Препаративное выделение специфических антигенов полного клеточного лизата Mycobacterium bovis и изучение их серологической активности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Москвичева Альбина Валерьевна

• Москвичева Альбина Валерьевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Москвичева Альбина Валерьевна

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Актуальная эпизоотическая ситуация по туберкулезу 11 крупного рогатого скота в мире

1.2 Интегрированный подход: «Единое здоровье» в контроле за 14 туберкулезом крупного рогатого скота

1.3 Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

1.3.1 Прямые методы диагностики

1.3.2 Непрямые методы диагностики

1.3.3 Серодиагностика

1.4 Серологически активные биомаркеры M. bovis

1.5 Заключение по обзору литературы

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Выделение и анализ основных секретируемых белков M. bovis 34 в культуральной жидкости

3.1.1 Препаративный электрофорез антигенов из ФКС и 36 концентрата ФКС

3.1.2 Выявление серопозитивных антигенов M. bovis 42 в культуральной среде Сотона

3.2 Выделение и характеристика основных белков клеточной 45 стенки M. bovis

3.2.1 Получение концентрата очищенных клеток M. bovis

3.2.2 Изучение электрофоретического профиля антигенов до и после 46 механического разрушения клеток M. bovis

3.2.3 Анализ экстрактов дебриса клеточной стенки M. bovis методом

гель- фильтрации

3.2.4 Выделение специфических антигенов из лизата клеток

M. bovis

3.3 Изучение спектра белков различных видов микобактерий

3.4 Оптимизация способа выделения антигена М. bovis с 71 молекулярной массой 28 кДа

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

ПРЕСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДЕНИЦ И ТЕРМИНОВ

АГ антиген

АТ антитело

БКБ бикарбонат-карбонатный буфер

БСА Бычий сывороточный альбумин

БЦЖ вакцина против туберкулёза

BCG бацилла Calmette-Guerin

ГЗТ гиперчувствительность замедленного типа

ГКГС главного комплекса гистосовместимости

ГОСТ Государственный стандарт

ДК дендритные клетки

ДСН додецилсульфат натрия

ДМСО диметилсульфоксид (CHs)2SO

ИЛ интерлейкин

ИФА иммуноферментный анализы

ИХА Иммунохроматографический анализ

КОИ Клеточно-опосредованный иммунитет

кДа молекулярная масса в килодальтонах

Мф макрофаг

НЦМ нитроцеллюлозная мембрана

ОП оптическая плотность

ПААГ полиакриламидный гель

ППД очищенный туберкулин (purified protein derivative)

ТЕМЕД ДД^'^'-тетраметилэтилендиамин

ТМБ раствортетраметилбензидина

ФКС фильтраты культуральной среды

ESAT-6 ранней секреторных целевой антигенной

NK натуральные киллеры

ГЧЗТ чувствительности замедленного типа

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

M. bovis Mycobacterium bovis

PBS Фосфатно-солевой раствор (Phosphate-buffered saline)

ТБЕ трисборатный буфер с бромистым этидием

м.м молекулярная масса

IFN-Y гамма - интерферон

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ФАО (Food and Agriculture Organization, (FAO))

Продовольственная и сельскохозяйственная организация

МЭБ Всемирная организация здравоохранения животных

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Препаративное выделение специфических антигенов полного клеточного лизата Mycobacterium bovis и изучение их серологической активности»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Туберкулез крупного рогатого скота продолжает оставаться острой проблемой в ветеринарии и медицине, причиняя огромный ущерб народному хозяйству и представляя серьезную опасность населению (Протодьяконова Г.П., 2019). По данным ВОЗ 3,1% случаев туберкулеза у людей во всем мире вызваны М. bovis (Мясоедов Ю.М. и др., 2020; WHO, 2022).

Огромные экономические потери для индустрии животноводства связаны с затратами на диагностику, убой животных, обезвреживание молока, санацию помещений и территории, а также с ограничениями продажи и экспорта животных (Найманов А.Х. и др., 2018; Донченко А.С. и др., 2019; Муковнин А.А. и др., 2020).

Основой борьбы с туберкулезом является диагностика методом аллергической внутрикожной пробы, однако, массовое выявление неспецифических реакций на туберкулин у животных, сенсибилизированных атипичными и сапрофитными микроорганизмами, делают результаты этой пробы ориентировочными. Серодиагностика представляет собой привлекательную альтернативу утвержденным диагностическим тестам, не требует многократных вмешательств, значительно менее субъективна для интерпретации и не влияет на иммунный статус исследуемых животных. Важно отметить, что серологические анализы позволяют обнаружить скот, инфицированный M. bovis, который является анергичным для тестов аллергической пробы (Баратов М.О., 2021).

В связи с этим, получение микобактериальных иммунодоминантных антигенов, изучение иммунологических характеристик и возможности их использования для серодиагностики туберкулеза крупного рогатого скота являются актуальной задачей и могут послужить основой для разработки новых экспресс-методов и диагностикумов для дифференциации

неспецифических аллергических реакций и быстрой постановки точного диагноза.

Степень разработанности проблемы. Стандартные тесты на туберкулез (туберкулиновый тест и анализ интерферона-гамма (IFN-y)), основаны на клеточно-опосредованных иммунных реакциях. В ранних стадиях туберкулеза крупного рогатого скота преобладает клеточный иммунитет, в то же время некоторые зараженные животные могут иметь антительный ответ без клеточно-опосредованной иммунной реакции, особенно при высокой бактериальной нагрузке [Третьякова А.Б., 2022; Москвичева А.В. и др., 2023]. Поэтому ученые активно работают над созданием серологических анализов в качестве диагностических тестов для обнаружения инфицированных животных, которые могли бы быть пропущены стандартными тестами [Спиридонов Г.Н. и др., 2020; Якупов Т.Р. и др., 2021; Латышева Л. А., Кошкин И.Н., 2022].

Однако, эти исследования ограничены выбором небольшого количества белков с серологической активностью, что объясняется вариабельностью иммунного ответа к структурным компонентам микобактерий на разных стадиях развития инфекции и недостаточным пониманием структуры полноценных антигенных комплексов. В связи с этим, изучение антигенного профиля M. bovis и разработка оптимальных методов их получения является актуальным.

Цели и задачи исследований. Цель исследований: исследование диагностического потенциала антигенов Mycobacterium bovis и разработка методических подходов их выделения и очистки.

В соответствии с установленной целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать серологическую активность секретируемых антигенов M. bovis;

2. Выделить и охарактеризовать серологическую активность антигенов, экстрагированных из клеток M. bovis;

3. Провести сравнительный электрофоретический анализ белков полных клеточных лизатов различных видов микобактерий;

4. Усовершенствовать методические подходы для выделения и очистки иммунодоминатных белков M. bovis.

Научная новизна. Впервые на основе комплексного исследования получен пул антигенов клеточной стенки и секреторных компонентов M. bovis Bovinus-8 штамма 700201, изучен их полипептидный профиль. При изучении антигенного спектра М. bovis выявлен целый ряд иммунодоминантных антигенов: белков клеточной стенки микобактерий с молекулярной массой 14,5 кДа, 15,2 кДа, 16,5 кДа, 23 кДа, 28 кДа, 33-39 кДа и экспрессируемых белков с молекулярной массой 23,5 кДа, 25 кДа, 29кДа, 30 кДа, 31 кДа и 32 кДа.

Впервые методом сравнительного электрофоретического анализа обнаружены значительные различия в суммарных белковых спектрах M. bovis, M. vallee, M. intracellularea, M. avium, M. tuberculosis, М. BCG; выявлен серологически активный биомаркер M. bovis, характеризующийся преобладанием полипептидной фракции с молекулярной массой 28 кДа, показана возможность его выделения в виде дискретной фракции.

Научная новизна подтверждена патентом на изобретение RU 2691586 C1 «Способ получения антигена из «Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201» молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа», 14.06.2019. Заявка № 2018127036 от 23.07.2018.

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость заключается в изучении иммунологических характеристик микобактериальных иммунодоминантных антигенов, определении возможности их использования для диагностики туберкулеза животных, что может послужить основой для разработки новых экспресс-методов для быстрой постановки точного диагноза и диагностикумов для дифференциации неспецифических аллергических реакций.

Практическая значимость полученных результатов заключается в разработке эффективных методик извлечения и очистки полноценных антигенных комплексов из взвесей бактериальных культур, а также в изучении спектра секретируемых антигенов M. bovis. Специфичность и диагностическая значимость отобранных биомаркеров M. bovis подтверждена с использованием контрольных и иммунных сывороток крови крупного рогатого скота. На основании проведённых исследований разработан «Технологический регламент получения антигена из клеточной стенки Micobacterium bovis Bovinus-8» (утвержден заместителем директора по НИР ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 07.07.2016).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Фракционированием фильтрата культуральной среды M. bovis через колонки с 12% ПААГ и вестерн-блот-анализом выявлены серопозитивные белки молекулярной массы 23,5 кДа, 25 кДа, 29кДа, 30 кДа, 31 кДа и 32 кДа.

2. Осаждение ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы клеток M. bovis, разрушение их на гомогенизаторе Fast Prep 24™ и последующая гель-фильтрация позволяют выявить серологические активные фракции белков молекулярной массы 14,5 кДа, 15,2 кДа, 16,5 кДа, 23 кДа, 28 кДа, 33-39 кДа.

3. Сравнительным электрофоретическим анализом белков полных клеточных лизатов различных видов микобактерий выявлены различия и уникальный антиген у M. bovis для дифференциальной диагностики.

4. Модифицированная методика позволяет выделять и получать антиген с молекулярной массой 28 кДа в препаративных количествах с высокой специфичностью и активностью, что даёт возможность использовать его в качестве маркерного антигена M. bovis при создании диагностических тест-систем ИФА для выявления специфических антител.

Методология и методы исследования. В работе применяли микробиологические, серологические, иммунологические и культуральные методы исследования, использовали методы аналитического диск-

электрофореза, вестерн-блоттинга, методы хроматографической очистки и гель-фильтрации, иммуноферментный анализ и другие.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных данных подтверждается значительным объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и проанализированных с использованием современных высокоточных приборов. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены в период с 2014 по 2023 годы на итоговых отчетных заседаниях кафедры эпизоотологии и паразитологии ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ, на международных научно-практических конференциях: IX Международной конференции «Новые концепции воспаления, аутоиммунного ответа и инфекций» (Казань, 26 - 27.10.2023 г.), «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 21 - 22.02.2014 г.) и «Биотехнология: реальность и перспективы» (Саратов, 01 - 31.12.2014 г.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 научные статьи в журналах, регламентированных перечнем ВАК при Министерстве науки и высшего образования РФ, одна статья в журнале из перечня индексируемых в базе данных Scopus, один патент Российской Федерации на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, практических предложений, списка сокращений, использованной литературы и приложений. Работа иллюстрирована 1 таблицей, 25 рисунками. Библиографический указатель включает 146 источников, из них 118 иностранных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Актуальная эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного

рогатого скота в мире

Туберкулез крупного рогатого - хроническое прогрессирующее инфекционное заболевание, вызываемое Mycobacterium bovis, являющееся эндемичным во многих частях мира (Васильева И.А. и др., 2017; Хисамутдинов А.Г. и др., 2018; Luciano S.A. et al., 2020; Kock R. et al., 2021).

Род Mycobacterium включает облигатные патогенные и сапрофитные виды микобактерий (Brites D. A et al., 2018). Существует более 140 видов, разделенных на 3 большие группы: M. tuberculosis complex, M. leprae и группа нетуберкулезных микобактерий. Классические представители комплекса M. tuberculosis включают M. canettii, M. africanum подтипы I и II, M. caprae, M. microti, M. Pinnipedii, аттенуированный вакцинный штамм M. Bovis (BCG), патогенный штамм M. bovis возбудитель туберкулеза крупного рогатого скота и зоонозного туберкулеза (Архипова Н.Д. и др., 2019; Duffy, S.C., et al., 2020). За последние десять лет этот список пополнился новыми видами микобактерий: M. orygis, M. mungi, Dassie Bacillus и Chimpanzee Bacillus (Rodrigo Macedo C. et al., 2019; Byrne A.W. et al., 2022; Mitermite M. et al., 2023).

В начале XXI века туберкулез продолжает оставаться важной национальной и международной проблемой (Zimpel C.K. et al., 2020; Чистякова А.А., Сорокина А.А., 2021). Многие зарубежные развитые страны сократили заболеваемость или полностью оздоровили поголовье скота от туберкулеза крупного рогатого скота, внедрив эффективные стратегии борьбы, которые включают тестирование и выбраковку инфицированных животных, активный надзор и ограничения передвижения в неблагополучных районах (Silva M.R. et al., 2018). В странах с низким уровнем дохода и с уровнем дохода ниже среднего контроль туберкулеза крупного рогатого скота

по-прежнему представляет собой серьезную проблему (Ramos J.M. et al., 2018; Camargo A.C. et al., 2021; Kumar R. et al., 2023).

Анализ распространенности туберкулеза крупного рогатого скота, проведенный в рамках программы «Единого здравоохранения» в 2021 г., позволил объективно оценить благополучие стран в Европе. Из 188 стран и регионов во всем мире, предоставивших данные об эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота во Всемирную организацию здравоохранения животных (OIE), 82 страны (44%) сообщили о распространенности инфекции. При этом 97,6% неблагополучных стран информировали о распространенности инфекции среди домашнего скота, и 35,4% стран зарегистрировали наличие M. bovis как у домашнего скота, так и у диких животных (Carrisoza-Urbina J., 2019; McCallan L. et al., 2021; WHO, 2022).

Реализация национальных программ по борьбе с туберкулезом, основанных на аллергической диагностике и убое выявленных инфицированных коров, привела к успешной ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в 17 странах Европы: Австрии, Бельгии, Чехии, Дании, Эстонии, Финляндии, Франции, Германии, Венгрии, Латвии, Литве, Люксембурге, Нидерландах, Польше, Словакии, Словении и Швеции (WHO, 2022).

Наиболее высокую распространенность микобактериальной инфекции, в период с 2005 по 2021 год, наблюдали в Болгарии, Хорватии, Кипре, Греции, Ирландии и Мальте, а также в Румынии. В то время как несколько регионов в Италии, Испании и Португалии получили статус свободных от болезни за данный период, в Греции, Ирландии и Испании не отмечено значительных улучшений (Romha G. et al., 2018; Lekko Y.M. et al., 2020; WHO, 2022). Однако, следует отметить, что статус благополучия в некоторых странах остается не известным вследствие не предоставления данных в ФАО, ВОЗ и МЭБ о распространении болезни, а также из-за отсутствия информации о заболеваемости скота.

Россия исторически считается эндемичной страной по туберкулезу крупного рогатого скота. Первые записи о данной хронической инфекции у скота появились в 1889 году, однако широкомасштабные исследования и оздоровительные мероприятия, направленные на борьбу с туберкулезом крупного рогатого скота, начали проводиться лишь в 1951 году (Муковнин А.А. и др., 2020). Благодаря своевременному обнаружению и уничтожению скота, зараженных туберкулезом, изолированному содержанию здорового молодняка, обеззараживанию молока и молочных продуктов, а также планомерному проведению широкого спектра ветеринарно-санитарных мероприятий при непрерывном надзоре государственной ветеринарной службы удалось существенно снизить уровень заболеваемости крупного рогатого скота туберкулезом. Если в 1951 году было зарегистрировано 9833 неблагополучных пункта, то в 2010 году их количество сократилось до 25, в 2020 году - до 3 неблагополучных пунктов (Муковнин А.А. и др., 2020).

Относительно стабильная эпизоотическая ситуация сохранилась и в 2021 году, зарегистрированы два неблагополучных пункта в Московской области и Республике Удмуртия, а также один, переходящий в Омской области. В 2022 году неблагополучных пунктов не обнаружено. Однако в 2023 году вновь выявлены три очага туберкулеза крупного рогатого скота: один в Республике Татарстан и два в Республике Мордовия (Mingaleev D.N. et al., 2020).

Таким образом, в настоящее время эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота характеризуется как стабильная, многолетние тренды убывающие, эпидемические пороги по неблагополучию и заболеваемости не преодолены.

1.2 Интегрированный подход: «Единое здоровье» в контроле за туберкулезом крупного рогатого скота

В течение последнего десятилетия зоонозный туберкулез снова привлекает внимание международных организаций, таких как Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Продовольственная и сельскохозяйственная организация (ФАО) и Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ). ВОЗ, ФАО, МЭБ включили этот зооноз в список вновь появившихся забытых инфекционных заболеваний. (Olea-Popelka F. et al., 2017; Macedo C. et al., 2019). Предложенная ВОЗ, ФАО и МЭБ стратегия надзора и борьбы фокусируется на охране здоровья человека и животных, а также на защите окружающей среды (Thirunavukkarasu S. et al., 2017; Vander Waal K. et al., 2017; Good M. et al., 2018). Согласно стратегии «Положить конец туберкулезу» принятой государствами-членами ВОЗ на период с 2016 по 2035 г.г., все ответственные ведомства должны сотрудничать для разработки политики и законодательства, планирования и реализации стратегий борьбы, расследования вспышек и их ликвидации (Kelly T.R. et al., 2017; de Macedo Couto R., et al., 2022).

Стратегии контроля, направленные на предотвращение рисков для здоровья животных. Туберкулез крупного рогатого скота - болезнь, имеющая глобальное распространение. С момента внедрения программ ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота распространенность этого заболевания значительно снизилась в странах с высоким уровнем доходов. Однако даже при наличии установленной программы искоренения болезни, даже в странах с высоким уровнем дохода, продолжают выявлять стада, инфицированные разными путями. Безконтрольная транспортировка крупного рогатого скота, недостаток систем отслеживания животных, а также отсутствие или ограниченная доступность ветеринарных служб - это лишь некоторые из факторов, способствующих ухудшению контроля за туберкулезом у животных

(Mehta P.K. et al., 2017; Dean A.S. et al., 2018; Duffy S.C. et al., 2020). Тип системы содержания скота также влияет на риск распространения туберкулеза. Распространенность туберкулеза крупного рогатого скота выше в молочных стадах, выращиваемых в загонах, чем среди мясного скота, выращиваемого на пастбищах.

Во всем мире дикая природа была определена как источник риска заражения крупного рогатого скота, причем видовой состав диких животных варьирует в зависимости от природно-географических условиий. Например, в Африке это буйволы, в Новой Зеландии - опоссумы, в Северной Америке -цервиды, в Европе - цервиды, дикие кабаны и барсуки (Meunier, N.V. et al., 2017; Martínez-Guijosa J. et al., 2020).

Программы борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота обычно ориентированы исключительно на домашних животных, что может снизить эффективность программы из-за возможности повторного появления болезни в результате контакта с дикими животными, зараженными M. bovis. Следовательно, необходимо разрабатывать меры контроля за инфекцией M. bovis у диких животных, так как они могут служить важными резервуарами этой болезни (Michele L. et al., 2018, Ncube P. et al., 2022).

Важно отметить, что содержание диких или экзотических видов в неволе, особенно в зоопарках и заповедниках, способствует распространению M. bovis и возможной передаче этой инфекции человеку (Баратов М.О., 2021, Найманов А.Х. и др., 2018). Исследования, проведенные в дикой природе, выявили зараженность M. bovis как минимум 16 различных видов диких животных (Pereira A.C. et al., 2020; Browning H. Veit W., 2021). Кроме того, существует опасность передачи болезни человеку от диких животных, которых используют для охоты в спортивных целях. Сравнительные исследования показали, что уровень заболеваемости у диких животных в 5 раз выше, чем у крупного рогатого скота из того же региона. Некоторые исследователи поддерживают идею разработки вакцин для диких животных в

качестве метода контроля за определенной популяцией (Macedo Couto R. et al., 2019, OIE, 2020, Milian-Suazo F. et al., 2022).

Стратегии контроля, направленные на предотвращение рисков неблагоприятного воздействия M. bovis на окружающую среду.

Микобактерии демонстрируют способность к адаптивным изменениям, таким как поли- и плеоморфизм, а также L-трансформации, особенно в условиях, неблагоприятных для них. Эти изменения проявляются в регуляции синтеза клеточной стенки, продукции межклеточного матрикса и образовании массивного липидного слоя. Микобактерии также обладают высокой стойкостью к воздействию различных факторов окружающей среды, как абиотических, так и биотических (Фазылов, В.Х. и др., 2021; Gibson A.J. et al., 2022).

Микобактерии выявляются в различных средах, таких как почва, водные ресурсы (морские и пресные реки), растения (включая овощи и сфагновые растения), домашняя и больничная пыль, а также в местах проживания и обитания человека и животных (Максимович В., 2021 ; Buddle B.M. et al., 2018). Как и другие микобактерии, M. bovis устойчив к условиям окружающей среды и может сохраняться до 88 дней в почве и до 58 дней в воде.

Механизмы адаптации, присущие патогенным микобактериям, обеспечивают им длительное выживание и распространение в окружающей среде, что придает им особое санитарное и экологическое значение и затрудняет программу контроля туберкулеза крупного рогатого скота (Ваганова Л.С., Верещак Н.А., 2017; Zhai W et al., 2019). Установлено, что особенности ландшафта, методы ведения сельского хозяйства, погодные условия и другие факторы окружающей среды влияют на устойчивость M. bovis в окружающей среде. Изучение и оптимизация этих факторов, запрет загрязнения окружающей среды отходами животноводства может помочь снизить нагрузку M. bovis на объектах внешней среды и, как следствие, снизить возможность контакта с этими патогенными бактериями и риска заражения людей (Abalos, P., et al. 2022, McEwen S.A., Collignon P.J., 2018).

Такие исследования могут быть полезны как для более глубокого понимания биологии микобактерий, так и для прогнозирования эпидемической ситуации.

Стратегии контроля, направленные на предотвращение рисков для здоровья людей. Россия является одной из 22 стран с наибольшим бременем туберкулеза, на долю которых приходиться 80 % всех случаев туберкулеза (Vayr F. et al., 2018; Taye H. et al., 2021). Наиболее эффективными мерами контроля, направленными на снижение подверженности населения заражению M. bovis, международной организацией здравоохранения признаны -пастеризация молока, ветеринарно-санитарный контроль на скотобойнях и обезвреживание продуктов животноводства, полученных от больных и подозреваемых в заражении туберкулезом животных (Melini F. et al., 2017; Singh S. et al., 2022). Важными мероприятиями при профилактике и оздоровлении неблагополучных хозяйств является своевременное выявление, выделение из стада и убой больных животных (Муковнин А.А. и др., 2020).

Поскольку до сих пор не известно, как влияет на заболеваемость людей реальное распространение M. bovis, необходимо активно рарабатывать и внедрять комплесные программы по искоренению зоонозного туберкулеза по всему миру, особенно в развивающихся странах (Palmer M. V. et al., 2021, 2022). Хотя в большинстве развитых стран риск для здоровья человека невелик, пандемия ВИЧ вызывает озабоченность по поводу ее воздействия на передачу M. bovis человеку и между людьми (Adesokan H.K. et al., 2019; Lombard J.E. et al., 2021).

1.3 Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

Несмотря на все усилия, предпринимаемые по борьбе с зоонозным туберкулезом, инфекция сохраняется, создавая угрозу для благополучия людей и экономики. При грамотной организации плановая аллергическая диагностика позволяет выявлять зараженный скот с высокой вероятностью.

Однако, чтобы повысить эффективность мероприятий по ликвидации инфекции необходимы дополнительные тесты. Это связано с увеличением вероятности обнаружения ложноположительных результатов у животных при кожных пробах на этапе завершения оздоровительных мероприятий (Singhla T. et al., 2019; Palmer M.V. et al., 2020). Проблемой для аллергической диагностики также является наличие анергичных животных. Сложный антигенный состав M. bovis и наличие анергичных животных, не реагирующих на кожные тесты, подчеркивает, что нет ни одного метода достаточно эффективного для обнаружения всех инфицированных животных на всех стадиях болезни (Цибулькин А.П. и др., 2016; Денгис Н.А., Новиков А.Н., 2020). Таким образом, следует использовать междисциплинарный подход, включающий разнообразные доступные диагностические методы. Современным подходом для диагностики и контроля зоонозного туберкулеза является использование бактериологических, молекулярных, гистопатологических, иммунологических и других анализов с учётом преимущества и недостатков каждого метода исходя из текущей эпизоотической и эпидемической ситуации.

1.3.1 Прямые методы диагностики

Метод бактериоскопии. Использование бактериоскопии для обнаружения возбудителей в биологическом материале представляет собой прямой, быстрый и простой метод диагностики. Однако, визуализация кислотоустойчивых бацилл неспособна обнаруживать их при концентрации ниже 104 клеток на миллилитр, а также не позволяет проводить дифференциацию между другими членами семейства Mycobacteriaceae и кислотоустойчивыми микроорганизмами (Госманов Р.Г., Равилов Р.Х., 2018; Kashi M.H. et al., 2020).

Бактериологический метод. Методы, используемые в ветеринарии для выделения чистой культуры M. bovis отличаются от тех, что используются в

медицинских лабораториях, в основном потому, что штаммы M. bovis плохо или совсем не растут на средах на основе глицерина, традиционно используемые для культивирования M. tuberculosis. Для выделения M. bovis вместо глицерина, используют среды, содержащие пируват натрия. Кроме того, общепринято считать, что эти виды микобактерий растут быстрее в жидкой среде (Yates G.F. et al., 2017).

С целью повышения чувствительности метода постоянно совершенствуются известные и разрабатываются новые питательные среды для выделения M. bovis и определения их биологических свойств (de Azevedo IssaM., et al., 2020, Lee D.F. et al., 2020, Guallar-Garrido S. et al., 2020).

Род Mycobacterium очень требователен к питательным веществам, тогда как другие микроорганизмы будут размножаться быстрее микобактерий. Поэтому отобранные биологические образцы (молоко, мокрота, пораженные ткани) следует предварительно обработать 1 - 5% NaOH, H2SO4 и др. для устранения конкурентных микроорганизмов. На твердой среде с добавлением пирувата в течение 6-8 недель M. bovis формируют гладкие колонии с беловатым оттенком. Однако, процесс обеззараживания может снизить жизнеспособность микобактерий, что в свою очередь снизит вероятность их выделения (Azadi D et al., 2018; Assal N. et al., 2021).

Выделение этиологического агента является окончательным подтверждающим диагнозом заболевания, а также это важно для эпидемиологических исследований и для валидации иммуноанализов. Однако сложность сбора биологических образцов для исследования, длительность культивирования, небходимость биохимической идентификации, ограничивают возможности этого способа (Лысенко А.П., 2016; García J.S.Y. et al., 2020; Maharajh R. A. et al., 2023).

Гистологический метод. Патоморфологические изменения при туберкулезе имеют характерную специфическую картину. На начальных стадиях инфекции очаги поражения не образуют капсул, но окружены альвеолярными макрофагами (Cicchese J.M. et al., 2018; Chen Y. et al., 2022).

По мере прогрессирования болезни в центре образуется бугорок, где постепенно развиваются эпителиоидные и гигантские клетки, окруженные лимфоцитами, плазматическими клетками и моноцитами. Затем вокруг бугорка начинает развиваться фиброплазия, а в его центре образуется казеозный некроз. При наличии таких характерных поражений тканей, гистологический метод представляет собой простой, быстрый и доступный способ анализа, обладающий высокой степенью достоверности результатов (Kiran D. et al., 2016). Диагностическая чувствительность метода повышается, когда исследования сочетаются с выделением культуры (Chung C.L. et al., 2018; Larenas-Muñoz F. et al., 2022).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Москвичева Альбина Валерьевна, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Архипова, Н.Д. Особенности развития возбудителя туберкулеза / Н.Д. Архипова, Е.В. Шатрубова, Ч.Т. Айбыкова // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2019. - № 5. - С. 7580.

2. Баратов, М.О. Проблемы и перспективы серологической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота / М. О. Баратов // Ветеринария сегодня. - 2021. - № 1(36). - С. 33-37.

3. Ваганова, Л.С. Оценка методов исследования крупного рогатого скота на туберкулез / Л.С. Ваганова, Н.А. Верещак // Молодежь и наука. - 2017. -№ 1. - С. 15-17.

4. Васильева, И.А. Глобальные отчеты ВОЗ по туберкулезу, формирование и интерпретация / И.А. Васильева, Е.М. Белиловский, С.Е. Борисов, С. А. Стерликов // Туб. и болезни легких. - 2017. - Т. 95. - № 5. - С. 7-15.

5. Госманов Р.Г. Лабораторная диагностика инфекционных болезней : учебное пособие / Р.Г. Госманов, Р.Х. Равилов, А.К. Галиуллин Ф.М. Нургалиев, Г. Г. Идрисов. — Санкт-Петербург: Лань, 2018. — 196 с.

6. Гребиножко, Э. И. Простой метод обнаружения белков в полиакриламидном геле с помощью импрегнации их серебром / Э.И. Гребиножко, А.И. Николаенко // Укр. биохим. журнал. - 1986. - Т. 58. -№ 5. - С. 62-65.

7. Денгис, Н.А. Комплекс новых методов дифференциальной диагностики туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота / Н.А. Денгис, А.Н. Новиков // Современные научные подходы к решению проблемы бруцеллеза: Сборник материалов конференции, Омск, 11 октября 2020 года / Редакционная коллегия: Л.Н. Гордиенко, В.С. Власенко. - Омск: ИП Машкеевой Е.А., 2020. - С. 118-122.

8. Доклад ВОЗ о глобальной борьбе с туберкулезом, 2022 г. [Электронный ресурс] Режим доступа: https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-

programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2022 (дата обращения: 10.09.2023).

9. Донченко, А.С. Профилактика туберкулеза крупного рогатого скота, завозимого из-за рубежа / А.С. Донченко, Н. А. Донченко, А.С. Жумаш, А.К. Шаймбетова, А.Б. Тургумбеков, А.К. Илимбаева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2019. - Т. 49. - № 6. - С. 53-61

10. Латышева, Л.А. Методы дифференциальной диагностики неспецифических реакций на введение ППД-туберкулинау животных / Л. А. Латышева, И.Н. Кошкин // Научно-инновационное развитие ветеринарной науки и практики: Материалы Национальной (Всероссийской) научно-практической конференции, Омск, 10 ноября 2022 года. - Омск: Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина, 2022. - С. 136-139.

11. Лысенко, А.П. Основы профилактики туберкулёза крупного рогатого скота и оздоровления стад / А.П. Лысенко // Ветеринарное дело. - 2016. -№2 (44). - С. 15-20.

12. Максимович, В. Туберкулез крупного рогатого скота / В. Максимович // Ветеринарное дело (Минск). - 2021. - № 3. - С. 12-22.

13. Москвичева, А.В. Гель-фильтрация продуктов экстракции клеточного дебриса Mycobacterium bovis / А.В. Москвичева, А.Р. Валеева, А.Б. Третьякова, М.О. Коровина, Г.Г. Казарян, К.С. Хаертынов // Ветеринарный врач. - 2022. - № 6. - С. 37-43.

14. Москвичева, А.В. Сравнительный анализ белковых профилей Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis: ключевые аспекты. / А.В. Москвичева, А.Р. Валеева, Г.Г. Казарян, К.С. Хаертынов, Э.А. Шуралев, М.А. Ефимова, Р.Х. Равилов // Ветеринария и кормление. -2023. - №7. - С.51 - 53.

15. Москвичева, А.В. Препаративное выделение специфических антигенов полного клеточного лизата M. bovis / А.В. Москвичева, К.С. Хаертынов,

И.Н. Хаммадов, Э.А. Шуралев, М.А. Ефимова, Р.Х. Равилов // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. - 2021. - №4. - С. 163-167.

16. Муковнин, А.А. Туберкулез крупного рогатого скота в России / А.А. Муковнин, А.Х. Найманов, А.М. Гулюкин // Ветеринария. - 2020. - № 7. - С. 19-23.

17. Мясоедов, Ю.М. Некоторые аспекты иммунопатогенеза туберкулеза / Ю. М. Мясоедов, И.Ю. Ездакова, А.Х. Найманов // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2020. - № 1(45). - С. 12-21.

18. Найманов, А.Х. Контроль благополучия крупного рогатого скота по туберкулезу в современных условиях / А.Х. Найманов, А.А. Муковнин, Н.И. Целуева // Ветеринария. - 2018. - № 7. - С. 3-7.

19. Найманов, А.Х. Симультанная туберкулиновая проба для отбора реагирующих животных и установления диагноза на туберкулез /А.Х. Найманов, Г.И. Устинова, Е.П. Вангели, О.Д. Кучерук, В.М. Калмыков, Н.Г. Толстенко // Ветеринария. - 2020. - № 4. - С. 3-6.

20. Протодьяконова, Г.П. Результаты комплексных научных исследований по туберкулезу / Г.П. Протодьяконова // Ученые записки КГАВМ им Н.Э. Баумана. - 2019. - Т. 237 (I). - С. 151-155.

21. Спиридонов, Г.Н. Метод ИФА для определения специфических антител к Mycobacterium bovis в сыворотке крови крупного рогатого скота / Г.Н. Спиридонов, Х.З. Гаффаров, Р.Я. Гильмутдинов, А.Г. Спиридонов // Ветеринарный врач. - 2020. - №4. - С. 56-62.

22. Третьякова А.Б. Оценка серологической активности структурных компонентов клеточной стенки mycobacterium bovis / А.Б. Третьякова // Вестник медицинского института «Реавиз»: реабилитация, врач и здоровье. - 2022. - №2 (56) Special Issue. - С. 173-175.

23. Фазылов, В.Х. Проблемы лабораторной диагностики и идентификации видов микобактерий / В. Х. Фазылов, И. В. Петров, Л. В. Петрова, Т.Х. Амирова // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. - 2021. -Т. 10, № 3(38). - С. 118-126.

24. Хисамутдинов, А.Г. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Республике Татарстан / А.Г. Хисамутдинов, Д.Н. 126 Мингалеев, Р.Х. Равилов, М.М. Валиев, В.С. Угрюмова, О.В. Угрюмов, А.З. Равилов // «Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана». Научно-практический журнал. - Казань, 2018. - Т.234. - С. 209 - 215.

25. Цибулькин, А.П. Скрининг диагностического потенциала нативных белковых фракций Mycobacterium tuberculosis методом иммуноблоттинга / А. П. Цибулькин, И. М. Хаертынова, Н. Г. Уразов, К.С. Хаертынов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - Т. 61, № 2. - С. 90-102.

26. Чистякова, А. А. Туберкулез крупного рогатого скота: эффективность профилактических мероприятий в условиях животноводческого хозяйства / А. А. Чистякова, А. А. Сорокина // Вестник Совета молодых ученых Рязанского государственного агротехнологического университета имени П.А. Костычева. - 2021. - № 2(13). - С. 20-23.

27. Шуралев, Э.А. Оценка иммунохроматографического теста на основе мультиантигенов Mycobacterium bovis / Э. А. Шуралев // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2017. - Т. 230, № 2. - С. 190-193.

28. Якупов, Т.Р. Иммунологические аспекты лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота / Т. Р. Якупов, Ф. Ф. Зиннатов, Н. Н. Масленников // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2021. - Т. 245, № 1. - С. 224-227.

29. Ábalos, P. Vaccination of Calves with the Mycobacterium bovis BCG Strain Induces Protection against Bovine Tuberculosis in Dairy Herds under a Natural Transmission Setting / P. Ábalos, N. Valdivieso, B. Pérez de Val, M. Vordermeier, M.B. Benavides, R. Alegría-Morán, K. Saadi, M. Wistuba, C. Ortega, N. Sánchez, P. Retamal // Animals (Basel). - 2022. - Vol. 12(9). - P. 1083-1094.

30. Adesokan, H.K. Reverse zoonotic tuberculosis transmission from an emerging Uganda I strain between pastoralists and cattle in South-Eastern Nigeria / H. K. Adesokan, V. O. Akinseye, E. M. Streicher, P.V. Helden, R. M. Warren, S. I. Cadmus // BMC Vet Res. - 2019. - Vol. 15. - P. 437-442.

31. Ashford, R.T. Evaluation of the Dual Path Platform (DPP) VetTB assay for the detection of Mycobacterium bovis infection in badgers / R. T. Ashford, P. Anderson, L. Waring, D. Dave, F. Smith, R.J. Delahay, E. Gormley, M.A. Chambers, J. Sawyer, S. Lesellier // Preventive Veterinary Medicine. - 2020. -Vol. 180. - P. 1-10.

32. Assal N. Proteome characterization of the culture supernatant of Mycobacterium bovis in different growth stages / N. Assal, B. Rennie, L. Walrond, T. Cyr, L. Rohonczy, M. Lin //Biochemistry and Biophysics Reports. - 2021. - V. 28. - 101154. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2021.101154.

33. Azadi, D. Mycobacteriosis and Tuberculosis: Laboratory Diagnosis / D. Azadi, T. Motallebirad, K. Ghaffari, H. Shojaei // Open Microbiol Journal. - 2018. -Vol. 12. - P. 41-58.

34. Back Y.W. Cell wall skeleton of Mycobacterium bovis BCG enhances the vaccine potential of antigen 85B against tuberculosis by inducing Th1 and Th17 responses / Yong Woo Back, Seunga Choi, Han-Gyu Choi, Ki-Won Shin, Yeo-Jin Son, Tae-Hyun Paik, Hwa-Jung Kim// PLOS. - 2019. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213536

35. Bailey, G.S. The production of antisera / Methods in Molecular Biology. -1984. - V. 1. - P. 295-300.

36. Bernitz, N. Parallel measurement of IFN-y and IP-10 in QuantiFERON®-TB Gold (QFT) plasma improves the detection of Mycobacterium bovis infection in African buffaloes (Syncerus caffer) / N. Bernitz, T. J. Kerr, W.J. Goosen Charlene Clarke, R.Higgitt, E.O. Roos, D.V. Cooper, R.M. Warren, P.D. van Helden, S. D.C. Parsons, M.A. Miller // Prev Vet Med. - 2019. - Vol. 169. -P. 1-12.

37. Brites, D.A new phylogenetic framework for the animal-adapted Mycobacterium tuberculosis complex / D. Brites, C. Loiseau, F. Menardo, S. Borrell, M.B. Boniotti, R. Warren, A. Dippenaar, S.D.C. Parsons, C. Beisel, M.A. Behr, J.A. Fyfe, M. Coscolla, S. Gagneux // Front Microbiol. - 2018. Vol. 9. P. 20-28.

38. Browning, H. Freedom and Animal Welfare / H. Browning, W. Veit // Animals (Basel). - 2021. - Vol. 11. - P. 1104-1148.

39. Brunton, L. A. Exploring the fate of cattle herds with inconclusive reactors to the tuberculin skin test / L. A. Brunton, A. Prosser, D. U. Pfeiffer, S.H. Downs // Front Vet Sci. - 2018. - Vol. 5. - P. 228 -238.

40. Buddle, B.M. Efficacy and safety of BCG vaccine for control of tuberculosis in domestic livestock and wildlife / B. M. Buddle, H. M. Vordermeier, M.A. Chambers, LM. de Klerk-Lorist // Front Vet Sci. - 2018. - Vol. 5. - P. 5-17.

41. Byrne, A.W. Bovine tuberculosis in youngstock cattle: A narrative review. / A. W. Byrne, D. Barrett, P. Breslin, J. Fanning, M. Casey, J.M. Madden, S. Lesellier, E. Gormley // Front Vet Sci. - 2022. - Vol. 9 - P. 100 - 124.

42. Camargo, A.C. Microbiological quality and safety of Brazilian artisanal cheeses / A. C. Camargo, J. P. A. de Araújo, A. Fusieger, A.F. de Carvalho, L.A. Nero // Braz J Microbiol. - 2021. - Vol. 52(1). - P. 393-409.

43. Carrisoza-Urbina, J. Atypical granuloma formation in Mycobacterium bovis-infected calves / J. Carrisoza-Urbina, E. Morales-Salinas, M. A. Bedolla-Alva, R. Hernández-Pando, J.A. Gutiérrez-Pabello // PLoS ONE. - 2019. - Vol. 14. - P. 1-17.

44. Chen, Y. Mycobacterium tuberculosis/Mycobacterium bovis triggered different variations in lipid composition of Bovine Alveolar Macrophages / Y. Chen, H. Ma, Y. Duan, X. Ma, L.Tan, J. Dong, Ch. Jin, R.Wei // Sci Rep. - 2022. -Vol.12(1). - P. 1-13.

45. Cho, Y.S. Identification of B cell antigenome in Mycobacterium bovis by immunoproteomic analysis / Y. S. Cho, S. E. Lee, Y. Jang, S. Jung, J.M. Kim // Acta Vet Hung. - 2020. -Vol. 68(2). - P. 123-129.

46. Chung, C.L. Outcome of untreated lung nodules with histological but no microbiological evidence of tuberculosis / C. L. Chung, Y. F. Chen, Y. T. Lin, J.Y. Wang, S.W. Kuo, J.S. Chen // BMC Infect Dis. - 2018. - Vol. 18(1). - P. 1-10.

47. Cicchese, J.M. Dynamic balance of pro- and anti-inflammatory signals controls disease and limits pathology / J. M. Cicchese, S. Evans, C. Hult, L.R. Joslyn, T. Wessler, J.A. Millar, S. Marino, N.A. Cilfone, J.T. Mattila, J.J. Linderman, D.E. Kirschner // Immunol Rev. - 2018. - Vol. 285. - P. 147-167.

48. Coad, M. Simultaneous measurement of antigen-induced CXCL10 and IFN-y enhances test sensitivity for bovine TB detection in cattle / M. Coad, M. Doyle, S. Steinbach, E. Gormley, M. Vordermeier, G. Jones // Vet Microbiol. - 2019. - Vol. 230. - P. 1-6.

49. de Azevedo Issa, M. Comparative study of Mycobacterium bovis primary isolation methods. Brazilian journal of microbiology / M. de Azevedo Issa, P. Martins Soares Filho, A. A. Fonseca Júnior, M. Arrais Hodon, C. L. Dos Santos, J.R. Karlisson Pimenta Dos, C.R. Leite // Brazilian Society for Microbiology. - 2020. - Vol. 48(1). - P. 139-144.

50. de Macedo Couto, R. One Health and surveillance of zoonotic tuberculosis in selected low-income, middle-income and high-income countries: A systematic review / R. de Macedo Couto, G. O. Santana, O.T. Ranzani, E.A.Waldman // PLoS Negl Trop Dis. - 2022. - Vol. 16(6). - P. 1-14.

51. de Melo, E.H. Genotypic characterization of Mycobacterium bovis isolates from dairy cattle diagnosed with clinical tuberculosis / E. H. de Melo, H. M. Gomes, P. N. Suffys, M.Q.P. Lopes, T.R.L. de Figueiredo, Í.R. Dos Santos, M.M.J .Franco, H. Langoni, A.C. Paes, J.A.B. Afonso, C.L. de Mendon?a // Front Vet Sci. - 2021. - Vol. 8. - P. 1-8.

52. Dean, A.S. A roadmap for zoonotic tuberculosis: A One Health approach to ending tuberculosis / A. S. Dean, S. Forcella, F. Olea-Popelka, A.E. Idrissi, P. Glaziou, A. Benyahia, E. Mumford, E. Erlacher-Vindel, G. Gifford, J. Lubroth,

M. Raviglione, P. Fujiwara // Lancet Infect. Dis. - 2018. - Vol. 18. - P. 137138.

53. Deng, G. Identification of secreted o-mannosylated proteins from BCG and characterization of immunodominant antigens BCG_0470 and BCG_0980 / G. Deng, W. Zhang, N. Ji, Y. Zhai, X. Shi, X. Liu, S.Yang // Front Microbiol. -2020. - Vol. 13. - P. 1-14.

54. Duffy, S.C. Reconsidering Mycobacterium bovis as a proxy for zoonotic tuberculosis: a molecular epidemiological surveillance study / S. C. Duffy, S. Srinivasan, M. A. Schilling, T. Stuber, S.N. Danchuk, J.S. Michael, M. Venkatesan, N. Bansal, S. Maan, N. Jindal, D. Chaudhary, P. Dandapat, R. Katani, S. Chothe, M. Veerasami, S. Robbe-Austerman, N. Juleff, V. Kapur, M.A. Behr// Lancet Microbe. - 2020. - Vol. 1. - P. 66-73.

55. Fang, L. Potential diagnostic value of the peripheral blood mononuclear cell transcriptome from cattle with bovine tuberculosis / L. Fang, W. Lin, H. Jia, X. Gao, X. Sui, X. Guo, S. Hou, Y. Jiang, L. Zhu, H. Zhu, J. Ding, L. Jiang, T. Xin // Front Vet Sci. - 2020. - Vol. 27. - P. 7-17.

56. Fresco-Taboada, A. A lateral flow assay for the rapid diagnosis of Mycobacterium bovis infection in wild boar / A. Fresco-Taboada, M. A. Risalde, C. Gortázar, I. Tapia, I. González, A. Venteo, P. Rueda // Transboundary and Emerging Diseases. - 2019. - Vol. 66(5). - P. 2175-2179.

57. García, J.S.Y. Does Mycobacterium bovis persist in cattle in a non-replicative latent state as Mycobacterium tuberculosis in human beings? / J. S. Y. García, M. M. Bigi, L.I. Klepp, E.A. García, F.C. Blanco, F.Bigi // Vet Microbiol. -2020. - Vol. 247. - P. 1-15.

58. Gibson, A.J. Defining the genes required for survival of mycobacterium bovis in the bovine host offers novel insights into the genetic basis of survival of pathogenic mycobacteria / A. J. Gibson, J. Stiens, I. J. Passmore, V. Faulkner, J. Miculob, S. Willcocks, M. Coad, S. Berg, D. Werling, B.W. Wren, I .Nobeli, B. Villarreal-Ramos, S.L. Kendall // mBio. - 2022. - Vol. 13(4). - P. 1-14.

59. Good, M. The history of in vivo tuberculin testing in bovines: tuberculosis, a "One Health" issue / M. Good, D. Bakker, A. Duignan, DM. Collins // Front Vet Sci. - 2018. - Vol. 5. - P. 59-69.

60. Guallar-Garrido, S. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect / S. Guallar-Garrido, V. Campo-Pérez, A. Sánchez-Chardi, Luquin M, Julián E. // Microorganisms. - 2020. - Vol. 8(5). - P. 1-16.

61. Hermann, C. Cell Envelope Proteomics of Mycobacteria / C. Hermann, L. Karamchand, J. M. Blackburn, N. C. Soares // J Proteome Res. - 2021. - Vol. 20(1). - P. 94-109.

62. Hlokwe, T.M. Utility of xpert® MTB/RIF ultra-assay in the rapid diagnosis of bovine tuberculosis in wildlife and livestock animals from South Africa / T. M. Hlokwe, R. M. Mogano // Prev Vet Med. - 2020. - Vol. 177. - P. 1-14.

63. Hoste, A. Development of a multiplex assay for antibody detection in serum against pathogens affecting ruminants / A. Hoste, T. Ruiz, P. Fernández-Pacheco Jiménez-Clavero MA, I. Djadjovski, S. Moreno, A. Brun, T.A. Edwards, J.N. Barr, P. Rueda, P. Sastre // Transboundary and emerging diseases. - 2021 - Vol. 68(3). - P. 1229-1239.

64. Infantes-Lorenzo, J.A. Proteomic characterisation of bovine and avian purified protein derivatives and identification of specific antigens for serodiagnosis of bovine tuberculosis / J. A. Infantes-Lorenzo, I. Moreno, M. L. A. Risalde, A. Roy, M. Villar, B. Romero, N. Ibarrola, J. de la Fuente, E. Puentes, L. de Juan, C. Gortázar, J. Bezos, L. Domínguez, M. Domínguez // Clin Proteomics. -2017. - Vol. 14. - P. 1-10.

65. Javed, R.A fluorescence polarization assay using recombinant protein ESAT-6 for the detection of antibodies against pathogenic Mycobacterium bovis in bovine / R. Javed, D. Narang, P. Kaur, M. Chandra, G. Filia, S.T. Singh // Iran J Vet Res. - 2022. - Vol. 23(3). - P. 204-209.

66. Jenkins, A.O. Cross reactive immune responses in cattle arising from exposure to Mycobacterium bovis and non-tuberculous mycobacteria / A. O. Jenkins, E.

Gormley, N. Gcebe, G.T. Fosgate, A. Conan, C. Aagaard, A.L. Michel, VPMG. Rutten // Prev Vet Med. - 2018. - Vol. 152. - P. 16-22.

67. Kapingidza, A.B. Antigen-Antibody complexes / A. B. Kapingidza, K. Kowal, M. Chruszcz // Subcell Biochem. - 2020. - Vol. 94. - P. 465-497.

68. Kaur, G. Characterization of an extracellular protein, Rv1076 from M. tuberculosis with a potential role in humoral response / G. Kaur, V. Saini, B. Kumari, J. Kaur, J. Kaur // Int J Biol Macromol. - 2017. - Vol. 101. - P. 621629.

69. Kashi, M.H. Detection and characterization of purified antigenic proteins from culture filtrate of Mycobacterium bovis strain AN5 / M.H. Kashi, N. Mosavari, M. Salehi, N. Mojgani // Iran J Microbiol. 2020 Feb;12(1):25-31. PMID: 32322376; PMCID: PMC7163036.

70. Kelly, T.R. One Health proof of concept: bringing a transdisciplinary approach to surveillance for zoonotic viruses at the human-wild animal interface / T. R. Kelly, W.B. Karesh, C.K. Johnson, K.V. Gilardi, S.J. Anthony, T. Goldstein, S.H. Olson, C. Machalaba, JA. Mazet // Prev Vet Med. - 2017. - Vol. 137. -P. 112-118.

71. Khalid H. Protein Levels of Pro-Inflammatory Cytokines and Chemokines as Biomarkers of Mycobacterium bovis Infection and BCG Vaccination in Cattle. / H. Khalid, A. van Hooij, T.K. Connelley, A. Geluk, J.C. Hope // Pathogens. -2022. - 11(7):738. doi: 10.3390/pathogens11070738.

72. Khaertynov, K.S. Extraction and serological properties of Mycobacterium cell surface and excreted proteins / K.S. Khaertynov, A.R. Valeeva, A.V. Ivanov, M.N. Mukminov, N.G. Urazov, I. M. Khaertynova, N.M. Aleksandrova, A.V. Moskvicheva, M.A. Efimova, R.M. Akhmadeev, E.S. Samigullina, A.A. Nabatov, E. A. Shuralev // BioNanoScience. - 2018. - Vol. 8. - P. 459-466.

73. Khosrobeygi M. Isolation and Purification of Low Molecular Weight Proteins from Culture Filtrate of Mycobacterium Tuberculosis Strain C. / M. Khosrobeygi, N. Mosavari, M. Salehi, N. Mojgani, M. Akbari // Arch Razi Inst. 2021 Jul;76(2):273-281. doi: 10.22092/ari.2020.127691.1390.

74. Klepp, L.I. Identification of bovine tuberculosis biomarkers to detect tuberculin skin test and IFN-y release assay false negative cattle / L. I. Klepp, M. E. Eirin, S. Garbaccio, M. Soria, F. Bigi, F.C. Blanco // Res Vet Sci. - 2019. - Vol. 122. - P. 7-14.

75. Kock, R. Zoonotic tuberculosis - the changing landscape / R. Kock, A. L. Michel, D. Yeboah-Manu, E.I. Azhar, J.B. Torrelles, S.I. Cadmus, L. Brunton, J.M. Chakaya, B. Marais, L. Mboera, Z. Rahim, N. Haider, A. Zumla // Int J Infect Dis. - 2021. - Vol. 113. - Suppl. 1. - P. 68-72.

76. Kumar, T.A defined antigen skin test for diagnosis of bovine tuberculosis in domestic water buffaloes (Bubalus bubalis) / T. Kumar, M. Singh, B. L. Jangir, D. Arora, S. Srinivasan, D. Bidhan, D.C. Yadav, M. Veerasami, D. Bakker, V. Kapur, N. Jindal // Front Vet Sci. - 2021. - Vol. 16. - P. 8-18.

77. Laemmli, U.K. Cleavage structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

78. Larenas-Muñoz, F. The role of histopathology as a complementary diagnostic tool in the monitoring of bovine tuberculosis / F. Larenas-Muñoz, J. M. Sánchez-Carvajal, A. Galán-Relaño, I. Ruedas-Torres, E. Vera-Salmoral, L. Gómez-Gascón, A. Maldonado, L. Carrasco, C. Tarradas, I. Luque, I.M. Rodríguez-Gómez, J. Gómez-Laguna // Front Vet Sci. - 2022. - Vol. 9. - P. 1-12.

79. Lee, D.F. Modelling early events in Mycobacterium bovis infection using a co-culture model of the bovine alveolus / D. F. Lee, G. R. Stewart, M. A. Chambers // Sci Rep. - 2020. - Vol. 10(1). - P. 1-29.

80. Lekko, Y.M. Mycobacterium tuberculosis complex in wildlife: Review of current applications of antemortem and postmortem diagnosis / Y. M. Lekko, P. T. Ooi, S. Omar, M. Mazlan, S.Z. Ramanoon, S. Jasni, F.F.A. Jesse, A. Che-Amat // Vet World. - 2020. - Vol. 13(9). - P. 1822-1836.

81. Lombard, J.E. Human-to-Cattle Mycobacterium tuberculosis Complex Transmission in the United States / J.E. Lombard, E.A. Patton, S.N. Gibbons-Burgener, R..F Klos, J.L. Tans-Kersten, B.W. Carlson, S.J. Keller, D.J.

Pritschet, S. Rollo, T.V. Dutcher, C.A. Young, W.C. Hench, T.C. Thacker, C. Perea, A.D. Lehmkuhl, S. Robbe-Austerman // Front. Vet. Sci. - 2021. -8:691192. doi: 10.3389/fvets.2021.691192

82. Lopes, B.C. A molecular strategy to optimize bovine tuberculosis post-mortem diagnosis and the exposure to Mycobacterium tuberculosis variant bovis / B. C. Lopes, E. M. Dos Reis, F. B. R. de Bitencourt, M.R. Loiko, A.V.A. Bezerra, T.S. Bueno, I.T. Lape, C. Cerva, M.M. Coppola, R.O. Rodrigues, J.E. Vargas,

A.C. Bertagnolli, F.Q. Mayer // Mol Biol Rep. - 2020. - Vol. 47(9). P. 72917296.

83. Lorente-Leal, V. Validation of a real-time PCR for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex members in bovine tissue samples / V. Lorente-Leal, E. Liandris, E. Castellanos, J. Bezos, L. Domínguez, L. de Juan,

B. Romero // Front Vet Sci. - 2019. - Vol. 6. - P. 61-70.

84. Lubbers, R.L. Complement component C1q as serum biomarker to detect active tuberculosis / R. Lubbers, J. S. Sutherland, D. Goletti, R.A. de Paus,

C.H.M. van Moorsel, M. Veltkamp, S.M.T. Vestjens, W.J.W. Bos, L. Petrone, F. Del Nonno, I.M. Bajema, K. Dijkman, F.A.W. Verreck, G. Walzl, K.A. Gelderman, G.H. Groeneveld, A. Geluk, T.H.M. Ottenhoff, S.A. Joosten, L.A. Trouw // Front Immunol. - 2018. - Vol. 9. - P. 2427-2442.

85. Lucas, M. Extraction and separation of mycobacterial proteins / M. Lucas, J. M. Ryan, J. Watkins, K. Early, N.A. Kruh-Garcia, C. Mehaffy, K.M. Dobos // Methods Mol Biol. - 2021. - Vol. 2314. - P. 77-107.

86. Luciano, S.A. Human zoonotic tuberculosis and livestock exposure in low- and middle-income countries: A systematic review identifying challenges in laboratory diagnosis / S. A. Luciano, S. Anne, A. Roess // Zoonoses and public health. - 2020. - Vol. 67 (2). - P. 97-111.

87. Lyashchenko, K.P. Differential antigen recognition by serum antibodies from three bovid hosts of Mycobacterium bovis infection / K. P. Lyashchenko, A. A. Sridhara, A. Johnathan-Lee, A. Sikar-Gang, P. Lambotte, J. Esfandiari, N.

Bernitz, T.J. Kerr, M.A. Miller, W.R. Waters // Comp. Immunol. Microbiol. Infect Dis. - 2020. - Vol. 69. - P. 1-20.

88. Macedo Couto, R. Zoonotic Tuberculosis in Humans: Control, Surveillance, and the One Health Approach. Epidemiol / R. Macedo Couto, O. T. Ranzani, E. A. Waldman // Rev. - 2019. - Vol. 41(1). - P. 130-144.

89. Maharajh R. A. computational method for the prediction and functional analysis of potential mycobacterium tuberculosis adhesin-related proteins / R. Maharajh M.Pillay, S.Senzani // Expert Review of Proteomics. - 2023. https://doi.org/10.1080/14789450.2023.2275678

90. Malone, K.M. Comparative 'omics analyses differentiate Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis and reveal distinct macrophage responses to infection with the human and bovine tubercle bacilli / K. M. Malone, K. Rue-Albrecht, D. A. Magee, K. Conlon, O.T. Schubert, N.C. Nalpas, J.A. Browne, A. Smyth, E. Gormley, R. Aebersold, D.E. MacHugh, S.V. Gordon // Microb Genom. - 2018. - Vol. 3. - P. 1-17.

91. Martínez-Guijosa, J. Environmental DNA: A promising factor for tuberculosis risk assessment in multi-host settings / J. Martínez-Guijosa, B. Romero, J. A. Infantes-Lorenzo, E. Díez, M. Boadella, A. Balseiro, M. Veiga, D. Navarro, I. Moreno, J. Ferreres, M. Domínguez, C. Fernández, L. Domínguez, Ch. Gortázar // PLoS One. - 2020. - Vol. 15(5). - P. 1-12.

92. Mazorra-Carrillo, J.L. Host serum proteins as potential biomarkers of bovine tuberculosis resistance phenotype / J. L. Mazorra-Carrillo, O. A. Alcaraz-López, G. López-Rincón, B. Villarreal-Ramos, J.A. Gutiérrez-Pabello, H. Esquivel-Solís // Front Vet Sci. - 2021. - Vol. 8. - P. 1-15.

93. McCallan, L. Serological test performance for bovine tuberculosis in cattle from herds with evidence of on-going infection in Northern Ireland / L. McCallan, C. Brooks, C. Barry, C. Couzens, F.J. Young, J. McNair , A.W. Byrne // PloS one. - 2021. - Vol. 16(4). - P. 1-14.

94. McEwen, S.A. Antimicrobial Resistance: a One Health Perspective / S. A. McEwen, P. J. Collignon // Microbiol Spectr. - 2018. - Vol. 6(2). - P. 1-20.

95. Mehta, P.K. Cattle as experimental model to study immunopathogenesis of tuberculosis / P. K. Mehta, R. Dharra, Z. Thakur // Mycobact Dis. - 2017. -Vol. 7. - P. 1-7.

96. Melini, F. Raw and heat-treated milk: From public health risks to nutritional quality / F. Melini, V. Melini, F. Luziatelli, M. Ruzzi // Beverages. - 2017. -Vol. 3(4). - P. 1-33.

97. Mendum, T.A. Transposon libraries identify novel Mycobacterium bovis BCG genes involved in the dynamic interactions required for BCG to persist during in vivo passage in cattle / T. A. Mendum, A. Chandran, K. Williams // BMC Genomics. - 2019. - Vol. 20(1). - P. 431-425.

98. Meunier, N.V. Wildlife-livestock interactions and risk areas for cross-species spread of bovine tuberculosis / N. V. Meunier, P. Sebulime, R. G. White, R. Kock // Onderstepoort J Vet Res. - 2017. - Vol. 84. - P.1-10.

99. Michelet, L. Second line molecular diagnosis for bovine tuberculosis to improve diagnostic schemes / L. Michelet, K. de Cruz, C. Karoui, J. Tambosco, J.-L. Moyen, S. Hénault, M. L. Boschiroli // PLoS One. - 2018. - Vol. 13(11).

- P. 1-10.

100. Mitermite M. Exploring virulence in Mycobacterium bovis: clues from comparative genomics and perspectives for the future /M. Mitermite, M. Elizari, J.M.U., R. Ma, D. Farrell, S.V. Gordon// Irish Veterinary Journal. 2023.

- v.76. https://doi.org/10.1186/s13620-023-00257-6

101. Milián-Suazo, F. Vaccination strategies in a potential use of the vaccine against bovine tuberculosis in infected herds / F. Milián-Suazo, S. González-Ruiz, Y. G. Contreras-Magallanes, S.L. Sosa-Gallegos, I. Bárcenas-Reyes, G.J. Cantó-Alarcón, E. Rodríguez-Hernández // Animals (Basel). - 2022. - Vol. 12(23). -P. 2-20.

102. Miller, M.A. Serological reactivity to MPB83 and CFP10/ESAT-6 antigens in three suid hosts of Mycobacterium bovis infection / M. A. Miller, C. Gortazar, E. O. Roos, M.A. Risalde, A. Johnathan-Lee, A.A. Sridhara, K.P. Lyashchenko // Vet Microbiol. - 2019. - Vol. 235. - P. 285-288.

103. Mingaleev, D.N. Cartographic assay of nozoareal tuberculosis of cattle in the Republic of Tatarstan / D. N. Mingaleev, A. G. Hisamutdinov, M. A. Efimova, A. I.Trubkin, J. R. Kamalieva // BIO Web of Conferences. -2020. - Vol. 17. -P. 115.

104. Mishto, M. Post-Translational Peptide Splicing and T Cell Responses / M. Mishto, J. Liepe // Trends Immunol. - 2017. - Vol. 38(12). - P. 904-915.

105. Ncube, P. Evidence, challenges, and knowledge gaps regarding latent tuberculosis in animals / P. Ncube, B. Bagheri, W. J. Goosen, M.A. Miller, S.L. Sampson, E. Challenges, K. Gaps // Microorganisms. - 2022. - Vol. 10(9). -P. 1-32.

106. OIE - World Organisation for Animal Health. Retrieved 17 May 2020. [Электронный ресурс] https://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/oie-listed-diseases-2020/. (Дата обращения: 22.10.2022 г.).

107. Olea-Popelka, F. Zoonotic tuberculosis in human beings caused by Mycobacterium bovis - a call for action / F. Olea-Popelka, A. Muwonge, A. Perera, A.S. Dean, E. Mumford, E. Erlacher-Vindel, S. Forcella, B.J. Silk, L. Ditiu, E.l. A. Idrissi, M. Raviglione, O. Cosivi, P. LoBue, P.I. Fujiwara // Lancet. Infect Dis. - 2017. - Vol. 17(1). - P. 21-25.

108. Palmer, M.V. Biomarkers of cell-mediated immunity to bovine tuberculosis / M. V. Palmer, T. C. Thacker, M. M. Rabideau, G.J. Jones, C. Kanipe, H.M. Vordermeier, W. Ray Waters // Vet Immunol Immunopathol. - 2020. - Vol. 220. - P. 1-18.

109. Palmer, M. V. Heterogeneity of pulmonary granulomas in cattle experimentally infected with Mycobacterium bovis / M. V. Palmer, T. C. Thacker, C. Kanipe, P.M. Boggiatto // Front Vet Sci. - 2021. - Vol. 8. - P. 1-10.

110. Palmer, S. Assessment of the frequency of Mycobacterium bovis shedding in the faeces of naturally and experimentally TB infected cattle / S. Palmer, G. A. Williams, C. Brady, E. Ryan, K. Malczewska, T.J. Bull, Ph.J. Hogarth, J. Sawyer // J Appl Microbiol. - 2022. - Vol. 133(3). - P. 1832-1842.

111. Pereira, A.C. Animal tuberculosis: impact of disease heterogeneity in transmission, diagnosis and control / A. C. Pereira, A. C. Reis, B. Ramos, M.V. Cunha // Transbound Emerg Dis. - 2020. - Vol. 67. - P. 1828-1846.

112. Pishesha, N.A guide to antigen processing and presentation / N. Pishesha, T. J. Harmand, H. L. Ploegh // Nat Rev Immunol. - 2022. - Vol. 22(12). - P. 751764.

113. Qiu, X. Accuracy of interferon-y-induced protein 10 for diagnosing latent tuberculosis infection: a systematic review and meta-analysis / X. Qiu, Y. Tang, Y. Yue, Y. Zeng, W. Li, Y. Qu, D. Mu // Clin Microbiol Infect. - 2019. - Vol. 25. - P. 667-72.

114. Ramos, J.M. Isolation and identification of Mycobacterium bovis in bovines with positive reaction to the tuberculin test in the state of Paraíba, northeast Brazil / J. M. Ramos, M. B. Heinemann, J. S. Ferreira Neto, A. F. de Souza Filho, N. C. Cárdenas, C. J. A. S. Santos de Azevedo // Arq. Inst. Biol. - 2018. - Vol. 85. - P. 1-7.

115. Romha, G. Epidemiology of Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis in animals: Transmission dynamics and control challenges of zoonotic TB in Ethiopia / G. Romha, G. Gebru, A. Asefa, Mamo G. // Prev Vet Med. - 2018. - Vol. 158. - P. 1-17.

116. Roperto, S. Proteomic analysis of protein purified derivative of Mycobacterium bovis / S. Roperto, M. Varano, V. Russo, R. Lucá, M. Cagiola, M. Gaspari, D.M. Ceccarelli, G. Cuda, F. Roperto // J Transl Med. - 2017. - Vol. 15(1). -P. 68-80.

117. Rusk, R.A. Measuring bovine y5 T cell function at the site of Mycobacterium bovis infection / R. A. Rusk, M. V. Palmer, W. R. Waters, J.L. McGill // Vet Immunol Immunopathol. - 2017. - Vol. 193(4). - P. 38-49.

118. Sales, É.B. Multispacer Sequence Typing for Mycobacterium bovis Genotyping / É. B. Sales, A. A. Fonseca, C. M. Gonfalves, A.P. Lage, G.I. Andrade, P.N. Suffys, H.M. Gomes, N.L. Dias, J.S. Ferreira Neto, A.M.dS. Guimaraes, M.B. Heinemann // Front Vet Sci. - 2021. - Vol. 8. - P. 1-12.

119. Salguero, F.J. Differential cell composition and cytokine expression within lymph node granulomas from BCG-vaccinated and non-vaccinated cattle experimentally infected with Mycobacterium bovis / F. J. Salguero, S. Gibson, W. Garcia-Jimenez, J. Gough, T.S. Strickland, H.M. Vordermeier, B. Villarreal-Ramos // Transbound Emerg Dis. - 2017. -Vol. 64. - P. 1734-1749.

120. Silva, M.R. Risk factors for human Mycobacterium bovis infections in an urban area of Brazil / M.R. Silva, A.D.S. Rocha, F.R. Araújo. A.A. Fonseca-Júnior, A.P. Alencar, P.N. Suffys, R.R.D. Costa, M.A.S. Moreira, M.D.C. Guimaraes // Mem Inst Oswaldo Cruz. - 2018. -Vol. 113(8). - P. 1-6.

121. Singh, S. Mycobacterium tuberculosis exploits MPT64 to generate myeloid-derived suppressor cells to evade the immune system / S. Singh, S. K. Maurya, M. Aqdas, H. Bashir, A. Arora, V. Bhalla, J.N. Agrewala // Cell Mol Life Sci. - 2022. - Vol. 79(11). - P. 567-580.

122. Singhla, T. Determination of the sensitivity and specificity of bovine tuberculosis screening tests in dairy herds in Thailand using a Bayesian approach / T. Singhla, S. Boonyayatra, S. Chulakasian, M. Lukkana, J. Alvarez, S. Sreevatsan, S.J. Wells // BMC Vet Res. - 2019. - Vol. 15(1). - P. 149-156.

123. Smith, K. Cell-mediated immunological biomarkers and their diagnostic application in livestock and wildlife infected with Mycobacterium bovis / K. Smith, L. Kleynhans, R. M. Warren, W.J. Goosen, M.A. Miller // Front. Immunol. - 2021. - Vol. 12. - P. 1-17.

124. Souza, I.I.F. ELISA using a recombinant chimera of ESAT-6/MPB70/MPB83 for Mycobacterium bovis diagnosis in naturally infected cattle / I. I. F. Souza, R. A. Rodrigues, K. S. Gonfalves Jorge, M.R. Silva, W. Lilenbaum, C.E.S. Vidal, R.N. Etges, M. Kostovic, F.R. Araújo // J Vet Med Sci. - 2019. -Vol. 81(1). -P. 9-14.

125. Sovetzhan, Z. Diagnostics of tuberculosis and differentiation of nonspecific tuberculin reactions in animals / Z.S. Basybekova, B.M. Bazarbayev, A.B. Yespembetov, A. Mussaeva, S.G. Kanatbayev, K. M. Romashev, A.K. Dossanova, T.

A. Yelekeyev, E.K. Akmatova, N.S. Syrym // Veterinary microbiology. - 2018. -Vol. 49(2). - P. 329-335.

126. Song, J. The adipocyte and adaptive immunity / J. Song, T. Deng // Front Immunol. - 2020. - Vol. 11. - P. 1-9.

127. Sridhara, A.A. Strong antibody responses to Mycobacterium bovis infection in domestic pigs and potential for reliable serodiagnostics / A. A. Sridhara, A. Johnathan-Lee, R. Elahi, M.A. Risalde, C. Gortazar, R.W. Waters, K.P. Lyashchenko, M.A. Miller // Vet Immunol Immunopathol. - 2021. - Vol. 231. - P. 1-9.

128. Srinivasan, S.A defined antigen skin test for the diagnosis of bovine tuberculosis / S. Srinivasan, G. Jones, M. Veerasami, S. Steinbach, Th. Holder, A. Zewude, A. Fromsa, G. Ameni, L. Easterling, D. Bakker, N. Juleff, G. Gifford, R.G. Hewinson, H. M. Vordermeier, V. Kapur // Sci Adv. -2019. -Vol. 5. - P. 1-8.

129. Stedman, A. Secretion and functional expression of Mycobacterium bovis antigens MPB70 and MPB83 in lactic acid bacteria / A. Stedman, M. A. Chambers, J. Gutierrez-Merino // Tuberculosis. - 2019. - V.117. - P. 24-30.

130. Subramanian, S. Defined antigen skin test for bovine tuberculosis retains specificity on revaccination with bacillus Calmette-Guerin / S. Subramanian, S. Srinivasan, K. Ramaiyan Selvaraju, P.M. Vinoli, S. Selladurai, B. Ramasamy, K. Kumaragurubaran, D. Bakker, M. Vordermeier, V. Kapur, D.R. Gopal / Front Vet Sci. - 2022. - Vol. 9. - P. 1-8.

131. Taye, H. Global prevalence of Mycobacterium bovis infections among human tuberculosis cases: Systematic review and meta-analysis. / H. Taye, K. Alemu, A. Mihret, J.L.N. Wood, Z. Shkedy, S. Berg, A. Aseffa // Zoonoses Public Health. - 2021. - V.68(7). - P. 704-718.

132. Thirunavukkarasu, S. Applying the One Health concept to mycobacterial research - overcoming parochialism / S. Thirunavukkarasu, K. M. Plain, K. de Silva, B.J. Marais, R.J. Whittington // Zoonoses Public Health. - 2017. - Vol. 64(6). - P. 401-422.

133. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. / H. Towbin, T. Staehelin, J. Cordon // Biochemistry. - 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

134. Turgenbayev, K.A. Tuberculosis prevalence in animals and humans in the Republic of Kazakhstan / K.A. Turgenbayev, A.M. Borsynbayeva, A.A. Plazun, R.K. Turgenbayev // Vet World. - 2021. - Vol. 14(9). - P. 2362-2370.

135. VanderWaal, K. Optimal surveillance strategies for bovine tuberculosis in a low-prevalence country / K. VanderWaal, E. A. Enns, C. Picasso, J. Alvarez, A. Perez, F. Fernandez, A. Gil, M. Craft, S. Wells // Sci Rep. - 2017. - Vol. 7(1). - P. 4140-4164.

136. Vayr, F. Occupational exposure to human Mycobacterium bovis infection: a systematic review / F. Vayr, G. Martin-Blondel, F. Savall, J.M. Soulat, G. Deffontaines, F. Herin // PLoS Negl Trop Dis. - 2018. - Vol. 12(1). - P. 1-14.

137. Villarreal-Ramos, B. Experimental infection of cattle with Mycobacterium tuberculosis isolates shows the attenuation of the human tubercle bacillus for cattle / B. Villarreal-Ramos, S. Berg, A. Whelan, S. Holbert, F. Carreras, F.J. Salguero, B.L. Khatri, K. Malone, K. Rue-Albrecht, R. Shaughnessy, A. Smyth, G. Ameni, A. Aseffa, P. Sarradin, N. Winter, M. Vordermeier, S.V. Gordon // Sci Rep. - 2018. - Vol. 8. - P. 894-907.

138. Waters, W.R. Potential for rapid antibody detection to identify tuberculous cattle with non-reactive tuberculin skin test results / W. R. Waters, H. M. Vordermeier, S. Rhodes, B. Khatri, M.V. Palmer, M.F. Maggioli, T.C. Thacker, J.T. Nelson, B.V. Thomsen, S. Robbe-Austerman, D.M. Bravo Garcia, M.A. Schoenbaum, M.S. Camacho, J.S. Ray, J. Esfandiari P. Lambotte, R. Greenwald, A. Grandison, A. Sikar-Gang, K.P. Lyashchenko // BMC Vet Res. - 2017. - Vol. 13. - P. 164-171.

139. WHO's global TB database. [Электронный ресурс] http://www.who.int/tb/country/data/download/en/. (Дата обращения: 21.10.2022 г.).

140. Wright, K. Biomarkers for detecting resilience against mycobacterial disease in animals / K. Wright, K. Plain, A. Purdie, B.M. Saunders, K. de Silva // Infect Immun. - 2019. - Vol. 88(1). - P. 1-9.

141. Wykowski, J.H. A systematic review of potential screening biomarkers for active TB disease / J.H. Wykowski, C. Phillips, T. Ngo, P.K. Drain // J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. - 2021. - Vol. 25. - P. 1-9.

142. Xin, T. Limitations of using IL-17A and IFN-y-induced protein 10 to detect bovine tuberculosis / T. Xin, X. Gao, H. Yang, P. Li, Q. Liang, S. Hou, X. Sui, X. Guo, W. Yuan, H. Zhu, J. Ding, H. Jia // Front Vet Sci. - 2018. - Vol. 5. -P. 28-40.

143. Yates, G.F. Comparison of the BBL mycobacteria growth indicator tube, the BACTEC 12B, and solid media for the isolation of Mycobacterium bovis / G. F. Yates, M. Price-Carter, K. Bland, M.A. Joyce, F. Khan, M. Surrey, G.W. de Lisle // J Vet Diagn Invest. - 2017. - Vol. 29(4). - P. 508-512.

144. Zhai, W. The Immune Escape Mechanisms of Mycobacterium Tuberculosis / W. Zhai, F. Wu, Y. Zhang, Y. Fu, Z. Liu // Int J Mol Sci. - 2019. - Vol. 20(2).

- P. 340-358.

145. Zimpel, C.K. Global Distribution and Evolution of Mycobacterium bovis Lineages. / C.K. Zimpel, J.S.L. Patane, A.C.P. Guedes, R.F. de Souza, T.T. Silva-Pereira, N.C.S. Camargo, A.F. de Souza Filho, C.Y. Ikuta, J.S.F. Neto, J.C. Setubal, M.B. Heinemann, A.M.S. Guimaraes // Front. Microbiol. -2020.

- 11:843. doi: 10.3390/ijms20020340

146. Zubair, M. Identification of 60 secreted proteins for Mycoplasma bovis with secretome assay. / M. Zubair, S.A. Muhamed, F.A. Khan, G. Zhao, H. Menghwar, M. Faisal, H. Zhang, X. Zhu, M.A. Rasheed, Y. Chen, M.A. Marawan, H. Chen, A. Guo // Microb Pathog. - 2020. - 143:104135. doi: 10.1016/j.micpath.2020.104135

ПРИЛОЖЕНИЯ

К диссертационной работе прилагаются следующие копии документов:

№ Документ Стр.

1 Технологический регламент получения антигена из клеточной стенки Micobacterium bovis Bovinus-8 109

2 Патент на изобретение RU 2691586 C1. Способ получения антигена из "Mycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201" молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа. 111

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Департамент научно-технологической политики и образования

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

«ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ» (ФГБПУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)

Технологический регламент получения антигена из клеточной стенки \I.bovis Воучпив 8

Казань 2016

russian federation

(19)

RU

do

2 691 586l3) C1

CS!) int. en. CI2NI AX (2006.01)

federal service for intellectual property

(12) ABSTRACT OF INVENTION

(52|CPC

C12N l/OO <2019.02)

CD 00 U)

TO) CD CM

D X

(21X22) Application: 2018127036. 23.07.2018

(241 Effective date for property rights: 23.071018

Registration date: 14.06.2019

Priority:

(22t Date of riling: 23.07.2018

(45 ) Date of publication: 14.06.2019 Bull. K 17

Mail address:

420012. g Kazan, ul. Mushtan. 11. KGMA filial PGBOU DPO RMANPO Minzdrava Rossii. TSNPNPK

(72) Inventor) s ):

Khacrtynov Kamil Saubanovich (RU). Tsibulkin Anatolij Pavlovich (RU). Shuralev Eduard Arkadevich (RU), Efimova Marina Anatolevna (RU). Valeeva Anna Rafkatovna (RU), Mukminov Malik Nilovich (RUX Akbmadeev Rafail Mazitovich (RU). Khaertynova Ilsiyar Mansurovna (RU). Valiev Ravil Shamilovich (RU). Gabdulkhakova Aida Gabdrakhmanovna (RU), Moskvichcva Albina Valerevru (RU)

(73) Proprietor!si:

1-ederalnoc gosudarstvennoe byudzbetnoe obrazovatelnoe uchrezhdenie dopolnitclnogo prolessionalnogo obrazovamya "Rossijskava mcditsinskava akademiya nepreryvnogo professionalnogo obrazovaniya" Mimstcrstva zdravookhraneniya Rossi jskoj Federatsii (FGBOU DPO RMANPO Minzdrava Rossii) (RU)

(54) METHOD FOR PRODUCING ANTIGEN FROM MYCOBACTERIUM BOVIS BOVINUS-8 STRAIN 700201 WITH MOLECULAR WEIGHT OF 28 kDa FOR STUDYING HUMORAL IMMUNE RESPONSE

(57) Abstract:

HELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention represents a method for obtaining an anagen from Mycobacterium bovis Bovinus-X strain 700201 with molecular weight of 28 kOa for studying the humoral immune response, involving cultivation of an agent on a solid nutrient medium of Lcvcashtcin-Jensen medium, destruction of washed cells and fractionation by preparative electrophoresis, where washed cells are subjected to destruction three times in homogcnizer Fast Prep 24 for 45 see at vibration rate of 6.5 ms, destructed cells

arc removed by centrifugation at 7,000 rpm, maintained supernatant at +4-6 °C for 10 days, repeatedly removing spontaneous sediment by centrifugation, adding to supernatant lysing buffer containing 0.2 ft sodium dodecvl sulphate, 0.1 ft 2-0 mercaptoethanol, samples are held at 100 °C from 10 minutes, fractionated on column using 9 ft polyacryamide gel.

EFFECT: invention enables to obtain an antigen having high specificity and activity.

I cl, 5 dwg

7J C

KJ

œ

CD

cn 00 0)

O

Cip.: 3

RU 2W158&CI

Изобретение Относится к биотехнологии, в частности к медицинской ¡1 в^гсринарНйй иммунологии, а именно к лабораторной диагностике, и касается получения антигенов из клеток Mvcobactcrium bovis Bovinus-8 штамм 700201, которые могут в дальнейшем Сыть использованы и качестве дискретных структур при создании диагностической -í панели наиболсс значимых микоБактериал ьных антигенов и для изучения itmo piuiu юго иммунного Ответа в серологических реакциях у Больных т уберкулезом.

Туберкулез 1ТБ) до настоящего времени остается самой страшной и смысле распространения, самой опасЕшй в смысле неизлечимости зпк}офгисй, одной из 10 ведущих причин (нерпюсш: ои свирепствует во всех странах мира, вызывая заболевания ю людей, крупно] о рогатого скота (К PC), который и свою очередь заражает люлей, работающих в жнвОТнОВОДСгас и пищевой промышленности. Несмотря па успехи, достигнутые в борьбеС ТБ, эта инфекция остается Одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии [I, 2].

В 2015 г. Организация Объединенных Наций (ООН) приняла Цели в области (г уст ойчивого развития (ЦУРЫо 2030 года. Одной из залач :лих целей является ликвидация глобальной эпидемии ТБ. Стратегия Всемирной Организации Здравоохранения <ВОЗ> по ликвидации туберкулеза 2016-2035, Одобренная Всемирной ассамблеей здравоохранения в 2014 г., призывает сократить к 2030 г. количество случаев смерти от ТБ па 90%, а показатель заболеваемости ТБ ejü flO'á; ico сравнению с 2015 и годом. По Оценкам ВОЗ в 2015 году во всем мнреТБ заболело 10,4 млн. ЛИДОЙ, т.е. заболеваемость Tls л мире составила 142 на 100 тыс. населения. Среди них U млн. (11%) составили больные ВИЧ инфекцией, у 4А0тыс. человек развился ТБ с множественной лекарственной устой чивость ю (МЛУ-ТБ). В 2015 году ТБ стал причиной детальных исходов у 1,8 млн., включая Ж) тыс. среди ВИЧ позитивных лиц и почти 2S 200 тыс Среди больных МЛУ-ТБ [15]. В елн:ш с актуальностью проблемы ТБ ВОЗ [гровела осенью 2017 года и г. Москве глобальную министерскую конференцию ВОЗ «Ликвидация туберкулеза В эпоху устойчивого развития: межеекторальпые меры* Призванную ускорить осуществление странами Стратегии ВОЗ «Остановить туберкулез» с целью достижения показателей поТБ, установленных Всемирной ассамблеей ли здра Booxpai 1сния, и ЦУР ООН. Итоги Кш|фсрс!щии на уро вне миниСгров будут приняты к сведению Совещанием высокого уровня по ТБ Генерал ьпой Ассамблей ООН в 2018 году [2,3, 14]. На ЭФОЙ конференции было отмечено, что туберкулез является ведущей инфекционной болезнью, уносящей житии людей во всем мире. С ним Связаны глубокие Экономические и социальные последствия. Продолжается кризис общественного .и здравоохранения, вызванный МЛУ-ТБ. Хотя с 2000 года мировые усилия позволили спасти 49 миллионов человек, мероприятия и инвестиции крайне малы, чтобы ноложить конец эпидемии ТБ. Необходимы межсскторальпые усилия высокого уровня, а меры в отношении ТБ могут СОужитъ показателем осуществления повестки дня в области ЦУР [14].

л? На со ярсмы том эта] te ft орь бы с ТБ, oci со вой i фОфил а кти чеек и \ и озд оро вител ы i ы х мероприят ий была и остается проблема ранней диагностики ЭТой болезни. Поэтому, наряду с общепринятыми методами диагностики ТБ, необходимы исследования Современными методами, т акими как серологическая диагностика с использованием маркерных ешткгсешв, специфичных для М .bovis, M.hibcrcnlosú, BCG, молскулярно-■tí биологические исследования, в частности полимеразпая цепная реакция (ПЦР) для уточнения диагноза BciioptibEX вопросах [12]. Выдел скис Самой микоБактерии из мокроты, моч и, либо других биологических секретОв является до казатсл ьпой н основной частью диагностики ТБ. Однако выделение микобактерий происходит только когда в

EL 2W15S&CI

результате активного заболевания очаг уже разрушен, тении повреждены, а размнОзсLLH3ЩИССЯ МИКОбактерий Hi ОЧага поступаю! ВО ВНСОШЕОВД среду (Открытая форма ТБ). Но лаже при наличии активного заболевания е открытой формой, и жхледусмом материале может бьГГЬ Слишком мало микобактерий для обнаружения их J путем посева или микроскопии (низкая чувствительность 40-50^ при конрентрадни микобактерий 10ОО-L 0000 кл/мл, а ори концентрации микобактерий не более 1000 кл/ мл отрицательные результаты отмечаются в 96® случаев! [16]-

Проблема совершенствования днагностиЕИ ТП имеет Своей целью поиск способов pain <сй докл и i снчес кой д иа г н (или ки боле:п си ( вел ючая латент] [ ые фор мы заболс ва н и я) ю и решения ряда задач, Связанных с дифференциальной диагностикой ТБ, туберкулиновых реакций, вызванных Сенсибилизацией Организма атипичными микобактсриями и микобактсриями птичьего вида [4, 5, й].

Предпосылкой для разработки методов серологической диагностики ТБ является тот фаЕт, что при активации инфекции отмечается интенсивный синтез iУ микобаЕзериальных антигенов, являющихся активаторами запуска

нммунекомпетентных клеток [7, 12] Вариабельность антигенной Структуры туберкуп^Зных микобактерий па разных Стадиях инфекционного процесса, наличиеу него большого количества антигенов, а Также вариабельная иммуиогеппость последних служат Объективными причинами того, 4to;jo настоящего времени не разработано ни ю ОДНОГО серологического теста, обла лающего настолько высоеой чувствительностью, чтобы им можно было бы заменить или дополнить применяемые в настоящее время <кустареншнс* метод ел диагностики TI} (Золотой стандарт: флюорография, реакция Манту, бактериологический посев). Во многих научных центрах мира активно ведутся поисковые работы по выявлению и выделению специфических туберкулезных антигенов я [8-11].

Наиболее близким по совокупности признаков и достигаемому результату к Заявленному техническому решению является СПОсоб получения антигенов [13]. раствори mux в изотоническом растворе хлорила натрия. Этот способ включает Получение бактериальной швеей в сухом виде путем ¡роекратной обработки ацегоном, .ю а затем эфиром и последующим высушиванием. Затем к 40 мг высушенной биомассы вносят 10 мл изОтоничеСКОгО раст вора хлорила натрия, .40 минут интенсивно встряхивают, после чего инкубируют 24 часа при комнатной температуре. Центрифугируют 2(1 мин при 9000 Об/мин, Сливают Прозрачный центрифугах. Полученный Экстракт используют в качестве антигенного препарата в серологических реакциях, а .if именно в реакции преципитации. Ü исследованиях сывороток больных методом

иммуноблт ипга :лот материал малоэффективен из-за низкой доли специфичссЕих и Значимых для диагностики ТБ антигенов, Слишком blicoeo го содержания балластного материала, что является Существенным недостатком рассмотренного ci[особа получения антигенов. К отмеченному недостатку, вероятно, приводит обра бот Еа бактериальных м клеток неразбавленным ацегоном, затеи "эфиром и последующее высушивание, в результате чего происходит Деструктивное разрушение и вымывание лнпнлов мембранных комплексов и, как следствие ЭТОГО, облегченная экстракция (изотоническим раствором! клеточного материала.

Задачей заявляемого способа является выделение антигена молекулярной массой 28 ¿í к Да, из разрушенных клеток Mycobacterium bovis Bovinu¡i-8, штамм 70020],

культивированных на твердой питательной среде Лсвснштейна-Йенссна, исключая использование продуктов экспрессии.

1 ^ель настоящего изобретения заключалась в разработке Способа получения антигена

Стр^ Б

EL 2W158&CI

молекулярной массой к Да из Mycobacterium bovis Bovinus-S, штамм 70(1201, который обладал бы высокой специфичностью и активностью, испоЛ ьзо ванн с которого и серологических постах ;шя клинической практики дало бы дополнительную информацию осу мораль] Ю м нмм у ином отлете при ТЕ к даннО му ai t thi et iy е реакциях им му н облоти] i La J и ИФЛ и охватило бы бОЛьсисе к ол и чсст во пациенто в с и од озрен нем да туберкулсан уЮ инфекцию.

Поставленная задача достигается тем, что в предлагаемом способе отмытые клетки Mycobacterium bovis Bovicius-Ä? штамм 700201 т рижды подвергают разрушению в гомогенизаторе Fast Prep 24™ в течение 45 с при скорости вибрации 6,5 мл/с, удаляют ю разрушенные клетки о помошыо центрифуг ирования при 7000 об/мин, выдержиаают еуперпатант при ++-6°С и течение 10 суток, повторно удаляют спонтанный осадок цез п рифугирО вакием, добавляют к cyiiepi 1ата нту лизирую щи й буфер, содержащий 0,2% додсцилсульфата натрия, 0,1 % 2-ß меркаптоэтаЕшла, выдерживаю т пробы при 100°С 10 мин.. фракционируют па колонке с использованием полиакриламидного геля Р (далее - ПАЛП-

Предполагаемое изобретение поясняется чертежами, па которых изображены:

Рис. L - Результаты иммуноблогиЕП а сывороток индивидуальных пациентов, больных туберкулезом с полными клеточными лизатами М. bovis штамм Valcc-88, M.bovis-Bovinus-8 штамм 700201, M.inLraiacelluhirc N 13N, М.avium, М. tuberculosis H37Rv TBC, 20 пггамм 700403f, В CG.

Рис.2 - Гистограмма препаративного фракционирования исходного материала еуперпатанта, полученно1"о разрушением на гомогенизаторе Fasl Prep 24™ клеток Mycobacterium txw i s Bcwinu4-8 штамм 700201.

Рис. 3 - Результаты н мм у] юблогш па отдельных фракций, полученных препаративным 25 электрофорезом в полиакриламидном геле.

Рис. 4 - Денси гограммы фракций, получсЕшых препаративным электрофорезом в 9f?fc полнакриламидном геле.

Рис. 5 - Показатели ОП И ФА фракции N¡>9 с гипсрнммуппой сывороткой крови кролика.

за Заявляемое тех» ичеекое peuiei те отл и чается ОТ прототш La тем, что к лето ч н ая м асса отмывасгся от остатков питательной среды, суспендируется 3-5 мин в 0, L М ФБР, pH 7,2-7,4 л стеклянном гомогенизаторе для получения однородной массы микобак терий, снятых с т вердой питат ельной среды, затем гомогенные слетки разрушают на приборе MP Biomedicals FastPrcp-24™ instrument с использованием пробирок B]ue LysinЕ[ Matrix if В с шариками из карбида кремния, диаметром 0,1 мм (объем пробирки -2 мл). Режим обработки: скорость вибрации 6,5 мл/с, время об работки 45 с, количество повторов -3, временной интервал между обработками 10 мин. По Окончанию обработки про бирки в ыдерживаЮг не менее 5 мин при кОннат но й tcmiicpaiyрс дл я осажде] du частиц карбида кремния, осторожно отбирают не осевшую, верхнюю часть раствора. Отобранный л? материал трижды встряхивают па Vortex V 1 plus (BioSar) по 50 с, интервал между вст ряхиваниями составляет 3 мин, затем взвесь центрифугируют 7 мин. при 13000 об/ мин. К отобранЕз ому cyiicpHата нту доба вл яют л изи ру ю]циЙ буфер, состоящнй из 0.0625 М трио-HCl (pH 6.Й), 0,2^ SDS и 0,lit 2-р-мерканто:}танола, разливают по I мл в 1,5 мл пробирки 'тпендорф и помещают их в термошейкер TS 100, используя термоблок SC is LS íl2yl,5 мл) «BIOSAN». Пробы инкубируют 10 мин. при 100DC, скорость вращения термоблока - 500 RPM (полученный материал служит основным для проведения дальнейших работ). Далее пробы вносят в колонку прибора Mini Prep Cell фирмы BIO RAD. Фракционирование антиген i to го материала Проводят на 17 см колонке,

Стр: -.

EU 2№ 58b Cl

заполненной 9% ПЛЛГ. Пробы собирают на коллекторе фракций FRAC 100 (Pharmacia LK В h, спектрофото метрический контроль осуществляют ]|ри помощи Optica] unil UV-I и Control Unit UV-1 (LKB), результаты документируют на самдпиС^с RecoderRec, МОдслЬ 102 (LKB>, скорость липоции регулируют перестал ьтическии насосом Peristahie pump л Varioperpex (LKB>. Условия разделения: напряжение 0,25 А, скорость элюцнн 500 мкл/ 10 мин.. Белковый состав определяют аналитическим электрофорезом в 12,5'£ ПААГ, б присутствии 0Л % додецил сульфата нат рия ico Laemiinli U.K. [LS], перепое па нитроцс. uno лозную мембрану (Suppolcd nitroccllulose memhrane 0,45 30 сшхЗ тп rol] фирмы BIO RADl осущест вляют по Towbin Н. [19]. ееролозичеекую активность ю опредСЛЯЮТ и реакции имузюблотнзпа с использованием гипсриммуЕзной СыворОтЩ крови кроликов, порученной Путем гипериммунизацин кроликов натавными кпеткамн Mycobacterium bovis Bovinus-ft, штамм 70020 L по описанному ранее методу [17].

Ранее проведенные исследования по изучению серологической активное™ индивидуальных сывороток крови больных ТБ к Полным клеточным лизатам м микобактерий (М bovis шт амм Vake-S8, М. bovis Bovinuü-8 штамм 70020],

М. i nlraraec Ни Lare N 13N, Maviom, M. tuberculosis H37Rv TBC, una мм 700403f, BCG-]) показали высокую активность антигенов полных клеточных лнзатов М. bovis Bovinus-S штамм 70020J и BCG-I, молекулярная масса которых располагалась в области 26 кДа и 2S-30 кДа из которых наибольший интерес представлял антиген С молекулярной 20 м ассой 2 8 к Да, показавший наибольшую актн bi гость. При с крн ез и ез гово и йбслрдо ва н ии индивидуальных сывороток больных ТБ серологическая активност ь к антигену М. bovis Bovinus-fl штамм 700201 молекулярной массой 2ít к Да регистрировалась у 35-40% Пациентов. Этот факт явился предпосылкой проведения раб ОТ ПО выделению антигена с молекулярной массой 2Й к Да и:; клегок М. bovis Bovinus-8 штамм 700201, показавшим 25 мажорную серологическую активность с сыворотками крови больных ТБ, для

дальнейшего изучения свойств дискретного препарата антигена 28 кДа и использования его в серологических реакциях ори изучении гуморального иммунного ответа у ТБ пациент ов. Полученные результаты иммуноблотнзп а полных клеточных лизатов микобактерий на примере 2-х индивидуальных сывороток крови больных ТБ поясняются .Uff рисунком 1.

Антиген изМ-bovis Bovinus-íl штамм 700201 для изучения гуморального иммунного ответа в реакции иммуЕзоблотиЕзга у больных ТБ получают следующим способом.

Пример I. Исходным сырьем для получения антигена служат клетки Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 7ГЮ201, Выращенные ез а твердой питательной срсдеЛсвсзпптсЙЕэа if ЙеносЕза в т ечение 30 сут.

]. Клетки Mycobacterium bovis Bovinus-ft, штамм 700201, полученные из Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр экспертизы средст в медицинского Применения» Минздрава России (г. Москва}, адаптировали к среде Лсвенштсйна-Йснссна в течение (> месяцев, постепенно снижая время между пересевами лт с (S0 до 30 суг.

1. Клетки снимали с Поверхности твердой питательной среды екреоком, промывали ОТ Остатков питательзюй среды дистиллированной водой, отделяя клетки центрифугированием при 7500 об/мин (+í?-]0DC) в тсчсезис 30 мин, супернатаит декантировали, осадок заливали новой порцией дист иллированной воды, встряхивали ¿í на ворисксс и везовь цсезтрифуЕировали. Данную ]|роцедуру повторяли т ри раза.

3. ОсадОк отмытых клегок гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе не менее 3-5 мин для получения однородной массы в 0, ] М ФБР (фосфатный бу^крпый раствор), pH 7,2-7,4, клетки вновь осаждали центрифугированием при 7500 об/мин (+8-]0D0 30

Cip.: Т

RU 2 5Sb CI

mlhl. СуЕзернатаЕзт сливали и Стерильную емкость, осадок вновь гоногеюйнрйвали, дОвОдя консистенцию до однородной массы и вновь осаждали центрифугированием. Данную процедуру повторяли 5 pat.

4. После последнего центрифугирования к осадку клеток добавляли О, I М ФБР, рН 3 7,2-7,4, клетки вновь гомогенизировали и разводили по стандарту мутности до конечной

концентрации Ш млрд. клеток/мл.

5. 10 млрд. взвесь клеток в объеме 1,8 мл вносили л 2 мл пробирки Blue Lysine Matrix В с шариками из карбида кремния, диаметром 0,1 мм (объем пробирки 2 мл) и 3 раза обрабатывали на Гомогенизаторе FastPrcp 24™. Режим обработки: скорость вибрации

ю 6,5 мл/с, и рем я обработки 45 с, количество повторов - 3, временной интервал между обработками L0 мин.

6. Разрушенную клеточную массу выдерживали в Езробирках Blue I.yüin« Matrix В не менее 5 мин до пол i еого осажлепия шариков карбида кремния, раствор осторожЕзо отбирали в пробирки эппенд арф. объемом 2,0 мл, центрифугировали при 13000 об/мин

is (й-10аС), супернатант декантировали в отдельнуео смкость. В Езробирки Blue Lysine Matrix В вновь добавляли 1,5 мл 0,1 М ФБР, рН 7,2-7,4, встряхивали па вортекее в течение 50 с, интервал между встраиваниями составлял 3 мин, выдерживали не мсеэос 5 мин ;io пОлиОГО осажлепия шариков карбида кремния, раст вор осторожно отбирали и пробирки глпзсЕздорф обьемом 2,0 мл, Центрифугировали 1Ери 13000 об/нин (8-10°С), л* супсрнатант объединяли с супернатантом 1]ослс 1-го центрифугирования. Данную ПрОфСДУРУ повторяли 3 раза.

7. К (л обраЕНЕОму супер Езатазпу добавляли лизирузосций буфер (0,0625 М трис-НС] (рН б.й), 0,2% SDS и 0,1% 2-Р-меркаптоэтанола), перемешивали, разливали !зо I мл в 1,5 мл пробирки :>ппсз1лорф и помещали их в термошейкер. Пробы выдерживали 10

25 мин з1ри ЮО^^Г скорость иращсЕзин термоблока Составляла 500 RPM. Приготовленный таким образом препарат являлся исходным материалом для дальнейшей работ ы.

Пример 2. Су пернатант обработаЕэпый лидирующей смесью при lOODC далее использовали для преЕзаратишЕоз о выделения iEa приборе Mini PncpCell фирмы BIQ RAD.

.j» I. В стеклянную трубку д и а метром 0,5 мм, длиной 17 см взюсили ЧЧс- ПААГ с катализаторами до отметки 14 см, оставляли isa ночь (Еэа I0-L2 часов) до полной полимеризации, далее дО Отметки 15 см вносили концентрирующий гель (2 см), и выдерживав]и 40 миез до завершения полимеризации. До отметки 16 см ( I см) вносили термически обработанный суЕзерз1атазгт, на еэсго осгорожио наслаивали трис-глиниповый if электрод еэый буфер <0,025 М н 0,193 М cot л ветст 1зсз i ез о), содержа щий 0,1 % SDS. Верхний и нижний коезцы стеклянной трубки соединяли с резервуарами, содержащими Электродный буфер и подавали напряжение Процесс разделения вели при постоянной силс тока.

2. Пробы собирали на коллекторе фракций FRAC 100 (Pharmacia LKB),

•/О СПСКТрОфОТОМСТрИЧССЕНЙ контроль OIетиЧССКОЙ ПЛОТНОСТИ осуществляли ]|ри длине волны 280 3IM па Optical unit UY-1 и Control Unit ITV-1 (LKB), результаты детектировали на самописце Rccoder Ttec, модель 102 (LKb>. скорость движения бумаги составляла 0,5 мм/мин, скорость 'злвдцин регулировали перистальтическим 1Еасосом PcristaLtic punp Variopcrpex (LKB). Условия разделения: 1Еа1Еряже1Еие 0,25 А, скорость Дпнэцин 500 мкл/ ■f.f 10 миз е . П ол у чен ез ьсе результ ат ы i ipcE] ара гиBI ео е о электрофореза поясняются рису] i ком 2.

3. Аналитический электрофорез отобранных фракций проводили в 12,5% ПААГ, в Присутствии 0,1 % SDS и переносили на нитроцеишзо лозную мембрану. Мембрану после

Стр.: а

К LI 2W15S&CI

Переноса примысли к высушивали. Имм^ноблОтикг проводили С гниериммупной сьширо гкой КрОви кролика, полученной против нативиых клеток Mycobacterium bovis Bovinus-8, una мм 700201. Полученные результаты нммуноблтиша поясняются

рИСуЕЗКОМ

f Результаты докумешнровал и на сметемс гсльдокументнроил]<ия Gel Doc XR+ фирмы BIO RAD, и обрабатывали с использованием программы Intake Lab Software 5. L. Результаты программной обработки и виде депенто грамм поясняются рисунком 4.

По результатам анализа дснеитограмм фракция зфедетавляла мономерезый антиген с высокой ссролоз ической активностью. Анализ денситограмм фракций №10, ¡о II1, 12 выявил раЗДвпгнис мономерной (фракции ]ia 2 составляющие Отмер: 2 мономера). Антиген №9 препаративно нарабатывался в количестве достаточном для проведения исследований, объединялся и использовался для дальнейшей работы.

Пример 3. Препаративно наработанная фракция .Nti9 была также использована для сенсибилизации лунок СТрипированнык нлапшегов ВИЛИ «Медзюлимср* для is о пределе! шя его е пепифи ч i Еоетн и азст ивез ости в ИФА

]. Фракцию М вносили в стрипироваипые лунки планшета ВНИИ «Медполимср* в объеме 120 мкл с последо вател ы еым днукраттз ым разводе!lhcm , планшеты вы держивал и 24 чаеа сзри комнатной температ уре.

2. По истечению 24 часов. Планшеты трижды промывали дистиллированной водой за и высушивали при комнатной температуре.

3. Реакцию иммунофермептпого анализа (ИФА) проводили с гипернммуниой еыиороткой крови кролика, полученной к нагивным клетам Mycobacterium bovis Bovinus-8, штамм 70020J. Б качест ве козгыозата использовали anti rabbit TgG, меченный псроксилаюй, производства фирмы ■vSiemia^. Полученные результаты ИФА поясняются

25 рисуЕэком 5.

П ри веде ез i еыс резу л ьтаты И Ф А с вид стел ьству ют о высокой специфичности фракции к гипериммунной сыворотке крови кролика, iioji учен ез ой против нативз1ых клеток Mycobaeteriinin bovis Bovinus-Я, штамм 700201.

Таким образом, фракция .4*9 можс1 в дальнейшем использоваться в качест ве ,к> маркерного антитена для создания днагиостической панел ез п ри разработке ИФА и мультиплексных тестов для выявления специфических ант ител в сыворотке крови больных туберкулезом. Список литературы

1. Васильева И. А., Белнловский Е. М., Борисов С.Е., Стерли ко в С. А. Глобальные jf отчеты Всемирной организации здравоохранения по туберкулезу, формирование и

изггсрпрстацня //Туберкулез и болезни легких. - 2017. - Т. 95, №5. - С. 7-16.

2. Васильева И. А., Бслшювский Е. М., Борисов С. Е., Стерли ков С. А. Заболеваемость, Смертность и распространенность как показатели бремени туберкулеза в регионах ВОЗ, странах мира ез в Российской Федерации. 'Часть 1. Заболеваемость и

« распространенность туберкулеза И Туберкулез и бо.лсзЕзи легких. -2017.-Т. 95, №6. -С 9-21.

3. Васильева И.А. Обращение главного редактора журнала Туберкулез ез болезни легких, президента РОФ/АФР, президента фонда им. М.И. ПерсльмаЕза, главного фтизиатора Минздрава России Н Туберкулез ез болезни легких, 2017 г., т. 95, .Ч°4, с. 5.

•S5 4. Гул еокиз i A.M., X исматулли ез а Н. А., Хаертьн еов К.С. и др. Исполъзо ваз ше анти гсез ов микобактерий M.bovis BCG-I, M.bovis-8 и М .bovis Valee-ftS для иммуноферментного анализа сывороток крови крупного рогатого скота // Труды Всероссийского НИИ Экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. - 2013- - Т. 77. - С. 200-203.

Е

RU 2 691 586 CI

5. Цибулькин А.П., Хасртынова И.М., Уразов Н.Г., Хасртынов К.С. Скрининг диагностического потенциала нативных белковых фракций Mycobacterium tuberculosis методом иммуноблотгинга// Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - Т. 61, №2. - С. 90-102.

s 6. Сотников Д.В.. Жсрдев А.В., Авднснко В.Г., Дзантисв Б.Б.

Иммунохроматографическая серодиагностика туберкулеза с использованием конъюгата коллоидное :юлото-а1ГГИГсн // Биотехнология. - 2015. - №2. - С. 76-81.

7. Яковлева Л.Ф. Сравнительная эффективность иммуноферментных тест-систем для выявления маркеров туберкулезной инфекции. Иммунология, аллергология,

ю инфсктология. 2007, №2: 59-64.

8. Валисв Р.Ш., Валиев Н.Р., Хасртынова И М.. Хасртынов К.С. Анти-ТБ антитела класса IgG в сыворотке крови больных туберкулезом, ВИЧ-инфекцией и при их сочетании //Туберкуле» и болезни легких. - 2014. - Т. 91, JSs9. - С. 14-15.

9. Хисматуллина Н.А., Хасртынов К.С., Шуралев Э.А., Гулюкин А.М., Ахмадеев is РМ . Найманов А.Х. Получение антигенов микобактерий М.bov is BCG-1, M.bovis-S и

М.bovis Valee для дифференциации поствакцинальных и постинфекционных антител // Ветеринарная медицина. - 2013. - №97. - С. 558-560.

10. Шуралсв Э.А. Мнкобактериальныс антиг ены: синтетические пептиды и рекомбинантные белки // Ученые записки Казанской государственной академии

20 ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2013. - Т. 216. - С. 403-407.

11. Дяглова В.И., Богун А.Г., БикстовС.Ф. Оценка ссродиагностичоского потенциала рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, полученных в разных экспрсссионных системах // Биотехнология. - 2014. - №1. - С. 72-78.

12. Яковлева Л.Ф.. Лысенко А.П., Суркова Р.К. и др. Иммунный спектр сыворотки 25 крови при различных формах туберкулеза и его влияние на результативность

серологической диаг ностики. Иммунопатология, аллергология, инфсктология. 2004, 2: 129-132.

13. Справочник но микробиологическим и вирусологическим методам исследования, иод редакцией М.О. Биргсра, Москва, ««Медицина», 1982, с. 141-142.

ю 14. Всемирная организация здравоохранения. Доклад о глобальной борьбе с туберкулезом 2016 год.

15. Global Tuberculosis Report 2016. WHO/HTM/ГВ/ 2016.13. Geneva World Health Organization, 2016.

16. M.O. Odubanjo, H O. Dada-Adegbola The microbiological diagnosis of tuberculosis in a 35 resource - limited setting: is acid-fast bacilli microscopy alone sufficient. Ann Ibd. Pg. Med 2011.

Vol. 9, No. 1 24-29.

17. Bailey, G.S. The production of antiscra / G.S. Bailey // Methods in Molecular Biology -1984.-V. l .-P 295-300.

18. Lacmmli. U.K. Cleavage structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 м / U.K. Lacmmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P 680-685.

19. Towbin H., Staehelint Т., Gordon J. Elcctrophorctie transfer of proteins from polyacrylamidc gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76 (9): 4350-4354.

Рис. 1

*5 Результаты иммуноблотинга сывороток крови индивидуальных пациентов, больных туберкулезом с полными клеточными лизатами М. bovis штамм Valcc-88, М. bovis Bovinus-8 штамм 700201, MAntraraccllularc N 13N. М. avium, М. tuberculosis H37Rv ТВС. штамм 700403f, BCG

Cm: W

RU 2(»1 536 CI

1 - M. btwiü штамм Valec-fi8,2-M.bovis Bovinus-8 ппаим 700201,3-Minlnaraoclliilan; N 13N, 4-M.3yiuiü, VM.tuberCofosis H37Rv TBC una мм 7004(Ш,й-вакцинный штамм БЦЖ-1 (производитель МикрОгсн), М-маркер молекулярных viatc Broad Range (Bio Rad).

Рлс. 2

J Гистограмма препаративного фракционирования исходного материала супернатанта. Полученного разрушением па i ом огени заторе FaüiPicp 24™ клетоя; Mvwbactfriurn bovis Bo\rmus.-R штамм 700201.

По оси абсцисс - номера фракций но оси ординат-оптическая плотность, вираже]шая в единицам оптической плотности (c;i.on.) ]ipn длине волны 280 им. Данные получены ю при использовании Optical unit UV-1 И Control Unit UV-L (LKB I, самописца Reeoder model 102 (LKB).

Рис. 3

Результаты ееммунобдотинга отдельных фракций, полученных препаративным электрофорезом в полиакрилами;пшм геле. 4-19 номера фракций, собранных па if коллекторе фракций и нЭяггЫХ ДЛЯ переноса ita нитрОцеллЮлоЗКую мембрану

(Nitrocellulose Membranes, 0,45 рШ, transfer of a broad range of proteins and nucleic acid. Bio Rad Laboratory, Germany^. Для выявления серологической активности фракций использовали гипериммунную сыворотку кролика, полеченную к нативным клеткам Mycobacterium bovis Bovinuü -Я штамм 700201. да Рис. 4

Денситограммы фракций, полученных Препаративным жсктрофорезом в полиакриламидном геле

Рис. 5

Показатели ОП И ФА фракции №9 с гипериммунпой Сывороткой крови кролика

К+ ] ипериммутшая с и воротка крови кролика, полученная к нативиым клеткам Mycobacterium bovis Bwinus-ft штамм 70020k

К- отрицательная сыворотка крови кроликов (пул|.

(57) Формула изобретения w Способ получения антигена из Mycobacterium bovis Bovinus-8 шт амм 700201 молекулярной массой 28 кДа для изучения гуморального иммунного ответа, включающий культивирование возбудителя натвердой питательной срсчеЛсвснштсйна-И споен а, разрушение отмытых клеток и фракционирование препаративным электрофорезом, Отличающийся тем, что Отмытые клетки трижды подвергают Li разрушению в гомогенизаторе Fast Prep 24 в течение 45 сек при скорости вибрации А,5 мс, удаляют разрушенные клетки е помощью центрифугирования при 7000 об/мин, Выдерживают су пернатант при +4-б°С в течение 10 дней, повторно удаляют спонтанный осадок центрифугированием, добавляют к супер] ¡атапгу лидирующий бу<|>ср, содержащий 0,2% додецилсульфата натрия, 0,1^2-0 меркаптотианола, выдерживают проб и при ^ I0Q°C 10 минут, фракционируют на колонне, С использованием <)% [[олиакриамидпого геля.

RU 2 691 586 CI

Рис .3

Результаты иммуноблотинга отдельных фракций, полученных препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле. 4-19 номера фракций, собранных на коллекторе фракций и взятых для переноса на нитроцеллюлозную мембрану (Nitrocellulose Membranes, 0,45щп, transfer of a broad range of proteins and nucleic acid, Bio Rad Laboratoris, Germany). Для выявления серологической активности фракций использовали гипериммунную сыворотку кролика, полученную к наггивным клеткам Mycobacterium bovis Buvinus -8 штамм 700201.

Рис.4

Денситограммы фракций, полученных прспаратиииым электрофорезом н 9%

полиакриламидном пгле