Адаптивный ответ в клетках человека с различной способностью репарировать повреждения ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Каминская, Инесса Алексеевна

• Каминская, Инесса Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каминская, Инесса Алексеевна

Содержание Страницы

Список сокращений

Актуальность работы 5

Цели и задачи исследования

Научная новизна

Научно-практическое значение работы

Обзор литературы 10

Общие понятия об адаптивном ответе 11

Гипотезы о механизмах адаптивного ответа в клетках человека 14

Перекрестный адаптивный ответ в клетках человека 18

Адаптивный ответ в репарационно -дефектных клетках человека 22

Адаптивный ответ в лимфоцитах людей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации, в результате аварии на 25 - 30 ЧАЭС

Экспериментальная часть 31

Глава 1. Материалы и методы 32

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Культура лимфоцитов периферической крови человека

2.1.2. Перевиваемые культуры клеток 32

2.1.3. Культура куриных фибробластов

2.2. Мутагены и их действие 33

2.3. Методы исследования 35-38 2.3.1. Определение возникновения однонитевых разрывов ДНК

2.3.1.1. Получение клеточных лизатов

2.3.1.2. Хроматография клеточных лизатов 36

2.3.2. Реактивация и индуцированный мутагенез вируса осповакцины

Глава 2. Адаптивный ответ в репарационно дефектных клетках человека а) Пигментная ксеродерма б) Гомоцистинурия Заключение

40-53 54-58 59

Глава 3. Радиоадаптивный ответ (РАО) в лимфоцитах детей, проживающих на территории с повышенным фоном радиации 61а) РАО в лимфоцитах детей, проживающих на загрязненной территории, в зависимости от плотности загрязнения 62 б) Сравнение РАО у детей с умственной отсталостью, проживающих на контрольных территориях и территориях с повышенным фоном радиации

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Адаптивный ответ в клетках человека с различной способностью репарировать повреждения ДНК»

Актуальность работы

Адаптивный ответ (АО)- одна из форм защиты клеток от внешних факторов, в частности, мутагенов. Адаптирующим фактором могут служить малые дозы радиации, некоторых химических мутагенов, тепловой шок, и др. Для проявления феномена адаптации необходим латентный период -не менее 3-х часов. В течение этого времени происходит индукция белков, о чем говорит отсутствие АО при обработке клеток ингибиторами белкового синтеза. Индуцируемые белки обеспечивают повышенную устойчивость клеток к последующему воздействию больших доз мутагенов (радиация, химические мутагены). Адаптивный ответ регистрируется по критериям хромосомных аберраций, СХО, генных мутаций, выживаемости клеток, индукции разрывов ДНК. Однако, несмотря на более чем пятнадцатилетний период изучения АО, механизм его формирования совершенно неясен. Большинство исследователей полагают, что для проявления АО необходимо функционирование репаративной системы. Эта точка зрения основывается на том, что в некоторых радиочувствительных клетках человека, например, в клетках больных синдромом Дауна, РАО отсутствует (Хандогина и др., 1991).

РАО не был выявлен также у людей, проживающих в зонах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС (Пелевина и др.,1996). Вместе с тем, показано, что репарация индуцированных повреждений ДНК в клетках этого контингента людей не отличается от контрольного уровня.

Следовательно, можно предполагать, что эти процессы, осуществляющие защиту клеток от мутагенов, могут быть не связаны.

Неясность механизма, формирующего АО, и имеющиеся противоречивые данные по этому вопросу и послужили предпосылкой к проведению данного экспериментального исследования для решения вопроса о связи или отсутствии таковой между репарацией ДНК и адаптивным ответом.

Цели и задачи исследования

Для определения возможной связи между двумя защитными системами клетки - репарацией ДНК и адаптивным ответом были изучены уровни РАО в репарационно-дефектных клетках человека; в лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном ионизирующей радиации; в клетках человека, предобработанных тяжелым металлом, вызывающим нерепарабельные повреждения ДНК.

Таким образом, была исследована способность формировать адаптивный ответ в разных системах, различающихся по характеру репарации ДНК.

В процессе работы решались следующие конкретные задачи:

1. Изучение возможной связи между репарацией ДНК и формированием РАО в репарационно-дефектных клетках человека.

2. Исследование уровней РАО в лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном ионизирующей радиаци.

3. Определение возможности индукции адаптивного ответа в клетках человека при воздействии тяжелых металлов, индуцирующих нерепарабельные повреждения ДНК.

Научная новизна

Впервые в экспериментах изучена связь между репарацией ДНК и способностью клеток человека формировать адаптивный ответ. С этой целью исследованы 3 системы, различающиеся по репарации ДНК:

1. Впервые в прямых экспериментах изучена связь между репарацией ДНК и способностью клеток человека формировать адаптивный ответ.

2. Выявлено, что в репарационно - дефектных клетках пигментной ксеродермы и гомоцистинурии не наблюдалась корреляция между формированием АО и способностью к репарации индуцированных повреждений ДНК.

В лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации, не отличающихся повышенной радиочувствительностью, обнаружена выраженная гетерогенность по формированию РАО.

Впервые доказано, что хлористый кадмий, индуцирующий нерепарабельные повреждения ДНК, способен формировать АО в клетках человека, предобработанных малыми концентрациями этого мутагена.

3. Впервые получены доказательства независимости двух защитных систем в клетках человека: системы репарации ДНК и способности формировать адаптивный ответ в 3-х модельных системах.

Научно - практическое значение работы

Различия в адаптивном ответе среди детей с наследственными заболеваниями соединительной ткани позволяет проводить диагностику и дифференциальную диагностику между исследуемыми синдромами.

Выявлена гетерогенность по радиоадаптивному ответу (РАО) у детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС.

Опубликовано пособие для врачей «Определение адаптивного ответа в лимфоцитах детей, подвергшихся воздействию малых доз ионизирующей радиации», М., 1998).

Возможно, что РАО может быть отнесен к показателям повышенного риска у детей.

Способность невысоких концентраций хлористого кадмия инициировать адаптивный ответ развивает новый подход к повышению устойчивости клеток человека к мутагенам окружающей среды, в том числе тяжелым металлам.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общие понятия об адаптивном ответе.

Адаптивный ответ (АО) является одной из форм защиты клеток от воздействия мутагенов.

АО проявляется в том, что предварительное воздействие на клетки малых доз некоторых физических или химических мутагенов, практически не вызывающих повреждений, увеличивает их устойчивость к повторному воздействию этого же, а иногда и другого мутагена в повреждающих дозах после определенного интервала времени. В качестве критериев повреждения клетки обычно используют:

1) формирование хромосомных аберраций (ХА),

2) сестринские хроматидные обмены (СХО),

3) микроядерный тест,

4) выживаемость клеток,

5) количество повреждений в ДНК,

6) генные мутации,

7) разрывы ДНК.

Характерной особенностью адаптивного ответа клеток на воздействие ионизирующей радиации является более чем 100 - кратное различие в величинах адаптирующей и повреждающей доз. Само по себе облучение малой дозой вообще не вызывает каких-либо изменений (ХА, СХО и т.д.), однако, при повторном облучении в высокой дозе регистрируемый эффект оказывается существенно ниже, чем таковой, наблюдаемый при однократном облучении.

Феномен адаптивного ответа был обнаружен Самсоном и Кернсом в 1977 г. на клетках Е. coli. (L. Samson, J. Cairns, 1977). Это явление выражалось в индукции низкими концентрациями и алкилирующих соединений (М-метил-М-нитро-Ы-нитрозогуани-дин) устойчивости клеток к последующему воздействию высоких концентраций того же мутагена, что приводило к уменьшению мутаций.

В дальнейшем адаптивный ответ был обнаружен у различных представителей эукариотов: растений, животных, человека. При этом АО описан не только в системе in vitro, но и in vivo (Morales-Kamiuz et al.,1996).

Кроме того, АО формируется при хроническом облучении малыми дозами радиации (Дубинин, 1994, Wolff, 1996, Mitchel, 1996 и др.).

Индукторами адаптивного ответа могут служить не только радиация, химические мутагены, но и инкорпорированный л

Н -тимидин, перекись водорода (Wolff et al., 1990, Zhang, 1995 и др.). Однако, перекись водорода менее эффективный индуктор устойчивости клеток, по сравнению с низкими дозами х-лучей (Cortes et al., 1994).

Для низших эукариот (дрожжей) адаптация к радиации может быть стимулирована также стрессами, такими как тепловой шок или голодание. Тепловой шок (40°С,15 мин.) как адаптирующий фактор был эффективен также для фибробластов человека, когда наблюдалась стимуляция репарации двойных разрывов ДНК (Mitchel, 1996).

Большинство работ по АО выполнено на лимфоцитах человека. При этом оптимальными условиями для формирования адаптивного ответа считают Gi, S и G2 фазы клеточного цикла (Wolff, 1996 и др.). Однако некоторые авторы сообщили о возможности АО и в фазе G0 (Cortes et. al., 1994). По этому вопросу в литературе имеются противоречивые сведения. Так, еще в 1980 г. Tuschl et al. обнаружили в нестимулированных лимфоцитах (Go) повышение внепланового синтеза ДНК и пониженный уровень СХО у людей, работающих на реакторе, после УФ-облучения.

Другие авторы (Moquet et al. Д 989) показали отсутствие АО в Go облученных лимфоцитах, когда в качестве повреждающего фактора использовали митомицин С. Эти работы сложно сравнивать, т.к. в первом случае объектом служили лимфоциты облученных людей, тогда как во втором - опыты проводили in vitro. Вместе с тем, по критерию хромосомных аберраций также наблюдали адаптивный ответ в нестимулированных лимфоцитах человека (Cai, Liu, 1990).

Гипотезы о механизмах адаптивного ответа в клетках человека.

Несмотря на то, что АО известен более десяти лет, механизм его остается неясным. По этому вопросу в литературе существуют противоречивые сведения.

Многие исследователи полагают, что для АО необходима репарация ДНК (Wojcik et al.,1996, Shadley & Wolff, 1987, Wolff et al., 1989, Gazievet al., 1992 и др.). Это предположение основывалось на ряде фактов. Так, наблюдался повышенный УФ-индуцированный внеплановый синтез ДНК в адаптированных клетках. Было показано, что 3-аминобензамид - ингибитор поли (АДФ-рибозы)-полимеразы, циклогексимид - ингибитор белкового синтеза-подавляют формирование АО. Кроме того, необходимость, приблизительно, 4-х часовой экспозиции после адаптирующей дозы для развития устойчивости клеток является также доказательством индукции каких-то ферментных систем. Кстати, новые белки при использовании 2-Д гелевого электрофореза были обнаружены в клетках после адаптирующей дозы (Ikushima,1992).

Была определена индукция после низкой дозы Х-лучей двух новых белков 14 кДа и 35 кДа в лимфоцитах человека, которые, возможно, и обеспечивают развитие последующей устойчивости клеток (Wolff, 1996). Однако, следует отметить, что клетки некоторых людей не способны к АО, что демонстрирует генетическую вариабельность людей.

Была также определена повышенная активность ДНК-полимера-зы в клетках мышей, хронически облучаемых низкими дозами лучей.

Однако адаптивный ответ был одинаковым в ооцитах как нормальной, так и репаративно-дефектной дрозофилы (Бгйг-М^Н ег а1.,1991).

Авторы объясняют этот феномен как доказательство индукции репаративных процессов в репаративно-дефектной линии.

Рядом авторов приведены доказательства существования различных субпопуляций клеток (ДД-^ак е1 а1.,1996). В таком случае повышенная репаративная активность объяснялась существованием медленно репарирующихся клеток в субпопуляции клеток после повреждающей дозы и отсутствии ее в субпопуляции клеток, получивших адаптирующую, плюс повреждающую дозу.

Авторы предполагают, что слабо репарирующими клетками были Оо лимфоциты, которые элиминировались из популяции клеток, получивших адаптирующую, плюс повреждающую дозу. Т.е. авторы полагают, что адаптирующая доза приводит к селективной элиминации слабо репарирующих клеток. Этими авторами было исключено предположение об изменениях в клеточном цикле: не было обнаружено различий в адаптированных и не адаптированных лимфоцитах. Эти авторы полагают, что цитогенетический АО не является единственным феноменом. В клетке происходит комплекс феноменов, индуцированных низкими дозами радиации. Д.М.Спитковский (1992) высказал предположение о гетерогенности клеточной популяции по критерию радиочувствительности.

Автор считает, что радиочувствительные клетки погибают при первом адаптирующем облучении малыми дозами ионизирующей радиации, а оставшиеся клетки создают картину повышенной радиоустойчивости.

Г.Д.Засухина (1999) полагает, что в таком случае трудно объяснить перекрестный АО, когда адаптирующим к радиации фактором используют не радиацию, а перекиси, тепловой шок, алкилирующие мутагены. Чувствительность к этим факторам детерминируется разными генами, и отбор, например, не мог бы сопровождаться отбором радиочувствительных клеток. В таком случае РАО должен был бы отсутствовать, но перекрестный АО известен и трудно объясним с этих позиций. Вместе с тем, другие авторы считают, что в механизме адаптивного ответа большую роль играет удлинение клеточного цикла (если адаптирующая доза дается в во фазе). В этом случае увеличивается период времени, необходимый для репаративных процессов (Мйс11е1,1996).

В этой работе интересной представляется также оценка РАО не только по критерию одного из традиционных методов -микроядерному тесту, но и РАО по критерию двойных разрывов ДНК. Кроме того, показано, что РАО распространяется на другие клеточные феномены - в том числе, клеточную трансформацию.

В клетках грызунов СЗН ЮТ/2 после хронического облучения как адаптирующего фактора (ЮсГр) образовывалось вдвое меньше фокусов трансформации при последующем облучении высокой дозой радиации. Эти данные автор считает доказательством безошибочности процесса адаптации.

Другими авторами был изучен после низкой дозы Х-лучей арсенал транскриптов (с- fos, c-mic, циклин 13, тимидинкиназа, плазминогенный активатор, р 53 и др.), уровень которых не изменялся на фоне двухкратного понижения выживаемости клеток (нормальные фибробласты, Нер-2 и др.), тогда как уровень некоторых других транскриптов (циклин А, и др.) был повышен. Повышенная выживаемость снижалась, если после 1-го облучения проводили обработку клеток циклогексимидом или актиномицином Д (Meyers et al.,1996).

Таким образом, в литературе имеются противоречивые сведения о механизмах АО. Одни авторы связывают этот феномен с изменениями клеточного цикла, усилением репарации ДНК, другие - не подтверждают этих данных.

Перекрестный адаптивный ответ в клетках человека

АО индуцируется в клетках человека малыми дозами X - радиации, "¡f - радиации, обработкой Н2О2 или Н -тимидином (Zhang, 1995; Cortes et al.,1994; Wojewodzka et al., 1994 и др.).

Последующая обработка высокими дозами ионизирующей радиации (через несколько часов после первичного воздействия) формирует в клетках повышенную устойчивость к этому воздействию.

Критериями оценки АО, как правило, служат хромосомные абберации (ХА), сестринские хроматидные обмены (СХО), микроядра, генные мутации, клеточная выживаемость (J.D Wolff et. al., 1990, Vijayalaxmi et. al., 1995, Kleczkowska et. al., 1996 и ДР-)

Однако, оценкой АО может служить также объем разрывов ДНК, формирующихся после воздействия мутагеном. Так, было показано, что объем разрывов ДНК в клетках, обработанных низкими дозами облучения, был ниже, чем в необлученных клетках (Ahnstrom, Edwardsson, 1978).

АО формируется в клетках человека не только по отношению к индуцирующему фактору, т.е. Х- облучение к Х- облучению,

- облучение к "jf-облучению, но и по отношению к некоторым химическим мутагенам. Наиболее полная информация о перекрестном АО описана в работе Wolff et.al. (1990). В качестве индукторов были использованы низкие дозы Х- лучей (1сГр), метилметансульфоната (0,018 мМ) и

N-метил - N- нитро-Ы-нитрозогуанидин (ET) (600 нг/мл) по отношению к ММС (0,42 мМ), к Х-радиации (1,5Гр) и НГ (30 мг/мл).

Было показано, что Х-облучение, ММС и НГ являются перекрестными индукторами АО и формируют устойчивость клеток к последующей обработке Х-облучением и НГ. Однако АО отсутствует и даже, напротив, наблюдается сенсибилизация клеток в опытах с высокими дозами ММС независимо от природы индуктора: низкие дозы Х-лучей, ММС и НГ, т.е. обработка малыми дозами адаптирующих факторов сопровождается повышением уровня ХА.

Интересно, что перекрестная адаптация может проявляться неодинаково в зависимости от критерия оценки. Так, было показано в клетках крысиной гепатомы, что предобработка их низкими концентрациями НГ, ММС или метилнитрозомочевиной индуцирует адаптивный ответ по критерию клеточной выживаемости, но не по критерию генных мутаций (устойчивость ктиогуанину) ( Zaval, Zaval, 1984). Ответ клеток к низким дозам НГ (2,5 нМ) был оценен по ряду критериев, таких как объем разрывов ДНК, стимуляция поли-(АДФ-рибозы), ДНК-синтез и выживаемость клеток (Kleczkowska, Althaus, 1996). Оказалось, что низкая концентрация мутагенов приводит к меньшему образованию разрывов ДНК по сравнению с контрольными клетками, сопровождается стимуляцией поли ( АДФ- рибозы), стимуляцией ДНК синтетазы и повышенной выживаемостью клеток. Что касается АО, индуцируемого тяжелыми металлами, то надо признать крайне скудными сведения по этому вопросу.

Так, на Vicia faba было показано наличие АО по критерию хромосомных аберраций, когда клетки обрабатывались хлоридом аммония или сульфонатом цинка, а повреждающим фактором служила малеиновая кислота (Michaelis et al., 1986).

На прокариотах - E.coli -было показано, что тяжелые металлы - соли кадмия и ртути ингибируют АО. Индукторами АО служили метилнитрозомочевина (МНМ), метилметан-сульфонат и метилиодид (Imaeda et al., 1989, Takahashi et al.,1991, Takahashi et al.,1992). Индуцированная МНМ Об"метил-ДНК-меттилтрансфераза подавлялась в присутствии ионов металла. Эффект ингибирования, т.е. комутагенного действия солей металлов, наблюдался в диком штамме E.Coli и 36-мутанте, в которых в норме формировался АО, но не в штамме ada 5, который вообще неспособен к АО. Эти результаты доказали один из механизмов АО, формирование которого связано с активностью ada и alk А генов.

Т.о. показан феномен перекрестной адаптации клеток к мутагенам различной природы. Феномен перекрестного АО играет очень важную роль в решении общей проблемы, связанной с загрязнением окружающей среды. Алкилирующие соединения встречаются достаточно часто, N- нитрозосоеди-нения попадают, например, в организм человека в виде нитратов и нитритов, содержащихся в качестве консервантов в пищевых продуктах.

Нитрозоамины содержатся также в некоторых гербицидах, которыми могут быт контаминированы продукты питания. Курение также является в некоторой степени источником алкилирования.

Высокие дозы алкилирующих соединений применяются при химиотерапии опухолей.

Наконец, ДНК человека может подвергаться повреждениям, индуцируемым алкилирующими соединениями, в результате эндогенных продуктов, образующихся при обмене веществ. Все эти доводы указывают на необходимость изучения адаптирующих механизмов защиты клеток человека по отношению к различным мутагенам.

Адаптивный ответ в репарационно-дефектных клетках человека

Репарационно-дефектные клетки человека характеризуются измененной чувствительностью к мутагенам физической и химической природы, в основе которой лежат либо мутации в генах, контролирующих репарационные ферменты, либо в результате мутаций в регуляторных генах, либо являются результатом постоянного длительного воздействия токсических продуктов при нарушении метаболизма, что может оказывать влияние на отдельные ферменты репарации. Изучение АО в различных репарационно-дефектных клетках может дать ответ на вопрос о связи этого защитного механизма и репарации ДНК. Однако, в литературе имеется очень скудная информация о способности репарационно-дефектных клеток формировать АО.

РАО не наблюдался в лимфоцитах 9 больных с синдромом Дауна, при котором отмечена высокая чувствительность к ионизирующему излучению (Хандогина и др., 1991). Эти данные об отсутствии РАО были подтверждены также другими исследованиями (КаПпа е1:.а1., 1994). Аналогичные данные об отсутствии АО были получены в клетках пациентов с атаксией -телеангиэктазией (АТ). Авторы изучали АО у 2 пациентов гомозиготных по гену АТ, 2-х гетерозигот по этому гену, по сравнению с АО в крови 3-х здоровых доноров ( Метейюуа е1а1.,1995).

Радиочувствительность лимфоцитов исследуемых гомозигот была в 5-6 раз, а у гетерозигот - в 2 раза выше по сравнению с контрольными клетками. Кроме того, авторы показали, что АТ-пациенты были также в 2 раза чувствительнее к блеомицину- химическому мутагену, репарация повреждений которого происходит по -типу (^-миметик), по сравнению с контрольными клетками. У всех 3-х здоровых доноров был выявлен АО при воздействии как ионизирующей радиации, так и блеомицина.

В лимфоцитах АТ- гетерозигот также формировался АО при воздействии блеомицина, но не$"- радиации. В АТ-гомозиготах АО не наблюдался ни при воздействии блеомицина, ни при воздействии низких доз ^ - облучения. Однако, другие авторы наблюдали РАО в Х-облученных клетках АТ- пациентов (БЬасИеу а1.,1987). Авторы объясняют различие в результатах возможной гетерогенностью в группе больных. Вместе с тем, можно предположить, что ЫетеЙюуа е!а1. и БЬасИеу е!а1. для индукции РАО использовали различные виды ионизирующего облучения: в первом случае были использованы ^ - лучи, во втором -Х-облучение.

Возможно, что Х-облучение является более эффективным индуктором РАО, чем облучение, хотя для клеток здоровых доноров, у которых РАО наблюдали при обоих видах облучения, различий обнаружено не было. Кроме того, возможно, что на формирование РАО в АТ-клетках могут влиять различные уровни радиочувствительности. В отличие от вышеприведенных сведений о корреляции между репарационной активностью клеток и способностью формировать адаптивный ответ имеются данные об отсутствии такой корреляции. Было показано, что уровень защиты клеток при РАО в клетках 3-х больных шизофренией, характеризующихся дефектом репарации ДНК, соответствует показателям защиты в клетках здоровых доноров ( Цховребова и др., 1995 ). Следовательно, расширение спектра репарационно-дефектных клеток может выявить различные закономерности, которые будут выявлять как неоднозначные нарушения различных этапов репарации ДНК в различных клеточных системах, так и независимое формирование РАО от систем репарации клетки.

Т.о. из данных литературы следует, что исследуемые репарационно-дефектные клетки больных с синдромом Дауна и АТ неспособны к формированию АО, индуцируемого как ионизирующей радиацией, так и блеомицином ( в случае с АТ ), тогда как в репарационно- дефектных клетках больных шизофренией РАО был таким же, как в клетках здоровых доноров.

Можно предполагать, что изучение ряда других репарационно-дефектных клеток может выявить новые закономерности. Решению этого вопроса и была посвящена часть наших экспериментальных исследований.

Адаптивный ответ в лимфоцитах людей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС.

В связи с тем, что большие группы людей проживают на территории с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС, исключительно важным является проблема возможной адаптации людей к радиационному воздействию. Можно предположить три варианта влияния хронического воздействия малых доз облучения на формирование радиоадаптивного ответа:

1) в клетках, культивируемых in vitro, формировалась повышенная устойчивость к повреждениям мутагенного воздействия или сохранялась на нормальном уровне, т.е. формировался РАО,

2) клетки теряют способность к формированию РАО,

3) клетки сенсибилизируются и становятся более чувствительными к последующему радиационному воздействию. Прежде, чем излагать конкретные данные по этим вопросам будут проанализированы сведения о хромосомных нарушениях у людей, хронически облучаемых в результате аварии на ЧАЭС. По этому вопросу в литературе имеются противоречивые сведения, касающиеся регистра средних и малых (100-700 кБк/м) доз облучения. В отношении высоких доз облучения (1000 кБк/м) практически все авторы обнаружили повышенный фон нестабильных хромосомных нарушений (Севанькаев и др., 1995, Шевченко и др., 1995,и др.). Обследование детей из Брянской области позволило установить повышенную частоту хромосомных нарушений из rs регионов с фоном облучения до 15 Ки/км (Хандогина и др., 1995).

Вместе с тем, этим авторам не удалось подтвердить данные рутинного цитологического анализа исследованиями, выполненными Fish- методом, позволяющим регистрировать стабильные транслокации.

В данных исследованиях не было обнаружено повышения частоты последних, хотя этот прием рекомендован для биологической дозиметрии.

Однако, некоторые авторы, используя микроядерный тест, который в последнее время является очень популярным в цитологических исследованиях и, в частности, при оценке различных мутагенных воздействий на организм человека, не обнаружили отличий в частоте клеток с микроядрами у обследуемых жителей Брянской области по сравнению с таковыми у московских доноров (Пелевина и др., 1996). Важными представляются не только данные о цитогенетичес-ких нарушениях в результате длительного облучения, но и сведения о возможных изменениях радиочувствительности клеток.

Не было обнаружено изменения радиочувствительности клеток при использовании микроядерного теста и облучения in vitro лимфоцитов людей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации (Пелевина и др., 1996). Вместе с тем, описаны изменения в показании внепланового синтеза ДНК в лимфоцитах ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС (Семов, 1995). Автором было обнаружено повышение спонтанного уровня и снижение внепланового синтеза, который был индуцирован УФ-облучением.

Возможно, что эти изменения связаны с наличием длительно живущих повреждений в клетках, которые нарушают конформацию ДНК или ее доступность для формирования репарации. Т.о. лимфоциты облученных людей имеют некоторые нарушения, как по цитогенетическим показателям, так и по изменениям функций репарации ДНК. Практически все исследователи, изучающие РАО в лимфоцитах облученных людей, обнаружили или значительное снижение, или отсутствие РАО (Пелевина и др., 1994, 1996, Рябченко и др., 1995). Так, по данным Пелевиной с сотрудниками было показано снижение РАО у жителей Брянской области по сравнению с московской популяцией. Предварительное облучение клеток было в дозе 0.05 Гр, а повреждающая доза составляла 1Гр. Если в московской популяции снижение числа микроядер составляло с 40,8 до 25,3 , то в двух регионах Брянской области снижение было только до 34,4. При этом число обследованных лиц из регионов Брянской области составляло 81 и 57 человек и в московской популяции - 24 человека.

Эти данные говорят о том, что хроническое облучение не приводит к повышению резистентности организма к острому облучению в дозе 1 Гр.

Аналогичные данные получены в работе Рябченко с сотрудниками (1995), которые также констатировали отсутствие РАО у 12 человек, проживающих также в одном из регионов Брянской области.

Исключительно интересные результаты по адаптивному ответу у детей, проживающих в зонах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС, получены итальянскими исследователями (Раёоуаш е1;.а]., 1995, ТеёеясЫ е1:.а1., 1995,1996). Авторы обследовали 13 детей из Брянской области, где уровень облучения составлял 12-3ОКи/км2 (дети были здоровы и были посланы в Италию гуманитарными организациями) и сравнивали с группой контрольных детей (4 человека). Не было обнаружено возможного снижения числа хромосомных аберраций в лимфоцитах облученных детей: процент аберраций после облучения (1,5 Гр) составлял 32.2 (в контрольной группе 23.5; различия недостоверны). 3-аминобензамид не оказывал влияния на число хромосомных нарушений как в контрольной, так и в экспонированной группах. Авторы объясняют отличие полученных данных от других вероятностью получения исследуемыми детьми меньших доз радиации по сравнению с другими контингентами. Однако совершенно неожиданные результаты были получены с блеомицином - классическим радиомиметиком. Уровень аберраций был примерно одинаковым в лимфоцитах детей контрольной и экспонированной групп. Лимфоциты 15 детей того же региона (Брянская область, уровень облучения 12-30 Ки/км ) и 7 детей из контрольного региона (г.Смоленск) обрабатывались блеомицином (2.5мг/мл), который служил в качестве повреждающего агента. Уровень блеомицин- индуцированных аберраций был достоверно ниже в клетках облученных детей по сравнению с контрольной группой: если уровень аберраций на клетку в опытной группе составлял 0.27, то в контрольной группе этот показатель был 0.59.

Следовательно, лимфоциты облученных детей были более устойчивы к блеомицину, чем лимфоциты детей контрольной группы, что свидетельствует о формировании четкого адаптивного ответа. Для решения вопроса о том, какие ферменты вовлекаются в адаптивный ответ в этом эксперименте, были испытаны 3 ингибитора: 3-аминобензамид (ингибитор поли-АДФ-рибозы)-полимеразы); афидиколин (ингибитор ДНК-полимеразы) и 3-дезокситимидин (ингибитор ДНК- полимеразы).

Оказалось, что гипочувствительность к блеомицину в лимфоцитах опытной группы сохранилась и при воздействии всех 3-х ингибиторов, в чем заключалось отличие от действия этих ингибиторов в лимфоцитах контрольных детей. Следует признать неожиданным сохранение устойчивости клеток к этому мутагену в лимфоцитах облученных детей, которое не модифицировалось при добавлении ингибиторов. Таким образом, «адаптивная» доза, полученная детьми в районах с повышенным фоном радиации, индуцирует клеточную защиту против действия блеомицина, но не против ионизирующей радиации. Кроме того, этот вид гипочувствительности не связан с активностью ферментов, включающихся в репарацию повреждений ДНК, индуцированных блеомицином. Возможно, что в радиорезистентных клетках повышена концентрация супероксид дисмутазы и не исключено, что в этих клетках происходит более эффективное гашение образующихся радикалов.

Авторы предполагают также, что некоторые ферменты, принимающие участие в контроле клеточного цикла, такие, например, как цистеин протеаза, могут играть определенную роль в эффекте защиты клеток, подвергшихся длительному облучению.

Кроме того, эти авторы доказали, что гипочувствительность облученных детей к блеомицину связана не с острым облучением (во время аварии на ЧАЭС в 1986г.), а с внутренней

137 контаминацией организма Сз , являющегося постоянным источником малых доз радиации. Этот вывод был сделан в результате исследований 10 детей из Припяти, у 5 из которых

137 обнаруживалась контаминация Сб (2800-4200 ЕЦ), а у 5 других детей контаминация не была обнаружена.

Следовательно, острое облучение высокими дозами радиации не индуцировали устойчивость клеток к блеомицину.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Каминская, Инесса Алексеевна

ВЫВОДЫ:

1. Адаптивный ответ (АО) и репарация индуцируемых разрывов ДНК были изучены в репарационно-дефектных клетках человека (пигментная ксеродерма, гомоцистинурия); в лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации и в перевиваемых фибробластах при воздействии хлористого кадмия, индуцируемые повреждения ДНК которого не репарируются.

Критерием оценки АО служила стабильность ДНК (объем разрывов ДНК).

2. В фибробластах больных пигментной ксеродермой, дефектных по репарации повреждений ДНК, индуцированных 4НХО и НГ, адаптивный ответ (АО) формировался в опытах с НГ, но не с НХО. Это свидетельствует о разных путях защиты клеток, функционирующих при репарации ДНК и АО при воздействии НГ.

3. Клетки гомоцистинурии, характеризующиеся неспособностью восстанавливать 4НХО - и повреждения ДНК, способны формировать АО в опытах с 4НХО, но не с ^ - радиацией. Эти данные также могут служить доказательством разобщенности процессов репарации ДНК и АО.

4. В лимфоцитах 22 детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации, РАО не регистрировался в 10 случаях. При этом не было выявлено зависимости между РАО и длительностью проживания в загрязненном регионе или плотностью загрязнения.

5. При сравнении РАО в группе из 10 детей из загрязненных радионуклидами территорий и 17 детей из контрольных регионов не выявлено какой-либо связи с показателями умственной отсталости.

6. В фибробластах человека, предварительно обработанных малыми концентрациями хлористого кадмия, при воздействии повреждающей дозы этого же мутагена наблюдался АО. Кадмий - индуцированные повреждения ДНК не репарировались. Защита клеток в опытах с хлористым кадмием была практически одинаковой при предварительном облучении в малых дозах и обработкой низкими концентрациями кадмия.

7. Отсутствие корреляции между способностью клеток к АО и репарации индуцированных повреждений ДНК в исследованных системах позволяет сформировать гипотезу о разобщенности этих защитных механизмов клеток человека.

Заключение

Следовательно, во-первых, показана возможность защиты клеток от воздействия тяжелых металлов при предварительном

- облучении в малых дозах. Во-вторых, доказана возможность формирования АО при предварительном воздействии малыми концентрациями СсЮ2 против высоких концентраций этого мутагена. В-третьих, эти данные доказывают независимость систем репарации ДНК, при которых СсЮЬ - индуцированные разрывы ДНК не восстанавливались, и систем АО, которые эффективно формируются в этих условиях.

Данные о разобщенности процессов репарации ДНК и возможности формирования АО в опытах с СсЮЬ в клетках человека являются, по-видимому, самыми прямыми в системе доказательств о том, что эти системы защиты клеток имеют независимые пути.

Таким образом, представлены данные о возможности защиты клеток человека от повреждающего действия тяжелых металлов как невысокими дозами^- радиации, так и низкими концентрациями тяжелых металлов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Имеются тысячи работ на клетках человека и животных по адаптивному ответу (АО), в основном по РАО. Подавляющее большинство работ выполнено на цитогенетичес-ком уровне с использованием критериев ХА, СХО, генных мутаций, микроядерных тестов, выживаемости. По выживаемости можно проводить подсчет не только некротических, но и апоптотических клеток (Martini et.al, 1996). Понятно, что формирование АО сопровождается изменениями в различных компонентах клетки, прежде всего в ДНК, первичные повреждения которой, если не репарируются, приводят к образованию мутаций.

По этой причине стабильность ДНК, которая оценивалась по объему индуцированных разрывов ДНК, была выбрана нами в качестве критерия эффективности АО.

Оценка АО по показателю стабильности ДНК была проведена в отдельных работах (Kleczkowska, Althaus, 1996). Эти авторы исследовали ДНК кератиноцитов при воздействии очень низких концентраций метилирующего агента - 2,5 М N - метил - N - нитро - N - нитрозогуанидина. Оказалось, что эта невысокая концентрация мутагена способствовала большей стабильности ДНК, стимулировала синтез поли (АДФ)-рибозы и повышала колониообразующую способность клеток. Вместе с тем механизм АО остается неясным. Имеется ряд работ, посвященных этому вопросу. Доказано, что воздействие малыми дозами радиации сопровождалось синтезом новых белков (Wolff, 1996).

При этом показано, что различные воздействия, обеспечивающие защиту клеток от повреждающих доз мутагенов, индуцируют различные образцы белков (Martini et.al, 1996). 8 белков индуцируются в лимфоцитах человека перекисями, 4 из них экспрессируются также тепловым шоком. Если клетки после адаптирующей дозы обрабатывали ингибиторами белкового синтеза, то АО не формировался. Вместе с тем, остается неясным, относятся ли эти белки к известным ферментам, принимающих участие в каких-либо путях репарации ДНК или они являются индуцируемыми ферментами, непосредственно осуществляющих АО. Одной из гипотез механизма РАО является предположение о гетерогенности клеточной популяции по критерию радиочувствительности (Д. М. Спитковский, 1992). Предполагается, что радиочувствительные клетки погибают при первом адаптирующем воздействии, а оставшиеся, более радиоустойчивые клетки и обеспечивают феномен повышенной устойчивости к радиации. Однако эта гипотеза не может объяснить феномен кросс - адаптации, когда в качестве адаптирующего фактора используют перекись водорода, тепловой шок, алкилирующие соединения (Г. Д. Засухина, 1999). Ясно, что отбор клеток по чувствительности к алкилирующим агентам или к перекисям не может совпадать с отбором по радиочувствительности клеток. Показано, что радиозащитное действие интерферона и формирование РАО имеют практически одинаковые показатели защиты (Г. П. Македонов и др., 1998, J1. В. Цховребова, 1998). Эти результаты были получены при анализах РАО в лимфоцитах детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС, а также в лимфоцитах пациентов с репарационно - дефектными наследственными заболеваниями (гомоцистинурия, синдром Марфана, синдром Элерса-Данлоса, шизофрения). Коэффициент защиты при РАО в клетках при всех синдромах практически не отличался от показателей, полученных в клетках нормальных доноров. Исключением был синдром гомоцистинурии, когда не наблюдалось формирования РАО. Невысокие показатели защиты клеток при предобработке их интерфероном объясняются возможной стимуляцией репарационных процессов. Авторы полагают, что РАО имеет общие пути с «нерепарационной» компонентой защитного действия интерферона. «Нерепарационная компонента»-эта та активность интерферона, которая не связана со стимуляцией различных этапов эксцизионных и пострепликативных компонент, а также возможная индукция нового пути репарации, связанного с восстановлением двунитевых разрывов ДНК (Г. Д. Засухина, 1994). Антимутагенное действие интерферона было обнаружено в лаборатории Г. Д. Засухиной и детально изучалось более 15 лет как на клеточном уровне (критерии ХА, СХО, выживаемость), так и при анализе отдельных этапов репарации ДНК. Данные об антимутагенной активности интерферона были многократно подтверждены (Suzuki et.al., 1998, Lazutka, 1996 и

ДР-)

Было показано, что в формировании интерферон - индуцированной устойчивости клеток, в том числе и репарационно-дефектных (синдром Кокайна), вовлекается чувствительная к антипейну (ингибитор) протеаза (Sugita et.al., 1996).

Анализируя публикации по механизмам РАО, следует признать, что большинство исследователей считают, что формирование РАО связано с репарацией ДНК. Это связано с тем, что в исследованиях репарационно-дефектных клеток (Атаксия телеангиэктазия, синдром Дауна) имелись совпадения нарушений РАО и репарации ДНК. Однако, при расширенном спектре репарационно - дефектных клеток появились исключения, число которых росло по мере дальнейших изучений.

Во-первых, в клетках больных шизофренией, дефектных по ^ - репарации, РАО не отличался от показателей здоровых доноров.

Во-вторых, такое же отсутствие корреляции наблюдалось при синдроме Элерса - Данлоса (Л. В. Цховребова, 1998). В-третьих, РАО был снижен или даже наблюдалась сенсибилизация в лимфоцитах людей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации в результате аварии на ЧАЭС, хотя радиочувствительность клеток не была изменена (И. И. Пелевина и др., 1996, Л. В. Цховребова, 1998). Можно считать, что расширение спектра репарационно-дефектных клеток в отношении изучения механизмов РАО будет плодотворным, поскольку каждое заболевание характеризуется нарушением какого-то одного специфического этапа репарации нуклеотидов. Этот же дефект обнаружен при трихотиодистрофии (Н. Naegleli, 1997). В этой же работе, продолжая список репарационно-дефектных болезней и обнаружения биохимческих дефектов, сообщается, что наследственный неполипозный колоректальный рак связан с нарушением репарации, протекающей с ошибками; синдром Ли-Фроймана - с мутацией в гене р53; синдром 46ВЯ с дефектом ДНК-лигазы.

В большом числе случаев дефекты репарации обнаружены при моногенном наследовании заболевания. Генез нарушения репарации ДНК при таких заболеваниях остается неясным, но может быть связан с разными причинами (А. Н. Семячкина, 1995).

Во-первых, изменения репарации ДНК могут быть обусловлены плейотропным эффектом одного гена, мутация которого формирует не только клинику заболевания, но и влияет на активность одного или нескольких ферментов, принимающих участие в репарации.

Во-вторых, снижение репарации ДНК может быть вторично и возникать в результате воздействия в организме продуктов, нарушающих метаболизм и, соответственно, влиять, например, на систему антиоксидантной защиты и т.п. Однако, исследуемые нами синдромы, в частности, гомоцисти-нурия, сохраняли дефект и при пассировании клеток в культуре, поэтому это предположение в конкретном случае не состоятельно.

В-третьих, не исключено, что дефект репарации может быть обусловлен сцеплением генов ферментов репарации с генами, мутации которых формировали клинику заболевания.

Вместе с тем, число заболеваний, характеризующихся как моногенным, так и полигенным наследованием, при котором обнаруживается дефект репарации и, соответственно, хромосомная нестабильность, продолжает расти. К ним относят, например, диабет, анкилозирующий спондилит, ревматоидный полиартрит, системную красную волчанку, болезнь Бешета и др. (Lehman, 1996, McCurdy et.al., 1997, Sonmez et.al., 1998, И. M. Васильева и др., 1997).

Вместе с тем, рядом исследований отмечено, что адаптивная доза сопровождалась усилением синтеза ряда ферментов, например, ДНК-полимеразы (Gaziev et/ al/, 1992). Другие авторы показали стимулирование УФ-индуцированного репарационного синтеза ДНК в лимфоцитах кролика (Liu et. al.,1995). По этой причине некоторые исследования полагают, что основной механизм РАО связан с усилением репарации ДНК (С. А. Гераськин, 1995). Однако некоторым исследователям не удалось обнаружить активацию репарации ДНК при РАО в лимфоцитах человека (Liu et.al., 1992).

Несомненно, что облучение увеличивает концентрацию соединений, принимающих участие в защите клеток от радиации-увеличение концентрации метилтиоксинов, глутатионина (Osmak, Hervat, 1992). Интересное предположение высказано о возможной роли апоптоза в РАО (Filippovich et.al., 1998). После воздействия радиации в дозе 2,5-20 сГр in vivo и in vitro скорость апоптоза тимоцитов снижалась по сравнению со спонтанным уровнем, так что выключение апоптоза может также играть определенную роль.

Обсуждая механизмы РАО, можно отметить, что малые дозы облучения (1-5 сГр) меняют вязкость лизатов клеток, которая непосредственно связана с конформационным состоянием хроматина (И. М.Спивак, 1998).

При этом процессы репарации протекают иначе и, возможно, изменение вязкости и соответственно хроматина могут играть определенную роль в пусковых механизмах РАО. Последнее время пространственная организация ДНК привлекает определенное внимание, т.к. уровень петельной суперспиральной ДНК оказывает влияние на все процессы, включая топоизомеразы (Г.А.Сигора, 1998). Изменения конформации хроматина при РАО были обнаружены в фибробластах и тимоцитах после облучения 0.5-4 сГр (Ве1уаеу, Нагтз-Я^ёаЫт, 1996).

Ответ клеток млекопитающих на воздействия ионизирующей радиации связан с двумя основными ферментами: ДНК - зависимой протеин-киназой и поли (АДФ-рибоза) полимеразой, которые активируют процесс ресинтеза разрывов ДНК (М. Беи^еМ е!а1., 1997). Активность этих ферментов также может быть связана с состоянием хроматина.

Вероятнее всего, формирование РАО - сложный процесс, для реализации которого включается ряд систем. Нами была поставлена конкретная цель - определить необходимость вовлечения репарации ДНК в процесс реализации РАО. Нами были исследованы три системы для решения этой задачи. Во-первых, помимо описанных в литературе, нами были использованы репарационно-дефектные клетки гомоцистину-рии и в качестве позитивного контроля - клетки пигментной ксеродермы.

Во-вторых, второй модельной системой служили лимфоциты детей, проживающих в регионах с повышенным фоном радиации, у которых радиочувствительность не была изменена. В-третьих, в качестве адаптивного и повреждающего фактора был использован хлористый кадмий, повреждения ДНК которого не репарируются.

Данные экспериментальных результатов наших исследований и литературных данных сведены в таблицах 10 и 11 (Г.Д.Засухина, 1999), из которых видно, что существует дивергенция между способностью клеток к репарации ДНК и АО.