Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Бульканова, Елена Анатольевна

• Бульканова, Елена Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бульканова, Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика бактерий рода Klebsiella.

1.2. Патогенность.

1.3. Резервуар и распространение инфекции.

1.4. Устойчивость к физико-химическим факторам.

1.5. Лабораторная идентификация клебсиелл.

1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике.

1.6.1. Взаимодействие бактериофагов с клеткой-хозяином.

1.6.2. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование.

1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ).

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Материалы.

2.1.2. Методы.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала.

2.2.2. Поиск бактериофагов клебсиелл и селекция клонов фагов.

2.2.3. Характеристика фагов бактерий рода Klebsiella.

2.3. Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных фагов клебсиелл.

2.4. Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella.

2.5. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага.

2.5.1. Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение.

2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

2.5.3. Разработка схемы постановки РНФ для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора.

2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Klebsiella с помощью РНФ.

2.5.3.5. Исследование фекалий больных диареей телят на присутствие бактерий Klebsiella spp. с использованием РНФ.

2.6. Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата»

Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяют диагностике мало изученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции. Представители рода Klebsiella широко распространены в природе, а подвид pneumoniae является нормальной микрофлорой респираторного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные варианты, способные вызывать у животных и людей самостоятельные заболевания. Клебсиеллы известны как возбудители пневмонии, заболеваний мочеполовой системы, острых кишечных инфекции, различных гнойно-септических осложнений, а также внутрибольничных инфекций, менингитов. Заболевания, вызываемые клебсиеллами, протекающие по типу острого сепсиса, предложено рассматривать как самостоятельную нозологическую единицу - клебсиеллез (Ковалева, Рейзис, 1993; Киселева, Красноголовец, 1996; Покровский, 1985; 1999). Известно так же, что К. pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, сеп-тицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин, Дервишов, Ставцева, 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов, 2003; Золотухин, 2004; 2005).

Выделение и идентификация клебсиелл в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Klebsiella. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из-за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов пока недоступны для большинства лабораторий. В связи с вышеизложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella.

Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Габрилович, 1981; 1983; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Золотухин, 2005; Натидзе с соавт., 2005) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов. Метод фагодиагностики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.

Выделением и изучением бактериофагов рода Klebsiella занимались исследователи разных научных школ (Przondo-Hessek, 1966; Slopek et. al., 1967; 1978; Габрилович с соавт., 1970; 1973; 1981; 1983; Gaston et. al., 1987; Pieroni et. al., 1994; Джапаридзе с соавт., 2005). Однако в арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют клебсиеллезные бактериофаги. Поэтому получение специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Klebsiella, выделенных из объектов ветеринарного надзора, с целью диагностики, является актуальным.

Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий рода Klebsiella в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Klebsiella.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул) выделенных бактериофагов.

4. Сконструировать на основе индикаторных бактериофагов новый биопрепарат - диагностикум.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагоидентификации и фагоиндикации бактерий рода Klebsiella.

6. Разработать схему идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью бактериофагов.

7. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Научная новизна:

Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Klebsiella, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов.

Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Впервые разработаны биотехнологические параметры для фагоидентификации и фагоиндикации клебсиелл в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, используемые для приготовления диагностического биопрепарата.

Два штамма бактериофагов депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и признаны перспективными для приготовления диагностического препарата.

Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА», одобренная Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006 года.

По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробак-терий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технологические параметры выделения бактериофагов бактерий рода Klebsiella.

2. Выделенные фаги имели высокую литическую активность, два бактериофага К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА обладали широким диапазоном литической активности, специфичностью к бактериям рода Klebsiella.

3. Доказана эффективность сконструированного фагового биопрепарата.

4. Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического фагового препарата.

5. Схема идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

6. Схема ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы народного хозяйства» (8-9 апреля 2004 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых Приволжского федерального округа «Молодые ученые в решении региональных проблем АПК» (22 - 23 сентября 2004 года Самарская ГСХА, Самара); Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (26 - 28 апреля 2005 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (21 - 23 марта 2006 года, Ульяновская ГСХА, Ульяновск); Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (21 - 23 июня 2006 года, Ульяновск).

Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН (26.06.2006 г.), на межкафедральном совещании сотрудников кафедр факультета фетеринарной медицины (15.03.2006 г.).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов К - 10 УГС-ХА, К - 81 УГСХА и индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний:

- в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006 г.);

- во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (от 21.02.2006 г.);

- в условиях производства, проведенных на базе Чердаклинской районной лаборатории (10.12.2005 г.).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии в соответствии с комплексным планом научной работы «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных» при творческом сотрудничестве с ВНИИВСГЭ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников (193 источника, в том числе 50 зарубежных авторов) и приложения. Работа изложена на 162 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, 29 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Бульканова, Елена Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. В объектах ветеринарного надзора и патологическом материале бактерии рода Klebsiella обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. Изолированно и идентифицированно 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов К pneumoniae и 2 штамма К. oxytoca.

2. Из объектов внешней среды был выделен и селекционирован 21 изолят бактериофагов активных в отношении бактерий рода Klebsiella.

3. Выделенные фаги имели литическую активность от 10~5 до 10'8 (по Ап

7 9 пельману) и от 4x10 до 8x10 фаговых корпускул в 1 мл (по Грация). Изученные фаги характеризовались разным диапазоном литической активности. Установлено, что два бактериофага отличались широким диапазоном литической активности: К - 10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги лизировали 97 % всех исследованных культур. Установлено отсутствие активности селекционированных фагов к представителям бактерий других родов и семейств, то есть фаги специфичны к бактериям рода Klebsiella.

4. Показана устойчивость фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА к воздействию высокой температуры. Температурный диапазон составил 67 - 88 °С. Установлена устойчивость названных фагов к воздействию хлороформа в течение 40 минут.

5. В соответствии с морфологическими параметрами бактериофаг К - 10 УГСХА относится к семейству Siphoviridae, к IV группе по классификации А.С. Тихоненко (1968), а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе.

6. Разработанные биотехнологические параметры изготовления и контроля клебсиеллезных бактериофагов позволяют получить специфический диагностический препарат с высокой литической активностью, состоящий из двух штаммов фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА.

7. Разработанная схема выделения и фагоидентификации клебсиелл с помощью фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА, позволяет выделить и идентифицировать бактерии рода Klebsiella за 48 часов.

8. Разработанные технологические параметры ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале с помощью РНФ с использованием индикаторных бактериофагов (К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА), позволяют обнаружить бактерий рода Klebsiella в концентрации 103-104 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18 -22 часа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены два штамма фагов К -10 УГСХА и К - 81 УГСХА активных по отношению к представителям бактерий рода Klebsiella, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности. Фаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага К - 10 УГСХА - Phagum Klebsiella 10 УГСХА - ДЕП от 21.02.2006 № 263-5/19, К - 81 УГСХА - Phagum Klebsiella 81 УГСХА - ДЕП от 21.02.2006 № 263-6/19), признаны перспективными и используются для изготавления диагностических препаратов.

2. Индикацию и идентификацию бактерий рода Klebsiella, предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энте-робактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Временной инструкции по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К -81 УГСХА», одобренной Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденной ректором академии 17.01.2006 года.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы все большее значение в ветеринарной практике приобретают заболевания, вызванные бактериями рода Klebsiella. Известно, что К pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, сеп-тицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин с соавт., 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов 2003; Золотухин с соавт., 2004; 2005).

Исследователи, занимающиеся лабораторной диагностикой, отмечают значительные трудности при обнаружении и идентификации клебсиелл бактериологическим методом. Идентификация бактерий рода Klebsiella бактериологическим методом, основана на изучении биохимических свойств данных микроорганизмов. Трудоемкость и длительность изучения ферментативных свойств не позволяет быстро и точно идентифицировать представителей рода Klebsiella.

Используя существующие схемы бактериологического выделения представителей рода Klebsiella, отмечали некоторые недостатки. Схема В.И. Покровского, O.K. Поздеева (1999) из-за трудоемкости и необходимости использования большого набора тестов, усложняла идентификацию. Недостаток использования методических рекомендаций по диагностике смешанной кишечной инфекции для выделения бактерий рода Klebsiella заключался в наборе тестов, который не позволяет дифференцировать выделенные культуры до вида, даже при большом сроке исследования (4 до 7 суток).

Для снижения трудоемкости бактериологического метода идентификацию бактерий проводили по следующим тестам: образование сероводорода (-), расщепление мочевины (+/-), определение подвижности (-), усвоение цитрата Симонса (+), реакция с метиленовым красным (-/+), Фогеса-Проскауэра (+/-). Указанные тесты позволяли нам дифференцировать клебсиеллы от других родов семейства Enterobacteriaceae. При получении соответствующих результатов продолжали изучение ферментативных свойств на средах с углеводами: глюкозой (+), лактозой (+), мальтозой (-), малонатом (+/-), ставили тесты на образование индола (-/+), утилизации ацетата (+/-) и ферментации сорбита (+).

В лабораторной практике некоторых заболеваний метод фагодиагностики показал высокую эффективность при индикации и идентификации возбудителей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1984; Русалеев, 1990; Кольпикова, Ба-кулов, Котляров, 1990, 1992; Натидзес соавт., 2005, Золотухин с соавт., 2005).

Исходя из выше перечисленного, целью наших исследований была разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Клебсиеллы были обнаружены в 8 из 18 хозяйств Ульяновской, Самарской областей и республики Татарстан, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. В результате проведенных исследований из патологического материала и объектов ветеринарного надзора, нами изолированно и идентифицированно 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов К. pneumoniae и 2 штамма К. oxytoca.

Для достижения поставленной цели из сточных вод свиноводческих и мо-лочно-товарных ферм разных хозяйств Ульяновской области, сточных вод Ульяновского мясокомбината нами был выделен и селекционирован 21 штамм бактериофагов Klebsiella. У выделенных фагов были изучены основные биологические свойства: 1) морфология негативных колоний; 2) литическая активность; 3) спектр литической активности; 4) специфичность действия; 5) температурная устойчивость; 6) чувствительность к хлороформу; 7) морфология фаговых корпускул.

Изученные фаги с разной морфологией негативных колоний были разделены на два типа. К первому типу относятся круглые, прозрачные в центре негативные колонии диаметром от 2 мм и более с зоной неполного лизиса

1-8 мм. Колонии второго типа круглые, прозрачные с ровными краями в диаметре до 2,5 мм с отсутствием зоны неполного лизиса.

Литическую активность бактериофагов оценивали по методу Аппельману она составила от 10"5 до 10"8 и от 4 х 107 до 8 х 109 фаговых корпускул в 1 мл по методу Грациа. В результате изученния спектра литической активности в отношении 28 (5 референс-пггаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella фаги характеризовались разным диапазоном литической активности.

Для дальнейшего изучения отобрали два бактериофага с наибольшим диапазоном по отношению к изучаемым культурам - фаг К - 81 УГСХА, который лизировал 75 % и фаг К - 10 УГСХА - 71 % штаммов бактерий рода Klebsiella. Отобранные бактериофаги исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл из коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов. В результате было установлено что, фаг К -10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги проявили литическое действие в отношении 97 % всех исследованных культур. В исследованиях на специфичность фаги оказались неактивны по отношению к представителям бактерий других родов семейства Enterobacteriaceae и семейств.

Селекционированные нами фаги К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА были термостабильны и не понижали свою физиологическую активность до 63 °С в течение 30 минут

Обработка бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА хлороформом, выявила выраженную устойчивость к воздействию данного агента в течение 40 минут. Полученные результаты учитывались при стерилизации фаголизата от бактерий.

По результатам изучения морфологии фаговых корпускул установили, что изученные фаги были различны по морфологическим параметрам. Бактериофаг К - 10 УГСХА согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов (Murphy с соавт., 1995) относится к семейству Siphoviridae, по классификации А.С. Тихоненко (1968) к IV группе - «Фаги с длинным несокращающимся отростком», а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе - «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

По литературным данным фаги, применяемые для индикации и идентификации должны соответствовать определенным биологическим свойствам, обладать широким диапазоном литического действия, высокой активностью и выраженной специфичностью, более высоким порогом термоинактивации, чем у бактерий (Тимаков, Гольдфарб, 1960; Ревенко, 1978). Результаты наших исследований соответствуют литературным данным. Бактериофаги К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА являются строго специфичными в отношении бактерий рода Klebsiella, с широким совместным диапазоном литического действия - 97 %, с высокой литической активностью от 2 х 109 до 4 х 109 фаговых корпускул в 1 мл, термостабильны и устойчивы к

Полученные результаты изученных биологических свойств двух фагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА позволили нам использовать их для изготавле-ния диагностических препаратов.

При разработке технологических параметров для получения индикаторных фагов Klebsiella с высокой литической активностью опытным путем установили множественность инфекции. Для штамма фага К - 10 УГСХА множественность инфекции составила 2,17 корпускул фага на 1 бактериальную клетку, фага К - 81 УГСХА - 0,21 к 1. Оптимальная экспозиция пассажа при 37 °С составила 4 часа. Был осуществлен контроль бактериофагов: определение стерильности, литической активности, спектра лизиса, специфичности; степень нарастания титра фага.

Метод фагоидентификации успешно применяется в ветеринарной и медицинской практике. С помощью специфических бактериофагов, многие исследователи идентифицировали большой процент патогенных культур в течение 48 часов (Островская, Папкова, 1951; Аврех, 1954; Кузнецова, 1956; Попхадзе,

1968; Цветков, 1941; Лихачев, 1948; Ганюшкин, 1984; Николаенко, Тутов, 1970; Капырина, Бакулов, 1972; Ревенко, 1978).

Предложенная нами схема выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов К - 10 и К - 81 серии УГСХА, позволяла сократить сроки исследования в два раза (48 часов). В то время как бактериологический метод исследования занимал 96 часов.

Следующей важной задачей, которая была нами решена, была фагоин-дикация бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале без выделения чистой культуры.

Решение поставленной задачи заключалось в разработки оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага с различными субстратами:

- определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение. В наших исследованиях РНФ считали положительной, если увеличение титра фагов произошло в 5 и более раз. Данный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага.

- установление оптимального времени, обеспечивающее наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Для решения поставленной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культурой при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella, оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров: предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5,16,24 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С; увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 6, 10,16 и 24 часов при температуре 37 °С.

Установлено, что с помощью исследуемых бактериофагов в РНФ при подращивании материала в течение 5 часов можно обнаружить клебсиеллы в концентрации 10 м.к./мл. С увеличение времени подращивания материала до 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 10 м.к./мл.

За 5 часов инкубации исследуемого материала с фагом К - 81 УГСХА обнаруживались бактерии К pneumoniae № 8172 в концентрации 104 м.к./мл, при увеличение времени культивирования до 6 часов повышает чувствительность реак

3 2 ции с указанным фагом до 10 м.к./мл, а 10 часовая инкубация - до 10 м.к./мл. На основании полученных данных можно сделать вывод, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 6 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 10 микробных клеток в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов. Одновременное исследование бактериологическим методом позволяло обнаружить бактерии рода Klebsiella в концентрации 104 м.к./мл, при этом на исследование затрачивалось 96 часов: выделение возбудителя (48 часов), изучение биохимических свойств (48 часов).

Полученные данные при исследовании воды, комбикорма и мяса подтверждают увеличение титра фагов более чем в 5 раз при минимальной концентрации бактерий рода Klebsiella 10 м.к./мл. При исследовании фекалий бактерии рода Klebsiella обнаруживались в концентрации 104 м.к./г, а с увеличением инкубации бактериофагов с материалом до 10 часов обнаруживали о данные бактерии в концентрации 10 м.к./г за 22 часа.

В результате проведенных исследований по обнаружению бактерий рода Klebsiella в контаминированных указанными микроорганизмами объектах ветеринарного надзора и патологическом материале, можно утверждать об успешном применении метода фашиндикации - РНФ, диагностическая чувствительность которого позволяет обнаруживать бактерии рода Klebsiella в минимальной концентрации 103 - 104м.к./мл за 18 - 22 часа.

Для оценки эффективности набора индикаторных бактериофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА в условиях производства мы испытывали 13 проб фекалий больных телят, с помощью РНФ. Бактерии рода Klebsiella при этом были обнаружены в 38 %, а при исследовании бактериологическим методом - в 15 % случаях. Из этого следует, что РНФ является высокочувствительным методом, позволяющим обнаружить бактерии рода Klebsiella даже в случаях, когда выделение культуры в чистом виде практически невозможно из-за наличия большого количества посторонней микрофлоры.

В качестве усовершенствования предложенного метода нами изучалась возможность использования смеси из монофагов. Определив активность монофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА, и активность смеси данных фагов на индикаторных штаммах культур К. pneumoniae № 1017 и К. pneumoniae № 8172 был получен аналогичный результат. Интерференция, то есть взаимное усиление или подавление при взаимодействии фагов отсутствовала.

На основании проведенных исследований, установлена возможность использования биопрепарата, состоящего из двух бактериофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА. Следовательно, полученный биопрепарат, может использоваться для идентификации, а также в реакции нарастания титра фага для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора. Предложены оптимальные технологические параметры постановки РНФ, позволяющие повысить эффективность обнаружения бактерий рода Klebsiella.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бульканова, Елена Анатольевна, 2006 год

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и рековалесцентов // ЖМЭИ. 1960. - № 1. - С. 23 - 27.

2. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов // ЖЭМИ. 1954. - № 7. - С. 93 - 96.

3. Адельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение // Тез. докл. юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. -Л., 1958.-С. 123-131.

4. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М. Кирова. 1964. - Т. 18.-С. 10-12.

5. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии // Здравоохранение Таджикистана. 1961. - № 2. - С. 5 - 11.

6. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров // Ветеринария. 1966. -№ 3. - С. 27.

7. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов Е. coli 0124:В17 // Проблемы бактериофагии и биология кишечных бактерий: сб. кафедры микробиологии I Лен. мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова Л., 1973.-53 с.

8. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 1970.- 19 с.

9. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага // Военно-медицинский журнал. -1961.-№ 4.-С. 39-42.

10. Беркли Р., Бок Э., Буль Д., Бреннер Д., Васильева J1.B., Видель Ф., Грунт У., Гудселлоу М. Определитель бактерий Берджи // Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильяме. М.: Мир, 1997.-432 с.

11. Бондаренко В.М., Баркус М.М. Энтеротоксигенная способность штаммов рода Klebsiella и Enterobacter, выделенных при острых кишечных заболеваниях у детей // Журн. микробиол. 1986. - № 7. - С. 28 - 32.

12. Бондаренко В.М., Баккус М.М., Брилис В.И. Гемаглютинирующая и адгезивная способность штаммов клебсиелл и энтеробактер // Журн. микробиол. 1987. - № 7. - С. 3 - 6.

13. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999.-367 с.

14. Быкова З.А. Некоторые свойства чумных фагов // Тр. Армянской противочумной станции. 1964. - № 3. - С. 171-175.

15. Вилькомирская Т.С. О диагностическом значении реакции нарастания титра фага при дизентерии // ЖМЭИ. 1971. - № 1. - С. 136 - 138.

16. Воронин Е.С., Девришов Д.А., Ставцева Л.Я. // Вестник с.-х. науки. -1989.-№9.-С. 105-110.

17. Воронцова А.А. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании // Кишечные инфекции: тез. докл. на межинстит. конф. -М., 1961. С. 127 - 128.

18. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // В кн.: Основы бактериофагии. Минск, 1973. - С. 5 - 24.

19. Габрилович И.М. Жугова Т.Ч. О взаимодействии фагов Klebsiella с чувствительными клетками // Вирусы микроорганизмов. Пущино: Науч. Центр биологических исследований АН СССР. - 1981. - С. 112-113.

20. Габрилович И.М., Азаматова А.Б., Хакешева Т.А. Об использовании бактериофагов для идентификации клебсиелл // Проблемы клинической микробиологии в неинфекционной клинике. М., 1983. С. - 139 - 140.

21. Газиев Г.М., Батуро А.П., Плетнев А.А. Определение факторов патогенности клебсиелл // Этиология острых кишечных заболеваний: сб. науч. трудов. -М., 1988. С. 86 - 90.

22. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят // Ветеринария. 1967. - № 3. - С. 69 - 71.

23. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение: Автореф. дис. . докт. вет. наук. Ульяновск, 1984. - 84 с.

24. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Ульяновск, 1988. - 45 с.

25. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 1990. -С. 20-28.

26. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - 299 с.

27. Гольдфарб Д., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага // ЖМЭИ. 1957. -№ 5. - 17 с.

28. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии // ЖМЭИ. 1957. - № 8. -С. 90-94.

29. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных бактерий и действие на них бактериофагов: Автореф. дис. . докт. биол. наук. -М., 1954. 52 с.

30. Горченина JI.B., Киселева Б.С. Среды для выделения клебсиелл // Журн. микробиол. 1985. - № 1.-С. 19-22.

31. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки // ЖМЭИ. 1958. -№ 12.-С. 53 -55.

32. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966 1970 гг. // В кн.: Кишечные инфекции. - Киев, 1972.-С. 41-46.

33. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко Л.К. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага. Иркутск, 1957.- 18 с.

34. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М., 1959. -С. 188-191.

35. Земцова И.Н. Применение реакции нарастания титра специфического бактериофага для индикации спор сибиреязвенных бактерий в почве // В кн.: Вопросы микробиологии и лабораторной диагностики особо опасных инфекций. Саратов, 1965. - С. 171 - 175.

36. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных // Ульяновск. 2004. - С. 64 - 75.

37. Золотухин С.Н., Каврук JI.C., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями // Ульяновск ГСХА. 2005. - С. 43 - 48.

38. Золотухин С.Н. Новые фармакологические средства в ветеринарии // Матер. 7 межгосуд. конф. С.-Пб., 1995. - С. 78 - 79.

39. Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Возбудители пищевых отравлений // Курс лекций по санитарной микробиологии. Учеб. пособ. 2002 -С. 151.

40. Зыкова JI.C. Факторы персистенции уропатогенов в диагностике, прогнозировании лечении пиелонефрита у детей: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Оренбург, 1998. - 75 с.

41. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1967.-20 с.

42. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. -№ 6. - 78 с.

43. Калина Г.П. Среды узконаправленного действия для обнаружения и количественного учета клебсиелл // Журн. микробиол. 1980. - № 6. -С. 28-32.

44. Камбаратов П.И. Клиническая оценка РНФ как метода лабораторной диагностики острой дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 4. - С. 29.

45. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага // Профилактика и меры борьбы с лептоспиро-зом и листериозом с/х животных: матер, симпозиума. Новочеркасск, 1972.-С. 76-78.

46. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение // ЖМЭИ. -1947.-№8.-С. 312-315.

47. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллезных культур с помощью О-бактериофага // Тез. докл. конф. Таллин, научн.-иссл. ин-та эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин, 1960. - С. 5 - 6.

48. Киселева Б.С. Род Klebsiella II Энтеробактерии: Руководство / Под ред.

49. B.И. Покровского. -М.: Медицина, 1985. С. 171 - 172.

50. Киселева Б.С. Гедзе Г.И., Солодова Т.Л. Результаты идентификации клебсиелл при различных заболеваниях новорожденных и детей раннего возраста // Жур. микробиол. 1982. - № 7. - С. 52 - 57.

51. Киселева Б.С. Капсульные антигены как основа для разработки диагностических и профилактических препаратов // Бактериальные антигены / Под ред. Семенова. М.: МНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 1982. - С. 15 - 24; 30 - 39.

52. Киселева Б.С., Дусмухамедов Н.С., Голубева И.В. О выделении бактерий трибы Klebsiella при диарее у полярников // Жур. микробиол. 1978. -№ 12.-С. 49-52.

53. Ковалева Е.П., Рейзис А.Р. Инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами // Профилактика внутрибольничных инфекций / Под ред. Е.П. Ковалевой, Семиной: руководство для врачей. М., 1993.1. C. 56-69.

54. Козловский Ю.Е., Плугина И.В., Серебряков С.Н., Барановская О.П., Тихонова Н.Б. Анализ токсигенности штаммов энтеробактерий, изолированных в зверохозяйствах России // Доклады Российской академии с.-х. наук. 2002. - № 3 - С. 44 - 46.

55. Колпикова Т.И., Бакулов И. А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: матер, научн. конф. ВНИИВиМ. Покров, 1992. - Ч. 11. - С. 211 - 212.

56. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листе-рий // Ветеринария. 1990. - № 6. - С. 31 - 32.

57. Коритняк Б.М. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yesinia enterocolitica, разработка технологических параметров по их применению: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2005.-20 с.

58. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом // Материалы 16 межоб-ластн. научно-практ. конф. лабор. работников Зап. Сибири. Томск, 1960.-С. 20-21.

59. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия — 2004. -Том 6. -№ 1.-С. 4-10.

60. Красноголовец В.Н., Киселева Б.С. Клебсиеллезные инфекции. М.: Медицина, 1996.-С.256.

61. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ.- 1961.-№7.-С. 124.

62. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий // В кн.: Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - С. 220 - 257.

63. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий. М., 1963. - 97 с.

64. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16 - 22.

65. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси. - 1974. - С. 276 - 280.

66. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей.-М., 1991.-250 с.

67. Кузнецова В.Н., Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

68. Кукава Г.Г., Джикидзе Э.К., Стасилевич З.К., Крылова Р.И., Кебу Т.И. Биологическая характеристика клебсиелл, выделенных от обезьян в норме и при патологии // Bait. J. Lab. Anim. Sci. 1998. - № 4. - С. 231 - 237.

69. Лакин Г.Ф. Биометрия // Учеб. пособие для биологич. спец. вузов. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

70. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

71. Лебедев В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях // Тр. науч. конф. аспирантов и ординаторов. М., 1964. -С. 105-107.

72. Ленев С.В., Дрогалина Н.А., Бугаев С.А. Бактериофаги для лечения и специфической профилактики сальмонеллеза птиц // Матер. Между нар. научн. конф. Ульяновск, 2006. - С. 417 - 420.

73. Ленев С.В. Способ выделения и свойства бактериофагов // Сб. науч. трудов Всеросс. науч. ин-та вет. препаратов. М., 1991. - С. 24.

74. Лешкович Н.Л., Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710 и их мутантов // В кн.: Проблемы особо опасных инфекций.-М., 1974.-С. 38-41.

75. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

76. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология. М.: Мир, 1970. - 397 с.

77. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 1.-С. 113-115.

78. Мамонтова JI.M., Савилов Е.Д., Рахманин Ю.А. Условно-патогенные микроорганизмы и их распространение в водных экосистемах Сибири // Гигиена и санитария. 2005. - № 3 - С. 13-17.

79. Матвеева С.М. РНФ в диагностике брюшного тифа // Кишечные инфекции: тез. докл. межинстит. конф.-М., 1961.-С. 146-147.

80. Маслова Э.И. Ферменты патогенности бактерий рода клебсиелла-энтеробактер // Кишечные инфекции в Казахстане. Алма-Ата, 1980. -Т. 21.-С. 36-40.

81. Машков А.В. Видовая принадлежность L-форм, выделенных из крови при гломерулонефрите и хроническом пиелонефрите // Журн. микро-биол. 1978. -№ 1.-С. 35-36.

82. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии // М.: Медицина, 1965. 113 с.

83. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастания титра бактериофага // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - 34 с.

84. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Е. coli 0157 и их применение в диагностике: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 20 с.

85. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styfimurium, выделенных на различных территориях СССР // ЖМЭИ. 1970. - № 1. - 53 с.

86. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10 науч. сем. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата, 1978. - С. 55 - 57.

87. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра фага'для выявления бруцелл во внешней среде // ЖМЭИ. 1961. -№5.-С. 145.

88. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фагом//ЖМЭИ. 1951.-№2.-С. 37-40.

89. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. cereus II ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

90. Петровская В.Г. Факторы патогенности энтеробактерий и их генетический контроль // Актуальные вопросы гигиены и краевой инфекционной патологии. Душанбе, 1981. - С. 194 - 200.

91. Петровская В.Г. Генетические основы вирулентности патогенных и условно-патогенных бактерий // Журн. микробиол. 1984. - № 7. -С. 77-85.

92. Петрушина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных маститом коров ЖМЭИ. 1967. - № 5. - 128 с.

93. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде // ЖМЭИ. 1962. № 1. -С. 29-31.

94. Пожарникова Е. Н. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Enterobacter и конструирование на их основе биопрепарата Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2006. - 21 с.

95. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: Медицина, 1999. - С. 389 - 393.

96. Покровский В.И. Проблемы внутрибольничных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996. - № 2. - С. 4.

97. Покровский В.И., Дунаевский О.А. Современные принципы и методы диагностики инфекционных болезней // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001.-№ 4. - С. 5 - 7.

98. Покровский В.И. Энтеробактерии.-М.: Медицина, 1985.-С. 171 192.

99. Поликарпов Н.А., Шилов В.М., Красноголовец В.Н. и др. Биологические свойства патогенных энтеробактерий, выделенных из крови больных // Журн. микробиол. 1985. - № 10. - С. 15 - 19.

100. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Артамонова Т.Н. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в неконцентрированных вирусосодержащих суспензиях // Вестник РАСХН. 2002. - № 2. -С. 74 - 77.

101. Пономарев А.П., Мищенко В.А. Электронная микроскопия вирусов животных и некоторых условно-патогенных микроорганизмов //В.: Фолиант.-2005. 160 с.

102. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - 135 с.

103. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для диагностики бру-целл // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119 - 124.

104. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: Ав-тореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 21 с.

105. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай, 1978. - С. 88.

106. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней // Ветеринария. 1970. - № 6. -34 с.

107. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1959. - № 6. -С. 110-112.

108. Русалеев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий // Ветеринария. 1990. - № 8. - С. 29.

109. Сельников О.П., Фролов А.Ф., Авдеева Л.В., Лукач И.Г. // Госпит. ин-фек. и лекарств, устойчивые микроорганизмы / ЦНИИ эпидемиол. М., 1992.-С. 46-47.

110. Сельников О.П., Персидский Ю.В., Барштейн Ю.А. Микробиологическая и патоморфологическая характеристика клебсиеллезной инфекции // Журн. микробиол. 1992. - Т. 54. - № 2. - С. 75 - 80.

111. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно1 д1агностики за допомо-гою бактерюфага // Мкробюл. журнал А.Н. УССР. 1936. - № 1. -С. 85-112.

112. Сиволодский Е.П., РовновН.В., Петров JI.H. Механизм специфической хромогенной реакции Klebsiella spp. на питательной среде с 5-аминосалициловой кислотой // Жур. микробиол. 1994 - № 3 -С. 489-494.

113. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. // Определитель зоопато-генных микроорганизмов. Справочник. М.: Колос - 1995. - 320.

114. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носи-тельства дизентерийных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Симферополь, 1964. 17 с.

115. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ). -М., 1962.-32 с.

116. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3 - 7.

117. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968-170 с.

118. Трухина Г.М. Оценка методов выделения и циркуляции клебсиелл в объектах окружающей среды // Методы индикации биоценоза патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. М., 1985. - С. 63 - 69.

119. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов. Основы генетики и молекулярной биологии. М.: Мир, 1965. - С. 275 - 368.

120. Хоменко И.М., Конюхова Н.А. Энтеротоксигенная и адгезивная активность клебсиелл // Молекулятная структура бактериальных токсинов и генитический контроль их биосинтеза: Тез. Всесоюз. конф. М., 1985. -С. 128- 129.

121. Хоменко Н.А., Киселева Б.С. Изучение ацетатной среды как теста для дифференциации энтеробактерий // Жур. микробиол. 1973. - № 12. -С. 101-105.

122. Цветков К.И. Применение специфического бактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл // Ветеринария. 1941. - № 6. -С. 4-6.

123. Чиракадзе Л.Г. Чинашвили Т.Г. Типирование S. typhimurium при помощи селекционированных фагов // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С. 72 - 78.

124. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде // Тез. докл. и выступл. на 5 Всес. научн. конф. по санитарн. микробиол. М. - 1962. - С. 89 - 93.

125. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней телят и поросят // Ветеринарный консультант. 2003. -№ 1.-С.4-5.

126. Шипицын А.Г., Басова Н.Ю. Роль микробного фактора в возникновении респираторных болезней телят // Ветеринарный консультант. 2003. -№ 4. - С. 6.

127. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага // ЖМЭИ. 1962. -№ 1. - С. 99 - 102.

128. Ackermann H.-W., DuBow M.S., Gershman M. Taxonomic changes in tailed of enterobacteria // Archies of virology. 1997. - № 142. - P. 1381 - 1390.

129. Atreyee M., Nirmolendu R. Pevisent structure of the capsular polysaccharide of Klebsiella serotype 15 // Syst. and Appl. Microbiol. 1992. -V. 15, № 4. -P. 505-512.

130. Bagley S.T., Seidler R.J., Talbot H.W.J., Morrow J.E. Isolation of Klebsiellae from within living wood // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 36. - P. 178- 185.

131. Batshon B.A., Baer H., Shaffer M.F. Immunologic paralysis produced in mice by Klebsiella pneumoniae type 2 polysaccharide // J. Immunol. 1963. - V. 90.-P. 121-126.

132. Brown C., Seidler R.J. Potential pathogens in the environment: Klebsiella pneumoniae, a taxonomic and ecological enigma // Appl. Microbiol. 1973. -V. 25.-P. 900-904.

133. Donaldson Scott G., Azizi S.Q., R. dal Nogare Anthony Characteristics of aerobic gram-negative bacteria colonizing critically ill patients // Amer. Rev. Respir. Diseases.-1991.-V. 144, № l.-P. 202-207.

134. Duguid J.P. Old D.C. Adhesive properties of Enterobacteriaceae // Bacterial Adherence / ed. E.H. Beachey. London: Chapman and Hall, 1980. -P. 187-215.

135. Edberg S.C., Piscitelli V., Cartter M. Phenotypic characteristics of coliform and noncoliform bacteria from a public water supply compared with regionaland national clinical species // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. -P. 474-478.

136. Edwards P.R., Ewing W.N. Identification of Enterobacteriaceae II Burgess publ. Co., Minneeaprolis, 1972.

137. Ewing W.H., Edwards P.R., Ewings Identification of Enterobacteriaceae. 4 th ed. - New York; Amsterdam; Oxford; Elsevier. - 1986. - V. 536.

138. Gaston M.A., Ayling-Smith B.A., Pitt T.L. New bacteriophage tiping scheme for subdivision of the frequent capsular serotypes of Klebsiella spp. II J. clin. Microbiol.- 1987.-V. 117, №2.-P. 1228- 1232.

139. Gragia J., Yan G. Demonstration of types of tyfosus by means of preparation of type // Canad. publ. hith. J. 1938. - V. 29, № 9. - P. 448.

140. Graigie J., Felix A. Typing of typhoid bacilli with Vi bacteriophage, suggestions for its standardization // Lancet. 1947. - № 14. - P. 823.

141. Ivanof A., Serban D., Joneseu 0. Enterotoxigenic bacteria in infantile diarrheal disease // Arch. roum. Path. exp. Microbiol. 1983. - V. 42, № 2 - 3. -P. 147- 153.

142. Jhanjee A., Asnani PJ. Klebsiella pneumoniae enterotoxin // Acta Microbiol. Hung.-1982.-V. 29,№ l.-P. 1-7.

143. Jolivet-Gougeon A., Tamanai-Shacoori Z., Sauvager F., Cormier M. Production of Escherichia cob group I-like enterotoxin by Enterobacteriaceae isolated from environmental water // Microbios. 1997. - 90. - Mb 364. - 365. -P. 209-218.

144. Junzaburo M., Seiki S., Tokashi Y. и др. Биологическая активность и химический состав цитотоксина К. oxytoca II J. Gen. Microbiol. 1992. -№9.

145. Kahlich R., Palecek A., Korych B. Nalez enterobakterove toxikose v Ram-cidiagnostiky strevnich epidemii // Voj. Zdrav. Listy. 1982. - V. 51. -P. 260-263.

146. Katznelson H., Sutton M. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of intern along borne bacterial infection of seed // J. Bact. 1951. - V. 61, № 1. - P. 689.

147. Kauffmann F. On the classificacion and nomenclature of family Enterobacte-riaceae // Intern. Bull. bact. Nomencl. a. Tacsonom., 1963. V. 13. -P. 187- 193.

148. Kauffmann F. On the serology of the Klebsiella group // Acta Pathol. Scand. -1949.-V. 26.-P. 381 -406.

149. Kaur K., Kaul M., Chhiber S. Enterotoxigemicity, klebocinogeny and antibiotic resistance pattern of food isolated of Klebsiella pneumoniae II Folia Microbiol. 1988. - V. 3, № 6. - P. 500 - 506.

150. Ketti I. A study of Escherichia coli from farm animals during // Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1981. - V. 28. - P. 393 - 398.

151. Lindberg R.B., Latta R.L. Phage tuping of Ps. aeruginosa chinical and epide-miologi considerations // J. Infect. Diseases. 1974. - V. 130, № 5. -P. 32-34.

152. Lee C.J., Jung D.S., Jung S.H., Baik J.H., Lee J.H., Cho Y.R., Go B.S., Lee S.W., Han S.Y., Lee D.H. Comparison of Liver Abscess between Diabetic Patients and Non-Diabetic Patients // J Hepatol. Korean. 2005. - V. 11, № 4. -P. 339-449.

153. Levintal C., Fisher A. Structural developmet of a bacteriae virus // Biochim. Biophys. Acta. 1952. - V. 9, № 4. - P. 419.

154. Martin W.J., Washington J.A. Enterobacteriaceae II Manual of clinical microbiology. 3rg ed. / Eds. E.H. Lennette et al. - Washington D.S.: ASM, 1980.-P. 195-209.

155. Matsen J.M., Spindler J.A., Blosser R.O. Characterization of Klebsiella isolates from natural receiving waters and comparison with human isolates // Appl. Microbiol. 1974. - V. 28. - P. 672 - 678.

156. Mukherjee Atreyee, Roy Nirmolendu Pevisend serotipe 15 // Syst. and Appl. Vicrobiol. 1992 - V. 15, № 4 - P. 505 - 512.173. 0rscov I., and 0rscov F. Serotyping of Klebsiella II Methods Microbiol. -1984.-V. 14.-P. 143- 164.

157. Pieroni P., Rennie R.P., Ziola В., Deneer H.G. The use of bacteriophages to differentiate serologically cross-reactive isolates of Klebsiella pneumoniae II J. Med. Microbiol. 1994. - V. 41, № 6. - P. 423 - 429.

158. Podschun R., Heineken P., Sonntag H.G. Haemogglutinins and adherence properties to HeLa and intenstine 407 cells of К pneumoniae and К oxytoca isolates // Zbl. Bakt. Hyg., 1 Abt. Orig. 1987. - Bd 255, № 4. -P. 585 -593.

159. Podschun R., Penner I., Ullmann U. Interaction of Klebsiella capsule type 7 with human polymorphonuclear leucocytes // Microb. Pathog. 1992. - V. 13.-P. 371 -379.

160. Podschun R., Ullmann U. Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens: Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors // Clinical Microbiol, reviews.- 1998.-V. 11, №4.-P. 589-603.

161. Przondo-Hessek A. Bacteriophages of Klebsiella bacilli. Isolation properties and use in typing. Arch. Immunol. Ther. Exp. 1966. - V. 14. - P. 413 - 435.

162. Riser E., Noone P., Howard F.M. Epidemiological studi of Klebsiella infection in the special care baby rinit of London Hospital // J. clin. Path. 1980. -V. 33, №4.-P. 400-407.

163. Schindler P.R.G., Metz H. Coliform bacteria in drinking water from South Bavaria: identification by the API 20 E system and resistance patterns // Len-tralbl. Hug. Und Umweftmed. 1990. - V. 190, № 5 - 6. - P. 436.

164. Seidler R.J., Knittel M.D., Brown C. Potential pathogens in the environment: cultural reactions and nucleic acid studies on Klebsiella pneumoniae from clinical and environmental sources // Appl. Microbiol. 1975. - V. 29. -P. 819-825.

165. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.JJ, Kanis I.Y.R., MacLaren D.M. Chemiluminescence of human leucocytes stimulated by clinical isolates of Klebsiella II J. Med. Microbiol. 1985. - V. 19. - P. 333 - 338.

166. Simoons-Smit A.M., Verweij-van Vught A.M.J.J., MacLaren D.M. The role of К antigens as virulence factors in Klebsiella II J. Med. Microbiol. 1986. -V.21.-P. 133 - 137.

167. Slopek S. Phage typing of Klebsiella 11 Methods Microbiol. 1978. - V. 11. -P. 193 -222.

168. Slopek S., Przondo-Hessek A., Milch H., Deak S. A working scheme for bacteriophage typing of Klebsiella bacilli. // Arch. Immunol. Ther. Exp. 1967. -V. 15, №4.-P. 589-599.

169. Slopek S. Phage typing of Klebsiella II Methods Microbiol. 1978. - V. 11. -P. 193-222.

170. Ullmann U. Pattern of microbial isolates in hospitalized patients // Zentbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Ser. 1986. - P. 103 - 113.

171. Vernet V., Philippon A., Madoulet C., Vistelle R., Jaussand R., Chippaux C. // FEMS Vicrobiol. Lett 1995 -V. 130, № 1. - P. 51 - 57.

172. Weiss R. Klebsiella // Handbuch der bakteriellen Infectionen bei Tieren / Hrsg. Von H. Blobel, T. Schlisser.- Jena 1981. - P. 453 - 479.

173. Williams P., Lambert P.A., Brown M.R.W., Jones R.J. The role of the О and К antigens in determining the resistance of Klebsiella aerogenes to serum killing and phagocytosis // J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 129. - P. 2181 - 2191.

174. Wong S.H., Cullimore D.R., Bruce D.L. Selective medium for the isolation and enumeration of Klebsiella spp. II Appl. Environm. Microbiol. 1985. - V. 49, №4.-P. 1022- 1024.

175. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Effect of capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae on the differentiation and functional capacity of macrophages cultured in vitro II Microbiol. Immunol. 1977. - V. 21. -P. 601-610.

176. Yokochi Т., Nakashima I., Kato N. Further studies on generation of macrophages in in vitro cultures of mouse spleen cells and its inhibition by the capsular polysaccharide of Klebsiella pneumoniae II Microbiol. Immunol. 1979. -V. 23.-P. 487-499.