Разработка биосовместимого композиционного матриксного гидрогеля для реконструктивной терапии травм центральной нервной системы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат биологических наук Щеблыкина, Анна Владимировна

• Щеблыкина, Анна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Щеблыкина, Анна Владимировна

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции внеклеточного матрикса

1.2. Взаимодействие внеклеточного матрикса и клеток

1.3. Особенности внеклеточного матрикса ниш стволовых клеток

1.4. Матрикс-опосредованное управление ростом и дифференцировкой клеток

1.5. Внеклеточный матрикс центральной нервной системы

1.6. Искусственные матриксные материалы для нейротрансплантации

1.7. Реконструктивная терапия спинальных травм

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выделение и очистка биополимеров - компонентов матриксных материалов

36

2.1.1. Получение и анализ модифицированных пектинов

2.1.2. Выделение коллагена I типа

2.1.3. Выделение и очистка димеров коллагена IV типа

2.1.4. Маркирование NCl-гексамеров коллагена IV флуоресцеина-5-изотиоцианатом

2.1.5. Определение содержания белка микробиуретовым методом

2.1.6. Анализ белковых препаратов с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) 40 2.1.7; Исследование морфологии молекул биополимеров методом атомно-силовой микроскопии

2.2. Приготовление матриксных материалов

2.2.1. Приготовление матриц на стеклянной подложке

2.2.2. Приготовление матриксных материалов в форме гидрогелей

2.2.3. Приготовление коллагеновых мембран

2.3. Исследование свойств матриксных материалов in vitro

2.3.1. Получение и культивирование нейральных стволовых клеток

2.3.2. Культивирование нейральных стволовых клеток на поверхности матриксных материалов

2.4. Исследование свойств матриксных материалов in vivo

2.4.1. Подкожная имплантация матриксных материалов

2.4.2. Имплантация матриксных гидрогелей в качестве консолидирующих субстратов в модели травмы спинного мозга

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Физико-химические свойства компонентов матриксных материалов

3.1.1. Анализ препаратов модифицированных пектинов

3.1.2. Анализ препарата коллагена I типа

3.1.3. Анализ препарата NCl-гексамеров коллагена IV

3.2. Исследование функциональных свойств компонентов матриксных материалов

3.2.1. Анализ поведения нейральных стволовых клеток на полисахаридных и белковых субстратах

3.2.2. Анализ поведения нейральных стволовых клеток при культивировании на микроструктурированных матрицах

3.3. Разработка композиционного матриксного материала

3.4. Свойства матриксных гидрогелей in vitro

3.5. Исследование биосовместимости биополимерных матриксов in vivo

3.6. Исследование функциональных свойств матриксных гидрогелей на модели

4.1. Модифицированные пектины обратимо ингибируют дифференцировку нейральных стволовых клеток в культуре

4.2. Использование микроструктурированных матриксных материалов для создания имплантируемых конструкций и анализа свойств биополимеров in vitro

4.3. Разработка композитного матриксного гидрогеля

4.4. Гидрогели на основе пектинов и коллагенов являются биосовместимыми медленно деградируемыми матриксными композициями

4.5. Имплантация композиционого гидрогеля в качестве консолидирующего субстрата в модели острой травмы спинного мозга способствует нейрорегенерации

травмы спинного мозга.

4. обсуждение

77

заключение выводы

список литературы

104

113

114

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка биосовместимого композиционного матриксного гидрогеля для реконструктивной терапии травм центральной нервной системы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Травматические повреждения центральной нервной системы (ЦНС) является причиной значительных изменений в качестве жизни человека. Это касается не только основных физиологических процессов (нарушение двигательных функций, функции тазовых органов, дыхательной, сердечно-сосудистой системы, трофических нарушений), но и кардинальным образом изменяет качество жизни пациента, его семьи, требует адаптации к совершенно новым социальным, экономическим, профессиональным и юридическим условиям существования.

Значительную долю среди травм ЦНС занимают травматические повреждения спинного мозга (ТПСМ). Исследование эпидемиологии травмы спинного мозга в период с 1995 по 2006 гг. выявило от 10 до 83 случаев на 1 млн. жителей в мире (Wyndaele, Wyndaele, 2006). В Соединенных штатах эта цифра составляет около 40 случаев на миллион, примерно 10-15 тыс. случаев в год (National Spinal Cord Injury Statistical Center).

В России наблюдается неуклонный рост доли повреждений спинного мозга в структуре сочетанной травмы. По данным М.А. Леонтьева (Леонтьев, 2003), за последние 70 лет количество больных с позвоночно-спинномозговой травмой (ПСМТ) возросло в 200 раз, и в России ее ежегодно получают более 8 тыс. человек. В 10—12% случаев травма спинного мозга затрагивает два и более уровней, множественные повреждения встречаются у 34% (Гринь, Яриков, 2000). Таким образом, поиск новых средств для лечения и реабилитации спинальных больных является актуальной задачей.

Восстановление утраченных функций спинного и головного мозга существующими фармакологическими средствами не представляется возможным из-за очень низкой способности нервной ткани к регенерации. В области травмы спинного мозга формируется плотный глио-мезодермальный рубец, который вместе с биохимическими ингибирующими факторами препятствует росту регенерирующих аксонов (Брюховецкий А.С., 2010). За последние годы появилось много экспериментальных работ, посвященных исследованиям восстановительной терапии тяжелых повреждений спинного мозга с помощью замещения дефекта различными клеточными трансплантатами. Изучают возможность трансплантации клеток нервной ткани: нейральные стволовые клетки (Ogawa et al., 2002), эмбриональные и феталь-ные нервные ткани (Iwanami et al., 2005); фрагменты периферических нервов (Aguayo et al., 1982; Cheng et al., 1996), шванновские клетки (Duncan et al., 1981; Kohama et al., 2001; Agudo et al., 2008), обкладочные обонятельные клетки (Li et al., 1997; Lu et al., 2002; Lima et al., 2006; Lima et al., 2010). Также активно исследуются различные типы стволовых клеток ненервного происхождения - стволовые клетки красного костного мозга (Sykova et al., 2006; Zurita et al., 2008), гемапоэтические стволовые клетки (Брюховецкий, 2010), клетки пупо-

винной крови (Park et al., 2011), индуцированные стволовые клетки (Salewski et al., 2010). Часть испытаний находится лишь на этапе экспериментальных исследований, в то время как другие уже перешли к стадии клинических испытаний (Feron et al., 2005; Mackay-Sim, John, 2011 - OECs). Однако общей проблемой, возникающей при трансплантации любого типа клеток в область дефекта спинного мозга, является их массовая гибель из-за крайне агрессивной среды, в которую они попадают (Zhong et al., 2010). Сегодня многие ученые сходятся во мнении, что для того чтобы обеспечить жизнеспособность, клетки необходимо трансплантировать вместе с матриксом (Eberly, 2011). Матрикс в составе тканеинженерной конструкции выполняет несколько функций: физически восстанавливает целостность мозга, создает благоприятную среду для имплантированных клеток, служит системой адресной доставки лекарств (противовоспалительных агентов, нейтротрофических факторов) (Straley et al., 2010).

В связи с этим в качестве перспективных инструментов управляемого реконструктивного нейрогенеза рассматривается использование различных биодеградируемых полимерных имплантатов, выполняющих сложную формообразующую, заместительную и трофическую, а также индукторную роль в реализации репаративных процессов. В качестве имплантатов используют природные полимеры: гиалуроновая кислота (Wei et al., 2010; Park et al., 2010b), коллаген (Li et al., 2009; Yoshii et al., 2009; Брюховецкий и др., 2008) матригель (Pinzon et al., 2001; Xiao et al., 2005); синтетические материалы: полиакриловая кислота (Hejcl et al., 2008; Woerly et al., 2004), полимолочная кислота (Baumann et al., 2010), поли-этиленгликоль (Luo, Shi, 2007). В экспериментах по реконструкции спинного мозга матрикс имплантируют как самостоятельный матрикс или как основу для тканеинженерной конструкции. Вместе с матриксом в область дефекта спинного мозга имплантируют клетки нервной ткани - шванновские, обкладочные обонятельные, эмбриональные, гемапоэтические стволовые

Несмотря на большое число экспериментальных исследований, посвященных реконструктивной терапии спинного мозга, использование самых разнообразных природных и синтетических полимеров, их модификацию, оптимальный матрикс для регенерации спинного мозга не разработан. Природные полимеры обладают слишком быстрой деградацией, в результате в области травмы формируется плотный соединительнотканный рубец, который не могут преодолеть аксоны (Marchand, Woery, 1990). Синтетические полимеры не способны в полной мере имитировать естественный внеклеточный матрикс даже при условии их модификации адгезионными сайтами. Поэтому в данный момент исследования в области разработки полимерных матриксов для реконструкции спинного мозга направлены на поиск таких материалов, которые будут способны поддерживать рост регенерирующих аксонов,

дифференцировку имплантированных клеток во все типы и при этом сохраняться в области травмы длительный срок, достаточный для восстановления собственных тканей реципиента.

Такими материалами, по нашему мнению, могут стать композиционные материалы на основе растительных углеводов и животных белков. Растительные углеводы близки к животным по своей структуре и общим свойствам, таким как способность образовывать высокогидрофильное основное вещество внеклеточного матрикса. Однако ввиду отсутствия в организме животных специфических ферментов, этот матрикс будет медленно деградируе-мым. Включение белковых компонентов придаст матриксу адгезионные и индукторные свойства, будет способствовать росту аксонов и восстановлению функций спинного мозга.

Целью данной работы явилась разработка имплантируемых биосовместимых мат-риксных гидрогелей для реконструктивной терапии травм центральной нервной системы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать препараты биополимеров внеклеточного матрикса, пригодные для создания биосовместимых композиционных матриксных гидрогелей медицинского назначения.

2. Провести первичную оценку свойств препаратов биополимеров на культурах ней-ральных стволовых клеток эмбрионального мозга крыс.

3. Апробировать получение микроструктурированных матриксных материалов с помощью оригинальной микроинжекторной установки.

4. Разработать состав и схему приготовления имплантируемого композиционного матриксного гидрогеля для реконструктивной терапии спинальной травмы.

5. Провести оценку биосовместимости композиционного матриксного гидрогеля.

6. Оценить возможность использования разработанного композиционного матрикса на модели острой спинальной травмы крыс в качестве консолидирующего нейро-репаративного геля, имплантируемого при реконструкции мозга в области травматического повреждения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Препараты модифицированных пектинов являются перспективным биоискусственным

внеклеточным матриксом, который подавляет спонтанную дифференцировку нейраль-

ных стволовых клеток в культуре, сохраняя клетки, способные к дальнейшему росту и

дифференцировке, что представляет интерес для биомедицинских клеточных технологий.

2. Композиционный гидрогель на основе препаратов модифицированного пектина, колла-

гена I типа, ЫС1-гексамеров коллагена IV типа является биосовместимым матриксным

материалом, перспективным для применения в качестве консолидирующего нейроре-паративного геля в реконструктивной терапии травм центральной нервной системы.

Научная новизна. В работе продемонстрирована возможность применения стандартизованных препаратов модифицированных пектинов в качестве компонентов матриксных материалов, поддерживающих жизнеспособность нервных клеток, и, в сочетании с другими компонентами, способствующих восстановлению нервных проводников при имплантации в область острой травмы спинного мозга. Для создания имплантируемых композиционных матриксных гидрогелей впервые использованы препараты ЫС1-гексамеров коллагена IV типа птиц, для которых продемонстрирована предпочтительная адгезия и направленный рост культивируемых нейральных стволовых клеток эмбрионального мозга крыс. На основе модифицированных пектинов, ЫСЛ-гексамеров коллагена IV типа и коллагена I типа с помощью оригинальной установки многоканального инжекторного напыления разработаны микроструктурированные матрицы, способные направлять рост культивируемых нейральных клеток. Разработаны оригинальные имплантируемые композиционные матриксные гидрогели, способствующие восстановлению проводниковых функций мозга, исследованные на модели острой спинальной травмы крыс.

Теоретическая и практическая значимость. Данные, полученные в работе, имеют теоретическую значимость для понимания процессов взаимодействия клеток и внеклеточного матрикса, а также пролиферации и дифференцировки клеток, опосредованные этими взаимодействиями. Практическая ценность работы заключается в разработке состава и способа приготовления матриксных гидрогелей, перспективных для применения в регенеративной медицине на этапах культивирования стволовых клеток и в качестве имплантатов для лечения заболеваний и травм нервной системы. Были разработаны лабораторные регламенты получения биополимеров - компонентов матриксных материалов и лабораторный регламент получения композиционного матриксного гидрогеля. Разработанные материалы прошли первичные доклинические испытания, показавшие их безопасность и эффективность, и могут быть рекомендованы лля дальнейшего изучения в качестве матриксных материалов в области регенеративной медцины.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (23-26 октября 2010 г., Санкт-Петербург), Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (14-15 октября 2011 г., Москва), Школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (17-21 октября 2011 года, Санкт-Петербург), годичных научных конференциях ИБМ ДВО РАН (2009-2011 гг.).

По результатам исследований опубликовано 10 печатных работ по теме диссертации. Из них 7 публикаций в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций, 4 публикации из которых являются полнотекстовыми статьями, содержащими оригинальные иллюстративные материалы, которые представляют основные результаты диссертационной работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 130 страницах печатного текста, иллюстрирована 29 рисунками и содержит 5 таблиц. Список литературы включает 228 источников.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке государственных контрактов с Минобрнауки Российской Федерации №02.740.11.0292, №02.740.11.0450, №16.512.11.2178.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структура и функции внеклеточного матрикса

Значительную часть объема тканей занимает внеклеточное пространство, заполненное сложной сетью макромолекул, образующих внеклеточный матрикс (ВКМ). В соединительных тканях внеклеточный матрикс часто занимает больший объем, чем окружаемые им клетки, и определяет физические свойства ткани. На границе между эпителиальными и соединительными тканями матрикс образует базальную мембрану, играющую важную роль в контролировании клеточного поведения. ВКМ состоит из множества макромолекул, которые секретируются в виде мономеров клетками во внеклеточное пространство, где происходит их полимеризация, сборка, поперечное сшивание, что в итоге придает ВКМ организованную структуру.

Основу внеклеточного матрикса составляют два класса макромолекул: полисахариды, относящиеся к классу гликозаминогликанов, которые чаще всего ковалентно пришиты к белкам в виде протеогликанов, и белки, такие как коллаген, эластин, фибронектин и лами-нин.

Гликозаминогликаны - неразветвленные полисахариды, состоящие из повторяющихся дисахаридных единиц (Gandhi, Mancera, 2008). Один из Сахаров - это N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин, чаще всего сульфатированный. Второй сахар представлен уроновой кислотой (глюкуроновой или идуроновой). При физиологическом рН все карбоксильные и сульфатные группы депротонированы, что придает гликозаминоглика-нам сильный отрицательный заряд. Такая полианионная структура позволяет притягивать огромное количество молекул воды. В результате гликозаминогликаны формируют гель -основу внеклеточного матрикса. Полисахаридный гель препятствует силам сжатия, в то же время не мешает быстрой диффузии питательных веществ, метаболитов, гормонов, а также перемещению самих клеток.

В зависимости от природы Сахаров, типа связей между ними, количества и расположения сульфатных групп различают четыре типа гликозаминогликанов: гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарансульфат и кератансульфат (Alberts et al, 2008).

Самым простым из гликозаминогликанов, хотя и самым нетипичным, является гиалуроновая кислота. Она не содержит сульфатированных Сахаров, все дисахаридные единицы идентичны. Длина полисахаридных цепей достигает тысяч мономеров, и они никогда не бывают ковалентно связаны с белками. В отличие от большинства гликозаминогликанов, которые синтезируются внутри клетки и выводятся путем экзоцитоза, гиалуроновая кислота

синтезируется ферментом, встроенным в плазматическую мембрану, непосредственно во внеклеточное пространство (DeAngelis, 1999).

Гиалуроновая кислота в различных количествах содержится в тканях и жидкостях взрослых организмов и особенно обильна в эмбриональных тканях. В периоды клеточной миграции она образуется в больших количествах, а после прекращения миграции избыток ее разрушается ферментом гиалуронидазой. Гиалуронат принимает активное участие в заживлении ран и выполняет роль лубриканта в суставных сумках

Остальные гликозаминогликаны существуют в виде протеогликанов, то есть полиса-харидные цепи ковалентно присоединены к сердцевинному белку. Разнообразие сердцевинных белков, количества и типа цепей гликозаминогликанов, присоединенных к нему, затрудняет классификацию протеогликанов. В целом их можно определить как группу высо-когликозилированных биополимеров, имеющих белковую часть (полисахариды в которых могут составлять до 95% по весу), чьи функции определяются структурой и сердцевинного белка, и полисахаридных цепей.

Протеогликаны способны формировать гели с различным размером пор и зарядом, что позволяет им работать как селективные сита, регулирующие движение молекул и клеток. Так, например, перлекан, относящийся к классу гепарансульфат протеогликанов, выполняет эту функцию в базальной мембране почечных клубочков (Farach-Carson, 2007).

Протеогликаны могут объединяться в огромные комплексы с гиалуроновой кислотой, фибриллярными белками, например коллагеном, или с такой сложной белковой сетью, как базальная мембрана. Молекулы аггрекана - главного протеогликана хрящевой ткани -соединяются с гиалуроновой кислотой в конгломераты размером с бактерию (Alberts et al., 2008). Декорин необходим для формирования фибрилл коллагена (Danielson et al., 1997). Мыши, не синтезирующие этот протеогликан, имеют тонкую кожу, не выдерживающую натяжения.

Не все протеогликаны секретируются во внеклеточное пространство. Некоторые из них являются интегральными компонентами плазматической мембраны, например синдека-ны (Carey, 1997). Такие протеогликаны работают как ко-рецепторы, участвуя в адгезии клеток и запуская ответ на некоторые сигнальные молекулы. Например, полисахаридные цепи гепарансульфат-протеогликанов связываются с фактором роста фибробластов, стимулирующего пролиферацию множества типов клеток. Это приводит к олигомеризации молекул фактора роста фибробластов, что делает возможным взаимодействие его с клеточным рецептором - трансмембранной тирозин киназой (Spivak-Kroizman et al., 1994).

Общим свойством белков внеклеточного матрикса является наличие специфической доменной структуры. Определенные домены повторяются в разных компонентах ВКМ.

Некоторые из этих доменов входят в состав клеточных рецепторов или даже внутриклеточных белков.

Наиболее обильными белками во внеклеточном матриксе являются коллагены, которые составляет до 25% от общего веса белка в организме человека. Отличительной чертой молекул коллагенов является длинная, жесткая, трехцепочечная спиральная структура. Каждая из цепей характеризуется последовательностью аминокислотных триплетов Gly-X-Y, где Y - чаще всего пролин. Существует не менее 27 типов коллагенов (Ricard-Blum 2005). Они делятся на несколько групп: фибриллярные (коллагены I, II, III, V, XI типов), ассоциированные с фибриллами (IX, XII, XIV, XVI, XIX), связанные с базальными мембранами (коллагены IV, VIII, XV, XVIII), (транс)мембранные типы (XIII, XVII, XXV) и другие типы коллагенов, формирующие специализированные структуры в различных тканях.

Внеклеточный матрикс содержит несколько адгезивных гликопротеинов, которые связываются и с клетками, и с другими макромолекулами матрикса, способствуя прикреплению клеток к матриксу. Из них лучше всего охарактеризован фибронектин. Фибронектин синтезируется в виде димеров, связанных дисульфидными связями, но после взаимодействия со специфическими интегриновыми рецепторами на поверхности клетки изменяет свою конформацию, открывая сайты, инициирующие полимеризацию его в фибриллы (Magnusson, Mosher, 1998). Фибронектин существует в виде двух форм: растворимая димер-ная форма - фибронектин плазмы, способствует свертыванию крови, заживлению ран и фагоцитозу, и труднорастворимая фибриллярная форма фибронектина во внеклеточном матриксе (матриксный фибронектин) (Hocking et al., 2000).

Фибронектин - многофункциональная молекула, в которой различные глобулярные домены играют разную роль, так как связываются с различными молекулами - коллагеном, гепарином, фибрином или интегриновыми рецепторами (Magnusson, Mosher, 1998). Таким образом, фибронектин участвует в организации матрикса и способствует прикреплению к нему клеток. Домен, ответственный за связывание с клеткой, содержит специфическую три-пептидную последовательность (Arg-Gly-Asp, или R-G-D). RGD- последовательность содержится не только в фибронектине - она является общей для многочисленных внеклеточных адгезивных белков и узнается целым семейством гомологичных рецепторов клеточной поверхности, связывающих эти белки. Фибронектин важен не только для клеточной адгезии, но и для миграции клеток. В зародышах беспозвоночных и позвоночных он, по-видимому, во многих случаях направляет миграцию. Например, большие количества фибронектина находятся вдоль пути передвижения клеток проспективной мезодермы при гаст-руляции у амфибий (Boucaut et al., 1985). Мыши, не синтезирующие фибронектин, погибают

в пренатальный период из-за дефектов в нервной трубке и краниальных складках, недоразвития кровеносной системы, мезодермы, угнетения гемопоэза (George et al., 1993).

Ламинин является главным образом компонентом базальных мембран и существует в виде нескольких форм, являющихся продуктами родственных генов. Ламинин состоит из трех цепей а, р и у. Они объединяются в форме креста в 15 различных молекул (Miner et al., 2004), название которых соответствует составу цепей, например ламинин al(31у1 - первый ламинин, выделенный из EHS-опухолей (Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma), богатых белками внеклеточного матрикса (Timpl et al., 1979). Последовательность RGD входит в состав молекулы ламинина, также как и другие специфические последовательности, такие как PDSGR, YIGSR, и IKVAV, которые распознаются клеточными рецепторами (Timpl et al., 2000).

Ламинины участвуют в образовании базальных мембран (Yang et al., 1998). Совместно с коллагеном IV типа, ламинин-1 является основным составляющим базальной мембраны (Timpl, Brown, 1994). Он стабилизируются другими компонентами ВКМ, такими как нидо-ген, гепарансульфат протеогликан, агрин, перлекан, фибулин и ВМ-40 - антиадгезивный гликопротеин, участвующий в ремоделировании ткани.

Гликопротеин тромбоспондин имеет сайты связывания с ламинином, коллагенами и фибриногеном (Chen et al., 2000). Во внеклеточном матриксе встречается в ассоциации с фибронектином или гепарансульфат-протеогликаном. В зависимости от клеточного типа тромбоспондин может стимулировать или ингибировать адгезию клеток (Murphy-Ullrich, 2001). Витронектин подобно фибронектину встречается в двух формах: растворимой в крови и фибриллярной форме во внеклеточном матриксе. Витронектин связывается с рецепторами клеточной поверхности, коллагенами, гепарином и ингибитором активатора плазмино-гена (Preissner, 1991).

Помимо уже описанных выше во внеклеточном матриксе встречаются и другие адгезивные гликопротеины со сходными функциями. Тенасцин, например, содержит несколько повторов, характерных для фибронектина и эпидермального фактора роста (Swindle et al., 2001). К гликопротеинам, содержащим RGD-последовательность, относятся хондронектин, остеопонтин и фибриллин (Rosso, 2004).

Эластические волокна внеклеточного матрикса состоят из аморфного белка - эластина. Стенки сосудов, кожа, легкие богаты этим белком.

Функции ВКМ. Внеклеточный матрикс играет критическую роль в развитии тканей и органов, их функционировании и регенерации. Мутации в генах, кодирующих белки внеклеточного матрикса, являются причиной серьезных наследственных заболеваний. Многие приобретенные заболевания, такие как цинга, хроническая обструктивная болезнь легких,

рак, развиваются вследствие нарушения организации или целостности внеклеточного мат-рикса.

Структура ВКМ определяет физические свойства различных тканей: кальцинированный матрикс костей и матрикс зубов, прозрачный матрикс роговицы, канатообразный мат-рикс сухожилий, выдерживающий огромные силы натяжения. Также ВКМ регулирует поведение контактирующих с ним клеток: их развитие, миграцию, воспроизведение, форму, функционирование. Вариации в относительном количестве различных типов макромолекул матрикса и в способе их организации в матриксе создают основу для разнообразия форм внеклеточного матрикса, приспособленных к функциональным потребностям различных тканей.

Особой формой ВКМ является базальная мембрана, подстилающая слои эпителиальных клеток, окружающая мышечные волокна. Функции базальной мембраны чрезвычайно разнообразны. В почечных клубочках необычно толстая базальная мембрана работает как молекулярный фильтр, регулируя переход молекул из крови в мочу. Для этой функции, по-видимому, необходимы протеогликаны, так как их удаление с помощью специфических ферментов ведет к утрате фильтрующих свойств мембраны. Базальная мембрана может также служить избирательным барьером для клеток. Например, базальная мембрана, подстилающая эпителиальный слой, обычно предотвращает контакт фибробластов подлежащей соединительной ткани с эпителиальными клетками, но не препятствует прохождению через нее макрофагов, лимфоцитов и нервных волокон.

Базальная мембрана играет важную роль в процессе регенерации ткани после повреждения. При нарушении целости мышечной, нервной или эпителиальной ткани сохранившаяся базальная мембрана служит субстратом для миграции регенерирующих клеток.

1.2. Взаимодействие внеклеточного матрикса и клеток

Долгое время внеклеточный матрикс позвоночных считали сравнительно инертным каркасом, стабилизирующим физическую структуру тканей. Но сейчас стало ясно, что он играет значительно более активную и сложную роль в регуляции поведения контактирующих с ним клеток, влияет на их развитие, миграцию, пролиферацию, форму и метаболизм.

Клетки могут участвовать в организации секретируемых ими коллагеновых фибрилл, изменяя натяжение матрикса. Фибробласты воздействуют на выработанный ими коллаген, передвигаясь по нему и растягивая его, что способствует уплотнению его в слои и вытягиванию в волокна. Если два кусочка эмбриональной ткани с фибробластами поместить на некотором расстоянии друг от друга на коллагеновый гель, то коллаген организуется в компактную полосу ориентированных волокон, соединяющих оба эксплантата (Stopak, Harris, 1982). Затем фибробласты будут мигрировать из обоих эксплантатов вдоль этих параллель-

ных волокон. Таким образом, фибробласты влияют на расположение коллагеновых волокон, а эти волокна в свою очередь воздействуют на распределение фибробластов. Вполне возможно, что фибробласты играют сходную роль и в организации внеклеточного матрикса на макроуровне, участвуя, например, в создании сухожилий и связок, а также прочных, плотных слоев соединительной ткани, окружающих и скрепляющих большинство органов.

Цитоскелет и внеклеточный матрикс взаимодействуют через плазматическую мембрану. Макромолекулы внеклеточного матрикса оказывают поразительное воздействие на поведение клеток в культуре, влияя не только на их движение, но и на форму, полярность, метаболизм и дифференцировку. Например, клетки эпителия роговицы при росте на искусственных поверхностях производят очень мало коллагена; если же культивировать их на ламинине, коллагене или фибронектине, то они накапливают и секретируют коллаген в больших количествах.

Матрикс может также влиять на организацию цитоскелета клетки. Обычно базальные поверхности эпителиальных клеток, растущих на пластике или стекле, имеют неправильную форму, а прилегающий к ним изнутри цитоскелет дезорганизован. Но когда те же клетки растут на подложке из подходящих макромолекул внеклеточного матрикса, базальные поверхности становятся гладкими, а цитоскелет над ними - таким же упорядоченным, как в интактной ткани. Сходные результаты были получены на культурах фибробластов, подвергшихся опухолевой трансформации. Трансформированные клетки часто вырабатывают меньше фибронектина, чем нормальные культивируемые клетки, и отличаются от них поведением: например, они слабо прикрепляются к субстрату и неспособны распластываться на нем или формировать организованные внутриклеточные ассоциации актиновых филамен-тов, известных под названием волокон натяжения, или стресс-фибрилл. У некоторых из таких клеток недостаток фибронектина по крайней мере частично ответствен за их аномальное поведение: если клетки растут на матриксе из организованных волокон фибронектина, то они распластываются и формируют внутриклеточные стресс-фибриллы, лежащие параллельно волокнам внеклеточного фибронектина.

Взаимодействие между внеклеточным матриксом и цитоскелетом бывает двусторонним: внутриклеточные актиновые филаменты могут влиять на расположение секретируемых молекул фибронектина (НупеБ, Безйее, 1978). Например, в культуре в близи фибробластов волокна внеклеточного фибронектина выстраиваются по направлению смежных внутриклеточных стресс-фибрилл. Если такие клетки обработать цитохалазином, который разрушает внутриклеточные актиновые филаменты, то волокна фибронектина отделяются от клеточной поверхности. Связь между внеклеточным фибронектином и внутриклеточными актино-выми филаментами осуществляют рецепторы фибронектина.

Поскольку цитоскелет клеток способен упорядочивать секретируемые ими макромолекулы матрикса, а те в свою очередь организуют цитоскелет контактирующих с ними клеток, ВКМ может распространять упорядочивание от клетки к клетке. Таким образом, ВКМ играет центральную роль в создании и поддержании ориентации клеток в тканях и органах в процессе развития; например, параллельное расположение фибробластов и коллагеновых волокон в сухожилии могло бы частично отражать именно такие взаимодействия между клетками и матриксом.

Интегрины - главные рецепторы взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом. Прикрепление клеток к внеклеточному матриксу может осуществляться двумя способами: посредством фокальных контактов, соединяющих ВКМ с актиновыми филаментами клетки, или посредством полудесмосом, в которых элементы ВКМ взаимодействуют с промежуточными филаментами. В обоих случаях взаимодействие происходит за счет рецепторов клеточной адгезии - интегринов.

Интегрины - это гетеродимеры, состоящие из двух типов трансмембранных глико-протеиновых частиц (а и Р субъединиц) (Hynes, 2002; Humphries et al., 2006). Внеклеточная часть молекулы интегрина взаимодействует со специфическими аминокислотными последовательностями белков ВКМ - коллагена, ламинина, фибронектина, в то время как внутриклеточный домен через белки-посредники соединяется с элементами цитоскелета.

У человека известно 24 типа интегринов. 23 из них связаны с актиновым цитоскеле-том посредством белка талина. В полудесмосомах участвует специфический тип интегрина (абР4) связывающий эпителиальные клетки с ламинином базальной мембраны. Внутриклеточная часть этого интегрина взаимодействует с цитокератиновыми промежуточными филаментами через плектин и дистонин.

Многие интегриновые рецепторы связываются с последовательностью RGD, характерной для белков ВКМ (Ruoslahti, 1996). Тем не менее, они способны распознавать различные типы белков ВКМ - одни типы интегриновых рецепторов связываются преимущественно с фибронектином, другие с витронектином. Экспрессия определенного типа интегринов может быть специфична для клеточного типа (Kumar, 1998). Например, апьрз экспонированы на плазматической мембране тромбоцитов, а абР4 экспрессируются в эпителиальных клетках.

Интегрины осуществляют не только адгезию клеток, но и проведение сигнала, причем сигнализация может быть двусторонней. С одной стороны, взаимодействие интегринов с молекулами внеклеточного матрикса запускает ответные реакции в клетке: в первую очередь изменение цитоскелета. С другой стороны, следуя внутренним сигналам, клетка может регулировать степень связывания интегринов с молекулами ВКМ (Calderwood, 2004).

Особенностью интегриновых рецепторов является способность переключаться между активным или неактивным состоянием. В основе такой способности лежит аллостерическая регуляция - связывание с лигандом измененяет конформацию рецептора, что сопровождается изменениями и во внутриклеточном домене. В зависимости от клеточного типа интег-рины могут быть либо постоянно активны, например, как у эпителиальных клеток, прикрепленных к базальной мембране, либо интегриновые рецепторы активируются только в определенных ситуациях, например, при агрегации тромбоцитов или при диапедезе - миграции лейкоцитов из кровяного русла в окружающие ткани при воспалении. В отличие от рецепторов к гормонам или другим растворимым факторам, связь между интеринами и молекулами ВКМ достаточно слабая, но их концентрация на клеточной поверхности в 10-100 раз выше. Поэтому для эффективной адгезии рецепторы собираются в кластеры - клетка образует фокальные контакты с внеклеточным матриксом. Фокальные адгезионные комплексы легко визуализируются при помощи иммунофлюоресцентной микроскопии и выглядят как бляшки на окончаниях актиновых стресс-фибрилл. В состав комплексов входят интегрины, белки цитоскелета, киназы и разнообразные сигнальные молекулы. Актин-связывающие белки, колокализованные с интегринами в местах фокальных контактов, представлены а-актинином, талином, тензином, паксиллином, винкулином. Киназы, участвующие в проведение сигнала от интегриновых рецепторов, - это киназа фокальной адгезии, c-src, протен-киназа С и интегрин-связанная киназа (Yamada and Miyamoto, 1995).

Интегрины не обладают киназной активностью, но за счет связи с цитоскелетом, они способны регулировать такие важнейшие функции клетки как пролиферация, миграция, форма клетки и даже выживание. Существует правило: для того, чтобы жить и делиться, клетка должна быть прикреплена к внеклеточному матриксу. В клетках, не имеющих связей с ВКМ, запускается механизм апоптоза (Re et al., 1994).

Связь клетки с внеклеточным матриксом осуществляется также посредством неин-тегриновых рецепторов. Наиболее охарактеризованными из них являются синдеканы, которые закреплены в мембране при помощи сердцевинного белка. Внеклеточный домен этого протеогликана несет от трех до пяти цепей гепарансульфата или хондроитинсульфата, а внутриклеточный домен связан с актиновым цитоскелетом. Синдеканы обнаруживаются на плазматической мембране фибробластов в области фокальных контактов, где они модулируют взаимодействие интегриновых рецепторов с фибронектином ВКМ. Также они связывают фактор роста фибробластов и презентируют его соответствующим рецепторам на поверхности клетки. Аналогично, протеогликан плазматической мембраны бетагликан презен-тирует трансформирующий фактор роста рецепторам клетки.

Рецептор CD44 — поверхностный клеточный гликопротеин, играющий важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. CD44 присутствует на поверхности Т-лимфоцитов и B-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, гранулоцитов, эритроцитов, фибробластов, некоторых эпителиальных клеток и клеток головного мозга. Основным лигандом для CD44 является гиалуроновая кислота (Aruffo et al., 1990), но также он может связываться и с другими лигандами, такими как остеопонтин, коллаген и металло-протеиназы матрикса. CD44 принимает участие в процессах клеточной миграции и метаста-зирования. Экспрессия CD44 усиливается в клеточных линиях карциномы (Stamenkovic I., et al., 1989). Экспрессия CD44 является прогностическим признаком диффузной крупноклеточной лимфомы (Horst Е., еа, 1990).

Значительная роль во взаимодействии между матриксом и клетками принадлежит протеогликанам. Протеогликаны связываются с растворимыми сигнальными молекулами внеклеточного матрикса и усиливают или ослабляют их действие. Сигнальные молекулы могут связываться как с полисахаридными цепями протеогликанов, так и с сердцевинным белком. Например, присоединение трансформирующего фактора ß к сердцевинному белку декорина ингибирует активность ростового фактора (Dallas et al., 1995).

Протеогликаны также связывают некоторые протеолитические ферменты и их ингибиторы, и контролируют таким образом их активность (Alberts et al., 2008). Это может происходить следующим образом: 1) протеогликан иммобилизует белок в том месте, где он продуцируется, ограничивая зону его действия; 2) протеогликан стерически блокирует активность белка; 3) протеогликан защищает белок от протеолитической деградации; 5) протеогликан связывает белок, и концентрирует его на поверхности клетки для более эффективного взаимодействия. Связанная форма фактора роста фибробластов деградирует медленнее, чем свободная (Moscatelli, 1988). Трансформирующий фактор роста ß и фактор роста тромбоцитов неактивны в связанном состоянии и высвобождаются при протеолизе ВКМ (Dallas et al., 1995).

1.3. Особенности внеклеточного матрикса ниш стволовых клеток

Стволовые клетки не существуют в организме сами по себе, они находятся в определенном микроокружении, которое обычно обозначают термином «ниша». В настоящее время этот термин также используется для обозначения совокупности факторов, обеспечивающих жизнеспособность и самовоспроизведение стволовых клеток, и дифференцировку дочерних транзиторных клеток. Среди этих факторов следует упомянуть наличие базальной мембраны, молекул внеклеточного матрикса и присутствие соседних клеток, продуцирующих факторы роста и другие регуляторные молекулы. Ниша активно участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток, она обеспечивает самоподдержание

стволовых клеток и длительное их пребывание в состоянии покоя. Стволовые клетки прочно закреплены в нише молекулами адгезии, в частности интегринами.

Ниша стволовых клеток может оставаться свободной и в дальнейшем ее могут занять новые клетки. Пустые ниши могут существовать независимо от стволовых клеток и при трансплантации в них стволовых клеток обеспечивать их нормальное функционирование.

Одно из назначений ниши в тканях взрослого организма заключается в ограничении пролиферации стволовых клеток. Другое назначение ниши - создание условий для максимальной защищенности стволовых клеток от внешних воздействий. Например, стволовые клетки эпителия кишечника находятся в нижней части крипт, в волосяном фолликуле стволовые клетки локализуются под сальной железой, стволовые клетки роговицы - в области лимба. Переход стволовых клеток в состояние покоя также повышает их устойчивость к внешним воздействиям.

Для самоподдержания стволовые клетки должны получать от своего микроокружения (ниши) определенные сигналы. Например, для поддержания эмбриональных стволовых клеток мыши в недифференцированном состоянии in vitro необходим фактор ингибирова-ния лейкемии (LIF).

Внутриклеточные сигналы также необходимы для поддержания пролиферации стволовых клеток. Для поддержания плюрипотентности и предотвращения дифференцировки эмбриональных стволовых клеток необходима экспрессия транскрипционного фактора Nanog.

Впервые термин ниша стволовых клеток был употреблен в отношении гемопоэтиче-ских стволовых клеток (Schofield, 1978), однако, только теоретически. Доказательства существования такой структурной единицы ткани было получено при изучении половых клеток дрозофилы (King, Lin, 1999).

Ниши стволовых клеток беспозвоночных хорошо изучены на примере таких модельных организмов как Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster. Стволовая ниша половых клеток С. elegans обеспечивается всего одной клеткой, которая осуществляет физический контакт с половыми стволовыми клетками и продуцирует растворимые факторы, управляющие судьбой клеток-мишеней. Эта клетка - дистальная верхушечная клетка - образует множество отростков, окружающих половые стволовые клетки. Основная её функция состоит в том, чтобы поддерживать фонд стволовых клеток и контролировать переключение деления стволовых клеток с митотического на мейотическое (Kimble et al., 2007). Аналогичным образом устроена ниша половых стволовых клеток Drosophila, только здесь нишу формирует не одна клетка, а группа клеток (Xie, 2000).

Ниши стволовых клеток млекопитающих более разнообразны и сложно устроены. Наиболее изучены следующие ниши: ниша нейральных стволовых клеток (НСК), ниша эпи-дермальных стволовых клеток, ниша гематопоэтических стволовых клеток, ниша стволовых клеток кишечного эпителия. Для всех этих ниш характерно наличие клеток, которые секре-тируют растворимые факторы, управляющие судьбой стволовых клеток, или несут закрепленные на своей поверхности лиганды, как например один из важнейших регуляторов клеточной дифференцировки и деления - лиганд сигнального пути Notch (Walker et al., 2009). Однако не меньшую роль в нише играют молекулы внеклеточного матрикса. В нишах нейральных стволовых клеток, сосредоточенных в субвентрикулярной зоне латеральных желудочков и субгрануляной зоне гиппокампа (Taupin, Gage, 2002), молекулы внеклеточного матрикса, такие как гепарансульфат-протеогликаны, связывают фактор роста фибробластов FGFb (FGF-2), стимулирующий пролиферацию НСК и поддержание стволового фонда (Кег-ever et al., 2007). В нише эпидермальных стволовых клеток и нише стволовых клеток кишечного эпителия именно контакт с базальной мембраной является сигналом того, что клетка остается стволовой (Lechler, Fuchs, 2005). Клетки базального слоя эпителия претерпевают ассиметричное деление. Расположение веретена деления, перпендикулярно базальной мембране, приводит к тому, что одна из клеток теряет связь с ней и становится прогени-торной. Вторая клетка, контактирующая с базальной мембраной посредством интегринов pi, остается стволовой.

Гепарансульфат-протеогликан участвует в поддержании способности стволовых клеток к самообновлению, регулируя активность некоторых сигнальных путей, таких как LIF, BMP и Wnt. Показано, что нокдаун гена ЕХТ1 в эмбриональных стволовых клетках, который необходим для удлинения цепей гепарансульфата, приводит к замедлению роста стволовых клеток и дифференцировке их в экстраэмбриональную энтодерму даже в присутствии фактора LIF и сыворотки (Sasaki et al., 2008).

Точно также как и в случае эмбриональных стволовых клеток, гепарансульфат влияет на пролиферацию и дифференцировку нейральных стволовых клеток, регулируя активность основных сигнальных путей. Для поддержания мультипотентности и стимуляции пролиферации нейральных стволовых клеток и нейральных клеток-предшественников необходим основной фактор роста фибробластов (FGFb). Гепарансульфат является его кофактором, необходимым для запуска сигналинга (Reynolds et al. 1992; Vaccarino et al. 1999). В мышиных нейральных клетках-предшественниках гепарансульфат-протеогликаны, секретируемые клетками, формируют высокоафинный комплекс с FGFb и его рецепторами через цепи гепарансульфата (Nurcombe et al., 1993). У мышей, мутантных по гену ЕХТ1, наблюдаются различные аномалии в развитии нервной системы, в том числе утончение коры головного мозга

(Inatani et al. 2003). Нейральные клетки-предшественники, полученные из таких мутантные мышей, характеризуются замедленной пролиферацией в ответ на действие FGFb.

1.4. Матрикс-опосредованное управление ростом и дифференцировкой клеток

Дифференцировку стволовых клеток еще совсем недавно связывали только с воздействием определенного набора ростовых факторов. Однако сейчас все большее значение в этом процессе отдается внеклеточному матриксу, а точнее тем физическим силам, которые возникают, когда клетка прикрепляется к ВКМ. На рост и дифференцировку стволовых клеток влияют такие параметры внеклеточного матрикса, как химический состав, надмолекулярная структура (паттерн) и жесткость.

Химический состав. Создавая искусственные матриксные материалы медицинского назначения нужно учитывать особенности внеклеточного матрикса различных типов тканей. Например, внеклеточный матрикс хрящевой ткани сильно гидратирован, поэтому при создании его искусственных аналогов нужно обеспечить достаточную концентрацию углеводов и протеогликанов. Известно, что во внеклеточном матриксе гиалинового хряща содержится 15-20% коллагена II типа, 5-10% хондроитин сульфата и 0,05-0,25% гиалуроновой кислоты (Maroudas, 1979). Группа тайваньских ученых разработала композиционный матрикс, состоящий из желатина (5%), хондроитин сульфата (1%) и гиалуроновой кислоты (0,05%), имитирующий естественный матрикс гиалинового хряща, с порами размером 180мкм (Chang et., 2003). Хондроциты, культивируемые в таком геле, сохраняли характерную для них морфологию и синтезировали коллаген II в течение 5 недель, что подтверждает возможность использования такого материала в области биоинженерии хрящевой ткани. Другая группа ученых разработала сходную тканеинженерную конструкцию, но содержащую желатиновые микросферы с трансформирующим фактором роста pi и мезенхимальные стволовые клетки (Fan et al., 2006). Имплантация такой структуры в область дефекта хряща способствовала восстановлению хрящевой ткани быстрее, чем в случае имплантации матрикса без клеток и капсул. Но в целом обе экспериментальные группы демонстрировали преимущество по сравнению с контролем.

Альгинаты считаются перспективным материалом для регенерации хрящевой ткани, так как имитируют молекулы гликозаминогликанов. Альгинатные гели, обогащенные гиалуроновой кислотой и фибрином, использовали для культивирования хондроцитов (Lindenhaynet al., 1999). Оказалось, что существенное значение в такой системе имеет концентрация основного компонента гелей - альгината. Гиалуроновая кислота, введенная в гели с концентрацией альгината 1,2%, в течение месяца почти полностью диффундировала из капсул в культуральную среду, также как и вновь синтезированные молекулы гиалуроновой кислоты. В то время как в гелях с концентрацией 2,4% альгината, более половины введен-

ной гиалуроновой кислоты сохранялась в гелях, а хондроциты отличались более высокими пролиферативными способностями. Таким образом, от концентрации основного гелеобра-зующего вещества зависит скорость диффузии других составляющих композиционных гелей. Необходимо в таких случаях либо повышать концентрацию основного компонента, чтобы избежать слишком быстрой диффузии, либо химически «сшивать» компоненты мат-рикса.

Надмолекулярная структура матрикса (паттерн). В клетках, не имеющих связей с ВКМ, запускается механизм апоптоза (Re et al., 1994). Оказывается, для выживания клетки имеет значение не только сам факт прикрепления к субстрату, но еще и паттерн молекул ВКМ. В эксперименте in vitro одинаковое количество фибронектина нанесли на подложку, изменяя при этом рисунок (Chen et al., 1997). Клетки, прикрепившиеся к большим округлым площадкам диаметром 20 мкм все равно уходили в апоптоз. Когда то же количество фибронектина было представлено в виде множества мелких (5мкм в диаметре) пятен, клетка эффективно распластывалась, выживала и размножалась.

Структура матрикса влияет на форму клетки, что в свою очередь определяет её диф-ференцировку и поведение в культуре и в организме. Этот тезис был подтвержден в эксперименте, в котором мезенхимальные стволовые клетки культивировали на микроструктурированном с помощью эластомерных штампов матриксе (McBeath et al., 2004). Клетки, прикреплявшиеся к островкам фибронектина 25 мкм в диаметре, приобретали соответствующую округлую форму и дифференцировались в адипоциты. В то время как клетки, распластывавшиеся по более крупным площадкам фибронектина 50x50 мкм, экспрессировали ос-теогенные маркеры. Механизмы, участвующие в запуске дифференцировки до конца не выяснены, авторы предполагают участие фактора Rho, так как его ингибирование элиминировало вышеуказанные эффекты.

Нейральные стволовые клетки гиппокампа крысы культивировали на микроструктурированном матриксе из полистирена, модифицированном при помощи ламинина (Recknor et al., 2006). До 75% клеток были ориентированы в направлении бороздок (13 мкм в ширину и 4 мкм высотой) и отличались повышенной экспрессией нейрональных маркеров. Клетки способны воспринимать структуру внеклеточного матрикса не только в микрометровом, но даже в нанометровом масштабе. Мезенхимальные стволовые клетки человека, культивируемые на наноструктурированном матриксе с шириной бороздок 130 нм, также характеризовались ориентацией цитоскелета и ядра параллельно паттерну матрикса (Yim et al., 2007). Экспрессия нейрональных маркеров была существенно увеличена по сравнению с неструктурированным или микроструктурированным матриксом. Введение ретиноевой кислоты дополнительно стимулировало нейрональную дифференцировку. Но даже в отсутствие этого

морфогена дифференцировка клеток в нейралыюм направлении на наноструктурированных субстратах была более выражена, чем на неструктурированном матриксе, но в присутствие ретиноевой кислоты.

Нейральные стволовые клетки гиппокампа крысы по-разному проявляют себя при культивировании их на субстратах, состоящих из синтетических волокон различного диаметра, покрытых ламинином (Christopherson et al., 2009). Клетки образуют множественные контакты с волокнами диаметром 283 нм. Когда клетки культивируют на субстрате из волокон большего диаметра (около 1000 нм), то клетки ориентируются вдоль волокна. Чем меньше диаметр волокон, тем выше пролиферативная активность клеток и меньше степень их агрегации. Механизмы, при помощи которых нанотопография внеклеточного матрикса влияет на пролиферацию и дифференцировку клеток, активно изучаются. Очевидно, что сигнализация осуществляется через элементы цитоскелета, такие как F-актин, виментин, у-тубулин и а-тубулин (Gerecht et al., 2007).

Культивирование клеток in vitro на двумерных субстратах в присутствии различных растворимых или иммобилизованных на подложке субстратах позволяет оценивать воздействие того или иного вещества на рост, размножение или дифференцировку клеток. Однако такие двумерные субстраты не способны в полной мере имитировать естественный внеклеточный матрикс животных, так как in vivo компоненты ВКМ формируют трехмерную сеть волокон. На поверхности двумерного матрикса клетка оказывается в неестественном окружении. Клетка контактирует с подложкой только базальной поверхностью, что ведет к ее поляризации. Остальная часть клетки при этом контактирует с культуральной средой - презентация ростовых факторов, таким образом, также отличается от естественного ВКМ, где морфогены распределены в пространстве в виде градиентов.

Разработаны различные типы искусственного трехмерного матрикса: микропористые (Levenberg et al., 2003; Shea et al., 1999; Yim and Leong, 2005), нанофибриллярные (Semino et al., 2003; Silva et al., 2004), гидрогелевые (Peppas et al., 2006). Микропористый матрикс (с диаметром пор~100 мкм) позволяет эффективно инкапсулировать клетки, однако размер пор, больший, чем диаметр клетки, приводит к тому, что поведение клетки внутри такого матрикса скорее напоминает поведение клетки на двумерной подложке, лишь слегка изогнутой, так как клетка контактирует с матриксом только базальной поверхностью. Трехмерный матрикс из нановолокон более близок по строению к естественному ВКМ, однако синтетические материалы, из которых изготавливают волокна требуют дополнительной химической модификации, например, в виде ковалетно пришитых адгезионных пептидных мотивов белков, для того, чтобы обеспечивать прикрепление клеток. Этих недостатков лишены

гидрогели, которые создают для клеток химические и механические условия, максимально приближенные к естественным.

Жесткость матрикса. Первые доказательства того, что жесткость матрикса влияет на дифференцировку клеток, были получены в 1979 году. Было показано, что эпителиальные клетки молочной железы мыши интенсивнее дифференцируются на коллагеновом геле, чем на пластике (Emerman et al., 1979). Эндотелиальные клетки пупочной вены, культивируемые на твердых субстратах (например, стеклах, покрытых матригелем), растут в монослое (Deroanne et al., 2001). Если же их культивировать на поверхности геля, то они формируют трубчатые структуры, наподобие сосудов. Введение коллагена I типа делает гели более твердыми, клетки экспрессируют актин, образуют фокальные контакты с подложкой и распластываются. Ведение в гели денатурированного коллагена в тех же концентрациях, но не изменяющего при этом механические свойства матрикса, не оказывает такого эффекта -клетки вновь сливаются в структуры, наподобие сосудов. Однако в этих экспериментах на дифференцировку и поведение клеток в культуре оказывала влияние еще и плотность ли-гандов, а не только эластичность матрикса. В другом эксперименте эту проблему решили следующим образом: миобласты культивировали на коллагеновых полосках, прикрепленных к различным субстратам - к стеклу или гелям с различной жесткостью. Независимо от типа субстрата, клетки сливались в миотубы. Но поперечная исчерченность появлялась только в миобластах, культивируемых на гелях, сходных по механическим свойствам с мышечной тканью (Engler et al., 2004).

Жесткость матрикса влияет на дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток. Более мягкие субстраты стимулируют нейральную дифференцировку, средние по жесткости субстраты имитируют мышечную ткань, более жесткие подложки обладают остеогенным эффектом (Engler et al., 2006). Механические свойства матрикса определяют рост и дифференцировку нейральных стволовых клеток. Синтетические гидрогели различной жесткости протестировали на взрослых нейральных стволовых KneTKax(Saha et al., 2008). Слишком мягкие субстраты (модуль сдвига 10-100 Па) ингибировали прикрепление клеток, размножение и дифференцировку. Гели с модулем жесткости более 100 Па поддерживали культуры, причем более мягкие субстраты (100-500 Па) стимулировали нейрональную дифференцировку, а более жесткие (1000-10000 Па) - глиальную.

Стоит помнить, что ни один из параметров внеклеточного матрикса не является достаточным для управления судьбой стволовых клеток. Так, например, гелевая подложка, обладающая механическими свойствами мышечной ткани, стимулирует лишь раннюю дифференцировку мезенхимных стволовых клеток в сторону миобластов. Клетки становятся вере-теновидными и экспрессируют соответствующие маркеры (Engler et al., 2006; Rowlands et

al., 2008), но они не сливаются в миотубы и не обладают сократительной способностью, как это делают мышечные клетки в культуре (Engler et al., 2004). Поэтому необходима комбинация всех факторов, влияющих на дифференцировку клеток: химический состав ВКМ, структура и механические свойства.

1.5. Внеклеточный матрнкс центральной нервной системы

Внеклеточный матрикс центральной нервной системы (ЦНС) составляет около 20% от общего объема ткани (Nicholson, Sykova, 1998). Многие из молекул, его составляющих, специфичны для нервной системы, хотя некоторые из них встречаются и в других тканях. В ЦНС обильно представлены гиалуроновая кислота и связанные с ней гликопротеины семейств лектикана, тенасцина и связующих белков (Zimmermann, 2008).

У млекопитающих семейство лектикана представлено четырьмя хондроитинсульфат-протеогликанами - бревиканом, нейроканом, аггреканом и верзиканом (Ruoslahti, 1996). Связующие белки осуществляют связь между лектиканами и гиалуронатом (Spicer et al., 2003). Это семейство небольших гликопротеинов включает 4 члена, 3 из которых были обнаружены в центральной нервной системе. К ним относится связующий белок хрящевой ткани (Crtll) (Neame, Barry, 1993). Этот белок был найден и в центральной нервной системе, где он соединяется с двумя другими связующими белками Brail и Вга12, экспрессирующи-мися исключительно в нервной системе (Bekku et al., 2003).

Тенасцины - это большие мультимерные гликопротеины, достаточно консервативные среди позвоночных (Hsia, Schwarzbauer, 2005). У млекопитающих они представлены 4 молекулами: тенасцин-С, -R, -X, -W (-N). Все они имеют сходную организацию, включают богатый цистеином амино-концевой участок, состоящий из 3-4 а-спиральных доменов, EGF-подобные повторы, повторы III типа фибронектина и фибриноген-подобный домен на карбоксильном конце.

Тенасцин-С и тенасцин-R связываются с различными лигандами внеклеточного мат-рикса и клеточной поверхности (Jones, Jones, 2000). Эти взаимодействия в первую очередь осуществляются через домены фибронектина III типа. Среди клеточных рецепторов тенас-цин взаимодействует с интегринами, синеканами, глипиканами или молекулами клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов. Также тенасцин связывается с другими молекулами внеклеточного матрикса - фибронектином, фосфоканом и лектиканами.

Способность отдельных компонентов внеклеточного матрикса ЦНС селективно связываться между собой ведет к образованию довольно свободной, гибкой сети, где гиалуроновая кислота играет роль остова. Современные представления о надмолекулярной организации компонентов ВКМ мозга основываются, прежде всего, на измерении аффинных свойств in vitro и данных электронной микроскопии при помощи кругового отеенения ме-

таллами (Lundell et al. 2004). Существующая модель выглядит следующим образом (Zimmermann, 2008). Молекулы гиалуроновой кислоты, простирающиеся от поверхности клеточной мембраны нейронов, соединяются с лектиканами и связующими белками. Другой конец лектикана взаимодейтсвует с тенасцином. Так как тенасцины между собой формируют олигомеры, то они, таким образом, соединяют отдельные комплексы гиалуроната-лектикана-связующих белков.

Члены каждого семейства белков различаются между собой, хотя и обладают общими свойствами. Поэтому замещение одного гликопротеина другим, но из того же семейства, существенно меняет свойства матрикса. Например, тенасцин-R при олигомеризации образует комплексы из трех молекул, а тенасцин-С - из шести. Отдельные типы лектиканов отличаются по длине корового белка. Различия в молекулярном составе цепей полисахаридов ведут к изменению физических свойств матрикса, так как меняется способность притягивать молекулы воды и катионы. За счет замещения родственных гликопротеинов объем внеклеточного матрикса изменяется от 40% во время развития до 20% во взрослом организме (Nicholson, Sykova, 1998).

Функции ВКМ в центральной системе связаны с миграцией клеток, направлением роста аксонов, ограничением пластичности, стабилизацией волокон нервных трактов, что подтверждается многочисленными исследованиями in vivo и in vitro.

В отличие от внеклеточного матрикса других тканей, в ВКМ центральной нервной системы взрослых организмов белковый компонент значительно редуцирован. Хотя во время эмбрионального развития в нервной системе значительная роль принадлежит известным белкам внеклеточного матрикса: ламинину, фибронектину и др.

Значение ламининов в развитии млекопитающих опирается на тот факт, что лами-нин-1 является самой первой молекулой внеклеточного матрикса, синтезируемой в развивающемся эмбрионе. Впервые наличие ламинина было показано на стадии морулы (Leivo et al, 1980), а потом и на стадии двухклеточного зародыша (Dziadek and Timpl, 1986). Во взрослой нервной системе, ламинины представлены в виде компонентов базальных мембран, в то время как во время эмбрионального развития ламинины существуют также в виде более растворимой, менее полимеризованной форме (Liesi, 1990). В такой форме ламинины являются молекулами, направляющими миграцию нейронов. Ламинин-1 экспрессируется вдоль основных путей миграции нейронов и лидирующих аксонов (Letourneau et al., 1988). В развивающейся нервной системе, а также во взрослой ЦНС, где возможна регенерация нейронов и рост аксонов (например, в обонятельных луковицах) экспрессия ламинина-1 обнаружена в астроцитах (Liesi, 1985). Также ламинин-1 временно экспрессируется в реактивной астроглии после травмы ЦНС (Liesi et al., 1984). Эти данные позволяют предположить,

что ламинин способствует регенерации в нервной системе. Боле того, шванновские клетки взрослой периферической нервной системы (Cornbrooks et al., 1983) и астроциты низших позвоночных, способных к регенерации ЦНС (Hopkins et al., 1985), также продуцируют ла-минин-1. Хорошо известна способность ламинина стимулировать аксоногенез in vitro (Sanes, 1989). В сравнении с другими молекулами ВКМ (коллагены, фибронектины, проте-огликаны), ламинин является лучшим субстратом, стимулирующим рост аксонов (Gundersen, 1987). Именно с отсутствием ламинина во взрослой ЦНС связывают невозможность регенерации после травм.

Роль коллагена IV и фибронектина во внеклеточном матриксе нервной системы сходна с таковой ламинина. Эти белки активно экспрессируются в развивающейся нервной системе вдоль основных путей миграции клеток (Perris et al., 2000; Testaz, Duband, 2001; Einheber et al., 1996). Во взрослой нервной системе продукция этих белков, прежде всего, связана с травматическим глиозом (Pasinetti et al., 1993; Liu and Sturner, 1988; Nag et al., 1997).

Уже упоминалось, что внеклеточный матрикс взрослой нервной системы существенно отличается от эмбрионального и ювенильного. Для ювенильного типа ВКМ характерны гиалуроновая кислота, тенасцин С, изоформы верзикана V0, VI, а также нейрокан и связующий белок Crtll (Rauch, 2004). В течении первых двух недель после рождения происходит мощная перестройка внеклеточного матрикса. Компоненты ювенильного матрикса замещаются гомологичными, но отличающимися по размеру и свойствам молекулами: верзи-кан V2, аггрекан, бревикан, тенасцин R, связующие белки Brail и Bral2 (Rauch, 2004). В результате более разреженный матрикс ювенильного типа замещается более плотной и густой сетью внеклеточного матрикса нервной системы взрослого организма. Считается, что эти изменения ограничивают высокодинамичный период, в течение которого происходит миграция клеток, рост аксонов, поэтому во взрослой ЦНС пластичность и регенерация практически невозможны. Во взрослом ВКМ мало белков, основу матрикса составляют гиауроно-вая кислота и хондроитинсульфат протеогликаны. Эти вещества ингибируют рост аксонов in vitro и не способствуют адгезии (Oohira et al., 1991). Предполагают, что и в центральной нервной системе протеогликаны выполняют ту же функцию. Например, в белом веществе бревикан и версикан V2 ингибируют аномальный рост и ветвление аксонов за счет аккумуляции этих веществ в местах перехватов Ранвье (Niederöst et al., 1999). Точно также пери-нейрональный матрикс стабилизирует нейрональные сети, подавляя формирование новых синаптических контактов (Galtrey, Fawcett, 2007; Hockfield et al., 1990). Кроме ингибирую-щей способности протеогликанов in vitro, подтверждение находится и в экспериментах по введению хондроитиназы in vivo. Инъекция этого фермента в зрительную зону коры голов-

ного мозга крысы нарушала целостность перинейронального матрикса и восстанавливала пластичность (Hooks, Chen, 2007).

ВКМ и травмы ЦНС. Нарушение целостности нервной системы приводит к формированию так называемого глиального рубца. Главными компонентами глиального рубца являются реактивные астроциты (Stichel, Muller, 1998). После травмы астроциты изменяются морфологически, увеличивается количество их отростков и усиливается синтез белка промежуточных филаментов - кислого глиального фибриллярного белка (GFAP). Астроциты формируют плотную сеть отростков, которая заполняет пустое пространство, образованное после гибели нейрональных клеток. Усиленная пролиферация астроцитов модифицирует внеклеточный матрикс, окружающий область повреждения, путем секреции таких молекул как ламинин, фибронектин, тенасин и протеогликаны. Плотная сеть астроцитов создает физический барьер для регенерирующих аксонов. Кроме того реактивные астроциты, а также предшественники олигодендроцитов и клетки микроглии, синтезируют молекулы, создающие биохимический барьер для регенерации (Silver, Miller, 2004). Главными ингибиторны-ми молекулами в регенерации ЦНС являются хонроитинсульфат-протеогликаны, тенасцин. Этот факт подтверждается тем, что введение хондроитиназы в область глиального рубца в модели острой травмы спинного мозга повышает аксоногенез и восстанавливает проводимость (Barritt et al., 2006).

Изменения в составе внеклеточного матрикса после травмы ЦНС включают два основных направления. С одной стороны, качественный состав матрикса становится ближе к составу ВКМ эмбриональной и ювенильной нервной системы. Вновь активизируется синтез белков ВКМ, в норме малочисленных во взрослой нервной системе - ламинина и коллагена. С другой стороны, реактивные астроциты и другие клетки в избытке синтезируют хондрои-тинсульфат-протеогликаны, ингибирующие рост аксонов. Ламинин, коллаген и фибронектин, в развивающейся нервной системе поддерживающие рост аксонов и направляющие миграцию нейронов, в глиальном рубце, однако, действуют тоже как ингибирующие молекулы из-за избыточной из продукции, в результате которой формируется слишком плотный для проникновения аксонов матрикс.

Таким образом, внеклеточный матрикс участвует в развитии центральной нервной системы, направляя миграции клеток и рост аксонов, а также стабилизирует ЦНС взрослого организма, предотвращая формирование новых связей и избыточный рост аксонов. ВКМ играет роль и в патогенезе травм ЦНС. Избыточная продукция белков и протеогликанов ВКМ позволяет изолировать место травмы от интактной ткани, но тем самым препятствует регенерации и восстановлению целостности ЦНС.

1.6. Искусственные матриксные материалы для нейротрансплантации

Одной из областей, где активно разрабатываются матриксные материалы медицинского назначения, является лечение нейродегенераторных заболеваний и травм центральной нервной системы. За последние годы появилось много экспериментальных работ, посвященных исследованиям восстановительной терапии тяжелых повреждений спинного мозга с помощью замещения дефекта различными имплантируемыми конструкциями. В качестве таких имплантатов используют природные (гиалуроновая кислота, полимеризованный коллаген, матригель) и синтетические материалы (полиакриловая кислота, полиэтиленгликоль, карбониловые нити); клетки нервной ткани - шванновские, обкладочные, обонятельные, эмбриональные, а также комбинацию этих двух видов имплантатов, представляющую собой биоинженерный аналог ткани (тканеинженерную конструкцию). Матрикс (бесклеточный или как основа для клеточного имплантата) может быть в виде гидрогелей, лиофильно высушенных губок, волокон (электроспининг).

Разрабатываются гели на основе гиалуроновой кислоты - углевода, формирующего аморфное вещество внеклеточного матрикса животных.

Гиалуроновую кислоту модифицируют добавлением тиоловых групп, которые затем ковалентно сшивают через поли-(этиленгликоль)диакрилат. Такие гели поддерживают жизнеспособность и аксональный рост нейронов дорзального ганглия цыпленка (Нош et al., 2007). Однако имплантация данных гиалуроновых гелей в область травмы спинного мозга крыс не способствует регенерации последнего.

Очевидно, что гиалуроновая кислота не способствует росту аксонов, инкапсулированных в нее нейронов. Внедрение гиалуронового геля в область повреждения коры головного мозга крысы ингибирует формирование глиального шрама, позволяет обеспечить миграцию клеток внутрь геля, но не поддерживает аксональный рост (Cui et al., 2006). Этого недостатка лишены те же гели, но модифицированные с помощью иммобилизованных RGD-пептидов. В такие гели проникают не только различные клетки, но и активно прорастают регенерирующие аксоны.

Для того чтобы стимулировать аксоногенез, гиалуроновую кислоту также модифицируют при помощи антител к рецептору Nogo-66, который является нейрональным рецептором, связывающимся с тремя молекулами, ингибирующими аксональный рост (Nogo-A, миелин-ассоциированным гликопротеином и гликопротеином олигодендроцитов) (Brittis, Flanagan, 2001; Hunt et al., 2002). В то время как гели на основе немодифицированной гиалуроновой кислоты не позволяет даже адгезию и выживание клеток дорзального ганглия, ан-TH-Nogo-66-гиалуроновая кислота поддерживает жизнеспособность клеток в культуре и стимулирует аксональный рост (Hou et al., 2006). Была также исследована возможность ис-

пользования таких гелей в терапии травмы спинного мозга. Гели, модифицированные полилизином и антителами к рецептору Nogo-66 значительно стимулировали ангиогенез и инги-бировали формирование глиального шрама (Wei et al., 2010).

Таким образом, гиалуроновая кислота является достаточно хорошим базовым материалом для формирования гелей - основы будущих имплантатов для реконструктивной терапии травм ЦНС. Однако без введения дополнительных компонентов или химической модификации, гиалуронат не способствует регенерации нервной системы. Другим её недостатком, также как и других природных материалов животного происхождения, является быстрая деградация. В организме животных существует 3 типа ферментов, эффективно расщепляющих гиалуроновую кислоту: гиалуронидаза, ß-D-глюкуронидаза и ß-N-ацетил-гексозаминидаза (Leach and Schmidt, 2004). Известно, что продукты деградации гиалуроно-вой кислоты, олигосахариды и низкомолекулярные фрагменты, обладают про-ангиогенными свойствами (Mio and Stern, 2002). Это способствует васкуляризации имплан-тата, однако важно, чтобы имплантат сохранял свою структуру до тех пор, пока собственные регенерирующие ткани организма не заменят его. Скорость деградации гиалуроновой кислоты уменьшается при её дополнительном «сшивании» или присоединении сульфатных групп.

Выходом в такой ситуации может стать использование природных материалов, например углеводов, но не животного, а растительного происхождения. Являясь натуральными биополимерами, они, с одной стороны, максимально соответствуют свойствами естественного внеклеточного матрикса, обладают биосовместимостью, не токсичны и иммуноло-гически инертны. С другой стороны скорость деградации этих материалов в организме животного намного ниже, чем биополимеров животного происхождения. Различные углеводы растительного происхождения исследуются как перспективные материалы для конструирования искусственного внеклеточного матрикса: альгинаты, агароза, метилцеллюлоза.

Альгинаты - это полисахариды, получаемые из бурых водорослей. Альгиновая кислота представляет собой линейный полимер, мономерами которого являются (1-4)-связанная ß-D-маннуроновая кислота (М) или a-L-гулуроновая кислота (G), ковалентно ассоциированные друг с другом в различной последовательности.

Полимеры альгиновой кислоты легко образуют высокогидрофильные, иммунологи-чески инертные и биосовместимые гели при добавлении к ним ионов кальция. Культивирование обкладочных обонятельных клеток, шванновских клеток и стромальных клеток красного костного мозга на альгинатном геле трансформирует их в атипичные клетки сферической формы, метаболическая активность клеток при этом ингибируется (Novikova, 2006). Но когда альгинатный гель, подвергнутый лиофильной сушке и представляющий собой губку,

имплантируют в поврежденный спинной мозг крыс, он стимулирует рост аксонов (Kataoka, 2001; Suzuki, 1999). Более того, аксоны, прорастающие в гель, покидают имплант с другого его конца и образуют контакты с локальными нейронами (Suzuki, 2002).

Альгинаты уменьшают формирование глиального рубца, при этом количество аксонов, проникающих в альгинатный гель значительно больше даже в сравнении с коллагеном (Kataoka, 2004). Внедрение анизотропного капиллярного геля на основе альгинатов в поврежденный шейный отдел спинного мозга способствовало росту регенерирующих аксонов (Prang, 2006).

Нейросферы, полученные в результате культивирования клеток гиппокампа плода крысы, внедрили в альгинатный гель и имплантировали в поврежденный спинной мозг крыс. Альгинаты увеличивали количество выживших нейросфер, стимулировали их миграцию, дифференцировку и интеграцию в спинной мозг реципиента (Wu et al., 2001).

Другим подходом в терапии повреждений травм спинного мозга является внедрение в место повреждения микрокапсул, содержащих фибробласты, продуцирующие нейротро-фический фактор BDNF. Сами капсулы были изготовлены из альгината и поли-Ь-орнитина и предохраняли фибробласты от иммунного ответа реципиента, что устраняло необходимость в проведении иммуносупрессорной терапии. Внедрение таких капсул стимулировало регенерацию аксонов и приводило к улучшению двигательных функций у крыс (Tobias et al., 2001; Tobias et al., 2005).

Были созданы и изучены двухкомпонентые матриксы, основанные на коллагене, как перспективные материаы для реконструктивной терапии (Hahn et al., 2006). Один содержал в качестве второго компонента гиалуроновую кислоту, другой - альгиновую. Фибробласты голосовых связок свиньи внедрили в эти гели и культивировали в течение четырех недель. Установили, что матрикс, содержащий коллаген-альгинат, является более подходящим для имплантации, так как этот гель менее подвержен сжатию со временем и медленнее деградирует в организме.

Агароза - это полисахарид красных водорослей. Агарозу также как и альгинаты рассматривают как биосовместимый матрикс для реконструктивной терапии травм ЦНС. Наибольшее применение нашли лиофильно высушенные гидрогели агарозы, которые в виде губки вводят в область дефекта спинного мозга лабораторных животных. Такой клеточный каркас сохраняет свою микроструктуру даже без дополнительных поперечных сшивок (Sto-kols, 2004). Гели, которые имеют поры, ориентированные параллельно продольной оси спинного мозга, создают каналы, по которым регенерирующие аксоны прорастают в им-плантат, а внедрение нейротрофических факторов, таких как BDNF, дополнительно стимулирует этот процесс (Stokols, 2006). Разрабатываются также гели, которые полимеризуются

уже в месте дефекта, максимально заполняя область травмы и обеспечивая поддержку для регенерации спинного мозга (Jain et al., 2006).

Целлюлоза - очень гидрофильное, но не растворимое в воде вещество. Химическая модификация придает ей свойства растворимости и способность образовывать гели в зависимости от температуры. Один из самых простых примеров - это метилцеллюлоза. Температура гелеобразования обычно около 60°С, но, регулируя состав и концентрацию соли, можно сделать её более физиологичной (Kobayashi et al., 1999). Метоцель А - это 2% метилцеллюлоза, принятая Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для трансплантации при лечении заболеваний и травм периферической нервной системы (Wells et al, 1997).

Хитозан - это 1,4-связанный 2-амино-2-деокси-Р-Б-глюкан, является производным хитина (Ы-ацетил-О-глюкозамина), получаемым путем щелочного деацетилирования. Хитин - структурный полисахарид панциря краба и других ракообразных. Хитозан энзиматически расщепляется в организме животных лизоцимом. Степень деацетилироания влияет на заряд молекул, а, следовательно, на адгезионные, механические свойства матрикса и скорость его деградации. Преимуществом хитозана по сравнению с другими полисахаридами растительного и животного происхождения является его поликатионная структура, которая способствует адгезии клеток, поэтому не требуется его дополнительная модификация.

Коллаген I - самый первый из биополимеров, который начали использовать для культивирования клеток in vitro, а также в качестве основы для биосовместимых биодегра-дируемых имплантатов, способных ассоциировать различные типы клеток. Специфической экспрессии коллагена I для центральной нервной системы не выявлено, он присутствует в белом веществе спинного мозга вокруг кровеносных сосудов (Okada et al., 2007). Однако показана его эффективная способность поддерживать культуры нейральных клеток в двумерных и трехмерных системах (Conor et al., 2002; Ma et al., 2005). Применение коллагена в качестве консолидирующего субстрата в модели травмы спинного мозга приводит к частичному восстановлению функционирования нервной системы. Комплексный гидрогель, состоящий из двух типов коллагена - коллагена птиц и коллагена млекопитающих запатентован под торговой маркой «Сферогель-Э» (Ярыгин и др., 2006; Брюховецкий и др., 2008).

1.7. Реконструктивная терапия спинальных травм

Существуют коренные различия в том, как протекает процесс восстановления центральной и периферической нервной системы после травмы. В обоих случаях существует баланс между факторами, которые стимулируют и ингибируют регенерацию. В центральной нервной системе этот баланс сдвинут в сторону ингибирования, в то время как в периферической нервной системе преобладающими являются факторы, способствующие регенера-

ции. Тем не менее, низшие позвоночные, и даже молодые особи млекопитающих, птиц и амфибий способны к регенерации ЦНС. Это доказывает, что нейроны ЦНС имеют регенераторный потенциал, который, однако, сдерживается ингибирующими факторами.

Из известных факторов, подавляющих регенерацию спинного мозга, наибольшее значение имеет формирование глиального рубца и избыточная продукция некоторых молекул, высокие концентрации которых обеспечивают физико-химический барьер.

Глиальный рубец формируется в результате защитной реакции с целью отгородить интактные ткани от повреждающих факторов и инфекции. Он представляет собой плотную сеть реактивных астроцитов и их отростков, которые синтезируют белки базальных мембран (ламинин, коллаген IV). Все эти компоненты создают физический барьер в виде плотного белкового матрикса, препятствующего прорастанию аксонов.

Ингибиторные молекулы формируют биохимический барьер. Прежде всего, это экспонированные на внешней миелиновой мембране Ио§о, миелин-ассоциированный глико-протеин и гликопротеин олигодендроцитов, а также семафорины и хондроитинсульфат-протеогликаны, продукция которых резко увеличивается после травмы.

Для того чтобы создать условия для прорастания аксонов, необходимо в определенной степени элиминировать оба барьера.

Для того чтобы предотвратить формирование глиального рубца, нужно заместить поврежденный участок на биосовместимый имплантат - «ткань-мост», соединяющий интактные участки мозга. Максимальное соответствие этого имплантата характеристикам ткани мозга (химический состав, механические свойства) снизят выраженность глиального рубца.

В предыдущей главе обсуждались различные биоматериалы животного и растительного происхождения, перспективные для нейротрансплантации. Все они активно исследуются для применения в терапии острой спинальной травмы. В качестве «ткани-моста» в терапии травмы спинного мозга преимущество имеют материалы, обладающие указанной ниже комбинацией свойств.

1. Специфические адгезионные свойства способствуют миграции клеток в имплантат, а также росту аксонов. Синтетические материалы, а также углеводы растительного происхождения (альгинаты, агароза) не имеют специфических рецепторов на клеточной поверхности, поэтому нуждаются в дополнительном введении адгезионных белков или модификации их ковалентным присоединением специфических пептидных последовательностей, связывающихся с клеточными рецепторами (например, КСЮ).

2. Структурированность материала. Материалы, имеющие поры, ориентированные параллельно оси спинного мозга, способствуют регенерации аксонов намного эффективнее, чем материалы с разнонаправленными порами.

3. Оптимальная скорость биодеградации. Вещества должны разрушаться в организме животного с такой скоростью, чтобы их успевали замещать структуры регенерирующих тканей. С учетом медленной регенерации нервной системы, такие материалы должны иметь низкую скорость биодеградации.

Матриксные материалы на основе коллагена I для экспериментальной регенерации спинного мозга применяют в самых различных формах. Например, в одном эксперименте в область травмы спинного мозга крыс внедрили трубку из коллагена I в первой экспериментальной группе (Sajjad, 2004). В другой группе проксимальный и дистальный участки соединили, обмотав их мембраной из коллагенов I и III типов (BioGide membrane). Дополнительно, животным помимо двух указанных видов имплантатов ввели ту же коллагеновую мембрану, примыкающую к дорзальному участку спинного мозга. Результаты эксперимента показали, что мембрана на поверхности проксимального участка спинного мозга эффективно ингибировала формирование глиального рубца. Самой перспективной оказалась группа, в которой дорзальный барьер сочетался с мембраной, окружающей спинной мозг в месте травмы. Этот вариант имплантата демонстрировал самые высокие показатели прорастания аксонов.

Однако недостаточно просто физически восстановить целостность спинного мозга при помощи полимерного имплантата. Нужно преодолеть биохимический (физико-химический) барьер в виде многочисленных ингибиторных молекул, например, специфическими антителами либо введением ферментов, их разрушающих, а также обогащением имплантата молекулами, стимулирующими и направляющими рост аксонов сквозь имплантат.

Коллаген IV изначально считали ингибиторной молекулой глиального рубца (Liesi, Kauppila, 2002). Блокирование синтеза коллагена при помощи 2,2-бипиридина также не способствовало прорастанию аксонов сквозь глиальный рубец (Weidnera et al., 1999) в модели травмы спинного мозга, в то время как в модели травмы коры головного мозга такой подход вполне оправдал ожидания - увеличивал регенерацию аксонов. Очевидно, роль коллагена IV в формировании глиального рубца и регенерации аксонов требует дополнительного изучения.

Помимо коллагена IV существуют другие молекулы, роль которых в ингибировании регенерации аксонов оказалась более определенной. Например, антитела против Nogo стимулируют рост аксонов сквозь область травмы спинного мозга и способствуют восстановлению функций задних конечностей (Schnell, Schwab, 1990; Bregman et al., 1995). Фермент, разрушающий хондроитинсульфат-протеогликаны, внедренный в область глиального рубца, также улучшает регенерацию спинного мозга (Bradbury et al., 2002).

Внеклеточный матрике является естественным микроокружеием клеток в многоклеточном организме. Он выполняет множество функций, в том числе активных, регуляторных. Особенно эти регуляторные функции проявляются во время регенерации, когда межклеточное вещество играет роль направляющей матрицы. В связи с этим искусственно созданный внеклеточный матрике, имитирующий естественный, может выступать перспективным инструментом в регенеративной медицине. Одной из областей применения искуственного внеклеточного матркиса является лечение травм центральной нервной системы, сопряженных с массивной гибелью клеток и замещением нервных тканей глиальным и соединительнотканным рубцом, а также образованием крупных патологичеких полостей. Перспективной технологией лечения травм нервной системы следует признать имплантацию биополимерно-клеточных конструкций. Клеточная терапия призвана восполнить утраченные клеточные элементы, стимулировать регенерацию собственных проводящих путей. Матриксные им-плантаты при этом выполняют каркасную функцию, заполняя место дефекта, а также трофическую и регуляторную функцию, поддерживают жизнеспособность, стимулируют регенерацию, регулируют размножение и дифференцировку клеток, кроме того, они могут служить системой адресной доставки иммобилизованных лекарств. Несмотря на огромный выбор разнообразных биоматериалов, естественных и синтетических, оптимальный матркис, способный выполнять все вышеперечисленные функции, до сих пор не разработан. Природные полимеры - коллаген, гиалуроновая кислота - слишком быстро деградируют в организме животных. Синтетические материалы, напротив, не деградируют, к тому же не обладают сайтами связывания клеточных рецепторов. В связи с этим разработка матрикса, который сможет эффективно выполнять функцию консолидирующего нейрорепаративного субстрата в реконструктивной терапии травм центральной нервной системы является действительно актуальной.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Выделение и очистка биополимеров - компонентов матриксных материалов

2.1.1. Получение и анализ модифицированных пектинов

Модифицированные пектины с различной степенью этерификации были получены по методике Ковалева В.В. (Ковалев, 2004). Препараты получали из высокоэтерифициро-ванного цитрусового пектина со степенью этерификации 60,2% (Copenhagen Pectin A/S, Lille Skensved) методом щелочной деэтерификации.

Исходный высокоэтерифицированный пектин предварительно очищали промывкой раствором этанола с концентрацией 50% (объемных). Для этого 200 г пектина суспендировали в 2 л раствора этанола в течение 30 мин, затем пектин отделили фильтрованием, промывали на фильтре 1,5 л 50% этанола, затем 1 л 95% этанола и сушили при 70°С. Полученный пектин измельчали и фракционировали по размеру частиц. Для работы использовали наиболее мелкодисперсную фракцию, прошедшую через сито с размером ячеи 74 мкм. Это было сделано для сведения к минимуму возможности возникновения неоднородности образца по степени этерификации из-за разной скорости деэтерификации пектиновых молекул снаружи и внутри гранул, обусловленной разной скоростью диффузии гидролизующего агента.

Процесс деэтерификации можно условно разделить на две стадии: вначале по мере добавления щелочи происходит нейтрализация свободных карбоксильных групп ангидрога-лактуроновой кислоты, затем при увеличении pH среды выше 8,5 начинается собственно деэтерификация пектина.

Количество щелочи, необходимой для нейтрализации карбоксильных групп, определяли следующим образом. 1 г пектина суспендировали в 10 мл 50% этанола и титровали 1 M раствора NaOH в 50% этаноле в присутствии индикатора Хинтона до перехода окраски индикатора. По результатам титрования определяли количество щелочи, необходимое для нейтрализации пектина, по формуле:

Fj =M'V0 где

Vi - объем раствора NaOH концентрацией 1 моль/л, необходимый для нейтрализации пектина, мл;

m - масса образца пектина, г;

Vo - раствора NaOH концентрацией 1 моль/л, пошедший на титрование 1,0 г пектина,

мл.

Количество щелочи, необходимое для достижения заданной степени этерификации пектина, рассчитывали на основании данных анализа образца пектина на содержание ангид-рогалактуроновой кислоты и степени этерификации, по формуле:

у _ (М ' Л) (СЭнт — СЭконеч ) ^QQQ

2 176 ' 100 ' 'где

Уг - объем раствора NaOH концентрацией 1 моль/л, необходимый для деэтерифика-ции пектина, мл;

m - масса образца пектина, г;

А - содержание ангидрогалактуроновой кислоты в пектине, %;

176 - молярная масса ангидрогалактуроновой кислоты, г/моль;

СЭнач - исходная степень этерификации пектина, %;

СЭКОнеч - заданная степень этерификации пектина, %.

Суммируя найденные объемы Vi и Уг, находили общее количество щелочи, необходимое для проведения процесса деэтерификации пектина.

Собственно процесс деэтерификации осуществляли следующим образом. 20 г порошка пектина суспендировали в 200 мл 50% этанола и при интенсивном перемешивании (на магнитной мешалке) постепенно добавляли 1 М раствор NaOH в 50% этаноле. Раствор щелочи вводили небольшими порциями (1-2 мл), что избежать как локального, так и общего (во всем реакционном объеме) скачка рН, который мог привести к неоднородности образца по степени этерификации. Для визуального контроля процесса в реакционную среду добавляли индикатор фенолфталеин (10-20 мг), переход окраски которого происходит в интервале рН 8,2-10,0. Очередную порцию щелочи добавляли в систему только после обесцвечивания индикатора. После того как в систему было введено примерно 95% расчетного количества щелочи, производился отбор пробы для определения степени этерификации, и по результатам анализа осуществлялась корректировка добавляемого количества щелочи.

После достижения заданной степени этерификации реакционную смесь подкисляли при интенсивном перемешивании 1М раствором НС1 в 50% этаноле до рН 5-6 (по индикаторной бумаге). Готовый пектин отделяли от водно-спиртового раствора на фильтре и промывали 300 мл 50% этанола, затем 150 мл 95% этанола. Промытый пектин сушили при 70° С.

В готовом образце пектина определяли содержание свободной ангидрогалактуроновой кислоты, общее содержание ангидрогалактуроновой кислоты, степень этерификации и характеристическую вязкость пектина.

Для приготовления матриксных материалов готовили маточный раствор МПК-30 с концентрацией 3%. Для этого к углеводному порошку добавляли дистиллированную воду и

перемешивали на магнитной мешалке в течение 30-40 минут при 70°С. Полученный раствор стерилизовали автоклавированием при 115°С, 0,7 атм, 30 мин.

2.1.2. Выделение коллагена I типа

Основой для процедуры выделения коллагена I типа из сухожилий хвостов крыс послужили методика Price, 1975.

Выделяли волокна сухожилий хвостов крыс, промывали несколькими порциями стерильной дистиллированной воды, обсушивали. Волокна взвешивали и помещали в емкость с раствором 0,03М уксусной кислоты с пенициллин-стрептомицином (ПанЭко, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 ЕД/мл стрептомицина) из расчета 100 мл раствора на 1 г материала и инкубировали в течение 7 суток при температуре 4°С и постоянном перемешивании. Смесь центрифугировали 3000 g, 15 мин, 4°С. Надосадочную жидкость собрали и центрифугировали второй раз 20000 g, 45 мин, 4°С.

Коллаген осаждали хлоридом натрия до концентрации 3%. После центрифугирования (10000 g, 45 мин, 4°С) осадок ресуспендировали в 0,03 М УК с добавлением пенициллина-стрептомицина (1%). Результаты выделения белка, а также все этапы выделения анализировали методом электрофореза по Лэммли в 6% полиакриламидном геле (ПААГ). Полученный препарат белка подвергали лиофильной сушке и хранили при -20 °С.

Для приготовления матрикса белок растворяли в 0,03М уксусной кислоте. Для стерилизации к раствору белка добавляли хлороформ до концентрации 0,5% с последующим интенсивным диализом против уксусной кислоты для удаления хлороформа. Раствор для диализа также предварительно стерилизовали и добавляли антибиотики в количестве бензилпе-нициллина натриевой соли 50 Ед/мл и гентамицин 50 мкг/мл (ОАО «Дальхимфарм»). После стерилизации измеряли концентрацию белка в полученных растворах микробиуретовым методом.

2.1.3. Выделение и очистка димеров коллагена IV типа

Коллаген IV выделяли из мускульных куриных желудков по методике Perris et al., 1993. Желудки (100 г) гомогенизировали в 500 мл буфера 1 (0,05 М трис-HCl, рН 7.4, 0.15 М NaCl, 0,02М фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ)). Суспензию центрифугировали 12000 g, 20 мин, 4°С. Процедуру повторяли. Осадок гомогенизировали с добавлением 250 мл буфера 2 (0,05М трис-HCl, рН 7.4, 0Д5М NaCl, 0,02 М ФМСФ, 0,01М ЭДТУ), инкубировали на ледяной бане 1 час при потоянном перемешивании. Смесь осаждали центрифугированием 12000 g, 20 мин, 4°С, повторяли промывание буфером 2 в течение часа, суспензию центрифугировали.

Осадок ресуспендировали в 250 мл 0,5М уксусной кислоты, оставляли на магнитной мешалке на 3 сут. при температуре 4°С. Суспензию центрифугировали 3000g, 20 мин, 4°С.

Осадок нейтрализовали 0,2М гидрокарбонатом аммония, рН 7,9, центрифугировали. Осадок снова ресуспендировали в 125 мл 0,2М NH4HCO3, рН 7,9 и обрабатывали трипсином (150 мг, 1200 Ед/мг, MpBio) при комнатной температуре 4 ч, при постоянном перемешивании. Трипсинизацию останавливали добавлением ингибитора трипсина из соевых бобов (Reanal, 1 мг ингибирует 1 мг трипсина с активностью 10000 ВАЕЕ) в количестве 150 мг. Смесь центрифугировали 20000 g, 30 мин, 4°С. К надосадочной жидкости при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке добавляли NaCl до конечной концентрации 1,7 М. Смесь инкубировали 2 ч при температуре 4°С в покое. После центрифугирования 20000 g, 45 мин, 4°С осадок ресуспендировали в буфере 3 (трис-НС1 0,05 М, рН 8,6, мочевина 2М) и диализ-вали в течение ночи против того же буфера. Раствор белка осветляли центрифугированием при 20000 g, 20 мин для удаления нерастворимых примесей.

Препарат очищали при помощи анионообменной хроматографии на носителе ДЭАЭ-сефароза (объем колонки 12мл, диаметр 1,5 см). Колонку уравновешивали буфером 3. Скорость протока составляла 1 мл/мин. Собирали проточную фракцию, не связавшуюся с носителем. Хроматографические процедуры контролировали с помощью спектрофотометра, снабженного проточной кюветой (Schimadzu UV-2550, программное обеспечение UVprobe 2.10). Оптическую плотность регистрировали при длине волны 234 нм. Фракцию, содержащую очищенные NCl-гексамеры коллаген IV, диализовали против раствора гидрокарбоната аммония 0,2 М, рН 7,9. Результаты очистки белка проверяли электрофорезом по Лэммли (Laemmli, 1970) в 7,5% разделяющем геле. Концентрацию белка определяли микробиурето-вым методом.

Препарат коллагена IV стерилизовали фильтрованием (диаметр пор - 0,22мкм). После фильтрации измеряли концентрацию белка микробиуретовым методом.

2.1.4. Маркирование NCl-гексамеров коллагена IV флуоресцеина-5-изотиоцианатом

Белок модифицировали путем ковалентного присоединения ФИТЦ (флуоресцеина-5-изотиоцианата). Для окрашивания белка использовали свежеприготовленный раствор ФИТЦ в концентрации 100 мкг/мл на 0,1 М карбонатном буфере (рН 9,2). К белку, растворенному в 0ДМ карбонатном буфере (рН 9,2), 0,2М NaCl, добавляли раствор ФИТЦ в молярном соотношении равном 1:20. Смесь инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере. Отделяли конъюгат от несвязавшегося красителя при помощи гель-фильтрации на Sephadex G-25. В собранных фракциях определяли оптическую плотность при длинах волн 280 и 493 нм и строили профиль элюции. Объединяли фракции, содержащие конъюгат белка и красителя.

2.1.5. Определение содержания белка микробиуретовым методом

Микробиуретовый метод является качественной реакцией на пептидную связь (Ytz-haki R.F., Gill, 1964), позволят определять содержание белка в аликвоте в пределах от 0,1 до 10 мг.

В экспериментальные пробирки наливали определенный объем образца, содержащего от 0,1 до 1 мг белка, прибавляли воды до конечного объема пробы 2 мл и 1 мл микробиу-ретового реактива. В контрольную пробирку наливали 2 мл воды и 1 мл реактива. Спустя 5 мин переливали раствор из экспериментальных пробирок в кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см и измеряли оптическую плотность при длине волны равной 310 нм против кюветы с раствором из контрольной пробирки.

Расчет содержания белка в образце проводили по формуле:

М(мг)= ах + Ь,

где: М(мг) - содержание белка в пробе в миллиграммах; а и b - коэффициенты линейной регрессии, полученные при построении калибровочного графика; х - величина поглощения при длине волны, равной 31 Онм.

Биуретовый реактив, содержащий 30% NaOH и 1% CuSC>4, готовили заранее. Для его приготовления 300 г NaOH растворяли в 800мл дистиллированной воды и осторожно добавляли при интенсивном перемешивании 200мл водного раствора медного купороса, содержащего 2 г CuS04*5H20. Используя готовый реактив и 1%-ый раствор бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта, готовили серию растворов с градиентом концентрации, измеряли их оптическую плотность и строили калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка, рассчитывали коэффициенты линейной регрессии "а" и "Ь", которые использовали для расчета содержания белка в эксперименте.

2.1.6. Анализ белковых препаратов с помощью гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН)

Для разделения высокомолекулярных белковых компонентов, входящих в состав препаратов коллагена использовали 6%-ные, 7,5% разделяющие гели полиакриламида. Для приготовления разделяющего геля смешивали 5 мл 1,5 М Трис-HCl (pH 8,9), 4 мл (для 6% геля) 30%-ного акриламида (содержащего 1/30 часть метилен-бис-акриламида), 0,4 мл 0.1 М ЭДТА, 2 мл 50%-ного глицерина, 0,2 мл 10%-ного ДСН, 2 капли ТЕМЭД и добавляли дистиллированной воды до конечного объема 19 мл. Полимеризацию инициировали добавлением 1 мл 2%-ного персульфата аммония. Полученный раствор заливали в блок между двумя стеклянными пластинами. После окончания полимеризации (обычно через 15-20 мин) сверху наслаивали раствор концентрирующего геля, содержащий 2.5 мл 0.5 М Трис-HCl (pH 6,7), 1.5 мл 30% раствора акриламида, 0,2 мл 0.1 М ЭДТА, 1 мл 50% глицерина, 0,1 мл 10%

ДСН, 2 капли ТЕМЭД и воды до конечного объема 9 мл. Для инициации полимеризации непосредственно перед заливкой добавляли 1 мл 2%-ного персульфата аммония.

Образцы солюбилизировали в смеси, содержащей 2 мл 0,5 М Трис-HCl рН 6,7, 3,2 мл 50% глицерина, 0,2 мл 0,1 М ЭДТА, 1,6 мл 10% ДСН, 1 мл дистиллированной воды, бромфе-ноловый синий до яркой окраски. Конечная концентрация белка в смеси была 1-2 мг/мл. Солюбилизацию проводили кипячением образцов в солюбилизирующей смеси в течение 5 мин в закрытых пробирках для микропроб. Препараты наносили по 5-20 мкл в каждый кармашек геля, подслаивая под электродный буфер, содержащий 192 мМ Трис-глициновый буфер и 0,1% ДСН. Предфорез проводили при плотности тока 20 мА/гель в течение 20 мин. Плотность тока при самом электрофорезе поддерживали на уровне 25 мА/гель. Электрофорез проводили до тех пор, пока полоска красителя бромфенолового синего не достигала конца геля. Гель извлекали из ячейки, фиксировали 1 ч в растворе, содержащем 30% этилового спирта и 10% уксусной кислоты.

Гель окрашивали 0,125% раствором Кумасси бриллиантового синего G-250 в течение 1 ч при постоянном встряхивании. Краситель многократно отмывали раствором 7% уксусной кислоты до полного исчезновения фоновой окраски и четкого выявления белковых полос.

2.1.7. Исследование морфологии молекул биополимеров методом атомно-силовой микроскопии.

Для изучения ультраструктурных особенностей организации компонентов композиционных матриксных гидрогелей проведен структурный анализ методом атомно-силовой микроскопии. Препараты лиофильно высушенного коллагена I и NCl-гексамеров коллагена IV были солюбилизированы в растворе 0,03М уксусной кислоты, осветлены высокоскоростным центрифугированием при 14000 g, 20 мин. После определения концентрации белка полученные маточные растворы коллагена I и NCl-гексамеров коллагена IV были разбавлены раствором 0,03М уксусной кислоты до концентрации 50 мкг/мл. Полученные препараты наносили по 20 мкл на слюдяные подложки, приготовленные ex tempore методом расслаивания на скотче, инкубировали во влажной камере 30 мин. и удаляли неадгезированный материал с одновременной сушкой в потоке сжатого воздуха высокой степени очистки. Подготовленные образцы анализировали с помощью атомно-силового микроскопа BioScope Catalyst (Bruker, Германия).

2.2. Приготовление матриксных материалов

2.2.1. Приготовление матриц на стеклянной подложке

Тщательно вымытые оптические стекла обрабатывали горячей концентрированной соляной кислотой, промывали в проточной воде, дистиллированной воде, сушили, стерили-

зовали в сухожаровом шкафу и хранили в стерильной посуде. Для адсорбции белков в ряде случаев дополнительно покрывали триэтоксивинилсиланом. Стерильные оптические стекла инкубировали 1 час в 1 % растворе стерильных модифицированных пектинов МПК-0, МПК-30 и МПК-50, в закрытых чашках Петри. Высушивали стекла в течение 30-40 мин и раскладывали в лунки планшетов. Стерильные оптические стекла инкубировали в растворе коллагена I и коллагена IV в концентрации 100 мкг/мл в течение 12 часов при температуре 4°С. Стекла промывали фосфатным буферным солевым раствором.

Микроструктурированные матрицы изготавливали на оригинальной опытной установке инжекторного многоканального напыления. Спроектированная система представляла собой инжекторную многоканальную установку с точным позиционированием образца поддерживающего носителя, на который происходило прецизионное нанесение компонентов, солюбилизированных в подходящих растворителях. В качестве основы использовали подготовленные вышеуказанным способом покровные стекла. Разработанная конструкция позволяла осуществлять быстрое изготовление матриц с градиентами морфогенов и точным микропозиционированием компонентов разрабатываемых комплексных полимеров. Все полученные матрицы разработаны с применением данного аппаратного средства.

2.2.2. Приготовление матриксных материалов в форме гидрогелей

Исследование условии гелеобразования пектинов проводили визуальным методом (Gamier, 1993). Смешивали равное количество 3% раствора пектина и инициатора полимеризации, содержащего ЗООмМ натрия хлорида и кальция хлорида в концентрации от 2 до 20 мМ. Компоненты матриксов тщательно перемешивали в пробирках и оставляли на ночь при комнатной температуре. На следующий день пробы визуально оценивали, наклоняя пробирку под углом 45 градусов. Выделили следующие состояния образцов: раствор (образец при наклоне пробирки стекает), мягкий гель (гель, который сползает при наклоне пробирки на 45 градусов), твердый гель (гель, который не меняет своей формы при наклоне пробирки), гель с явлением синерезиса (отделение жидкой фазы геля). На основании данного эксперимента были выбраны оптимальные концентрации калция для формирования гидрогеля на основе пектина.

Были приготовлены два типа матриксных материалов для последующих исследований in vitro и in vivo: углеводный гель и композиционный гель.

Готовили инициатор гелеобразования для углеводного матрикса, содержащий 12 мМ СаСЬ, ЗООмМ NaCl, 100 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинсульфоновой кислоты (HEPES). Углеводный гидрогель готовили смешивая равные количества 3% раствора пектина и инициатора гелеобразования.

Готовили инициатор гелеобразования для композиционного матрикса, содержащий 20 мМ NaOH, 45 мМ HEPES, 85 мМ СаСЬ, 2,1 М NaCl. Стерилизовали автоклавированием при 121 °С, 1 атм, 30 мин. Композиционный гидрогель готовили из стерильных растворов пектина, коллагена I, NCl-гексамеров коллагена IV и инициатора гелеобразования по схеме, разработанной в данной работе (см. главу Результаты).

2.2.3. Приготовление коллагеновых мембран

Стерильный раствор коллагена I в 0,03 М уксусной кислоте с концентрацией 1,5 мг/мл нейтрализовали добавлением 1 М NaOH и 1 М HEPES. Раствор разлили по 4 мл в чашки Петри диаметром 4 см, инкубировали 30 мин при 37°С для полимеризации. Гели толщиной 3-4 мм сушили в ламинарном шкафу в течение суток при комнатной температуре. Пленки отделяли от чашек, разрезали на фрагменты 0,5 х 1 см, стерилизовали ультрафиолетом 30 мин.

2.3. Исследование свойств матриксных материалов in vitro

2.3.1. Получение и культивирование нейральных стволовых клеток

Для получения культур нейральных стволовых клеток использовали разные отделы головного мозга 15-ти дневных эмбрионов белых беспородных крыс. Беременных крыс усыпляли эфирным наркозом и забивали путем декапитации. Препарировали матку, извлекали эмбрионы, быстро промывали в стерильном физиологическом растворе и помещали в чашки Петри со средой ДМЕМ. В стерильных условиях препарировали эмбрионов, вскрывали черепную коробку и выделяли вентральные области среднего мозга, обонятельные доли и гиппокамп. Выделенные отделы мозга помещали в маркированные чашки со средой ДМЕМ.

Органы переносили в стерильные пробирки со средой ДМЕМ в объеме 2-3 мл и 20-30 раз пипетировали с помощью стерильной пипетки Пастера. Полученную суспензию клеток центрифугировали в стерильных флаконах типа Falcon при 400g, 10 мин. Клетки ресуспен-дировали в 2 мл стандартного раствора трипсина и ЭДТА (1:4), приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4) и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Действие трипсина ингиби-ровали добавлением среды с эмбриональной сывороткой. Материал пипетировали и суспензию осаждали при 400 g, 15 мин. Полученный осадок ресуспендировали в растворе среды с добавлением 12% эмбриональной сыворотки. Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью окраски трипановым синим с подсчетом клеток в камере Горяева.

Альтернативно, те же отделы эмбрионального мозга крыс дезагрегировали с помощью пипетки Пастера, оставляли в покое на 1 мин. для седиментации крупных фрагментов, суспензиию переносили в новую пробирку и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в среде Neurobasal (Invitrogen) с добавкой В-27 без витамина А, 10

нг/мл EGF, 20 нг/мл bFGF. Суспензию клеток высевали в полистирольные флаконы

С О

плотностью 2x10 клеток в 1 см среды. Клетки выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 12% фетальной сыворотки коров или в среде Neurobasal с вышеуказанными добавками при 37°С, 5% СОг- Пересев осуществляли каждые 7 дней, для этого собирали и дезагрегировали нейросферы, не затрагивая адгезированный и одиночный клеточный материал.

2.3.2. Культивирование нейральных стволовых клеток на поверхности мат-риксных материалов

После трех недель культивирования и пересева нейросфер в культуральных флаконах их клетки ресуспендировали и пересаживали на матриксные материалы в лунки 24-луночных культуральных планшетов.

Нейральные стволовые клетки культивировали на поверхности стеклянных матриц, покрытых биополимерами. Матрицы предварительно раскладывали в лунки 24-луночных планшетов. Лунки заливали средой на 1 ч. Через час среду меняли на среду с 2% эмбриональной сывороткой и помещали в лунки планшета клетки из расчета 22 тыс. клеток на лунку. В качестве контроля использовали полистирольный пластик дна планшета, а также стерильные оптические стекла. Культивировали клетки до 30 суток, среду меняли один раз в трое суток.

Нейральные стволовые клетки также культивировали на поверхности композиционных матриксных материалов в форме гидрогелей. Гидрогели готовили в лунках 24-луночных планшетов согласно методике, указанной в п.2.2.2. В лунки вносили среду с 2% эмбриональной сывороткой, инкубировали в течение 2 чаов. Затем меняли среду и помещали в лунки планшета клетки из расчета 22 тыс. клеток на лунку. В качестве контроля использовали полистирольный пластик дна планшета. Культивировали клетки в течение 7 суток.

Препараты анализировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM 510 Meta (Carl Zeiss) с применением детекторов проходящего и отраженного света; источников когерентного излучения - аргонового и гелий/неонового лазеров.

2.4. Исследование свойств матриксных материалов in vivo.

2.4.1. Подкожная имплантация матриксных материалов.

Углеводный гель и композиционный гель были имплантированы подкожно крысам для оценки биосовместимости и биодеградации.

В эксперименте использовали 36 белых крыс-самок линии Wistar массой около 250г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. Животных вводили в наркоз внутримышечным введением смеси золетила (2 мг/кг) и ксилазина (4 мг/кг). На спине выстрига-

ли шерсть и обрабатывали операционное поле раствором йода на 70% спирте. Разрезали кожу парамедиально и тупым рассечением делали карманы. В каждый карман помещали по одному имплантату. Каждому животному имплантировали 4 образца одного типа, по три крысы на каждый тип матрикса. Кожу ушивали шелком. Рану повторно обрабатывали спиртовым раствором и тетрациклином. Сразу после операции и в последующие три дня вводили подкожно профилактическую дозу антибиотика (цефтриаксон 40 мгк/г).

Животных выводили из эксперимента на сроках 10 дней, 1 месяц, 3 месяца глубоким эфирным наркозом. Извлекали имплантаты, фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере, в течение суток. Образцы отмывали фосфатным буфером и переводили в абсолютный этанол через серию водных растворов этанола. Заливали в парафин по стандартной методике. Изготавливали поперечные срезы толщиной 5 мкм. Окрашивали гематоксилином-эозином для выявления общей морфологии.

2.4.2. Имплантация матриксных гидрогелей в качестве консолидирующих субстратов в модели травмы спинного мозга 2.4.2.1.Ход операции

В эксперименте использовали белых беспородных крыс-самок линии массой 250300 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Модель острой травмы спинного мозга создавали путем удаления фрагмента спинного мозга длинной 2 мм на уровне 12 грудного - 1 поясничного позвонка, согласно работам Вэрли ^оег1у е1 а!., 2001Ь).

Анестезию осуществляли ингаляцией медицинского эфира. Волосяной покров на спине животного обрабатывали антисептическим раствором. Выбривали операционное поле. Зону операционного поля обрабатывали 70% этиловым спиртом.

Кожу рассекали по спине, продольно, над позвоночником от 9 грудного до 3 поясничного позвонков. Подкожные фасции отделяли ножницами по уровню кожного разреза. С двух сторон от остистого отростка 12 грудного позвонка (Т12) вплотную к нему, выполняли 2 параллельных разреза длиной приблизительно 15мм, отделяя мышцы от поверхности позвонка.

Проводили ламинэктомию на уровне 12 грудного позвонка, открывая прямой доступ к спинному мозгу. Спинной мозг пересекали одноразовым лезвием скальпеля. Кровотечение останавливали гемостатической коллагеновой губкой (ОАО Лужский завод "БЕЛКОЗИН"). После остановки кровотечения отсекали фрагмент спинного мозга длиной приблизительно 2 мм.

После полного гемостаза образовавшийся дефект спинного мозга в контрольной группе заполняли гемостатической губкой. В экспериментальной группе 1 дефект заполняли

углеводным гелем, в экспериментальной группе 2 - композиционным гелем. Имплантат изолировали коллагеновой мембраной. После чего рану послойно ушивали.

В течение трех дней после операции проводили курс антибактериальной терапии: 100 мкл цефтриоксона 5% внутрибрюшинно 2 раза в день. Осмотр оперированных животных проводили ежедневно в течение 3 месяцев до окончания эксперимента. Мочу спускали дважды в день. Трофические нарушения оценивали по общему виду крыс, потере массы тела, состоянию волосяного покрова, наличию трофических язв, пролежней.

Животных выводили из эксперимента на сроках 10, 1 месяц, 3 месяца глубоким эфирным наркозом.

2.4.2.2.Анализ двигательной активности крыс Восстановление нервной проводимости оценивали по появлению двигательной активности задних конечностей. Двигательную активность оценивали использованием патентованной шкалы «ВВВ» (Basso et al., 1995). Эта шкала является прямым аналогом оценочной шкалы «ASIA», используемой для диагностики неврологической патологии у человека. Шкала «ВВВ» включает набор из 21 уникального критерия качественной и количественной оценки различных движений в задних конечностях у животного со спинальной травмой, начиная от полного паралича, заканчивая полной подвижностью.

Шкала «ВВВ» для оценки локомоторной активности экспериментальных крыс ранжирует наблюдаемые параметры (21) в 5 групп признаков, соответствующих группам А-Е

по шкале ASIA.

ASIA ВВВ \ Признаки (параметры)

А 0 - не наблюдается никаких движений в задних конечностях; 1 - вялые движения в одном или двух суставах (обычно бедро или колено); 2 - активные движения в одном суставе ИЛИ бодрые движения в одном суставе и вялые движения в одном из других суставов. 3 - активные движения в двух суставах; 4 - вялые движения всех трёх суставах; 5 - вялые движения двух суставов И интенсивное движение в третьем; 6 - активные движения в двух суставах и вялое движение в третьем;

В 7 - активные движения в трёх суставах задней части тела; 8 - «ползание» без удержания веса ИЛИ подошвенная ходьба, но без удержания веса; 9 - подошвенными поверхностями задних конечностей удерживает вес, только когда стоит неподвижно ИЛИ, зачастую случайно, вес удерживается «задней не подошвенной ходьбой»; 10 - Редкие удержания веса во время ходьбы с опорой на подошвы, отсутствие координации между передними конечностями (ПК) и задними конечностями (ЗК);

С 11 - Частые удержания собственного веса во время ходьбы с опорой на подошвы и отсутствие координации между ПК - ЗК; 12 - Частые удержания собственного веса во время ходьбы с опорой на подошвы и случайная координация между ПК - ЗК; 13 - Частые удержания собственного веса во время ходьбы с опорой на подошвы

и частая координация между ПК - ЗК; 14 - Стабильные удержания собственного веса во время ходьбы с опорой на подошвы и хорошая координация между ПК - ЗК и преобладающая позиция лап после движения ротированная (внутрь или наружу), когда животные впервые контактируют с поверхностью, а также сразу после окончания подъёма ИЛИ частичные подошвенные движения;

д 15 - Стабильные подошвенные движения и стабильная координация между ПК -ЗК и отсутствие пальцевого зазора ИЛИ случайный пальцевой зазор после перемещения, преобладающая позиция лап - параллельно телу; 16 - Стабильные подошвенные движения и стабильная координация ПК - ЗК, отсутствие ротации лап после ходьбы; 17 - Уверенные, качественные движения задних конечностей с использованием подошв, качественная координация в ПК и ЗК, отсутствует клиренс большого пальца во время походки; после уверенных перемещений конечностей преобладающая позиция лап параллельно до и после подъема с опоры; 18 - Качественные движения лап с использованием подошв, качественная координация в ПК и ЗК, отсутствует клиренс большого пальца во время походки; после уверенных перемещений конечностей преобладающая позиция лап параллельно к началу контакта с поверхностью и ротирование к концу;

Е 19 - Качественные движения лап с использованием подошв; координация в ПК и ЗК; отсутствует клиренс большого пальца во время походки; после уверенных перемещений конечностей преобладающая позиция лап параллельно в начале контакта и в конце; хвост в нижней части всё время. 20 - Уверенная ходьба подошвами и координированная походка; клиренс большого пальца; преобладающая позиция лап параллельно до и после контакта; нестабильность позвоночника. 21 - Уверенная походка подошвами и координированная ходьба; стабильный клиренс большого пальца, позиция лап параллельно всё время; стабильный позвоночник.

2.4.2.3.Магнитно-резонансная томография спинного мозга крыс

Ядерно-магнитные резонансные (ЯМР) томограммы спинного мозга крыс получали на аппарате Вгикег РЬагшазсап 7 Тез1а в ТИБОХ ДВО РАН. Животных вводили в наркоз внутрибрюшинным введением смеси рометара и дроперидола.

2.4.2.4.Гистологические исследования

Фрагмент позвоночного столба, включающий область травмы спинного мозга, фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере, в течение суток. Декальцинацию образцов проводили при помощи 6% трихлоруксусной кислоты в течение 6 ч при постоянном перемешивании. Образцы отмывали фосфатным буфером и переводили в 70% спирт. Для гистологического анализа материал заключали в парафин по стандартной методике и изготавливали саггитальные срезы толщиной 15-20 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином. Методом иммуногистохимии в имплантате выявляли нейрональ-ные структуры (антитела против Р-Ш-тубулина) и астроциты (антитела против глиального кислого фибриллярного белка). После депарафинирования и регидратации срезы переводи-

ли в 0,05М трисовый буфер, содержащий детергент Tween-20, pH 7,4 (TBST). Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 30 мин в 3% растворе бычьего сывороточного альбумина, приготовленном на ТВ ST. Инкубацию с первичными антителами проводили при 4°С в течение ночи, затем промывали 3 раза по 10 минут в буфере. Визуализацию проводили с помощью вторичных антител, конъюгированных с флюоресцентным красителем Alexa fluor 546. Ядра окрашивали 4\6-диамидино-2- фенилиндола (DAPI). В других случаях визуализацию проводили при помощи непрямой стрептавидин-биотин-пероксидазной реакции. Инкубировали срезы 30 минут со вторичными биотинили-рованными антителами. Затем обрабатывали конъюгатом стрептавидин-пероксидазы и хромогеном Vector SG SK-4700 (Invitrogen). Препараты анализировали на уровне световой микроскопии, а также при помощи флуоресцентного микроскопа и лазерного конфокального микроскопа LSM Meta 510 (Carl Zeiss).

Для выявления коллагена препараты окрашивали пикросириусом красным. Использовали раствор 0,1% сириуса красного (Direct Red 80, Sigma), приготовленный на насыщенном растворе пикриновой кислоты. После депарафинирования и регидратации срезы инкубировали в растворе сириуса красного в течение часа. Затем быстро споласкивали в двух сменах 0,5% раствора уксусной кислоты и 1 смене дистиллированной воды. Препараты высушивали, просветляли в ксилоле и заключали в синтетическую смолу Glasseal. Анализировали при помощи светового микроскопа в условиях светлого поля и поляризационной микроскопии.

2.5. Статистическая обработка результатов

Жизнеспособность нейральных стволовых клеток, восстановление двигательной активности животных оценивали с применением критерия Манна-Уитни. Результаты обрабатывали в программе GraphPad.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

Для разработки биополимерных композиционных материалов для реконструктивной терапии заболеваний и травм нервной системы были выделены, очищены и охарактеризованы компоненты матриксных материалов - растительные полисахариды и белки животного происхождения.

3.1. Физико-химические свойства компонентов матриксных материалов 3.1.1. Анализ препаратов модифицированных пектинов

В качестве основного компонента биополимерных композиционных матриксных материалов были выбраны пектины - полисахариды клеточной стенки высших растений. Пектины представляют собой полимеры, основной структурной единицей которых является га-лактуроновая кислота. В природных пектинах более половины карбоксильных групп галак-туроновой кислоты этерифицированы метиловым спиртом, поэтому из растительного сырья получают высокоэтерифированные пектины. Для того, чтобы получить низкоэтерифициро-ванные пектины, природные полисахариды подвергают деэтерификации. Таким образом можно получать препараты пектинов с регулируемыми физико-химическими свойствами. В данной работе препараты модифицированных пектинов получали из высокоэтерифициро-ванного цитрусового пектина методом щелочной деэтерификации. Данным методом было получено 3 образца пектинов, отличающихся по количеству ионогенных групп. Препараты со степенью этерификации 1,2% и 27,4% относятся к низкоэтерифицированным пектинам. Препарат пектина со степенью этерификации 1,2% представляет собой практически полностью деэтерифицированный полисахарид, обладающий максимальным количеством заряженных карбоксильных групп в составе галактуроновой кислоты. Препарат пектина со степенью этерификации 52% обладает наименьшим количеством свободных карбоксильных групп и близок по строению к высокоэтерифицированным пектинам. Характеристики полученных препаратов представлены в таблице 1. Полученным образцам были присвоены условные обозначения МПК-0, МПК-30 и МПК-50, что соответствует модифицированным пектинам со степенью этерификации близкими к 0, 30 и 50%.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Щеблыкина, Анна Владимировна

выводы

1. Получены и охарактеризованы препараты биополимеров, пригодные для создания имплантируемых композиционных матриксных гидрогелей. NCl-гексамеры коллагена IV цыпленка, коллаген I и модифицированные пектины впервые использованы совместно для изготовления биосовместимых композиционных матриксных препаратов медицинского назначения.

2. Препараты модифицированных пектинов со степенью этерификации 1,2%, 27,4% и

52,0%, использованные в качестве однокомпонентного матрикса для культивирования клеток, подавляют спонтанную дифференцировку нейральных стволовых клеток, сохраняя культуры, способные к дальнейшему росту и дифференцировке на субстрате NCl-гексамеров коллагена IV цыпленка.

3. С помощью микроинжекторной установки получены лабораторные образцы микроструктурированных матриксных материалов на основе препаратов коллагена I типа, NCl-гексамеров коллагена IV типа и модифицированного пектина со степенью этерификации 27.4%. Нейральные клетки эмбрионального мозга крыс при культивировании на микроструктурированных матрицах локализуются вдоль треков NCl-гексамеров коллагена IV цыпленка, предпочитая его в качестве субстрата.

4. Разработан лабораторный регламент получения имплантируемого композиционного матрикса в форме гидрогеля, предназначенного в качестве консолидирующего субстрата для реконструктивной терапии травм мозга, на основе препаратов коллагена I, NC1 гексамеров коллагена IV и модифицированного пектина со степенью этерификации 27.4%.

5. Установлена биосовместимость композиционного матрикса in vitro при культивировании нейральных прогениторных клеток и in vivo на экспериментальной модели при подкожной имплантации крысам.

6. Имплантация разработанного композиционного матриксного материала в область повреждения на модели острой травмы спинного мозга крыс способствует восстановлению двигательной активности животных в среднем до 8,5±3,3 баллов по шкале оценки локомоторной активности «ВВВ».

7. Консолидирующий матрикс сохраняется в области травматического повреждения не менее 3 месяцев после экспериментальной травмы, препятствует развитию плотной посттравматической капсулы и способствует регенерации проводящих элементов спинного мозга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено исследование, посвященное разработке композиционных материалов в форме гирогелей, перспективных для применения в тканевой инженерии в качестве матрицы-носителя и субстрата для культивирования клеток. Проведен поиск и анализ информации, посвященной матриксным материалам, применяемым в области тканевой инженерии. На основании теоретических исследований были выбраны биополимеры, перспективные для создания композиционных матриксных материалов. Выделены, очищены и охарактеризованы препараты модифицированных пектинов, препарат коллагена I, препарат NC1-гекссамеров коллагена IV. Исследованы функциональные свойства компонентов матриксных материалов на культурах стволовых клеток. На основании предварительных экспериментов были выбраны 3 компонента и разработана технология получения композиционного матриксного материала в форме гидрогеля. Матриксные материалы в форме гидрогелей были протестированы in vitro на культурах нейральных стволовых клеток. Была показана способность композиционного гидрогеля поддерживать жизнеспособность, размножение и рост отростков нейральных стволовых клеток. Матриксные материалы были протестированы in vivo на модели подкожной имплантации и в качестве консолидирующего субстрата на модели острой травмы спинного мозга. Показано, что материалы являются биосовместимыми, медленно деградируемыми в организме лабораторных животных и способствуют репара-тивным процессам в области повреждения спинного мозга крыс. Матрикс восстанавливает целостность спинного мозга, способствует регенерации аксонов и восстановлению двигательных функций экспериментальных животных. Полученные данные закладывают основу для дальнейших исследований и разработок в области создания высокоструктурированных биосовместимых имплантируемых материалов медицинского назначения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Щеблыкина, Анна Владимировна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Брюховецкий A.C. Травма спинного мозга: клеточные технологии в лечении и реабилитации. - М.: Практическая медицина, 2010.-341 с.

2. Брюховецкий И.С. Механизмы регенерации спинного мозга крыс при трансплантации обкладочных нейроэпителиальных клеток в биополимерном коллагеновом матриксе. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 2008.

3. Брюховецкий И.С., Дюйзен И.В., Мотавкин П.А. Морфохимическая характеристика спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомии и трансплантации полимерного коллагенового нейроматрикса «Сферогель-Э»™ с инкорпорированными обкладочными нейроэпителиальными клетками. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2008. ТЗ, №2. С.57-62.

4. Гринь A.A., Яриков Д.Е. О стандартизации неврологических нарушений при изолированной травме позвоночника и спинного мозга // Нейрохирургия. 2000. №4. С. 37-39.

5. Ковалев В.В. Сравнительная оценка металлсвязывающей активности низкоэтерифици-рованных и высокоэтерифицированных пектинов. Дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 2004. - 127с.

6. Леонтьев М.А. Хирургическая коррекция патологии стопы в комплексе двигательной реабилитации у пациентов с нижней параплегией: Автореферат дисс. канд. мед. наук. Новокузнецк, 2003. 25 с.

7. Оводов Ю.С.. Современные представления о пектиновых веществах. Биоорганическая химия, 2009, т. 35, №3, с.293-310

8. Отеллин В.А. Нейробиологические проблемы структурно-медиаторной организации цнс и нейротрансплантологии. — СПб. Изд. РАМН, ИЭМ, 1992.

9. Фомина Г.А., Масгутов Р.Ф., Штырлин В.Г., Зявкина Ю.И., Челышев Ю.А. Гидрогеле-вый матрикс на основе биосовместимых карбомеров для восполнения дефектов нервной ткани // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. Том II, № 4. С. 63-67.

10. Хотимченко Ю.С., Кропотов A.B., Хотимченко М.Ю. Фармакологические свойства пектинов // Эфферентная терапия. 2001. Т. 7. №4. С. 22-36.

11. Ярыгин В. И., Банин В. В., Ярыгин К. И., Брюховецкий А. С.. Регенерация спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомии: рост и восстановление нервных проводников // Морфология. 2006. Т. 129, №1. С.30-38.

12. Aguayo A., David S., Richardson P., Bray G. Axonal elongation in periferal and central nervous system transplants. In Fedoroff, Herz, Advances in cellular neurobiology. 1982. Vol. 3. P. 215-234.

13. Agudo M., Woodhoo A., Webber D. et al. Schwann cell precursors transplanted into the injured spinal cord multiply, integrate and are permissive for axon growth // Glia. 2008. Vol. 56. P. 1263-1270.

14. Arnold M., Cavalcanti-Adam E.A., Glass R. et al. Activation of integrin function by nanopat-terned adhesive interfaces // A European journal of chemical physics and physical chemistry. 2004. Vol. 5. P. 383-388.

15. Aruffo A., Staminkovic I., Melnik M. et al. CD44 is the principal cell surface receptor for hya-luronate // Cell. 1990. Vol. 61. №7. P.1303-13.

16. Ashton R.S., Banerjee A., Punyani S. et al. Scaffolds based on degradable alginate hydrogels and poly(lactide-co-glycolide) microspheres for stem cell culture // Biomaterials. 2007. Vol. 28. P. 5518-5525.

17. Bandtlow C.E., Zimmermann D.R. Proteoglycans in the developing brain — new conceptual insights for old proteins // Physiology Review. 2000. Vol. 80. P. 1267-1290.

18. Barritt A.W., Davies M., Marchand F. et al. Chondroitinase ABC promotes sprouting of intact and injured spinal systems after spinal cord injury // Journal of Neuroscience. 2006. Vol. 26. P. 10856-10867.

19. Basso D.M., Beattie M.S., Breshahan J.C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats // Journal of Neurotrauma. 1995. Vol. 12. P. 1-21.

20. Battista S., Guarnieri D., Borselli C. et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation // Biomaterials. 2005. Vol. 26. P. 6194-6207.

21.Baumann M.D., Kang C.E., Tator C.H., Shoichet M.S. Intrathecal delivery of a polymeric nanocomposite hydrogel after spinal cord injury // Biomaterials. 2010. Vol. 31. P. 7631-7639.

22. Bekku Y., Su W.D., Hirakawa S. et al. Molecular cloning of Bral2, a novel brain-speciWc link protein, and immunohistochemical colocalization with brevican in perineuronal nets // Molecular and Cellular Neuroscience. 2003. Vol. 24. P.148-159.

23. Bergman M., Djaldetti M., Salman H., Bessler H. Effect of citrus pectin on malignant cell proliferation // Biomedical Pharmacotherapy. 2010. Vol. 64 (1). P. 44-47.

24. Bradbury E.J., Moon L.D.F., Popat R.J. et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury //Nature. 2002. Vol. 416. P. 636-640,

25. Bradford M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anales of Biochemistry. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

26. Bregman B., Kunkel-Bagden E., Schnell L. et al. Recovery from spinal cod injury mediated by antibodies to neurite growth inhibitors // Nature. 1995. Vol. 378. P. 498- 501,

27. Brightman A.O., Rajwa B.P., Sturgis J.E. et al. Time-lapse confocal reflection microscopy of collagen fibrillogenesis and extracellular matrix assembly in vitro // Biopolymers. 2000. Vol. 54. P. 222-234.

28. Brittis P.A., Flanagan J.G. Nogo domains and aNogo receptor: implications for axon regeneration//Neuron. 2001. Vol. 30. P. 11-14.

29. Bueter C.L., Lee C.K., Rathinam V.A. et al. Chitosan but not chitin activates the inflam-masome by a mechanism dependent upon phagocytosis // Journal of Biological Chemistry. 2011. Vol. 286 (41). P. 35447-55.

30. Calderwood D. A. Integrin activation // Journal of Cell Science. 2004. Vol. 117. P. 657-666.

31. Chang C., Liu H., Lina C. et al. Gelatin-chondroitin-hyaluronan tri-copolymer scaffold for cartilage tissue engineering // Biomaterials. 2003. Vol. 24. P. 4853^858.

32. Chen B.K., Knight A.M., Madigan N.N. et al. Comparison of polymer scaffolds in rat spinal cord: a step toward quantitative assessment of combinatorial approaches to spinal cord repair // Biomaterials. 2011. Vol. 32 (32). P. 8077-86.

33. Chen C.S., Alonso J.L., Ostuni E. et al. Cell shape provides global control of focal adhesion assembly // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2003. Vol. 307. P. 355361.

34. Chen C.S., Mrksich M., Huang S. et al. Micropatterned surfaces for control of cell shape, position, and function // Biotechnology Progress. 1998. Vol. 14. P. 356-363.

35. Chen H., Herndon M.E., Lawler J. The cell biology of thrombospondin- 1 // Matrix Biology. 2000. Vol. 19. P. 597-614.

36. Chen Y.G., Lee M.W., Tu Y.H. et al. Surface coupling of long-chain hyaluronan to the fibrils of reconstituted type II collagen // Artificial Cells and Blood Substitutes. Biotechnology. 2009. Vol. 37. P. 222-226.

37. Cheng H., Yihai C., Olson L. Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function // Science. 1996. Vol. 273. P. 510-513.

38. Cholas R.H., Hsu H.P., Spector M. The reparative response to cross-linked collagen-based scaffolds in a rat spinal cord gap model // Biomaterials. 2012. Vol. 3. P. 2050-2059.

39. Christopherson G.T., Song H., Mao H.Q. The influence of fiber diameter of electrospun substrates on neural stem cell differentiation and proliferation // Biomaterials 2009. Vol. 30. P. 556-564.

40. Cornbrooks C., Carey D., McDonald J., et al. In vivo and in vitro observations on laminin produced by Schwann cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983 Vol. 80. P. 3850-3854.

41. Cox D. N., Chao A., Baker J. et al. A novel class of evolutionary conserved genes defined by piwi are essential for stem cell self-renewal // Genes Dev. 1998. Vol. 12. P. 3715-3727.

42. Crompton K. E., Tomas D., Finkelstein D. I. et al. Inflammatory response on injection of chito-san/GP to the brain // Journal of Material Science: Materials for Medicine. 2006. Vol. 17. P. 633-639.

43. Cui F.Z., Tian W.M., Hou S.P., et al. Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering // Journal of Material Science: Materials in Medicine. 2006. Vol. 17. P. 1393-1401.

44. Cullen D.K., Lessing M.C., LaPlaca M.C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures // Annals of Biomedical Engineering. 2007. Vol. 35, №5. P. 835-846.

45. Deroanne C.F., Lapiere C.M., Nusgens B.V. In vitro tubulogenesis of endothelial cells by relaxation of the coupling extracellular matrix-cytoskeleton // Cardiovascular Research. 2001. Vol. 49. P. 647-658.

46. Dhoot N.O., Tobias C.A., Fischer I., Wheatley M.A. Peptide-modified alginate surfaces as a growth permissive substrate for neurite outgrowth // Journal of Biomedical Material Research, Part A. 2004. Vol. 71A. P. 191-200.

47. Dike L., Chen C., Mrksich M. Geometric control of switching between growth, apoptosis, and differentiation during angiogenesis using micropatterned substrates in vitro // Cell Devel. Biol. -Animal. 1999. Vol. 25. P. 441^148.

48. Discher D.E., Janmey P., Wang Y.L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate // Science. 2005. Vol. 310. P. 1139-1143.

49. Duncan I.D., Aguayo A.J., Bunge R.P., Wood P.M. Transplantation of rat Schwann cells grown in tissue culture into the mouse spinal cord // J Neurol Sci. 1981. Vol. 49. P. 241-252.

50. Dziadek M., Timpl R. Expression of nidogen and laminin in basement membrane during mouse embryogenesis and in teratocarcinoma cells // Development Biology. 1986. Vol. 111. P. 372382.

51. Eberli D. Regenerative medicine and tissue engineering - cells and biomaterials. InTech, 2011. 588 pages.

52. Einheber S., Schnapp L.M., Salzer J.L. et al. Regional and ultrastructural distribution of the alpha 8 integrin subunit in developing and adult rat brain suggests a role in synaptic function // Journal of Comparative Neurology. 1996. Vol. 370. P. 105-134.

53. Emerman J.T., Burwen S.J., Pitelka D.R. Substrate properties influencing ultrastructural differentiation of mammary epithelial cells in culture // Tissue Cell. 1979. Vol. 11. P. 109-119.

54. Engler A.J., Griffin M.A., Sen S. et al. Myotubes differentiate optimally on substrates with tissue-like stiffness: pathological implications for soft or stiff microenvironments // Journal of Cell Biology. 2004. Vol. 166. P. 877-887.

55. Engler A.J., Sen S., Sweeney H.L., Discher D.E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification // Cell. 2006. Vol. 126. P. 677-689.

56. Eyre D.R., Wu J.J. Collagen cross-links // Topics in Current Chemistry. 2005. Vol. 247. P. 207-209.

57. Fan H., Hu Y., Qin L. et al. Porous gelatin-chondroitin-hyaluronate tri-copolymer scaffold containing microspheres loaded with TGF-ßl induces differentiation of mesenchymal stem cells in vivo for enhancing cartilage repair // Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2006. Vol. 77A, №4. P. 785-794.

58. Feron F., Perry C., Cochrane J. et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human spinal cord injury // Brain. 2005. Vol. 128. P. 2951-2960.

59. Flanagan L.A., Ju Y., Marg B. et al. Neurite branching on deformable substrates // Neuroreport. 2002. Vol. 13. Vol. 18. P. 2411-2415.

60. Galtrey C.M., Fawcett J.W. The role of chondroitin sulfate proteoglycans in regeneration and plasticity in the central nervous system // Brain Research Reviews. 2007. Vol. 54. P. 1-18.

61. Gao X., Zhi Y., Zhang T. et al. Analysis of the neutral polysaccharide fraction of MCP and its inhibitory activity on galectin-3 // Glycoconjugate Journal. 2012. Vol. 29(4). P. 159-65.

62. Gamier C., Axelos M., Thibault J. Phase diagrams of pectin-calcium systems: Influence of pH, ionic strength, and temperature on the gelation of pectins with different degrees of methylation // Carbohydrate Research. 1993. Vol. 240. P. 219-232.

63. Georges P.C, Janmey P.A. Cell type-specific response to growth on soft materials // Applied Physiology. 2005. Vol.98. P. 1547-1553.

64. Gerecht S., Bettinger C.J., Zhang Z. et al. The effect of actin disrupting agents on contact guidance of human embryonic stem cells // Biomaterials. 2007. Vol. 28. P. 4068-4077.

65. Gillette B.M., Jensen J.A., Wang M.X. et al. Dynamic hydrogels: Sswitching of 3D microenvironments using two-component naturally derived extracellular matrices // Advanced Materials. 2010. Vol.22. P. 686-691.

66. Guilak F., Cohen D.M., Estes B.T. et al. Control of Stem Cell Fate by Physical Interactions with the Extracellular Matrix // Cell Stem Cell. 2009. Vol. 5, № 1. P. 17-26.

67. Gundersen R. W. Response of sensory neurites and growth cones to patterned substrata of laminin and fibronectin in vitro // Developmental Biology. 1987. Vol. 121. P. 423-432.

68. Hahn M.S., Teply B.A., Stevens M.M. et al. Collagen composite hydrogels for vocal fold lamina propria restoration // Biomaterials. 2006. Vol. 27. P. 1104-1109.

69. Hashimoto T., Suzuki Y., Kitada M et al. Peripheral nerve regeneration through alginate gel: analysis of early outgrowth and late increase in diameter of regenerating axons // Experimental brain research. 2002. Vol. 146, №3. P. 356-368

70. Hejcl A., Urdzikova L., Sedy J. et al. Acute and delayed implantation of positively charged 2-hydroxyethyl methacrylate scaffolds in spinal cord injury in the rat // J Neurosurg Spine. 2008. Vol. 8. P. 67-73.

71. Hockfield S., Kalb R.G., Zaremba S., Fryer H. Expression of neural proteoglycans correlates with the acquisition of mature neuronal properties in the mammalian brain // Cold Spring Harbor Symposium Quant Biology. 1990. Vol. 55. P. 505-514

72. Hooks B.M., Chen C. Critical periods in the visual system: changing views for a model of experience-dependent plasticity //Neuron. 2007. Vol. 56. P. 312-326.

73. Hopkins J.M., Ford-Holevinski T.S., McCoy J.P., Agranoff B.W. Laminin and optic nerve regeneration in the goldfish // Journal of Neuroscience. 1985. Vol. 5. P. 3030-3038.

74. Horn E.M., Beaumont M., Shu X.Z. et al. Influence of cross-linked hyaluronic acid hydrogels on neurite outgrowth and recovery from spinal cord injury // Journal of Neurosurgery-Spine. 2007. V. 6. P. 133-140.

75. Horst E., Meijer C.J., Radaszkiewicz T., Ossekoppele G.P., VanKrieken J.H.J.M., Pals S.T. Adhesion molecules in the prognosis of diffuse large-cell lymphoma: expression of a lymphocyte homing receptor (CD44), LFA-1 (CD11 a/18), and ICAM-1 (CD54) // Leukemia. 1990. Vol. 4. № 8. P. 595-599.

76. Hou S., Tian W., Xu Q. et al. The enhancement of cell adherence and inducement of neurite outgrowth og dorsal root ganglia co-cultured with hyaluronic acid hydrogels midified with Nogo-6 receptor antagonist in vitro // Neuroscience. 2006. Vol. 137. P. 519-529.

77. Hsia H.C., Schwarzbauer J.E. Meet the tenascins: multifunctional and mysterious // Journal of Biological Chemistry. 2005. Vol. 280. P. 26641-26644.

78. Humphries J.D., Byron A., Humphries M.J. Integrin ligands at a glance // Journal of Cell Science. 2006. Vol. 119. P. 3901-3903.

79. Hunt D., Coffin R.S, Anderson P.N. The Nogo receptor, its ligands and axonal regeneration in the spinal cord: a review // Journal of Neurocytology. 2002. Vol. 31. P. 93-120.

80. Hynes R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines // Cell. 2002. Vol. 110. P. 673-687.

81. Hynes R.O., Destree A.T. Relationships between fibronectin (LETS protein) and actin // Cell. 1978. Vol. 15. P. 875-886.

82. Iwanami A., Kaneko S., Nakamura M. et al. Transplantation of human neural stem cells for spinal cord injury in primates // Journal of Neuroscience Research. 2005. Vol. 80. P. 182-190.

83. Jain A., Kim Y.T., McKeon R.J., Bellamkonda R.V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury // Biomaterials. 2006. Vol. 27. P. 497-504.

84. Jones F.S., Jones P.L. The tenascin family of ECM glycoproteins: structure, function, and regulation during embryonic development and tissue remodeling // Developmental Dynamics. 2000. Vol. 218. P. 235-259.

85. Joo N.Y., Knowles J.C., Lee G.S. et al. Effects of phosphate glass fiber-collagen scaffolds on functional recovery of completely transected rat spinal cords // Acta Biomaterialia. 2012. Vol. 8(5). P. 1802-12.

86. Joosten E.A., Dijkstra S., Brook G.A. et al. Collagen IV deposits do not prevent regrowing axons from penetrating the lesion site in spinal cord injury // Journal of Neuroscince Research. 2000. Vol. 62. № 5. P. 686-691.

87. Kang H.J., Jo C., Kwon J.H. et al. Antioxidant and cancer cell proliferation inhibition effect of citrus pectin-oligosaccharide prepared by irradiation // Journal of Medicine and Food. 2006. Vol. 9(3). P. 313-20.

88. Kataoka K., Suzuki Y., Kitada M. et al. Alginate, a bioresorbable material derived from brown seaweed, enhances elongation of amputated axons of spinal cord in infant rats // Journal of Biomedical Materials Research. 2001. Vol. 54. P. 373-384.

89. Kataoka K., Suzuki Y., Kitada M., Hashimoto T. et al. Alginate enhances elongation of early regenerating axons in spinal cord of young rats // Tissue Engineering. 2004. Vol. 10. P. 493504.

90. Kerever A., Schnack J., Vellinga D. et al. Novel extracellular matrix structures in the neural stem cell niche capture the neurogenic factor fibroblast growth factor 2 from the extracellular milieu // Stem Cells. 2007. Vol. 25. P. 2146-2157.

91. Khotimchenko M.Y., Kolenchenko E.A., Khotimchenko Y.S. et al. Cerium binding activity of different pectin compounds in aqueous solutions // Colloids Surface B Biointerfaces. 2010. Vol. 77 (1). P. 104-10.

92. Kimble J., Crittendeon S.L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the sperm/oocyte decision in Caenorhabditis elegans // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2007. Vol. 23. P. 405^33.

93. King F.J., Lin H. Somatic signaling mediated by fs(l)Yb is essential for germline stem cell maintenance during Drosophila oogenesis // Development (Camb.). 1999. Vol. 126. P. 18331844.

94. Kleinman H.K. Isolation of laminin-1 and type IV collagen from the EHS sarcoma // Journal of Tissue Culture Methods. 1994. Vol. 16. P. 231-233.

95. Kobayashi K., Huang C.-I., Lodge T.P. Thermo-reversible gelation of aqueous methyl cellulose solutions //Macromolecules. 1999. Vol. 32. P. 7070-7077.

96. Kohama I., Lankford K.L., Preiningerova J. et al. Transplantation of cryopreserved adult human Schwann cells enhances axonal conduction in demyelinated spinal cord // Journal of Neuroscience. 2001. Vol. 21. P. 944-950.

97. Kolatsi-Joannou M, Price KL, Winyard PJ, Long DA. Modified citrus pectin reduces galectin-3 expression and disease severity in experimental acute kidney injury // PLoS One. 2011. Vol. 6 (4). P. 18683.

98. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. Vol. 227, №5259. P. 680-685.

99. Lechler T, Fuchs E. Asymmetric cell divisions promote stratification and differentiation of mammalian skin//Nature. 2005. Vol. 437. P. 275-280.

100. Leivo I., Vaheri A., Timpl R., Wartiovaara J. Appearance and distribution of collagens and laminin in the early mouse embryo // Developmental Biology. 1980. Vol. 76. P. 100-114.

101. Letourneau P., Madsen A., Palm S. Furcht L. Immunoreactivity for laminin in the developing longitudinal pathway of the brain // Developmental Biology. 1988. Vol. 125. P. 135-144.

102. Levenberg S., Huang N.F., Lavik E. et al. Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2003. Vol. 100, №22. P.12741-12746.

103. Li X., Yang Z., Zhang A. et al. Repair of thoracic spinal cord injury by chitosan tube implantation in adult rats // Biomaterials. 2009. Vol. 30 (6). P. 1121-1132.

104. Li Y., Field P.M., Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplant of olfactory ensheathing cells // Science. 1997. Vol. 277. P. 2000-2002.

105. Liesi P. Do neurons in the vertebrate CNS migrate on laminin // EMPO Journal. 1985. Vol. 4. P. 1163-1170.

106. Liesi P., Kauppila T. Induction of type IV collagen and other basement membrane-associated proteins after spinal cord injury of the adult rat may participate in formation of the glial scar // Experimental Neurology. 2002. Vol. 173. P. 31—45.

107. Liesi. P. Laminin and fibronectin in normal and malignant neuroectodermal cells // Medical Biology. 1984. Vol. 62. P. 163-180.

108. Lima C., Escada P., Pratas-Vital J., et al. Olfactory mucosal autografts and rehabilitation for chronic traumatic spinal cord injury // Neurorehabil Neural Repair. 2010. Vol. 24. P. 10-22.

109. Lima C., Pratas-Vital J., Escada P. et al. Olfactory mucosa autografts in human spinal cord injury: a pilot clinical study // J Spinal Cord Med. 2006. Vol. 29. P. 191-206.

110. Lin Y.C., Tan F.J., Marra K.G. et al. Synthesis and characterization of colla-gen/hyaluronan/chitosan composite sponges for potential biomedical applications // Acta Bio-materialia. 2009. Vol. 5. P. 2591-2600.

111. Lindenhayn K., Perka C., Spitzer R.-S. et al. Retention of hyaluronic acid in alginate beads: Aspects for in vitro cartilage engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 1999. Vol. 44(2). P. 149-155.

112. Liu H.M., Sturner W.Q. Extravasation of plasma proteins in brain trauma // Forensic Science International. 1988. Vol. 38. P. 285-295.

113. Liu L.S., Won Y.J., Cooke P.H. et al. Pectin/poly(lactide-co-glycolide) composite matrices for biomedical applications // Biomaterials. 2004. Vol. 25. P. 3201-3210.

114. Liu W.G., Griffith M., Li F.F. Alginate microsphere-collagen composite hydrogel for ocular drug delivery and implantation // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2008. Vol. 19. P. 3365-3371.

115. Lu J., Feron F., Mackay-Sim A., Waite P.M. Olfactory ensheathing cells promote locomotor recovery after delayed transplantation into transected spinal cord // Brain. 2002. Vol. 125. P. 14-21.

116. Lundell A., Olin A.I., Morgelin M. et al. Structural basis for interactions between tenascins and lectican C-type lectin domains: evidence for a crosslinking role for tenascins // Structure. 2004. Vol. 12. P. 1495-1506.

117. Luo J., Shi R.Y. Polyethylene glycol inhibits apoptotic cell death following traumatic spinal cord injury // Brain Research. 2007. Vol. 1155. P. 10-16.

118. Mackay-Sim A., St. John J.A. Olfactory ensheathing cells from the nose: Clinical application in human spinal cord injuries // Experimental Neurology. 2011. Vol. 229. P. 174-180.

119. Mao Y., Schwarzbauer J.E. Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process // Matrix Biology. 2005. Vol. 24. P. 389-399.

120. Marchand R., Woerly S. Transected spinal cords grafted with in situ self-assembled collagen matrices //Neuroscience. 1990. Vol. 36 (1). P. 45-60.

121. Marchand R., Woerly S., Bertrand L. et al. Evaluation of Two Cross-Linked Collagen Gels Implanted in the Transected Spinal Cord // Brain Research Bulletin. 1993. Vol. 30. P. 415-422,

122. Maroudas A. Physiochemical properties of articular cartilage in adult articular cartilage, 2nd ed. Kent, UK: Pitman Medical Publishing Co. 1979. P. 215-290.

123. McBeath R., Pirone D.M. et al. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment // Developmental Cell. 2004. Vol. 6. P. 483-495.

124. Miner J.H., Yurchenco P.D. Laminn functions in tissue morphogenesis // Annual Review of Cell and Developmental Biology. Biol. 2004. Vol. 20. P. 255-284

125. Mio K., Stern R. Inhibitors of the hyaluronidases // Matrix Biology. 2002.Vol. 21. P. 3137.

126. Miyake K., Media K.L., Hayashi S. et al. Monoclonal antibodies to Pgr-1/Cd44 block lym-pho-hemopoiesis in long- term bone marrow cultures // Journal of Experimental Medicine. 1990. Vol. P. 171-477.

127. Mosahebi A., Wiberg M., Terenghi G. Addition of fibronectin to alginate matrix improves peripheral nerve regeneration in tissue-engineered conduits // Tissue Engineering. 2003. Vol. 9 (2). P. 209-218.

128. Munarin F., Guerreiro S.G., Grellier M.A. et al. Pectin-Based Injectable Biomaterials for Bone Tissue Engineering // Biomacromolecules. 2011. Vol. 12 (3). P. 568-77.

129. Munarin F.., Tanzi M.C., Petrini P.. Advances in biomedical applications of pectin gels // International Journal of Biological Macromolecules. 2012. Vol. 51. P. 681-689.

130. Murphy-Ullrich J.E. The de-adhesive activity of matricellular proteins: Is intermediate cell adhesion an adaptive state? // Journal of Clinical Investigation. 2001. Vol. 107. P. 785-790.

131. Muzzarelli R., Baldassarre V., Ferrara C.F. et al. Biological activity of chitosan: ultrastructural study // Biomaterials. 1988. Vol. 9. P. 247-252.

132. Nag S., Takahashi J. L. Kilty D.W. Role of vascular endothelial growth factor in blood-brain barrier breakdown and angiogenesis in brain trauma // Journal of Neuropathol Exp Neurol. 1997. Vol. 56. P. 912-921.

133. Nahmias Y., Schwartz R.E., Verfaillie C.M. and others. Laser-guided direct writing for three-dimensional tissue engineering // Biotechnol. Bioeng. 2005. Vol. 92 (2). P. 129-136.

134. Neame P.J, Barry F.P. The link proteins // Experimentia. 1993. Vol. 49. P. 393^102.

135. Necas J., Bartosikova L., Brauner P., Kolar J. Hyaluronic acid (hyaluronan): a review // Veterinarni Medicina. 2008. Vol. 53 (8). P. 397-411.

136. Nelson C.M., Tien J. Microstructured extracellular matrices in tissue engineering and development // Current Opinion in Biotechnology. 2006. Vol. 17. P. 518-523.

137. Nicholson C., Sykova E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis // Trends Neuroscience. 1998. Vol. 21. P. 207-215.

138. Niederost B.P., Zimmermann D.R., Schwab M.E., Bandtlow C.E. Bovine CNS myelin contains neurite growth inhibitory activity associated with chondroitin sulfate proteoglycans // Journal of Neuroscience. 1999. Vol. 19. P. 8979-8989.

139. Nisbet D.R., Crompton K.E., Home M.K. Neural tissue engineering of the CNS using hydrogels // Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2008. Vol. 87B. P. 251-263.

140. Novikov L.N., Novikova L.N., Mosahebi A. et al. A novel biodegradable implant for neuronal rescue and regeneration after spinal cord injury // Biomaterials. 2002. Vol. 23. P. 33693376.

141. Novikova L.N., Mosahebi A., Wiberg M. et al. Alginate hydrogel and matrigel as potential cell carriers for neurotransplantation // Journal of Biomedical Materials Reseach, Part A. 2006. Vol. 77A. P. 242-252.

142. Novikova L.N., Novikov L.N., Kellerth J.O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury // Current Opinion in Neurology. 2003. Vol. 16. P. 711-715.

143. Nurcombe V., Ford M.D., Wildschut J.A., Bartlett P.F. Developmental regulation of neural response to FGF-1 and FGF-2 by heparan sulfate proteoglycan // Science. 1993. Vol. 260. P. 103-106.

144. Odde D.J., Renn M.J. Laser-guided direct writing of living cells // Biotechnol. Bioeng. 2000. Vol. 67, № 3. P. 312-318.

145. Ogawa Y., Sawamoto K., Miyata T. et al. Transplantation of in vitro-expanded fetal neural progenitor cells results in neurogenesis and functional recovery after spinal cord contusion injury in adult rats // Journal of Neuroscience Research. 2002. Vol. 69. P. 925-933.

146. Okada M., Miyamoto O., Shibuya S. et al. Expression and role of type I collagen in a rat spinal cord contusion injury model // Neuroscience Research. 2007. Vol. 58. P. 371-377.

147. Olano-Martin E., Rimbach G.H., Gibson G.R., Rastall R.A. Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in in vivo human colonic adenocarcinoma cells // Anticancer Res. 2003. V. 23. P. 341-346.

148. Oohira A., Fumiko M., Ritsuko K. Inhibitory Effects of Brain Chondroitin Sulfate Proteoglycans on Neurite Outgrowth from PCI 20 Cells // The Journal of Neuroscience. 1991. Vol. 1. №3. P. 822-827.

149. Park D.H., Lee J.H., Boriongan C.V. et al. Transplantation of Umbilical Cord Blood Stem Cells for Treating Spinal Cord Injury // Stem Cell Reviews and Reports. 2011. Vol. 7. P. 181194.

150. Park J., Lim E., Back S., et al. Nerve regeneration following spinal cord injury using matrix metalloproteinase-sensitive, hyaluronic acid-based biomimetic hydrogel scaffold containing brain-derived neurotrophic factor // Journal of Biomedical Materials Reseach, Part A. 2010. Vol. 93A. P. 1091-1099.

151. Peppas N.A., Hilt S.Z., Khademhosseini A., Langer R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology // Advanced Materials. 2006. Vol. 18, №11. P.1345-1360.

152. Perris R., Perissinotto D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration // Mechanisms of Development. 2000. Vol. 95. P. 3-21.

153. Perris R., Syfrig J., Paulsson M., Bronnerfraser M. Molecular Mechanisms of Neural Crest Cell Attachment and Migration on Type-I and Type-Iv Collagen // Journal of Cell Science. 1993. Vol. 106. P. 1357-1368.

154. Petersen O.W., Ronnovjessen L., Howlett A.R., Bissell M.J. Interaction with basement-membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992. Vol. 89, №19. P.9064-9068.

155. Phillippi J.A., Miller E., Weiss L. et al. Microenvironments engineered by inkjet bioprint-ing spatially direct adult stem cells toward muscle- and bone-like subpopulations // Stem Cells. 2008. Vol. 26. P. 127-134.

156. Pinzon A., Calancie B., Oudega M., Noga B.R. Conduction of impulses by axons regenerated in a Schwann cell graft in the transected adult rat thoracic spinal cord // J Neurosci Res. 2001. Vol. 64. P. 533-541.

157. Prang P., Muller R., Eljaouhari A., Heckmann K. et al. The promotion of oriented axonal regrowth in the injured spinal cord by alginate-based anisotropic capillary hydrogels // Biomaterials. 2006. Vol. 27. P. 3560-3569.

158. Preissner KT. Structure and biological role of vitronectin // Annu Rev Cell Biol. 1991. Vol. 7. P. 275-310.

159. Price P.J. Preparation and use of rat tail collagen // Methods in cell science. 1975. Vol. 1, № 1. P.43-44.

160. Ramachandran C., J Wilk Barry, Hotchkiss, Arland, Chau Hoa, Eliaz Isaac, Melnick Steven J. Activation of human T-helper/inducer cell, T-cytotoxic cell, B-cell, and natural killer (NK)-cells and induction of natural killer cell activity against K562 chronic myeloid leukemia cells with modified citrus pectin // BMC Complementary and Alternative Medicine 2011. Vol. 11. P.1-9.

161. Raz A, Loton R. Endogenous galactoside-binding lectins: a new class of functional cell surface molecules related to metastasis // Cancer Metastasis Review. 1987. Vol. 6. P. 433-452.

162. Recknor J.B., Sakaguchi D.S., Mallapragada S.K. Directed growth and selective differentiation of neural progenitor cells on micropatterned polymer substrates // Biomaterials. 2006. Vol. 27. P. 4098—4108.

163. Reilly G.C., Engler A.J. Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation // Journal of Biomechanics. 2010. Vol. 43. № 1. P. 55-62.

164. Ricard-Blum S., Ruggiero F., van der Rest M. The collagen superfamily // Top. Curr. Chem. 2005. Vol. 247. P.35-41.

165. Rochkind S. Shahar A., Fliss D. et al. Development of a tissue-engineered composite implant for treating traumatic paraplegia in rats // Europine Spine J. 2006. Vol. 15. P. 234-245.

166. Rosso F., Giordano A., Barbarisi M., Barbarisi A. From cell-ECM interactions to tissue engineering // Journal of cellular physiology. 2004. Vol. 199. P. 174-180.

167. Rowlands A.S., George P.A., Cooper-White J.J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation // American Journal of Physiology - Cell Physiology. 2008. Vol. 295. P. C1037-C1044.

168. Ruoslahti E. Brain extracellular matrix (review) // Glycobiology. 1996/ Vol. 6. P. 489-492.

169. Ruoslahti E., Reed J. Anchorage dependence, integrins, and apoptosis // Cell. 1994. Vol. 77. P. 477 - 478.

170. Sadeghi M. Pectin-Based Biodegradable Hydrogels with Potential Biomedical Applications as Drug Delivery Systems // Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology. 2011. Vol. 2. P. 36-40.

171. Saha K., Keung A.J., Irwin E.F., Li Y., Little L., Schaffer D.V., Healy K.E. Substrate modulus directs neural stem cell behavior // Biophysical Journal. 2008. Vol. 95. P. 4426-4438.

172. Sajjad, 2004. Spinal cord regeneration via collagen tube intubulation. Master thesis. - Massachusetts Institute of Technology. 2004. - 57p.

173. Sanes J.R. Extracellular matrix molecules that influence neural development // Annual Reviews in Neuroscience. 1989. Vol. 12. P.491-516.

174. Schnell L., Schwab M.E. Axonal regeneration in the rat spinal cord produced by an antibody against myelin-associated neurite growth inhibitors // Nature. 1990. Vol. 343. P. 269-272.

175. Schofield R. The relationship between the spleen colony- forming cell and the haemopoi-etic stem cell // Blood Cells. 1978. Vol. 4. P. 7-25.

176. Semino C.E., Merok J.R., Crane G.G., Panagiotakos G., Zhang S.G. Functional differentiation of hepatocyte-like spheroid structures from putative liver progenitor cells in three-dimensional peptide scaffolds // Differentiation. 2003. Vol. 71. P. 262-270.

177. Shea L.D., Smiley E., Bonadio J., Mooney D.J. DNA delivery from polymer matrices for tissue engineering //Nature Biotechnology. 1999. Vol. 17, №6. P. 551-554.

178. Silva G.A., Czeisler C., Niece K.L., Beniash E., Harrington D.A., Kessler J.A., Stupp S.I. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers // Science. 2004. Vol. 303, № 5662. P. 1352-1355.

179. Silver J., Miler J.H. Regeneration beyond the glial scar // Nature Reviews Neuroscience. 2004. Vol. 5, №2. P. 146-156.

180. Sirchia R., Ciaccioferal V., Luparello C. Tumor cell-collagen interactions: Identification and semiquantitative evaluation of selectively-expressed genes by combination of differential display- and multiplex-PCR // Biological Proceedings. 2003. 5, №1. P. 222-227.

181. Spicer A.P., Joo A., Bowling R.A. A hyaluronan binding link protein gene family whose members are physically linked adjacent to chondroitin sulfate proteoglycan core protein genes: the missing links // Journal of Biological Chemictry. 2003. Vol. 278. P. 21083-21091.

182. Stamencovic I., Amiot M., Pesando J.M., Seed B. A lympocyte molecule implicated in lymph node homing is a member of the cartilage link protein family // Cell. 1989. Vol. 56, № 6. P.1057-1062.

183. Stichel C.C., Muller H.W. The CNS lesion scar: new vistas on an old regeneration barrier // Cell Tissue Research. 1998. Vol. 294. P. 1-9.

184. Stokols S., Tuszynski M.H. Freeze-dried agarose scaffolds with uniaxial channels stimulate and guide linear axonal growth following spinal cord injury // Biomaterials. 2006. Vol. 27. P. 443-451.

185. Stokols S., Tuszynski M.H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury // Biomaterials. 2004. Vol. 25. P. 5839-5846.

186. Straley K.S., Foo C.W.P., Heilshorn S.C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries // Journal of neurotrauma. 2010.Vol. 27. P. 1-19.

187. Stuart K., Panitch A. Characterization of Gels Composed of Blends of Collagen I, Collagen III, and Chondroitin Sulfate // Biomacromolecules. 2009. Vol. 10. P. 25-31.

188. Stuart K., Panitch A. Influence of chondroitin sulfate on collagen gel structure and mechanical properties at physiologically relevant levels // Biopolymers. 2008. Vol. 89. P, 841851.

189. Sugar O., Gerard R.W. Spinal cord regeneration in the rat // Journal of Neurophysiology. 1940. Vol. 3.P. 1-19.

190. Surazynski A., Miltyk W., Czarnomysy R., Grabowska J., Palka J. Hyaluronic acid abrogates nitric oxide-dependent stimulation of collagen degradation in cultured human chondrocytes // Pharmacological Research. 2009. Vol. 60. P. 46-49.

191. Suri S., Schmidt C.E. Cell-laden hydrogel constructs of hyaluronic acid, collagen, and laminin for neural tissue engineering // Tissue Engineering Part A. 2010. Vol. 16. P. 17031716.

192. Suzuki K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Regeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel // Neuroreport. 1999. Vol. 10. P. 2891-2894.

193. Sykova E., Jendelova P., UrdzHkova L. et al. Bone marrow stem cells and polymer hy-drogels-two strategies for spinal cord injury repair // Cell and Molecular Neurobiology. 2006. Vol. 26(7-8). P.l 113-29.

194. Tang M.D, Golden A.P., Tien J. Molding of three-dimensional microstructures of gels // Journal of American Chemical Society. 2003. Vol. 125. P. 12988-12989.

195. Taupin P., Gage F. Adult neurogenesis and neural stem cells of the central nervous system in mammals // Journal of Neuroscience Research. 2002. Vol. 69. P. 745-749.

196. Teng Y.D., Lavik E.B., Qu X. et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells // PNAS. 2002. Vol. 99 (№5). 3024-3029.

197. Testaz S., Duband J.L. Central role of the alpha4betal integrin in the coordination of avian truncal neural crest cell adhesion, migration, and survival // Developmental Dynamics. 2001. Vol. 222. P. 127-140.

198. Tien J., Nelson C.M., Chen C.S. Fabrication of aligned microstructures with a single elas-tomeric stamp // PNAS. 2002. Vol. 99, № 4. P. 1758-1762.

199. Timpl R., Tisi D., Talts J.F. et al. Structure and function of laminin LG modules // Matrix Biology. 2000. Vol. 19. P. 309-317.

200. Timpl, R., Rohde, H., Robey, P.G. et al. Laminin, a glycoprotein from basement membranes // Journal of Biology Chemistry. 1979. Vol. 254. P. 9933-9937.

201. Tobias C.A., Dhoot N.O., Wheatley M.A. et al. Grafting of encapsulated BDNF-producing fibroblasts into the injured spinal cord without immune suppression in adult rats // Journal of Neurotrauma. 2001. Vol. 18. P. 287-301.

202. Tobias C.A., Han S.S.W., Shumsky J.S. et al. Alginate encapsulated BDNF-producing fibroblast grafts permit recovery of function after spinal cord injury in the absence of immune suppression // Journal of Neurotrauma. 2005. Vol. 22. P. 138-156.

203. Trakhtenberg I.M., Litenko V.A., Dereviago I.B. et al. The use of pectin-containing entero-sorbents in exposure to radionuclides and heavy metals // Likars'ka sprava. 1992. Vol. 5. P. 2933.

204. Tsai E.C., Dalton P.D., Shoichet M.S., Tator C.H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection // Journal of neurotrauma. 2004. Vol. 21. P. 789-804.

205. Vogel V., Sheetz M. Local force and geometry sensing regulate cell functions // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2006. Vol. 7. P. 265-275.

206. Walker M.R., Patel K.K., Stappenbeck T.S. The stem cell niche // The Journal of Pathology. 2009. Vol. 217. P. 169-180

207. Wang W.H., Zhang M., Lu W. et al. Cross-linked collagen-chondroitin sulfate-hyaluronic acid imitating extracellular matrix as scaffold for dermal tissue engineering // Tissue Engineering, Part C-Methods. 2010. Vol. 16. P. 269-279.

208. Wang Y., Lapitsky Y., Kang C.E., Shoichet M.S. Accelerated release of a sparingly soluble drug from an injectable hyaluronan-methylcellulose hydrogel // Journal of Controlled Release. 2009. Vol. 140. P. 218-223.

209. Wei Y.T., He Y., Xu C.L. et al. Hyaluronic acid hydrogel modified with nogo-66 receptor antibody and poly-L-lysine to promote axon regrowth after spinal cord injury // Journal of biomedical materials research B: applied biomaterials. 2010. Vol. 95B. № 1. P. 110-117.

210. Weidnera N., Grilla R.J., Tuszynski M.H. Elimination of basal lamina and the collagen "scar" after spinal cord injury fails to augment corticospinal tract regeneration // Experimental Neurology. 1999. Vol. 160, №1. P. 40-50.

211. Wells M.R., Kraus K., Batter D.K. et al. Gel matrix vehicles for growth factor application in nerve gap injuries repaired with tubes: a comparison of biomatrix, collagen, and methylcel-lulose//Experimental Neurology. 1997. Vol. 146. P. 395-402.

212. Whitesides G.M., Ostuni E., Takayama S. Soft lithography in biology and biochemistry // Annual Review of Biomedical Engineering. 2001. Vol. 3. P. 335-373.

213. Woerly S., Doan D., Sosa N. et al. Reconstruction of the transected cat spinal cord following NeuroGel™ implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructural studies // International Jornal of Developmental Neuroscience. 2001. Vol. 19. P. 63-83.

214. Woerly S., Doan V., Evans-Martin F. et al. Spinal cord reconstruction using NeuroGel (TM) implants and functional recovery after chronic injury // Journal of Neuroscience Research. 1998a. Vol. 66. P. 1187-1197.

215. Woerly S., Pinet E., De Robertis L. et al. Heterogeneous PHPMA hydrogels for tissue repair and axonal regeneration in the injured spinal cord // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 1998b. Vol. 9. P. 681-711.

216. Wu S.F., Suzuki Y., Kitada M. et al. Migration, integration, and differentiation of hippocampus-derived neurosphere cells after transplantation into injured rat spinal cord // Neuroscience Letters. 2001. Vol. 312. P. 173-176.

217. Wyndaele M., Wyndaele J.J. Incidence, prevalence and epidemiology of spinal cord injury: what learns a worldwide literature survey? // Spinal Cord. 2006. Vol. 44 (9). P. 523-9.

218. Xiao M., Klueber K.M., Lu C. et al. Human adult olfactory neural progenitors rescue axotomized rodent // Experimental Neurology. 2005 Vol. 194, № 1. P. 12-30.

219. Xie T., Spradling A.C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary // Science. 2000. Vol. 290. P. 328-330.

220. Xie W., Xu P., Wang W., Liu Q. Preparation and antibacterial activity of a water-soluble chitosan derivative // Carbohydrate Polymer. 2002. Vol. 50. P. 35^0.

221. Yan J, Katz A. PectaSol-C modified citrus pectin induces apoptosis and inhibition of proliferation in human and mouse androgen-dependent and- independent prostate cancer cells. Integr Cancer Ther. 2010 Jun;9(2): 197-203.

222. Yim E.K., Pang S.W., Leong K.W. Synthetic nanostructures inducing differentiation of human mesenchymal stem cells into neuronal lineage // Experimental Cell Research. 2007. Vol. 313. P. 1820-1829.

223. Yoshii S., Ito S., Shima M., Taniguchi A., Akagi M. Functional restoration of rabbit spinal cord using collagen-filament scaffold // Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2009. Vol. 3. P. 19-25.

224. Ytzhaki R.F., Gill D.M. A micro-biuret method for estimating proteins // Analytical Biochemistry. 1964. Vol. 9, P. 401—407.

225. Zhang S., Zhao X., Spirio L. PuraMatrix: Self-assembling peptide nanofiber scaffolds. In: Ma, PX.; Elisseeff, J., editors. Scaffolding in tissue engineering. Boca Raton, FL: CRC Press; 2005. P. 217-238.

226. Zhong J., Chan A., Morad L., Kornblum H.i., Fan G., Carmichael S.T. Hydrogel matrix to support stem cell survival after brain transplantation in stroke // Neurorehabilitation and Neural Repair. 2010. Vol. 24 (7). P. 636-44.

227. Zimmermann D.R., Dours-Zimmermann M.T. Extracellular matrix of the central nervous system: from neglect to challenge // Histochem Cell Biology. 2008. Vol. 130. P. 635-653.

228. Zurita M., Vaquero J., Bonilla C. et al. Functional recovery of chronic paraplegic pigs after autologous transplantation of bone marrow stromal cells // Transplantation. 2008. Vol. 86. P. 845-853.