Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Цибизов, Антон Сергеевич

• Цибизов, Антон Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Цибизов, Антон Сергеевич

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Характеристика альфагерпесвирусов

1.1. Вирусы простого герпеса 1, 2 типов

1.2. Строение вируса простого герпеса

1.3. Организация вирусного генома

1.4. Жизненный цикл вируса

1.5. Экспрессия вирусного генома

1.6. Сборка дочерних вирусных частиц

1.7. Выход вируса из клетки

1.8. Цитомегаловирус человека

1.8.1. Строение вириона

1.8.2. Структура ДНК. Организация генома

1.8.3. Жизненный цикл вируса

1.8.4. Пути заражения и клинические проявления ЦМВ инфекции

Глава 2. Инфекции, вызванные вирусом простого герпеса

2.1. Латентная ВПГ инфекция

2.2. Реактивация ВПГ инфекции

2.3. Клинические проявления ВПГ инфекции

Глава 3. Влияние герпесвирусов на процессы репродукции человека

3.1. Ассоциация герпесвирусной инфекции с возникновением мужского бесплодия

3.2. Герпесвирусная инфекция и женское бесплодие

3.3. Влияние герпесвирусной инфекции на развитие эмбриона и плода

3.4 Влияние герпесвирусов на течение беременности и ее исход

3.5. Герпесвирусная инфекция у новорожденных детей

3.6. Влияние клеточного иммунитета на наступление, течение и исход беременности при вирусных инфекциях

3.7. Лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения

3.8. Влияние иммунорегуляторных факторов на эффективность ЭКО

Глава 4. Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций

4.1. Культуральные методы

4.2. Иммуноцитохимическое определение вирусных антигенов в клинических образцах

4.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

4.4. Иммуноферментный метод для обнаружения противовирусных антител

4.5. Определение авидности антител 54 Заключение

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 5. Материалы и методы

5.1. Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе

5.2. Клеточные культуры

5.3. Вирусы

5.4. Определение инфекционной активности ВПГ-1 58 5.5 Быстрый культуральный метод (БКМ)

5.6. Пациенты

5.7. Клинический материал

5.8. Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА)

5.9. Определение авидности антител

5.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

5.11. Полимеразная цепная реакция in situ

5.12. Анализ интерферонового статуса и уровней цитокинов

5.13. Характеристика используемого лечебного препарата - Виферон®

5.14. Статистическая обработка данных

Глава 6. Влияние бессимптомной герпесвирусной инфекции на результаты экстракорпорального оплодотворения

6.1. Детекция ВПГ в эякуляте

6.1.1. Частота обнаружения ВПГ в цельном эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов

6.1.2. Оценка влияния ВПГ-инфицированных сперматозоидов на эмбриогенез in vitro

6.1.3. Анализ результатов ЭКО при ВПГ инфицировании мужских гамет

6.2. Детекция прямых маркеров ВПГ у пациенток, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО 72 6.2.1. Выявление ДНК ВПГ и инфекционно активного вируса в фолликулярной жидкости у пациенток ЭКО

6.3. Изучение антител против ВПГ в периферической крови женщин с бесплодием 73 6.3.1. Оценка эффективности ЭКО у пациентов в зависимости от уровней IgG антител к ВПГ

6.4. Исследование цитокинового профиля в материалах от пациенток с бесплодием

6.4.1. Определение цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови

6.4.2. Изучение зависимости эффективности ЭКО от концентрации цитокинов в фолликулярной жидкости

Глава 7. Изучение маркеров герпесвирусных инфекций ВПГ-и ЦМВ-этиологии у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом

7.1. Частота анализ выявления маркеров ВПГ и ЦМВ у беременных женщин

7.2. Результаты обнаружения маркеров ВПГ и ЦМВ у беременных женщин различными методами

7.3. Частота определения маркеров ВПГ в различных клинических материалах

7.4.Выявление серологических маркеров ВПГ и ЦМВ инфекций у беременных женщин

7.5. Влияние иммунотерапии рекомбинантным интерфероном альфа на течение герпесвирусных инфекций у беременных женщин

7.6. Оценка влияния инфицированности матерей герпесвирусами на состояние новорожденных детей

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности»

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в популяции и вызывают широкий спектр заболеваний человека [162, 195]. В последние годы возрастает число исследований, свидетельствующих о том, что инфекции органов мочеполовой системы, в том числе вирусные, занимают важное место в структуре причин мужского бесплодия [32, 61]. Мнения исследователей относительно роли герпесвирусов (ГВ) в этиологии нарушений фертильности у мужчин расходятся от полного отрицания влияния ВПГ и ЦМВ на процесс созревания мужских половых клеток [96,191] до установления прямой корреляции между вирусным инфицированием эякулята и мужским бесплодием [67, 173]. V

Многие вопросы в этой области оставались невыясненными. Так, не была доказана внутригаметная локализация вирусных частиц в зрелых мужских половых клетках, не установлена способность инфицированных ВПГ сперматозоидов участвовать в оплодотворении ооцитов и в передаче вируса эмбрионам через вируссодержащие сперматозоиды. Недостаточно изучены роль и механизмы противовирусной защиты в репродукции человека, которые могли бы эффективно сдерживать развитие герпесвирусной инфекции (ГВИ). Это, прежде всего, относится к реакциям врожденного иммунитета.

В настоящее время бесплодием страдают более 70 млн. пар во всем мире, однако результаты лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий остаются относительно невысокими. Так, средняя частота наступления беременности в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) составляет 30-40%. В связи с этим активно ведутся поиски средств и методов повышения эффективности лечения бесплодия, а также выявления маркеров, которые позволили бы прогнозировать результаты проведения ЭКО. Особый интерес представляет выяснение роли цитокинов, иммунорегуляторная функция которых в репродукции человека мало изучена. В связи с этим перспективным представляется выяснение экспрессии цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ЭКО.

Урогенитальные инфекции (УТИ) могут оказывать влияние как на ранние стадии беременности, так и на течение беременности, создают серьезный риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [16]. Особое место среди возбудителей УГИ занимают возбудители вирусных инфекций: ВПГ, ЦМВ. Рост заболеваемости ГВИ у людей репродуктивного возраста, многообразие клинических проявлений с преобладанием бессимптомных форм, определенные трудности в диагностике и терапии позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ включить указанные инфекции в группу заболеваний, которые определяют будущее инфекционной патологии человека [13]. Кроме того, эти инфекции представляют перинатальную угрозу, увеличивая риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [19].

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния бессимтомных форм ВПГ- и ЦМВ-инфекций на мужскую фертильность, на ранние стадии эмбриогенеза человека и на течение беременности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить частоту выявления ВПГ в эякуляте пациентов с нарушением фертильности по сравнению со здоровыми мужчинами.

2. Изучить влияние ВПГ на основные показатели качества спермы (концентрацию сперматозоидов, количество подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов).

3. Установить, влияют ли герпесвирусы, обнаруженные в сперматозоидах и в фолликулярной жидкости, на исход лечения бесплодия методом ЭКО.

4. Провести анализ уровней цитокинов в фолликулярной жидкости (ФЖ) и в сыворотке крови (СК) у женщин, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, и определить, существует ли зависимость между уровнями цитокинов, показателями эмбриогенеза и эффективностью лечения.

5. Выявить частоту встречаемости прямых маркеров ВПГ и ЦМВ и серологические показатели ВПГ-инфекции у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА) в течение беременности, начиная со 2-го триместра.

6. Провести анализ влияния иммунотерапии рекомбинантным интерфероном альфа на течение герпесвирусных инфекций у беременных женщин.

7. Оценить влияние ВПГ и ЦМВ на состояние детей, родившихся у инфицированных герпесвирусами матерей.

Научная новизна и практическая значимость

1. Установлена частота выявления ДНК ВПГ и инфекционной активности вируса в эякуляте, во фракции подвижных сперматозоидов и в ФЖ у пациентов с бесплодием в браке.

2. Проведен анализ влияния ВПГ на качество спермы, показатели эмбриогенеза и исход лечения бесплодия методом ЭКО.

3. Исследован цитокиновый профиль у пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО. Оценено влияние уровней цитокинов на основные показатели раннего эмбриогенеза и исход лечения по программе ЭКО.

4. Определена распространенность ГВИ в группе беременных женщин с ОАГА. На основании комплексного обследования беременных в динамике установлена частота первичного инфицирования и реактивации ВПГ в данной группе риска.

5. Изучено влияние иммунотерапии с использованием рекомбинантного интерферона а2Ъ (Виферон®) на элиминацию маркеров ВПГ и ЦМВ.

6. Проведена оценка влияния ВПГ и ЦМВ, обнаруженных у матерей с ОАГА, на состояния новорожденных детей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установлена прямая корреляция между инфицированностью эякулята ВПГ и показателями качества спермы. ДНК и инфекционная активность ВПГ выявлены не только в цельном эякуляте, но и во фракции подвижных сперматозоидов.

2. Частота формирования бластоцист после проведения ЭКО статистически значимо ниже при обнаружении ВПГ у партнера во фракции подвижных сперматозоидов по сравнению с пациентами, у которых ВПГ в сперматозоидах выявлен не был. Показано, что у пациенток, у которых в ФЖ присутствовали маркеры ВПГ, достоверно снижена частота имплантации эмбрионов после применения ЭКО.

3. Показано, что при высоких концентрациях ИЛ2 и ИФНу в ФЖ и в СК у женщин, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО, частота наступления беременности снижена в 7 раз и 33 раза, соответственно. Предиктором негативного результата лечения могут служить концентрации ИФНу и ИЛ2 в СК выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно.

4. У беременных женщин с ОАГА отмечается высокая инфицированность ВПГ и ЦМВ. В связи с этим показана целесообразность комплексного подхода к диагностике ГВИ у беременных женщин, включающего применение вирусологических, молекулярно-биологических и серологических методов диагностики, с целью своевременного установления активности инфекционного процесса.

5. Показана эффективность включения препарата рекомбинантного интерферона а2Ь (Виферон®) в состав базовой терапии при лечении ГВИ, начиная со второго триместра беременности.

6. Выявлена повышенная частота рождения детей в тяжелом состоянии и в состоянии средней степени тяжести у беременных с ОАГА, у которых перед родами были обнаружены маркеры ГВИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Цибизов, Антон Сергеевич

ВЫВОДЫ:

1. В эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов у мужчин с бесплодием в браке обнаружена инфекционная активность ВПГ в 28,6% и 11,4% случаев, соответственно. Частота определения ДНК ВПГ во фракции подвижных сперматозоидов была выше и составила 21,4%. Выявлена зависимость между присутствием ВПГ и ухудшением показателей качества спермы: снижена подвижность и количество морфологически нормальных форм сперматозоидов.

2. Показано, что при лечении бесплодия методом ЭКО присутствие ВПГ в сперме не влияет на частоту оплодотворения яйцеклеток и дробления зиготы, но статистически значимо снижает частоту формирования бластоцист, частоту имплантации эмбрионов и частоту наступления беременности.

3. Обнаружение ИЛ2 и ИФНу в высоких концентрациях в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у женщин, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, ассоциируется со статистически значимым снижением частоты наступления беременности. Предиктором негативного результата лечения могут служить концентрации ИФНу и ИЛ2 в сыворотке крови выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно.

4. У 43 из 115 обследованных беременных женщин (37,4%) с ОАГА, но без клинических проявлений ГВИ, в материалах обнаружены маркеры ВПГ и ЦМВ. Реактивация и первичная ЦМВ инфекция были выявлены 30,6% и 2,4%, соответственно. Реактивация и первичная ВПГ инфекция была установлена в 22,4% и 3,5% случаев, соответственно.

5. Включение Виферона® в состав базовой терапии беременных женщин приводило к элиминации маркеров герпесвирусов статистически значимо чаще, чем при базовой терапии без Виферона®.

6. Установлено, что у женщин с ОАГА при обнаружении ЦМВ в Ш-м триместре беременности риск рождения детей в тяжелом состоянии в 3,9 раза выше, чем у неинфицированных беременных женщин.

Заключение

Анализ данных научной литературы, приведенных в настоящем обзоре, показал, что вопросы, связанные с воздействием герпесвирусной инфекции на процессы репродукции, в настоящее время являются актуальными и интенсивно изучаются. В то же время следует отметить, что как в результатах экспериментов, так и в их интерпретации, наблюдаются существенные расхождения. Многие вопросы, связанные с иммунной регуляцией процессов репродукции и с влиянием герпесвирусной инфекции на эти процессы остаются до конца невыясненными. Некоторые из них перечислены ниже.

Во-первых, не определена роль бессимптомной ВПГ-инфекции в процессах репродукции человека. Ассоциация бесплодия с ГВИ.

Во-вторых, не установлены стадии репродукции человека, чувствительные к воздействию вируса.

В-третьих, не выяснено влияние иммунных реакций, развивающихся при вирусной инфекции, на ранние стадии эмбриогенеза.

В-четвертых, отсутствуют необходимые сведения о связи между инфицированием герпесвирусами и исходом лечения бесплодия методом ЭКО.

В-пятых, не получены достаточно полные и достоверные данные о влиянии бессимптомных герпесвирусных инфекций на течение беременности и ее исход.

Цель и задачи диссертационной работы направлены на поиск ответов на поставленные вопросы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

5.1. Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе

Антимышиные иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (Dako, Дания)

Бальзам для заключения препаратов (Shandon, США) Гематоксилин (БиоВитрум, Россия) Диаминобензидин (ДАБ) (Bioscience, США) Конъюгат Streptavidin/HRP (Dako, Дания)

Моноклональные антитела к белкам ВПГ (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»Минздравсоцразвития России)

Перевиваемые клетки почки зеленой мартышки линии Vero (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»Минздравсоцразвития России)

Праймеры, меченные биотином (Синтол, ДНК-синтез, Россия)

Протеиназа К (Dako, Дания)

Среда Игла MEM (ПанЭко, Россия)

Тест-системы для выделения ДНК: «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия)

Тест-системы для детекции ДНК: «АмплиСенс® HSV I, II-EPh»; "АмплиСенс® CMV- EPh" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия)

Тест-системы для выявления антител: «ВектоВПГ-IgM» (ООО «Ветор-бест Россия) , «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-0» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» («Диагностические системы», Россия) Тест-система для определения индекса авидности IgG-AT «ДС-ИФА-Анти-Bnr-1,2-G- Авидность», «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О-АВИДНОСТЬ» Тест-системы для определения уровня цитокинов и ростовых факторов: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2

Bender MedSystems USA), CD95 Human ELISA Kit (Abcam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abcam, USA). А также тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 - ИФА

- БЕСТ, альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ, альфа-Интерферон - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-1 бета - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-6 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-18 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-2 - ИФА - БЕСТ, Интерлекин-10

- ИФА - БЕСТ

Трис (гидроксиметил) аминометан (Serva, Германия) ТритонХ-100 (Serva, Германия) Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Эванс голубой (Sigma, США)

Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (ПанЭко, Россия) СупраСперм (Medi-Cult, Дания)

5.2. Клеточные культуры

В работе использовали перевиваемую культуру клеток почек зеленой мартышки Vero, полученную из лаборатории культур тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Для культивирования Vero использовали среду Игла-MEM (ПанЭко, Москва), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

5.3. Вирусы

В работе использовали референс-штамм вируса простого герпеса 1 типа

- F, любезно предоставленный доктором L. Pereira (США). ВПГ-1 поддерживали путем пассирования на чувствительных клетках линии Vero. Адсорбцию вируса с инфекционной множественностью (ИМ) = 0,1-0,01 БОЕ/кл проводили в течение 1 часа при 37°С. Затем вносили поддерживающую среду с 2% ЭТС. Инфицированные клетки инкубировали при 37°С. Сбор вируссодержащей жидкости производили при выявлении 90%-ого цитопатического действия (ЦПД) в монослое (в среднем, 2 дня для ВПГ-1). Для освобождения от фрагментов клеточного детрита вируссодержащую жидкость центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10-15 мин. на центрифуге Jouan MR1812 (Франция) и отбирали пробу для контроля инфекционного титра.

5.4. Определение инфекционной активности ВПГ-1

Инфекционный титр ВПГ-1, характеризующий активность вируса, определяли в клеточной культуре модифицированным методом бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 0,05 мл в 96-ти луночные планшеты с монослоем клеток Vero. Панели с материалом инкубировали при 37°С в течение 7 дней. Очаги инфицированных клеток (бляшки) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к сверхраннему и позднему белкам ВПГ. Титр вируса выражали в количестве БОЕ, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл), используя формулу А=(а х b)/v, где А - число бляшкообразующих единиц в 1 мл; а - среднее число бляшек на одну лунку; b -разведение вируса; v - объём вносимого вируссодержащего материала.

5.5. Быстрый культуральный метод (БКМ)

БКМ выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [20].

Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили 0,2 мл образцов и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СОг. Через 24 ч клетки фиксировали холодным ацетоном в течение 30 мин. при +4°С и проводили детекцию белков ВПГ в реакции непрямой иммунофлюоресценции (нИФ) с помощью вирусспецифических МКА.

5.6. Пациенты

Обследование беременных женщин и их новорожденных детей проводилось на базе ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) в период с 2010 г. по 02 июня 2011 г. Были исследованы клинические материалы (кровь, моча, соскоб из цервикального канала, вагинальный смыв) от 115 беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА), проходящих обследование и лечение в акушерском обсервационном отделении (зав. отд. - д.м.н. Зароченцева Н.В.) и в клинико-диагностическом отделении (зав.отд. - д.м.н. Новикова C.B.) ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва).

Обследование 404 супружеских пар, обратившихся для лечения бесплодия методом ЭКО, проводилось в лечебно-диагностическом центре «Евро-Клиник» (г. Москва), в отделение репродукции ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) и в Медицинском Центре вспомогательных репродуктивных технологий «Новая жизнь» (г. Москва).

Эякулят было получен и исследован от 315 мужчин, обратившихся в медицинские учреждения г. Москвы: в Медико-генетический научный центр РАМН; в ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России; в клинику «Альтра-Вита», в клинико-диагностический центр «Пастер» и в медицинский центр «Евро-Клиник».

5.7. Клинический материал

В качестве клинических образцов исследовали кровь, мочу, урогенитальные соскобы, цельный эякулят, фракцию подвижных сперматозоидов (ПС), а также фолликулярную жидкость (ФЖ).

Цельную кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин. Затем стерильно отбирали фракцию лейкоцитов, расположенную над эритроцитами. Для проведения БКМ по 0,2 мл лейкоцитарной фракции вносили в культуру клеток. Сыворотку и/или плазму крови использовали для серологического анализа и определения цитокинового статуса. Мочу центрифугировали в тех же условиях. Для проведения анализа БКМ использовали осадок мочи. Фракцию ПС получали с использованием набора СупраСперм (Medi-Cult). Во всех случаях объем анализируемой пробы ФЖ и ПС для метода БКМ составлял 0,2 мл.

5.8. Твердофазный нммуноферментный анализ (тИФА)

Определение антител к ВПГ и ЦМВ классов M и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА).

Выявление вирусоспецифических антител проводили с помощью сертифицированных наборов фирм НПО «Диагностические системы» (Россия), а также ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Для определения антител IgM использовали набор «ВектоВПГ-IgM» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М». Для выявления и определения титра IgG антител использовали наборы «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-0» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G». Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

5.9. Определение авидности антител

Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью набора «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-С-Авидность» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G-АВИДНОСТЬ» фирмы «Диагностические системы» (Россия). Оценку результатов осуществляли согласно рекомендациям фирмы производителя.

5.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Выделение ДНК проводили с помощью двух сертифицированных коммерческих наборов ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора («ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В»), в зависимости от природы анализируемой биологической пробы.

В работе были использованы наборы реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора «АмплиСенс® HSV I, II-EPh»; «АмплиСенс® CMV- EPh» согласно инструкции фирмы производителя. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) при определенной температурной программе, согласно рекомендации производителя тест-систем.

5.11. Полимеразная цепная реакция in situ

Препараты для ПЦР in situ готовились на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond). Препараты культур клеток для положительных контролей были получены путем культивирования клеток Vero и ФЛЭЧ на адгезивных стеклах.

Фиксировали препараты в 10% нейтральном формалине в течение 4 часов, затем промывали в 0,05М ТРИС-НС1 рН 8,0 буфере. Затем на стёкла наносили 200 мкл 0,01%) раствора ТритонХ-100 на 90 секунд и стекла промывали в 0,05М ТРИС-НС1 буфере в течение 2 минут.

Препараты обрабатывали протеиназой К в разведении 1:50 (разведение проводилось в ТРИС-НС1 буфере 0,05М). Время инкубации с протеиназой К было определено в результате проведения серии предварительных опытов. Для препаратов культур клеток оптимальное время инкубации составило 5 мин. Инкубацию проводили в термостате при 37°С, затем препараты промывали в ТРИС-НС1 буфере 0,05М. Промытые стекла высушивали на воздухе.

На высушенные стекла наносили по 20 мкл амлификационной смеси, состоящей из смеси праймеров, ПЦР-буфера, дНТФ, ДНК-полимеразы и деионизованной воды. Препараты накрывали покровными стёклами и обрабатывали края клеем для предотвращения испарения амлификационной смеси.

В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ. Амплификация проводилась в амплификаторе Вютейа ТЬегтосус1ег Т1 при оптимизированной температурной программе: 95°С 2 мин, 30 циклов; 95°С - 30 сек, 60°С - 35 сек, 72°С - 50 сек; 72°С - 4 мин.

Препараты вынимали из амплификатора, погружали в ёмкость с буфером (0,05 М ТРИС-НС1) и, не вынимая из раствора, с препаратов снимали покровные стёкла. Затем препараты высушивали на воздухе.

Детекцию проводили с использованием комплекса биотин-стрептавидин-пероксидаза хрена и красителя ДАБ. Конъюгат разводили в соотношении 1:100 в ТРИС-НС1 буфере. Инкубацию с коньюгатом проводили в течение 1 часа при 37°С. После инкубации стекла промывали в ТРИС-НС1 0,05М буфере и высушивали на воздухе.

На препараты наносили смесь, которую готовили непосредственно перед употреблением: 36% перекись водорода смешивали с раствором ДАБ+ТРИС (в

1 мл ТРИС-НС1 буфера растворяли 0,0005г ДАБ) из расчета Імкл Н2О2 на 1 мл ДАБ+ТРИС, наносили 500 мкл раствора на стекло.

Реакцию останавливали через 15 минут дистиллированной водой. После этого препараты 10 секунд докрашивали гематоксилином, высушивали и заключали в бальзам.

Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах, инфицированных ВПГ, наблюдались метки в виде темно-коричневых зерен. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

5.12. Анализ интерферонового статуса и уровней цитокинов

Уровни цитокинов и факторов роста у женщин, проходящих программу ЭКО, проводили в сыворотке крови и фолликулярной жидкости с использованием тест-систем: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2 (Bender MedSystems USA), CD95 Human ELISA Kit (Abeam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abeam, USA). А также тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 - ИФА - БЕСТ, альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ, альфа-Интерферон - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-1 бета - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-6 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-18 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-2 - ИФА -БЕСТ, Интерлекин-10 - ИФА - БЕСТ.

5.13 Характеристика используемого иммунопрепарата

Для лечения беременных женщин использовали иммуномодулирующий препарат Виферон® (ООО «Ферон», Россия). В состав препарата входит человеческий рекомбинантный интерферон-а2Ь, антиоксиданты (а-токоферола ацетат и аскорбиновая кислота) и основа (масло какао).

5.14. Статистическая обработка данных

Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTICA 6,0. При анализе полученных данных были использованы приемы альтернативного анализа и описательной статистики (среднее арифметическое М, медианы, среднее квадратическое отклонение а и средняя ошибка ш). Оценка статистической значимости различий в группах с нормальным распределением проводилась с помощью 1>критерия Стьюдента и двухстороннего точного критерия Фишера.

Применение критерия Шапиро-Уилка использовалось для оценки присутствия нормального распределения признаков. Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений - критерий Вилкоксона. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

Глава 6. Влияние бессимптомной герпесвируснон инфекции на результаты экстракорпорального оплодотворения

6.1. Детекция ВПГ в эякуляте

6.1.1. Частота обнаружения ВПГ в цельном эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов

Было изучено влияние ВПГ на показатели спермы. Работа проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетики нарушений репродукции ГУ МГНЦ РАМН (зав. лаб. доктор биол. наук, профессор Л.Ф. Курило), а также были обследованы мужчины, обратившиеся для лечения бесплодия методом ЭКО в отделение репродуктологии ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (руководитель, д.м.н. Краснопольская К.В.).

Инфекционно активный вирус методом БКМ определяли в эякуляте от 245 мужчин, из которых 164 обследовались по поводу бесплодия в браке, 81 фертильный мужчина, проходивших обследование для включения в группу доноров спермы. Данные по частоте обнаружения вируса у пациентов с бесплодием и у здоровых фертильных мужчин представлены в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Цибизов, Антон Сергеевич, 2012 год

1. Абдулмеджидова А.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Макарова Н.П., Климова P.P., Кущ A.A. Бессимптомная форма генитального герпеса и бесплодие у мужчин// Урология. 2007. - №3. - С. 56-59.

2. Аншина М. Б. Если вам нужен ребенок// Изд. 8-е, доп. и перераб. М., 2006.

3. Аншина М.Б. ВРТ: прошлое, настоящее, будущее// Проблемы репродукции. 2002. - №3. - С. 6-15.

4. Баринский И.Ф. Герпевирусная инфекция иммунодефицитные заболевания XXI века// Аллергология и иммунология. - 2004. - Т.5. -С. 202-204.

5. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров A.A., Гребешок В.Н. Герпес (этиология, диагностика, лечение)// М.: Медицина. 1986. - С. 272.

6. Баркалина Н.В. Фолликулярная жидкость и прогноз исходов программ ВРТ// Проблемы репродукции. М.: Медиа Сфера. - 2006. - Т. 12 № 6. -С. 57-64.

7. Безнощенко Г.Б., Долгих Т.И., Кривчик Г.В. Внутриутробные инфекции (вопросы диагностики и врачебной тактики)// М.: Мед. Книга, Н.Новгород: Издательство НГМА 2006; 41-52.

8. Бочарова E.H., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К. и др. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов// Андрол. и генит. хир. 2006. - №1. - С. 59-65.

9. Бочарова E.H., Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е. и др. Выявление геномной ДНК простого герпеса методом гибридизации in situ в сперматозоидах человека при нарушении фертильности// Докл. РАН. -2007. Т. 412 №3. - С. 417-421.

10. Брагина Е.Е., Абдулмаликов P.A., Курило Л.Ф., Шилеко Л.В. Дмитриев Г.А. Выявление сперматозоидов, инфицированных вирусом простого герпеса// Вестник дерматологии венерологии. 2006. - №5. -С. 18-22.

11. Владимирова Н.Ю., Никитин В.Г., Чижова Г.В. Индивидуальный подход к дородовой подготовке женщин с синдромом потери плода на фоне различных форм генитального герпеса// Акушерство и гинекология. 2008 . - N 5 . - С. 31-35.

12. Власова М.А., Островская О.В., Львов Н.Д., Никитина A.A. Влияние бессимптомного генитального герпеса на течение и исход беременности//Вопр. Вирусологии. 1991. - №36(6).- С.501-503.

13. ВОЗ. Глобальная стратегия профилактики инфекций, передаваемых половым путем, и борьбы с ними 2006-2015 гг.». 2007. стр.5.

14. Володин H.H., Рогаткин С.О. Современные подходы к комплексной терапии перинатальных поражений ЦНС у новорожденных// Фарматека. 2004. - № 1. - С. 72-80.

15. Воробьева O.A., Кирсанов A.A., Потин В.В. Особенности оплодотворения ооцитов и развития эмбрионов в культуре у женщин с недостаточностью яичников// Проблемы репродукции. 1999. - №4. -С. 17-21.

16. Кудашов Н.И. Клинико-диагностические аспекты внутриутробной герпесвирусной инфекции у новорожденных// Вестник акуш. и гинек. 1993.- 1-2: 5-12

17. Кущ A.A., Федорова Н.Е., Климова P.P. и др. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций// Методические рекомендации. 2008. - №02.030-80.

18. Львов Д.К. Медицинская вирусология: Руководство// М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008 г. С. 260 -266; 310312; 318-321; 330-339; 413-419;426-432

19. Макаров, О.В., Алешкин В.А., Савченко Т.Н. Внутриутробное инфицирование// Инфекции в акушерстве и гинекологии. М.: МЕДпресс-информ. - 2007. - С. 263-419.

20. Марченко JI. А., Лушкова И.П. Генитальный герпес и его влияние на репродуктивное здоровье женщины// Медицина. 2004. - С. 39-43.24