Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Попадьин, Павел Владимирович

• Попадьин, Павел Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Попадьин, Павел Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.6.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10.

1.1 Болезни и генетика устойчивости белокочанной капусты. .10.

1.1.1 Настоящая мучнистая роса.10.

1.1.2 Альтернариоз или чёрная пятнистость. .11.

1.1.3 Кила.12.

1.2 Дефензины как представители антимикробных пептидов растений.16.

1.2.1 Антимикробная активность. .16.

1.2.2 Механизм антимикробного действия.18.

1.2.3 Роль в защите растения.19.

1.3 Генная инженерия в селекции растений. .24.

1.3.1 Селекция растений в III тысячелетии.24.

1.3.2 Проблемы применения генно-инженерных подходов в селекции растений.28.

1.4 Регенерация из соматических клеток растений рода Brassica.35.

1.5 Факторы, влияющие на агробактериальную трансформацию представителей рода Brassica.39.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.46.

2.1 Растительный материал.46.

2.2 Бактериальные штаммы и плазмиды.46.

2.3 Штаммы фитопатогенов.48.

2.4 Культивирование in vitro и генетическая трансформация белокочанной капусты.48.

2.4.1 Введение в культуру in vitro. .48.

2.4.2 Получение регенерантов методом прямого органогенеза.49.

2.4.3 Стрессовая обработка эксплантов. .50.

2.4.4 Агробактериальная трансформация.50.

2.4.5 Размножение растений клонированием in vitro.51.

2.4.6 Адаптация регенерантов к условиям in vivo.51.

2.5 ПЦР-анализ наличия трансгена в геноме растений.52.

2.6 Гибридизация ДНК растений-регенерантов по Саузерну.54.

2.7 Анализ транскрипции трансгена методом реверсной ПЦР.55.

2.8 Иммуноферментный анализ (Вестерн-блоттинг) трансформантов.56.

2.9 Оценка устойчивости трансгенных растений к заболеваниям.57.

2.9.1 Оценка устойчивости растений поколения То к настоящей мучнистой росе.57.

2.9.2 Оценка устойчивости растений поколения То к альтернариозу.58.

2.9.3 Оценка устойчивости семенного потомства растений поколения То к киле.58.

2.10 Статистическая обработка данных.59.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.60.

3.1 Разработка методики регенерации белокочанной капусты.60.

3.1.1 Оценка растительного материала на интенсивность адвентивного морфогенеза in vitro.60.

3.1.2 Влияние состава питательных сред на адвентивный морфогенез в условиях in vitro.64.

3.1.3 Влияние гипотермического стресса на адвентивный морфогенезе условиях in vitro.78.

3.2 Разработка методики агробактериальной трансформации белокочанной капусты.84.

3.2.1 Анализ устойчивости растений белокочанной капусты к канамицину.85.

3.2.2 Влияние генотипа растения, типа экспланта и штамма агробактерий на эффективность генетической трансформации.87.

3.3 Изучение трансгенных растений белокочанной капусты.96.

3.3.1 Анализ растений поколения То на наличие транскриптов трансгена.96.

3.3.2 Анализ растений поколения То на содержаниепептида RS-AP.98.

3.3.3 Первичная оценка устойчивости трансгенных растений поколения То к настоящей мучнистой росе.99.

3.3.4 Первичная оценка устойчивости трансгенных растений поколения То к альтернариозу.101.

3.3.5 Первичная оценка устойчивости семенного потомства трансгенных растений поколения То к киле.102.

3.3.6 Изучение наследования трансгена в семенном потомстве растений поколения То.104.

3.3.7 Анализ на наличие транскрипции трансгена в семенном потомстве растений поколения То.106.

ВЫВОДЫ.111.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Применение агробактериальной трансформации в селекции белокочанной капусты на устойчивость к болезням»

Белокочанная капуста (Brassica oleracea convar. (L.) Alef. var.capitata L. f. alba DC) относится к роду Brassica, семейству Brassicaceae (Barnett), трибе Brassiceae (Hayek) субтрибе Brassicinae (Hayek). Это наиболее распространённая овощная культура в Росии. В настоящее время в Российской Федерации белокочанную капусту выращивают на площади 161,7 тыс. га, или 21,6% всех площадей, занятых овощами (Абрамов,1999). Она даёт дешёвую продукцию в открытом грунте, а наличие сортов разных сроков созревания и хозяйственного назначения позволяет использовать её в свежем виде на протяжении всего года. Благодаря универсальному использованию, высокой урожайности (до 100 т/га) и широкой экологической пластичности, белокочанная капуста выращивается повсеместно (Пантиелев,1981).

Этот овощ обладает благоприятным для пищеварения биохимическим составом. В среднем, капуста содержит 8% сухого вещества, в который входят сахара, лимонная и яблочная кислоты, около 2,1% сырого белка, 0,9% клетчатки, 0,7% минеральных веществ, включающих в себя значительное количество серы. Белокочанная капуста богата витаминами, которые представлены аскорбиновой кислотой (витамин С), тиамином (Bi), рибофлавином (В2), пантотеновой кислотой (Вз), пиридоксином (Вб), фолиевой кислотой (В9), никотинамидом (РР), биотаном (Н), фарнохиноном (К) и метилметионином (U) (СоколД978; Гусев, 1991).

Помимо высоких вкусовых достоинств, белокочанная капуста обладает целебными и диетическими свойствами. Блюда из свежей или квашеной капусты обязательно включают в состав лечебного питания людей, страдающих сердечно-сосудистыми и желудочно-кишечными заболеваниями. Благодаря высокому содержанию солей калия, капуста способствует выведению из человеческого организма излишков жидкости, улучшая работу сердца и почек. Высокое содержание клетчатки в капусте позволяет использовать её для стимуляции моторной функции кишечника и удаления из организма холестерина. Витамин U, содержащийся в соке, способствует быстрому зарубцовыванию язв желудка и двенадцатиперстной кишки, являясь хорошим средством для профилактики этих болезней. Из-за высокого содержания витамина С белокочанная капуста является одним из важнейших источников его поступления в рацион питания зимой (Гусев, 1991).

Многочисленные заболевания, которым подвержена белокочанная капуста, приводят к потерям значительной части урожая и сильно снижают качество продукции. В годы эпифитотий некоторых болезней потери урожая кочанов могут достигать 100% (Дорожкин, Куневич,1980; Шувалова, 1980), а семян - 60% (Тивари,1989). Ситуация осложняется отсутствием разрешённых для применения на продовольственной капусте химических средств защиты. Всё это вызывает необходимость выведения устойчивых сортов. Однако редкая встречаемость доноров устойчивости среди видов, скрещивающихся с белокочанной капустой, делает эту задачу трудновыполнимой при помощи методов традиционной селекции - гибридизации, бекроссов и отбора.

Ускорить решение данной проблемы можно при помощи методов генной инженерии - нового, в значительной мере технологического направления биологии, возникшего в 70-х годах двадцатого века. На данном этапе развития методы генной инженерии позволяют манипулировать с нуклеиновыми кислотами, искусственно создавать рекомбинантные молекулы ДНК с любыми заданными нуклеотидными последовательностями - генами и необходимыми для их функционирования элементами, и вводить их в геном любого организма.

Среди генов иммунного ответа растений особое внимание привлекли к себе гены дефензинов, кодирующие короткие цистеинсодержащие пептиды широкого фунгицидного и бактерицидного действия (Broekaert et al., 1995). Из обнаруженных к настоящему времени растительных дефензинов, одними из наиболее активных и широкоспецифичных, являются дефензины редьки

Raphanus sativus). При трансформации табака геном одного из них, rs-afp2, были получены растения, проявляющие устойчивость к грибному патогену Alternaria longipes, вызывающему альтернариоз (Terras et al.,1995). Впечатляющим оказался и успех фирмы "Monsanto Co.", учёные которой создали картофель, экспрессирующий ген дефензина alfAFP, выделенного из семян люцерны (Medicago sativa). Полученный трансгенный картофель существенно меньше поражался вертициллёзом, вызываемым грибным патогеном Verticillium dahliae, по сравнению с растениями исходного сорта, обработанными фунгицидами (Gao et al.,2000).

Важнейшим этапом в создании трансгенных растений является наличие эффективной методики генетической трансформации. Однако, несмотря на то, что представители рода Brassica являются удобными объектами для манипуляций в культуре in vitro (Sjodin ,1992.), работ по генетической трансформации белокочанной капусты опубликовано немного (Радчук и др.,2000). Ранее были получены трансгенные растения только у небольшого количества сортов, а именно: у сортов King Cole (Metz et. al.,1995), Gourmet, Gourmet Sweet, Sommer Globe (Christey et. al.,1997) и гибридов Fi Kalorama, Erdeno и Krautman (Радчук и др., 2000). Известно, что успешная регенерация -необходимая предпосылка возможности генетической трансформации растений. Однако требования к факторам, влияющим на морфогенез растений в культуре in vitro, в значительной мере определяются их генотипом (Narasimhulu and Chopra, 1988). В связи с этим, практически все опубликованные протоколы регенерации белокочанной капусты малопригодны для применения на конкретных инбредных самонесовместимых родительских линиях Fi гибридов. Большинство опубликованных протоколов трансформации также имеют значительные ограничения. Например, использование необезоруженных штаммов Agrobacterium rhizogenes (Berthomieu, Jouanin, 1992; Christey et. al., 1997) приводит к регенерации растений с изменённым фенотипом из-за встраивания в растительный геном генного локуса rol (Tepfer, 1989). 9

Применение в качестве эксплантов черешков листьев (Berthomieu, Jouanin, 1992) или цветоносов (Metz et. al., 1995) требует заблаговременного, тщательного планирования работ, что особенно усложняется двухлетним циклом развития белокочанной капусты. Кроме того, возникают большие проблемы при стерилизации этих эксплантов для введения в культуру in vitro. Использование же только гипокотилей и не использование семядолей (Радчук и др., 2000) снижает производительность труда и увеличивает расход семян подвергаемого трансформации генотипа.

В связи с вышеизложенным, данная работа посвящена разработке эффективной методики регенерации и генетической трансформации депрессированных инбредных родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, а также изучению устойчивости трансгенных растений к заболеваниям.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Попадьин, Павел Владимирович

выводы

1) Разработана методика регенерации адвентивных побегов из семядольных и гипокотильных эксплантов инбредных родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, позволяющая получить у линий И 34 и Б 25 частоту события, в среднем, 76%. Установлено, что:

- семядольные экспланты обладают большим морфогенетическим потенциалом, чем гипокотильные;

- наибольшим морфогенетическим потенциалом из изученных обладают линии И 34 и Б 25;

- оптимальным для регенерации адвентивных побегов является состав питательной среды: минеральная основа по Мурасиге -и Скугу, витамины В5, 30 г/ л сахарозы и 3 мг/ л БАП;

- воздействие на экспланты низкой положительной температуры существенно увеличивает частоту как адвентивного морфогенеза в целом (на 10-26%), так и регенерации побегов в частности (на 6-9%).

2) Разработан протокол агробактериальной трансформации, позволяющий получать до 8% трансформантов инбредной линии Б 25. Установлено, что:

- концентрация канамицина-сульфата 25 мг/л эффективна для выделения экспрессируюгцих неомицинфосфотрансферазу трансформантов;

- оптимальной является концентрация агробактерий 105 клеток/мл;

- частота генетической трансформации зависит от агробактериального штамма: при использовании LBA 4404 не получен ни один трансформант, при применении LGV 3850 частота трансформации составила около 0,8%, тогда как при инокуляции штаммом А4 - 8%;

- достоверных различий в частоте трансформации между семядольными и гипокотильными эксплантами у исследованных генотипов

112 белокочанной капусты нет. 3) Получено тринадцать независимых трансгенных линий белокочанной капусты генотипа Б 25 и их семенное потомство. Установлено, что:

- по морфологическим признакам трансформанты не имеют отличий от контрольных нетрансформированных растений;

- транскрипция трансгена rs-ap происходит не во всех растениях поколения То;

- присутствие трансгена в нескольких локусах встраивания может не препятствует его транскрипции;

- наибольший уровень экспрессии трансгена rs-ap проявляется при наличии его в гемизиготном состоянии в единичном локусе встраивания; трансформация белокочанной капусты конструкцией pK22rs неэффективна для получения генотипов, устойчивых к заболеваниям;

- использование гена дефензина RS-AP перспективно для создания исходного селекционного материала белокочанной капусты, обладающего устойчивостью к киле. из

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате проведённых экспериментов разработаны эффективные методики регенерации и агробактериальной трансформации депрессированных инбредных линий белокочанной капусты. Получены и изучены трансгенные растения, содержащие ген дефензина Rs-AP.

Изучение морфогенетического потенциала пяти инбредных самонесовместимых родительских линий Fi гибридов белокочанной капусты, выведенных на селекционной станции им. Н. Н. Тимофеева, показали, что семядольные экспланты подавляющего большинства исследованных генотипов обладают большим морфогенетическим потенциалом, чем гипокотильные, и регенерируют, в среднем, на 15% чаще. Тем не менее, данный показатель имеет существенные значения у обоих типов эксплантов, что позволяет использовать для получения растений - регенерантов и те, и другие, экономя трудовые затраты, а так же семена. Было выделено две линии - И 34 и Б 25 - отличающиеся высокой способностью к регенерации адвентивных побегов. Частота адвентивного морфогенеза у эксплантов линии Б 25 достигала, в среднем, 94%, а И 34 - 82%.

Из пяти изученных, определён оптимальный состав питательной среды, включающий: минеральную основу по Мурасиге и Скугу, витамины В 5, 45 г/л сахарозы и 3 мг/л БАП.

В ходе работы установлено, что воздействие на экспланты гипотермического стресса существенно увеличивает как частоту адвентивного морфогенеза в целом (на 10-26%), так и регенерации побегов в частности (на 6-9%), что, вероятно, связано со стимуляцией экспрессии генов, отвечающих за клеточную дифференциацию.

Выявлена селективная концентрация канамицина-сульфата, 25 мг/л, позволяющая с успехом отбирать трансформанты, экспрессирующие неомицинфосфотрансферазу.

Показано, что большое значение на успех генетической трансформации белокочанной капусты оказывает концентрация агробактерий. Существенного уровня регенерации инокулированных эксплантов (в среднем 82%) удалось достичь лишь при испорльзовании суспензии с концентрацией 103 клеток/ мл. При больших концентрациях регенерации не наблюдалось, а экспланты погибали, что, вероятно, связано с их реакцией сверхчувствительности в ответ на инфекцию.

Частота агробактериальной трансформации белокочанной капусты в существенной мере зависела и от генотипа растения. Несмотря на высокую частоту регенерации, не удалось получить ни одного трансформанта инбредной линии И 34, по-видимому, из-за её устойчивости к использованным в работе агробактериальным штаммам.

Существенное влияние на частоту генетической трансформации оказывал также штамм агробактерий. Инокуляция эксплантов штаммом LBA 4404 не позволила получить ни одного трансгенного растения, при использовании LGV 3850 частота трансформации составила, в среднем, около 1%, тогда как при применении А4 - 7%.

Тип экспланта не оказывал существенного влияния на эффективность трансформации.

Трансгенные растения, адаптированные к условиям in vivo, не проявляли отличий по морфологическим признакам от нетрансформированных, что свидетельствует о стабильности генома белокочанной капусты при регенерации по разработанной методике.

Наличия дефензина Rs-AP в трансгенных растениях поколения То детектировать не удалось. Так же не удалось выявить отличий трансгенных растений поколения То от нетрансформированных по устойчивости к настоящей мучнистой росе и альтернариозу. Полученные результаты, возможно, объясняются отсутствием или недостаточным уровнем накопления пептида.

Изучение наследования трансгена rs-ap на примере расщепления семенного потомства независимой трансгенной линии БТ1 по его наличию, а так же анализ растений поколения То методом гибридизации ДНК по Саузерну показало, что в геноме трансформантов он может быть представлен несколькими копиями и находится в локусах разных хромосом.

Наличие нескольких копий трансгена не препятствовало его транскрипции. В то же время транскрипция трансгена происходила не во всех растениях поколения То что, вероятно, объясняется его инсерцией в область гетерохроматина.

При анализе устойчивости к киле семенного потомства трансгенных растений поколения То наблюдалось расщепление по этому признаку, что, возможно, свидетельствует об активности дефензина Rs-AP против возбудителя данной болезни. Кроме того, анализ наблюдаемой картины расщепления позволил установить, что, по-видимому, наибольшее накопление пептида RS-AP происходит при наличии кодирующего его трансгена в гемизиготном состоянии в единичном локусе встраивания и, вероятнее всего, в виде одной копии.

Полученные в ходе исследований трансгенные растения белокочанной капусты могут быть использованы для дальнейшего изучения наследования и экспрессии трансгена rs-ap. Использование же их в качестве исходного материала для создания килоустойчивых Fi гибридов затруднительно из-за наблюдаемого эффекта «дозы» трансгена. Однако обнаруженная активность дефензина Rs-AP в отношении возбудителя килы свидетельствует о перспективности применения его для этой цели, однако, вероятно, он должен находится под контролем других регуляторных элементов.

Разработанные эффективные методики регенерации и генетической трансформации депрессированных инбредных линий белокочанной капусты могут быть использованы при размножении их в культуре in vitro, для

116 переноса в их геном чужеродных генов, определяющих хозяйственно-ценные признаки и для проведения фундаментальных исследований по биологии этой культуры. Созданные трансгенные линии, отличающиеся повышенной устойчивостью к киле, могут быть использованы в качестве модельных объектов для изучения фунгицидной активности дефензинов в отношении облигатных паразитов и для изученияфеномена «замолкания» трансгена.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Попадьин, Павел Владимирович, 2002 год

1. Абрамов В. К овощному сезону 1999 года. // Семена. 1999. - №1. - С. 26.

2. Алпиева М., Димитров С. Изследвания върху устойчивостта към брашнеста мана (Erysiphe cruciferarum Opis ex L. Junell) на хибриди в Fi от главесто зеле. // Генетика и селекция. 1989. - Т22. - №5. с. 420-423.

3. Биотехнология растений: культура клеток./ Под редакцией Бутенко Р. Г.- М.: Агропромиздат, 1989. С. 13.

4. Геринг X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. С. 197-200.

5. Глазков М. В. Границы структурно функциональных единиц (доменов) эукариотических хромосом. / / Генетика. - Т. 34. - С. 593 - 604.

6. Гусев А. М. Целебные овощные растения. М.: МСХА, 1991. С. 90-101.

7. Дёрфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. С. 42-46.

8. Джалилов Ф. С., Монахос Г. Ф., Семёнов П. А. Оценка устойчивости гибридов капусты к болезням при хранении. / / Известия ТСХА. 1999. -Вып. 2. - С. 107-113.

9. Дорожкин Н. А., Куневич Л. Р. Слизистый бактериоз капусты в БССР: Тез. докл. на IV Всес. совещании. Ереван, 1980. С. 75-76.

10. Дорохов Д. Б., Клоке Э. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов. // Молекулярная генетика. 1997. - Т. 33.- №4. С. 443-450.

11. Доспехов Б. А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1979. С. 242-271.

12. Дрейпер Дж., Скотт Р., Кумар А. и др. Генная инженерия растений. / Пер. под ред. А. М. Колчинского. М.: Мир, 1991. С. 262, 277-303.

13. Катаева H. В., Александрова И. Г., Драгавцева Е. В. Значение гормонов в формировании витрифицированных побегов яблони при микроразмножении. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991.С. 189-192.

14. Квасников Б. В. Методика оценки сортов капусты на устойчивость к киле. М.: Типография ВАСХНИЛ, 1970. С.21.

15. Кирай 3., Клемент 3. Методы фитопатологии. // М.: Колос, 1974. С. 189190.

16. Комалетдинова Ф. М. Методы получения трансгеиных растений картофеля с использованием штаммов Agrobacterium, несущих гены устойчивости к болезням и вредителям: дис. канд. биол. наук. Санкт-Петербург: ВНИИ Защиты растений, 1997.132 с.

17. Кучеренко JI. А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro. В кн.: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М.: Наука, 1991. С. 232-242.

18. Ли А., Тинланд Б. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность (Т-ДНК агробактерий). / / Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 354-359.

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование.// Под ред. Баева А. А. и Скрябина К. Г. М.: Мир, 1984. С. 225-229.

20. Марьяхина И. А. Методические указания по размножению кочанной капусты в культуре. М.: ВАСХНИИЛ, 1985. 22 с.

21. Методические указания по селекции капусты./ Под редакцией Бобровой Ю. М.: Типография ВАСХНИЛ, 1989. С. 35

22. Методы экспериментальной микологии. / Под ред. Билай В. И. Киев. Наукова думка, 1982. С. 486-487.

23. Мобильность генома растений./ Под редакцией Винецкого Ю. П. М.: Агропромиздат, 1990. С. 228-260.

24. Молекулярная клиническая диагностика.Методы. / Под редакцией С. Херрингтона и Дж. Макли. М.: Мир, 1999. С. 354-357.

25. Монахос Г. Ф. Расовый состав возбудителя килы и результаты селекции капусты на устойчивость к патогену.// Защита овоще-бахчевых культур и картофеля от вредителей и болезней: Тез. докл. науч.-практ. конф. -Тирасполь, 1986. С. 64-66.

26. Монахос Г. Ф. Состояние и перспективы селекции капусты белокочанной на устойчивость к киле (Plasmodiophora brassicae Woron.). В кн.: Акту ал. пробл. науки в с.-х. пр-ве. - М.: РУДН, 1997. С. 24-26.

27. Монахос Г. Ф., Джалилов Ф. С., Артемьева Е. А. Устойчивость пекинской капусты к киле и рассовый состав патогена. // Селекция и семеноводство в XXI веке.: Тез. докл. международной науч.-практич. конф. . М.: ВЫПИСОК, 2000. Т. 2. С. 84-85.

28. Монахос Г. Ф., Зубик И. Н. Наследование устойчивости к киле у линий дайкона. // Доклады ТСХА. 2000. - Вып. 272. - С. 227-233.

29. Монахос Г. Ф., Ушанов А. А. Наследование устойчивости к киле (.Plasmodiophora brassicae Woron.) у линий листовой капусты (Brassica oleracea ssp. acepliala). / / Известия ТСХА. 1998. - Вып. 2. - С. 106-114.

30. Народицкий B.C., Лунин В. Г., Анисимова С. С. и др. Ген rs-ap из Raphanus sativus, вектор для трансформации растений и способ получения трансгенного растения. / / RU 2176669 С1, 2000.

31. Норова Г. Е., Калиев А. Б. Трансформация растений томата (Lycopersicon esculentum L.) сорта Бахтемир. // Биотехнология. 1991. - №2. - С. 16-18.

32. Пантиелев Я. X. Пригородное овощеводство. М.: Колос, 1981. С. 195-201.

33. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. М.: Агропромиздат, 1989. С. 318-330.

34. Петрова С., Родева В., Антонова Т. Регенерация ин витро при експланти от облъчени с гамма-лъчи семена на главесто зеле. // Сборник на докладите и резюментата от Юбилейната научна сессия на тема:

35. Устойчивото земледелие в условиях на перехода въм пазарна икономика. Пловдив, 1995. T.IV. кн. 2. С.83-86.

36. Попов Ф. А. Вредоносность альтернариоза семенников капусты. / / Защита растений. 1993. - №10. - С. 30.

37. Радчук В. В., Блюм Я. Б., Рышка у. И. др. Изучение регенерации и получение трансгенных растений у различных сортов белокочанной капусты. / / Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 453-460.

38. Ралдугина Г. Н., Горелова С. В., Кожемякин А. В. Стабильность и наследование трансгенов в растениях рапса. // Физиология растений. -2000. Т. 47. - №3. - С. 437-445.

39. Романов Г. А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности // Физиология растений. 2000. - Т. 47. - №3. - С. 343-353.

40. Сафразбекян С. А., Катаева Н. В., Миляева Э. JI. Морфогенетические особенности побегов каперса в системе клонального микроразмножения. / / Физиология растений. 1990. - Т. 37. - N 1. - С. 169-176.

41. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести. -М.: Издательство стандартов, 1985. 57 с.

42. Сокол П. Ф. Улучшение качества продукции овощных и бахчевых культур. М.: Колос, 1978. С. 66-97.

43. Тивари Р. Д. Биологическое обоснование приёмов защиты капусты от сосудистого бактериоза: автореф. дис. канд. с.-х. наук. М., 1989. - 21 с.

44. Тутельян В. А., Кравченко JI. В., Лашнева Н. В. и др. Медико-биологическая оценка безопасности белкового концентрата, полученного из генетически модифицированной сои. Биохимические исследования. / / Вопросы питания. 1999. -Т. 68. - № 5/6. - С. 9-12.

45. Ушанов А. А. Наследование основных хозяйственных признаков и комбинационная способность самонесовместимых линий кормовой капусты: дис. канд. с.-х. наук. М.: МСХА, 2001.190 с.

46. Шаденков А. А., Ковалёва М. В., Кузьмин Е. В. и др. Vir D2 независимый, но Mob-A зависимый перенос ДНК плазмиды широкого круга хозяев RSF 1010 из агробактерии в ядро растительной клетки. / / Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - Вып. 2. - С. 458-464.

47. Шувалова Г. В. Распространение слизистого бактериоза корнеплодов крестоцветных культур в Ленинградской обл./ Тез. докл. на IV Всес. совещании. Ереван, 1980. С.34-35.

48. Almedia М. S., Cabral К. М., Lindali R. В. , Kurtenbach Е. Characterisation of two novel defense peptides from pea (Pisum sativum) seeds. / / Arch. Biochem. Biophys. 2000. - V. 378 - № 2. - P. 278-286.

49. Bailey J. E. Metabolic Engineering. / / Adv. Mol. Cell. Biol. 1996. -V 15. - P 289-296.

50. Basu A., Sethi U. and Gua-Mukherjee S. Regulation of cell proliferation and morphogenesis by amino acids in Brassica tissue cultures and its correlation with threonine deaminase. // Plant Cell Rep. 1989. - V. 8. - P. 333-335.

51. Beclin C., Chalot F., Botton E. et al. Potential use of the aux2 Gene from Agrobacterium rhizogenes as a Conditional Negative Marker in Transgenic Cabbage. // Transgen Res. 1993. - V 2. - P. 48-55.

52. Berthomieu P., Jouanin L. Transformation of Rapid Cycling Cabbage ( Brassica oleracea var. capitata) with Agrobacterium rhizogenes. / / Plant Cell Rep. -1992. V. 11.-P. 334-338.

53. Bevins C. L. and Zasloff M. Peptides from frog skin. // Annu. Rev. Biochem. -1990. V. 59. - P. 103-106.

54. Bhatia C. R., Mitra R. Biosafety of Transgenic Crops Plants. // Proc. Indian Natl. Sci. Acad. Pt. В (Biol. Sci.). 1998. - V. 64 - №5-6. - P. 293-318.

55. Bhattacharya N. M., Sen S. K. Production of plantles through somatic embriogenesis. // Z. Pflanzenphysiol. 1980. - V. 99. -P. 357-365.

56. Bogre L., Meskiene J., Heberle-Bors E. and Hirt H. Stressing the role of MAP kinases in mitogenic stimulation. // Plant Molecular Biology. 2000. - V. 43. -P. 705-718.

57. Bloh C. and Richardson M. A new family small (5 kDa) proteins inhibitors of insect a-amilases from seeds of sorgum (Sorgum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat y-purothionins. / / FEBS Lett. 1991. - V. 279. - P. 101-104.

58. Boman H. and Hultmark. G. Cell-free immunity in insects. // Annu. Rev. Microbiol. 1987. - V. 41. - P. 103-106.

59. Borlaug N. E. A Green Revolution yelds a golden harvest. // Columbia J. World Bus. -1969. P. 9-19.

60. Boulter M. E., Croy E., Simpson P. et al. Transformation of Brassica napus L. (oilseed rape) using Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhisogenes a comparison. / / Plant Science. -1990. - V. 70 - P. 91-99.

61. Broecaert W. F., Cammue B. Ph., Osborn R. W. et al. Biocidal Proteins.//WO 93/05153 -1993.

62. Broecaert W. F., Terras F. R. G., Cammue B. P. A., Osborn R. W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1354-1358.

63. Brown D. C. W., Leug D. W. N. and Thorpe T. A. Osmotic requirement for shoot formation in tobacco callus. // Physiol. Plant. 1979. - V. 46. - P. 36 -41.

64. Brown D. С. W. and Thorpe T. A. Changes in water potential and its components during shoot formation in tobacco callus. / / Physiol. Plant. -1980. V. 49. - P. 83 -87.

65. Buczacki S. Т., Toxopeus Hv Mattusch P. et al. Study of physiologie specialization in Plasmodiophora brassicae: proposols for attempted rationalization trough an international approach. / / Trans. Br. mycol. Soc. -1975. V. 65 -P. 295-303.

66. Buiatti M., Baroncelli S., Bennici A. et al. Genetic of growth and differantion in vitro of Brassica oleracea var. botrytis. II. An in vitro and in vivo analysis of a diallel cross. // Z. Pflazenzucht. 1974. - V. 72. - P. 269-274.

67. Casse F. Le mais et la resistance aux antibiotique. //La Recherche. 2000. - V. 327. - P. 35-39.

68. Charest P. }., Holbrook L. A., Gabard J. et al. Agrobacterium-mediated transformation of thin cell layer explants from Brassica napus L. // Theor Appl Genet 1988. - V. 75. - P. 438 - 445.

69. Chevassus-au-Luis N. La batalle non termine de terminator. //La recherche. -2000. V. 327. - P. 80-82.

70. Chen L., Marmey P., Taylor N. J. et al. Expression and inheritance of multiple transgenes in risce plants. / / Nature Biotechnology. 1998. - V. 16. - P. 10601064.

71. Chi G.-K. and Pua E.-C. Ethylene inhibitors enhanced de novo shoot regeneration from cotyledons of Brassica campestris ssp. chinensis (Chinese cabbage) in vitro. // Plant Science. 1989. - V. 64. - 243-250.

72. Chiang С. C. and Hadwiger L. A. The Fusarium solani-inducted expression of a pea gene family encoding high cysteine content proteins. / / Mol. Plant-Microbe interact. 1991. - V. 4. - P. 324-331.

73. Chiang M. S. and Crete R. Interitance of clubroot resistance in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata L.). // Can. J. Genet. Cytol. 1970. - V. 12. - P. 253-256.

74. Chiang M. S. and Crete R. Diallel analis of the inheritance of resistsnce to race 6 of Plasmodiophora brassicae in cabbage. / / Can. J. Plant Sci. 1976. - V. 56. - P. 865-868.

75. Chiang M. S. and Crete R. Transfer of resistance to rase 2 of Plasmodiophora brassicae from Brassica napus to cabbage (B. oleracea var. capitata). The inheritance of resistance. // Euphytica. 1983. - V. 32. - P. 479-483.

76. Comczynskiy P. A reagent for the single-step simultaneosus isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. // Biotechniques. 1993. - V. 15 - №3. - P. 532-534,536-537.

77. Chriqui D. Strategies et Enjeux de Transgenese chez les Plantes. // Comptes Rendus Societe de Biologie. 1997. - V. 191. - P. 143-153.

78. Christey M. C., Sinclair В. K., Braun R. H., Wyke L. Regeneration of transgenic vegetable brassicas ( Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation. // Plant Cell Reports. -1997. V. 16 - P. 587-593.

79. Chua N.-H. and Sundaresan V. Plant Biotechnology. The ins and auts of a new green revolution. / / Current Opinition in Biotechnology. 2000. - V. 11. - P. 117-119.

80. Conner A. J., Jacobs J. M. Genetic engineering of crops as potential source of genetic hazard in the human diet. // Mutat Res. 1999. - V. 443. - V. 1-2. - P. 223-234.

81. Cramer C. L., Boothe J. G., Oishi К. K. Transgenic Plants for Therapeutic Proteins: Linking Upstream and Downstream Strategies. / / Plant Biotechnology ./ Eds. Hammond J. et al. Berlin : Springer, 1999. P. 95-118.

82. Crete R. Word wide importance of clubroot. // Clubroot Newsletters. 1981. -V. 11.-P. 6-7.

83. Crisp P., Crute R. A., Sutherland S. M. et al. The exploitation of genetic resources of Brassica oleracea in breeding for resistance to clubroot (Plasmodiophora brassicae). // Euphytica. 1989. - V. 42. - P. 215-226.

84. Crute J. R. and Pink D. A. C. The characteristics and inheritance of resistance to clubroot in Brassica oleracea. / / Asp. Applied Biol. 1989. - V. 23. - P. 57-60.

85. Daniell H. GM Crops: Public Perception and Scientific Solution. / / Trends Plant Sci. 1999. - V. 4 - P. 467-469.

86. Daniell H., Muthukumar В., Lee S. B. Marker free transgenic plants: engineering the chloroplast genome without the use of antibiotic selection. / / Curr. Genet. 2001. - V. 39. - № 2. - P. 109-116.

87. Daniell H., Streatfield S. ., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodes, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. / / Trends Plant Sci. 2001. - V. 6. - № 5. - P. 219-226.

88. Davies G., SheikhM., Ratcliffe O. et al. Genetics of homology-dependent gene silencing in Arabidopsis: a role for methylation. / / Plant J. 1997. - V. 12. -P. 791-804.

89. Debergh P.CV Harbcoui J., Lemeur R. Mass propogation of globe artichoke (Cynare scolymus) evolution of different hypotheses to overcome vitrification with spesial reference to water potential. // Physiol, plant. 1981. - V. 53. - P. 181-187.

90. De Block M., De Brouwer D. and Terming P. Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea Using Agrobacterium tumefaciens and the Expression of the bar and neo Genes in the Transgenic Plants. / / Plant Physiol. 1989. - V. 91. -P. 694-701.

91. De Carvalho F., Gheyesen G., Kushnir S. et al. Supression of b-l,3-glucanase transgene expression in homozygous plants. / / EMBO J. 1992. - V. 11. -P. 2595-2602.

92. De Samblanx G. Wv Goderis I. J., Thevissen K. et al. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Raphanus sativus L.) revereals two adjacent sitesimportant for antifungal activity. //J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 11711179.

93. De Wilde C., Podevin N., Windels P., Depicker A. Silencing of antibody genes in plants with single-copy transgene inserts as a result of gene dosage effects. / / Mol. Genet. Genomics. 2001. - V. 265. - № 4. - P. 647-653.

94. Ding L.-C., Hu C.-Y., Yeh K.-W., Wang P.-J. Development of insect-resistant transgenic cauliflower plants expressing the trypsin inhibitor gene isolated from local sweet potato. // Plant Cell Reports. -1998. V. 17. - P. 854-860.

95. Dingermann Т., Zundorf J. Gentechnik, Biotechnik. Stutgart: Wiss. Verl.-Ges., 1999. P. 213-232.

96. Dixon G. R. Review of resistance to fungal pathogens in the Brassica Eucarpia./ "Cruciferae 1979". Wageningen, 1979. P. 122-129.

97. Dunwell J. M. In vitro regeneration from excised leaf discs of three Brassica species. //J. Exp. Bot. 1981. - V. 32. -№ 129. - P. 789 - 799.

98. Dunwell J. M. Novel Food Product from Genetically Modified Crop Plant: Method and Future Prospects.// Int. J. Foods Sci. Techn. 1998. - V. 33. - P. 205-213.

99. Eimert K., Siegemund F. Transformation of cauliflover (Brassica oleracea L. var. botnjtis) an experimental survey. / / Plant Mol. Biol. - 1992. - V. 19. - P. 485490.

100. Elmayan Т., Balzergue S., Beon F., Bourdon V. Arabidopsis mutants impaired in cosuppression. / / Plant cell. -1998. V. 10. - P. 1447-1457.

101. Elomaa P., Helariutta Y., Griesbach R. et al. Transgene inactivation in Petunia hybrida is influenced by the properties of the foreing gene. / / Mol. Gen. Genet. -1995 V. 248 - P.649-656.

102. Epple P., Apel K., Bohmann H. ESTs reveal a multigene famyly for plant defensins in Arabidopsis thaliana. / / FEBS Lett. 1997. - V. 400. - P. 168-172.

103. Fagard M. and Vaucheret H. (Trans)gene silencing in plants: how many mechanisms? // Annu.Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 2000. - V.51. - P. 179-188.

104. Filatti J. J., Kiser J. et al. Efficient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens vector. / / Biotechnology. -1987. V. 5. - №7. - P. 726-730.

105. Fisher R., Emans N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. // Transgenic Res. 2000. - V. 9. - № 4 - P. 279-299.

106. Flannery К. V. The origins of agriculture. // Ann. Rev. Of Anthropic. 1973. -V. 2. - P. 271-310.

107. Fraley R. Т., Rogers S. G., Horsh R. B. et al. Expression of bacterial genes in plant cell. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P. 4803-4807.

108. Fry J., Barnason A., Horsh R. B. Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens Based Vectors. / / Plant Cell Rep. 1987. - V. 6. - P. 321-325.

109. Gandhi R. and Khurana P. Stress-mediated regeneration from mature embryo-derived calli and gene transfer trough Agrobacterium in rice (Oryza sativa). // Indian J.of Exp. Biol. 1999. - V. 37. - P. 332-339.

110. Ganz T. and Lehrer R. J. Defensins. // Immunology. 1995. - V. 6. - P. 584589.

111. Gao A.-G., Hakimi S. M., Mittanck C. A. et al. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. / / Nature biotechnology. -2000. V. 18. - P. 1307-1310.

112. George L., Rao P. S. In vitro regeneration of mustard plants (Brassica juncea cv. Rai-5) on cotyledon explants from non-irradiated, irradiated and mutagen-treated seed. / / Ann. Bot. 1980. - V. 46. - P. 107-112.

113. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - No 11. - P. 1151-1155.

114. Goodwin J., Gordon Т., Ford-Lloyd B. and Newbury H. J. The effect of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. / / Plant Cell Reports. -1991. V. 9. - P. 671-675.

115. Gu Q., Kawata E. E., Morse M.-J. et al. A flower-specific cDNA encoding a novel thionin in tobacco. // Mol. Gen. Genet. 1992. - V. 234 - P. 89-96.

116. Gutierrez R., Macintosh G. C., Green P. J. Current Perspectives on mRNA Stability in Plants: Multiple Levels and Mechanisms of Control. // Trends Plant Sci. 1999 - V. 4. - P. 429-438.

117. Haldrup A., Petersen S. G., Okkels E. T. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry. / /. Plant Cell Rep. 1998. - V. 18. - P. 76-81.

118. Halmes-Davis R., Commai L., Nuclear Matrix Attachment Regions and Plant Gene Expression. // Trends Plants Sci. 1998. - V. 3. - P. 91-97.

119. Hamilton C. M., Frary Av Lewis C., Tanksley S. D. Stable Transfer of Intact High Molecular Weight DNA into Plant Chromosomes // Proc Natl. Acad. Sci. USA. -1996. V. 93. - P. 9975-9979.

120. Hanley Z., Slabas Т., Elborough К. M. The use of plant biotechology for the production of biodegradable plastics. / / Trends Plant Sci. 2000. - V. 5. - № 2. - P. 45-46.

121. Hansen L. N. Intertribal somatic hybridization between rapid cycling Brassica oleracea L. and Camelina sativa (L.) Crantz. // Euphitica. 1998. - V. 104. - P. 173-179.

122. Hansen M. Genetic variation and inheritance of tolerance to clubroot (Plasmodiophora brassicae Wor.) and other quantitative characters in cabbage (Brassica oleracea L.). // Hereditas. 1989. - V. 110. - P. 13-22.

123. HensKke R. B. and Shmidt F. R. J. Survival, distribution, and gene transfer of bacteria in a compart soil microcosm system. // Biol. Fertil. Soil. -1989. V. 8. -19-24.

124. James С. and Krattiger A. F. Global Review of the Field Testing and Commercialisation of Transgenic Plants 1986 to 1995: The First decade of Crop Biotechnology. IS AAA Brifs No.l. - Ithaca, NY ,USA: ISAAA, 1996. P.31.

125. Jejelowo O. A., Conn K. L. and Tewari J. D. Relationship between conidial concentrarion, germing growth, and phytoalexin production by Camelina sativa leaves inoculated zvith Alternaria brassicacea. // Mycol. Res. 1991. - V. 95. - P. 928-934.

126. Joersbo M., Okkels F. T. A novel principle for selection of transgenic plant cells: positive selection. // Plant Cell Rep. 1996. - V. 16. - P. 219-221.

127. Jun S. J., Kwon S. Y., Pack К. H. Agrobacterium-mediated transformation and regeneration of fertile transgenic plants of Chinese cabbage (Brassica campestris spp. pekinensis cv. ''Spring Flavor"). // Plant Cell Rep. 1995. - 14. - 620-625.

128. Kaiser J. Ecology. Words (and axes) fly over transgenic trees. // Science. -2001. V. 292. - № 5514. - P. 34-36.

129. Kartha К. K., Michayluk M. R., Kao R. N. et al. Callus formation and plant regeneration from mesophill protoplasts of rape plants (Brassica napus L. cv. Zephir.). // Plant Sci. Lett. 1974. - V. 3. - P. 265-271.

130. Karunananda В., Singh A. and Kao T.-H. Characterisation of a predominantly pistil-expressed gene encoding a y-thionin-like protein of Petunia inflata. / / Plant Mol. Biol. -1994. V. 26. - P. 459-464.

131. Kimball S. L., Beversdorf W. D. and Bingam E. T. Influence of osmotic potential on the grown and development of soybean tissue culture.// Crop Sci. 1975. - V. 15. - P. 750 - 752.

132. Klimaszweska K., Keller W. A. High frequency plant regeneration from thin layer explants of Brassica napus. . / Plant Cell Tissue and Organ Culture. -1985. V. 4. - P. 183-197.

133. Klimaszweska K., Keller W. A. Somatic embryogenesis in cell suspension and protoplast cultures of Brassica nigra (L.) Koch.// J. Plant Physiol. 1986. - V. 122. - P. 251-260.

134. Kragh К. M., Nielsen J. E., Nielsen К. K. et al. Characterisation and localization of new antifungal cysteine-rich proteins from Beta vulgaris. // Mol. Plant. Microbe Interact. -1995. V. 8. - P. 424-434.

135. Kubicek Q. B. Panorama da biotechnologia nos EUA. // Biotec. Cien. & Desenv. Brasilia. 1997. - V. 1. - P. 38-41.

136. Kumpatla S. P., Chandrasekharah M. В., Iyer L. et al. Genome Intruder Scannig and Modulation Systems and Trans gene Silencing. / / Trends Plant Sci. 1998. - V. 3. - P. 97-104.

137. Laine E., Haicour R. Risque lies a la commersaliasation des Plantes Transgeniques? / / Cahiers Agricultures. 1998. - V. 7. - P. 546-556.

138. Laufs P., Autran D., Traas I. A. Chromosomal Paracentric Inversion Associated with T-DNA Integration in Arabidopsis. / / Plant J. 1999. - V. 18. - P. 131139.

139. Lazzeri P. A., Dunwell J. M. In vitro regeneration from seedling organs of Brassica oleracea var. italica Plenck cv. Green Comet. I.Effect of plant growth regulators. // Ann. Bot. 1986. -V. 58. - P. 689-697.

140. Lehrer R. J., Ganz T. and Selsted M. E. Defensins: endogens antibiotic peptides of animal cells. / / Cell. 1991. - V. 64. - P. 229-230.

141. Leshem В., Sahs T. Vitrified Dianthus-teratoma in vitro due to growth factor imbalance. // Ann. Bot. 1985. - V. 56. - P. 613-617.

142. Leshem В., Shaley D. P., Izhar S. Cytokinin as an inducer of vitrification in melon. // Ibid. 1988. - V. 61. - P. 255-260.

143. Lim H. Т., You Y. S., Park E. D. et al. High plant regeneration, genetic stability of regenerants, and genetic transformation of herbicide resistance gene (bar) in Chinese cabbage (Brassica campestris ssp. pekinensis). j j Proc. Int. Symp. on

144. Brassicas. Eds Thomas Gregoire and Antonio A. Monteiro. Acta Hort. 1998. P 199 208.

145. Logemann E., Wu S. C., Shroder J. et al. Gene activation by UV light, fungal elicitor or fungal infection in Petroselium crispum is correlated with repressin of cell cycle related genes. / / Plant J. V. 8. - P. 865-876.

146. Maliga P. Towards Plastid Transformation in Flowering Plants. // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - P. 101-106.

147. Mattusch P. Kohlhernieanfalligkeit enes Chinakohlsortimetes. / / Gemuse. -1994. V. 6. - P. 357-359.

148. Matzke A., Neuhuber F., Park Y. et al. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes. / / Mol. Gen. Genet. -1994. V.244 - P. 219-229.

149. Mendez E., Moreno A., Collila F. et al. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free sistem of a novel thionin, y-hordothionin, from barley endosperm. // Eur. J. Biochem. -1990. V.194. - P. 533-539.

150. Metz T. D., Dixit R., Earle E. D. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (B. oleracea var. capitata). // Plant Cell Reports. 1995. - V. 15. - P. 287-292.

151. Meyer P., Heidmann I., Niedenhof I. Differences in DNA-methylation are assocated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia. / / Plant J. -1993. V. 4. - P. 89-100.

152. Meyer P., Saedler H. Homology-dependent gene silencing in plants. / / Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1996. V. 47. - P. 23-48.

153. Miflin В., Napier J., Shewry P. Improving Plant Product Quality. / / Nature Biotech. 1999. - V. 17. - Suppl. P. BV 13-BV14.

154. Miki B. L., Labbe H., Hattori J. et al. Transformation of Brassica napus Canola Cultivar with Arabidopsis thaliana Acetohydroxyacid Synthase Genes and Analysis of Herbicide Resistance. / / Theor. Appl. Genet. 1990. - V. 80 - P. 449-458.

155. Mittelsten S., Afsar K., Paszkowski J. Release of epigenetic gene silencing by trans-acting mutations in Arabidopsis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95. - P. 632-637.

156. Moloney M. M., Radke S. Transformation and foreign gene expression in Brassica species. //US 5750871,1998.

157. Moloney M. M., Walker J., Sharma К. K. High Efficiency Transformation of Brassica napus Using Agrobacterium Vectors. / / Plant Cell Rep. 1989. - V. 8. -P. 238-242.

158. Moreno M., Segura A. and Garcia-Olmedo F. : Pseudothionin, a potato peptide active agains potato pahogens. / / Eur. J. Biochem. 1994. - V. 223. - P. 135 -139.

159. Murashige T. and Skoog F. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiologia Plantarum. 1962. - V. 15. - P. 473497.

160. Murphy D. J. Production of Novel Oils in Plants. / / Cur. Opin. Biotech. -1999. V. 10. - P. 175-180.

161. Nacry P., Camilleri C., Courtial B. et al. Major-Chromosomal Rearrangements Inducted by T-DNA Transformation in Arabidopsis. / / Genetics. 1998. - V. 149. - P. 641-650.

162. Nap J. P., Bijvoet J. and Stiekema W. D. Biosafety of kanamycin-resistant transgenic plants. / / Transgenic Research. -1992. V. 1. - № 6. - 239-249.

163. Narasimhulu S. В., Chopra V. L. Species specific shoot regeneration response of cotyledonary explants of Brassicas. / / Plant Cell Reports. 1988. - V. 7. - P. 104 -106.

164. Narasimhulu S. В., Kirti S. В., Mohapatra T. et al. Shoot regeneration in stem explants and its amenability to Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer in Brassica carinata. / / Plant Cell Reports. 1992. - V. 11. - P. 359-362.

165. Oh B. J., Ко M. K., Kostenyuk I. et al. Coexpression of a defensin gene and a thionin-like via different signal transduction pathways in pepper and

166. Colletotrichum gloeosporioides interactions. // Plant Mol. Biol. 1999. - V. 41. -№ 3. - P. 313-319.

167. Ohlrogge J. Plant Metabolic Engineering: Are We Ready to Phase Two? / / Cur. Opin. Plant. Biol. 1999. - V. 2. - P. 121-122.

168. Osborn R. W., De Sanblanx G. W., Thevissen K. et al. Isolation and characterisation of plant defensins of Asteracea, Fabacea, Hippocastanacea and Saxifragacea. / / FEBS Lett. 1995. - V. 368. - P. 257-262.

169. Ovesna J., Ptacec L. and Opartny Z. Factors influencing the regeneration capacity of oilseed rape and cauliflower in transformation experiments. / / Biologia Plantarum. 1993. - V. 35 - № 1. - P. 107-112.

170. Penninckx J. A. M. A., Eggermont K., Terras F. R. G. Pathogen-inducted systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a Salicylic Acid Independent patway. // Plant Cell. - 1996. - V. 8. - P. 2309-2323.

171. Pental D., Pradhan A. K., Sodhi Y. S. Mykhopadhyay A. Variation amongst Brassica juncea Cultivars for condition for Agrobacterium-mediated Genetic Transformation. // Plant Cell Rep. -1993. V. 12. - P. 462-467.

172. Perennes C., Clab Nv Gugliem B. et al. Ars A3 a possible mediator in the signal transduction patway during agonist cell cycle arrest by salicylic acid and UV irradiation ?// J. Cell Sci. 1999. - V. 112. - P. 1181-1190.

173. Perl A., Shaul O., Galili G. Regulation of lysine synthesis in transgenic potato plants expressing a bacterial dihydrodipicolinate synthase in their chloroplasats. // Plant Mol. Biol. 1992. - V. 19. - P. 815-823.

174. Pua E.-C., Trinh Т. H. and Chua N.-H. High frequency plant regeneration from stem explants of Brassica alboglabra Bailey in vitro. // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1989,17:143-152.

175. Poirier Y. Production of New Polymeric Compound in Plants.// Cur. Opin. Biotech. 1999 - V. 10. - P. 181-185.

176. Poirier Y. Production of poliesters in transgenic plants. / / Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2001. - V. 71. - P. 209-240.

177. Prols F. and Meyer P. The methilation patterns of chromosomal integration regions influence gene activity of transferred DNA in Petunia hybrida. / / Plant J. -1992. V. 2. - P. 465-475.

178. Radchuk V. V., Klocke E., Ryscka U., Neumann M. Optimierung des Agrobacterium-vermittelten Gentransfers bei verschiodenen Brassicaceae. / / Vortrage Pflanzenzuchtung. -1998. V. 42. - P. 107-109.

179. Radke S. E., Andrews B. M., Moloney M. M. Transformation of Brassica napus L. using Agrobacterium tumefaciens: developmentally regulated expression of a reintroduced napin gene. // Theor Appl Genrt. 1988. - V. 75. - P. 685 - 694.

180. Ranee J. M., Tian W., Mathews H. et al. Partial desiccation of mature embryo-derived calli, a simple treatment that dramatically enhances the regeneration ability of indica rice.// Plant Cell Rep. 1994. - V. 13. - P. 647-651.

181. Raybould A. F. Transgenes and Agriculture: Going with the Flow. / / Trends Plant Sci. 1999. - V. 4. - P. 247-248.

182. Reichheld J.-P., Vernoux Т., Lardon F. et al. Specific checkpoints regulate plant cell cycle progression in response to oxidative stress. / / Plant J. 1999. - V. 17. - P. 647-656.

183. Richter L. and Kipp P. B. Transgenic Plants as Edible Vaccines. Plant Biotechnology./ Eds. Hammond J. et al. - Berlin : Springer, 1999. P. 159-176.

184. Salamini F. North-South Innovation Transfers. // Nature Biotech. 1999. -V.17. - Suppl. P. BV 11 - BV12.

185. Sanhis V., Agaisse H., Chaufaux J., Lereclus D. A. Recombiase Mediated System for Elimination of Antibiotic Resistance Gene Markers from Genetically Engineered Bacillus thuringiensis Strains. // Appl. Environ Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 779-784.

186. Schuller Т. H., Poppy G. M„ Kerry B. R., Denholm I. Potential Side Effects of Insect Resistant Transgenic Plants on Arhropod Natural Enemies. / / Trends Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 210-216.

187. Segura A., Moreno M., Garcia-Olmendo F. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea). // FEBS Lett. 1998. - V. 435. - № 2-3. -159-162.

188. Serageldin I. Biotechnology and Food Security in the 21st Century. / / Science. -1999. V. 285. - P. 387-389.

189. Sethi U. and Gua-Mukherjee S. Biochemistry and molecular biology of competence of plant cell differentiation and regeneration in vitro a review. // Current Science. - 1990. - V. 59. - № 6. - P. 308-311.

190. Shade R. E., Schroeder H. E., Pueyo J. J. et al. Transgenic pea seeds expressing the a-amilase inhibitor of the common bean are resistant to branched beetles. // Biotechnology. 1994. - V. 12. - P. 793-796.

191. Shagger H. and von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.// Anal. Biochem. 1987. - V. 166. - № 2. - 368-375.

192. Shaul O., Galili G. Threonine overproduction in transgenic tobacco plants expressing a mutant desensitized aspartate kinase of Eslierichia coli. / / Plant Physiol. 1992. - V. 100. - P. 1157-1163.

193. Shimoda S. Seeds in 1998 moving into a period of competitive disequilibrium. - ISTA news bull. Zurich: Intern. Seed testing assoc, 1998. V. 116. P. 27-29.

194. Shmit F., Oakeley E. J., Jost J. P. Antibiotics Induce Genome-Wide Hypermethylation in Cultured Nicotiana tabacum Plants //J. Biol. Chem. -1997. V. 272. - P. 1534-1540.

195. Shuppler U., He P.-H., John P. C. L. and Munns R. Effect of water stress on cell-division-cycle 2-like cell-cycle kinase activity in wheat leaves. // Plant Physiol. 1998. - V. 117. - P. 667-678.

196. Sing S. Inducted organ differentiation in hypocotyl segments callus and cell suspension cultures of rape Brassica napus campestris. / / Indian J. Exp. Biol. -1981. V. 19. - P. 658-660.

197. Sjodin С. Brassicacea, a Plant Family Well Suited for Modern Biotechnology. // Acta Agric. Scand. -1992. V. 42. - P. 197-207.

198. Skoog Fv Miller С. B. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. / / Simp. Soc. Exp. Biol. 1957. - V. 11. - P. 118130.

199. Smith H. O., Wilcox K. W. A restriction enzyme from Haemophilus influenzae. Purification and general properties. / / J. Mol. Biol. 1970. - V. 51. - P. 379.

200. Srivastava V., Reddy A. S., Guha-Mukkerjee S. Transformation and regeneration Brassica oleracea mediated by an oncogenic Agrobacterium Tumefaciens. / / Plant Cell Rep. 1988. - V. 7 - 504-507.

201. Stam M., De Bruin R., Kenter S. et al. Post-transcriptional silencing of chalcone syntase in petunia by iverted transgene repeats. // Plant J. -1997. V. 12. - 6382.

202. Terras F. R. G., Eggermont K., Kovaleva V. et al. Small Cysteine-Rich Antifungal Proteins from Radish: Their Role in Host Defense. / / Plant Cell. -1995. V. 7. - P. 573-588.

203. Terras F. R. G., Schoofs H. M. E., De Bolle M. F. C. et al. Analysis of two novel classes of antifungal proteins from radish ( Raphanus sativus L.) seeds. / / J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. - P. 15301-15309.

204. Terras F. R. G., Torrekens S., Van Leuven F. et al. A new famili of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicae-species. / / FEBS Lett. -1993. V. 316. - P. 233-240.

205. Thanh N. Т., Siemens J.; Sacristan M.D. Regeneration und Transformation von Brassica oleracea-Linien,die in Vietnam angebaut werden . // Vortr.fur Pflanzenzuchtung. Bonn. 1996. - H.32. - S. 76-78 .

206. Thevissen К., Ghazi A., De Samblanx G. W. et al. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins. / / The journals of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - № 25 - P. 15018-15025.

207. Thevissen K., Terras F. R., Broekaert W. F. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth. // Appl. Environ Microbiol. 1999. - V. 65. - №12. - P. 5451-5458.

208. Thiery D. and Vaucheret H. Sequence homology requirements for transcriptional silencing of 35S transgene and posttranscriptional silencing of nitrite reductase (trans)gene by the tobacco 271 locus. // Plant Mol. Biol. -1996. V. 32. - P. 1075-1083.

209. Thomzik J. E., Hain R. Transgenic Brassica napus Plants Obtained by Cocultivation of Protoplast with Agrobacterium tumefaciens. // Plant Cell Rep. -1990. V. 9. - P. 233-236.

210. Tjallingii F. Testing clubroot-resistance of turnip in the Netherlands and the physiologic specialization of Plasmodiophora brassicae. / / Euphitica. 1965. -V. 14. - P. 1-22.

211. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from acrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

212. Tsukahara M. and Hirosawa T. Simple dehydration treatment promotes plantlet regeneration of rice ( Oryza sativa L.) callus.// Plant Cell Rep. 1992. -V. 11. - P. 550-553.

213. Van Elsas J. D. and Pereira M. T. P. R. R. Occurence of antibiotic resistance among bacilli in Brazilian soils and the possible invovlement of resistance plasmids. / / Plant Soil. -1986. V. 94. - 213-226.

214. Vaucheret H. Identification of a general silencer for 19S and 35S promoters in a transgenic tobacco plant: 90 bp of homology in the promoter sequences are sufficient for trans-inactivation. // C.R. Acad. Sci. 1993. - V. 316. - P. 14711483.

215. Vilitez A. M., Ballester A., San Jose M. S., Vieitez E. Anatomical and chemical studies of vitrified shoots of chestnut regenerated in vitro. / / Ibid. -1985. V. 65. - P. 177-184.

216. Vogel J., Somerville S. Isolation and characterization of powdery mildew-resistant Arabidopsis mutants. / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000. V. 97. -№ 4. - P. 1897-1902.

217. Voorrips R. E. Plasmodiophora brassicae: aspects of pathogenesis and resistance in Brassica oleracea. // Euphytica. 1995. - V. 83. - P. 139-146.

218. Voorrips R. E. and Visser D. L. Examination of resistance to clubroot in accessions of Brassica oleracea using a glasshouse seedling test. / / Neth. J. PL Pathol. -1993. V. 99. - P. 269-276.

219. Vriesenga J. D. and Honma S. Inheritance of seedling resistance to clubroot in Brassica oleracea L. // HortScience. 1971. - V. 6. - P. 395-396.

220. Wang Y., Nowak G., Culley D. et al. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeriamaculans) disease in transgenic canola(Brassica napus ). // Mol. Plant-Microbe Interact. 1999. - V. 12. - P. 410-418.

221. Waterhouse P.M., Wang M. В., Lough T. Gene silencing as an adaptive defence against viruses. // Nature. 2001. - V. 411. - № 6839. - P. 834-842.

222. Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular structure of nucleic acids. A structure for deoxyribose nucleic acid. // Nature. 1953. - V. 171. - P. 737.

223. Wetherell D. F. Enchanced adventive embriogenesis resulting from plasmolysis of cultured wild carrot cells.// Plant Cell Tissue Org. Cult. 1984. - V. 3. - P. 221-227.

224. Willmitzer L. Plant Biotechnology: Output Trans the Second Generation of Plant Biotechnology Products Is Gaining Momentum. / / Cur. Opin. Biotech. -1999. - V. 10. - P. 161-162.

225. Wolf E. C. Beyond the Green Revolution. // Worldwatch. -1986. P. 73.

226. Wolfenbarger L. L., Phifer P. R. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants. / / Science. 2000. - V. 290. - № 5499. - P. 2088-2093.

227. Yoshikawa H. Breeding for clubroot resistance of crucifer crops in Japan. / / Jpn. Agr. Res. Quart. 1983. - V. 17. - P. 6-11.

228. Yu J., Langridge W. H. A plant-based multicomponent vaccine protect mice from enteric diseases. / / Nat. Biotechnol. 2001. - V. 19. - № 6. - P. 548-552.

229. Zambriski P., Jools H., Genetello C. et al. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cell without alteration of their normal regeneration capacity. // EMBO J. 1983. - V. 2. - P. 2143-2150.

230. Zhang C. L., Chen D. F., McCormac A. C. et al. Use of the GFP reporter as a vital marker for Agrobacterium-mediated transformation of sugar beet (Beta vulgaris L.). // Mol. Biotechnol. 2001. - V. 17. - № 2. - P. 109-117.

231. Zuo J., Niu Q. W., Moller S. G., Chua N. H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. / / Nat. Biotechnol. 2001. - V. 19. - № 2. -P. 157-161.141