Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Мишуткина, Яна Владимировна

• Мишуткина, Яна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мишуткина, Яна Владимировна

1. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

2. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

• 3. ВВЕДЕНИЕ.

4. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

4.1 Биология и особенности селекции сахарной свеклы {Beta vulgaris L.).

4.2 Основные этапы генетической трансформации и получения генетически модифицированного растения (ГМР).

4.2.1 Культура клеток и морфогенез растений in vitro.

4.2.2 Влияние генотипа растения на компетентность к регенерации in vitro.

4.2.3 Влияние типа и состояния экспланта на морфогенез in vitro.

4 4.2.4 Влияние компонентов питательной среды на морфогенез растений in vitro.

4.2.5 Влияние условий культивирования клеток и тканей на процессы морфогенеза.

4.3 Клональное микроразмножение растений.

4.4 Генетическая трансформация растительных клеток.

4.4.1 Способы генетической трансформации растений.

4.4.2 Молекулярные механизмы и факторы влияющие на агробактериальную трансформацию.

• 4.4.3 Векторные системы на основе Ti-плазмид.

4.4.4 Бактериальные штаммы.

4.4.5 Гены, используемые для трансформации.

4.4.6 Селекция как этап трансформации.

4.5 Сахарная свёкла как объект генно-инженерных манипуляций.

5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Растительный материал.

5.2 Методы культивирования сахарной свеклы in vitro.

5.2.1 Состав сред и условия культивирования.

5.2.2 Получение стерильного растительного материала.

5.2.3 Изоляция сегментов гипокотиля и индукция образования каллуса.

5.2.4 Регенерация побегов из морфогенного каллуса.

5.2.5 Изоляция семядолей и индукция образования каллуса.

5.2.6 Индукция образования побегов из семядольных узлов.

5.2.7 Клональное микроразмножение.

5.2.8 Индукция регенерации побегов из черешков листа.

5.2.9 Укоренение побегов и адаптация растений к почвенным условиям.

5.3 Культура агробактерии.

5.3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.

5.3.2 Подготовка агробактериальной культуры к трансформации.

Ф 5.4 Трансформация и селективный отбор растений.

5.4.1 Сокультивация эксплантатов с Agrobacterium tumefaciens.

5.4.2 Определение оптимальной концентрации селективного агента

5.5 Молекулярно-генетический анализ.

5.6 Определение GFP свечения.

5.7 GUS окрашивание.

5.8 Анализ устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста

5.9 Статистическая обработка данных.

6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Получение стерильного растительного материала.

6.2 Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации побегов in vitro.

6.2.1 Индукция образования каллуса.

6.2.2 Индукция образования каллуса из семядолей.

6.2.3 Регенерация побегов из морфогенного каллуса.

6.2.4 Регенерация побегов из семядольного узла.

6.2.5 Клональное микроразмножение побегов.

6.2.6 Регенерация побегов из черешка листа.

• 6.3 Оптимизация параметров укоренения побегов in vitro и адаптация растений из культуры in vitro к условиям искусственного климата.

6.4 Определение оптимальных параметров агробактериальной трансформации на основе транзиентной экспрессии маркерных генов

6.5 Определение оптимальной селективной концентрации фосфинотрицина in vitro.

6.6 Получение трансгенных растений сахарной свеклы с геном bar.

6.7 Оценка устойчивости трансгенных линий к действию гербицида Баста

6.8 Разработка селекционного процесса с участием трансгенной составляющей.

7. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение регенерационной и трансформационной компетентности сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и создание трансгенных растений, устойчивых к гербициду Баста»

Актуальность проблемы Сахарная свекла (Beta vulgaris L) важнейшая техническая культура, являющаяся сырьем для производства 3540% сахара в мире. В Российской Федерации это традициопный и основной отечественный источник получения сахара. Ежегодно в РФ эту культуру высевают на площади около 1 млн.га. Однако за последние 15 лет произошло снижение урожайности и, как следствие, уменьшение производства сахара из сахарной свеклы и увеличение использования в качестве сырья импортного сахара-сырца (более 50%) (Рисунок 1). Сложившаяся ситуация объясняется целым рядом экономических и агротехнических причин: низкой эффективностью борьбы с патогенными микроорганизмами, сорняками и насекомыми-вредителями; отсутствием сортов и гибридов сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам, абиотическим и биотическим стрессам. Рисунок 1. Данные Росстата по производству сахарной свеклы и сахарапеска. Производство сахарной свеклы в РФ в период с 1970-2005 (млн.т.) 35 30 25 Производство сахара-песка 7000 6000 5000 4000 If ,6 I 3000 2000 1000 2503 3196,6 !3096,7| 2646,4 К 20 1 I 15 10 1990 1995 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2005 Ш из импортного сырья 2006 S из отечественного сырья Более половины всех затрат при возделывании сахарной свеклы приходится на борьбу с сорной растительностью [1]. Засоренность посевов может доходить до 99%, из них 60% в средней и сильной степени [2, 3]. Потери от сорняков в среднем оцениваются в 25-30% от урожая, но реально они могут быть выше [4, 5]. В связи с этим, необходимым условием сохранения урожая является борьба с сорной растительностью. Такими методами по защите культуры от сорняков как севообороты, системы удобрений, механизированная обработка, ручная пронолка и др., невозможно полностью очистить поля от сорняков. Один из основных путей решения данной проблемы является химическая обработка посевов с помош;ью гербицидов. В связи с тем, что сахарная свекла обладает высокой чувствительностью к фитотоксическому эффекту многих гербицидов, обработку нроводят либо большой дозой однократно (до прорастания семян), что негативно сказывается на всхожести семян, либо небольшими дозами несколько раз на стадии прорастания семян (в течение 6 недель). Многократные обработки часто оказывают неблагоприятное воздействие, как на сами проростки, так и на окружающую среду. Методы генной инженерии отрыли возможность вводить в сахарную свеклу гетерологичные гены, улучшаюшие агротехнические свойства данной культуры, которые раннее невозможно было использовать в традиционной селекции. Создание устойчивых к гербицидам сортов и гибридов позволит решить проблему сорных растений, уменьшить время и частоту обработки полей и, тем самым, снизить экологическую нагрузку на окружающую среду [6]. В течение последних 2-х десятилетий с помощью генной инженерии были получены различные сельскохозяйственные виды растений устойчивые к гербицидам, в том числе и сахарная свекла [7, 8]. Однако создание трансгенных линий до сих пор под силу только крупным международным биотехнологическим компаниям, инвестирующим большие средства в изучение молекулярно-генетических основ данного процесса. В настоящее время существует ряд факторов, сильно ограничивающих возможности генетической трансформации этой культуры. Прежде всего, регенерация и трансформация сахарной свеклы является в значительной степени генотипзависимым процессом. К тому же большинство опубликованных работ по трансформации выполнены на сортах и гибридах иностранной селекции. Иностранные гибриды имеют ряд недостатков при выращивании в климатических условиях РФ: неустойчивы к заболеваниям в поле, склонны к загниванию корнеплодов при хранении [9, 10]. Это связано с тем, что сорт любой культуры обладает устойчивостью к патогенным организмам и вызываемым ими болезням для тех условий, в которых он был создан. Почвенно-климатические условия большинства европейских стран, в которых ведется селекция сахарной свеклы, существенно отличается от условий основных зон свеклосеяния Российской Федерации, как по видовому составу почвенной микрофлоры, так и по соотнощению в ней грибов и бактерий, а также по активности патогенных организмов [11]. К тому же гибриды иностранной селекции требуют большего периода вегетации и более высоких температур, чем климатические условия большинства свекловысевающих областей РФ. Данные факторы существенно влияют на заболеваемость иностранных сортов и гибридов. Создание сахарной свеклы устойчивой к гербицидам общего действия на основе сортов и гибридов Российской селекции даст возможность сократить потери урожая и увеличить доли отечественного сырья на российских сахарных заводах. Кроме того, применение гербицид устойчивых гибридов позволить снизить экологическую нагрузку на окружающую среду. В результате этого российская сахарная промышленность сможет постепенно заменить 50% используемого сахара-сырца на отечественное сырье. Все сказанное выше показывает необходимость разработки систем регенерации и генетической трансформации сортов и гибридов отечественной селекции с целью создания растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам. Этой главной цели и посвящена настоящая работа. Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось изучение регенерационной и трансформационной компетентности сортов и линий сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) отечественной селекции и создание трансгенных растений/линий, экспрессирующих ген bar, онределяющий резистентность к гербициду снлошного действия Баста (Либерти), Дальнейшее включение таких растений в селекционный нроцесс нриведет к созданию гербицид-устойчивых сортов и гибридов. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи: 1, Определить для каждого из исследуемых генотипов оптимальную комбинацию ростовых регуляторов и тип эксплантата с целью получения регенерации побегов in vitro с частотой, подходящей для разработки системы генетической трансформации, 2, Оптимизировать трансформации сахарной параметры свеклы, проведения используя для агробактериальной оценки системы транзиентной экспрессии маркерных генов, 3, Разработать методику негативной селекции трансгенных клеток сахарной свеклы ш vitro, основанную на устойчивости к фосфинотрицину (действующему веществу гербицида Баста), определяемую экспрессией гена bar. 4, Получить трансгенные растения сахарной свеклы, несущие ген bar, обуславливающий устойчивость к гербициду Баста, и определить наличие экспрессии данного гена, 5, Оценить устойчивость полученных трансгенных линий к действию гербицида Баста, Научная регенерации новизна. из Разработан семядольных эффективный узлов способ прямой частота побегов (достигнутая регенерации составила, в зависимости от генотипа, 35-61%), На основе этого способа регенерации разработана оригинальная система генетической трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens. Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов ш vitro для сахарной свеклы является прямое образование побегов из многоклеточных эксплантов. При использовании данного способа частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%. Разработана эффективная система клонального микроразмножения побегов, позволяющая получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца. Разработана система негативной селекции in vitro трансгенных клеток, устойчивых к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов. Практическая значимость получениых результатов. Полученные трансгенные линии сахарной свеклы российской селекции, устойчивые к гербициду Баста, являются ценным исходным материалом для селекционной работы. Разработанные системы регенерации и трансформации могут быть применены для получения трансгенных растений сахарной свеклы с другими хозяйственно-ценными генами. Разработанный способ клонального микроразмножения сахарной свеклы может быть использовап: для оздоровления растений от вирусов; для сохранения и быстрого размножения ценного исходного материала; для скрининга генотипов сахарной свеклы на устойчивость к биотическим и абиотическим факторам; в качестве источника эксплантатов для генетической трансформации и как способ «расхимеривания» (получения однородных по введенному гену растений после генетической трансформации многоклеточных эксплантов). Разработанная составляющей схема селекционного процесса с трансгенной представляет практический интерес для современного свекловодства в РФ, поскольку создание трансгенных гибридов сахарной свеклы на основе ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивых к гербицидам, позволит не только снизить потери урожая и увеличить долю отечественного сырья на российских сахарных заводах, но и минимизировать возможный риск распространения трансгенной пыльцы на другие сорта и линии, а также близкородственные виды. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2-ой научной конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики» (Москва, 2003); на XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005); на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва, 2005); на Четвертом Московском международном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007). СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гапоненко А.К., Маркеев А. Н,, Мишуткина Я.В., Фадеев B.C. Пути и проблемы создания трансгенных растений важнейших сельскохозяйственных культур, В книге: Трансгенные растения новое направление в биологической защите растений. Краснодар, 2003. 156-170. 2. Мишуткина Я.В., Гапоненко А.К. Изучение морфогенеза сахарной свеклы в культуре in vitro. Вторая научная конференция Московского общества генетиков и селекционеров «Актуальные проблемы современной генетики». Москва, 2003. 154. 3. Gaponenko А.К., Mishutkina Y.V. The development of an efficient regeneration and transformation systems for the transgenic sugar beat (Beta vulgaris L) production. XVth International Plant Protection Congress, Beijing, China, May 11-16,2004. P. 704. 4. Мишуткина Я.В., Гапоненко А.К. Определение концентрации фосфинотрицина для селекции in vitro трансгенных растений сахарной свеклы, несущей ген BAR, «Перспективные XVII зимняя молодежная физико-химической научная школа биологии и направления биотехнологии», Москва, 2005. 91. 5. Гапоненко А.К., Скрябин К.Г., Мишуткина Я.В. «Способ получения генетически модифицированных растений сахарной свеклы с использованием Agrobacterium tumefaciens», Патент РФ 2278162. Приоритет от 30,12.2004. 6. Мишуткина Я.В., Трухина М.С., Гапоненко А.К. Регенерация сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) in vitro. Международная школа-конференция молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». Москва, 2005. 194-195. 7. Мишуткииа Я.В., Гапоненко А.К. Изучение влияния состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на частоту регенерации растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) in vitro. Генетика, 2006, том 42, 2, с. 210-218. 8. Трухина М.С., Мишуткииа Я.В., Гапоненко А.К. Индукция адвентивных побегов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) in vitro. Студенческая научная конференция им. П.И. Вавилова «Генетика, Селекция и Биотехнология». Москва, 2006. 52-53. 9. Мишуткииа Я.В., Гапоненко А.К. Влияние абсцизовой кислоты на регенерацию побегов из каллуса сахарной свеклы {Beta vulgaris L.) I(IX) Международная конференция молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 2006. 174. 10. Мишуткииа Я.В. Агробактериальная трансформация сахарной свеклы {Beta vulgaris L) in vitro. Материалы четвертого съезда Обш,ества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Пущино, 2006. 160-162. 11. Мишуткина Я.В., Богомолов М.А., Федулова Создание нового гибрида сахарной свеклы с Т.П., Скрябин К.Г. трансгенной конгресс участием компоненты. Четвертый Московский международный «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития». Москва, 2007. 236. 12. Мишуткина Я.В., Ганоненко А.К., Скрябин К.Г. Микроклональное размножение сахарной свеклы in vitro. Сахарная свекла, 2007. 7. С,28-30.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Мишуткина, Яна Владимировна

7. ВЫВОДЫ

Показано, что наиболее эффективным способом регенерации побегов in vitro для сахарной свеклы является прямой органогенез из многоклеточных эксплантов. При использовании данного способа, частота побегообразования составила 35-97% (в зависимости от генотипа и типа экспланта), в то время как при регенерации через каллус 10-17,1%.

Разработан эффективный способ регенерации побегов из семядольных узлов (частота регенерации составила 35-61%) и на его основе разработана оригинальная система агробактериальной трансформации. Разработан эффективный способ клонального микроразмножения побегов, позволяющий получать более 500 клонов от одного растения сахарной свеклы за 2,5 месяца. На основе использования микроразмноженных клонов, оптимизирован способ регенерации побегов из черешков листа (частота регенерации составила 73-97%). Оптимизированы параметры агробактериальной системы трансформации с использованием супервирулентной линии Agrobacterium tumefaciens ЕНА 105 для отечественных сортов и гибридов сахарной свеклы.

Разработана система селекции трансгенных тканей, основанная на устойчивости к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов. Получены трансгенные растения сахарной свеклы сортов «Рамонская односемянная 47», «Льговская односемянная 52» и линий «РМС 73», «ЛБО 17» и «ЛБО 19», экспрессирующие ген bar и показана их высокая устойчивость к действию гербицида Баста: в условиях in vitro (400мг/л РРТ), в условиях закрытого грунта (9 л/га) и полевых условиях (3 л/га).

Предложена схема оптимизированного селекционного процесса с трансгенной составляющей, позволяющая минимизировать возможный риск распространения трансгенной пыльцы на другие сорта и линии, а также близкородственные виды.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мишуткина, Яна Владимировна, 2007 год

1. D'Halluin К., Bossut М., Bonne Е., Mazur В., Leemans J. and Botterman J. Transformation of sugarbeet {Beta vulgaris L.) and evaluation of herbicide resistance in transgenic plants // Biotechnology. 1992. V. 10. P. 309-314.

2. Mannerlof M., Tuvesson S., Steen P., Tenning P. Transgenic sugar beet tolerant to glyphosate // Euphytica 1997. V. 94. P. 83-91.

3. Балков И .Я. В новых условиях новые решения // Сахарная свекла. 2004. №4.

4. Спичак В.В., Дудкин В.М., Сапронов Н.М. Свеклосахарный комплекс России в 2005 году: некоторые итоги // Сахарная свекла. 2006. № 2. С. 2-5.

5. Апасов И. В., Парфенов A.M., Безлер Н. В. Сортовой состав сахарной свеклы и его влияние на эффективность свеклосахарного производства России // Сахарная свекла. 2004. №1.

6. Сурков Н.А., Турьянский А.В., Хмельницкий А.А., Кондратенко. Свеклопроизводство // Белгород. 2002.-160 с.

7. Мазлумов A.M. Пути увеличения производства сахарной свеклы // Воронежское издательство. 1993.^46 с.

8. Балков И. Я. Селекция сахарной свеклы на гетерозис//М.: Россельхозиздат. 1978.— 167 с

9. Хмельницкий А.А., Жуковский А.С., Черный А.Г., Чурсин А.С. Практикум по свекловодству. Учебное пособие // Белгород, БГСХА. 2004. -82 с.

10. Цыренов В.Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений: Учебно-методическое пособие // Улан-Удэ: ВСГТУ, 2003. 58с.

11. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии//М.: Издательский центр «Академия». 2005. 208 с.

12. Ежова Т.А. Генетический контроль тотипотентности растительных клеток в культуре in vitro II Онтогенез. 2003. том 34. № 4. с. 245-252.

13. Stahl Y. and Simon R. Plant stem cell niches // Int. J. Dev. Biol. 2005. V. 49. P 479489.

14. Prem L., Bhalla Mohan B. Singh Molecular control of stem cell maintenance in shoot apical meristem // Plant Cell Rep. 2006. V. 25. P. 249-256.

15. Kut S.A., Evans D.A., Plant regeneration from cultured leaf explants of eight wild tomato species and two related Slanum species // In vitro, 1982. v.l8. p. 583 589.

16. Высоцкий В.А. Регенерационная способность изолированных меристематических верхушек черной смородины и вишни и методы получения из них целых растений // Л.: ВИР, 1978

17. Green С. Е., Phillips R. L., Plant regeneration from tissue cultures of maize // Ibid., 1975. v.15. p.417-421.

18. Sears R.G., Deckard E.L., Tissue culture variability in wheat: callus induction and plant regeneration // Crop Sci., 1982. v.22. p. 546 550.

19. Paterson K.E., Shoot tip culture og Helianthus annuus flowering and development of adventitious and multiple shoots // Am. J. Bot., 1984. v. 71. p.925 931.

20. Kaburu M'ribu, Veilleux K, Effect of genotype, explant, subculture interval and environmental conditions on regeneration of shoots from in vitro monoploids of a diploid potato species // Plant Cell Tissue Organ Culture, 1990. v.23. p. 171 173.

21. Dovzhenko A. Koop HU. Sugarbeet (Beta vulgaris L.): shoot regeneration from callus and callus protoplasts//Planta, 2003. V.217. P. 374-381.

22. Kut S.A., Evans D.A., Plant regeneration from cultured leaf explants of eight wild tomato species and two related Slanum species // In vitro. 1982. V.l 8. P. 583 589.

23. Witrzens В., Scowcord W., Downes R., Larkin P.J., Tissue culture and regeneration from sunflower (H. annuus L.) and interspecific hybrids (H. tuberosus x H. annuus) // Plant Cell Tissue Organ Culture. 1988. V. 13. P. 61 76.

24. Gurel E., Kazan K. Development of an efficient plant regeneration system in sunflower (H. annuus L.) // Tr. J. Botany. 1998. V. 22. P. 381-387.

25. Paterson K.E., Douglas, The role of ethylene in the regeneration of H. annuus (sunflower) plants from callus // Physiol. Plant. 1987. V. 71 P. 151 156.

26. Paterson K.E., Shoot tip culture og Helianthus annuus flowering and development of adventitious and multiple shoots // Am. J. Bot. 1984. V. 71. P. 925 931.

27. Tetu T, Sangwan RS and Sangwan-Norreel BS Hormonal control of organogenesis and somatic embryogenesis in Beta vulgaris callus//J Exp Bot Vol 1987. V. 38 (188). P. 506-517.

28. Алексеева JI. И. Оптимизация условий для морфогенеза картофеля в стерильной культуре В кн. Биология культивируемых клеток и биотехнология//Тез докл. Международной конференции, Новосибирск, 1988. с. 158- 159.

29. Никитина Н.И., Федоренко Т. С. Бороков А.Ю. Кульура неоплодотворенных семяпочек подсолнечника // НТБ ВНИИМК. № 3 (106), 1989. С. 14 16.

30. Антонова Т. С., Боровков А. Ю., Зезуль Т.Г., Краснянский С. Прямой соматический эмбриогенез из семядолей зрелых и незрелых зародышей подсолнечника// НТБ ВНИИМК, вып. 4 (103), 1988. С. 16 -21.

31. Evans D.A.Sharp W.R., Flick С.Е. Growth and behavior of cell cultures. Embryogenesis and organogenesis // In: Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture, Ed. Thorpe Т., Academic Press, New York. 1981. P.45 -113.

32. Williams E. G., Maheswarwn G. Somatic embryogenesis: Factors influencing coordinated behavior of cells as an embryogenic group // Ann. Bot. 1986. V. 57. P. 443-462.

33. Wernicke, W., Brettell, R., Somatic embryogenesis from Sorghum bicolor leaves//Nature. 1980. V. 287. P. 138-139.

34. Gamburg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and defection of glucanases in cultures of wheat and barley // Canad. J. Biochem. 1968. v. 46. N 5. p. 417-421.

35. Nitsch J.P., Nitsch C. Science. 1969. V. 163. P. 85-87.

36. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P.473-497.

37. Gamborg O. The effects of amino acid and ammonium on the growth of plant cells in suspension cultures // Plant Physiol. 1970. V. 45. P. 372-375

38. Медведев С.С. Физиология растений: Учебник. СПб.: Изд-во С.-Петерб. Унта. 2004.-336 с.

39. Холодова В.П. Рост и метаболизм углеводов в культуре ткани растений. В кн: Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.

40. Физиология растений: Учебник для студ. вузов / Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. и др.; Под ред. Ермакова И.П. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 640 с.

41. Чайлахян М.Х. Гормональная регуляция роста и развития высших растений // Успехи современной биологии. 1982. Т. 95. Вып. 1.

42. Полевой В.В. Фитогормоны. JI.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1982. с 248.

43. Кулаева О.Н., Прокопцева О.С. Новейшие достижения в изучении механизма действия фитогормонов//Биохимия. 2004. №69. С. 293-310.

44. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985. с.304.

45. Skoog F., Miller С.О. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro // Symp. Soc. Exp. Biol. 1957. V. II, P.l 18-131.

46. Arnold S Von, Hakman I Regulation of somatic embryo development in Picea abies by abscisic acid (ABA) // J Plant Physiol. 1988. V. 132. P. 164-169

47. Langhansova L., Konradova H., Vanek T. Polyethylene glycol and abscisic acid improve maturation and regeneration of Panax ginseng somatic embryos // Plant Cell Rep. 2004. V. 22. P. 725-730.

48. Linossier L, Veisseire P, Cailloux F, Coudret A Effects of abscisic acid and high concentrations of PEG on Hevea brasiliensis somatic embryos development // Plant Sci. 1997. V. 124. P. 183-191

49. Moghaddam B.E., Masbah M., Yavari N. The effect of in planta TIBA and proline treatment on somatic embryogenesis of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Euphytica. 2000. V. 112. P. 151-156.

50. Катаева H.B., Аветисов B.A. Клональное размножение растений в культуре ткани. В кн: Культура клеток растений. М.: Наука, 1981.-168 с.

51. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве//Пер. с болг. Е.В. Дененко. Отв. Ред. Шумный В.К., Новосибирск, 1993. -241 с.

52. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений // IV всесоюзная конференция «Культура клеток растений и биотехнология». Кишинев, 1983.

53. Kamm, L. Liao, S. Kim, C. Hendrick, Z.-Y. Zhao, M. Dolan, F. Chumley, S. V. Tingey, J.-F. Tomb, M. P. Gordon, M. V. Olson, and E. W. Nester. The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58//Science. 2001. V. 294. P.2317-2323.

54. Potrikus I. Gene transfer to plants: assesment of published approaches and results // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. V. 42. P. 205-225.

55. Lindsey K. Plant transformation systems // Transgenic plants: a production system for industrial and pharmaceutical proteins. Edited by M.R.L. Owen and J. Pen. 1996.

56. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир. 2002. - 589 с.

57. Gelvin S.B. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. 51:223-56

58. Gelvin S.B. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool //Microbiology and molecular biology reviews. Mar. 2003. P. 16-37

59. Tzfira Т. T. and Citovsky V. Agrobacterium-mediated -genetic transformation of plants: biology and biotechnology // Current Opinion in Biotechnologyology. 2006. 17:147-154

60. McCullen C.A., Binns A.N. Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2006. 22:101-27

61. Чумаков М.И. Механизм агробактериальной трансформации растений. Саратов. Издательство «Слово». 2001. 256 с.

62. Citovsky, V., Zupan J., Warnick D., and Zambryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells // Science. 1992. V. 256. P. 1802-1805.

63. Dumas, F., M. Duckely, P. Pelczar, P. Van Gelder, and B. Hohn. An Agrobacterium VirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 485-490.

64. Escudero J., Hohn B, Transfer and integration of T-DNA without cell injury in the host plant //The Plant Cell. 1997. V. 9. P. 2135-2142

65. Chumakov M.I., Kurbanova I.V. Localization of protein VirBl involved in contact formation during conjugation among Agrobacterium cells // FEMS Microbiol. Letters. 1998. V. 168. P.297-301.

66. Graves A.C.F., Goldman S.L. The transformation of Zea mays seedlings with Agrobacterium tumefaciens П Plant Molec. Biol. 1986. V. 7. P. 43-50.

67. Feldman K.A., Marks M.D. Agrobacterium-mediaXed transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

68. Пухальский B.A., Смирнов С.П., Корыстылева T.B., Билинская Е.Н., Елисеева А.А. Генетическая трансформация пшеницы (Triticum aestivum L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens II Генетика. 1996. Т. 32. № 11. С. 1596-1600.

69. Гапоненко А.К. Способ получения трансгенных растений подсолнечника. Патент РФ № 2179187.2002.

70. Bidney D., Scelonge С., Martich J., Burrus M., Sims L., Huffman G. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens // Plant Molecular Biology. 1992. V. 18. P. 301-313.

71. Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. C.R. // Acad. Sci. Paris Life Sci. 1993. V. 316. P. 1194-1199.

72. Майсурян A.H., Овчинникова B.H., Долгих Ю.И., Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Мартиросян Ю.Ц., Харченко П.Н. Агробактериальная трансформация ячменя // Биотехнология. 2006. №3. С. 56-61.

73. Hellens R., Mullineaux P., Klee H. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors October // Trends in Plant Science 2000. V. 5. №. 10.

74. Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D. fi-glucuronidase from Escherichia coli as a genefiision marker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. V. 83. P. 8447-8451.

75. Shimoura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and proporties of Aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromeduson, Aequorea // J. Cell Сотр. Physiol. 1962. V. 59. P. 223-239.

76. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein // Gene. 1992. V. 111. P. 229-233.

77. Chalfie M., Tu Y„ Euskirchen G., Ward W.W., Prasher D.C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression // Science 1994. V. 263. P. 802-805.

78. Inouye S., Tsuji, F.I. Aequorea green fluorescent protein. Expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant protein//FEB S Lett. 1994. V. 341. P. 277-280.

79. Brasileiro A.C.M., Aragro F.J.L Marker Genes for In Vitro Selection of Transgenic Plants // J. Plant Biotechnology. 2001. V. 3 (3). P. 113-121.

80. Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Petersen S.G, Brunstedt J., Okkels F.T Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet // Mol Breed. 1998. V.4.P. 111-117.

81. Haldrup A., Petersen S.G., Okkels F.T. The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent // Plant Mol Biol 1998. V. 37. P. 287-296.

82. Bevan M.W., Flavell R.B., Chilton M.D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation //Nature. 1983. V. 304. P. 184-187.

83. Herrera-Estrella L., De Block M., Messens E., Hernalsteens J.P., Van Montagu M, Schell J Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells // EMBO. 1993 V. 2. P. 987-995.

84. Van Den Elzen P.J.M, Townsend J., Lee K.Y., Bedbrook J.R. A chimaeric hygromycin resistance gene as a selectable marker in plant cells // Plant Mol Biol. 1985. V. 5. P. 299-302.

85. Vasil I.K. Molecular improvement of cereals//Plant Mol. Biol. 1994. V. 25. P. 925-937.

86. Haughn G.W., Smith J., Mazur В., Somerville C. Transformation with a mutant Arabidopsis acetolactate syntase gene renders tobacco resistant to sulfonylurea herbicides//Mol Gen Genet 1988. V. 211. P. 266-271.

87. Mourad G., Williams D., King J. A double mutant allele, crsl-4. of Arabidopsis thaliana encodes an acetolactase synthase with altered kinetics//Planta. 1995. V. 196. P. 64-68.

88. Comai L., Facciotti D., Hiatt W.R., Thompson G., Rose R.E., Stalker D.M. Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate //Nature. 1985. V. 317. P. 741-744.

89. Comai L., Sen L.C., Stalker D.M. An altered arok gene product confers resistance to the herbicide glyphosate // Science. 1983. V. 221 P. 370-371.

90. Mazur B.J., Falco S.C. The development of herbicide resistant crops // Annu. Rev. Plant Physiol. 1989. V. 40. P. 441-470.

91. Murakami Т., Anzai H., Imai S., Satoh A., Nagaoka K., Thompson C.J. The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus: molecular cloning and characterization of the gene cluster // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 42-50.

92. Lindsey K. Genetic manipulation of crop plants. J. Biotech. 1992. V. 26. P. 1-28.

93. Bellinder, R.R., R.E. Lyons, S.E. Scheckler, and H.P. Wilson. Cellular alterations resulting from foliar applications of HOE-39866. // Weed Sci., 1987. V.35. P.27-35.

94. Ridley, S.M. McNally S.F.// Effects of phosphinothricin on the isozymes of glutamine synthetase isolated from plant species which exhibit varying degrees of susceptibility to the herbicide. // Plant Sci., 1985. V.39. P.31-36.

95. Wanamarta G., Penner D. Foliar absorption of herbicides // Rev. Weed Sci. 1989. V.4. P. 215-231.

96. Дрейпер Дж., Скотт P., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений Лабораторное руководство // М.: «Мир». 1991 408 е., ил.

97. Butenko R.G., Atanassov A.I., Urmantseva V.V. Some feature of sugarbeet tissue cultures // Phytomorphology. 1972. V. 22. P. 140-143.

98. Welander T. Callus and root formation in explants of Beta vulgaris L. // Physiol Plant. 1974. V. 32. P. 305-307.

99. Hooker M.P., Nabors M.W. Callus initiation, growth, and organogenesis in sugarbeet (Beta vulgaris L.) // Z Pflanzenphysiol. 1977. V. 84. P. 237-246.

100. Bhat S.R., Ford-Lloyd B.V. and Callow J.A. Isolation and culture of mesophyll protoplasts of garden, fodder and sugarbeets using a nurse culture system: callus formation and organogenesis // J Plant Physiol. 1986. V. 124. P. 419-423.

101. Колодяжная Я.С., Дейнеко E.B. Получение регенерантов сахарной свеклы// Онтогенез. 2002. Том. 33. № 3. С. 170-175.

102. Банникова М.А., Головко А.Э., Хведынич О.А., Кучук Н.В. Регенерация растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro. Гистологическое изучение процессов регенерации//Цитология и генетика. 1995. Т. 29. №6. С. 14-21.

103. Фирсов А.П., Пиголева С.В., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Регенерация побегов сахарной свеклы из листовых эксплантов // Биотехнология. 2004. № 1. С. 56-61.

104. Богомолова Н.М. Разработка метода получения трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Рамонь 2002.

105. Kulshreshtha S., Coutts R.H.A., Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from mature sugarbeet (Beta vulgaris L.) zygotic cotyledons // Plant Growth Regulation. 1997. V. 22. P. 87-92.

106. Lindsey K. and Gallois P. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterim tumefaciens IIJ Exp Bot. 1990. V. 41. P. 529-536.

107. Grieve T.M., Gartland K.M.A., Elliott M.C. Micropropagation of commercially important sugar beet cultivars // Plant Growth Regulation. 1997. V. 21. P. 15-18

108. Ivic, S., Saunders J.W. and Smigocki A. Leaf disc callus from sugarbeet breeding lines for biolistic transformation // Am. Soc. of Sugar Beet Technologist Proceedings. 2001. V. 31.P. 214-217.

109. Ivic-Haymes S.D., Smigocki A.C. Biolistic transformation of highly regenerative sugar beet (Beta vulgaris L.) leaves // Plant Cell Rep. 2005. V. 23. P. 699-704.

110. Jacq B, Tetu Т., Lesorbe O., Sangwan R.S., Sangwan-Norreel B.S. Factors influencing T-DNA transfer in Agrobacterium-mQdiated transformation of sugarbeet//Plant Cell Rep. 1993. V. 12. P. 621-624.

111. Snyder G.W., Ingersoll J.C., Smigocki A.C., Owens L.D. Introduction of pathogen defense genes and a cytokinin biosynthesis gene into sugarbeet (Beta vulgaris L.)by Agrobacterium or particle bombardment // Plant Cell Rep. 1999. V. 18. P. 829— 834.

112. Kifle S., Shao M., Jung C.,Cai D. An improved transformation protocol for studying gene expression in hairy roots of sugar beet (Beta vulgaris L.) // Plant Cell Reports. 1999. V. 18. P. 514-519.

113. Joersbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Petersen S.G, Brunstedt J., Okkels F.T Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet // Mol Breed. 1998. V. 4. P. 111-117.

114. Ingersoll JC, Huette TM and Owens LD Effect of promoter-leader sequences on transient expression of reporter gene chimeras biolistically transferred into sugarbeet (Beta vulgaris) suspension cells //Plant Cell Rep. 1996. V. 15. P. 836— 840.

115. Krens FA, Trifonova A, Keizer LCP and Hall RD The effect of exogenously-applied phytohormones on gene transfer efficiency in sugarbeet (Beta vulgaris L.) //Plant Sci. 1996. V. 116. P. 97-106.

116. Joersbo M., Mikkelsen J.D., Brunstedt J. Relationship between promoter strength and transformation frequencies using mannose selection for the production of transgenic sugar beet // Molecular Breeding. 2000. V. 6. P. 207-213.

117. Freytag A.H., Anan S.C., Rao-Ardelli A.P., Owens L.D. An improved medium for adventious shoot formation and callus induction in Beta vulgaris L. in vitro II Plant Cell Rep. 1988. V. 7. P. 30-34

118. Jacq B, Tetu Т., Sangwan R.S., Laat A.D. Sangwan-Norreel B.S. Plant regeneration from sugarbeet (Beta vulgaris L.) hypocotyls cultured in vitro and flow cytometric nuclear DNA analysis of regenerants // Plant Cell Rep. 1992. 11: 329-333.

119. Rady M.R., Ali Z.A. Comparison of physiology and anatomy of seedlings and regenerants of sugar beet//Biologia Plantarium. 1999. V. 42 (1). P.39-48.

120. Zhang C.L., Chen D.F., Elliott M.C., Slater A. Thidiazuron induced organogenesis and somatic embryogenesis in sugar beet (Beta vulgaris L.) // In Vitro Cell Div Biol Plant. 2001. V. 37. P. 302-310.

121. Hood E.E., Gelvin S.B., Melchers L.S., Hoekema A. New Agrobacterium helper strains for gene transfer to plants // Transgenic Res. 1993. V. 2. P. 208-218.

122. Becker D. Binary vectors which allow the exchange of plant selectable markers and reporter genes //Nucleic Acids. Res. 1990. V. 18. P. 203.

123. Падегимас JI.C., Шульга О.А., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений Nicotiana tabacum и Solanum tuberosum, устойчивых к гербициду фосфинотрицину // Мол. Биол. 1993. Т. 27. №4. С.947-951

124. Грибова Т.Н., Камионская A.M., Монахос Г.Ф., Скрябин К.Г. Создание трансгенных растений капусты белокочанной Brassica oleracea var. capitata с новыми агротехническими свойствами // Биотехнология. 2005. Т. 6. С.12-19.

125. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва «Мир». 1984 480стр.

126. Сайт Strategic Diagnostics Inc: www.sdix.com

127. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 1977. V. 84. P. 63-67.

128. Dellaorta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: version II // Plant Mol. Biol. Rep. 1987. V. 1. P. 19-21.

129. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 3-17.

130. Vitha S. Histochemical localization of b-glucuronidase (GUS) reporter activity in plant tissues. Microscopy and Imaging Center, Texas A & M University http://www.tamu.edu/mic

131. Tetu T, Sangwan RS and Sangwan-Norreel BS Hormonal control of organogenesis and somatic embryogenesis in Beta vulgaris callus // J Exp Bot Vol. 1987. V. 38 № 188. P. 506-517.