Разработка фагового препарата Bacillus mesentericus и область его практического применения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Юдина, Мария Александровна

• Юдина, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юдина, Мария Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологические свойства бактерий Bacillus mesentericus.

1.1.1. Характеристика бактерий Bacillus mesentericus.

1.1.2. Ареал распространения бактерий Bacillus mesentericus.

1.1.3. Устойчивость бактерии Bacillus mesentericus.

1.1.4. Методы индикации и идентификации Bacillus mesentericus.

1.2. Характеристика бактериофагов и область их применения.

1.2.1. Классификация фагов.

1.2.2. Свойства бактериофагов.

1.2.3. Фагоиндикация.

1.2.3. Фаготипирование бактерий.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты, материалы и методы исследований.

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.

2.2.1 .Выделение бактерий Bacillus mesentericus.

2.2.2. Выделение и селекция бактериофагов Bacillus mesentericus.

2.2.3. Изучение основных биологических свойств выделенных фагов бактерий Bacillus mesentericus.

2.2.4. Технологические параметры изготовления и контроля лабораторной серии биопрепарата на основе бактериофагов Вш-3 и Вш-8 серии

УГСХА.

2.2.4.1. Характеристика производственных штаммов Bacillus mesentericus и порядок работы с ними.

2.2.4.2. Культивирование индикаторных фагов, входящих в состав биопрепарата.

2.2.4.3. Технология изготовления бактериофагов, входящих в состав биопрепарата.

2.2.4.4. Контроль бактериофагов, составляющих биопрепарат.

2.2.5.Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий Bacillus mesentericus.

2.2.6. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага (РНФ).

2.2.7. Использование РНФ для обнаружения бактерий

Bacillus mesentericus пищевом сырье и продуктах питания.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка фагового препарата Bacillus mesentericus и область его практического применения»

Актуальность темы. Бактерии Bacillus mesentericus - фитопатогенные бактерии, поражающие лен, тыкву, кукурузу, свеклу, плоды апельсина, абрикоса, кабачков и других растений, клубни картофеля, семенники капусты, коробочки хлопчатника и т.п., и тем самым наносящие значительный экономический ущерб сельскохозяйственным и перерабатывающим предприятиям (Аскалонов, 1962; Меркулов, 2011).

Бактерии Bacillus mesentericus в ассоциации с Bacillus subtilis являются возбудителями картофельной болезни хлеба. Разрушение структуры хлеба и разложение содержащихся в нем веществ, связано с продуцированием этими видами бактерий активных протеолитических и амилолитических ферментов (Медведев, 2010). Спороносным бактериям Bacillus mesentericus, особенно их термофильным формам, отводится значительная роль в процессах самосогревания зерна (Пельц, 2003).

Бактерии Bacillus mesentericus являются возбудителями порчи пищевого сырья и продуктов питания, вызывают отравления, характеризуемые острым течением болезни по типу отравлений, вызываемых Bacillus cereus.

В настоящее время в бактериологических лабораториях идентификация бактерий Bacillus mesentericus, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и изучении их биохимических свойств. Этот метод трудоемок и не достаточно эффективен из-за выраженного полиморфизма ферментативных свойств бактерий Bacillus mesentericus. Поэтому перед исследователями стоит задача разработки достоверного и метода индикации и идентификации названных микроорганизмов. Классическая схема идентификации бактерий рода Bacillus первой морфологической группы по R. Gordon (1973) чрезвычайно материало затратная и трудоемкая. На сегодня вопрос о разработке ускоренной схемы идентификации Bacillus mesentericus остается открытым.

Мы предлагаем использовать для индикации и идентификации Bacillus mesentericus использовать специфичные бактериофаги, позволяющие достоверно идентифицировать пищевые контаминанты и проводить их дифференциацию на биотипы и фаговары внутри вида.

Патентный поиск и анализ литературных данных свидетельствует, что в настоящий момент в Российской Федерации не разработаны методики индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus с помощью бактериофагов в объектах санитарного надзора. Применение этих методик позволит в сжатые сроки найти и идентифицировать бактерии вида Bacillus mesentericus, в течение 25 часов, используя минимальное количество расходных материалов.

Цель исследования - разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий Bacillus mesentericus в пищевых продуктах.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий Bacillus mesentericus.

3. Изучить основные биологические свойства (литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.

4. Сконструировать биопрепарат для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата на основе фагов.

6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания титра фага с использованием созданного биопрепарата.

7. Разработать экспресс-метод идентификации бактерий Bacillus mesentericus с помощью бактериофагов.

Научная новизна. Впервые выделены из проб почвы и изучены по основным биологическим свойствам специфичные бактериофаги Bacillus mesentericus, из них для конструирования биопрепарата отобраны фаги Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА, имеющие наиболее широкий спектр литического действия и высокие показатели литической активности, незначительно изменяющиеся при хранении в течение 12 месяцев.

Разработаны биотехнологические параметры изготовления лабораторной серии биопрепарата для индикации и идентификации Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания.

Доказана возможность применения схемы фагоиндикации Bacillus mesentericus в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с применением созданного биопрепарата.

Предложен экспресс-метод выделения и идентификации бактерий вида Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора с помощью созданного фагового биопрепарата.

Практическая значимость.

Использование разработанных схем фагоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus mesentericus открывает перспективы их использования в лабораторной практике для оценки качества пищевого сырья и продуктов питания растительного и животного происхождения, позволяющие сократить время исследования до 25 часов (при постановке РНФ) и до 32 часов (при фагоидентификации) и снизить экономические затраты на исследования.

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов Вш-3 УГСХА и Вт-8 УГСХА и методика фагоиндикации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания подтверждены актом производственных испытаний в ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (22.10.2012), утвержденным директором Юсуповым P.M., актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П. А. Столыпина» (17.09.2012), утвержденными первым проректором - проректором по науке, профессором Исайчевым В.А.

По материалам диссертационных исследований разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов», рассмотренная на научно-техническом совете и утвержденная первым проректором - проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (16.10.2012), размещенная в виде электронного ресурса на сайте научной библиотеки ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» и предназначенная для аспирантов и научных сотрудников, специализирующихся в области биотехнологии и микробиологии

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина».

Положения, выносимые на защиту:

1. Используя схему выделения бактериофагов из объектов санитарного надзора применительно к бактериям Bacillus mesentericus, выделено и селекционировано 22 изолята специфических бактериофагов, изучены основные биологические свойства (спектр литического действия, литическая активность, специфичность, изменение литической активности при хранении, устойчивость к температуре).

2. На основе селекционированных фагов бактерий Bacillus mesentericus Bm-З УГСХА и Bm-8 УГСХА, которые обладали наиболее высокими титрами литической активности и широким спектром литического действия был сконструирован биопрепарат. Разработаны технологические параметры его изготовления.

3. Результаты исследований свидетельствуют, что разработанный экспресс-метод идентификации бактерий Bacillus mesentericus с применением биопрепарата на основе фагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА, позволяет определить видовую принадлежность Bacillus mesentericus за 25 часов.

4. Эксперименты демонстрируют, что схема ускоренной индикации бактерий В. mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания методом реакции нарастания титра фага (РНФ), применяя сконструированный биопрепарат, позволяет обнаружить бактерии Bacillus mesentericus за 25 часов в концентрации 103 м.к./г.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» и была поддержана 3 грантами Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса 2011, 2012» («УМНИК»), грантом «Молодые новаторы аграрной России» некоммерческой организации «Ассоциация образовательных учреждений АПК и рыболовства» и Федеральной целевой программой «Поддержка научных исследований, проводимых коллективами научно-образовательных центров по научному направлению «Науки о жизни (Живые системы)»» (Шифр лота 20121.1-12-000-2008, наименование «Бактериофаги как природные биосенсоры для индикации и идентификации бактериальных агентов, вызывающих пищевые инфекции и порчу пищевого сырья»).

Апробация работы:

Все научные положения и выводы по результатам диссертационной работы обеспечены глубокой проработкой литературного материала, согласованностью полученных теоретических и экспериментальных данных с результатами исследований, которые были представлены на: III Международной научно -практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука 21 века»

Ульяновск, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее», посвященного 90-летию Заслуженного профессора Московского университета Н.С. Егорова (Москва, 2011), Научно-практическом семинаре с международным участием «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности» (Ульяновск, 2011), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), VI Международной научно-практической конференции «Аграрная наука - сельскому хозяйству» (Барнаул, 2011), III Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2011), III Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), Н-й конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя состоит в планировании и проведении экспериментальных исследований в рамках диссертационной работы, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, перечня сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 126 страницах, включают 26 таблиц и 12 рисунков. Список использованных литературных источников включает 182 наименования, в том числе 54 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Юдина, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено 20 культур бактерий вида Bacillus mesentericus при исследовании 65 проб объектов санитарного надзора. Уровень контаминации исследуемых пищевых продуктов бактериям Bacillus mesentericus составил 31%.

2. Выделено и селекционировано 22 изолята фагов из объектов внешней среды активных по отношению к бактериям Bacillus mesentericus.

3. Изучены основые биологические свойства 22 изолятов фагов Bacillus mesentericus (морфология негативных колоний, специфичность, спектр литического действия, литическая активность).

4. Сконструирован биопрепарат на основе фагов Вт-3 и Вт-8 серии УГСХА, индикаторные штаммы - бактерии Bacillus mesentericus 66 и Bacillus mesentericus 2. Фаги характеризовались высокими титрами литической активности (1,5х109 ± ОДхЮ9 и 4,0x109±0,3x109 корпускул в 1 мл фаголизата, соответственно) и максимально широким совместным спектром литического действия - 91,0 %, сохраняли литическую активность в пределах 107 в течении 12 месяцев при хранении в условиях 2-4 °С.

4. Усовершенствована технология изготовления фагового биопрепарата Bacillus mesentericus: наработка фагов идет на коммерческом мясо-пептонном бульоне. Температурный оптимум - 37 °С. Оптимальное соотношение бактериофага Вт-3 УГСХА и штамма Bacillus mesentericus 66 - 1:1, т.е. 0,2 мл фага на 0,2 мл индикаторной культуры, время пассажа составляет 6 часов (параметры культивирования бактериофага Вт-8 УГСХА с культурой Bacillus mesentericus 2 аналогичны). Очистка фагов от бактериальных клеток осуществляется методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 цш GV). Биопрепарат представляет собой 2 флакона с прозрачной жидкостью желтоватого цвета (цвет засеянной среды) без посторонних примесей и осадка. Титр не ниже 108. Дату изготовления серии исчисляют со дня закупорки флаконов. Срок годности бактериофагов при температуре 2-4 °С 12 месяцев.

5. Создана схема ускоренной индикации бактерий Bacillus mesentericus методом реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата на основе фагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА, которая позволяет обнаружить бактерии в л концентрации 10 м.к./г пищевого сырья и продуктов питания за 25 часов.

6. Разработана схема идентификации бактерий Bacillus mesentericus с помощью сконструированного биопрепарата, позволяющая идентифицировать микрооганизмы за 32 часа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для выявления бактерий Bacillus mesentericus в концентрации 103 м.к./г пищевого сырья и продуктов питания предлагаем использовать биопрепарат, сконструированный на основе фагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА, в реакции нарастания титра фага.

2. Идентификацию бактерий Bacillus mesentericus предлагаем проводить с использованием высокоспецифичных бактериофагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА методом «стекающая капля». Время исследования 32 часа при минимальных затратах расходных материалов и экономии трудовых ресурсов.

3. Разработанные схемы ускоренной индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus предлагаем использовать как лабораторный метод приемочного контроля пищевого сырья и оценки качества продуктов питания растительного и животного происхождения.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АПК - агропромышленный комплекс г/л - грамм на литр

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ корпл./мл - корпускул в миллилитре

МЗ РФ - министерство здравоохранения Российской Федерации мин - минута

М.к. - микробная клетка

М.к./г. - микробных клеток на 1 грамм

Мкм - микрометры м.к./мл - микробных клеток на миллилитр

МПА - мясопептонный агар

МПБ - мясопептонный бульон Нм - нанометр

НТД - нормативно-техническая документация Об./мин - оборотов в минуту ПЦР - полимеразно-цепная реакция рН - показатель кислотности РНК - рибонуклеиновая кислота РНФ - реакция нарастания титра фага СВЧ - сверхвысокие частоты С/с - градусов Цельсия в секунду

УГСХА - Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия УФ - ультрафиолетовые

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии рода Bacillus благодаря способности образовывать эндоспоры и высоким адаптивным возможностям, широко распространены в природе и играют большую роль в различных биологических процессах. Наличие анаэробных спорообразующих бактерий в воде, воздухе, почве - это факт общеизвестный, подтвержденный многими литературными данными (Dominici, 1982; Mastroeni, 1984; Ипатенко, 1987; Алтон, 1988; Васильев, 2007). Меньше известно о содержании бактерий рода Bacillus в пищевых продуктах, кормах, организме человека и животных. Связано это, прежде всего с тем, что представители рода Bacillus (за исключением с Bacillus anthracis) традиционно считаются безвредными сапрофитами. Поэтому не редко при исследовании микробных культур, изолированных из организма больного или из продуктов, подозреваемых в качестве причины отравлений, спорообразующие аэробные бактерии вообще, а особенно Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus, рассматриваются как контаминанты (Katsaras, 1974; Мустафин, 2008). В связи с этим они детально не изучаются и с ними, следовательно, не связывают конкретные' случаи заболеваний. Тем не менее, в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что бактерии рода Bacillus в значительных количествах обнаруживаются в пищевых продуктах, в пищеварительном тракте человека и животных, других органах и тканях. В ряде случаев они служат причиной различных заболеваний - сепсиса, пищевых интоксикаций, энцефаломиелитов и т.д. (Затула, 1973; Stoeva, 1991; Genov, 2009).

Современные методы диагностики (ПЦР, ИФА), которые могут быть использованы для индикации и идентификации бактерии Bacillus mesentericus дорогостоящи и недоступны большинству бактериологических лабораторий. Поэтому изысканию простых и доступных методов для лабораторной практики является актуальной проблемой.

В связи с этим наша работа была посвящена изысканию вирулентных специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий Bacillus mesentericus, выделенных из объектов санитарного надзора. У

В период с 2010 по 2012 год было исследовано на наличие бактерий Bacillus mesentericus 65 проб пищевых продуктов: 15 проб хлеба из муки пшеничной высшего и первого сортов, 20 проб муки пшеничной высшего и первого сортов, 15 проб специй, приобретенных в Ульяновской и Самарской областях, 15 проб почвы различного хозяйственного значения. Выделение бактерий вида Bacillus mesentericus проводили по классической схеме выделения и идентификации бацилл первой морфологической группы (Gordon, 1973), которую дополнили тестами на определение ферментативной активности выделенных бактерий по Сидорову (1995). Результаты наших исследований не расходятся с данными отечественных и зарубежных исследователей, занимавшихся проблемой контаминации пищевого сырья и продуктов питания почвенными сапрофитами (Африкян, 1973; Архангельская, 1988; Коломникова, 2009; Stoeva, 1991).

Вторым этапом работы было выделение фагов бактерий Bacillus mesentericus. Первоначально, мы исследовали выделенные нами штаммы как потенциально лизогенные. Поиск умеренных фагов мы проводили по методике Лурия и Дарнелла (1970) в модификации Шестакова (2010). В первой серии экспериментов мы использовали методику выделения бактериофагов бацилл без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии экспериментов на культуры. Bacillus mesentericus, исследуемые как «лизогенные», мы воздействовали индуцирующим фактором (воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей в течение 5-20 минут при помощи бактерицидной лампы, 80 % энергии которой приходится на длину волны 2537 Ä, на расстоянии 50 см между лампой и объектом) по методике Мейнелла (1965) в модификации Калдыркаева (2011). Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Bacillus mesentericus методом агаровых слоев. В наших исследованиях мы не наблюдали естественной и искусственной лизогенности исследуемых штаммов Bacillus mesentericus. Профаги, интегрированные с хромосомой микробной клетки, выявлены не были. Цель третьей серии экспериментов - выделение бактериофагов из объектов внешней среды по

92 методике Гольдфарба (1961) в оригинальной модификации Ревенко (1978). По литературным данным, наиболее эффективно в качестве источника выделения бактерий рода Bacillus, использовать пробы почвы, так как они являются почвенными сапрофитами. При исследовании 88 проб почвы различного хозяйственного назначения двух областей Приволжского федерального округа, нам удалось выделить 22 изолята фагов бактерий Bacillus mesentericus. Они были изучены по основным биологическим свойствам, которыенеобходимо знать при создании биопрепарата на основе фагов для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus: морфологии негативных колоний; специфичности действия; литической активности и ее изменению при хранении; спектру литического действия.

Экспериментальным путем было установлено, что негативные колонии, образуемые 22 изолятами фагов Bacillus mesentericus, были однотипными - это прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0 — 4,0 мм в диаметре. Данная характеристика подтверждает их вирулентность, так как лизогенизированных фагов бактериальных клеток на дне фага отмечено не было.

Важнейшей характеристикой фага, входящего в состав биопрепарата для индикации и идентификации бактерий, является его специфичность в пределах вида. Изучение специфичности 22 выделенных изолятов бактериофагов Bacillus mesentericus мы проводили на культурах гомологичного рода: Bacillus subtilis — 35 штаммов, Bacillus mycoides — 15 штаммов, Bacillus megaterium — 14 штаммов, Bacillus cereus - 25 штаммов, Bacillus thuringiensis - 4 штамма Наиболее важной для нас характеристикой выделенных фагов была специфичность по отношению к штаммам Bacillus mesentericus и отсутсвие спосбности лизировать культуры Bacillus subtilis, которые по биохимическим свойствам сходи с исследумыми культурами. Эксперимент ставили, используя методику Калдыркаева (2011).

Литическую активность выделенных бактериофагов оценивали по их способности вызывать лизис бактериальной культуры на плотной питательной среде методом агаровых слоев (Гольдфарб, 1961). Для статистической обработки каждый эксперимент проводили троекратно. Эталонные культуры выращивали на мясо-пептонном бульоне в течение 18 часов. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что выделенные бактериофаги Bacillus mesentericus обладали различной активностью. Ее показатели были выявлены в диапазоне от 1,0х106±0,1х106 до 4,0х109±0,Зх109 корпускул в 1 мл фага. Наиболее высокой активностью обладали фаги Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА - 1,5х109±0,1х109 и 4,0х109±0,3х109 корпускул в 1 мл фаголизата, соответственно.

Важной характеристикой выделенных фагов является диапазон их действия на штаммы бактерий в пределах вида (Золотухин, 2007). Для изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 20 штаммов бактерий Bacillus mesentericus, выделенных нами их проб пищевого сырья и продуктов питания и 2 штамма, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры методом «стекающая капля». Экспериментальным путем установлено, что изучаемые специфичные бактериофаги имеют различный диапазон действия по отношению к 22 изучаемым штаммам Bacillus mesentericus.

Для конструирования биопрепарата нами было отобрано два фага Вш-3 и Вш-8 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совместным спектром литического действия.

Последующие эксперименты были направлены на изучение изменения литической активности укупоренных во флаконы бактериофагов Вш-3 и Вш-8 серии УГСХА, хранящихся в условиях холодильника в течение 12 месяцев. Установлено, что в течение 3 месяцев показатели литической активности исследуемых бактериофагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА оставались без изменений, 1,5х109±0,1х109 и 4,0хЮ9±0,ЗхЮ9 корпускул в 1 мл фаголизата, соответственно. Через 6 месяцев литическая активность снижалась и составила у фага Вт—3 УГСХА 4,7х108±0,2хЮ8 корпускул в 1 мл фаголизата и у Вт-8 УГСХА - 1,3х108±0,4х108, через 9 месяцев - 1,8х107±0,1х107и 0,9х108±0,2х108 корпускул в I мл фаголизата, через 12 месяцев - 0,6х107±0,3х107 и 1,1х107±0,2х107 корпускул в 1 мл фаголизата, соответственно. Опытным путем установлено, что пассирование бактериофагов на исходном штамме бактерий Bacillus mesentericus в течение 7 пассажей методом агаровых слоев восстанавливает литическую активность бактериофагов на 1 порядок.

Для изготовления биопрепарата используют штаммы фагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА и штаммы бактерий Bacillus mesentericus 2 и Bacillus mesentericus 66. Индикаторные культуры хранят на полужидком МПА (pH 7,2 - 7,4) с содержанием 0,3 % бактериологического агара при температуре 2-4 °С, которые пересевают каждые 2-3 месяца. Биопрепарат готовится на коммерческом мясо-пептонном бульоне. Опытным путем установлено, что температурным оптимумом для культивирования биопрепарата на основе фагов Вш-3 УГСХА и Вт-8 УГСХА с индикаторными культурами является температура 37 °С. Определено оптимальное соотношение бактериофага Вш —3 УГСХА и штамма Bacillus mesentericus 66 - 1:1, т.е. 0,2 мл фага на 0,2 мл индикаторной культуры, время пассажа составляет 6 часов (параметры культивирования бактериофага Вт - 8 УГСХА с культурой Bacillus mesentericus 2 аналогичны). Очистка фагов от бактериальных клеток осуществлялась методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0,22 pim GV). Разлитый во флаконы фаг контролируется на чистоту и стерильность, обязательно определяется его титр.

Биопрепарат на основе фагов представляет собой 2 флакона с прозрачной жидкостью желтоватого цвета (цвет засеянной среды) без посторонних примесей, осадка. Титр не ниже 108. Дату изготовления серии исчисляют со дня закупорки флаконов. Срок годности бактериофагов при температуре 2-4 °С 12 месяцев.

Нами изучена возможность использования индикаторных бактериофагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА для идентификации бактерий В. mesentericus. Используя строгую специфичность биопрепарата, нами был разработан экспресс-метод идентификации бактерии Bacillus mesentericus по показателям лизиса культур на плотной питательной среде («метод стекающей капли»). Подготовку и посев пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». Разработанная нами схема (рисунок 4) позволяет идентифицировать бактерии Bacillus mesentericus за 32 часа. Срок бактериологического исследования по традиционной схеме выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы (Gordon, 1973), составил 107 часов при значительных экономических затратах.

О высокой чувствительности РНФ для индикации бацилл во внешней среде сообщают многие исследователи (Русалеев, 1990, Калдыркаев, 2008; Мустафин, 2012). В первую очередь для постановки РНФ определяли концентрации бактериофагов Bacillus mesentericus, имеющих диагностическое значение. Интересные исследования были проведены И.Н. Земцовой (1965), И.П. Павловым (1971), которые применили реакцию нарастания тира фага для индикации спор сибирской язвы в искусственно зараженных пробах почвы. Используя эту методику, им удалось выявлять споры в концентрации 2x105 и больше м.к./г. почвы при совместной инкубации исследуемого материала с бактериофагом в течение 3 часов. Удлинение срока инкубации до 6-7 часов повышало чувствительность реакции: в 1 г почвы удавалось обнаружить 104 спор.

Для разработки схемы индикации бактерий использовали метод реакции нарастания титра фага по В.Я. Ганяюшкину (1988) в модификации С.Н. Золотухина (2007). Первоначально определяли параметров постановки реакции. Были проведены эксперименты на модели - искусственно контаминированном бактериями Bacillus mesentericus МПБ в концентрации от 101 до 105 м.к./мл. В качестве контроля был использован интактный МПБ. Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования, согласно оценке, предложенной В.Я. Ганюшкиным (1988). Реакция считается положительной, если количество негативных колоний фага, образовавшихся в контроле превышает количество негативных колоний фага, образовавшихся в эксперименте в 5 и более раз.

Доказано, что количество негативных колоний фага в эксперименте, более чем в 5 раз превышает количество негативных колоний фага в контроле при контаминации МПБ бактериями Bacillus mesentericus в концентрации 10 м.к./мл. Необходимо было также определить наиболее эффективный временной показатель взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров реакции нарастания титра фага (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл).

Установлено, что при 6 часовой экспозиции индикаторной культуры с фагом без дополнительного ее подращивания, удается провести индикацию бактерий Bacillus mesentericus в концентрации 102 м.к./мл МПБ. На исследование затрачивается 25 часов (0,5 часа - подготовка реакции + 6 часов - время экспозиции субстрата с фагом + 0,5 часа - постановка реакции + 18 часов - время термостатирования). Увеличение времени инкубирования до 10-24 часов не повышает чувствительность метода.

Для ускоренной индикации бактерий вида Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания без выделения чистой культуры, нами была разработана модель постановки реакции нарастания титра фага на пищевом сырье и продуктах питания, максимально подверженных контаминации вышеназванными бактериями. Использовали муку пшеничную высшего и первого сортов, персики, перец черный молотый, мясо - свинину. Подготовку и посев проб пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». Пробы растирали в фарфоровой ступке до получения гомогенной массы. Затем объекты исследований в количестве 10 г вносили в колбы с МПБ в соотношении 1:10 и искусственно контаминировали штаммами Bacillus mesentericus 66 и Bacillus mesentericus 2 в концентрации 101 -105 м.к./мл. В качестве контроля использовали колбы МПБ с пробами, неконтаминированными бактериями Bacillus mesentericus 66 и Bacillus mesentericus 2.

Доказано, что увеличение титра фагов Вт-3 и Вт-8 серии УГСХА в 5 раз у произошло при концентрации 10 м.к. бактерий Bacillus mesentericus в 1 г объектов исследований. Данная концентрация бактерий в пищевом сырье и продуктах питания считается пороговой для их отбраковки или вторичной переработки с использованием соответствующих технологий.

Проведенные нами исследования и полученные результатовы бактериологического исследования и фагоиндикации, позволяют нам подтвердить специфичность РНФ и ее высокую чувствительность. Наши данные согласуются с работами многих авторов (Молофеева, 2004; Феоктистова, 2006; Мустафин, 2012). Ковалевой (2009) была доказана возможность применение РНФ для обнаружения энтерококков в объектах санитарного надзора, которая позволяла определять в искусственно зараженных мясе, комбикормах, фекалиях животных бактерии в концентрации 103 м.к./г. Проведенное параллельно бактериологическое исследование давало отрицательные результаты.

А.Х. Мустафиным (2012) была разработана схема ускоренной индикации бактерий вида Bacillus subtilis с помощью специфических бактериофагов при постановке реакции нарастания титра фага на искусственно контаминированных о пробах продуктов питания. Чуствительность реакции составила 10 м.к./г. Как сказано выше, данная концентрация бактерий группы Bacillus mesentericus -subtilis в пищевом сырье и продутах питания считается критической и может стать причиной не только производственного брака при выпечке хлеба под названием «картофельная болезнь», но и серьезного пищевого отравления.

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА и методика фагоиндикации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания подтверждены актом производственных испытаний в ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (приложение 4), актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (приложение 3). По материалам диссертационных исследований разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Вш-3 УГСХА и Вш-8 УГСХА для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus» (приложение 2) и «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов» (приложение 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юдина, Мария Александровна, 2012 год

1. Алтон, JI.B. Развитие и выживаемость бактерий рода Bacillus в морской и речной воде / JI.B. Алтон // Гигиена и санитария. -1988. № 9. - С. 14-16.

2. Алымова, А.Ф. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа / А.Ф. Алымова, В.В. Гортинская, А.П. Кузнецова // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М.Кирова. Горький: ГТМИ, 1964.-Т.13.-С.10-12.

3. Арский, В.Г. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии / В.Г. Арский, 3.3. Ахметова, A.B. Ясенский // Здравоохранение Таджикистана. -1961. № 2. - С. 5-11.

4. Архангельская, О.Н. Изучение обсемененности образцов коммерческих салатов и винегретов / О.Н. Архангельская // Журн. микробиол. 1988. - № 10. - С. 113-114.

5. Асколонов, С.П. Пищевые заболевания, вызываемые спорообразующими бактериями Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus I С.П. Асколонов, А.И. Ильченко // Вопросы питания. -Киев: Госмедиздат УССР, 1962 -С.226-229.

6. Афанасьев, E.H. Совершенствование экспресс методов индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний / E.H. Афанасьев, И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко, и др.. Ставрополь: ВИНИТИ, 2000. -С.5.

7. Африкян, Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение / Э.К. Африкян. Ереван: Изд-во АН АрмССР, 1973.-С.418.

8. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях /И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев. М.: Медгиз,1962. -С. 180.

9. Бакулов, И. А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой болезни» / И.А. Бакулов, В.А., Гаврилов, В.В. Селивестров. — Владимир: Посад, 2007. -С.8-70.

10. Бахаровская, Е.О. Роль бактерий вида Bacillus mesentericus в контаминации объектов санитарного надзора / Е.О. Бахаровская, H.A. Феоктистова,

11. Д.А. Васильев // Аграрная наука сельскому хозяйству: материалы VI международной научно-практической конференции. -Барнаул. -2011. -С.353-355.

12. Беленева, И.А. Особенности распространения и свойства бактерий рода Bacillus, ассоциированных с гидробионтами и водой Залива Петра Великого (Японское море) / И.А. Беленева // Микробиология Т. 77. -№ 4. -2008. - С. 558-565.

13. Бургасов, П.Н. Сибиреязвенная инфекция / П.Н. Бургасов, Г.И. Рожков. -М.: Медицина. -1984. С.204-206.

14. Бурлаченко, И.В. Теоретические и прикладные аспекты повышения резистентности осетровых рыб в аквакультуре: автореф. дис. .докт. биол. наук: 03.00.10 / Бурлаченко Ирина Виленовна. -М., 2007. -С.19.

15. Василевская, И.А. Изучение каталазной и протеолитической активности различных вариантов Bacillus mesentericus / И.А. Василевкая, И.Д. Колчинская, М.Г Сергейчук., и др.. // Прикладная биохимия и микробиология. -1975. -№ 64. С.550-553.

16. Витавская, A.B. Биологическая зашита хлеба от картофельной болезни хлеба / A.B. Витавская, Г.Н. Дудикова, К.А. Тулемисова. Алмата, 1998. - С. 430432.

17. Воронцова, A.A. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании / A.A. Воронцова // Кишечные инфекции: тезисы докладов на межинституциональной конференции. М.,1961. - С. 127-128.

18. Вуд, У. Брожение углеводов и родственных соединений / У. Вуд // Метаболизм бактерий. — М.: Изд-во иностр. лит., 1963. С. 92-96.

19. Габрилович, И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences / И.М. Габрилович // ЖМЭИ. 1992. - №6. - С.10-12.

20. Габрилович, И.М. Лизогения / И.М. Габрилович // Минск, 1970. С.68-89.

21. Габрилович, И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. Минск, 1973, С.5 24.

22. Гавенский, С.Д. Современные методы диагностики особо опасных инфекций и способы их применения / С.Д. Гавенский, В.И. Еременко, И.М. Климова, и др.. Саратов, 1991. - С. 213-219.

23. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение: автореф. дис. .докт. биол. наук: 16.00.03/ Ганюшкин Виктор Яковлевич. М., 1984. - С. 13-34.

24. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии / В.Я. Ганюшкин. Ульяновск: УГСХА, 1988. - С.42-45.

25. Ганюшкин, В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика / В.Я. Ганюшкин // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск: УГСХА, 1990. — С.20-28.

26. Ганюшкин, В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят / В.Я. Ганюшкин // Ветеринария. 1967. - № 3. - С. 69-71.

27. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия // Д.М. Гольдфарб. М.: Медгиз,1961. -С. 169-187.

28. Гольдфарб, Д.М. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага / Д.М. Гольдфарб, З.С. Островская // ЖМЭИ. 1957. - №5. - С. 15-17

29. Гольдфарб, Д.М. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии / Д.М. Гольдфарб, В.Н. Кузнецова // ЖМЭИ. 1957. - № 8. -С. 90-94.

30. ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов. М.: Госстандарт СССР, 1985. - С.4-6.

31. ГОСТ Р 51448-99 Мясо и мясные продукты. Методы подготовки проб для микробиологических исследований. М.: Госстандарт России, 1999. - С.6-7.

32. ГОСТ Р 51426-99 Микробиология. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований. М.: Госстандарт России, 1999. - С.6.

33. Гуторова, Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки / Л.Д. Гуторова // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - С. 53-55.

34. Динчева, E.H. Микробиологическое изучение мясного фарша / E.H. Динчева //Научные труды высшего ветеринарно-медицинского института. — 1970. Т.22. -С.139-146.

35. Домарадский, И.В. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага / И.В. Домарадский, О.Н. Мосолова, Л.К. Денисенко. -Иркутск: Науч. изд-во, 1957. С.44-51.

36. Ершов, Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ / Ф.И. Ершов // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М.: Медгиз, 1959. - С. 188.

37. Ефременко, В.И. Способ индикации микроорганизмов / В.И. Ефременко И.С. Тюменцева, Е.Б. Жилченко, Т.В. Марковаи др.// Патент РФ № 2165081.

38. Жвирблянская, А.Ю. Микробиология в пищевой промышленности / А.Ю. Жвирблянская, О.А Бакушинская. -М.: Пищевая промышленность, 1966. С. 134.

39. Затула, Д.Г. Влияние метаболитов споровых сапрофитных бактерий на организм человека и животных / Д.Г. Затула, С.Р. Резник. Киев: Изд. «Наукова Думка», 1973. - С.75-98.

40. Золотухин, С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят: автореф. дис. .канд. ветеринарных наук: 16.00.03 / Золотухин Сергей Николаевич. М, 1994. - С.13.

41. Золотухин, С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных / С.Н. Золотухин. Ульяновск: Копиринг, 2004. - С.29-37.

42. Золотухин, С.Н. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями / С.Н. Золотухин, JI.C. Каврук, Д.А. Васильев. Ульяновск: Копиринг, 2005. - С.20-25.

43. Зуев, В.А. Литическая активность бактериальных вирусов /В.А. Зуев. М.: Медицина, 1965. -С. 184.

44. Иллютович, А.Ю. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов / А.Ю. Иллютович, З.С. Петрова, Е.Е. Голубева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1958.-№ 6. -С.78.

45. Ипатенко, Н.Г. Сибирская язва сельскохозяйственных животных. / Н.Г. Ипатенко, В.А. Седов. Покров: ВНИИВВиМ, 1987. - С.256.

46. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир, 2012. - С. 365-369.

47. Кац-Чернохвостова, Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение / Л .Я. Кац-Чернохвостова // ЖМЭИ. 1947. - № 8. - С.312-315.

48. Коломникова, Я. П. Технологические приемы по предупреждению заболеваний хлебобулочных изделий / Я. П. Коломникова // Хлебопродукты. — 2009.-№3.-С.51-53.

49. Колядицкая, Л.С. Некоторые особенности морфологии «Taches vierges» дизентерийного бактериофага / Л.С. Колядицкая // ЖМЭИ. 1947. - №1. -С. 81.

50. Коритняк, Б.М. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yersinia enterocolitis и их применение в диагностике: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 / Коритняк Богдан Михайлович. Саратов, 2005.-С.12.

51. Красильников, H.A. Жизнь растений / H.A. Красильников, A.A. Уранов. — М.: Просвещение, 1974. С. 352.

52. Красильников, H.A. Микроорганизмы почвы и высшие растения H.A. Красильников. М.: Изд-во АН СССР, 1958. - С. 461.

53. Красильников, H.A. Определитель бактерий и актиномицетов / H.A. Красильников. М.: Изд-во АН СССР, 1949. - С. 54.

54. Крылова, М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий / М.Д. Крылова // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен 50-летию

55. Тбилисского НИИВС. Тбилиси, 1974. - С. 276-280.

56. Крылова, М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий / М.Д. Крылова // Бактериофагия. М.: Наука, 1961. - С.220.

57. Крылова, М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis / М.Д. Крылова // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16-22.

58. Крылова, М.Д. Фаготипирование бактерий / М.Д. Крылова. — М.: Мед-гиз, 1963.-с. 199.

59. Крючков, А.Г. Основные принципы и методология агроэкологического районирования зерновых культур в степи Южного Урала / А.Г. Крючков // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. — 2006. С. 704.

60. Кузнецова, В.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды / В.Н. Кузнецова, М.И. Хазанов, Т.Н. Ремова // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С.59.

61. Курилова, А.А. Питательная среда (жидкая) для культивирования сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов / А.А. Курилова, JI.C. Катунина, О.В. Малецкая, O.JI. и др. //ПатентРФ2288950.

62. Лабинская, А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологического исследования / А.С. Лабинская, Л.П. Ещина. М.: Медицина, 2004. - С. 34-37.

63. Левина, Е.Н. Люминесцирующие антитела (в изучении патогенных микроорганизмов). / Е.Н. Левина, Р.Б. Гольдин, Ф.С. Носков М.: Мир, 1972. - С. 144.

64. Лурия, С. Общая вирусология / С. Лурия, Д. Дарнелл. М., Мир, 1970. С.36-47.

65. Львов, А. Природа размножения фага / А Львов. М.: Мир,1956. - С.187.

66. Малофеева, Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli 0157 и их применение в диагностике: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 / Малофеева Надежда Ивановна. Саратов, 2004.-С. 20.

67. Манина, Е.Г. Антигенные особенности клеток четырех вариантов Bacillus brevis var. /Е.Г. Манина, И.Н. Полякова, E.B. Езепчук /^Микробиология. 1975. - № 6.-С. 1086-1089.

68. Мац, Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии / Л.И. Мац.- М.: Медицина,1965. С.44-59.

69. Миляева, E.H. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью РНФ бактериофага / E.H. Миляева // ЖМЭИ. -1958. -№12. -С. 33-34.

70. Мирзоева, В.А. Бактерия группы сенной и картофельной палочек. / В.А. Мирзоева. М.: Изд-во АН СССР, 1959. - С.176.

71. Мишустин, E.H. Почвенные типы и их микробное население / E.H. Мишустин // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. — 1974.- № 4. С. 73-86.

72. Нурызгалиев, С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями / С.Н. Нурызгалиев // Материалы 10 научной сессии Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата: Изд-во гос. мед. ин-та, 1978. - С. 55-57.

73. Омельченко, В.Д. Зерна, поврежденные и испорченные микроорганизмами и самосогреванием как критерий санитарно-гигиенического состояния пшеницы и кукурузы: автореф. дис. .канд. техн. наук: 03.00.04 / Омельченко Виктор Данилович. М., 1992. — С. 19.

74. Островская, З.С. Диагностика брюшного тифа у больных с помощью РНФ / З.С. Островская // Аннотация научной работы академии медицинских наук СССР.-1956.-С.57-59.

75. Очирова, JI.A. Микробиологическая оценка безопасности пищевых продуктов: автореф. дис. .канд. техн. наук: 16.00.03 / Очирова Луиза Андреевна. -Барнаул, 2008. С. 12.

76. Павлова, И.П. Вопросы эффективности противосибиреязвенных мероприятий / И.П. Павлова, К.Н. Полянская // Матер. IX пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. М., 1974. - С. 131-132.

77. Павлова, И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. cereus / И.П. Павлова // ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

78. Пельц, О.В. Гигиеническая оценка контаминации муки возбудителями картофельной болезни / О.В. Пельц, Е.Я. Долгушина, H.H. Аксенова, и др. //Медицина в Кузбассе, спецвыпуск. 2003, №5. С.74-75.

79. Петрова, JI.H. Дифференциране на культури от род Bacillus изолирани от местних полуконсервов / Л.Н. Петрова // Ветеринарно-медицинские науки. 1975. — X2 8.-C.12.

80. Пивоваров, Ю.А. Распространение Bacillus cereus во внешней среде / Ю.А. Пивоваров, P.C. Волкова, В.В. Шелакова // Актуальные вопросы гигиены. -Москва, 1970. С.98-103.

81. Погодаева, А.Я. Микрофлора, вызывающая порчу консервированных компотов и фруктово-ягодных соков из местного сырья / А .Я. Погодаева, Ч.Я. Овруцкая // Физиология и биохимия микробов. Минск. Наука и техника, 1970. — С.116-120.

82. Полховский, В.А. Биохимические типы Bacillus cereus, выделенных из различных природных источников / В.А. Полховский // Журн. микробиол. 1970. — № 2. - С.82-86.

83. Полховский, В.А. Нуклеотидный состав ДНК аэробных спорообразующих бактерий: в кн.: Вопросы инфекционной и неинфекционной патологии / В.А. Полховский. Ташкент: Ташк. книж. изд-во, 1975. - С.183-185.

84. Полховский, В.А. Реакция агглютинации как метод серологической дифференциации Bacillus cereus II В.А. Полховский // Докл. АН БССР. 1967. - № 5. -С.436-438.

85. Поляк, М.С. Питательные среды для медицинской микробиологии / М.С. Поляк, В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. Санкт-Петербург, ГИОРД, 2003. - С.56.

86. Пульчеровская, Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: автореф. дис. .канд. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 / Пульчеровская Лидия Петровна. Саратов, 2004.-С. 21.

87. Пучкова, Л.И. Технология хлеба / Л.И. Пучкова, Р.Д. Поландова, И.В. Матвеева. СПб. ГИОРД, 2005. - С.65.

88. Раднаева, Р.Б. Разработка бактериального концентрата на основе пробиотических микроорганизмов для хлебопекарного производства: автореф. дис. .канд. биол. наук: 05.18.04 / Раднаева Раджана Баирована. — Улан-Удэ, 2008. — С. 67.

89. Рапопорт, Л.Г. Опыт характеристики дизентерийного бактериофага / Л.Г. Рапопорт. Сталинабад, 1947. - С. 65.

90. Раутенштейн, Я.И. Изменчивость Bacillus mycoides. Морфология вариантов/ Я.И. Раутенштейн // Микробиология. 1977. - №1 (16). - СЗЗ-41.

91. Ревенко, И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике / И.П. Ревенко. Киев: Урожай, 1978. - С. 41-88.

92. Ревенко, И.П. К диагностике рожи свиней / И.П. Ревенко // Ветеринария. 1970. — № 6. — С. 13.

93. Резник, С.Р. Дополнительный подход к дифференциации споровых бактерий Вас. subtilis и Вас. cereus / С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова, А.Ф. Качан // Микробиол. журн. 1978. - № 4. - С.448-453.

94. Русалеев, B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий / B.C. Русалеев // Ветеринария. 1990. - №8. - С.29-30.

95. Русалеев, B.C. Фагочувствительность консервированных культур Bacillus anthracis / B.C. Русалеев II Ветеринария. 1990. - №9. - С. 39.

96. Сбойчаков, В.Б. Санитарная микробиология / В.Б. Сбойчаков. М.: Изд. группа «ГЭОТАР-Медиа», 2007. - С. 98.

97. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов: справочник / М.А. Сидоров. М.: Колос, 1995. - С. 104-112.

98. Ситник, И.О. Микробиология, вирусология, иммунология / И.О. Ситник, С.И. Климнюк, М.С. Творко. Тернополь: Укрмедкнига, 1998. - С.354-358, 360-363.

99. Скокан, Л.Е. Микробиология основных видов сырья и полуфабрикатов в производстве кондитерских изделий / Скокан JI.E., Жарикова Г.Г. М.: ДеЛи Принт, 2006. - С.89-94.

100. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. -Киев: Наукова Думка, 1982. - С.117-120.

101. Смирнов, В.В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова. Киев: Наукова думка, 1983. - С. 51.

102. Стефанов, С.Б. Строение некоторых бактериофагов культур группы Вас. cereus-thuringiensis / С.Б. Стефанов, Я. И. Раутенштейн, Л.С. Хачатрян // Микробиология. 1968. - № 35. - С.106-114

103. Тимаков, В.Д. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // Вестник АМН СССР. 1958. - № 2. - С. 37.

104. Тимаков, В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб. М., Наука, 1962. - С.65-71.

105. Тимаков, В.Д. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С.3-7.

106. Тихоненко, A.C. Ультраструктура вирусов бактерий / A.C. Тихоненко // М. Наука,1968.-С.89-168.

107. Топчий, М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят. Минск, 1979. - С.21.

108. Тюлембаев, М.А. Стабилизация литической активности холерных типирующих монофагов 1-7 методом сублимации /М.А. Тюлембаев, В.Ф. Разумнова // материалы науч. практ. конф., посвящ. образованию противочум. службы России. Саратов, 1997. - Т.2. - С.277.

109. Феоктистова, Н.А Литическая активность бактериофагов Bacillus cereus / H.A. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев // Молодежь и наука XXI века: материалы III международной научно-практической конференции молодых ученых. —

110. Ульяновск, 2010. Т.З. - С.70-72.

111. Хейс, У. Генетика бактерий и бактериофагов / Хейс У. М.: Мир, 1965. -С.288-294.

112. Шестаков, А.Г. Схема выделения и идентификации бактерий Pseudomonas aeruginosa / А.Г. Шестаков, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Естественные и технические науки. 2009. - №6(44). - С. 118-120.

113. Щеглова, М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага / М.К. Щеглова // ЖМЭИ. 1962. - № 1. - С.99-102.

114. Юсупова, Г.Г. Обеспечение микробиологической безопасности зерновых культур в технологиях производства муки и хлебобулочных изделий: автореф. дис. . .докт. с/х. наук: 05.18.01/ Юсупова Галина Георгиевна. Красноярск, 2010. - С. 19.

115. Ackermann, H.W. Bacteriophage jbserwations and evolution / H.W. Ackermann // Res microbial. 2003. - P.245-251.

116. Ackermann, H.W. Classification jf Bacteriophages / H.W. Ackermann, R. Calendar // Oxford University Press. 2005. - P. 134.

117. Ahmed, R. Bacillus cereus Phage Typing as an Epidemiological Tool in Outbreaks of Food Poisoning / R. Ahmed, P. Sankar-mistry, S. Jackson, H. Ackermann and

118. S. Kasatiya // Journal, of clinical, microbiology. 1995. - V. 3. - P.636-640.

119. Ammini, P. Biochemical and molecular characterization of Bacillus pumilus isolated from coastal environment in Cochin, India // P. Ammini, K. Kiran, J. Jiya, J. Neetha, N. Santha // Braz. J. Microbiol. 2009. - № 40 - P.269-275.

120. Baijac, H. Interet de certains criteres biochemiques supplémentaires pour la classification des souches de Bacillus / H. Baijac // Ann. Microbiol. — 1975. — V. 126. — P.83-95.

121. Baijac, H. Mise au point sur la classification des Bacillus thuringiensis / H. Baijac // Entomophaga. 1973. - V.18. - P.5-17.

122. Bergey's manual of determinative bacteriology. 9 ed. - Baltimore: Williams and Wilkins Co., 1993. - P.1258.

123. Beyer, W. Polymerase chain reaction-ELISA to detect Bacillus anthracis from soil samples-limitations of present published primers /W, Beyer, S. Pocivalsek, R. BöhmII J. Appl. Microbio.l. 1999. -V. 87. - P. 229-236.

124. Boeye, A. Numerical taxonomy of Bacillus isolates from North Sea sediments / A. Boeya // Int. J. Syst. Bacteriol. 1976. - V.26. - P.427-441.

125. Bonde, G. The genus Bacillus. An experiment with cluster analysis / G. Bonde // Dan. Med. Bull. 1975. - V.22. - P.41-61.

126. Breitbart, M. Genomic analysis of uncultured marine viral communities / M Breitbart., P. Salamon, B. Andresen//Pros. Natl. Acad. Sei. 2002. - P. 14250-14255.

127. Brison, F. Les queiques Bacillus isoles en nur Mediterranee / F. Brison // Rev. cytol. ei. biolveg. Bol. 1978. - V.l. - P.405-412.

128. Brown, E. Specific identification of Bacillus / E. Brown // J.Bact. 1955. -V.69. - P.590-602.

129. Brown, E. Specific identification of Bacillus anthracis by mean of a variant bacteriophage / E. Brown // J. infect. Dis. 1955. - V.96. - P.34-39.

130. Candel, A. Sensitivity to lytic agents and DNA base composition of several aerobic spore-bearing bacilli / A. Candel // Zbl. Bacteriol. Parasitenk., Infektionskrankh. und Hyg., Abt. 1978. - V.133. P.250-260.

131. Clark, R. Speculations on the incidence of anthrax in bovines / R. Clark // J.S. Afr. vet. med. Assoc. 1938. - V.9. - P.5-12.

132. Costlow, R. Studies on the lysis and formation of protoplasts / R. Costlow // Bact.proc.-1961.-P.83.

133. Cotter, P.A. Bordetella. Principles of Bacterial Pathogenesis / P.A. Cotter, J.F. Miller// Academic Press, San Diego. 2001. - P. 619-674.

134. Delia, S. Bacillus in carni fresche ed insaccate / S. Delia // Ann. ig.: Med prev comunita. 1989. - №6. - P. 1459-1464.

135. Denis, F. Les Bacillus de s milieu marin: Etude de 120 souches / F.Denis // C.R.Soc.biol. 1971. - № 12. - P. 2404-2408.

136. Dominici, S. Identificazion rapida del B. cereus mediante immunofluoreszenza / S. Dominici // Atti. Soc. ital. sei. vet. 1972. - V.25. - P.418-421.

137. Durand, M. Nutrition carbonee et etude taxonomique de Bacillus subtilis et. B. licheniformis / M. Durand // Can. J. Microbiol. 1979. - V.24. - P.491-498.

138. Fais, S. Lymphocyte activation by Bacillus subtilis spores / S. Fais // Boll. 1st. Sieroter. Milan. 1987. - № 5. - P. 391-394.

139. Fildes, P. Function of tryptophan in the adsorption of bacteriofage /P. Fildes, D. Kay// Brit. J. Exp. Path. 1959. - V.40. - P.71-79.

140. Genov, N. Conformational Studies on alkaline protease From Bacillus mesentericus / N. Genov, G. Jori // Article first published online. 2009. - № 12. - P. 13993011.

141. Gibson, T. Genus Basilius «Bergeyis manual of determinative bacteriology» / T. Gibson // Baltimore. 1974. - P.529-550.

142. Gordon, R. The genus Bacillus / R. Gordon // In Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio). 1973. - V.l. - P.71-88.

143. Hooper, P.T. Mycoplasma polyarthritis in a cat with probable severe immune deficiency / P.T. Hooper, L.A. Ireland, A.H. Carter // Vet. J. №1. 1985. - №62. - P.352.

144. Isenberg, H.D. Clinical microbiology procedures handbook / H. D. Isenberg // American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1992. - №5. — P.89.

145. Kaneko, T. Deoxyribonucleic acid relatedness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis /T. Kaneko, R. Mozaki, K. Aizawa // Microbiol. Immunol. 1978. - Vol. 22. - P. 639-641.

146. Katsaras, K. Untersuchungen über saurelosliche Antigene an verschiedenen Stammen der Gattung Bacillus / K. Katsaras // Berlin und München, tierartzl. Wochenschr. -1979. V.92. — P.243-247.

147. Katzheson, H. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonsration of internalug borne bacterial infections of seed H. / Katzheson // J. Bact. 1951. - №1. - P.689.

148. Klein E. Pathogenic Microbes in Milk / E. Klein // Mikrobiol. )K. 1977. -V. 39. - P. 286.

149. Koltukova, N.V. Various physico-chemical properties of the amylolytic complex from Bacillus mesentericus / N.V. Koltukova, A.A. Bondarchuk, E.A. Kovalenko,

150. E.I. Get'man // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1990. - № 26. - P. 50.

151. Kundrat, W. Zur Differenzierung aerober sporenbildner (Genus Bacillus Cohn) / W. Kundrat // Zbl. Veterinarmed. 1963. - V.10. - P.418-426.

152. Lemille, F. Essai sur la classification biochimique de 97 Bacillus du groupe I /

153. F. Lemille // Ann. Inst. Past. 1969. - V.l 16. - P.808-819.

154. Levintal, C. Structural developmet of a bacteriae virus / C. Levintal // Biochim. Biophys. Acta. -1952. № 4. - P.419.

155. Long, G.W., O'Brien T. Antibody based system for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples // Abstract. Book. 3-rd International Conference on Anthrax Plymouth, England. -1998. № 7. - P.7.

156. Lwoff, A. Induction par des substances reductrices de la production de bacteriophages chez une bacteria lysogene / A. Lwoff, L.Siminovitch // C. R. Acad. Sei. -1951.-№ 232.-P.l 146.

157. Lwoff, A. Rechercher sur un Bacillus megaterium lysogene / A. Lwoff, A. Gutmann // Ann. Inst. Pasteur. 1950. - № 78. - P.711.

158. Malkov, S.V. Capacity of Bacillus mesentericus for certain kinds of genetic exchange / S.V. Malkov, A.A. Prozorov // Genetika. 1983. - № 19. - P. 1091.

159. Mastroeni, P. Immunoelectrophoretic analysis of surface antigens in vegetative cells and spores of Bacillus cereus / P. Mastroeni // G. bacteriol. virol. et immunol. 1974. -V.67.-P.180-184.

160. Mc Clou, E.W. Studies on a lysogenic Bacillus strain. A bacteriophage specific for Bacillus antracis /E.W. Mc Clou //J.Hyg. Camb. 1951. - V.49. - P.114-125.

161. Mendez, J. Conservation of phage reference materials and water samples contaning bacteriophages jf enteric bacteria./ J. Mendez ,J Jofre ,F Contreras et al// J. Virol. Methods. 2002. -P.215-224.

162. Mercier, P. Bactériologie du sperme frais de larin: Etude préliminaire / P. Mercier // Prod. anim. 1990. - №3. - P.215-221.

163. Miller, J. An Antibiotic from Bacillus mesentericus / J. Miller, D. Rowley // Br. J. Exp. Pathol. 1948. - V.5. - P.452-457.

164. Perlac, F.I. Converting Bacteriophage for sporulacion and cristel formacion in Bacillus thuringiensis /F.I. Perlac, C.L. Mendelson, C.B. Thome // J. Bact. 1979. -V. 140.-P. 699-706.

165. Sechter, I. Metodika de cercetare a prezentei bacilului tifis in materufacale ajutorole bacterofagului / I. Sechter // V. Academje RPSH Filialr Vasi Studii si cercetari Stintifie. Ann. 1962. - V.4. - P.99.

166. Seo, G. A new factor from Bacillus mesentericus which promotes the growth of Bifidobacterium / G. Seo, Y. Akimoto, H. Hamashima, K. Masuda, K. Shiojima, C. Sakuma, M. Sasatsu, T. Arai //Microbios. 2000. - № 101. - P. 105.

167. Stoeva, S. Proteolytic specificity of the neutral zinc proteinase from Bacillus mesentericus strain 76 determined by digestion of an alpha-globin chain / S. Stoeva, T. Kleinschmidt // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1989. -№ 10. - P. 1139-1143.

168. Stoeva, S. Modification of a zinc proteinase from Bacillus mesentericus strain 76 by diethylpyrocarbonate / S. Stoeva // Int. J. Pept. Protein. Res. 1991. - № 37.-P.325.

169. Stoeva, S. Primary structure of a zinc protease from Bacillus mesentericus strain 76 / S. Stoeva, T. Kleinschmidt, B. Mesrob, G. Braunitzer // Biochemistry. -1990. -№ 29. P.527-534.

170. Suttle, C.A. Use jf ultrafiltration to isolate viruse from seawater which are pathogens of marine phytoplankton / C.A. Suttle, A. M. Chan // Appl. Environ Microbiol. 1991. - P.721-726.

171. Tetart, F. Phylogeny of the major head tail genes of the wide-ranging / F Tetart, C. Desplats, M. Kutateladze et al // J. Bacterid. 2001. - P.358-366.