Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Кирьянова, Светлана Владимировна

• Кирьянова, Светлана Владимировна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Кирьянова, Светлана Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фукоиданы растительного сырья: структура и свойства

1.2 Фукозидазы: классификация, продуценты

1.2.1 Продуценты a-L-фукозидазы

1.2.2 Факторы, влияющие на биосинтез a-L-фукозидазы при культивировании продуцентов

1.3 Генно-инженерные методы в получении высокоактивных продуцентов

1.3.1 Общая характеристика метода рекомбинантных ДНК

1.3.2 Клонирование и экспрессия гена a-L-фукозидазы

1.4 Получение препаратов a-L-фукозидаз и их характеристика

1.4.1 Выделение и очистка a-L-фукозидаз

1.4.2 Физико-химические свойства a-L-фукозидаз различного происхождения

1.4.3 Продукты деструкции фукоидана

1.4.3.1 Функциональные свойства фукозы и

фукоолигосахаридов

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Объект исследования и условия культивирования

2.2 Штаммы микроорганизмов, плазмиды и синтетические олигонуклеотиды, используемые в работе

2.3 Методы молекулярного клонирования в бактериях

2.3.1 Выделение хромосомной ДНК L. rhamnosus 12L

2.3.2 Выделение плазмиды рЕТ-23Ь (+) из грамотрицательных микроорганизмов - Е. coli

2.3.3 Полимеразная цепная реакция

2.3.4 Создание генетических конструкций

«клонирующий вектор - встроенная ДНК»

2.3.5 Трансформация клеток химическим методом

2.3.6 Электрофорез в агарозном геле и визуализация ДНК

2.3.7 Выделение ДНК из агарозного геля

2.4 Определение активности a-L-фукозидазы

2.5 Очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы

2.6 Получение спиртоосажденного ферментного препарата

2.7 Определение физико-химических свойств фермента

2.8 Выделение фукоидана из биомассы бурых водорослей

2.9 Определение степени гидролиза фукоидана

2.10 Исследование пребиотических свойств фукозосодержащих

ги дро лизатов

2.11 Общие биохимические и микробиологические методы исследования

2.12 Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3 КОНСТРУИРОВАНИЕ

ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО

ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА a-L-ФУКОЗИДАЗЫ

3.1 Сравнительное исследование a-L-фукозидаз

различного происхождения

3.2 Выбор объекта клонирования и системы экспрессии

3.3 Создание генетических конструкций на основе плазмидного вектора рЕТ-23Ь (+)

3.4 Исследование стабильности генетически модифицированного

штамма Е. coli top 10

ГЛАВА 4 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ a-L-ФУКОЗИДАЗЫ И

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА

4.1 Подбор оптимальных условий глубинного культивирования генетически модифицированного штамма Е. coli top 10

4.1.1 Очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы

4.2 Получение спиртоосажденного ферментного препарата a-L-фукозидазы

4.3 Технология получения ферментного препарата рекомбинантной

a-L-фукозидазы Е. coli top 10

4.4. Исследование влияния pH и температуры на активность

a-L-фукозидазы

ГЛАВА 5 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ ДЕСТРУКЦИИ ФУКОИДАНА РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ФУКОЗОСОДЕРЖАЩИХ ГИДРОЛИЗАТОВ

5.1 Определение оптимальных параметров ферментативного гидролиза фукоидана и идентификация продуктов гидролиза

5.2 Изучение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов

5.3 Расчет себестоимости рекомбинантной a-L-фукозидазы

по предлагаемой технологии

5.4 Технико-экономический расчет производства фукозы и

фукозосодержащих гидролизатов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биотехнологии α-L-фукозидазы и исследование пребиотической способности гидролизатов фукоидана»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В настоящее время, согласно Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года, производство ферментов является одним из приоритетных направлений промышленной биотехнологии.

a-L-фукозидазы (ЕС 3.2.1.51) - ферменты, относящиеся к классу О-гликозидгидролаз, расщепляют внутренние a - 1,3, - 1,4 - гликозидные связи основной цепи молекул фукоидана - полисахарида клеточных стенок бурых водорослей. Установлено, что образующиеся в результате ферментативного гидролиза фукоолигосахариды и моносахарид фукоза обладают пребиотическим и иммунотропным действием. Отсутствие или низкий уровень фукозы в крови приводит к нарушению синтеза фукозилированных гликанов и вызывает хронический иммунодефицит и недоразвитость ткани тимуса (Park, 2007, АН et al, 2008). Поэтому актуальным является создание на основе продуктов гидролиза фукоиданов лечебно-профилактических средств с иммуностимулирующими свойствами.

Спектр микроорганизмов - природных продуцентов a-L-фукозидаз довольно широк, однако они характеризуются недостаточной активностью для их использования в качестве промышленных продуцентов.

В мировой практике для получения биотехнологически важных ферментных препаратов используют различные молекулярно-генетические подходы, которые состоят в комбинации методов генной инженерии и микробиологии, для создания микроорганизмов с заданными генетическими характеристиками, что позволяет повысить активность и выход целевого фермента по сравнению с нативным продуцентом.

Изучением a-L-фукозидаз занимались в основном зарубежные ученые: Sano (1992), Goso (2001), Katayama (2004), Miura (2005),

Rodriguez-Diaz (2013) и другие. Однако число работ, посвященных выделению и клонированию генов a-L-фукозидаз с целью максимальной продукции фермента, увеличению его активности, изменения свойств ферментов для их промышленного применения немногочисленно, а в отечественной практике отсутствуют вовсе.

В настоящее время на рынке имеется коммерческий ферментный препарат термостабильной a-L-фукозидазы из Т. maritima фирмы Megazyme. Однако он имеет низкую фукозидазную активность и высокую стоимость. На отечественном рынке коммерческих препаратов ферментов, способных расщепить сульфатированные полисахариды морских водорослей, не существует. Поэтому поиск и получение активных продуцентов a-L-фукозидазы является актуальной задачей современной биотехнологии.

Данная работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по разработке биологических методов получения минорных Сахаров и изучению их функциональных свойств в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственный контракт № 14.512.11.0069 от 17.04.2013 г.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы заключалась в разработке биотехнологии высокоактивной a-L-фукозидазы с использованием методов генной инженерии, исследовании некоторых физико-химических свойств ферментного препарата и определении пребиотической способности полученных фукозосодержащих гидролизатов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выбор микроорганизма - источника гена a-L-фукозидазы и системы экспрессии клонированного гена;

• получение рекомбинантного штамма - высокоактивного продуцента a-L-фукозидазы;

• определение оптимальных условий биосинтеза целевого фермента;

• получение ферментного препарата a-L-фукозидазы и исследование его некоторых физико-химических свойств;

• очистка рекомбинантного белка a-L-фукозидазы;

• исследование ферментативной деструкции фукоидана;

• определение пребиотических свойств фукозосодержащих гидролизатов в опытах in vivo.

Научная новизна. С применением технологии рекомбинантных ДНК впервые получен отечественный ферментный препарат высокоактивной a-L-фукозидазы. путем введения в составе плазмиды pet23b+ гена a-L-фукозидазы под контролем Т7 - промотора сконструирован штамм Е. coli top 10 - перспективный продуцент a-L-фукозидазы, превышающий уровень активности нативного продуцента в 20 раз и не уступающий известным рекомбинантным бактериальным продуцентам a-L-фукозидаз. Установлены оптимальные параметры биосинтеза генетически-модифицированного штамма. Доказано, что внесение фукозосодержащих гидролизатов дозировке 0,04 % от массы тела опытных мышей в условиях экспериментального дисбиоза, способствует восстановлению нормальной микрофлоры животных.

Практическая значимость. Разработана биотехнология рекомбинантной a-L-фукозидазы, способной гидролизовать фукоидан бурых водорослей до фукоолигосахаридов и фукозы, позволят существенно расширить рынок пребиотиков.

Полученные научные материалы используются в учебном процессе для студентов, обучающихся по направлению подготовки

«Биотехнология».

Новизна технических решений отражена в заявке на изобретение (приоритет от 24.09,2013 № 2013143212).

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных конференциях ВГУИТ (г. Воронеж, 2011-2013 гг.); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011,2012 гг.).

Данная работа была представлена на конкурс молодых ученых, проходивший в рамках VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».

Работа поддержана грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.».

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 13 работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов (3 главы), заключения, выводов, списка использованных источников, приложений и представлена на 123 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 20 рисунков и 9 таблиц. Библиография включает 145 наименований, в т. ч. 115 иностранных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Фукоиданы растительного сырья: структура и свойства

Фукоиданы - это сложные сульфатированные гетерополисахариды, выделяемые преимущественно из бурых водорослей, основным моносахаридным звеном которых является Ь-фукоза. Содержание фукоиданов может достигать 25-30 % от сухого веса водоросли и зависит, в основном, от вида водоросли, а также от сезона или стадии развития водоросли, места сбора и других факторов. Строение фукоидана представлено на рис. 1.1. [ 1, 24]

/

Рисунок 1.1- Строение фукоидана бурых водорослей (по А. И. Усову).

Параметры, по которым различаются фукоиданы в зависимости от вида водорослей и условий ее произрастания, это молекулярная масса (от

10 до 1000 кДа), моносахаридный состав (помимо фукозы в их структуре могут присутствовать галактоза, ксилоза, манноза, арабиноза, рамноза, рибоза, глюкуроновая кислота), положение и содержание сульфатов (могут иметь 0-2 остатка серной кислоты в молекулах фукозы), а также тип связи между молекулами фукозы (а-(1—>3), (1—>2), (1—»4) либо их сочетание) и структура боковых цепей [2].

Несмотря на то, что фукоиданы известны давно, далеко не все их структурные особенности выяснены с достаточной определенностью. В первую очередь это относится к структуре фрагментов, включающих минорные моносахариды. В настоящее время установлено, что большинство известных фукоиданов относится к двум структурным типам: первый тип содержит в основной цепи а-1—>3-, второй тип — чередующиеся а-1—>3- и а-1 —>4-связанные остатки фукозы. Разветвления присоединены в положении 2, а сульфатные группы могут находиться при С4 остатка фукозы. Выделены фукоиданы, в которых сульфатные группы расположены при С2, а также при С2 и С4. Кроме того, известны фукоиданы, в которых остатки фукозы не только сульфатированы, но и ацетилированы [65].

Нужно отметить, что в большинстве случаев установлены структуры фракций фукоиданов, основным компонентом которых является фукоза. Эти полисахариды выделены из бурых водорослей, принадлежащих к порядкам Chordariales, Laminariales, Fucales. Бурые водоросли, принадлежащие порядкам Chordariales и Laminariales (Phaeosporophyceae), синтезируют полисахариды, состоящие из а-1—>3-связанных остатков фукозы. Основная цепь этих полисахаридов может иметь разветвления при С2 некоторых остатков фукозы (остаток D-GlcA ( Cladosiphon okamuranus ) или остаток Fue {Chorda filum)). Основная цепь фукоиданов водорослей порядка Fucales (Cyclosporophyceae)построена из чередующихся а-1—>3- и а-1 —>4-связанных остатков фукозы, в результате

чего формируется регулярная структура полисахаридной цепи. Однако в нативном фукоидане эта регулярность маскируется беспорядочным расположением сульфатных и ацетатных групп. Возможно, что различия в структуре основной цепи фукоиданов связаны с разным механизмом биосинтеза этих полисахаридов у бурых водорослей, принадлежащих Phaeosporophyceae и Cyclosporophyceae[66, 70].

Фукансульфаты морских ежей Arbacia lixula , Lytechinus variegates и голотурии (Ludwigothurea grisea) состоят из повторяющихся тетрасахаридных звеньев и, в отличие от фукоиданов, обладают четко выраженной регулярной линейной структурой и не содержат ацетатных групп.

Выяснение связи между структурой и биологической активностью фукоиданов в настоящее время является важной, но малоизученной проблемой. Следует отметить, что большинство исследователей приводят данные о биологической активности нативных фукоиданов, детали структуры которых, как правило, если и установлены, то лишь частично в силу своей сложности. Четкое установление структуры в сочетании с биологической активностью необходимо для разработки на основе фукоиданов как лекарственных средств, так и препаратов для научно-исследовательских целей [37, 38, 135].

Многочисленные исследования последних 10-15 лет посвящены биологическому действию фукоиданов и фукоолигосахаридов, полученных путем частичного гидролиза фукоиданов. Фукоиданы проявляют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что является причиной повышенного интереса к ним. Так, в литературе имеются сообщения о противоопухолевых, иммуномодулирующих, антибактериальных, противовирусных, противовоспалительных и других свойствах фукоиданов. По этой причине фукоиданы можно отнести к так называемым «поливалентным биомодуляторам» [131, 132]. Недавно было

показано, что фукоиданы, выделенные из бурых водорослей ингибируют обратную транскриптазу in vitro. [41, 66] Это открытие позволит сделать определенные шаги в направлении создания препаратов нового поколения для борьбы с вирусными заболеваниями. Такие выводы подкреплены недавними исследованиями японских ученых, показавших, что фукоиданы из морской водоросли Cladosiphon okamuranus при определенных условиях препятствуют развитию вируса тропической лихорадки [129]. В ряде исследований было выявлено наличие у препаратов водорослей противовирусной активности в отношении вируса иммунодефицита человека. Активность вируса иммунодефицита человека in vitro подавляли экстракты Dygenea simplex, полисахариды Fucus vesiculosus, сульфатированные полисахариды некоторых других видов морских водорослей [137]. Кроме того, полисахариды морских водорослей проявляли активность в отношении вируса герпеса, гриппа, цитомегаловируса, кори и эпидемического паротита [138].

Фукоидан из фукусовых водорослей ингибировал рост некоторых патогенных бактерий в культуре, а также стимулировал in vivo фагоцитоз и другие реакции клеточного и гуморального иммунитета. [145]

Особый интерес вызывает антикоагулянтное действие фукоиданов. В настоящее время известны два механизма антикоагулянтного действия фукоиданов: один реализуется посредством прямого ингибирования активности факторов VII, XI, XII свертывания крови, второй основан на гепариноподобном ингибировании свертывающих факторов посредством активации специфического эндогенного ингибитора - антитромбина-Ш (AT-III) [67, 136]. Фукоиданы, действующие по первому механизму, могут применяться при антикоагулянтной терапии у больных с врожденным или приобретенным дефицитом антитромбина AT III, когда гепарин не эффективен. Структура фрагментов молекул фукоиданов, ответственных за действие их по первому или второму механизму, неизвестна. В данном

случае выяснение различий в структуре этих фрагментов приобретает важное значение [98, 130].

Большое количество публикаций посвящено изучению протовоопухолевой активности биологически активных веществ из морских водорослей. Экстракты из ряда бурых и зеленых водорослей японского побережья проявляли in vitro выраженную цитотоксическую активность в отношении клеток мышиного лейкоза L1210, но слабую цитотоксичность в отношении здоровых клеток. Скармливание мышам порошка микроводоросли Chlorella vulgaris тормозило рост перевитой опухоли и стимулировало активность естественных Т-киллеров. Частично очищенный полисахарид из пищевой морской водоросли проявлял противоопухолевую активность в отношении перевиваемой карциномы легких Льюиса, спонтанного Т-клеточного лейкоза и эритролейкоза, вызываемого ретровирусом Раушера. Сульфатированные полисахариды водорослей также угнетали метастазирование перевиваемой аденокарциномы молочной железы у крыс [66, 94, 95]. Фукоидан из водоросли Sargassum thunbergii тормозил развитие метастазов в легких у мышей при перевивке им карциномы легких Льюиса, а также ингибировал рост асцитной карциномы Эрлиха и стимулировал фагоцитарную активность макрофагов. Предположительно, механизмы

противоопухолевого действия полисахаридов водорослей связаны с их способностью тормозить клеточную пролиферацию и стимулировать выработку факторов некроза опухоли макрофагами.

Кроме того, продемонстрировано наличие онкопрофилактической активности биологически активных добавок из водорослей. Так, Laminaria angustata тормозила канцерогенез кишечника, индуцированный 1,2-диметилгидразином у крыс. У крыс, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации, пищевой рацион, обогащенный порошком Laminaria japónica, оказывал профилактическое действие на развитии

лейкозов, рака молочной железы, легких и матки, а также опухолей других локализаций. Водоросль ЗрггиИпа /ш1/огт18 ингибировала канцерогенез в ротовой полости у животных в эксперименте, а также приводила к регрессии лейкоплакий слизистой оболочки полости рта у людей, жующих табак [73, 74, 77].

Интенсивность изучения биологической активности фукоиданов значительно опережает исследования их химической структуры. Считается, что биологическая активность фукоиданов обусловлена в первую очередь степенью сульфатирования, наличием фрагментов определенной структуры, а также может быть связана с моносахаридным составом, степенью разветвленности, типом связи, молекулярно-массовым распределением.

Как показано рядом исследователей, молекулярная масса наиболее активных фукоиданов находится в диапазоне 30 - 100 кДа, при этом установлена тенденция: чем меньше молекулярная масса, тем выше эта активность. Нативные фукоиданы имеют ограничение для применения в медицине, вследствие, высокой молекулярной массой, а также наличия остаточных протеинов, что несет риск иммунных осложнений. Но в целом авторы считают, что разные фракции фукоиданов имеют свой оптимум молекулярной массы для проявления этой активности [70, 72].

Большинством исследователей также установлено, что биологическая активность фукоиданов возрастает с увеличением содержания сульфатов, имеет значение и расположение сульфатных групп в молекуле [18, 21].

Однако, несмотря на все усилия, пока так и не удалось с определенной уверенностью установить структурный мотив, который отвечает за проявление той или иной биологической активности фукоиданов.

В настоящее время, к сожалению, несмотря на большое количество исследований, подтверждающих широчайший спектр биологических активностей препаратов из морских водорослей, в том числе, противоопухолевую, противовирусную, антикоагулянтную и иммуностимулирующую активность, методики выделения, очистки и идентификации биологически активных веществ водорослей не внедрены в пищевую и фармацевтическую промышленность. Практически все существующие в настоящий момент медицинские и косметические препараты содержат слабоочищенные или частично фракционированные экстракты морских водорослей, зачастую с неустановленным достоверно составом, что затрудняет разработку схем лечения из-за отсутствия информации о точных дозировках отдельных компонентов. Кроме того, несмотря на чрезвычайно низкую стоимость исходного сырья (в некоторых регионах водоросли являются бросовым сырьем и загрязнителями побережья растительной биомассой) существующие препараты чрезвычайно дороги, что ограничивает их использование.

1.2 Фукозидазы: классификация, продуценты

Фукозидазы - гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз фукозидных связей с образованием молекул Ь-фукозы, остаются наименее изученным семейством гликозидгидролаз, но представляют большой научный и практический интерес. Эти ферменты востребованы современной биотехнологией и могут широко использоваться для нужд фармакологической промышленности и сельского хозяйства. В зависимости от типа разрываемой связи фукозидазы подразделяются на а-Ь-фукозидазу (ЕС 3.2.1.51), 1,2-а-фукозидазу (ЕС 3.2.1.63), 1,3-а-фукозидазу (ЕС 3.2.1.111) и 1,6- а-фукозидазу (ЕС 3.2.1.127).

а-Ь-фукозидаза (ЕС 3.2.1.51) - фермент, способный гидролизовать все типы фукозильных связей.

Рисунок 1.2 - Реакция, катализируемая а-Ь-фукозидазой.

1.2-а-фукозидаза (ЕС 3.2.1.63) - является ферментом, который катализирует химическую реакцию типа:

метил-2-а-Ь-фукопиранозил-^-П-галактозид + Н20 = Ь-фукоза + метил-р-И-галактозид

Данный фермент обладает высокой специфичностью по отношению к концевому невосстанавливающему остатку Ь-фукозы, связанному с остатком Б-галактозы 1,2-а-связью.

1.3-а-фукозидаза (ЕС 3.2.1.111) является ферментом, который катализирует реакцию расщепления 1,3-связей между Ь-фукозой и остатков Ы-ацетилглюкозамина гликопротеинов.

1,6- а-фукозидаза (ЕС 3.2.1.127) катализирует гидролиз 1,6-связей между а-Ь-фукозой и М-ацетил-О-глюкозамином в гликопептидах, таких как иммуноглобулин в и фукозил-ацило-агалакто-фетуин.

Систематическое название этого фермента - 1,6-Ь-фукозил-1Ч-ацетил-О-глюкозоаминилгликопептид фукогидролаза.

он

он

а-И-фдкози§

1-фдкоза

1.2.1 Продуценты a-L-фукозидаз

Спектр микроорганизмов, из которых были выделены a-L-фукозидаза, довольно обширен. Среди бактерий - продуцентов a-L-фукозидаз преобладают различные виды рода Bifidobacterium и Bacillus [54, 62, 80, 82, 112]. Данные микроорганизмы вырабатывают фермент активный в отношении а-1,2-гликозидных связей, но не способный гидролизовать 1,3-, 1,4- и 1,6-фукозиданые связи.

Также способность к биосинтезу фукозидазы обнаружена у бактерий родов Lactobacillus, Clostridium, Ruminococcus, Thermus [32, 55, 56, 119 ]. Причем фермент, продуцируемый штаммом Thermus sp. Y5 был активен в отношении связей а-1,2, 1,3, 1,4 и 1,6-связей [35].

a-L-фукозидазы, способные к гидролизу фукозосодержащих субстратов, обнаружены в актиномицетах из группы стрептомицетов, таких как Streptomyces species 142 [123] и Streptomyces sp. ОН11242 [111]. Из Streptomyces sp. ОН11242 было выделено две фракции фермента, обладавшие различной субстратной специфичностью: 1 - отщепляла фукозу от полисахаридов муцина, но не действовала на синтетический субстрат; 2 - наоборот, была активна в отношении нитрофенил-фукозида. Изучение субстратной специфичности Streptomyces species 142 показало, что фермент гидролизует 1,3- и 1,4-фукозидные связи, но не активен в отношении 1,2- и 1,6-связей.

Среди грибов продуценты фукозидаз представлены родами Rhizopus, Pénicillium, Aspergillus, Trihoderma [3, 36, 92]. Причем максимальная активность целевого фермента среди микромицетов отмечена у A. awamori ВКМF-808 [3].

Также активные фукозидазы были обнаружены в морских моллюсках Littorina kurila и Pecten maximus [50, 61]. Из Littorina kurila были изолированы и изучены фукоидангидролаза, a-L-фукозидаза и

арилсульфатаза моллюска, показано что фукозидаза и арилсульфатаза гидролизуют синтетические субстраты и не гидролизуют нативный фукоидан, а фукоидан-гидролаза гидролизует нативный фукоидан с образованием сульфатированных олигосахаридов и фукозы [87].

Перечень организмов - природных продуцентов а-Ь-фукозидаз представлен в таблице 1.1.

Таблица 1.1- Продуценты a-L-фукозидаз

Продуценты Литература Продуценты Литература

Bifidobacterium bifidum штаммы JCM1254 и VIII-210 80 Pseudoalteromonas issachenkonii KMM3549 93

Fucophilus fucoidanolyticus 54 Streptomyces sp. OH 11242 111

Bacillus cereus 90 Bacillus sp. K40T. 62

Aspergillus niger 92 Streptomyces species 142 142

Clostridium perfringens 32 Bacillus fulminans 82

Fucobacter marina (Flavobacteriaceae) 54 Bifidobacterium infantis 134

Thermus sp. Y5 35 Ruminococcus torques 54

Ruminococcus gnavus VI-268 54 Sphingomonas paucimobilis PF-1 54

Lactobacillus casei BL23 119 Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 55

Thermotoga maritima 59 Bacillus circulans 112

Bacteroides fragilis 113 Bacteroides thetaiotaomicron 54

Fusarium oxysporum 54 Limulus polyphemus 54

Microscilla sp. 54 Microscilla sp. PRE1 54

Penicillium multicolor 36 Propionibacterium acnes 54

Rattus norvegicus 54 Rhodopirellula baltica 54

Streptococcus gordonii 54 Streptococcus pneumoniae TIGR4 54

Xanthomonas axonopodis 54 Xanthomonas campestris 54

1.2.2 Факторы, влияющие на биосинтез а-Ь-фукозидаз при культивировании продуцентов

Биосинтез ферментов, по мнению ряда авторов, зависит от основных факторов: правильно выбранного микроорганизма - продуцента заданного фермента, рациональной питательной среды и оптимального режима культивирования отобранного штамма на специально разработанной среде. При этом значительная доля трудностей связана с подбором условий для культивирования микроорганизма - продуцента, так как синтез активных а-Ь-фукозидаз напрямую зависит от таких условий,

как источники углерода и азота, а также их концентрации в питательной среде.

Источники углеродного и азотного питания в биосинтезе ферментов крайне необходимы. Биологическая роль углеродных источников питания связана с энергетической функцией, а также определяет основные метаболические пути любого организма. Без азота невозможно формирование аминокислот, а, следовательно, белковых веществ и нуклеотидов. Микроорганизмы способны усваивать азот минеральных соединений и органический азот.

Наиболее важным условием культивирования является выбор источника углерода. В этом качестве могут быть использованы различные органические соединения, во многом это зависит от физиологических особенностей продуцента. Показано, что биосинтез a-L-фукозидаз бактериями существенно возрастает, если в качестве углеродного субстрата в питательную среду вносят небольшое количество свиного желудочного муцина. Некоторые бактерии рода Bacillus проявляют фукозидазную активность при внесении в среду фукозы и арабинозы [82, 90, 112]. По-видимому, в этом случае источник углерода одновременно является индуктором синтеза a-L-фукозидаз.

Исследования различных источников углерода на биосинтез грибной a-L-фукозидазы [3, 36, 92] показали, что уровень активности значительно варьируется в зависимости от источника углерода. Так, фукоидан и фукоза были наиболее эффективными стимулятороми синтеза внеклеточной a-L-фукозидазы. Питательные среды с маннозой, глюкозой или галактозой не обеспечивали достаточно высокую активность фермента.

Помимо источника углерода, титр a-L-фукозидазы зависит от типа источника азота в питательной среде [2,13]. Для интенсификации биосинтеза a-L-фукозидазы с успехом используются неорганические

источники азота, такие как цитрат аммония, нитрат натрия. Следует отметить, что использование в составе сред только неорганических источников азота не обеспечивает высокого уровня синтеза фермента. Поэтому наряду с источниками минерального азота для повышения уровня синтеза a-L-фукозидазы в питательную среду вносят дрожжевой экстракт и пептон.

При выборе источника азота следует обращать особенное внимание на физиологическое воздействие аниона или катиона при избирательном потреблении азота, так как это может заметно влиять на рН среды и, соответственно, на рост продуцента.

Кроме источников углерода и азота, важным фактором является концентрация ионов различных металлов в питательной среде. Ионы металлов часто оказывают сильное влияние на продукцию a-L-фукозидаз различными микроорганизмами. Например, было обнаружено, что ионы Hg и Мп ингибируют синтез a-L-фукозидазы бактериями рода Bacillus. В то же время, показано, что ионы Fe , Zn , EDTA увеличивают продукцию a-L-фукозидаз [82, 90, 112].

На процесс культивирования продуцента и накопления фермента большое влияние оказывает начальная величина рН среды, оптимальное значение которой варьируется в зависимости от типа продуцента. Для a-L-фукозидаз оптимум рН находится в пределах от 4,5 до 7,5. Для бактерий максимальный уровень продукции a-L-фукозидаз наблюдается при значении рН среды около 7.0, в частности для Lactobacillus casei. [55, 119].

Температура оказывает большое влияние на скорость биосинтеза ферментов различными микроорганизмами. Установлено, что a-L-фукозидазы синтезируются в интервале температур 35 - 95°С [54]. В большинстве случаев оптимальная температура продуцирования a-L-фукозидазы соответствует температуре роста соответствующего

микроорганизма, например оптимальная температура роста и биосинтеза a-L-фукозидазы в случае Lactobacillus casei - 40°С [55, 119].

Одним из важных факторов, оказывающих положительное влияние на накопление ферментативной активности, является продолжительность культивирования микроорганизмов. Время выращивания продуцентов a-L-фукозидазы варьирует в зависимости от продуцента. Например, установлено, что выращивание A. awamori ВКМ F-808 в течение 96 часов приводит к увеличению активности фермента. В то же время культивирование Bacillus subtilis 75 продолжительностью 24 часа также обеспечивает достаточную ферментативную активность [3, 82].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кирьянова, Светлана Владимировна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Аминина, H. М. Состав и возможности использования бурых водорослей дальневосточных морей / H. М. Аминина [и др.] // Вестник ДВО РАН. - 2007. - №7. - С. 123-130.

2. Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф., Коровкин. - М.: Москва, 1988 г. - 704 с.

3. Выбор продуцента высокоактивной фукозидазы и оптимизация условий его культивирования / Корнеева О.С., Санина Т.В., Кирьянова C.B. // Фундаментальные исследования. - 2011. - №9 (3). - с. 579-582.

4. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. - М.: «Мир», 2002. - 589 с.

5. Доронин, А. Ф. Функциональное питание Текст. / А. Ф. Доронин, Б. А. Шендеров. М.: ГРАНТЪ, 2002. - 296 с.

6. Евдокимова, О. В. Конкурентный потенциал функциональных сиропов [Текст] / О. В. Евдокимова, Т. Н. Иванова, В. В. Марков // Технология и товароведение инновационных пищевых продуктов. - 2011. - № 5 (10). - С. 83-88.

7. Клаг, Уильям С. Основы генетики / Уильям С. Клаг, Майкл Р. Каммингс. - М.: Техносфера, 2007. - 896 с.

8. Кудряшева, А. А. Новые нанобиотехнологии и натуральные биокорректоры (экология, питание и здоровье человечества) Текст. / А. А. Кудряшева. М.: Пшцепромиздат, 2007. - 96 с.

9. Леек, A.M. Введение в биоинформатику [Текст] / A.M. Леек. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2013. - 324 с.

10. Малкоч, A.B. Пребиотики и их роль в формировании кишечной микрофлоры / A.B. Малкоч, C.B. Бельмер // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. -2009. - Т. 87. - № 4. - С. 111-114.

11. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М: Мир, 1984. - 479 с.

12. Меркулова, О.В. Влияние состава питательной среды на биохимическую активность закваски с бифидобактериями / О.В. Меркулова, А.Д. Лодыгин // Сборник научных трудов Северо-Кавказского госуд. технич. университета. Серия «Продовольствие». - Ставрополь. -2006.-№ 2.-С. 13-15.

13. Методы общей бактериологии / А. А. Щеркабов и др.-Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина (Ульяновск), 2007. - 130 с.

14. Огурцов, А.Н. Нанобиотехнология. Основы молекулярной биотехнологии [Текст]: учеб. пособие [ по курсу «Молекулярная биотехнология» для студ. направ. подг. 051401 «Биотехнология», в т.ч. иностр. студ.] / А.Н. Огурцов. - Харьков: НТУ «ХПИ», 2010.-384 с.

15. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. - М. : Мир, 1997. -Т. 1. - С. 180-252.

16. Павлов, А. Биоинформатика / А. Павлов, Ю.М. Ермолаев. -М.: Народное образование, 2010. - 256 с.

17. Пат. № 2240816. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии. Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН.

18. Пат. № 2096974. Способ коррекции углеводного состава пищевых продуктов общего и специального назначения. И.П. Чепурной, С.М. Кунижев. 1997.

19. Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов. Справочник. / Г.В. Полыгалина, В.С. Чередниченко, JI.B. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.

20. Рыбчин, В.Н. Основы генной инженерии / В.Н. Рыбчин. -Спб.: «Студенческая книга», 2002. - 522 с.

21. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов из бурых водорослей /Т. В. Кузнецова [и др.] //Вестник ДВО РАН. - 2006. - №6. - С. 105-110.

22. Сравнительный анализ альфа-фукозидаз с применением методов биоинформатики [Текст] / С.В. Кирьянова, А. Самченко, М.С.

)

Кондратьев, Д.А. Черенков, О.С. Корнеева // Актуальные биотехнологии. -2010.-№ 1. - с 31 -34.

23. Теплов, В. И. Физиология питания Текст./ В. И. Теплов, В. Е. Боряев. -М.: Издательский дом Дашков и К, 2006.-215с.

24. Усов, А.И. Фукоиданы - сульфатированные полисахариды бурых водорослей / А.И. Усов, М.И. Билан // Успехи химии. - 2009. -Т.78. - № 8.-С. 846-862.

25. Усов, А. И. Полисахариды водорослей. Выделение фукоидана из бурой водоросли Laminaria cichorioides Miyabe / А. И. Усов, А. В. Кирьянов // Биоорганическая химия. - №12. - 1994. - С. 1342-1348.

26. Харди К.Г. Методы клонирования в бациллах: Клонирование ДНК.-М: Мир, 1988-311 с.

27. Чепурной, И.П. Питание и здоровье человека / И.П. Чепурной. - М.: Медицина, 2003. - 208 с.

28. тендеров, Б.А. Пробиотики, пребиотики и синбиотики /Б.А. Шендеров // Пищевые ингридиенты, сырье и добавки. - 2005. - № 2. - С. 23 -26.

29. Экономическая эффективность производства фукозы из растительного сырья [Текст] / С.В. Кирьянова, А.А. Толкачева, О.С. Корнеева // Финансы. Экономика. Стратегия. -2013.-е.

30. Ярилин, А.А. Иммунология / А. А. Ярилин. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.-752 с.

31. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds / A. Cumashi [et al.] // Glycobiology. - 2007. - V. 17. - P. 541-552.

32. Aminoff, D. Purification and general properties of 1,2 -L-ficosidase from Clostridium Perfringens / D. Aminoff, K. Furukawa // J. Biol. Chem. - 1970. - V. 245. - P. 1659-1669.

33. Analysis of the reaction coordinate of alpha-L-fucosidases: a combined structural and quantum mechanical approach / Lammerts van Bueren A [et. al.] // J Am Chem Soc. - 2010. - V. 132(6). - P. 1804-1806.

34. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweed / T.N. Zvyagintseva [et al.] // Carbohydrate Research. - 1999. - V. 322. - №1-2. - P. 32-39.

35. An alpha-L-fucosidase from Thermus sp. with unusually broad specificity / E. V.Eneyskaya [et al.] // Glycoconj J. - 2001. - V. 18. - №10. - P. 827-834.

36. An alpha-L-fiicosidase from Penicillium multicolor as a candidate enzyme for the synthesis of alpha (l-->3)-linked fucosyl oligosaccharides by transglycosylation / K. Ajisaka, H. Fujimoto, M. Miyasato // Carbohydr Res. - 1998. - V. 309. - № 1. - P. 125 - 129.

37. A non-anticoagulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo/ E.M. Barroso // Planta Med. - 2008. - V. 74. - № 7. - P. 712-718.

38. Anticoagulant activity of fucoidans from brown algae / N.A. Ushakova [et al.] // Biomed Khim. - 2008. - V. 54. - № 5. - P. 597-606.

39. Antiproliferative and antioxidant properties of an enzymatic hydrolysate from brown alga, Ecklonia cava / Y. Athukorala, K.N. Kim , Y.J. Jeon // Food and Chemical Toxicology. - 2006. - V. 44. - P. 1065-1074.

40. Antitumor activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllumnodosum / M. Ellouali [et al.] // Anticancer Res. - 1993. - V. 13. - P. 2011—2019.

41. A study of fucoidan from brown seaweed Chorda filum / A.O. Chizhov [et al.] // CarbohydrateResearch. - 1999. - V. 320. - P. 108-119.

42. Bacterial fitness and plasmid loss: the importance of culture conditions and plasmid size / M. A. Smith, M. J. Bidochka, U. Can // J. Microbiol. - 1998. - V. 44. - P. 351-355.

43. Barnes M.R. Bioinformatics for Geneticists: A Bioinformatics Primer for the Analysis of Genetic Data / John Wiley & Sons, 2007.-p. 576.

44. Baxevanis A.D. Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins / Baxevanis A.D., Ouellette B.F. // John Wiley & Sons, 2001.-P. 488.

45. Berger S.L. Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology / Berger S.L., Kimmel A.R. // Elsevier Science, 1987. -p. 813.

46. Borim A. Understanding Biotechnology / Borim A., Santos F.R., Bowen D.E. // Prentice Hall, 2003. - p. 240.

47. Brown S.M. Bioinformatics: A Guide to Biocomputing and the Internet / BioTechniques Press. - 2000. - P. 200.

48. Casali N. E. coli Plasmid Vectors, Methods and Applications Methods in Molecular Biology / Humana Press - 2003. - P.328.

49. Cerami E. XML for Bioinformatics / Springer-Verlag, 2005. - p.

304.

50. Characterization of a new alpha-L-fucosidase isolated from the marine mollusk Pecten maximus that catalyzes the hydrolysis of alpha-L-fucose from algal fucoidan (Ascophyllum nodosum) / Berteau O [et. al.] // Glycobiology. - 2002. - V. 12(4). - P.273-282.

51. Characterization and role of fucosemutarotase in mammalian cells / Park D. [et al.] // Glycobiology. - 2007. - V. 17. - №9. - P. 955-962.

52. Chen, Y.M. The organization of the fuc regulon specifying L-fucose dissimilation in Escherichia coli K12 as determined by gene cloning / Y.M. Chen, Y. Zhu, E.C. Lin // Mol. Gen. Genet. - 1987. - V. 210. - P. 331337.

53. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / M. Dubois [et al.] // Anal. Chem. - 1956. - V. 28. - P. 350-356.

54. Comparative and phylogenetic analysis of alpha-L-fucosidase genes / Intra J [et. al.] // Gene. - 2007. - V. 392(1-2). - P. 34-46.

55. Complete genome sequence of the probiotic Lactobacillus casei strain BL23 / Mazé, A.[ et al. ] // J. Bacteriol. - 2010. - V. 192. - P. 26472648.

56. Complete genome sequence of the probiotic Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 / Morita, H. [ et al. ] // J. Bacteriol. - 2009. - V. 191. -P. 7630-7631.

57. Composition of the cell wall of Chlorella fusca / E. Loos, D. Meindl // Planta. - 1982. - V. 156. - P. 270-273.

58. Dieffenbach C.W. Per Primer: A Laboratory Manual / Dieffenbach C.W., Dveksler G.S. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003.-p. 520.

59. Directed evolution of the alpha-L-fucosidase from Thermotoga maritima into an alpha-L-transfucosidase / Osanjo G [et. al.] // Biochemistry. - I 2007. - V. 46(4). - P. 1022-1033.

60. Dische, Z. A specific color reaction of methylpentoses and a .vi^jw spectrophotometric micromethod for their determination / Z. Dische, L. B. ' a Shettles // J. Biol. Chem. - 1948. - V. 175. - № 2. - P. 595-603. -

61. Distribution of O-glycosylhydrolases in marine invertebrates. Enzymes of the marine mollusk Littorinakurila that catalyze fucoidan transformation/ M. I. Kusaykin [et al.] // Biochemistry (Mose). - 2003. - V. 68.-№3.P. 317-324.

62. Efficient production and purification of extracellular 1,2-alpha-L-fucosidase of Bacillus sp. K40T / Y. Kurimura [et al.] // Biotechnol Biochem. -1995. - V. 59. - № 4. - P. 589-594.

63. Enzymatic synthesis of fucose-containing disaccharides employing the partially purified alpha-L-fucosidase from Penicillium multicolor / Farkas E [et. al.] // Carbohydr Res. - 2000. - V. 328(3). - P.293-299.

64. Fucose: biosynthesis and biological function in mammals / D. J. Becker, J. B. Lowe // Glycobiology. - 2003. - V. 13. - №13. - P. 41-53.

65. Fucoidan: structure and bioactivity / B. Li [et al.] // Molecules. -2008. - V. 13. - № 8. - P. 1671-1695.

66. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystisutricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies / N. M. Ponce [et al.] // Carbohydr Res.- 2003. - V. 338(2). - P. 153-165.

67. Giroldo, D. An extracellular sulfated fucose-rich polysaccharide produced by a tropical strain of Cryptomonas obovata (Cryptophyceae) / D. Giroldo, A.A.H. Vieira // Journal of Applied Phycology. - 2002. - V. 14. - № 3 8921-8971.

68. Hacking. A.J. Disruption of the fucose pathway as a consequence of genetic adaptation to propanediol as a carbon source in Escherichia coli / A.J. Hacking, E.C. Lin // J. Bacteriol. - 1976. - V. 126. - P. 1166-1172.

69. Harwood A.J. Basic DNA and RNA Protocols Methods in Molecular Biology / Humana Press, 1996. - P. 528.

70. Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium, Formosa algae / Silchenko AS [et. al.] // Mar Drugs. -2013. -V. 11(7).-P. 2413-2430.

71. Identification of an archaeal alpha-L-fucosidase encoded by an interrupted gene. Production of a functional enzyme by mutations mimicking programmed -1 frameshifting / Cobucci-Ponzano B. [et. al.] // J Biol Chem. -2003.-V. 278.-№ 17.-P. 14622-14631.

72. Induction of hepatocyte growth factor by fucoidan and fucoidan-derived oligosaccharides / K. Fukuta, T. Nakamura // J Pharm Pharmacol. -2008. - V. 60. - № 4. - P. 499-503.

73. In vitro measurement of the impact of human milk oligosaccharides on the faecal microbiota of weaned formula-fed infants compared to a mixture of prebiotic ructooligosaccharides and galactooligosaccharides / Q. Shen [et al.] // Lett. Appl. Microbiol. - 2011. - № 52.-P. 337-343.

74. In vitro antioxidant properties of crude extracts and compounds from brown algae / Balboa EM [et al.] // Food Chem. - 2013. - V. 138(2-3). -P. 1764-1785.

75. Intra, J. An a-L-Fucosidase Potentially Involved in Fertilization Is Present on Drosophila Spermatozoa Surface / J. Intra, F. Cenni, M.-E. Perotti // Molecular reproduction and development. - 2006. - V. 73. - P. 1149-1158.

76. Isolation and characterization of marine bacterial strain degrading fucoidan from Korean Undaria pinnatifida Sporophylls / W.J. Kim [et al.] // J Microbiol Biotechnol. - 2008. - V. 18. - № 4. - P. 616-623.

77. Isolation and characterization of a sulfated polysaccharide from the brown alga Sargassum patens and determination of its anti-herpes activity / W. Zhu [et al.] // Biochem Cell Biol. - 2003. - V. 81(1). - P. 25-33.

78. Jones N.C. An Introduction to Bioinformatics Algorithms (Computational Molecular Biology) / Jones N.C., Pevzner P.A. // MIT Press, 2004. - p. 448.

79. Kaplan, D. Chelating Properties of Extracellular Polysaccharides from Chlorella spp. / D. Kaplan, D. Christiaen, S. Arad // Applied and environmental microbiology. - 1987. - P. 2953-2956.

80. Katayama T. Molecular1 Cloning and Characterization of Bifidobacterium bifidum 1,2-a-L-Fucosidase (AfcA), a Novel Inverting Glycosidase (Glycoside Hydrolase Family 95) / T. Katayama, A. Sakuma, T. Kimura // Journal of Bacteriology. - 2004. - V. 15. - P. 4885-4893.

81. Klotzko A.J. Cloning Sourcebook / Oxford University Press. -2003.-P. 376.

82. Kochibe, N. Purification and properties of alpha-L-fucosidase from Bacillus fulminans / N. Kochibe // J. Biochem. - 1973. - V. 74. - P. 11411149.

83. Lange K. Mathematical and Statistical Methods for Genetic Analysis / Springer-Verlag, 2002. - P. 384.

84. Larson, G. Degradation of human intestinal glycosphingolipids by extracellular glycosidases from mucin-degrading bacteria of the human fecal flora / G. Larson, P. Falk, L.C. Hoskin // J. Biol. Chem. - 1988. - V. 263. - P. 10790-10798.

85. Leukocyte Extravasation: An Immunoregulatory Role for a-L-Fucosidase / Ali S. [et al.] // The Journal of Immunology. - 2008. - V. 181. - P. 2407-2413.

86. Lim, B.L. Purification, structural characterization, and antioxidant activity of antioxidant substance from the red seaweed / B.L. Lim, I.H. Ryu//J Med Food.-2009.-V. 12. -№ 2.-P. 442-451.

87. L-Fucosidases: Exoglycosidases with Unusual Transglycosylation Properties, / O. Berteau, J.Bielicki, A. Kilonda // Biochemistry. - 2004. - V. 43. - P. 7881-7891.

88. Lutjen, P. A role for fucose in human spermatozoa pellucida recognition / P. Lutjen, M. Witt, Hoy // Clin. Reprod. Fertil. - 1986. -V.4.- № 2. -P. 185-186.

89. Mild acid hydrolysis of sulfated fucans: a selective 2-desulfation reaction and an alternative approach for preparing tailored sulfated oligosaccharides/ V. H. Pomin [et al.] // Glycobiology. - 2005. - V. 15. - №12. - P.1376-1385.

90. Miura, T. Purification and characterization of extracellular 1,2-alpha-L-fucosidase from Bacillus cereus / T. Miura, K. Okamoto, H. Yanase // J BiosciBioeng. - 2005. - V. 99. - № 6. - P. 629-635.

91. Molecular cloning and expression of GDP-D mannose-4,6-dehydratase, a key enzyme for fucose metabolism defective in Lecl3 cells / C. Ohyama [et al.] // J. Biol. Chem. - 1998. - V. 273. - P. 14582-14587.

92. Om, P. Bahl Glycosidases of Aspergillus niger. Purificationand general properties of 1,2-L-ficosidase / Bahl Om P. // J. Biol. Chem. - 1970. -V. 245.-P. 299-304.

93. Optimization of glycosidases production by Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T) / Y.V. Alexeeva [et al.] // Lett Appl Microbiol. -2002. - V. 35. - № 4. - P. 343-346.

94. Pat. № 090631. Fucoidan-derived oligosaccharide. S. Fujikawa [et. al.]. 2008.

95. Pat. № CN1763212. Process for preparing fucoidan by enzymatic hydrolysis of brown algae.

96. Pat. № KR20100014846. Fucoidan-derived oligosaccharide.

97. Pat. № US5637490. Alpha -1,3/4-fiicosidase gene.

98. Pat. № MX2012006944. Fucose-containing bacterial biopolymer.

99. Pat. № US5372937. Process for producing an oligosaccharide compound by using glycosidases from a mollusc.

100. Pat. № W02013046181. New synthesis of fucose.

101. Pat. № JP2000351790. Production of fucose-containing oligosaccharide, or its composition and fucose-containing oligosaccharide or its composition.

102. Pat. № 054087. Degradation of brown alga-derived fucoidan oh. K. Duk. 2008.

103. Pat. № 017215. Endofucanases and method using same for preparing fuco-oligosaccharides from fucanes , bacterium produsing endofucanases and uses of fuco-oligosaccharides for plant protection. 2000.

104. Pat. № 095427. Composition for prevention or theatment of thrombosis. L. Hiebert, T. Sakai, I. Kato. 2005.

105. Pat. № 091568. Cosmetic composition of two polysaccharides based on fucose and rhamnose. J.L. Gesztesi. 2004.

106. Pereira, M. S.Mild acid hydrolysis of sulfated fucans / M.S. Pereira, P.A.S.Mourâo // Glycobiology. - 2005. - V. 15. - № 12. - P. 13761385.

107. Pharmacological properties of fucose. Applications in age-related modifications of connective tissues/ G. Péterszegi[et. al] // Biomedicine & Pharmacotherapy. -2003. - V. 57. - P. 240-245.

108. Primrose S.B. Principles of Gene Manipulation / Primrose S.B., Twyman R.M., Old R.W. - Blackwell Science.: 2002.- P. 390.

109. Production of GDP-L-fucose, L-fucose donor for fucosyloligosaccharide synthesis, in recombinant Escherichia coli / S. G. Byun [et al.] //ApplMicrobiolBiotechnol. - 2007. - V. 74. - № 4. - P. 768-775.

110. Protein estimation with folin phenol reagent / O.H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. - № 1. - P. 265 - 275.

111. Purification and characterization of alpha-L-fucosidases from Streptomyces sp. OH11242 / Y. Goso [et al.] // Comp BiochemPhysiol B BiochemMol Biol. - 2001. - V. 130. - № 3. - P. 375-383.

112. Purification and characterization of alpha-L-fucosidase from Bacillus circulans grown on porcine gastric mucin / Tsuji Y [et. al.] // J Biochem. - 1990.- V. 107(2). - P. 324-330.

113. Purification of glycoside hydrolases from Bacteroides fragilis / Berg J.O, Lindqvist L, Nord C.E // Appl Environ Microbiol. - 1980. - V. 40(1). - P. 40-47.

114. Purification of alpha-L-fucosidase from various sources by affinity chromatography / Jain RS [et. al.] // J Chromatogr. - 1977. - V. 139(2). -P. 283-290.

115. Rapley R. PCR Sequencing Protocols Methods in Molecular Biology / Humana Press, 1996. - p. 236.

116. Reinikainen T., Eds. Foundation for biotechnical and industrial fermentation research. Helsinki. - 1994. - P. 153-158.

117. Recombinant DNA Part I. Methods in Enzymology / Elsevier Science, 1993.-p. 740.

118. Ricken, J. Investigation of the metabolism of L-fucose in aortic tissue and cultured arterial wall cells / J. Ricken, M. Herting, P. Vischer // Biochem. Soc. Trans. - 1990. - V. 18. - P. 963-964.

119. Rodriguez-Diaz, J. Utilization of natural fucosylated oligosaccharides by three novel alpha-L-fucosidases from a probiotic Lactobacillus casei strain / J. Rodriguez-Diaz, V. Monedero, M.J. Yebra // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V. 77. - P. 703-705.

120. Role of unusual O-glycans in intercellular signaling /K.B.Luther, R.S. Haltiwanger// The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. -2009.-V. 41.-P.1011- 1024.

121. Sakai, T. A marine strain of flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan/ T. Sakai, H. Kimura, I. Kato // Mar Biotechnol (NY). -2002. - V. 4. - №4. - P. 399-405.

122. Sambrook J. Molecular cloning: Laboratory manual / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 452 p.

123. Sano, M. Purification and characterization of alpha-L-fucosidase from Streptomyces species / M. Sano, K. Hayakawa, I. Kato // JBiol Chem. -1992. - V. 267. - № 3. - P. 1522-1527.

124. Segal, S. On the biosynthesis of L-fucose and L-fucose metabolism in man / S. Segal, Y.J. Topper // Biochim. Biophys. Acta. - 1960. -V. 42.-P. 147-151.

125. Setlow J.K. Genetic Engineering: Principles and Methods / Springer-Verlag, 2005. - P. 262.

126. Schmidt F. Biochemistry / John Wiley & Sons, 2000. - P. 266.

127. Starkey M.P. Genomics Protocols Methods in Molecular Biology / Starkey M.P., Elaswarapu R. // Humana Press, 2001.-p. 560.

128. Stereoselective inhibition of alpha-L-fucosidases by N-benzyl aminocyclopentitols / Blaser A, Reymond JL // Org Lett. - 2000. - V. 2(12). -P. 1733-1736.

129. Structure and anti-dengue virus activity of sulfated polysaccharide from a marine alga / K. I. Hidari [et al.] //BiochemBiophys Res Commun. - 2008. - V. 376. -№ l.-P. 91-95.

130. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum / U. Adhikari [et al.] //Phytochemistry. - 2006. -V. 67. - P. 2474—2482.

131. Structures of oligosaccharides derived from Cladosiphon okamuranus fucoidan by digestion with marine bacterial enzymes / T. Sakai [et al.] // Mar Biotechnol (NY). - 2003. - V. 5. - № 6. - P. 536-544.

132. Structural analysis of heteropolysaccharide from Saccharina japonica and its derived oligosaccharides / Jin W [et al.] // Int J Biol Macromol. -2013. - V. 62.-P. 697-704.

133. Structural and kinetic analysis of Escherichia coli GDP-mannose 4,6 dehydratase provides insights into the enzyme's catalytic mechanism and regulation by GDP-fucose / J.R. Somoza [et al.] // Structure Fold Des. - 2000. -V. 8.-P. 123-135.

134. Structural basis of the catalytic reaction mechanism of novel 1,2-alpha-L-fucosidase from Bifidobacterium bifidum / M. Nagae [et al.] // J Biol Chem. - 2007. - V. 282. - № 25. - P. 18497-18509.

135. Structural analysis of fucoidans / M.I. Bilan, A.I. Usov // Natural Product Communications. - 2008. - V. 3. - № 10. - P. 1639-1648.

136. Sulfated galactofucan from Lobophora variegata: anticoagulant and anti-inflammatory properties V.P. Medeiros [et al.] // Biochemistry (Mose).

- 2008. - V. 73.-№9.-P. 1018-1024.

137. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide / O. Berteau, B. Mulloy // Glycobiology. -2003. - V. 13. - № 6. - P. 29R-40R.

138. Talyshinsky, M.M. Anti-viral activity of red microalgal polysaccharides against retroviruses / M.M. Talyshinsky, Y.Y. Souprun, M.M. Huleihel // 2002 Cancer Cell International. - 2002. - V. 2. - P. 8.

139. The alpha-L-fucosidase from Sulfolobus solfataricus / Cobucci-Ponzano B [et. al.] // Extremophiles. - 2008. - V.12. - № 1. - P.61-68.

140. The gene of an archaeal alpha-L-fucosidase is expressed by translational frameshifting / Cobucci-Ponzano B. [et. al.] // Nucleic Acids Res.

- 2006. - V.34. - № 15. - P. 4258 - 4268.

141. The purification and characterization of alpha-L-fucosidase from the hepatopancreas of Octopus vulgaris / D'Aniello A [et. al.] // J Biochem. -1982. - V. 91(3). - P. 1073-1080.

142. Tsai C.S. Biomacromolecules: Introduction to Structure, Function and Informatics / Springer-Verlag, 2006. - p. 740.

143. Two distinct alpha-L-fucosidases from Bifidobacterium bifidum are essential for the utilization of fucosylated milk oligosaccharides and glycoconjugates/ H. Ashida, et. al. // Glycobiology. - 2009. - № 19. - P. 1010-1017.

144. White B.A. PCR Cloning Protocols; From Molecular Cloning to Genetic Engineering. Methods in Molecular Biology / Humana Press, 1996. -P. 512.

145. Zapopozhets, T.S. Antibacterial and immunomodulating activity of fucoidan / T.S. Zapopozhets, N.N. Besednova, I.N. Loenko //Antibiot. Khimioter- 1995. -V. 40.-P. 9-13.