6 и 7 типов ВГЧ 6 ВГЧ 7 Лимфотропные вирусы. Предполагают этиологическую связь ВГЧ - 6 с внезапной экзантемой, а ВГЧ -7 - с синдромом хронической усталости

Вирус герпеса человека 8 типа ВГЧ 8 Саркома Калоши у ВИЧ-серонегативных людей Саркома Калоши, ассоциированная с ВИЧ-инфекцией и СПИДом

Уникальными биологическими свойствами всех герпесвирусов человека являются тканевой тропизм, способность к персистенции и латенции в организме

инфицированного человека. Штаммы герпесвирусов обладают неодинаковой способностью к персистенции и латенции, чувствительностью к противогерпетическим препаратам в связи с особенностями их ферментных систем. Известны шесть генотипов ЭБВ поразному представленных в различных географических областях [118]. У каждого герпесвируса имеется свой темп персистенции и латенции: наиболее активны в этом отношении - ВПГ, наименее - ЭБВ [11]. Герпесвирусы способны поражать практически все органы и системы организма-хозяина, вызывая различные формы течения инфекции.

По данным многочисленных исследований [11,142] к 18 годам более 90% жителей городов инфицируются одним или несколькими вирусами, по меньшей мере 7-ю клинически значимыми герпесвирусами (ВПГ 1 и 2-го типов, ВЗВ, ЦМВ, ЭБВ, вирус герпеса человека 6 и 8-го типов), что сопровождается клиническими симптомами соответствующего острого инфекционного заболевания в среднем не более чем у 50% людей: детская эритема (вирус герпеса человека 6-го типа), афтозный стоматит (ВПГ 1 или 2-го типов), ветряная оспа (ВЗВ), инфекционный мононуклеоз (ЭБВ), мононуклеозоподобный синдром (ЦМВ). В последнее время с герпесвирусами связывают атеросклероз и ишемическую болезнь сердца, ревматоидный артрит и рассеянный склероз. Так, например, ВПГ-1 и ЦМВ обладают тропностью к тканям сердечно-сосудистой системы, что неоднократно подтверждалось отечественными исследователями определением ДНК этих вирусов в крови и материале атеросклеротических бляшек всех обследованных пациентов с ишимической болезнью сердца [45].

Все известные ГВИ могут рецидивировать, однако, порог и причины трансформации острой формы в рецедивирующую для каждого типа герпесвируса свои. Так, например, рецидивирование инфекций, вызванных ВПГ, нередко наблюдается на фоне стрессов, неспецифических эндокринных нарушений, изменения географической зоны проживания, гиперинсоляции и др. Субклинические рецидивы ЦМВИ чаще всего наблюдаются у беременных и больных, получающих иммуносупрессорную терапию. В то же время инфекции, вызванные ЭБВ, рецидивируют крайне редко и только у больных с врожденным

или приобретенным иммунодефицитом. В целом ГВИ принимают рецидивирующее течение не более чем у 8-20% больных.

Наибольшее распространение и социальную значимость получил рецидивирующий генитальный герпес [22,36,50,86,142] - одна из наиболее часто встречающихся инфекций передающихся половым путем (ИППП). Проблема диагностики рецидивирующего генитального герпеса осложняется тем, что у женщин почти в 65% случаев заболевание протекает атипично. По данным зарубежных и отечественных исследователей часто рецидивирующий генитальный герпес наблюдается у 50-75% больных, а редко рецидивирующий -только у 10% [50,74,86]. Генитальная локализация герпеса у беременных встречается в 7-35 % случаев и за последние годы этот показатель постоянно увеличивается [53]. Вне сомнения ГВИ у беременных женщин создаёт прямой и серьёзный риск для плода и новорожденного, является одной из причин развития неврологических, соматических и эндокринных проблем у новорожденных и детей старшего возраста [3,35,58,127,128,136,140].

1.4. Герпесвирусные инфекции в неонатологии и педиатрии.

Инфицирование новорожденного ГВ может происходить внутриутробно, перинатально и постнатально. Так, по данным многих исследователей, 85% новорождённых инфицируются ВПГ во время непосредственного контакта с инфицированными тканями родовых путей, 5-6% - внутриутробно и примерно 9% - в первую неделю жизни - от матери или медперсонала через повреждённую кожу и слизистые оболочки ребёнка, при грудном кормлении инфицированным молоком. Следствием ВУИ плода или интранатального инфицирования новорожденного могут быть уродства, умственное недоразвитие ребёнка и летальный исход [57,66,143]. Инфекции являются причиной большого спектра антенатальной патологии: плацентарной недостаточности, хронической гипоксии и синдрома задержки развития плода, пороков развития и инфекционных заболеваний плода, мертворождения, невынашивания беременности [33].

В исследовании Закиной A.A. установлено, что при перинатальной ГВИ с наибольшей частотой определяются гипотрофия, катаральный синдром,

проявляющийся гиперемией зева (при отсутствии острой респираторной вирусной инфекции на момент осмотра), лимфоаденопатия, гепатомегалия и поражения глаз в виде кератоконъюнктивита, аллергодерматит, а также нарушения микробиоценоза. При анализе неврологического статуса было показано, что 60% детей имели очаговую неврологическую симптоматику. Часто отмечался синдром двигательных расстройств, проявляющийся преимущественно снижением мышечного тонуса (64,4%). При УЗИ головного мозга в 77,8% случаев выявлялась смешанная, преимущественно наружная гидроцефалия, свидетельствующая об атрофических изменениях в коре мозга, а у 31,1% больных детей отмечались признаки внутренней гидроцефалии. У 6,7% детей при первом исследовании на УЗИ был обнаружен процесс кистообразования. У 2 из 19 (10,5%) детей с сочетанным вирусным поражением (ВПГ, ЦМВ, ЭБВ) были обнаружены кальцинаты в головном мозге [34].

Актуальность данной проблемы обусловлена и тем, что у выживших детей с ВУИ очень часто в дальнейшем развиваются серьезные нарушения здоровья [23,26]. Даже при бессимптомных формах у 5-15% детей в ближайшие 1-2 года и в более поздние сроки регистрируются нарушения ЦНС, слуха, зрения, детский церебральный паралич, отставание в умственном развитии, плохая успеваемость в школе [141]. Специфическая клиническая симптоматика обнаруживается лишь у 10% новорожденных и только в 5% случаев наблюдаются классические признаки ВУИ [9,20,63]. Учитывая неспецифичность клинических проявлений ВУИ во время беременности, а также после рождения ребенка, диагностика в большинстве случаев затруднена и возможна лишь при сочетании нескольких методов лабораторного исследования [10,19].

Заболевания печени и желчных протоков занимают одно из ведущих мест в структуре врожденной патологии у детей, приводящей к ранней инвалидизации и смертности. Среди теорий формирования врожденных болезней гепатобилиарной системы, таких как атрезия внепеченочных желчных протоков (АВЖП) и синдрома Алажиля особый интерес представляет гипотеза о вирусной природе этих заболеваний. Обследование биоптатов печени 33 детей в возрасте от

1 до 9 месяцев жизни показало наличие ДНК ЦМВ у 16 и ДНК ВЭБ у 1 из 20 больных с АВЖП и у 2 из 3 детей с синдромом Алажиля. При этом в указанном клиническом материале ДНК ВПГ, вирусов папилломы человека (ВПЧ), вируса гепатита В и РНК вируса гепатита С обнаружены не были. ДНК ЦМВ выявлена в крови у 5 и в моче у 4 из 20 больных АВЖП, а ДНК других исследованных вирусов обнаружить не удалось [4].

Особую группу высокого риска по частоте заболеваемости и ранней неонатальной смертности составляют недоношенные дети (НД) [12,25]. Доля детей, родившихся недоношенными, составляет 3-16,6% от общего числа новорожденных. В настоящее время частота недонашивания в нашей стране и в большинстве развитых стран не имеет тенденции к снижению. Частота недонашиваемости в России в 2000 году составила 6,2%, а в 2007 - 10% [6]. По данным литературы новорожденные с очень низкой массой тела при рождении, составляющие примерно 1% от всех рожденных детей, формируют до 75% заболеваемости и смертности. Эта группа детей характеризуется наибольшим количеством факторов риска по развитию инфекционных заболеваний, связанных с общей функциональной незрелостью иммунной системы.

По данным разных авторов, смертность среди недоношенных детей, инфицированных ГВИ в разы выше, чем среди доношенных детей с ГВИ. Например, зарубежные авторы O'Riordan D. P., Golden С. W., Aucott S. W. указывают на тяжелую реализацию ВПГ инфекции у недоношенных детей вплоть до развития энцефалитов и диссеминированной формы инфекции, в отличие от доношенных ВПГ-инфицированных детей. Процент заболеваемости и тяжесть реализации неонатального герпеса обратно пропорциональны массе тела при рождении и гестационному возрасту. По данным O'Riordan D.P.(2007), в группе новорожденных детей с ВПГ-инфекцией в среднем гестационный возраст составлял 27 недель, с массой тела менее 1500г [156].

Одной из основных причин, способствующих генерализации инфекционно-воспалительных заболеваний у ННД, является незрелость иммунной системы, которая не способна обеспечить адекватный иммунный ответ. В то же время сами

преждевременные роды создают нарушения в системе мать-плацента-плод, что затрудняет обеспечение новорожденного трансплацентарным иммуноглобулином в, осуществляющим защитную функцию в организме. Острая и хроническая гипоксия плода, низкая масса тела при рождении, присоединение инфекции в неонатальном периоде приводят к развитию инфекционной иммуносупрессии у новорожденного [3,156]. Следует отметить, что недоношенность представляет собой одну из важнейших проблем здравоохранения во всем мире. Статистика большинства стран свидетельствует о высокой смертности и большом числе лиц с физической и интеллектуальной неполноценностью среди выживших недоношенных детей [68,71].

Глава 2. Методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции. В настоящее время существуют разнообразные методы лабораторной диагностики ГВИ, которые можно разделить на несколько групп:

1. Электронная микроскопия;

2. Цитологические методы;

3. Серологические методы;

4. Вирусологические методы (выделение вируса в культуре клеток);

5. Молекулярно - биологические методы. 2.1. Электронная микроскопия.

С помощью этого метода можно обнаружить наличие вируса по морфологическим характеристикам. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно Ю10 частиц в 1 мл, но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного осаждения и концентрации. Кроме того, этот метод не позволяет типировать герпесвирусы, так как у многих из них нет морфологических различий внутри семейства. В связи с этими причинами, а также из-за относительной длительности постановки и необходимости дорогостоящего оборудования этот метод редко используется в диагностической практике.

2.2. Цитологический метод.

Метод заключается в обнаружении в исследуемом материале инфицированных клеток на цитологическом препарате. Их идентифицируют как многоядерные гигантские клетки с внутриядерными включениями. Несмотря на доступность и простоту недостатками цитологического метода диагностики являются: неудовлетворительная воспроизводимость результатов, невозможность дифференциации разных типов герпесвирусов, а также первичной инфекции от рецидивирующей.

2.3. Серологические методы

К серологическим методам относят реакцию нейтрализации (РН), реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию агглютинации латекса (РАЛ), иммунофлуоресцентное окрашивание при помощи моноклональных антител (различные модификации РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблот (ИБ) [36].

2.3.1. Иммунофлюоресцентный метод (РИФ) - основан на выявлении с помощью люминесцентного микроскопа святящихся иммунных комплексов с применением меченых флюоресцентным красителем моноклональных или поликлональных антител [36,37,49]. Позволяет обнаружить антигены возбудителей в различном биологическом материале - мазки, соскобы, ликвор, кровь, сперма, слезная жидкость, моча и др. При оценке результатов обращают внимание на характер и количество антигенсодержащих клеток, локализацию специфического свечения и его интенсивность. Чувствительность и специфичность данного метода составляют 90% и 96%, соответственно. Наряду с этими характеристиками, быстрота получения результата исследования, его доступность делают метод широко используемым в клинической лабораторной диагностике.

2.3.2. Иммуноферментный метод (ИФА).

ИФА широко используется для эпидемиологических исследований, при перинатальном скрининге и с диагностической целью [8], как для выявления противовирусных антител (АТ), так и для детекции вирусных антигенов (АГ).

Обнаружение АГ в биологических жидкостях или в клетках является прямым доказательством присутствия вируса и его активной репликации, и, следовательно, подтверждает этиологию заболевания. В основе метода лежит образование комплекса антиген - антитело на твердой фазе и дальнейшая трансформация ферментной метки в соответствующий сигнал, регистрируемый с помощью спектрофотометра. Для оценки характера иммунного ответа на возбудителя проводят обнаружение циркулирующих специфических АТ классов ^О, ^М, 1§А к ГВ в сыворотке крови, СМЖ или других биологических жидкостях организма больного [2,10]. С помощью метода ИФА возможно количественное определение антител, что позволяет судить о клиническом течении заболевания. Однако при диагностике ВПГ ИФА имеет низкую диагностическую ценность, дает лишь предварительную информацию о наличии инфекции и требует дальнейшего лабораторного обследования. ИФА можно использовать в качестве дополнительного метода в случаях асимптоматического течения ВПГ, когда возникают трудности с постановкой диагноза и определением стадии инфекции [105] и является необходимым тестом при обследовании беременных женщин. Используется для выявления серонегативных женщин, так как при первичном инфицировании ГВ во время беременности возрастает риск внутриутробной передачи инфекции [2,10].

О наличие первичной инфекции можно судить по обнаружению ^М АТ в сыворотке крови при условии отсутствия АТ или при выявлении

низкоавидных 1§0 АТ, а также при нарастании титров антител в динамике. 1§М АТ способны нейтрализовать вирус, активировать комплемент и играют важную роль в элиминации возбудителя из кровеносного русла. При первичной инфекции антитела появляются через 4-7 дней после инфицирования и достигают высоких титров на 2-4 неделю. АТ присутствуют в течение всей жизни, незначительно колеблясь. АТ появляются после первичного инфицирования и относятся к «ранним АТ», но также могут обнаруживаться при реактивации инфекции, реинфицировании [105].

При диагностике неонатальной ГВИ обнаружение 1§М АТ свидетельствует о наличии острой инфекции у новорожденного, поэтому обнаружение АТ этого класса является маркером острой инфекции и имеет диагностическую ценность. Однако их появление в сыворотке крови нередко отстает от клинических проявлений заболевания. Срок жизни ^М АТ составляет 7-10 дней, поэтому не всегда удается регистрировать наличие АТ этого класса в сыворотке крови. ^М-АТ не проникают через плаценту, синтезируются у плода и относятся к собственным антителам новорожденного [30].

Серологические тесты определения антител при диагностике

неонатальной ВПГ-инфекции, в отличие от многих других инфекций, в большинстве случаев не представляют диагностической ценности. Одной из причин является свойство АТ класса проникать через маточно-плацентарный барьер во внутриутробном периоде, тем самым выполняя защитную функцию от возбудителей. Материнские АТ циркулируют в крови новорожденного

ребенка до 6-9 месяцев жизни. В последние годы появилась возможность определения, так называемых «ранних» специфических АТ, которые

обладают низкой авидностью и указывают на первичную инфекцию. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать АТ, которые вначале обладают низкой авидностью, слабо связывая АГ. Затем появляются высокоавидные антитела, которые более прочно связываются с АГ. Таким образом, высокоавидные АТ являются показателем давней, ранне перенесенной инфекции. Авидность АТ в сыворотках крови оценивают по индексу авидности (ИА) [31].

2.4. Вирусологический метод.

Среди методов лабораторной диагностики до сих пор культуральный метод считается «золотым стандартом», чувствительность и специфичность, которого составляют 80 - 100% и 100%, соответственно. Классический вирусологический метод до настоящего времени остается достоверным подтверждающим лабораторным тестом при постановке окончательного диагноза [59]. Данный

метод основан на изоляции вируса из клинического материала в культуре высокочувствительных клеток in vitro. Сокультивирование клинических образцов и чувствительной культуры клеток приводит к цитопатическому действию (ЦПД) при наличии вирусных частиц в исследуемом материале. Период времени, необходимый для появления морфологических изменений клеток в зависимости от количества вируса в материале варьируется в пределах 18 - 96 часов (нескольких дней) до нескольких недель, поэтому существенным недостатком метода является длительность проведения анализа.

Длительность постановки указанного варианта метода способствовало разработке модификации культурального метода, которая получила название «shell vial method» (быстрый культуральный метод, БКМ). БКМ сокращает время обнаружения вируса до 18-72 час, а также чувствительный и специфичный как для выявления ЦМВ, так и для ВПГ [157]. Достоинствами данного подхода перед классическим культуральным методом является то, что БКМ позволяет обнаружить вирусные белки на ранних стадиях инфекции, в реакции непрямой, прямой иммунофлюоресценции или пероксидазного окрашивания с помощью моноклональных антител (МКА), не дожидаясь развития ЦПД [43]. Дальнейшее усовершенствование БКМ включает использование центрифугирования после внесения исследуемого материала на монослой клеток высокочувствительной культуры, что позволяет значительно повысить эффективность выявления вируса в клинических образцах. Для постановки диагноза неонатального герпеса или ЦМВИ БКМ, вирусы могут быть выявлены в различных биологических жидкостях, включая кровь, мочу, слюну, спинномозговую жидкость (СМЖ), слезную жидкость и смывов из носа и гортани. В настоящее время разработаны количественные варианты БКМ [43].

2.5. Молекулярно-биологические методы.

Открытие в 1983 году метода ПНР и разработка различных разновидностей указанной технологии коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической диагностики [13,21]. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту - уровень

определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации [32,52,69]. В основе метода ПЦР лежит уникальное свойство нуклеиновых кислот (НК) (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro [61]. К достоинствам ПЦР относятся: универсальность процедуры выявления различных возбудителей; результат исследования можно получить за короткое время; возможность диагностики некультивируемых и трудно культивируемых типов возбудителей; возможность использования при скрининге большого числа образцов. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью (95% и 100%, соответственно), дает возможность обнаружить даже единичные копии вирусной ДНК в исследуемых материалах [14,15,19,138].

Особое значение метод ПЦР приобретает при диагностике бессимптомной формы ГВИ, для быстрой диагностики неонатального герпеса при генерализованной форме инфекции и поражении ЦНС [38,80,102,117,159,178,182,194]. Клиническим материалом для обнаружения вирусной ДНК при указанных, формах инфекции являются кровь и СМЖ. Чувствительность метода ПЦР при диагностике генерализованной формы ВПГ-инфекции и поражении ЦНС составляет 75-100%. ПЦР является незаменимым методом при постановке диагноза в случаях асимптоматического течения генитального герпеса [89], и чаще всего при таком течении ВПГ-инфекции культуральные методы дают отрицательный результат [105].

В последнее время появилось большое количество модификаций ПЦР, позволивших значительно увеличить потенциальные возможности первоначально предложенного метода: ПЦР-сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР); гнездовая-ПЦР, ПЦР с горячим стартом, ПЦР непосредственно в клетках (in situ), ПЦР «в реальном времени» качественная и количественная (ПЦР РВ) и мультипраймерная ПЦР (мПЦР).

2.5.1. Мультипраймерная ПЦР.

Значительно ускорить и упростить проведение анализа позволяют мультипраймерные наборы реагентов для ПЦР, когда вместо одной пары

праймеров используются несколько, что дает возможность в одной пробирке обнаруживать несколько инфекционных агентов. Первый мультипраймерный ПЦР набор «AMPLICOR - для одновременной детекции хламидии и гонококка в одной пробирке» создан фирмой «Хоффман-Ля Рош» в 1995 году. Разработка и практическое внедрение мПЦР наборов требует решения ряда экспериментальных проблем и осуществляется поэтапно. Сначало необходимо подобрать такой фрагмент молекулы ДНК вируса, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего вируса или в исследуемом гене. Синтез праймера по заданной последовательности нуклеотидов осуществляется в автоматических синтезаторах. Разработка праймеров для ПЦР является самым важным этапом в создании мультипраймерного набора реагентов [69], причем выбор структуры праймеров усложняется с увеличением количества их пар, в частности в подборе размеров амплифицируемых фрагментов. Наиболее интересными с точки зрения создания указанных наборов реактивов являются группы вирусов сходных по структуре генома и (или) по клинической картине, вызываемых ими заболеваний, например, определение отдельно вирусов ВПГ 1 и ВПГ 2, так как в настоящее время ВПГ 1 выявляется более чем у 25% обследуемых пациентов с герпетическими поражениями половых органов [39,40,42,137].

Научно-производственная фирма «ГЕНТЕХ» несколько лет назад разработала набор для выявления C.trachomatis (продукт амплификации 316 п.н.); а затем, с использованием более короткого продукта амплификации C.trachomatis (200 п.н.) - для пяти основных ИППП (рис. 3 «А»). Клинические испытания показали, что мультипраймерные наборы обладают одинаковой чувствительностью и эффективностью, как и широко используемые монопраймерные наборы ХламАм (рис. 3 «Б»).

+

«А»

К линические образцы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

+

К линические образцы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 «Б»

Рисунок 3. Электрофореграммы амплификации клинических образцов с использованием: а) мультипраймерного набора реагентов для одновременного выявления ДНК C.trachomatis (200 п.н.), М. genitalium (281 п.н.), М. hominis (374 п.н.), Ureaplasma parvum (466 п.н.) и Ureaplasma urealyticum (Т-960) (666 п.н.); б) набор реагентов для выявления ДНК C.trachomatis (316 п.н.).

2.5.2. ПЦР в режиме реального времени.

До 1992 года метод ПНР оставался качественным, то есть позволял получать ответ на вопрос - есть ли искомая НК-мишень в образце, или её нет. Разумеется, были попытки проведения полуколичественных анализов, в частности «конкурентным методом» ПЦР, но все они были громоздки и трудновоспроизводимы, особенно, если учесть проблему контаминации ампликонами [114]. В 1992 году благодаря работе Higuchi и соавторов впервые была продемонстрирована возможность проведения ПЦР с одновременной детекцией сигнала флуоресценции, ассоциированного с ростом количества ампликонов после каждого цикла ПЦР. Указанная работа и последовавший за ней шквал публикаций произвели настоящий прорыв в технологии ПЦР, так как

позволили наблюдать кинетику реакции, в которой заложена важнейшая для исследователей информация об исходном количестве НК-мишени в образце [60].

ПЦР РВ уверенно занимает лидирующие позиции среди амплификационных методов, используемых в научно-исследовательских и диагностических ПЦР - лабораториях [93,124,135]. Результат ПЦР можно регистрировать в процессе реакции, в любой момент времени и позволяет избежать последней стадии анализа: проведение электрофоретической детекции результатов, тем самым минимизируя возможность загрязнения лаборатории ампликонами. Данная методика позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ содержания в клиническом образце ДНК [60]. Именно получение количественной информации снискало методу ПЦР РВ широкое применение для решения таких задач, как количественная детекция патогенов, анализ экспрессии генов, поиск однонуклеотидных полиморфизмов и нарушений в структуре ДНК хромосом, так называемых хромосомных транслокаций.

ПЦР РВ - это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами: определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации, построение по этим данным кинетической кривой ПЦР, определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой. Для детекции ПЦР продукта используются красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта, механизмы генерации которой, различаются в зависимости от типа ПЦР в реальном времени. Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет три стадии (рисунок 4): инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флуоресцентной меткой), экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость интенсивности флуоресценции от количества циклов ПЦР) и плато (стадию насыщения).

. a » "

m

v-

— — — m.

«ft iNJ 1Л ее ч—'• Т» О* СЧ1 OM С"»

No. of PGR cycles

<s>

Рис 4. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени.

Также как и в «обычной» ПЦР нас интересует экспоненциальная стадия процесса. Для проведения правомерного (объективного) количественного анализа необходимо производить измерения в экспоненциальной фазе реакции, когда количество ПЦР-продукта прямо пропорционально начальному количеству матрицы. Метод ПЦР PB применяется для диагностики герпесвирусных инфекций в частности ЭБВ, ЦМВ и других герпесвирусов [70,131,195].

2.5.3. ПЦР in situ.

Метод ПЦР in situ был разработан на основе двух методов - метода ПЦР и гибридизации in situ, с целью соединить высокую чувствительность метода ПЦР с преимуществами морфологического исследования «in situ». О первых результатах, полученных с использованием этого метода, сообщалось в работе Haase А.Т. и соавт. в 1990 г. [107]. В дальнейшем, количество работ с применением метода ПЦР :in situ, для обнаружения ДНК в срезах тканей, фиксированных формалином и заключенных в парафин, заметно возросло, но наибольший вклад в развитие и стандартизацию методики, ее усовершенствование и использование в научных исследованиях внес G. Nuovo с соавторами [150,151, 152, 153, 154, 155]. Схема проведения ПЦР in situ представлена на рисунке 5.

Этапы ПЦР т зНи

т

клеточная суспензия фиксация 10% формалином или тканевые срезы предварительная обработка

•..... «>. * ^ ■ " <; "я •

амплификация нанесение покровного стекла нанесение амплификационной смеси

1 ш

детекция

Рис. 5. Схема проведения ПЦР in situ.

Важным моментом подготовительного этапа является качественное фиксирование клеток к предметному стеклу, так как многократно повторяющиеся термические циклы могут привести к смыванию срезов со стекол. Оптимальным фиксатором для ПЦР in situ является нейтральный 10% формалин. Зафиксированные образцы обрабатывают протеазами: пепсин, трипсин, протеиназа К или проназа. Не существует точных критериев для применения той или иной протеиназы, однако G.Nuovo советует использовать пепсин [151]. Оптимальное время протеолитической обработки препарата зависит от времени его фиксации в формалине и подбирается опытным путем.

Обнаружение продуктов амплификации проводится с помощью использования меченых праймеров или смеси меченых нуклеотидов, которые в процессе амплификации включаются в состав ампликонов. После амплификации, снятия покровных стекол, меченные ампликоны внутри клеток, визуализируют в зависимости от включенной в ДНК метки. Один из способов визуализации молекул-мишеней - это использование флюоресцентного метода определения ампликонов. О наличии метки судят по цвету ее флюоресцентного свечения.

Другим способом является использование ферментов, например, пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы. Ферменты подвергают химическому связыванию с синтетическими олигонуклеотидами что делает возможным их последующее обнаружение с помощью реакции ферментативной преципитации. Использование таких непрямых систем обнаружения помогает избежать нежелательного фонового сигнала. Визуализацию специфической метки проводят с помощью микроскопии.

ПЦР in situ обладает определенными недостатками: более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады на этапе амплификации нередко приводят к разрушению срезов, а также возможность побочных реакций, приводящих к регистрации ложноположительных сигналов. К методическим сложностям метода можно отнести его многоэтапность и трудоемкость. В связи с этим были проведены работы, посвященные оптимизации и усовершенствованию ПЦР in situ, которые увеличивают чувствительность и уменьшают количество неспецифических продуктов реакции. При проведении амплификации in situ исследователи рекомендуют изменение соотношения смеси ПЦР реактивов [154]: увеличение концентрации Mg2+ в реакционной смеси; увеличение количества ДНК-полимеразы. Во избежание испарения реакционной смеси срез накрывают покровным стеклом.

Наиболее яркими примерами использования метода ПЦР in situ является результаты изучения нервной ткани больных новорожденных детей. Энцефалиты, как полагают, являются основным заболеванием ЦНС у новорождённых детей. Постановка диагноза основана на результатах гистологического обследования. Роль ВПГ в развитии патологических изменений в тканях мозга у новорождённых до конца не определена. Доказательств вирусной локализации в нервной системе и гистологических изменений нервной ткани, вызванных ВПГ, недостаточно. Поэтому использование метода ПЦР in situ в решении этих вопросов весьма целесообразно, кроме того данный метод может помочь в установлении

некоторых положений, касающихся биологии диссеминированной ВПГ инфекции у новорожденных детей [104].

P. Gressens с соавторами (1994) представили результаты выявления ДНК ВПГ методом ПЦР in situ в парафиновых срезах нервной ткани из аутопсийного материала от новорожденных детей с диссеминированной ВПГ-инфекцией. В этой работе была продемонстрирована локализация вирусной ДНК методом ПЦР in situ в клетках ткани с гистологическими изменениями, характерными для инфекционного поражения мозга, которое было подтверждено и другими использованными в работе методами (гибридизацией in situ и иммуногистохимическим окрашиванием с использованием антител). Однако вирусная ДНК была обнаружена и в клетках ткани без очевидных гистологических изменений, причем методами гибридизацией in situ и иммуногистохимическим окрашиванием наличие антигена ВПГ в этих областях обнаружено не было, что указывает на большую чувствительность метода ПЦР in situ по сравнению с другими использованными в работе методами [104].

2.6. Заключение.

Клиническая диагностика ГВИ в настоящее время, в группах высокого риска, является актуальной и в тоже время чрезвычайно трудной задачей из-за неспецифичности и полиморфности симптоматики. Одна из нерешенных проблем состоит в быстрой и дифференциальной диагностике бактериальных инфекций от заболеваний вирусной этиологии. В работах последних лет доказано, что отрицательный результат обследования крови и мочи методом ПЦР, полученный в самые первые дни жизни, не исключает возможности отсроченной реализации ВУИ [67].

За последние пятнадцать лет в лабораторной диагностике ГВИ достигнуты значительные успехи, усовершенствованы традиционные и разработаны и внедрены в клиническую практику современные молекулярно-генетические методы. Однако эффективность и информативность различных методов неодинаковая при диагностике ГВИ, как у взрослых людей, так и у новорожденных детей и детей раннего возраста. Суммируя данные литературы,

можно заключить, что наряду с достоинствами каждый из имеющихся в лабораторной практике методов имеет и ряд недостатков. Это означает, что для надежной и адекватной диагностики ГВИ требуются дальнейшие детальные сравнительные исследования, которые помогут выработать алгоритмы вирусологического обследования, оптимальные для разных групп риска. Данный вывод в особенности относится к таким социально значимым группам, какими являются новорожденные дети и взрослые люди репродуктивного возраста.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заключение диссертации по теме «Клиническая лабораторная диагностика», Евсегнеева, Жанна Витальевна

ВЫВОДЫ:

Разработан и клинически апробирован мультипраймерный набор для одновременного определения ДНК вирусов простого герпеса, цитомегаловируса и вируса Эпштейн-Барра, который может быть использован для проведения скрининговых исследований.

2. Апробация оптимизированных наборов реагентов для определения ДНК вируса простого герпеса и цитомегаловируса методами ПЦР in situ и ПЦР в режиме реального времени показала эффективность указанных технологий для оценки локализации вирусов и вирусной нагрузки в различных клинических образцах.

3. Для выявления прямых маркеров вируса оптимально одновременное использование ПЦР и быстрого культурального метода, а серологические маркеры необходимы в качестве дополнительных тестов для определения стадии инфекционного процесса.

4. Исследование динамики появления прямых и серологических маркеров цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции показало необходимость проведения трехкратного обследования в течение первого года жизни.

5. Предпочтительным неинвазивным клиническим материалом для диагностики внутриутробной цитомегаловирусной инфекции является моча, в которой вирус накапливается в больших количествах, чем в других биологических пробах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для проведения екрининговых исследований оптимально использовать мультипраймерный набор для одновременного определения ДНК вирусов простого герпеса, цитомегаловируса и вируса Эпштейн-Барра, что ускорит проведение анализа и снизит его себестоимость.

2. Для диагностики внутриутробной герпесвирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей рекомендуется применять одновременно быстрый культуральный метод и ПЦР.

3. Для выявления прямых маркеров герпесвирусов у новорожденных детей рационально использовать мочу, так как в ней вирус содержится чаще, накапливается в больших количествах, и биологический материал является неинвазивным.

4. Рекомендуется трехкратное обследование недоношенных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции на наличие цитомегаловируса: на первой неделе жизни, через 1-3 месяца и 4-7 месяцев после рождения из-за длительной персистенции вируса и возможной реактивации инфекции.

5.Показано проведение серологического обследования на наличие специфических ^М и антител с оценкой авидности ^в-антител, которая имеет прогностическое значение, так как присутствие низкоавидных антител класса к цитомегаловирусу сочетается с появлением прямых маркеров цитомегаловируса через 1-6 месяцев после рождения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Евсегнеева, Жанна Витальевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Адаскевич В.П. Заболевания, передаваемые половым путем. // 1997. Витебск. Издательство витебского медицинского института, 310 с.

2. Аксимов О. А., Осипова 3. А., Мельникова Р. Ф. Ретроспективная диагностика сроков инфицирования при внутриутробных инфекциях.// Материалы 3 съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Проблемы ВУИ плода и новорожденного» - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ.-2000.-С. 124-125

3. Альбицкий В. Ю. Состояние здоровья детей дошкольного возраста, родившихся недоношенными.// Рос. педиатр, журнал. -1998.- № 4. С. 12-15

4. Асади С.М., Дегтярева A.B., Мухина Ю.Г., Володин H.H. и др. Внутриутробная ЦМВ инфекция и атрезия внепеченочных желчных протоков.// Генодиагностика инфекционных болезней -2007, Сборник трудов, т. 3, 357-359, М., 2007.

5. Бажора Ю.И., Кресюн В.И., Запорожан В.Н. и др. Молекулярно-генетические и биофизические методы исследования в медицине.// - К.: Здоров'я, 1996. - с.206.

6. Баранов А. А., Альбицкий В. Ю., Волчина С. Я. Глубоконедоношенные дети как биоэтическая проблема.// Рос. педиат. журнал. - 1999. - № 1. - С. 29-32

7. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров A.A., Гребенюк В.Н. Герпес (этиология, диагностика, лечение). 1986. М. Медицина. 272 с.

8. Барычева Л. Ю., Орехов К. В.// Иммунология. - 2004. - № 6. - С. 8-12

9. Безнощенко Г.Б., Долгих Т.И., Кривчик Г.В. Внутриутробные инфекции (вопросы диагностики и врачебной тактики).// Москва: Мед. книга, Н.Новгород, изд. НГМА, 2003.- 88с.: ил

10. Беловолова Р. А., Алексеенко Л. Т., Безверхая Л. К. и др. Этапность диагностики и лечения ВУИ новорожденных детей.// Материалы 3 съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Проблемы ВУИ плода и новорожденного» - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. - 2000. - С. 127-128

11. Букринская А.Г., Жданов В.М. Молекулярные основы патогенности вирусов.// 1991. М., Медицина. 255 с.

12. Буштырев В.А., Лаура Н. В., Захарова Н. И. Оценка состояния здоровья недоношенных новорожденных с перинатальными инфекциями.// Рос. вестник перинатологии и педиатрии. - 2006. - № 3. - С. 11-14

13. Введение в молекулярную медицину. Под ред. Пальцева М.А. 2004. М, Медицина, 496 с.

14. Ведяков A.M., Долгих М.С. Детекция ДНК цитомегаловируса в различном биологическом материале у больных с аллотрансплантатами органов методом полимеразной цепной реакции.// Клиническая лабораторная диагностика.-1998.-11.- с. 19-24

15. Виноградская Г.Р., Горышин И.Ю., Новикова Л.И., Плуталов О.В., Башмакова М.А., Берлин Ю.А., Цинзерлинг В.А., Шварц Е.И., Ланцов В.А. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для диагностики вирусной инфекции: цитомегаловирус человека. //Биополимеры и клетка.- 1991.-е. 35-48.

16. Вирусология в 3-х томах/Под ред. Б.Филдса, Д.Найпа. перев. С англ. -М.: Мир, 1989.

17. Власова М.А. Влияние бессимптомной генитальной герпетической инфекции на исход беременности и состояние здоровья новорожденного.//2000. Дисс. к.м.н. Владивосток.

18. Володин Н. Н. Неонатология: национальное руководство.// М.: Геотар-медиа, 2007. - С. 848

19. Володин Н. Н., Дегтярев Д. Н., Ковтун И. Ю. и др. Перспективы использования метода ПЦР для ранней диагностики герпесвирусной инфекции у новорожденных детей.// генодиагностика в современной медицине (сборник тезисов) - М. - 2000. - С. 197-198

20. Воронцова Ю.Н., Володин H.H., Дегтярев Д.Н. и др. Особенности клинических проявлений врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных. Рос.вестн. перинатологии и педиатрии. 2004; 49 (2): 60-66.

21. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. //1997, СПб., Специальная литература. 287 с.

22. Гранитов В.М. Герпетическая инфекция. // Новгород: изд. НГМД-2001.-С.88

23. Гриноу А., Дж. Осборн. Врожденные перинатальные и неонатальные инфекции.// Пер. с анг. - М.: Медицина, 2000. - С. 288

24. Дегтярев Д.Н., Дегтярева М.В., Ковтун И.Ю., Шаламова J1.B. Принципы диагностики внутриутробных вирусных инфекций у новорожденных и тактика ведения детей группы риска. // Перинатология сегодня. - 1997. - № 3. -С. 18-24

25. Дементьева Г. М. Профилактическая и превентивная неонатология. Низкая масса тела при рождении. Гипоксия плода и новорожденного: лекция для врачей. - М., 1999. - С. 70

26. Дементьева Г. М., Фролова М. И., Дедумкина О. И. и др. Внутриутробная герпесвирусная инфекция у новорожденных.// материалы 3 съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины. «Проблемы внутриутробной инфекции плода и новорожденного» - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. - 2000. - С. 159-161

27. Дидковский H.A., Малашенкова И.К., Танасова А.Н. и другие. Герпес-вирусная инфекция: клиническое значение и принципы терапии. 2004, РМЖ, 12, №7, 459-465.

28. Дидковский H.A., Малашенкова И.К., Танасова А.Н. и другие. Патогенетические аспекты герпетической инфекции тяжелого течения. 2007, Бюллетень эксп. патологии и мед., 2, 76-81.

29. Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций.// 2003. М., Медицинская книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 336 с.

30. Долгих Т. И. Лабораторная диагностика - основа информационного обеспечения диагностического процесса при оппортунистических инфекциях (обзор литературы).// Клин. Лаб. Диагн. - 2008. - № 1. - С. 49-51

31. Долгих Т. И. Оценка эффективности лабораторных методов диагностики врожденной ЦМВИ.// Клиническая лабораторная диагностика -2000. -№ 11. -С. 35

32. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR).

33. Ефимов Е. И. Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя».// Н. Новгород: Изд-во НГМА. - 2004. - С. 376

34. Закина A.A. Патогенетические аспекты перинатальных герпесвирусных инфекций у детей. // Дисс. к.м.н. Санкт-Петербург, 2006.

35. Ивановская Т.Е., Гусман Б.С. Заболевания, обусловленные вирусами герпеса / Патологическая анатомия болезней плода и ребёнка: Руководство для врачей// Под ред. Т.Е.Ивановской, Л.В. Леоновой. -М. 1989. Т.2. С.266-271.

36. Исаков В.А., Борисова В.В., Исаков Д.В. Герпес: патогенез и лабораторная диагностика. Руководство для врачей. 1999. С-Петербург. Издательство «Лань», 192 с.

37. Климова P.P. и др. Получение и свойства моноклональных антител к вирусу герпеса 1 и 2 типа.// ЖМЭИ.- 1999. - № 5. - С. 99-103.

38. Коломиец A.A., Вотяков В.И., Бикбулатов P.M. Генерализованная герпетическая инфекция: факты и концепция. Минск. 1992. 350 с.

39. Коломиец А.Г., Малевич Ю.К., Коломиец Н.Д. Многоликий герпес. Минск. 1988. 70 с.

40. Круглова А.И. Молекулярно-генетическоая идентификация и дифференциация герпесвирусов человека. // Дисс.к.б.н. М., 2004.

41. Круглова А.И., Николаева Н.П., Демкин В.В. Определение частоты встречаемости герпесвирусов человека в урогенитальном материале. Сборник

трудов 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней».- 2004.-Том 1.- М. с. 69-70.

42. Круглова А.И., Николаева Н.П., Нюхалова Ю.В., Баринский И.Ф., Алимбарова JI.M., Демкин В.В. Полиморфизм ДНК вируса простого герпеса типов 1 и 2 из лабораторных штаммов и клинического материала от пациентов с генитальным герпесом//Вопросы вирусологии.-2004.-1.- с.23-27.

43. Кущ А. А., Федорова Н. Е., Климова Р. Р. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций.// Методические рекомендации №02.030-08, Роспотребнадзор. М. - 2008. - С. 20

44. Кущ A.A., Хахалин J1.H. Клиника, лечение и лабораторная диагностика герпесвирусных заболеваний человека. Руководство для врачей. // М., ЗАО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», 1998.- 46 с.

45. Леган М.В., Чернявский А.М., Мироненко С.П. и др. Исследование герпесвирусов в крови больных с сердечнососудистой патологией.// Клиническая лабораторная диагностика.-2003.- № 4.- с. 48-49.

46. Львов Н.Д. Вирусы герпеса человека 6,7 и 8 типов - новые патогены семейства Herpesviridae//Bonpocbi вирусологии.-1999.-3 .-с. 105-109.

47. Львова И.И., Минаева Н.В. Возрастные особенности инфицированности и типичных клинических проявлений инфекций, вызванных вирусами простого герпеса и цитомегалии у детей. 2005, №3, 128-134.

48. Льюин Б. Гены. Под ред. Георгиева Г.П. 1987. М. Мир. 544 с.

49. Макарова Н.Е., Кущ A.A.,Иванова Л.А. и др. Получение моноклональных антител к сверхранним белкам цитомегаловируса человека и их применение для выявления инфицированных клеток. Вопр. вирусол. 1996; 41 (1): 28-32.

50. Марченко Л.А. Генитальный герпес. Новые клинические аспекты. Проблемы репродукции.-1996.- 4.- с. 29-33.

51. Меджидова A.A., Нисевич Л.Л., Федорова Н.Е., Ильина E.H., Талалаев А.Г., Адуева С.М., Хижнякова Т.М., Малахова М.В., Говорун В.М., Кущ A.A. Сравнение эффективности лабораторных методов выявления цитомегаловируса

в аутопсийном материале.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2002.-2.-C.63-69.

52. Молочков В.А., Кириченко И.М., Кривошеин Ю.С., Хайтович А.Б., Андроновская И.Б., Латыпова М.Ф., Несвижский Ю.В., Смирнов И.В., Щербо С.Н. Полимеразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматовенерологии. // Под ред. Воробьева A.A., 2004, М., Медицинское инфомационное агенство., 72 с.

53. Никонов А. П., Асцатурова О. Р. Генитальный герпес и беременность.// Гинекология - 2002. - Т. 4. - № 1. - С. 4-6

54. Нисевич Л. Л., Талалаев А. Г. Основные причины смерти новорожденных.// Руководство по педиатрии. Неонатология. Москва - 2006.- С. 432-448

55. Нисевич Л.Л., Каск Л.Н., Адиева A.A., Кущ A.A. Перинатальные факторы риска инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте. Вопр. акушерства, гинекологии и перинаталогии. 2007; 6(4): 13-17.

56. Павлюк A.C. Методы лабораторной диагностики заболеваний, вызванных вирусом простого герпеса.// Заболевания, передаваемые половым путем.- 1994.-3.- с. 3-7.

57. Пенкина Н. И., Лопатина Л. Н., Успенская И. И. и др. Внутриутробная инфекция в структуре младенческой смертности.// Материалы 3 съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины. «Проблемы внутриутробной инфекции плода и новорожденного» - М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ.-2000.-С. 33-34

58. Полетаев А. В., Будыркина Т. С., Морозов С. Г. и др. Инфекция матери как причина патологии плода и новорожденного.// Аллергология и иммунология - 2001. - Т. 2. - № 2. - С. 110-116

59. Протоколы диагностики, лечение и профилактики внутриутробной инфекции у новорожденных детей -М.:ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ. - 2001. - С. 96

60. Ребриков Д. В., Трофимов Д. Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных (обзор).// Прикладная биохимия и микробиология - 2006. - Т. 42.-№5.-С. 520-528

61. Саики Р., Гиленстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция. В кн. Анализ генома. Методы. Под ред. К.Дейвис. М. Мир. 1990. 176-190.

62. Серов В. Н. Сочетанная внутриутробная герпетическая и цитомегаловирусная инфекция и ее влияние на плод и новорожденного.// Материалы III съезда Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ - 2000. - С. 76-77

63. Серов В. Н., Тютюнник В. Д., Зубков В. В. Перинатальные исходы у беременных с инфекционными заболеваниями и плацентарной недостаточностью.// Акушерство и гинекология. - 2001. - № 1. - С. 16-21

64. Скоромец А. П. Инфекционные поражения нервной системы у новорожденных: Автореф. дис. доктора мед. наук - С.Пб. - 2001. - С. 70

65. Сорокина М. Н., Скрипченко Н. В. Вирусные энцефалиты и менингиты у детей.// Москва - 2004. - С. 424

66. Сухих Г.Т. Иммунология беременности. // М.: Изд. РАМН-2003. С.400

67. Федорова Н.Е., Меджидова М.Г., Воронцова О.Н. и др. Количественные лабораторные методы для диагностики цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей.// Вопросы вирусологии. -2005.-№ 1.-С. 9-14

68. Цинзерлинг А. В., Мельникова В. Ф. Перинатальная инфекция: практическое руководство.// Практич. рук-во. - СПб.: Эпби СПб. - 2002. - С. 352

69. Щербо С.Н. Разработка и применение гибридизационных и ПЦР технологий для молекулярного анализа геномов микроорганизмов.// 2005. Дисс. д.б.н., Москва

70. Allice Т., Cerutti F., Pittaluga F. et. al., Evalution of a novel real-time PCR for cytomegalovirus DNA quantitation on whole blood and correlation with pp65-

antigen test in guiding pre-emptive antivirial treatment. J. Virol., Methods, 2008, v. 148, 9-12.

71. Andorsky D. J., Lund D. P., Lillehei C. W. Nutritional and other postoperative management of neonates with clinical outcomes.// J. Pediatr. - 2001. -V. 139.-P. 27-33

72. Baumal C. R., Levin A. V., Read S. E.Cytomegalovirus retinitis in immunosuppressed children.// Am. J. Ophthalmol. - 1999. - V. 127. - № 5. - P. 550558

73. Boggess K.A., Watts D.H., Hobson A.C., Ashley R.L., Brown Z.A., Corey L. Herpes simplex virus type 2 detection by culture and polymerase chain reaction and relationship to genital symptoms and cervical antibody status during the third trimester of pregnancy//Am. J. Obstet. Gynecol.-1997.-176.-2.- p. 443-451.

74. Brown Z. A., Gardella C., Wald A., Morrow R. A., Corey L. Genital herpes complicating pregnancy.// Obstet Gynecol. - 2005. - V. 106. - P. 845-856

75. Bruisten S. M., Cairo I., Fennema H., Pijl A., Buimer M., Peerbooms P. G. H. et al. Diagnosing genital ulcer disease in a clinic for sexually transmitted diseases in Amsterdam.// J. Clin. Microbiol. - 2001. - V. 39. - P. 601-605

76. Buchman T.G., Simpson T., Nosal C., Roisman B,. Nahmias A.J. The structure of herpes simplex virus DNA and its application to molecular epidemiology. // Ann. NY Acad. Sci.-1980.-354.-p.270-290.

77. Campadelli-Fiume G., Foa-Tomasi L., Cassai E. Evidence that herpes simplex virus DNA is transcribed by cellular RNA polymerase Costanzo F.,B.// J of Virol. - 1977. - V. 21. - P. 996-1001

78. Casas I, Pozo F, Trallero G, Echevarria J. M, Tenorio A. Viral diagnosis of neurological infection by RT multiplex PCR: a search for entero- and herpesviruses in a prospective study.//J. Med. Virol.-1999.-57.-2.- p. 145-151.

79. Cassinotti P, Mietz H, Siegl G. Suitability and clinical application of a multiplex nested PCR assay for the diagnosis of herpes simplex virus infections // J. Med. Virol.-1996.-50.-1.- p.75-81.

80. Cassinotti P, Siegl G. A nested-PCR assay for the simultaneous amplification of HSV-1, HSV-2, and HCMV genomes in patients with presumed herpetic CNS infections.// J Virol Methods.-1998.-71.-l.- p.105-114.

81. Centers for Disease Control and Prevention Website. Sexually transmitted disease guidelines.//[http://www.cdc.gov/std/treat ment/2006/rr551 l.pdf]

82. Chee M.S., Bankier A.T., Beck S., Bohni R., Brown C.M., et al../ Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD 169 // In book: Current topics in microbiology and immunology. Ed. McDougall J.K., Berlin, Heidelberg, New York, 1990, V.154, P.125-169.

83. Chou S. Differentiation of cytomegalovirus strains by restriction analysis of DNA sequences amplified from clinical speciments // J.Infect.Dis.l990.Vol.l62. № 3.P. 738-742.

84. Chou S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection // Rev. Infect. Dis. 1990. Vol.12. Suppl.7.P.727-736.

85. Clements J.B., Hay J. RNA and protein synthesis in herpesvirus-infected cells // J.Gen. Virol. 1977. Vol.35. № 1. P. 1-12.

86. Corey L., Handsfield H. H. Genital herpes and public health; addressing a global problem.// JAMA. - 2000. - V. 283. - P. 791-794

87. Coyle P.V., Desai A., Wyatt D., McCaughey C., O'Neill H.J. A comparison of virus isolation, indirect immunofluorescence and nested multiplex polymerase chain reaction for the diagnosis of primary and recurrent herpes simplex type 1 and type 2 infections.//J. Virol. Methods.-1999.-83.-1 -2, c.75-82.

88. Croen K.D., Ostvove J.M., Dragovic L.I. et al. Patterns of gene expression and sites of latency in human nerve ganglia are different for varicella-zoster and herpes simplex virus // Proc.Nat.Acad.Sci USA. 1988. Vol. 85. № 24.P.9773-9777.

89. Cusini M., Ghislanzoni M. The importance of diagnosing genital herpes.// J Antimicrob Chemother - 2001. - V. 47. - P. 9-16

90. Daiminger A., Schalasta G., Betzt D., Enders G. Detection of Human Cytomegalovirus in Urine Samples by Cell Culture, Early Antigen Assay and Polymerase Chain Reaction. // Infection.-1994.-22.-l.-p.24-28.

91. Desselberger U. Herpes simplex virus infection in pregnancy: diagnosis and significance.// Intervirology. - 1998. - V. 41. - P. 185-190

92. Edward K., Wagner's, Herpes Virus Research.// [http://www.dbc.uci.edu/]

93. Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PCR.// Horizon Bioscence -2004.-P. 1-36

94. El Borai N., Inouer M., Levefre C at al. J. Obstet. Geneacol. Res., 1997, 23, 17-24.

95. Enright A. M., Prober C. G. Neonatal herpes infection: Diagnosis, treatment and prevention.// Semin Neonatol - 2002. - V. 7. - P. 283-291

96. Fang X.F., Song B., Tu Y.Y., Tong J.Z., Faul J.L., Bai H. Rapid detection of glycoprotein G gene for the diagnosis and typing of herpes simplex virus infection in genital herpes.// Sex. Transm. Infect.-1999.-75.-6.-p.396-397.

97. Fluit A.C., van Stijp J.A.G., Miltenburg L.A.N, et al. The use of a hybridization assay for the study of host deferences against HSV // J.Virol. Meth.1989. Vol.26. № 3. P.269-278.

98. Forman M., Charache P., Arthur R. The use of polymerase chair reaction for detection of cytomegalovirus in clinical specimens // Abstr. Ann. Meeting Am.Soc.Microbiol. (New Orlean).-1989. D-238. P. 122

99. Freedman E., Mindel A., Jones C.I. Epidemiological, clinical and laboratory aids for the diagnosis of neonatal herpes - an Australian perspective. // Herpes. -2004. - V. 11. - № 2. - P. 38-40

100. G. J. J. van Doornum, Guldemeester J., Osterhaus A. D. M. E. et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Culture.// Journal of Clinical Microbiology - 2003. - P. 576-580

101. Gaytant M. A. et al. Congenital cytomegalovirus infection: review of the epidemiology and outcome.// Obstet. Gynecol. Surv. - 2002. - V. 57. - P. 245-256

102. Gonzalez-Villasenor L.I. A duplex PCR assay for detection and genotyping of Herpes simplex virus in cerebrospinal fluid. // Mol. Cell. Probes. - 1999.-13.-4.-p.309-314.

103. Graza A., Silverio C., Ferreira J.P. et al. Congenital or neonatal cytomegalovirus infection? Acta Med. Port. 2004; 17 (4): 335-340.

104. Gressens P., Langston C., Martin J. R. In Situ PCR Localization of Herpes Simplex Virus DNA Sequences in Disseminated Neonatal Herpes Encephalitis.// J of Neuropathology and Experimental Neurology - 1994. - V. 53. - № 5. - P. 469-482

105. Grossman Z. Laboratory assessment and diagnosis of congenital viral infections: Rubella, cytomegalovirus (CMV), varicella-zoster virus (VZV), herpes simplex virus (HSV), parvovirus B19 and human immunodeficiency virus (HIV).// Reproductive Toxicology - 2006. - V. 21. - P. 350-382

106. Haarr L., Shukla D., Rodahl E. et al. Transcription from the gene encoding the herpesvirus entro receptor nectin - 1 (HveC) in nervous tissue of adult mouse.// Virol. 2001. - V. 287. - P. 301-309

107. Haase A.T., Retzel E. F., Staskus K. A. Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1990. - V. 87. - P. 49714975

108. Haliona B. Epidemiology of genital herpes - resentadvancer.// Eur. J. Dermatol - 1999.-V. 9. -№3.-P. 177-184

109. Halwachs-Baumann G., Genser B.,Pailer S. Et al. Human cytomegalovirus load in various body fluids of congenital infected newborns. J.Clin. Virol. 2002; 25: 81-87.

110. Hassan J., Connell J. Translational mini-review series on infectious disease: congenital cytomegalovirus infection: 50 years on.// Clin Exp Immunol. -2007. - V. 149. - № 2. - P. 205-210

111. Herold B.C. Glycoprotein C of herpes simplex virus type 1 plays a principal role in the adsoption of virus to cells and in infectivity // J.Virol. 1991.Vol.65.№ 3. P. 1090-1098.

112. Hill D. J., Petrik J., Arany E. Growth factors and the regulation of fetal growth.// Obstst. Gynecol. - 1998. - V. 92. - № 2. - P. 179-183

113. Hoang MP, Dawson DB, Rogers ZR, Scheuermann RH, Rogers BB. Polymerase chain reaction amplification of archival material for Epstein-Barr vi-rus,

cytomegalovirus, human herpesvirus 6, and parvovirus B19 in children with bone marrowhemophagocytosis. //Hum. Pathol.-1998.- 29.-10.-p. 1074-1077.

114. Hobson A., Wald A., Wright N., Corey L. Evaluation of a quantitative competitive PCR assay for measuring herpes simplex virus DNA content in genital tract secretions. // J. Clin. Microbiol.-1997.-35.-3.- p.548-552.

115. Honess R. W., Roizman B. Regulation of herpesvirus macro-molecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of viral proteins.// J of Virol. - 1974. - V. 14. - P. 8-19

116. Huang E.S., Kowalik T.F. The pathogenicity of human cytomegalovirus: an overview. - In book: Molecular aspects of human cytomegalovirus diseases, Ed. By Becker Y., Darai G. Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelone, Budapest., 1993, P. 3-45.

117. Hukkanen V., Rehn T., Kajander R., Sjoroos M., Waris M. Time-resolved fluorometry PCR assay for rapid detection of herpes simplex virus in cerebrospinal fluid.// J. Clin. Microbiol.-2000.-38.-9.-p. 3214-3218.

118. Ikegaya H., Motani H., Sakurada K. et al., Forensic application of Epstein-Barr virus genotype: correlation between viral genotype and geographical area. J. Virol., Methods, 2008, v. 147, 78-85.

119. Jackson R, Morris DJ, Cooper RJ, Bailey AS, Klapper PE, Cleator GM, Tullo AB. Multiplex polymerase chain reaction for adenovirus and herpes simplex virus in eye swabs. // J. Virol. Methods. - 1996. - 56. - 1.- p. 41-48.

120. Jones C.L. Herpes simplex virus infection in the neonate: clinical presentation and management. // Neonatal Network - 1996. -V. 15.-P. 11-15

121. Karen B.Fowler, Robert F. Et al. Risk Factors for Congenital Cytomegalovirus Infection in the Offspring of Young Women: Exposure to Young Children and Recent Onset of Sexual Activity. Pediatrics. 2006; 118: 286-292.

122. Kawana T. Vertical transmission of alpha herpes virus.// Nippon. Rinsho -2000. - V. 58. - № 4. - P. 871-876

123. Kenneson A., Cannon M. Review and meta-analysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. // Rev Med Virol. - 2007. - V. 17. - № 4.-P. 253-76.

124. Kessler H.H, Muhlbauer G., Rinner B., Stelzl E., Berger A., Dorr H.W, Santner B., Marth E., Rabenau H. Detection of Herpes simplex virus DNA by realtime PCR. // J. Clin. Microbiol.-2000.-38.-7.- p.2638-2642.

125. Kieff E.D., Hoyer B., Bachenheimer S.L., Roizman B. Genetic relatedness of type 1 and 2 herpes simplex virus.// J. Virol.- 1972.- 9.- p. 738-745.

126. Kimberlin D. W. Herpes simplex virus infections in newborn. // Semin. Perinatol. - 2007. - V. 31. - P. 19-25

127. Kimberlin D. W. Herpes Simplex Virus, Meningitis and Encephalitis in Neonates.// J. Herpes - 2004. - V. 11. - № 2. - P. 65-76

128. Kleinschmidt-De Masters B. K., Gilden D. H. The expanding spectrum of herpes simplex virus infection of the nervous system.// Brain Pathol. - 2001. - V. 11. - № 4. - P. 440-451

129. Knipe D.M. , Howley P.M.. Fields Virology, 5th Edition.// Copyright B©2007 Lippincott Williams & Wilkins

130. Knipe D.M.. Fundamental Virology.// Lippicott W&W. - Philadelphia, 2001.-P. 1123-1185

131. Kubota N., Wada K., Ito Y. et al. One-step multiplex real-time PCR assay to analyze the latency patterns of Epstein-Barr virus infection, J. Virol., Methods, 2008, v. 147, 26-36.

132. Kudashov N.I., Ozerova O.E., Voroshilova G.P., Lvov N.D., Ivanova N.V. The role of herpes simplex virus in the pathogenesis of cerebral lesions and visceral disorders in newborn infants. // Akush. Ginekol.- 1990- 1.- p. 24-28.

133. Kudo E., Shiota H., Kinouchi Y., Mimura Y., Itakura M. Detection of herpes simplex virus DNA in tear fluid of stromal herpetic keratitis patients by nested polymerase chain reaction//Jpn. J. Ophthalmol. -1996.-40.-3 p. 390-396.

134. Kwong A. D., Kruper J. A., Frenkel N. Herpes simplex virus virion host shutoff function.//J of Virol. - 1988. -V. 62. - P. 912-921

135. Lazzarotto T.,Guerra B.,Lanari M. Et al. New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Virol. 2008; 41 (3): 192-197.

136. Linssen C.F.M., Jacobs J.A., Stelma F. et al. Herpes simplex virus load in bronchoalveolar lavage fluid is related to poor outcome in critically ill patients.// Intensive Care Med. - 2008. - V. 34. - № 12. - P. 2202-2209

137. Lucotte G, Bathelier C, Lespiaux V, Bali C, Champenois T. Detection and genotyping of herpes simplex vims types 1 and 2 by polymerase chain reaction.// Mol. Cell. Probes.-1995.-9.-5.-p.287-290.

138. Mariotti M., Lefrere J.J., Rouger Ph. La technique de "Polymerase chain reaction" (PCR) // Spectra boil. 1989. Vol.7 №3. P. 45-47.

139. McGeoch D.J. The genome of herpes simplex virus: structure, function and evolution//Biol.Chem.Hoppe-Seyler. 1986. Vol. 367. P.477.

140. Meerbach A., Sauerbrei A., Meerbach W. et al. Fatal outcome of herpes simplex virus type 1-induced necrotic hepatitis in a neonate.// Med Microbiol Immunol.-2006.-V. 195.-P. 101-105

141. Michaels M.G. Treatment of congenital cytomegalovirus: where are we now? Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2007; 5 (3): 441-448.

142. Mindel A. Genital herpes - "the forggotten epidemic"// J. Internat. Herpes Management Forum.-1994.-1 (2).-p.39-48.

143. Mladina N., Mehikic G., Pasik A. TORCH infection in mother as a course of neonatal morbidity.// Med. Arh. - 2000. - V. 54. - P. 273-276

144. Mocarski E.S. Cytomegalovirus: biology and replication.- In book: The human herpesviruses. Ed. by Roizman B., Whitley R.J., Lopez C., New York, 1993, P. 173-226.

145. Musiani M., Zerbini M., Gentilomi G. et al. An amplified dot immunoassay for the direct quantitation of adapted and wild strains of human cytomegalovirus //J.Virol.Meth.l989.Vol.24 № 3. P. 327-334.

146. Naidu A.S. Site specific inversion sequence of the herpes virus genome: domaine and structural features // Acta mictobiol. Hung 1991. Vol. 38. № 3-4. P.245.

147. Najioullah F., Bosshard S., Thouvenot D. et al. Diagnosis and surveillance of herpes simplex virus infection of the central nervous system. // J Med Virol - 2000. -V. 61.-№4. -P. 468-73

148. Nelson C.T., Demmler G.J. Cytomegalovirus infection in the pregnant mother, fetus and newborn infant. Clin. Perinatol. 1997; 24: 151-160.

149. Norrild B. Immunochemistry of herpes virus glicoproteins // Curr.Top.Micro-biol.Immunol. 1980. Vol. 90., P.67.

150. Nuovo G. PCR in situ hybridization.// NY, Raven Press - 1992

151. Nuovo G. Preparation of samples for polymerase chain reaction in situ.// Scan Microsc Suppl. - 1996. - V. 10. - P. 49-55

152. Nuovo G., Gallery F., McConnell P. Analysis of non - specific DNA synthesis during in situ PCR.// PCR Method Applic. - 1994. - V. 4. - P. 342 - 349

153. Nuovo G., Gallery F., McConnell P., Becker J., Bloch W. An improved technique for the in situ detection of DNA after polymerase chain reaction amplification.// Am J Pathol. - 1991. - V. 139. - P. 1239 - 1244

154. Nuovo G., Gallery F., McConnell P., Horn R., Bloch W. Importance of different variables for enchansing in situ detection of PCR - amplified DNA.// PCR Methods Appl. - 1993. -V. 2. - № 305. - P. 312

155. Nuovo G., Gorgone G., McConnell P. In situ localization of PCR -amplified human and viral cDNAs.// PCR Methods Appl. - 1992. - V. 2. - P. 117123

156. O'Riordan D. P., Golden C. W., Aucott S. W. Herpes Simplex Virus Infection in Preterm Infant.// J. Pediatrics. - 2007. - V. 22. - P. 1613-1620

157. Proffit M. R., Schindler S. A. Rapid detection of HSV with enzyme-linked virus inducible system employing a genetically modified cell line.// Clin Diagn Virol - 1995.-V. 4.-P. 175-82

158. Rawlinson W. et al. Viruses and other infections in stillbirth: what is the evidence and what should we be doing?// Pathology. - 2008. - V. 40. - № 2. - P. 14960

159. Read S. J., Kurtz J. B. Laboratory Diagnosis of Common Viral Infections of the Central Nervous System by using a Simple Multiplex PCR Screening Assay. // J. Clin. Microbiol.-1999.-37.-5.- p.1352-1355.

160. Revello M. et al. Preconceptional primary human cytomegalovirus infection and risk of congenital infection // J. Infect. Dis. - 2006. - V. 193. - № 6. -P.783-7

161. Roizman B. Herpesviruses. In: The Molecular Biology of Tumor Viruses. // Ed. By Tooze J. 1973. p.470-501.

162. Roizman B., Batterson W. Herpesviruses and their replication // Virology / Eds.by B.N.Fields et al. New York, 1985. P. 497-526.

163. Rudnick C. M., Hoekzema G. S. Neonatal herpes simplex virus infections.// Am Fam Physician. - 2002. - V. 65. - № 6. - P. 1138-1142

164. Safrin S., Shaw H., Bolan G., Cuan J., Chiang C.S. Comparison of virus culture and the polymerase chain reaction for diagnosis of mucocutaneous herpes simplex virus infection//Sex. Transm. Dis. - 1997.-24.-3.- p. 176-180.

165. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S.et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. Vol.239. № 4839. P. 487-491.

166. Sakrauski A, Weber B, Kessler HH, Pierer K, Doerr HW. Comparison of two hybridization assays for the rapid detection of PCR amplified HSV genome sequences from cerebrospinal fluid.//J. Virol. Methods. -1994.-50.-l-3.-p.l75-184.

167. Sauberbrei F., Eichborn U., Hottenrott G., Wutzler P. Virological diagnosis of herpes simplex encephalitis.// J. Clin. Virol. - 2000. - V. 17. - P. 31 - 36

168. Schochetman G., Ou Chi-Yih, Jones Wands K. Polymerase chain reaction // J.Infec. Diseases. 1988. Vol.158. № 6. P. 1154-1157.

169. Shore S., Nahmias A. Immunology of herpes simplex virus: Immunology of human infection // Ed. Nahmias A.I. O'Reilly R.N.Y. 1992., P.21-72.

170. Slomka M. J., Emery L., Munday P. E. et al. A comparison of PCR with virus isolation and direct antigen detection for diagnosis and typing of genital herpes.//J Med Virol - 1998,-V. 55.-P. 177-183

171. Spann W., Pachmann K., Zabnienska H. et al. In situ amplification of single copy gene segments in individual cells by the polymerase chain reaction // Infection. 1991. Vol.19. № 4. P. 242-244.

172. Spear P. Herpes Simplex Virus: receptors and ligands for cell entry.// Cellular Microbiology. - 2004. - № 6. - P. 401-410

173. Spear P., Longnecker R. Herpesvirus entry: an Update.//J.of virol.-2003.-V.77.- № 19.-P. 10179-10185

174. Squier W. Shaken baby syndrome: the quest for evidence.// Dev. Med. Child Neurol. - 2008. - V. 50. - № 1. - P. 10-14

175. Stinski M.F., Mocarski E.S., Thomsen D.R.. DNA of human cytomegalovirus: size heterogeneity and defectiveness resulting from serial undiluted passage.//J. Virol..-1979.-V.31 .-P.231-239.

176. Stow N. D. Localization of an origin of DNA replication within the TRS/IRS repeated region of the herpes simplex virus type 1 genome.// EMBO J. -1982.-V. l.-P. 863-867

177. Syridou G., Spanakis N., Konstantinidou A. et. al. Detection of cytomegalovirus, parvovirus B19 and herpes simplex viruses in cases of intrauterine fetal death: association with pathological findings. //J. Med. Virol. - 2008. - Vol.80. -№10. -P.1776-82.

178. Tang Y.-W., Mitchell P. S., Espy M. J., Smith T. F., Persing D. H. Molecular Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infections in the Central Nervous System.//J. Clin. Microbiol., 1999.-6.-p.2127-2136.

179. Taylor T. J., Brockman M. A., McNamee E. E., Knipe D. M. Herpes Simplex Virus.// Front Biosci. - 2002. - V. 7. - P. 752-764

180. Tognon M., Cassai E., Rotola A., Roizman B. The heterogeneous regions in herpes simplex virus 1 DNA. // Microbiologica.-1983.- 6.- p. 191-198.

181. Tunback P., Bergstrom T., Claesson B. A. et al. Early acquisition of herpes simplex virus type 1 antibodies in children—a longitudinal serological study.// J Clin Virol - 2007. - V. 40. - № 1. - P. 26-30

182. Twagira M., Hadzic N., Smith M., et al. Disseminated neonatal herpes simplex virus (HSV) type 2 infection diagnosed by HSV DNA detection in blood and successfully managed by liver transplantation.// Eur J Pediatr - 2004. - V. 163 - № 3. -P. 166-169

183. Van Doornum G. J. J., Guldemeester J., Osterhaus A. D. M. E. et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Culture.// Journal of Clinical Microbiology - 2003. - P. 576-580

184. Vaughan P.J., Purifoy D.J., Powell K.L. DNA-binding protein associated with herpes virus DNA polymerase // J.Virol. 1985. Vol. 53. P. 501-508.

185. Vesanen M., Piiparinen H., Kallio A., Vaheri A. Detection of herpes simplex virus DNA in cerebrospinal fluid samples using the polymerase chain reaction and microplate hybridization.// J. Virol. Methods.-1996.- 59.- l-2.-p. 1-11.

186. Wagner E. K., Roizman B. Ribonucleic acid synthesis in cells infected with herpes simplex virus. I. Patterns of ribonucleic acid synthesis in productively infected cells.// J of Virol. - 1969. - V. 4. - P. 36-46

187. Wald A., Huang M., Carrell D. et al. Polymerase Chain Reaction for Detection of Herpes Simplex Virus (HSV) DNA on Mucosal Surfaces: Comparison with HSV Isolation in Cell Culture.// The Journal of Infectious Diseases - 2003. - V. 188.-№ 1.-P. 1345-1351

188. Warford A.L., Chung J.W., Drill A.E., Steinberg E. Amplification techniques for detection of herpes simplex virus in neonatal and maternal genital specimens obtained at delivery // J.Clin.Microbiol. 1989. Vol. 27. № 6. P. 1324-1328.

189. Weller S.K. et al. Cloning, sequencing, and functional analysis of oriL, a herpes simplex virus type 1 origin of DNA synthesis.// Molecular & Cellular Biology. - 1985.-V. 5.-P. 930-942

190. Whitley R. J. Herpes simplex virus in children.// Curr Treat Options Neurol -2002. - V. 4.-P. 231-237

191. Wildy P. Portraits of viruses. Herpes virus // Intervirology. 1986. Vol.25. P.l 17-140.

192. Winnacker E.L. From genes to clones (introduction to gene technology).-Weinheim, 1987.

193. Yamamoto A.Y., Mussi-Pinhata M.M., Cristina P. et al. Congenital cytomegalovirus infection in preterm and full-term newborn infants from a population with a high seroprevalence rate. Pediatr. Infect. Dis. J. 2001; 20 (2): 188-192.

194. Yamamoto T, Nakamura Y.A. Single tube PCR assay for simultaneous amplification of HSV-1/-2, VZV, CMV, HHV-6A/-6B, and EBV DNAs in cerebrospinal fluid from patients with virus-related neurological diseases.// J. Neurovirol.-2000.- 6.- 5.-p. 410-417.

195. Yerly S., Perrin L., Van Delden C. et al. Cytomegalovirus quantification in plasma by an automated real-time PCR assay. 2007, J. Clin. Virol., 38, 298-303.

196. Zhang Y., Kimura T., Fujiki K., Sakuma H., Murakami A., Kanai A. Multiplex polymerase chain reaction for detection of herpes simplex virus type 1, type 2, cytomegalovirus, and varicella-zoster virus in ocular viral infections. // Jpn. J. 0phtalmol.-2003 .-47.-3.- p.260-264.