Получение антигенов Mycobacterium tuberculosis и выявление наиболее значимых из них для диагностики туберкулеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Алфредо Элдер

• Алфредо Элдер
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алфредо Элдер

СОДЕРЖАНИЕ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика микобактерий

1.1.1. Mycobacterium tuberculosis — возбудитель туберкулеза человека

1.1.2. Особенности строения Mycobacterium tuberculosis

1.2. Туберкулез человек

1.2.2. Роль Т-лимфоцитов в формирования иммунной защиты от Mycobacterium tuberculosis

1.2.3. Гуморальнный иммунный ответ при туберкулезе Mycobacterium tuberculosis

1.3.Диагностикая туберкулеза

1.3.1.Бактериоскопия и бактериогический метод диагностики Mycobacterium tuberculosis

1.3.2. Метод полимеразной цепной реакции

1.3.3. Иммунодиагностика 3

1.4.Антигены Mycobacterium tuberculosis 42 1.5.3аключение по обзору литературы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Штаммы бактерий и биологические препараты

2.2. Питательные среды для культивирования Mycobacterium

tuberculosis

2.3. Основное оборудование

2.4. Основные реактивы

2.5. Условия проведения анализов

2.5.1. Условия проведения иммуноферментного анализа

2.5.2. Условия проведения электрофореза

2.5.3. Условия проведения иммублотинга

2.5.4. Гель фильтрация на сефадексе G-200

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И PIX ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выявление секретируемых антигенов Mycobacterium tuberculosis

3.2. Выделение антигенных комплексов из фильтрата культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis с помощью этонола

3.3. Выделение антигенных комплексов Mycobacterium tuberculosis фильтрата культурального супернатанта методом

ультрацентрифугирования

3.4. Спектр белков различных видов микобактерий

3.5. Получение антигена с молекулярной массой 45 кДа из клеток Mycobacterium tuberculosis

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 76 ВЫВОДЫ 79 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СПИСОК СОКРАЩЕНИИ АГ антиген

АТ антитело

БКБ бикарбонат-карбонатный буфер

БСА Бычий сывороточный альбумин БЦЖ вакцина против туберкулеза ( ВСвО ВИЧ вирус иммунодефицита человека ГЗТ гиперчувствительность замедленного типа

ГКГС главный комплекс гистосовместимости ГМ-КСФ гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ДАТ 2,3-диацилтрегалоза

ДК дендритные клетки

ДСН додецилсульфат натрия

дмсо диметилсульфоксид (СНз)2&0

ИЛ интерлейкин

ИФА иммуноферментный анализ

ИХА иммунохроматографический анализ

кДа молекулярная масса в килодальтонах

Мф макрофаг

НЦМ нитроцеллюлозная мембрана

оп оптическая плотность

ПАГ полиакриламидный гель

ппд очищенная белковая фракциея (туберкулин)

ПТАТ противотуберкулезные антитела

ПЦР полимеразная цепная реакция

РАГА реакции агрегатагглютинации

РГЧЗТ реакция гиперчувствительиости

РИА радиоиммунный анализ

РИЛ раствор для разведения исследуемых проб

РПГА реакция пассивной гемагглютинации

РСК реакция связывания комплемента

спид синдром приобретённого иммуннодефицита

ТАТ триацилтрегалоза

ТБ туберкулез

ТЕМЕД ТУ'-тетраметилэтилендиамин

Т-Лф лимфоцит

ТМБ туберкулезные микобактерии

ТМБ тетраметилбензидин

ФГА фитогемагглютинином

ФКС фильтрат културального супернатата

ФИО фактор некроза опухоли

ФСБ фосфатно-солевой буфер без твина

ЦБ цитратный буфер

СБ4 лимфоциты -Т-хелперы (ТЫ и ТЬ2)

СБ4/СБ8 иммунорегуляторный индекс

СБ8 лимфоциты - Т-супрессоры/киллеры

НЬА человеческие лейкоцитарные антигены

ик натуральные киллеры

тья Толл-подобный рецептор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение антигенов Mycobacterium tuberculosis и выявление наиболее значимых из них для диагностики туберкулеза»

Введение

Актуальность проблемы. Туберкулез представляет собой важную медицинскую и социально-экономическую проблему во всем мире. Анализ сложившейся эпидемиологической ситуации показывает, что заболеваемость туберкулезом в России носит характер эпидемии [Карпов, 1998; Пунга., 1999; Онищенко, 2002]. По данным ВОЗ в период с 2000 по 2020 гг. туберкулезом в мире заболеет около 200 млн. человек, умрет около 35 млн. человек, будут инфицированы приблизительно 1 млрд. человек [World Health Organization., 2009]. В связи с этим, одной из важных задач мировой медицины является разработка надежных (эффективных и специфических), простых в использовании, методов для быстрой диагностики туберкулеза.

Важную проблему в настоящее время представляет сам возбудитель заболевания, в частичности его способность к выживанию в среде обитания и все увеличивающееся число устойчивых к противотуберкулезным препаратам первого ряда (стрептомицину, изониазиду, рифампицину и этамбутолу) форм, в том числе одновременно к нескольким (поли- и мультирезистентных), особенно у впервые заболевших [Dwyer et al, 1993; Díaz-Infantes et al., 2000]. Микробиологические исследования играют в современных условиях важную роль в выявлении, диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза, выборе лечения, оценке его эффективности.

Следует отметить, что из-за многообразия форм туберкулеза диагностика этой болезни весьма сложна. Обязательный диагностический минимум включает обследование с использованием клинических анализов крови и мочи, физикальных, рентгенологических, микроскопических и бактериологических, а также иммунологических методов.

В нашей стране при диагностике туберкулеза большое внимание уделяется культур альным методам. Однако культивирование с момента посева инфекционного материала занимает от 2 до 8 недель [Клименко с соавт., 1985; Литвинов с соавт 2004], что является существенным недостатком. За рубежом большее внимание уделяют микроскопии мазков, с использованием

флуоресцентного метода. В обоих случаях отмечается низкая эффективность диагностики — выявляются не более 14% больных [Калюк с соавт 1995]. До недавнего времени наиболее чувствительными и широко применяемыми методами для выявления антител к Mycobacterium tuberculosis являлись реакции пассивной гемагтгаотинации (РПГА) по Бойдену, агрегатагтлютинации (РАГА), связывания комплемента (РСК). В настоящее время используются для постановки диагноза более чувствительные серологические методы, такие как иммунофлуоресценция, радиоиммунный (РИА) и иммуноферментный анализы (ИФА).

Фактически серологические методы наиболее удобны для клинической и эпидемиологической работы по диагностике туберкулеза, так как для анализа используется легко доступный клинический материал - сыворотка или плазма крови человека. Однако эти методы, включая метод ИФА, не обладают достаточной диагностической чувствительностью [Туберкулёз., 2002].

На использованных в недавнем прошлом антигенных препаратах у лиц с установленным диагнозом туберкулез, ГГГАТ обнаруживаются в 100% случаях только при фиброзно-кавернозном туберкулезе и при бакгериовыделении [Карпов, 1998]. Однако больные с фиброзно-кавернозной формой туберкулеза составляют небольшую часть от общего количества больных туберкулезом. При очаговом туберкулезе ГГГАТ обнаруживают только в 31% случаев, а при туберкулезе бронхов - в 15,5% случаев [Карпов., 1998]. В более поздних публикациях также отмечается не очень высокий процент выявляемости ГГГАТ, в среднем в 71% случаев [Чуканов и Слогоцкая., 2007].

При применении отдельных рекомбинантных антигенов Mycobacterium tuberculosis, выявляемость ПТАТ в сыворотках больных туберкулезом, за исключением ВИЧ инфицированных пациентов, также невысока - около 60% [Mukherjee et al., 2004]. Есть сведения, что использование набора значительного количества рекомбинантных антигенов приводило к улучшению результата: ПТАТ выявляли у 93% больных туберкулезом [Houghton et al., 2002; Wang et al., 2005]. Но, поскольку не ясно, у пациентов

с какой формой туберкулеза обнаруживали такой высокий процент ПТАТ, трудно оценить диагностическую ценность предложенного набора антигенов.

В последние годы стало возможным применение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики туберкулеза, но из-за высокой стоимости анализа этот метод пока не получил широкого распространения. А если принять во внимание количество носителей палочки Коха в мире, и что большая часть их проживает в бедных и слаборазвитых странах, то вряд ли метод ПЦР будет приемлем в ближайшее время для скрининговых исследований.

Особо остро проблема туберкулеза встала с возникновением и распространением ВИЧ-инфекции. На фоне этого заболевания туберкулез развивается очень стремительно. Используемые в настоящие время скрининговые тест-системы, в связи с недостаточной чувствительностью, не позволяют своевременно выявить развитие этого заболевания. Поэтому работы по совершенствованию тест-систем, основанных на серологических реакциях, являются актуальными.

Цель исследования:

Разработка способа получения антигенных препаратов Mycobacterium tuberculosis и изучение их серологической активности в ИФА и иммуноблотинге.

Основные задачи исследования:

1. Выявление антигенов Mycobacterium tuberculosis в фильтрате культурального супернатанта.

2. Определение целесобразности использования этанола для повышения активности и специфичности антигеновиз супернатанта Mycobacterium tuberculosis, предназначенных для использования в ИФА и иммуноблотинге.

3. Определение возможности повышения специфичности антигенов Mycobacterium tuberculosis, содержащихся в супернатанте, с использованием метода ультрацентрифугирования.

4. Определение особенностей антигенных спектров различных видов микобактерий.

5. Установление возможности использования комплексов Mycobacterium tuberculosis, выделенных из клеток с помощью экстракции 10% раствором ДМСО, для получения индивидуальных специфичных антигенов, пригодных для использования в реакции иммуноблотинга.

Положения, выносимые на защиту:

1. При культивировании в среде Сотона в течение 14-28 суток Mycobacterium tuberculosis штамма «Академия» в фильтрате супернатанта обнаруживаются белки с молекулярными массами 38 кДа, 29-31 кДа и 6,5 кДа.

2. Осаждение этанолом фильтрата культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis приводит к повышению активности антигенсодержащего материала и позволяет избавиться от значительного количества балластных, нереагирующих с противотуберкулезными антителами, белков.

3. Метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы позволяет выделить из супернатанта Mycobacterium tuberculosis материал с более высоким содержанием специфических антигенов.

4. Классические приемы очистки белков, такие как осаждение их при определенных значениях pH, использование этанола, высаливание сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией, позволяют получить из ДМСО-экстракта М. tuberculosis антигенный препарат, содержащий практически одну серопозитивную фракцию с молекулярной массой в 45 кДа.

Научная новизна. Выявлены особенности антигенного профиля Mycobacterium tuberculosis шт. «Академия». Среди секретируемых белков серологическую активность проявляли доминирующий белок с молекулярной массой 38 кДа и белки 31 кДа, 29 кДа и 6,5 кДа. Белок с молекулярной массой 45 кДа присутствует в значительных количествах в спектрах белков Mycobacterium tuberculosis, М. intracelliilare М. avium и практически не

выявляется у М. bovis и вакцинного штамма БЦЖ. Это позволяет использовать данный антиген в качестве компонента тест-системы, выявляющей противотуберкулезные антитела в сыворотке крови людей, инфицированных патогенными микобактериями, а также исключить из круга подозреваемых лиц, вакцинированных БЦЖ.

Практическая ценность. Разработаны методы получения растворимых антигенных комплексов Mycobacterium tuberculosis из супернатанта (белки с молекулярными массами 38кДа, 29-31кДа, 6,5кДа) и клеточного антигена (белок с м.м. 45кДа). Определены приемы, позволяющие сохранить большую часть диагностически значимого антигенного материала и освободиться от значительной части балластных белков. Антигены М. tuberculosis 45 кДа, 38 кДа, 29-31 кДа и 6,5 кДа планируется использовать в разрабатываемой на основе метода иммуноблотинга тест-системе, необходимой практическому здравоохранению для эффективной диагностики туберкулеза.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Итоговых научных конференции КФУ (Казань 2011, 2012) , XIX Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2012», (Москва, 2012), III международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммуного ответа и развития опухли» (Казань, 2012), III Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнология» (Казань, 2012).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общая характеристика микобактернн.

По современной классификации микобактерии являются представителями филы BXIV Actinobacteria. Термин «актинобактерии» впервые появился во втором издании «Bergey's Manual of Systematic Bacteriology» (2001), В филу BXIV Actinobacteria входит класс Actinobacteria, который на основании гомологии 16S РНК подразделяется на 5 подклассов (Acidimicrobidae, Rubrobacteridae, Coriobacteridae, Shaerobacteridae, Actinobacteridae), 6 порядков и 10 подпорядков. В целом фила объединяет 130 родов. [Bergey's., 2012].

В физиологическом и морфологическом отношениях актинобактерии очень разнообразны; представлены бактериями с грамположительным морфотипом, использующими все известные варианты энергетического и конструктивного метаболизма, за исключением фототрофии. В этой группе есть хемолитотрофы, автотрофы и гетеротрофы по углероду (и/или азоту), а также хемоорганотрофы дыхательного и бродильного типа, в том числе паразиты. Благодаря своей липофильной клеточной стенке актинобактерии хорошо переносят высушивание. В отличие от большинства бактерий, они могут расти в воздушной среде. Кроме того, актинобактерии секретируют большое количество экзоферментов, что лежит в основе их высокой биологической активности. Фенотипы актинобактерий подразделяются на две основные группы. В первую группу входят не образующие спор одноклеточные актинобактрии разной формы, в том числе мицелиальные. Ко второй группе относятся мицелиальные актинобактерии, в том числе многоклеточные, образующие споры. Микобактерии отнесены к одной из семи групп низших актинобактерий и характеризуются как хемоорганогетеротрофы с аэробным дыханием, имеющих форму палочки или длинных нитей, обладающих выраженным ветвлением. Воздушный мицелий не образуют. Есть патогенные формы - это представители рода Mycobacterium (сем. Mycobacterifceae) [Пиневич, 2007 и Захарова и соав ].

В состав рода Mycobacterium включены неподвижные аэробные палочковидные бактерии с грамположительным морфотипом, иногда образующие длинные ветвящиеся нити. Для бактерий характерно высокое содержание липидов, фосфатидов и восков в клеточных стенках, что определяет их щелоче, спирто и кислотоустойчивость, поэтому бактерии плохо окрашиваются анилиновыми красителями. Для окраски применяют интенсивные методы, обычно Циля-Нильсена. Растут медленно или очень медленно; сапрофитические виды растут несколько быстрее. Некоторые виды образуют каротиноидные пигменты.

Большинство из представителей этого рода относятся к сапрофитным микроорганизмам, которые широко распространены в окружающей среде и лишь незначительное количество имеет клиническое значение [Ерохин с соав., 2008].

При классификации микобактерий учитывают патогенность для человека, способность к пигментообразованию, сокрость роста и способность к синтезу никотиновой кислоты. По патогенности выделяют патогенные (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium bovis); потенциально патогенные и сапрофитические микобактерии. Заболевания, вызываемые микобактериями, называются микобактериозами. По скорости роста выделяют быстрорастущие (дают видимый рост через 4-7 сутки), медленнорастущие (7-10 и более суток) и не растущие на искусственных средах {Mycobacterium leprae) виды. По способности образовывать пигменты выделяют фотохромогенные (образуют пигмент на свету), скотохромогенные (образуют пигмент в темноте) и нефотохромогенные (не образуют пигмента) виды. [Поздеев, 2001].

1.1.1 .Mycobacterium tuberculosis - возбудитель туберкулеза.

Туберкулез - хроническая инфекция, поражающая органы дыхания, кости, суставы, кожу, мочеполовые органы и др. Инфекционную природу заболевания доказал Вильмен (1867г.). Важнейшим этапом в изучении

возбудителя, совершенствовании методов диагностики и борьбы с туберкулезом стало открытие Р.Кохом в 1882г. Mycobacterium tuberculosis.

В настоящее время туберкулёз у человека вызывает условно выделенный комплекс М. tuberculosis, включающий в себя Mycobacterium tuberculosis (человеческий вид), Mycobacterium bovis (бычий вид), Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti, Mycobacterium canettii. В последнее время к нему отнесены Mycobacterium pinnipedii, Mycobacterium саргае, филогенетически имеющие отношение к Mycobacterium microti и Mycobacterium bovis. [Маянский., 2006].

Морфология и тинкториальные свойства. Неподвижные, не образующие спор прямые или изогнутые палочки, со слегка закругленными концами, или ветвящиеся нити. Бактерии имеют грамположительный морфотип, образуют микрокапсулу и формируют L-формы, сохраняющие способность к инфицированию. Методом Циля-Нильсена окрашиваются в ярко-красный цвет. Содержат кислотонеустойчивые гранулы (зерна Муха), располагающиеся в цитоплазме.

Культуральные свойства. Туберкулезные палочки могут расти как в аэробных, так и факультативно анаэробных условиях. Повышенное содержание двуокиси углерода (5-10%) способствует быстрому росту. Оптимальная температура роста -37-38°С; pH 7,0-7,2.Нуждаются в присутствии в среде глицерина, факторов роста (биотин, рибофлавин, никотиновая кислота и др.), белков. Для выращивания чаще всего используют глицериновые, картофельные с желчью, яичные, полусинтетические и синтетические среды. Наиболее оптимальна среда Левенстайна-Иенсена. На средах туберкулезные палочки обычно образуют R- колонии; под влиянием антибактериальных препаратов бактерии могут диссоциировать с образованием S-колоний. В жидких средах образуют сухую морщинистую пленку (на 7-10 сутки), поднимающуюся на рая пробирки; среда остается прозрачной. При росте бактерий на жидких средах, выявляют корд-фактор - важный дифференциальный признак вирулентности

(рост в виде серпантинообразных кос). На плотных средах рост отмечают на 14-40-е сутки в виде сухого морщинистого налета желтовато-кремового цвета. Зрелые колонии напоминают цветную капусту, крошковатые, плохо смачиваются одой. Культуры плохо снимаются со среды. [Поздеев., 2001]

1.1.2.0собенностн строения Mycobacterium tuberculosis.

Своеобразие микобактерий связано с необычностью их поверхностных структур.

Клеточная стенка. Электронно-микроскопически в клеточной стенке выделяют три слоя толщиной по 10 нм, поверхностный - микрокапсула, которая состоит из полисахаридов и играет важную роль в жизнедеятельности микобактерии, в том числе обеспечивает их устойчивость к неблагоприятным воздействиям. В клеточной стенке находятся видоспецифические антигены. Вакцины, приготовленные из клеточных стенок туберкулезных микобактерии, имеют разную вирулентность и иммуногенность. Наиболее выраженный иммунитет вызывают вакцины из клеточных стенок высоковирулентных микобактерий. Клеточные стенки вызывают в организме здоровых животных развитие гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), антителообразование. Однако их сильные сенсибилизирующие свойства и наличие в них токсического корд-фактора значительно осложняют гипериммунизацию этой фракцией микобактерии туберкулеза [Перельман., 2006].

Клеточная стенка микобактерий устроена сложнее, чем у других бактерий. В ней преобладают липиды (более 60% сухой массы), в том числе специфичные для микобактерий. Именно они определяют нестандартность тинкториальных, физиологических и экологических свойств туберкулезной палочки. Большинство липидов представлено миколовыми кислотами и их производными - длинноцепочечными (60-90 углеродных атомов), разветвленными жирными кислотами. Часть миколовых кислот ковалентно связана с пептидогликаном посредством арабиногалактана. При экстракции

хлороформом его получают в виде фракции «воск D». Миколовые кислоты образуют подобие палисада, определяя восковидность структуры. Но миколовые кислоты не только фиксированы в каркасе клеточной стенки. Они присутствуют и в виде свободных гликолипидов-сульфолипидов (сульфатидов) и корд-фактора. Снаружи клеточная стенка окутана слоем гликолипидов (микозиды). Микозиды структурно и функционально напоминают липополисахариды наружной мембраны грамотрицательных бактерий, но лишены их агрессивности. Тем не менее, они токсичны и, подобно корд-фактору и сульфатидам, вызывают образование гранулем [Маянский, 2006].

Еще одним компонентом клеточной стенки микобактерий является липоарабиноманнан. Он заякорен на плазматической мембране, пронизывает клеточную стенку и выходит на ее поверхность. В этом отношении он похож на липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий. Липоарабиноманнан представлен гетерогенной смесью высокомолекулярных липополисахаридов, углеводным компонентом которых служат разветвленные полимеры арабинозы и маннозы, а липидная часть состоит из диацилглицерольных производных пальмитиновой и туберкуло-стеариновой кислот. Особенности терминального фрагмента лилоарабиноманнана (прежде всего его маннозные радикалы - кэпы) существенно влияют на взаимоотношения микобактерий с макрофагами, вмешиваясь в патогенез туберкулезного процесса.

В составе клеточной стенки имеются белки, часть из них входит в состав диагностического препарата «туберкулин». Особую известность получил протеиновый комплекс под названием «антиген 85». Он состоит из трех близкородственных белков, которые относятся к числу сильных индукторов иммунного ответа против М. tuberculosis. Данный комплекс выполняет функцию фермента, соединяющего миколовые кислоты с трегалозой. Это делает его мишенью для новых антибактериальных препаратов, которые в настоящее время проходят испытания [Маянский.,

2006].

Цитоплазматическая мембрана. В состав цитоплазматической мембраны, расположенной под клеточной стенкой, входят липопротеидные комплексы. С ней связаны различные ферментные системы, в частности окислительно-восстановительные. В цитоплазматической мембране осуществляются процессы, ответственные за специфичность реакций микобактериальной клетки на окружающую среду. Цитоплазматическая мембрана микобактерий туберкулеза путем инвагинации в цитоплазму формирует внутрицитоплазматическую мембранную систему, или мезосому. Мезосомы полифункциональны. С ними связана локализация многих ферментных систем, они участвуют в синтезе материала клеточной стенки, выполняют роль посредника между ядром и цитоплазмой. Отмечено слабое развитие или отсутствие мезосом у авирулентных штаммов микобактерий туберкулеза и их L-форм [Тогунова., 1964]. Цитоплазма микобактерий туберкулеза состоит из гранул и вакуолей различной величины. Основная часть мелкогранулярных включений представлена рибосомами, на которых синтезируется специфический белок.

1.2.Туберкулез человека

Инфицирование человека Mycobacterium tuberculosis происходит различными путями: в большинстве случаев - случаев воздушно-капельным и воздушно пылевым путем, в редких случаях - алиментарным путем. Возможно также инфицирование через слизистые оболочки, конъюнктиву глаза, миндалин. [Bodnar et al., 2001, von Reyn and Vuola., 2002;]. У беременной женщины при тяжелой форме туберкулеза может произойти внутриутробное заражение плода. Решающими факторами для развития заболевания являются количество МВТ, попавшее в организм, и длительность контакта здорового человека с больным. Чаще всего болезнь возникает при семейных контактах с больным. Принято выделять два

патогенетических варианта туберкулеза. Первичный ТБ, который возникает у лиц, ранее не имевших контакта с возбудителем; он определяется особенностями врожденного иммунитета, в то время как реакции специфического иммунитета включаются значительно позднее. Вторичный туберкулез относят к разряду иммунопатологий. Особенности взаимоотношения человека с Mycobacterium tuberculosis представлены на рисунке 1.

Иммунный 11 ответ у

Рис.2. Схема взаимоотношений человека с М. tubérculos is [приведено из Маянский, 2006]

При первичном заражении человека, ранее не контактирующего с микобактериями и не подвергавшегося вакцинации БЦЖ, МБТ сразу же подвергаются фагоцитозу. Медиаторы, продуцируемые макрофагами в результате фагоцитоза, активизируют B-лимфоциты, обеспечивающие синтез антител. Несмотря на накопление в крови иммуноглобулинов, они не стимулируют иммунную систему. Кроме того, повышенная ферментативная активность фагоцитов обеспечивает развитие воспаления, реакцию ГЗТ и положительную кожную реакцию на туберкулин. Первичное заражение микобактериями сопровождается увеличением количества МБТ, однако их количество затем снижается наряду с возрастанием иммунитета, что приводит затуханию инфекционного процесса, [van Crevel et al., 2002; Ulrichs and Kaufmann., 2006]. Формирование ГЗТ происходит в течение первых 2-3 недель при инфицировании микобактериями или в результате вакцинации, а ярко выраженный иммунитет формируется через 8 недель. Иммунная реакция формируется на фоне действия вирулентного корд-фактора, который приостанавливает образование фаголизосом и лизирование микобактерий [Mathema et al., 2006].

Обострение туберкулезного процесса, сопряженного с интенсивным размножением возбудителя, характеризуется дальнейшими изменениями в иммунной системе больного: увеличивается число Т-супрессорных лимфоцитов, снижается активность Т-хелперов. В результате медленно развивающаяся гиперчувствительность ГЗТ затухает, что приводит к формированию некротической гранулемы. Малочисленная популяция возбудителя приводит к тому, что под воздействием медиаторов ГЗТ макрофаги направляются в очаг инфекции и создают условия для образования продуктивного экссудата или продуктивной гранулемы. Образование гранулем воспринимается как иммунный ответ организма на заражение возбудителем туберкулеза [Frieden et al., 2003]. Установлено, что при вторичном заболевании туберкулезом существенная роль принадлежит

иммунитету, сформированному при первичном заражении [Hernandez et al., 1990].

В результате перенесенного первичного туберкулеза, и даже в состоянии выздоровления, в очагах могут сохраняться как типичные МВТ, так и их L-формы. Они становятся причиной вторичного заболевания туберкулезом. Кроме этого вторичное заболевание может развиться в результате экзогенной суперинфекции при повторном внедрении возбудителя воздушно-капельным, воздушно-пылевым или алиментарным путями. В ходе иммунного ответа организма на распространение инфицированных макрофагов формируется воспалительный процесс, который приводит к некрозу тканей из-за разрушения макрофагов, [van Crevel et al., 2002]. Образующиеся в результате некроза тканей тромбы, препятствуют циркуляции клеток крови, в частности лимфоцитов и макрофагов, и ухудшается фагоцитоз МБТ. Приобретенный иммунитет ослабевает из-за нарушений в лимфатической системы при истощении организма из-за недостаточного питания, беременности, приема иммунодепрессантов, алкоголя, наркотиков, у онкологическх больных и больных сахарным диабетом [Ferraz et al 2006; Bierrenbach et al 2007]. Защитные механизмы, препятствующие проникновению в организм микобактерий, генетически детерминированы. Известна связь генотипов больных туберкулезом с HLA-антигенами, влияющими на выраженную активность Т- и B-лимфоцитов, и как следствие происходит активация или затухание инфекционнного процесса. У больных туберкулезом - носителей антигенов HLA, DR2 и В7 не происходит увеличения количества иммунокомпетентных клеток, даже после БЦЖ-вакцинации [van Crevel et al., 2002].

Изменения, происходящие в результате проникновении МБТ, в первую очередь являются локальными и опосредованы реакцией полинуклеаров с участием макрофагов. В дальнейшем они замещаются еще более совершенной формой защитной реакции, приводящей к фагоцитозу и лизису

МБТ. В основе киллинг-эффекта при фагоцитозе лежат кислород-зависимые механизмы уничтожения патогенов. Многие патогенны, в том числе, Mycobacterium tuberculosis, попадая внутрь макрофага сохраняют жизнеспособность. Однако, по завершении данного процесса, микобактерии, их клеточные фрагменты, гидролитические ферменты лизосом, монокины (интерлейкин 1) выходят во внешнюю среду и активируют Т-лимфоциты. Активированные Т-хелперы выделяют медиаторы и фактор ауторегуляции -интерлейкин-2. Под их влиянием в очаг инфекции начинается миграция вновь образованных фагоцитов. В связи с этим ослабляется и даже исчезает миграция, а энзиматическая активность макрофагов увеличивается. Активированные лимфоциты выделяют кожно-реактивный фактор, обуславливающий развитие воспалительной реакции и повышающий венозную проходимость. С этим фактором связывают положительную реакцию на туберкулин и ослабление ГЗТ.

Патологические изменения в организме больного в значительной степени вызваны продуктами самого возбудителя, которые появляются в процессе роста и при делении клеток. Эти вещества и фракции всесторонне изучены. Ведущая роль принадлежит корд-фактору, провоцирующему интенсивное воспаление, причем токсичность корд-фактора усиливают сульфатиды. Интенсивное размножение патогенна, происходящее в результате затухания фагоцитоза, сопровождается выделением токсических вещества, усиливающих интенсивность ГЗТ. Это приводит к появлению экссудативного воспаления и развитию казеоза. При этом отмечается увеличение числа Т-супрессоров и снижение количества Т-хелперов, приводящее к затуханию гиперчувствительности замедленного типа. В результате кожная туберкулиновая проба становится отрицательной, несмотря на то, что туберкулезный процесс усиливается. В том случае, если инфицирование осуществляется сравнительно малой бактериальной популяцией при ГЗТ и активном фагоцитозе, формируется туберкулезная гранулема. Последующая трансформация нейтрофилов, несущих антиген, и

хемотаксис мононуклеаров происходят под влиянием Т-лимфокинов. На различных стадиях заболевания количество бактерий и характер иммунного реагирования меняются, а природа морфологических реакций у больных туберкулезом носит разнообразный характер.

Попадание МБТ в организм через различные входные ворота инфекции приводит к развитию первичного воспалительного очага (первичный аффект), который локализуется в полости рта, миндалинах, кишечнике, печени или легких. В регионарных лимфатических узлах в результате первого контакта с возбудителем болезни начинается развитие специфического процесса, приводящего к формированию первичного туберкулезного комплекса. На начальном этапе может развиться очаговый туберкулез грудных лимфатических узлов, плеврит, туберкулема. У большей части больных (около 90%) первичный туберкулез протекает без клинических проявлений, у остальных отмечаются характерные признаки инфекции. Такое заражение сопровождается изменениями туберкулиновых реакций [Тегга2 et а1, 2006]. Первоначальное инфицирование может пройти бесследно или вызвать остаточные явления. В результате перенесенного первичного туберкулеза формируется адаптивный (приобретенный) иммунитет, оказывающий в дальнейшем влияние на сопротивляемость организма. Персистирующие микобактерии могут представлять угрозу для организма, так как они не только не поддерживают приобретенный иммунитет, а становятся фактором риска, приводящим к реактивации эндогенной инфекции и за счет увеличения популяции МБТ развитию рецидива болезни. Возобновление болезни, как правило, происходит при ослаблении иммунитета. Вторичный туберкулез может развиваться и другим образом - при повторном попадании МБТ в организм, однако для его развития недостаточно необходимо присутствие ослабляющих иммунитет факторов риска. Разнообразные клинические формы характерны для вторичного туберкулеза. Так установлены следующие патоморфологические изменения в легких и других органах: 1). хронические очаги с продуктивной

реакцией легочной ткани; 2). инфильтративные изменения с экссудацией легочной ткани и развитием казеозного некроза; 3).туберкулезная каверна, характеризующаяся распадом казеозной ткани с выходом через главные бронхи и образованием полости.

Для туберкулеза характерно волнообразное течение; характер течения заболевания (прогрессирование, обострение или исчезновение) обусловлен множеством факторов. Новые очаги болезни появляются в результате попадания МБТ в здоровую легочную ткань через кровь и лимфу. Развитие болезни и ее исход во многом определяется эффективностью лечения и от состояния защитных сил организма. Особое влияние на состояние защитных сил организма оказывает неполноценное в отношении белков и витаминов питание. Активации туберкулеза способствуют некоторые эндогенные факторы, в частности такие соматические заболевания как сахарный диабет, лимфогранулематоз, силикоз, язва желудка и двенадцатиперстной кишки, хронические воспалительные процессы и инфекции, ослабление организма после хирургических вмешательств, длительное лечение стероидами, цитостатиками, иммунодепрессантами, развитие иммунодефицита при СПИДе и воздействие стрессов. У ослабленных лиц и пациентов с иммунодефицитами, наблюдается диссеминированный туберкулез, характеризующийся образованием гранулем в различных органах. (Поздеев, 2001). Состояние развивается в результате попадания содержимого гранулемы в кровяное русло. Проявления такие же, как при вторичном туберкулезе, но к ним могут присоединяться поражение мозга и мозговых оболочек.

Одним из основных средств лечение туберкулеза остается лекарственная терапия. Применяют противотуберкулезные препараты первого ряда (изониазид, этамбутол, рифампицин и др.) и ихкомбинации, а также альтернативные препараты (канамицин, циклосерин, ПАСК, этионамид, виомицин, капреомицин и триацетозон). Даже эффективная комплексная и специфическая химиотерапия не всегда приводит к

выздоровлению, так как полное выздоровление зависит не только от лечения, но и от многочисленных факторов, влияющих на репаративные процессы в организме.

1.2.Иммуннын ответ при туберкулезе

На начальном этапе инфекционного процесса и попадании в организм единичных микобактерий нейтрализация патогена происходит с участием реакций врожденного иммунитета. Осуществляется удаление бактерий из органов дыхания посредством неспецифического механизма -мукоцилиарного клиренса, осуществляющего местную защиту слизистой оболочки органов дыхания от внешних воздействий, включая инфекцию. Аппарат мукоцилиарного клиренса состоит из реснитчатых клеток, образующих реснитчатый аппарат бронхов, трахеи, полости носа, непосредственно, ресничек со слизистым покрытием, которое вырабатывается секреторными железами бокаловидных клеток, клеток Клара и желез подслизистого слоя. Бактерицидным действием обладают легочные сурфактанты, которые способны подавлять рост бактерий и облегчают фагоцитоз бактерий в результате активности макрофагов и нейтрофилов. [Griese et al., 2004].

Фагоцитирующие клетки, чаще всего макрофаги, первыми взаимодействуют с МБТ. Макрофаги секретируют протеазы, вызывающие экссудативную воспалительную реакцию, и других хемокины, привлекающие полинуклеары и моноциты крови. Еще одна функция инфицированных Мф заключается в продукции широкого спектра интерлейкинов (ИЛ-1; 6; 8; 10; 12; 18;), ФНО-а и ГМ-КСФ, которые участвуют в деструкции и элиминации микобактерий. Развитие защитных реакций или формирование патологического состояния будут зависеть от соотношения этих веществ. Кроме того, Мф обеспечивают процессинг и презентацию антигенов МБТ Т-лимфоцитам [Levitz, Diamond et al., 1985; Garlanda, 2002]. Активная секреция и выброс ряда цитокинов и хемокинов усиливает миграцию циркулирующих в крови нейтрофилов в очаг инфекции

[Parket, et al., 2004; Belloccchio et al., 2004]. Нейтрофилы взаимодействуют с микобактериями, распознавая в их клеточной стенке терминальные фрагменты липоарабиноманнана и липогалактоманнана, и, прежде всего, их маннозные радикалы - кэпы. В распознавание Mycobacterium tuberculosis участвуют и другие рецепторы макрофагов, в частности CD 14, То1-подобные рецепторы (TLR-1,2) и рецепторы для СЗ-компонента комплемента (CR1-CR3). Разрушение патогенов происходит за счет активации кислородзависимых механизмов фагоцитоза, а также продуктов дегрануляции нейтрофилов [Abel et al 2002; Hayashi et al., 2003]. Процесс протекает быстро и эффективно, и большая часть патогенов погибает в первые часы инфекции [Kato et al., 2004].

Тромбоциты, тучные клетки, базофилы и эозинофилы, а также клетки эпителия, участвуют в защите против микобактерий за счет взаимодействия через То1-подобные рецепторы, усиливая реакцию, обусловленную нейтрофилами. Кроме того, нейтрофилы синтезируют дефенсины, представляющие собой полипептиды с антимикробной активностью и участвующие в повреждении патогенов [Liang and Sha, 2002; Proud et al., 2004].

Следует отметить, что, несмотря на активное включение механизмов врожденного иммунитета, противоборство Mycobacterium tuberculosis с организмом человека, часто завершается в пользу патогена. Тогда подключается система приобретенного иммунитета, которая формирует специфический иммунный ответ к возбудителю туберкулеза.

1.2.2 Роль Т- лимфоцитов в формировании иммунной защиты от Mycobacterium tuberculosis

Главным эффектором приобретенного противотуберкулезного иммунитета являются Т-лимфоциты, участвующих в реакциях клеточного иммунитета. СБ4+-клеткам принадлежит ведущая роль в контроле иммунного ответа, индуцированного Mycobacterium tuberculosis [Schaible U.E

and Kauffinann S.H., 2000; Alemán et al., 2002]. У обладающего устойчивостью к МБТ человека, в очагах туберкулёзного воспаления количество CD4+ Т-клеток вдвое превышает количество CD8+-KneTOK [Flynn and Chan., 2001]. Активное участие в иммунной защите против микобактерий, локализованных внутриклеточно, принимают также цитотоксические С08+-клетки [Stenger, 1997]. Недостаток ЦТЛ приводит к активации латентной формы туберкулеза [Nicholson, Kuchroo, 1997].

Снижение числа СБ4+-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных усиливает восприимчивость к заражению туберкулезом или к реактивации латентной инфекции [Barnes et al., 1992]. Известно, что популяция включает два типа клеток - Th-1 (клетки воспаления) и Th-2 (истинные хелперы), которые дифференцируются по отношению к антигенпрезентирующим клеткам (В-лимфоцитам, макрофагам и дендритным клеткам), типу синтезируемых цитокинов и потребностям в дополнительных стимулирующих факторах. Th-1 клетки секретируют ИФН-у и ИЛ-2, усиливающие антимикробное действие макрофагов, и ГЗТ. Кроме того, ИЛ-2 является фактором ауторегуляции Т-Лф, усиливая их пролиферацию и увеличивая концентрацию других цитокинов, активирующих макрофаги. Монокины - ИЛ-12 и ИЛ-18, синтезируемые макрофагами, инфицированными микобактериями, стимулируют С04+-лимоциты к продукции ИФН-у [Wang., et al., 1999]. В своих исследованиях Флинн также указывает на то, что ИЛ-12 индуцирует фагоцитоз микобактерий макрофагами и дендритными клетками, что ведет к развитию клеточного иммунного ответа с активным синтезом ИФН-у [Flynn, 2004]. Важность цитокинов ИФН-у и ИЛ-12 в формировании иммунного ответа Th 1-типа подтверждается на больных с повышенной чувствительностью к микобактериям. Такие пациенты имеют дефекты в структуре ИЛ-12, а также в структуре рецепторов к ИЛ-12 или к ИФН-у [Doffinger et al., 2002; Caragol et al., 2003; Lichtenauer-Kaligs et al, 2003].

Центральным цитокином, контролирующим туберкулезную инфекцию в организме человека, является ИФН-у, активирующий антибактериальную

функцию макрофагов. [Flynn,Chan., 1993; Strieter et al., 2002]. Он способен при совместном действии с ФНО-а усиливать антигенпредставляющую способность Мф и активировать реакции цитотоксических клеток - Т-Лф и натуральных киллеров [Rook, Attiyah., 1991]. Рядом авторов было показано, что недостаточная продукция ИФН-у является причиной интенсивного размножения микобактерий внутри клеток, что сопровождается тканевым некрозом и тяжелым течением инфекции. В свою очередь М. tuberculosis может ограничивать активацию Мф с помощью ИФН-у, что указывает на ведущую роль Т-Лф, активированных ИФН-у, в контроле над возбудителем туберкулеза [Cooper et al., 1997; Flynn., 2004]. Важной функцией С04+-клеток воспаления (Th-1) является формирование гранулем, содержащих зараженные макрофаги. Образование гранулем является одним из факторов защиты, ограничивающим распространение по организму возбудителя ТБ [De Bruyn et al., 1990; Со et al., 2004]. Адгезины эндотелия сосудов участвуют в процессе возвращения в легкие активированных Th-1. Кооперативное взаимодействие Мф и Th-1 обеспечивает формирование гранулем вокруг погибших Мф. Формирование гиперчувствительности к М. tuberculosis и инвазия патогена связаны с недостаточной активацией Th-1 и преобладанием Th- 2 клеток [Vassallo et al., 2000; Clemons et al., 2000]. Зрелые Th-1 клетки участвуют в активации С08+-лимфоцитов и обеспечивают защиту от внутриклеточных патогенов. Th-1 клетки также оказывают помощь фагоцитам, индуцируя слияние фагосом с лизосомами, что позволяет удалять патогены, локализованные в фагосомах [Mastroeni, 2002; Manca etal., 2004].

Th-2 клетки продуцируют группу цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10), участвующих в пролиферации и дифференцировке В-Лф, усиливая гуморальное звено специфического иммунитета. ИЛ-10 подавляет продукцию лимфокинов и монокинов, является антагонистом и ингибитором синтеза ИЛ-12. Кроме того, ИЛ-10 ингибирует конститутивную и индуцированную ИФН-у экспрессию молекул МНС II класса на Мф, что

приводит к ингибированию ответа с участием Th-1 клеток воспаления. Это предупреждает избыточное развитие воспалительных реакций и некроз тканей. Однако, повышенная секреция ИЛ-10, наблюдаемая при активном туберкулезе, подавляет эффекты с участием цитокинов, а также функции Т-Лф, что обуславливает недостаточное подавление ТБ-инфекции [Maeda et al., 1993; Boom et al., 2003].

Другие цитокины, в частности ИЛ-6, усиливают продукцию антител активированными В-лимфоцитами, что приводит к гиперглобулинемии, характерной для больных ТБ [Hirano and Kishimoto, 1990]. ИЛ-4 подавляет активность Мф и блокирует размножение Т-Лф. Все эти события способствуют подавлению иммунного ответа на М. tuberculosis [Но et al 1992]. Для роста Th-2 клеток необходим ИЛ-1, обладающий провоспалительным действием и привлекающий Лф и моноциты в зону воспалительной реакции. В ходе иммунного ответа на специфические антигены М. tuberculosis отмечается перекрёстная регуляция с участием Th-1 и Th-2 клеток, приводящая к доминированию одной из этих субпопуляций. Образование ИФН-у Th-1 клетками подавляет размножение Th-2 клеток, в то время как ИЛ-10, синтезируемый Th-2 клетками, подавляет активность Th-1 клеток, а ИЛ-4 - пролиферацию Т1г-1клеток воспаления [Maggi et al., 1992].

Важную роль в формировании иммунного ответа против М. tuberculosis выполняют CD8+ Т-Лф - цитотоксические клетки, лизирующие макрофаги, инфицированные патогенном, при участии ИЛ-2. Кроме макрофагов возможно инфицирование микобактериями паренхиматозных клеток, которые не распознаются CD4+ Т-Лф из-за отсутствия на их поверхности МНС II класса. Они распознаются только с помощью CD8+ Т-Лф. Известно, что CD8+ цитотоксические Т-Лф, распознающие МНС I класса, способны «освобождать» внутриклеточные микроорганизмы путем киллинга инфицированных клеток. При «нокауте» гена молекулы МНС I мыши становятся чувствительны к М. tuberculosis, так как антиген-специфические CD8+ Т-клетки не формируются. Т-Лф проявляют цитотоксическое действие

при участии двух белков - перфорина и гранулизина. ЦТЛ лизируют инфицированные клетки, из которых высвобождаются микобактерии, которые затем фагоцитируются активированными Мф. Гранулизин также через перфориновые поры проникает в Мф и оказывает свое токсическое действие, лизируя находящиеся внутри микобактерии. [Flynn, 2004].

Установлено, что уб Т- клетки появляются первыми в очаге размножения М. tuberculosis. Несмотря на то, что этот тип клеток составляет всего около 5 % общего пула Т-Лф, они выполняют эффекторные функции до появления антигенспецифических оф Т-Лф. Показано, что у/5 Т-Лф генетически детерминированы к распознаванию туберкулёзных антигенов, поэтому повторный контакт с М. tuberculosis не сопровождается их количественным увеличением [Griffin et al., 1991; Tsuyuguchi et al., 1991]. Сенсибилизированные к М. tuberculosis у/8 Т-лимфоциты секретируют спектр цитокинов, включающий интерлейкины (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10), ИФН-у и ФНО-а. Они также способны уничтожать клетки, инфицированные М. tuberculosis [Barnes., 1992]. Известно, что ФНО-а обладает множественными функциями в реализации иммунного ответа организма. При инфицировании М. tuberculosis ФНО-а стимулирует образование гранулемы; совместно с ГМ-КСФ усиливает противовоспалительное действие и привлекает в очаг воспаления новые Лф и моноциты. ФНО-а участвует в инкапсулировании туберкулезной гранулёмы и способствует развитию её некроза. В эксперименте на мышах, инфицированных микобактериями, было показано, что нейтрализация ФНО-а приводит к смерти всех испытуемых животных. Однако дисбаланс цитокина в лёгких приводит к усилению патологических реакций, увеличению некроза и деструктивному воспалению, у/5 Т-лимфоциты способны распознавать устойчивые к действию протеаз антигены М. tuberculosis [Tsuyuguchi et al 1991]. Установлено, что для лёгкой формы ТБ, не сопровождающейся грубыми деструктивными изменениями лёгких, характерна повышенная продукция ИФН-у в ответ на специфическую стимуляцию туберкулином и на стимуляцию фитогемагглютинином. При

тяжёлых формах (диссеминированный туберкулез) и процессах с деструкцией лёгочной ткани отмечается уменьшение ИФН-у при специфической стимуляции и его высокий уровень при неспецифической стимуляции [Комогорова с соавт., 2005]. Анализ данных литературы указывает на важнейшую роль клеточного иммунного ответа (с участием Th-1 клеток воспаления), обуславливающего защиту организма от туберкулезных микобактерий.

1.2.3.Гуморальнный иммунный ответ при туберкулезе

Установлено, что клеточные формы иммунного реагирования являются важнейшими для протективного иммунного ответа у больных ТБ. [Ehlers et al., 2001; Tasneem et al., 2001]. Несмотря на то, что гуморальное звено в патогенезе этой инфекции не является определяющим для течения и исхода заболевания, определение антител может служить важным диагностическим критерием. У ряда больных антитела к патогенам обнаруживаются в довольно высоких титрах [Kurug, 2000; Araujo et al., 2004]. Так при оценке иммунного статуса больных ТБ было отмечено преобладание иммунного ответа Th-2 типа, сопровождавшегося увеличением пула клеток, секретирующих ИЛ-10, а также сниженный уровень ИФН-у. Отмечался также высокий уровень антител у больных по сравнению с лицами, контактными и вакцинированными БЦЖ. [Verbon et al., 1999].

Особое значение в патогенезе ТБ отводится IgG антителам. Имеются сведения о том, что, инвазия М. tuberculosis, приводит к нарушению иммунорегуляции. При участии Т-Лф и цитокинов в ходе иммунного ответа, отмечается повреждение тканей [Theilmann et al., 1990]. У больных с тяжелыми формами ТБ лёгких отмечали повышение количества IgA и IgE и снижение относительной аффинности синтезируемых антител [Комогорова с соавт., 2005]. У больных ТБ среди специфических AT преобладли иммуноглобулины IgG типа,, редко подавляющая часть пула была

представлена IgA. IgM характерны только для начальных стадий заболевания. Иная картина выявлена среди детей, больных туберкулезом: высокие титры специфичных IgA и IgM отмечаются гораздо чаще. При этом высокие титры IgM- антител могут долго сохраняться при относительно низких уровнях IgG и IgA.

При сенсибилизации организма происходит выработка IgE, участвующих в развитии гиперчувствительности немедленного типа. Наличие IgE антител в сыворотке крови запускает каскад атопических реакций, нарушающих проницаемость сосудов, приводящую сосудистым и некротическим нарушениям. У больных ТБ ПТАТ класса IgE обнаруживаются у 63-85 % [Aronson et al., 2004].

Таким образом, формирование иммунитета против микобактерий туберкулеза представляет собой сложный многокомпонентный процесс. Болезнетворность М. tuberculosis основана на способности выживать и реплицироваться в макрофагах и не случайно туберкулез относят к классическим макрофагальным инфекциям. Взаимодействие между туберкулезной палочкой и МФ формирует характерное для туберкулеза воспаление грануломатозного типа. Дальнейшие события тесно связаны с развитие специфического иммунного ответа с тонкой системой регуляции.

1.3.Диагностика туберкулеза

Для диагностики ТБ проводятся различные исследования больного (клинические, рентгенологические, микробиологические,

иммунологические). Рентгенологическая картина при ТБ разнообразна, нередко она бывает неспецифичной, часто протекает без заметных изменений на рентгенограмме грудной клетки [Foulds and O'Brien., 1998]. Микробиологическая диагностика является более информативной. Применяются бактериоскопические, бактериологические, серологические и

аллергологические методы. Материалом для исследования является мокрота, моча, спинномозговая жидкость, отделяемое свищей, испражнения и др.

1.3.¡.Бактериоскопия и бактериологический метод диагностики Mycobacterium tuberculosis

При микроскопии мазков, приготовленных из патологического материала и окрашенных по Цшпо-Нильсену, обнаруживают кислотоустойчивые бактерии. Нередко материал содержит незначительное количество бактерий, их количество в образце повышают (до 5-10 тыс. бактерий в 1 мл) методом центрифугирования или флотации. Однако, при микроскопии невозможно отличить возбудителя ТБ от нетуберкулезных микобактерий [Ларионова с соавт., 2004]. Наиболее результативна люминисцентная микроскопия с аурамин-родамином. Краситель окрашивает микобактерии в бело-желтый цвет. Для выявления L-форм применяют меченные флюорохромами антитела (Поздеев, 2001).

Максимальная чувствительность присуща культуральным методам исследования, основанным на выделении и идентификации чистой культуры возбудителя туберкулеза. Инфицированный материал высевают на твёрдые питательные среды (Левенштейна-Иенсена, Финн-2 и др.). Однако микобактерии медленно растут и результат может быть получен только через 5-6 недель. Нетуберкулезные микобактерии растут быстрее их можно идентифицировать через 2 недели с момента посева [Gillespie and McHugh., 1997].

1.3.2.Метод полимеразнон цепной реакции

Одно из новейших направлений в диагностике туберкулеза основано на выявлении генетических маркеров патогена методом полимеразной цепной реакции (ПНР). Основной принцип ПЦР - ферментативная амплификация фрагмента ДНК, фланкированного двумя праймерами, комплементарными ДНК-мишени. Реакция осуществляется при помощи термостабильной ДНК-

полимеразы. Образование в результате реакции фрагментов ДНК ожидаемого размера оценивается как факт наличия в пробе клеток искомого микроба и позволяет идентифицировать исследуемую ДНК. Чувствительность современных вариантов ПЦР составляет 70-90% от культурального метода и дает положительный результат в 90-95% образцов мокроты бациллярных больных и позволяет подтвердить диагноз у 50-60% абациллярных больных (Маянский, 2006). На основе ПЦР были разработаны методы генотипирования и дифференцирования штаммов микобактерий на уровне хромосомной ДНК [Goto et al., 1991; Kent et al., 1995; Hellyer et al, 1996; Gillespie andMcHugh., 1997; Badaketal., 1999].

Однако ряд авторов указывает на то, что с помощью ПЦР выявить микобактерии можно лишь в том случае, если в исследуемом материале содержится от 100 до 1000 клеток в 1 мл [Куличенко с соавт., 1996; Кулаков с соавт., 1992], а чувствительность ПЦР с клиническими образцами, в которых при микроскопии микобактерий не обнаружены, составляет всего 40 — 77 % [Barnes., 1997]. Кроме дорогостоящего оборудования и реагентов, необходимости проведения исследований в специализированных помещениях, к недостаткам ПЦР-анализа следует отнести возможность получение ложно-положительных результатов за счёт глобального инфицирования населения микобактериями [Butler et al., 1994; Somoskovi et al., 2000]. Кроме того, одна из технических трудностей ПЦР связана с ингибиторами ДНК-полимеразы, которые могут присутствовать в исследуемом образце.

5.3. Иммунодиагностика

Реакция гиперчувствительности замедленного типа при внутрикожном введении туберкулина (проба Манту) хорошо известна и широко применяется для определения инфицирования М. tuberculosis [Chan et al 2002]. Реакция на туберкулин - не что иное, как очаг грануломатозного

воспаления, вызванного взаимодействием сенсибилизированных Т-лимфоцитов с антигенами туберкулезных бактерий. Однако, специфичность этих тестов оставляет желать лучшего из-за наличия перекрестно реагирующих антигенов у различных микобактерий, в том числе нетуберкулезных микобактерий. Вакцинация БЦЖ у некоторых лиц также способна поддерживать положительную кожную сенсибилизацию в отсутствие ТБ [Havllir et al 1991].

При проведении серологических исследований с целью выявления антигенов микобактерий и ПТАТ применяют различные методы: РА, РСК, РПГА, агрегатагглютинации, ИФА, иммуноблотинг и др. Традиционно серологические реакции используются для экспресс-диагностики патогенных микроорганизмов. Учитывая тот факт, что на питательных средах микобактерии растут очень медленно, использование ИФА позволяет значительно сократить время для постановки диагноза. На сегодня ИФА дешевле других диагностических методов, он безопасен, полностью автоматизирован и широко применяется в практическом здравоохранении. Особенно ценен он для диагностики внелегочных форм ТБ, поскольку при этих формах нет доступных для диагностики объектов.

Суть метода заключается в том, что в лунках полистероловых планшетов сорбируют антитела (антигены), вносят испытуемый материал, образовавшийся в результате реакции комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата, меченого ферментом. Активность фермента, входящего в состав адсорбированного иммунного комплекса, оценивают по изменению цвета субстрата фотометрически [Ficapal et al 1995].

Сегодня практическому здравоохранению доступны несколько тест-систем для серологической диагностики ТБ. ИФА-диагностикумы: Фирма «ANDA Biological» (Франция) выпускает наборы для экспресс диагностики туберкулеза; IgG-, IgA-, IgM- антитела к Mycobacterium tuberculosis; «BioChem ImmunoSysteras» (Канада) - «DETECT-TB ELISA»; «Аквапаст» (Россия, Санкт-Петербург) - «Акватуб-АТ-1»; «Вектор-Бест» (Россия,

Новосибирск) - «АТ- ТУБ-Бест», а также набор реагентов «MycoDot» фирмы «DynaGene» (США) для иммуноблотинга на основе антител против липоарабиноманнана и диагностикум для иммунохроматографии "ICHECK-Tb" (IND Diagnostic).

Следует отметить, что широкому внедрению ИФА препятствуют отсутствие высокоспецифичных и чувствительных тест-систем, позволяющих исключить получение ложноположительных результатов. В первую очередь это связано с наличием перекрестных антигенов у туберкулезных и сапрофитных микобактерий, а также низкой чувствительностью (25-87%) тест-систем, сформированных на основе различных антигенов микобактерий [Caminero et al., 1991; Лопаткин с соавт., 1993; Lawn et al., 1997; Amicosante et al., 1999; Banerjee et al., 2003]. Повысить чувствительность ИФА можно за счет определения ПТАП, относящихся к определенным изотипам - IgG-, IgA-, IgM, IgE [Verbon et al., 1990]. Однако в тяжёлых случаях часто отмечается угнетение гуморального иммунного ответа. В этом случае, целесообразно сосредоточится на оценке показателей иммунного статуса, характеризующих клеточное звено специфического иммунитета. Так в случае латентного ТБ таким показателем может служить содержание ИФН-у, который секретируется мононуклеарами в ответ на стимуляцию высокоспецифичными антигенами М. tuberculosis (ESAT-6 и CFP10), отсутствующих в вакцине БСЖ и у большинства сапрофитных микобактерий [Lalvani et al., 2001; Brock et al., 2004]. Такой подход более специфичен, чем кожно-аллергическая проба Манту [Hill et al., 2005; Mori et al., 2004; Shams et al., 2004]. Его используют для выявления латентного ТБ у больных ВИЧ-инфекцией. [Chapman et al., 2002]. Разработаны два методических подхода: 1) ELISpot [T-SPOT.TB; Oxford, UK] предусматривает подсчёт клеток, секретирующих ИФН-у; 2) ELISA [QuantiFERON-TB Gold; Australia] позволяет определять содержание ИФН-у в супернатанте активированных клеток [Brock et al., 2004]. Оба методических

подхода превосходили по специфичности реакцию Манту, причём ELISpot оказался более чувствительным, чем ELISA [Lalvani et al., 2001].

Таким образом, использование серологических методов диагностики, в частности ИФА, позволяет значительно сократить время лабораторного подтверждения клинического диагноза, активно применять его для диагностики внелегочных форм туберкулеза, и особенно, как отмечают многие авторы, для диагностики туберкулеза у детей .

1.3. Антигены Mycobacterium tuberculosis

Полный антиген туберкулезных микобактерий представляет собой сложный ЛПС комплекс, который при парентеральном введении в вакцинированном организме вызывает образование антител. Полный антиген является полноценным иммуногеном и способствует образованию широкого спектра AT; фосфолипидный, белковый, полисахаридный компоненты микобактерий не обладают свойствами полного антигена [Колычев Н.М., Госманов Р.Г., 2003]. Авторы описали 4 основные группы растворимых антигенов микобактерий: I группа - антигены, общие для всех видов микобактерий и близких бактериальных родов; II группа - антигены, характерные для медленно растущих микобактерий; III группа - антигены, свойственные быстро растущим микобактериям и нокардиям; IV группа -антигены, специфические для отдельных видов микобактерий. Групповые антигены (А, В, С, Д ) определяют родство видов, входящих в одну группу. У быстрорастущих микобактерий выявлены антигены, отличающие их от медленнорастущих группа А, которая в свою очередь разделена на 3 подгруппы - Al, А2, A3. Микобактерии каждой подгруппы отличаются по 12 антигенам, от представителей других групп и подгрупп. Существенные различия в антигеном спектре зарегистрированы среди быстрорастущих микобактерий , которые в связи с этим подразделяются на 3 серогруппы (В, С, Д) [Воробьев с соавт., 2003]. По физико-химическим свойствам групповые

и видоспецифические антигены различаются. В частности, видоспецифические антигены являются термостабильными, а группоспецифические - термолабильными. У различных видов микобактерий выявлены 1-2 антигена, характерные для всех представителей рода Mycobacterium. Между некоторыми представителями рода имеется более близкое антигенное родство (до 10-12 общих антигенов). При сравнительной оценке антигенных спектров М. bovis и атипичных микобактерий были обнаружены общие антигены, однако степень антигенного сходства различалась в зависимости от вида атипичных микобактерий и составляла от 15 до 63 % . Методом ИФА продемонстрирована строгая специфичность антигенной структуры микобактерий при использовании полученных специфических антисывороток, каждая из которых взаимодействовала только с использованными для иммунизации антигенами [Воробьев, 1999].

Внимание исследователей, занимающихся проблемой серологической диагностики туберкулеза человека и животных, привлекают иммунодоминантные антигены с видоспецифическими эпитопами, стимулирующими выраженный гуморальный ответ. Поиск иммунодоминантных антигенов микобактерий важен как для создания новых вакцин, так и новых скрининговых тест-систем для диагностики туберкулеза. Современные достижения в области фракционирования и фрагментирования макромалекул делают возможным создание препаратов и методов диагностики, позволяющих достичь максимальной чувствительности и специфичности в ИФА диагностике туберкулеза. В последние годы наиболее успешно в этом направлении велись исследования в области ветеринарии. Исследователям удалось обнаружить и идентифицировать ряд антигенов микобактерий, выявляющих антитела у 85-90 % инфицированных животных, а так же, получить их в частично очищенном виде. Испытание антигенов в ИФА подтвердило возможность использования их не только для диагностики, но и для дифференциации туберкулиновых реакций.

При изучении антигенного спектра М. tuberculosis выявлен целый ряд иммунодомунантных антигенов. Цитозольный регуляторный антиген Rv2031c, имеющий м.м. 16 кДа, представляет собой фактор вирулентности комплекса М. tuberculosis, обеспечивающий выживание патогена в организме хозяина [Wayne., 1994]. При экспоненциальном росте этот белок не экспрессируется, его появление отмечается только в стационарной фазе роста патогена [Yuan et al., 1996]. Следует отметить, что накопление продуктов метаболизма и недостаточная аэрация негативно сказываются на образовании Rv2031c [O'Toole et al., 2003]. Мутация в гене ю2031 лишает патоген способности выживать внутри макрофагов [Yuan et al., 1998]. В ответ на данный антиген, в организме синтезируются преимущественно специфические IgG, IgA-антитела, в меньшей степени - IgM. Установлено, что антиген Rv2031c является одним из основных иммуногенов М. tuberculosis и может быть использован в качестве моноантигена, так и в комбинации с другими микобактериальными антигенами для серологической диагностики туберкулеза [Raja et al., 2002; Demkow et al., 2002; Demissie et al., 2006].

Описан антиген MTB81, представляющий собой белок (м.м. 88 кДа) малят-синтазной активностью. Индуцирует сильный иммунный ответ у больных туберкулезом [Laal et al., 1997], а также при туберкулезе, развившемся на фоне ВИЧ-инфекции [Hendrickson et al., 2000].

Одним из наиболее перспективных для конструирования новых противотуберкулезных вакцин является специфический антиген М. tuberculosis — ESAT-6. Охарактеризован как ранний секреторный антиген, играющий роль одного из ведущих пусковых факторов, ответственных за раннюю продукцию ключевого фактора протективного иммунитета ИНФу. В экспериментах на мышах установлена его протективная активность. Однако использование белка ESAT-6 в виде субъединичных или ДНК-вакцин выявило его недостаточную иммуногенность и необходимость многократной вакцинации с использованием адъювантов для формирования защитного

эффекта. Белок имеет молекулярную массу 6 кДа [Malen et al., 2007]; экспрессируется на ранней стадии инфекции; принимает участие в обеспечении жизнеспособности и распространении М. tuberculosis в организме человека [Chapman et al., 2002]. Специфические антитела к нему выявлены в сыворотке крови большинства пациентов, инфицированных М. tuberculosis, и, следовательно, их можно считать маркером латентного ТБ [Silva et al., 2003]. Однако, существует противоположное мнение, которое подтверждается увеличением титра AT к ESAT-6 по мере развития заболевания [Demissie et al., 2006].

У М. tuberculosis описан комплекс 85В, являющийся основной антигенной фракцией фильтрата культур ТМБ. В его состав входятследующие антигены: Ag85A, Ag85B, Ag85C и Ag85D [Wiker and Harboe., 1992]. Комплексу свойственна миколил-трансферазная активность, необходимая для синтеза одного из факторов патогенности, а именно корд-фактора [Belisle et al., 1997]. Ag85B, имеющий молекулярную массу 30 кДа, является основным секретируемым антигеном и появляется в фильтрате культуральной жидкости уже через 72 часа выращивания М. tuberculosis. Использование Ag85B в серологических реакциях позволяет диагностировать до 94% случаев инфцирования возбудителем туберкулеза, а также при туберкулезе, ассоциированным с ВИЧ-инфекцией. [Raja et al., 2002]. Некоторые авторы отмечают высокую перекрестную реактивность комплекса Ag85 с антигенами практически всех микобактерий [Wiker and Harboe., 1992], что в значительной степени снижает специфичность тест-систем. Значительно специфичнее тесты, проводимые только с одним компонентом комплекса - антигеном Ag85D с м.м. 27 кДа [Ramalingam et al., 2004]. Специфичность подобных тестов составляет около 70%, что позволяет рекомендовать его для диагностики туберкулеза, ассоциированного с ВИЧ-инфекцией.

Еще один антиген - Rv0455c представлен в фильтратах культуральной жидкости ТМБ. Имеет молекулярную массу 14 кДа. Специфические антитела

к данному антигену присутствуют в сыворотке крови у большинства инфицированных М. tuberculosis людей, при этом у больных кожно-аллергические реакции с туберкулином (реакция Манту) не регистрируются [Jackett et al., 1988]. Показана возможность использования данного антигена для диагностики туберкулезного менингита при исследовании спинномозгового ликвора [Sumi et al., 1999].

Описан растворимый антиген МРТ32, активно секретируемый культурами М. tuberculosis [Nagai et al., 1991]. Охарактеризован как белок, гомологичный фибронектин-связывающему антигену М. leprae [Harboe and Wiker., 1998]. Секретируется возбудителем туберкулеза на ранней стадии инфекции и продолжается до образования каверн в легких [Samanich et al., 2000; Houghton et al., 2002]. Антитела к антигену МРТ32 регистрируются у большинства больных ТБ, а также у ТБ/ВИЧ инфицированных людей. [Samanich et al., 1998; Samanich et al., 2000].

Антиген A60 - термостабильный компонент фильтрата культуральной жидкости М. bovis (вакцинный штамм) и М. tuberculosis [Harboe et al., 1977]. Входит в состав иммуноферментной тест-системы для диагностики ТБ фирмы «Anda Biologicals» (Франция). Антиген обеспечивает диапазон чувствительности от 36 до 91% и специфичности от 68 до 98 %, однако проявляет низкую чувствительность при туберкулезе детей и его внелегочных формах.[Chan et al., 2000; Garg et al., 2003]. Установлено, что с помощью антигена А60 можно отличить поствакцинальную реакцию, латентную инфекцию и активный туберкулез. Антитела к антигену А60 выявляются в различных биологических жидкостях: сыворотке крови, слюне, спинномозговом ликворе, плевральном выпоте, бронхо-альвеолярных смывах [Del Pezzo et al., 1996; Grubek-Jaworska et al., 1997; Maheshwari et al., 2000. Ghoshal et al., 2003], [Ghelani et al., 1999]. Однако данный антиген неспецифичен для микобактерий - он дает перекрестные реакции с нокардиями и коринебактериями, что снижает специфичность тестов на его основе [Li et al., 1998]

Новая группа антигенов М. tuberculosis - ТМБ ТВ9.7, ТВ 15.3, ТВ 16.3 и ТВ51. По специфичности аналогичны антигену с м.м. 38 кДа. Получены их рекомбинантные аналоги, которые использовали для серодиагностики ТБ: чувствительность тестов составила 31-93%, а специфичность - 97% [Weldingh et al., 2005]. Установлена наибольшая ценность антигена ТВ 16.3 для диагностики ТБ, а антигена ТВ9.7- для ТБ/ВИЧ-инфекции. Гепаринсвязывающий гемагглютинирующий адгезин, или антиген Rv0475 представляет собой поверхностный антиген М. tuberculosis, обеспечивающий взаимодействие МБТ с клеткам эпителия и распространение патогена за пределы респираторного тракта [Menozzi et al., 1996; Pethe et al., 2001]. Выявлен у всех ТМБ, но отсутствует у непатогенного М. smegmatis [Pethe et al., 2001]. У инфицированных М. tuberculosis людей без клинических признаков болезни к антигену Rv0475 формируется иммунный ответ опосредованный С04+клетками воспаления. Антитела появляются лишь в активной стадии болезни. [Masungi et al., 2002]. Иммунитет аналогичен создаваемому при вакцинации БЦЖ и носит протективный характер.

Антигены М. tuberculosis, обозначаемые как РЕ и РРЕ в структуре N-терминального конца молекулы имеют аминокислотные последовательности пролин - глютамин (РЕ) и пролин - пролин - глютамин (РРЕ). Выявлены в результате полной расшифровки генома М. tuberculosis. РРЕ индуцируют выраженный иммунный ответ к М. tuberculosis, как гуморального, так и клеточного типов [Abou-Zeid et al., 1991]. В крови инфицированных обнаружены анти-РРЕ55 антитела, которые не выявляются у вакцинированных. [Singh, et al., 2005]. Антиген из группы РЕ экспрессируется только in vivo, а в клетках ТМБ отсутствует [Espitia et al., 1999].. Антиген Rv3872 из группы РЕ признан подходящим для серологической диагностики туберкулеза: чувствительность проводимого с его применением иммуноферментого теста составила при легочной и внелегочных формах туберкулеза 94 и 90% соответственно, а специфичность в обоих случаях оценена в 95% [ Mukherjee. et al., 2007].

Полисахаридный антиген липоарабиноманнан является компонентом клеточной стенки М. tuberculosis. В ИФА с сыворотками больных ТБ к нему обнаруживаются антитела в 72 и 89% случаев, при специфичности показаний 90 и 100%. Следует отметить, что у лиц с внелегочными формами туберкулеза и с ТБ/ВИЧ-инфекцией чувствительность теста была значительно ниже. [Chan, Heifets and Iseman., 2000].

Антигены M. tuberculosis, включающие в качестве основного компонента трегалозосодержащие гликолипиды: 2,3-диацилтрегалоза (ДАТ); 2,3,6-триацилтрегалоза (TAT); 2,3,6,6-тетраацилтрегалоза 2-сульфат (сульфолипид-I) и трегалоза 6,6-димиколат (корд-фактор). При постановке ИФА с антигенами ДАТ и TAT чувствительность составляла 11-88% и 5193% соответственно. [Julian et al., 2002]. Чувствительность теста, проводимого с применением сульфолипида-I, при выявлении специфических IgG, IgA и суммарно обоих типов антител составляла 81%, 66% и 93,7% соответственно, а специфичность - 77,6%, 87% и 67,5% соответственно [Laal. étal., 1997].

На основе некоторых иммунодоминантных антигенов МВТ разработаны комерческии тест-системы, которые используются для диагностики ТБ с разной эффективностью.

Заключение по обзору литературы.

Анализ литературы, посвященной исследованиям антигенного спектра М. tuberculosis, выполненным методом иммуноблотинга, демонстрируют на редкость разнообразный спектр антигенов, с которыми реагируют сыворотки пациентов больных туберкулезом. Однако следует отметить, что использование антиген содержащего материала часто приводит к получению высокого процента ложноположительных результатов. Поэтому представляется важным, что для повышения чувствительности диагностических тест-систем при сохранении специфичности необходимо

выявлять и использовать специфические антиген, с которыми реагируют все сыворотки больных, или хотя бы большинство из них. Представляется, что сконструированная на основе 7-10 таких антигенов тест-система может удовлетворять современным требованиям диагностики туберкулеза.

В настоящее время, несмотря на значительное количество публикаций, посвященных изучению антигенов М. tuberculosis, работ, в которых имеется подробное описание процедуры их получения, недостаточно. Возможно, это связано с коммерческим интересом. Тем не менее, использующиеся сегодня диагностические тест-системы обладают недостаточной чувствительностью. Настоящая работа посвящена разработке способов получения серологических активных антигенных препаратов из М. tuberculosis, которые представляют интерес для диагностики туберкулеза методами ИФА и иммуноблотинга.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в период с 2009 по 2012 гг. на кафедре микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета и в лаборатории молекулярной биологической исследований «Республиканском центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ».

2.1 Штаммы бактерий и биологические препараты

1. Штаммы бактерий - Mycobacterium tuberculosis штамм «Академия», Mycobacterium bovis, Mycobacterium vallee, Mycobacterium intercellulari, Mycobacterium avium, полученные из ГИСКа им Л. А Тарасевича.

2. Вакцина БЦЖ.

3. Сыворотки условно здоровых людей и сыворотки больных туберкулезом.

2.2. Питательные среды для культивирования Micobacteriiun tuberculosis

Для приготовления антигенов из Micobacterium tuberculosis пггамм «Академия» выращивали на твердой питательной среде Левинштейна- Иенсена в течение 40-60 дней, отмывали от питательной среды, переносили в жидкую питательную среду Сотона. Наращивание бактериальной массы в указанной среде проводили в аппарате «Bacteck» при 37° С в течение 14-28дней.

Состав среды Левинштейна- Йенсена ("г/л):

L-аспарагин - 3,60; калия дигидрофосфат - 2,40; магния сульфат - 0,24; магния цитрат - 0,60; картофельная мука - 30,0; малахитовый зеленый - 0,40.

Состав среды Сотона (г/л):

Железа аммонийного цитрат - 0,0167; L-Аспарагин - 1,330; лимонная кислота - 0,660; магния сульфат - 0,166; калия гидрофосфат - 0,287; натрия дигидрофосфат - 0,633; натрия хлорид - 0,400; твин-80 - 0,833.

2-З.Основное оборудование:

1. Ультрацентрифуга «BECMAN L7-80».

2. Многоканальный спектрофотометр «MULTISKAN ЕХ»

3. Вошер «PW-40»

4. Аппарат для электрофореза в пластинчатом геле «Хийу Калур»

5. Аппарат для электропереноса белков из ПАГ на НЦМ «NRANS-BLON SD» (Производитель BIO-RAD)

6.Блок питания «Power Рас»

7. Центрифуга ОПН-8.

8. Водяная баня (mLm)

9.Хроматографическая система

10. Термостат ТС-80.

11 Bacteck

2.4.0сновные реактивы:

1. Полистироловые планшеты «ВНИИ медполимер», г. Москва.

2. Конъюгат: иммуноглобулины против IgG и IgM человека, меченые пероксидазой хрена (НИИ им. Гамалея).

3. Тетраметилбензидин (ТМБ).

4. Нитроцеллюлозные мембранные фильтры (НЦМ) «Мііііроге».

5. Набор реактивов для электрофореза «ДиаэМ». РИП

6. Буферные растворы: - 0,2 М бикарбонат-карбонатный буфер, рН 9,5; 0,05 М фосфатный солевой буфер, рН 7,4 с 0,05% твина 20; 0,15 М цитратный буфер, (рН 5,1), содержащий 0,05% Н202.

7. Набор белков с известной молекулярной массой: миозин (200,0 кДа), галактозидаза (116,5 кДа), фосфорилаза В (97,4 кДа), сьшороточный альбумин (66,2 кДа), овальбумин (45,0 кДа), карбоангидраза (31,0 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), лизоцим (14,4 кДа) и аршгинин (6,5 кДа).

8. Сефадекс-0-200

9. Диметилсульфоксид (ДМСО)

2.5.Условия проведенння анализов

2.5.1.Условия проведения иммуноферментного анализа.

Определение специфических противотуберкулезных антител к антигенам МБТ в сыворотке крови больных проводилось стандартным методом ИФА

согласно инструкции к тест-системе «АТ-Туб-Бест» ( производитель: ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск)

Сенсибилизация планшетов: исследуемые в ИФА антигенные препараты вносили в лунки полистеролового планшета в объеме 100 мкл. Планшеты оставляли на сутки при 20-24°С для связывания АГ с поверхностью лунок планшета. Неадсорбированный материал удаляли трехкратной промывкой дистиллированной водой, остатки влаги удаляли постукиванием планшета по 5 фильтровальной бумаге. Планшет высушивали. Сыворотки, разведенные в фосфатно-солевом растворе с 0,5% твина-20 (ФСРТ) или в растворе для разведения проб (РИП) вносили в лунки в объеме 100 мкл. В последнем случае, цвет раствора менялся с сине-фиолетового на зеленоватый, или с розового на желтый, в зависимости от того, какой индикаторный краситель был добавлен в РИП. Планшеты помещали во влажную камеру и инкубировали в течение 30 минут при температуре 37°С. Затем содержимое лунок удаляли и промывали их 4 раза раствором ФСРТ. Остатки содержимого удаляли легким постукиванием по 5 фильтровальной бумаги.

Во все лунки вносили по 100 мкл коныогата и выдерживали во влажной камере при 37°С в течение 30 минут. Затем содержимое лунок удаляли, лунки промывали 5 раз раствором ФСРТ, остатки влаги удаляли постукиванием по фильтровальной бумаге.

В лунки вносили по 100 мкл субстратной смеси (цитратный буфер и раствор тетраметилбензидина (ТМБ) в пропорции 20: 1) и выдерживали планшет при комнатной температуре в течение 15 минут. Реакцию останавливали добавлением в лунки 50 мкл стоп-реагента (1N серная кислота).

Учет результатов проводили при длине волны 450 нм на 96-лучевом спектрофотометре «МЦЬТККАЫ ЕХ».

Критерием качества антигенных препаратов служили абсолютные показатели оптической плотности (ОП) его в реакциях с положительной и отрицательной сыворотками, а также коэффициент специфичности. Последний расчитывали по формуле:

Кс =

ОП 4$о та К+

ОП 450 ни К-

2.5.2. Условия проведения электрофореза.

Электрофорез антигенных препаратов в ПАГ проводили по Лаэммли [ЬаеттН, 1970]. Использовали 12,5% и 15% полиакриламидный гель, а таюке градиент концентраций полиакрил амида - 9-16,5%. Линейный градиент создавали с помощью аппарата, изготовленного в лаборатории.

Раствор, содержащий акр ил амид и К,>1-метилен-бисакриламид в соотношении 30:0,8, служил исходным раствором для приготовления концентрирующего и разделяющего гелей. В конечной концентрации разделяющий гель содержал 0,375 М трис-НС1 буфер (рН 8,8) и 0,1% ДСН; концентрирующий гель содержал 0,125 М трис-НС1 буфер (рН 6,8 - 7,2) и 0,1% ДСН; электродный буфер (рН8,3) содержал 0,025М трис, 0,192М глицина и 0,1% ДСН. Катализаторами служили аммоний надсернокислый и ТЕМЕД.

Лизирование фракционируемого материала проводили в кипящей водяной бане в течение 5 минут в растворе, состоящем из 0,0625М трис-НС1 буфера (рН6,8) 2,5% ДСН и 5% 2-меркаптоэтанола. Пробы, готовые к электрофоретическому фракционированию, содержали глицерин -15% и бромфеноловый синий - 0,003%.

Электрофорез проводили при комнатной температуре при силе тока 15 мА/пластинку до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинку. Продолжительность электрофореза составляла 2-4 часа, в зависимости от концентрации ПАГ.

Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПАГ проводили, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза. Для этого белки фиксировали в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты. Дважды промывали по 15 минут в дистиллированной воде и проводили окрашивание 0,04% кумаси 0-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение 90 минут. Затем гель погружали в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления

от избытков красителя.

Определение молекулярных масс белков, содержащихся в антигенных препаратах, проводили электрофоретически путем сравнения с подвижностью белков известной молекулярной массы [Weber, Osborn, 1969].

Электроперенос белков, фракционированных в ПАТ на нитроцеллюлозную мембрану проводили, придерживаясь метода описанного в книге [Фримель, 1989].

Для этого нитроцеллюлозный мембранный фильтр вымачивали в буфере для переноса и помещали его на диализную пленку, прикрывающую толстый слой фильтровальной бумаги. Сверху на фильтр накладывали гель, который покрывали диализной пленкой и еще 15-20 листами фильтровальной бумаги. Собранную таким образом форму помещали между двумя электродами. Перенос проходил в течение 4045 минут при напряжении в 100V и силе тока 100 мА на пластинку размером 100 на 100 мм.

2.53.Условия проведения иммублоншга.

От не адсорбировавшегося на фильтрах материала, а так же для отделения ДСН от белков, полученную на нитроцеллюлозной мембране реплику промывали 4 раза по 5 минут в 0,05% ФСБТ.

Фильтры погружали в 0,3% ФСБТ, содержащий бычий сывороточный альбумин, и после пятнадцатиминутной инкубации добавляли специфическую сыворотку в разведении 1:100 в объеме 30мл. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. Далее фильтры промывали 4 раза по 5 минут 0,05% ФСБТ и заливали тем же буфером, но содержащим 1% БСА, в который через 15 минут добавляли коныогат и инкубировали в течение 2 часов. После пятикратного промывания в 0,05% ФСБТ и однократного в 0,01 М фосфатно-солевом буфере без твина, нитроцеллюлозную мембрану погружали в 0,01 М ФСБ, содержащий 3,3-диаминобензидин и Н202-

Интерпретацию результатов иммуноблотинга проводил согласно инструкции.

2.5.4. Гель фильтрация на ссфадексе G-200.

Гель-хроматографию проводили на колонке размером 2,5см х 100см, заполненной сефадексом G-200. Колонку перед работой промывали 0,01М натрий фосфатным буфером. Образец наносили на колонку в объеме 7мл.

З.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЗЛ.Выявлснис секретнруемых антигенов Mycobacteriunu

tuberculosis

Одним из ключевых препаратов иммуноферментной тест-системы, предназначенной для выявления специфических антител, является антиген. Именно его качеством во многом определяется чувствительность и специфичность конкретной тест-системы. Помимо высокой активности и специфичности антигены, используемые в твердофазном варианте ИФА, должны прочно сорбироваться на поверхности полистерола, не терять специфичности и активности при высушивании и длительном хранении. Для этого антигены должны быть достаточно небольшого размера, гомогенными и прочно связываться с поверхностью твердой фазы в виде монослоя. В инфицированном организме антитела образуются как на антигены самого микроорганизма, так и на секретируемые им продукты. Целью описанной ниже серии экспериментов было определение возможности использования фильтрата культурального супернатанта в качестве источника антигенов и определение возможности использования последних для диагностики туберкулеза методами иммуноферментного анализа и иммуноблотинга.

Следует отметить, что работ, посвященных изучению иммуногенных свойств секретируемых белков М. tuberculosis, великое множество. Причем, одни авторы указывают на важность для диагностики антигенов с М.м. 6 кДа, 16 кДа, 19 кДа и 23 кДа [Wang et. al., 2005], другие - на антигены с М.м. 3129 кДа, 38 кДа и фермент супероксид дисмутазу с М.м. 80 кДа [Deshpande et al., 1993]. Полагая, что спектр секретирумых белков зависит от штамма микроорганизма и условий его культивирования, нами было выполнена работа по определению спектра секретируемых белков М. tuberculosis штамма «Академия».

Культуру М. tuberculosis, выращивали на среде Левенштейна-Йенсена, а затем - на среде Сотона. После отделения бактериальной массы

центрифугированием, полученный супернатант фильтровали через сэндвич из нитроцеллюлозных фильтров «Millipore» (размер пор 0,65 мкм, 0,45 мкм и 0.22 мкм) с целью избавиться от, возможно, присутствующего в супернатанте бактериального дебриса. Полученный ФКС использовали как исходный материал для дальнейших экспериментов.

Для исследования в ИФА, ФКС разводили 1:5 в 0,05М Трис-НС1 буфере, рН 6,8; вносили в верхний ряд лунок планшета для иммунологических реакций и проводили последовательное 2-кратное разведение исследуемого материала в том же буфере в нижних рядах планшета.

Определение активности и специфичности иммобилизованного в лунках планшета материала проводили с использованием положительной и отрицательной сывороток в разведении 1:100.

Показатели оптической плотности (ОП) ФКС, иммобилизованной в лунках полистеролового планшета в разведениях от 1:5 до1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 и 1:640, приведены на рисунке 1. Видно, что показатели ОП сорбированного материала при взаимодействии с положительной сывороткой выше, чем при взаимодействии с отрицательной сывороткой. На этом основании мы приходим к заключению, что ФКС содержит специфические для М tuberculosis антигены. 1,20

в

с

о

"Л

d о

1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

к+ к-

Титры К.С

1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640

Рис. 1. Показатели ОП ФКС М. tuberculosis в реакциях с положительной и отрицательной сыворотками.

Белковый спектр ФКС был исследован методом электрофореза, а

серологическая активность полученных фракций - методом иммуноблотинга.

На рисунках 2 и 3 представлены, соответственно, электрофореграмма

пластинчатого геля, с которого был проведен перенос белков на

нитроцеллюлозную мембрану, и иммуноблоты, полученные на стрипах НЦМ

с фракционированным материалом. При постановке иммуноблотинга

использовали сыворотки пациентов условно здоровых людей и сыворотки

пациентов с установленным диагнозом туберкулез.

Рис. 2. Электрофореграмма ФКС М. tuberculosis в 12,5% ПАГ после переноса фракционированного материала с ПАГ на НЦМ.

На рисунке 2, представляющего фотографию геля, с которого был осуществлен электроперенос белков на НЦМ, обнаруживаются 3 группы белков с молекулярными массами 38 кДа, 29-31 к Да и 6,5 кДа.

Рис.3. Иммуноблоты. Треки: 1-17 с сыворотками условно здоровых пациентов; 18-19 - с сыворотками пациентов с сочетанной ВИЧ/ туберкулезной инфекцией; 20-24 с сыворотками больных туберкулезом пациентов.

Из рисунка 3 видно, что различий между иммуноблотами, полученными с сыворотками больных туберкулезом и сыворотками здоровых пациентов, практически нет. При этом наибольшую серопозитивность проявляет фракция с молекулярной массой 38 кДа и меньшую - 6,5 кДа. Третья фракция с М.м. 29-31 кДа, хорошо представленная на электрофореграмме, проявляет слабую серопозитивность со всеми использованными сыворотками.

По результатам этой серии экспериментов мы пришли к заключению, что данные фракции не представляют особой диагностической ценности, поскольку не позволяют дифференцировать сыворотки здоровых и больных туберкулезом пациентов. Однако позднее выполненные исследования показали, что данный вывод не совсем верен, а причина отсутствия дифференциации кроется в недостаточном разведении исследуемых сывороток.

Следует отметить, что полученные нами результаты, частично совпадают с результатами ранее проведенных,эксипериментах в которых

указывается на 3 важных для диагностики туберкулеза антигенов [Deshpande at. al., 1993]. Это секретируемые антигены с М.м. 38 кДа, 30-31 кДа и супероксид дисмутаза (М.м.80 кДа - тетрамер, субъединица имеет М.м. в 23 кДа). Однако, на полученных нами электрофореграммах фракции с М.м. 80 кДа и 23 кДа не обнаруживаются, возможно, из-за их малого содержания в ФКС.

По данным Беек С.Т [Beck at al., 2005], которые исследовали гуморальный иммунный ответ на антигены с М.м. 6 кДа и 16 кДа следует, что они важны для детекции латентной туберкулезной инфекции. Положительная реакция с указанными антигенами у пациентов с установленным диагнозом туберкулез выявлялась с частотой 50,9% и 57%, соответственно, тогда как в группе контактных пациентов частота к обоим антигенам составляла 16%, а для группы условно людей - 6,6% и 3,3%, соответственно. Мы полагаем, что серопозитивная фракция с М.м. 6,5 кДа на иммуноблотах, полученных нами, соответствует указанной авторами фракции 6 кДа.

3.2. Выделение антигенных комплексов из фильтрата культуралыюго супернатанта М. tuberculosis с помощью этонола

Полагая, что присутствующие в ФКС метаболиты, возможные продукты разрушившихся клеток и иные низкомолекулярные соединения могут конкурировать с антигенами при сорбции на полистероловом планшете, было проведено осаждение белков из ФКС этанолом.

Процедуру осаждения проводили следующим образом: к ФКС приливали равный объем охлажденного до -20°С этанола и выдерживали 15 минутной при -20°С. Осадок отделяли центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут. К полученному супернатанту добавляли еще один, равный первоначальному, объем этанола и повторно отделяли осадок. Дальнейшее добавление органического растворителя не приводило к агрегации белков и образованию осадка.

Следует отметить, что ФКС, использованный в данной серии экспериментов, хранился около 40 суток в при +4°С в присутствии азида натрия. Перед процедурой осаждения спонтанно выпавший в ФКС осадок был отделен центрифугированием при 6000 об/мин. в течение 10 минут.

Полученные осадки, а также супернатант, после удаления этанола диализом против дистиллированной воды и последующего концентрирования, были исследованы в ИФА. Иммобилизацию антигенсодержащих материалов в лунках полистеролового планшета проводили при комнатной температуре в течение 18-20 часов в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,2-7,4. При этом концентрации препаратов по белку составляли 120 мкг/мл и 3,75 мкг/мл. ИФА проводили с положительной и отрицательной сыворотками, разведенными 1:100.

На рисунках 4 и 5 представлены показатели ОП антигенных препаратов: исходного ФКС, спонтанного выпавшего осадка, двух этанольных осадков и двух супернатантов (супернатанты концентрировали в 20 раз).

1 2

с? о 1.8

1,6

1,4

1,2

1

0.8

0?6

0.4

0.2

0

2.726 2.776

■ К+ ■К-□ Спей

1.641

1,487

1|$7 И

г I 1

т

к

+ 3 = Т в

V 8

+ 2 «

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Алфредо Элдер

Выводы

1. Фильтрат культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis штамма «Академия» содержит антигены с молекулярными массами 38 кДа, 31 кДа, 29 кДа и 6,5 кДа, которые проявляют серологическую активность с сыворотками больных легочной формой туберкулеза.

2. Осаждение белков из фильтрата культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis равным объемом этанола приводит к образованию осадка, содержащего основную долю серологически активного материала.

3. Ультрацентрифугирование фильтрата культурального супернатанта Mycobacterium tuberculosis в ступенчатом градиенте сахарозы позволяет получить антигенсодержащий материал, по специфичности превосходящий исходный супернатант.

4. Белок с М.м. 45 кДа в большом количестве представлен в спектрах основных возбудителей туберкулеза человека - М. tuberculosis, М. intracellulars и М. avium и содержится в следовых количествах в спектрах белков М. bovis и вакцинного штамма БЦЖ. Это позволит использовать данный антиген в качестве компонента тест-системы, выявляющей антитела в сыворотке крови людей, инфицированных патогенными микобактериями, а также исключить из круга подозреваемых пациентов, вакцинированных БЦЖ.

5. Обработка клеток М. tuberculosis 10% водным раствором ДМСО с последующим фракционированием супернатанта при изменении рН, осаждением этанолом и сульфатом аммония, гель-фильтрации на колонке с сефадексом G - 200 позволяют получить антигенный препарат, содержащий одну серопозитивную фракцию с молекулярной массой в 45 кДа.

Заключение

Результаты выполненных нами экспериментов свидетельствуют о том, что фильтрат культурального супернатанта М. tuberculosis содержит достаточно широкий спектр белков. Белками, проявляющими серологическую активность, являются доминирующий в спектре белок с молекулярной массой 38 кДа и представленные в меньших количествах антигены 31кДа, 29 кДа и 6,5 к Да. Фракционирование супернатанта с помощью этанола и ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы позволяет получить антигенные препараты с более высокой специфичностью, что подтверждено результатами иммуноферментного анализа.

Нами были изучены антигенные спектры полных клеточных лизатов различных видов микобактерий - М. tuberculosis, М. intracellulare, М. avium, М. bovis, являющихся возбудителями туберкулеза человека. Обращает внимание большое количесво белка с М.м. 45 кДа у М. tuberculosis, М. intracellulare, М. avium и следовые количества его у М bovis, редко вызывающего туберкулез у человека, и в вакцине БЦЖ. Полагая, что в сыворотке у людей, вакцинированных БЦЖ, будут отсутствовать антитела к белку 45 кДа, целесообразно использование данного антигена в качестве компонента диагностической тест-системы, которая позволит отдифференцировть вакцинированных от пациентов, инфицированных патогенными микобактериями, в частности, М. tuberculosis.

Результаты дальнейших экспериментов позволили разработать методику выделения и очистки антигена 45 кДа из клеток М. tuberculosis.

Для этого были использованы экстракция с помощью ДМСО, фракционирование этанолом и сульфатом аммония, гель-фильтрация на сефадексе G-200. Последующий анализ полученного антигена в иммуноблотинге с сыворотками 24 больных туберкулезом, подтвердил его высокую чувствительность

Таким образом, в результате проделанной работы были определены методические подходы к выделению и наработке серологически активных антигенов М. tuberculosis 45 кДа, 38 кДа, 29-31 кДа и 6,5 кДа, которые планируется использовать в разрабатываемой на основе метода иммуноблотинга тест-системе, необходимой практическому здравоохранению для надежной диагностики туберкулеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алфредо Элдер, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Воробьев A.A. Микробиология и иммунология [Текст] / М.: Медицина. - 1999. - С.464.

2. Воробьев A.A. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии [Текст] / А. А. Воробьев, А. С. Быков, Е.П. Пашков, А. В. Караулов, М.Я. Корн. // М.; МИА - 2003.-С.232.

3. Ерохин В.В. Микробиологические методы диагностики туберкулеза [Текст] / В.В. Ерохин, В.И. Голышевская, Э.В. Севастьянова, М.В. Шульгина. // Триада - 2008. - С.40.

4. Захарова Н.Г. Микробиология в определениях и иллюстрация [Текст] / Н. Г Захарова, В.И. Вершинина, О.Н. Ильинская, // изд-во. ФЭН АН Р. - 2012.-.800с.

5. Калюк А.Н. Комплексные бактериологические исследования в диагностике туберкулеза [Текст] /АН Калюк // Туберкулеза и экология.-1995.- № 3.-С.28-31.

6. Карпов A.B. Сравнительная эффективность раннего выявления туберкулеза иммунологическими методами [Текст] / A.B. Карпов // Вестник Новгородского государственного университета, 1998.

7. Колычев Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст] / Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов, // М.: Колос. - 2003.

8. Комогорова Е. Э. Особенности иммуногических показателей у больных с различными формами туберкулеза [Текст] / Е.Э Комогорова, Е.В. Костенко, В.А Стаханов, [и др] // Иммунология.-2005.-№1.-С.45-50.

9. Клименко М.Т. Микробиологическая диагностика туберкулеза почек [Текст] / М.Т. Клименко, Т.С. Гинсбург, С.В. Сокало, И.В. Бочко, А.И. Крикун // Проблемы туберкулеза - 1985. - №8- С.37-40.

10. Кулаков Ю. К. Высокочувствительная неизотопная система гибридизации ДНК с применением амплификации (ПЦР дла идентификакции бруцелл) [Текст] / Ю.К. Кулаков, В. Н. Горелов, В.Л.

Мотин [и др] // Молек. генетика, микробиология, и вирусология-1992.-№7.-8.-С.23

11. Куличенко А. Н. Методические указания по детекции потогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктотах, объектах внешне среды и выполнению генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции [Текст] / А. Н Куличенко, В.В. Кутырев, И.Н. Шарова, H.A. Осина,[ и др] // -М.-1996.-С.11.

12. Ларионова Е. Е. Сравнительная характеристика молекулярных и микробиологических методов контроля химиотерапии у впервые выявленных больных туберкулезом легких [Текст] / Е.Е. Ларионова, А.В Кузьмин, И.А. Васильева // Проблемы туберкулеза и болезней легких-2004.-№6.-С.31 -34.

13. Литвинов В.И. Влияние социальных факторов на смертность от туберкулеза, эффективность мер медико-социальной защиты в Москве в XX столетии [Текст] / В.И. Литвинов, П.П. Сельцовский, Л.В. Слогоцкая, // Пробл. туберкулеза и болезней легких - 2004.- № 2. - С. 11-16.

14. Лопаткин О Н. Усовершенствование иммуноферментного метода для диагностики туберкулёза у людей и крупного рогатого скота. Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики о.о.и. заболеваний: Тез. докл. научной конф [Текст] / О.Н. Лопаткин, И.В. Кронгауз. [и др]. // Омске- Ставрополь.-1993.С.229-230.

15. Маянский А.Н. Патогенетическая микробиология: руководство [Текст] / А.Н. Маянский // Н.Новгород: Издательство Нижегородской государственной медицинской академии, 2006.-520с.

16. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая ситуация в Российской Федерации и меры по ее стабилизации [Текст] / Г.Г Онищенко. // Проблемы туберкулеза и болезней легких -2003. №11. С.4-9.

17. Перельман М.И. Консультант врача. Фтизиатрия [Текст] / М.И.Перельман //М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - С. 57-65.

18. Поздеев O.K., Медицинская микробиология [Текст] / О.К Поздеев. // М., ГЕОТАР-МЕД. - 2001. - 765с

19. Пиневич. А.В.,Микробиология. Биология прокариотов [Текст] / А.В. Пиневич.// т.1, Изд-во С-Пб. Университета. - 2007, - 351с.

20. Пунга В.В. Туберкулез в России [Текст] / В.В. Пунга, Л.П. Капков. // Проблемы туберкулеза -1999. №1.- С. 14-16

21. Слогоцкая Л.В. Особенности клинических исследований во фтизиатрии [Текст] / Л. В. Слогоцкая, О.В. Ловачева, В. И Литвинов. //Туберкулез в России материалы VIII Российского съезда фтизиатров-2007.- С.58.

22. Тогунова А.И. Туберкулез.Руководство по микробиологической диагностике инфекционных заболеваний [Текст] /

A.И. Тогунова А.И, М.А. Пешков, Г.П. Колина, [и др.]. // под ред. К.И. Матвеева, М.И. Соколова. - Москва.: Медицина, 1964.-СЗ87-421.

23. Фримель X. Методы оценки Т и Б-системы иммунитета крупного рогатого скота при бруцеллезе и туберкулезе [Текст] / X. Фримель, М.А Бажин // Иммунологическии методы. - 1989. - С. 16-22.

24. Туберкулёз. Под ред. Б. Блума. // М.: Медицина,-2002.- С.677

25. Чуканов В.И. Особенности диагностики и эффективность лечения больных туберкулезом легких без бактериовыделения [Текст] /

B.И. Чуканов, Л.В. Слогоцкая. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2007. - № 11. - С. 22-25.

26. Якупов Т.Р. Способ получения антигенного препарата из Mycobacterium tuberculosis с расшеренным спектром серопозитивных фракции в реакции иммуноблотинга [Текст] / Т. Р. Якупов, К. С Хаертдинов // патент № 2010101484/10(002020) - .2010

27. Abel В. Toll-like receptor 4 expression is required to control chronic Mycobacterium tuberculosis infection in mice [Текст] / В. Abel, N. Thieblemont, V.J. Quesniaux, [et af\. II J Immmunol. - 2002.-Vol.169.- P 315562.

28. Abou-Zeid C. Genetic and immunological analysis of Mycobacterium tuberculosis fibronectin-binding proteins. / C. Abou-Zeid, T. Garbe, R. Lathigra, [et at\. II Infect Immun. - 1991. - V.59. P.2712-2718.

29. Aleman M. Mycobacterium tuberulosis-induced activation accelerates apoptosis in peripheral blood neutrophils from patients with active tuberculosis [Текст] / M. Aleman, A. Garcia, M. A. Saab, [et al\. II Am J Respir Cell Mol Biol-2002.-Vol-27.-P 583-92.

30. Amicosante M. Sensitivety and specificity of a multi-antigen ELISA test for serological diagnosis of tuberculosis[TeKCT] / M. Amicosante, M. Houde, G. Guaraldi, C. Saltini. // Int J Tuberc Lung Dis.-1999.-Vol.3.P.736-40.

31. Andersen P. Specific immunebased diagnosis of tuberculosis [Текст] / P. Andersen, M.E. Münk, J.M Pollock, [et al\. II Lancet. - 2000. -V.356.-P.1099-1104.

32. Aqeel A. Diagnosis of tuberculosis by using elisa to detect 38 kDa mycobacterial antigen in the patients [Текст] / A. Aqeel, A. Sophia, R. Chandra, C. David // Immunology - 1995. - V.8(4). -P.155-160.

33. Araujo Z. Stady of the antibody response against Mycobacterium tuberculosis antigens in Warao Amerindiam children in Venezuela [Текст] / Z. Araujo, J.H Waard, D.L Fernandez, [et al\. II Mem Inst Oswaldo Cruz-2004.-Vol.99,-P.517-24.

34. Aronson NE. Long-term efficacy of Beg vaccine in American Indians and Alaska Natives: A 60-year follow-up stady [Текст] / N.E Aronson, M. Santosham, G.W. Comstock, [et af\. II JAMA-2004.- Vol.291.-P2086-91.

35. Badak FZ. Use of nucleic acid probes for identification of Mycobacterium tuberculosis directly from MB/Bac T bottles [Текст] / F. Z Badak, S. Goksel, R. Sertoz [et al\. II J Clin Microbabiol.-1999.-Vol. 37. -P. 1602-5.

36. Banerjee S. Seroreativity of 31 kDa and 41 kDa mycobacterial secretory proteins isolated from culture filtrate in extra pulmonary tuberculosis [Текст] / S.Banerjee, S. Gupta, S. Kumar, A.V. Shrikhande, M.V. Reddy,[e/ al\ II Indian J Pathol Microbiol. - 2003.-Vol. 46.-P.261-4.

37. Barnes PF. Cytokine production induced by Mycobacterium lipoarabinomannan. Relationship to chemical structure [Текст] / P.F. Barnes, D. Chatterjee, J.S. Abrams, [et al\. IIJ Immunol.-1992.-Vol.149.-541-7.

38. Barnes PF. Rapid diagnostic test for tuberculosis: progress but no gold standard [Текст] / P.F. Barnes. // Am J Respir Crit Care Med. - 1997.-Vol. 155. P. 1497-8.

39. Belisle J.T. Role of the major antigen of Mycobacterium tuberculosis in cell wall biogenesis [Текст] / J. T Belisle, V.D Vissa, T. Sievert, [etal\. II Science. - 1997. - V.276. - P.1420-1422

40. Belloccchio S. TLRs govern neutrophil activity in aspergillosis [Текст] / S. Belloccchio, S. Moretti, K. Perruccio, [et al\. II J Immunol.-2004/-Vol.173.-7406-15.

41. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology [Текст] / The Actinobacteria. - 2012. - V.5. - C.1750.

42. Beck S.T. Humoral response to low molecular weight antigens of mycobacterium tuberculosis by tuberculosis patients and contacts[TeKCT] / S.T Beck, O.M Leite, R.S. Arrunda and A.W Ferreira // Brazilian journal of medical and Biological Research. -2005. V.38. P.587-598.

43. Bierrenbach A.L. Tuberculosis incidence and cure rates, Brazil, 2000-2004 [Текст] / A. L Bierrenbach, A.B.F. Gomes, E.F Noronha, M.F.M. Souza. // Rev Saude Publica.- 2007.- Vol.41 (Suppl.l) P. 24-33

44. Bodnar KA. Fate of Mycobacterium tuberculosis within murine dendritic cells [Текст] / K.A Bodnar, N.V. Serbina, J.L. Flynn, // Infect Immun. -2001.-Vol.69.-P. 800-809.

45. Boom W.H. Human immunity to M. tuberculosis: T cell subsets and antigen processing [Текст] / W.H. Boom, D. H. Canaday, S.A. Fulton, A.J. Gehring, [etal\ //Tuberculosis(Edinb).- 2003.-Vol.83.-P98-106.

46. Brock I, Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts [Текст] / I Brock, K. Weldingh, T. Lillebaek, F. Follmann, P. Andersen. // Am J Respir Crit Care Med.-2004.-Vol.170.-P.65-9

47. Butler WR. Cross-reactivity of genetic probe for detection of Mycobacterium tuberculosis with newly described species Mycobacterium celatum [Текст] / W. R Butler, S. P. O'Connor, M. A Yakrus, W. M. Gross. // J Clin Microbiol. - 1994.-Vol.32.-P.536-8.

48. Caminero JA. Antimycobacterial antibodies in tuberculous pleural effusions: reliability of antigen 60 [Текст] / J. A. Caminero, D.C. Rodriguez, T. Carrillo, P. Cabrera. // Chest. - 199l.-vol.99.-P.l315-6.

49. Caragol I. Clinical TB in 2 of 3 siblings with IL-12 receptor betal deficiency [Текст] / I. Caragol, M. Raspall, C. Fieschi, [et al\. II Clin Infect Dis.-2003.-Vol 37.-P.302-6.

50. Chapman A.L. Rapid detection of activ and latent tuberculosis infection in HIV-positive individuals by enumeration of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells latent tuberculosis- specific T cell [Текст] / A.L. Chapman, M. Munkanta, K. A. Wilkinson, [et al\. II AIDS. - 2002.-Vol.16.-P.2285-93.

51. Chan E.D. Immunologic diagnosis of tuberculosis: a review [Текст] / E.D. Chan, L. Heifets, M.D Iseman. // Tuber Lung Dis. - 2000. - V.80. -P.131-140.

52. Chan CM. Detection of antibodies specific to an antigenic cell wall galactomannoprotein for serodiagnosis of Aspergillus fumigatus aspergillosis

[Текст] / E.D. Chan, P.C. Woo, A.S. Leung, [et al\. II J Clin Micobiol-2002.-Vol.40.-P.2041-5.

53. Clemons KV. Pathogenesis I: interactions of host cells and fungi [Текст] / K.V. Clemons, V.L. Calich, E. Burger, [et al\ II Med Mycol-2000.-Vol.38, Suppl 1.-P.99-111.

54. Clive A Prevalence and Clinical Manifestations of Disseminated Mycobacterium avium Complex Infection in South Africans with Acquired Immunodeficiebcy Syndrome [Текст] / A.P Clive, S.K Alan, H. Mark // Clin. Inf. Diss. - 2001. - V.33. - P.2068-2071.

55. Co D.O. Mycobacterial granulomas: keys to a long-lasting host-pathogen relationship [Текст] / D.O Co, L.H Hogan, S.L Kim, M. Sandor. // Clin Immunol. -2004. - Vol.l 13.-P.130-6.

56. Cooper A.M. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with mycobacterium tuberculosis [Текст] / A.M. Cooper, J. Magram, J. Ferrante, I.M. Orme. // J Exp Med.-1997.Vol.l86.-P.39-45.

57. van Crevel R. Innate Immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clinical Microbiology [Текст] / R. van Crevel, T.H.M Ottenhoff, J.W.M. van der Meer. // Reviews. 2002.-Vol.5(2).- P. 294-309.

58. Demkow U. Humoral immune response against 38-kDa and 16-kDa mycobacterial antigens in bone and joint tuberculosis [Текст] / U. Demkow, T.M. Zielonka, M. Nowak-Misiak M, [et al\. II Int J Tuberc Lung Dis. - 2002. -V.6. - P.1023-1028.

59. De Bruyn J. The 32 kDa protein antigen of M. bovis BCG and M. tuberculosis H37Rv [Текст] / J. De Bruyn, K. Huygen, J. Van Vooren, J. Content J, M. Turneer. //Trop.Med.Parasitol1990.- Vol.41.-P.331-332.

60. Del Pezzo M. Detection of IgA against the mycobacterial antigen A60 in serum and saliva in patients with active pulmonary tuberculosis:

preliminary results [Текст] / M. Del Pezzo, M. Alifano, S. Faraone, [et al\. II New Microbiol. - 1996. - V.19. - P.363-367.

61. Demissie A. Recognition of stage-specific mycobacterial antigens differentiates between acute and latent infections with Mycobacterium tuberculosis [Текст] / A. Demissie, E.M. Leyten, M. Abebe, [et al\. II Clin Vaccine Immunol. - 2006. - V.13. - P.179-186.

62. Deshpande R.G. Superoxide dismutase activity of Mycobacterium tuberculosis patients and immunoreactivity of superoxide dismutase [Текст] / R.G Deshpande, M.B Khan, R.G Navalkar // Tuber Lung. - 1993. - V.74(6). -P.388-94.

63. Diaz-Infantes M.S. Evaluation of the MB/BacT Mycobacterium Detection System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis [Текст] / M. S. Díaz-Infantes, M. J Ruiz-Serrano, L. Martínez-Sánchez, A. Ortega, E. Bouza. // J Clin Microbiol - 2000. - V. 38(5). - P.l988-1989.

64. Diagbouga S. Immunoblot analysis for Serodiagnosis of tuberculosis Using a 45/47- Kilodalton Antigen Complex of Mycobacterium tuberculosis [Текст]. / S. Diagbouga, F. Fumoux, A. Zoubga, P.T. Sanou, G. Marchal. // Clinical and Diagnostic Laboratory immunology, 1997, May, vol. 4 No. 3, pp. 334-338.

65. Doffinger R. Inherited disorders of IL-12- and IFNgamma-mediated immunity: a molecular genetics update [Текст] / R. Doffinger, S. Dupuis, C. Picard, [et al\. // Mol Immunol-2002.-Vol.38.-P.903-9.

66. Dwyer B. DNA restriction fragment analysis to define an extended cluster of tuberculosis in homeless men and their associates [Текст] / В. Dwyer, К. Jackson, К. Raios, A. Sievers, E. Wilshire, B. Ross. // J Infect Dis.-1993. -V.167. C.490-494.

67. Ehlers S. Alphabeta T cell receptor-positive cells and interferon-gamma, but not inducible nitric oxide synthase, are critical for granuloma necrosis in mouse model of mycobacteria-induced pulmonary

immunopathology [Текст] / S. Ehlers, J. Benini, H.D. Held, С. Roeck, G. Alber, S. Uhlig. // J Exp Med. - 2001 .Vol.194.P. 1847-59.

68. Espitia C. The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding proteins? [Текст] / С. Espitia, J. P. Laclette, M. Mondragon-Palomino, [et al\. II Microbiology. - 1999. -V.145. - P.3487-3495.

69. Ferraz JC. Immune factors and immunoregulation in tuberculosis [Текст] / J.C. Ferraz, F.B. Melo, M.F. Albuquerque, S.M. Montenegro, F.G. Abath // Braz J Med Biol Res. - 2006. - Vol.39(l 1). - P. 1387-97.

70. Ficapal A. Diagnosis of Brucella ovis infection of rams with an ELISA using protein G as conjugate [Текст] / A. Ficapal, B. Alonso-Urmeneta, J. Velasco, I. Moriyon, J. M. Blasco // Vet Ree. - 1995.Vol.l37.-P.145-7,

71. Flynn JL. An essential role for interferon gramma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection [Текст] / J.L. Flynn, J. Chan, K.J. Triebold, D.K. Dalton [et al\ И J Exp Med.-l 993 .-Vol.178.-P.2249-54

72. Flynn JL. Tuberculosis: latency and reactivation [Текст] / J.L. Flynn, J. Chan // Infect Immun-2001.-Vol.69.-P.4195-201.

73. Flynn JL. Immunology of tuberculosis and implications in vaccine development [Текст]. / J.L. Flynn // Tuberculosis (Edinb).-2004.-Vol.84.P.93-101.

74. Frieden TR. Tuberculosis [Текст] / T.R. Frieden T.R. Sterling, S.S. Munsiff, C.J Watt, C. Dye // Lancet. - 2003.-Vol.362.-P 887-99.

75. Foulds J. New tools for the diagnosis of tuberculosis: the perspective of developing countries [Текст] / J. Foulds, R. O'Brien //Int Tubero Lung Dis.-l 998.-V.2.-P.778-83.

76. Garg S.K. Diagnosis of tuberculosis: available technologies, limitations, and possibilities [Текст] / S.K. Garg, R.P. Tiwari, D. Tiwari [et al\ II J Clin Lab Anal. - 2003. - V.17. -P155-163.

77. Garlanda С. Non-redundant role of the long pentraxin PTX3 in antifungal innate immune response [Текст]. / С. Garlanda, E. Hirsch, S Bozza [et аГ\ IINature-2002. -Vol.420.-P. 182-6.

78. Ghoshal U. Serodiagnosis of smear and culture-negative neurotuberculosis with enzyme linked immunosorbent assay for anti A-60 immunoglobulins [Текст] / U. Ghoshal, J. Kishore, B. Kumar, A. Ayyagari // Indian J Pathol Microbiol. - 2003. - V.46. - P.530-534.

79. Ghelani D.R. Diagnostic significance of immunoglobulins and adenosine deaminase in pleural effusion [Текст] / D.R Ghelani, F. S. Parikh, A. S. Hakim, J. V. Pai-Dhungat // J Assoc Physicians India. - 1999. - V.47. -P.787-790.

80. Gillespie SH. Monitoring the therapy of pulmonary tuberculosis by nested polymerase chain reaction [Текст]. / S.H. Gillespie, T.D. McHugh // J Infect.-1997.-Vol.35.-P.324-5.

81. Goto M. Evaluation of acridinium-ester-labeled DNA probs for identification of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellular complex in culture [Текст] / M. Goto, S. Oka, K. Okuzumi, S. Kimura, K. Shimada // J Clin Microbiol.-1991.-Vol.-P.2473-6.

82. Griese M. Pulmonary surfactant, lung function, and endobronchial inflammation in cystic fibrosis [Текст] / M. Griese, R. Essl, R. Schmidt [et al\ II Am J Respir Crit Care Med. - 2004.-Vol.170.-P 1000-5.

83. Griffin JP. Kinetics of accumulation of gamma delta receptor-bearing T lymphocytes in mice infected with live mycobacteria. / Harshan KV, Born WK, Orme IM // Infect Immun. - 1991.-Vol.59.-P.4263-5.

84. Grubek-Jaworska H. Serum and bronchoalveolar IgG against A60 and 38 kDa antigens in the diagnosis of tuberculosis [Текст] / H. Grubek-Jaworska, Z. Zwolska, P. Droszcz [et al\. // Int J Tuberc Lung Dis. - 1997. -V.l. - P.556-562.

85. Harboe M. Antibodies against BCG antigen 60 in mycobacterial infection [Текст] / M. Harboe, O. Closs, B. Bjorvatn, G. Bjune // Br Med J. -1977-V.2-P.430-433.

86. Harboe M. Secreted proteins of Mycobacterium leprae [Текст] / M. Harboe, H. G. Wiker, J. Scand // Immunol. - 1998. - V.48. - P.577-584.

87. Hayashi F. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function [Текст] / F. Hayashi, Т.К. Means, A.D. Luster // Blood.-2003. - Vol. 102.-P. 2660-9.

88. Havlir DV. A 19-year follow-up of tuberculin reactors. Assessment of skin reactivity and in vitro lymphocyte responses [Текст] / D.V. Havlir, K.F. Van Der, E. Duffy, R. Marshall, D. Horn, J.J Ellner // Chest. - 1991.-Vol.99.-P.l 172-6.

89. Hendrickson R.C. Mass spectrometric identification of mtb81, a novel serological marker for tuberculosis [Текст] / R.C. Hendrickson, J.F. Douglass, L.D. Reynolds [et al\. J Clin Microbiol. - 2000. - V.38. - P.2354-2361.

90. Hernandez C. Tuberculosis in the age of biologic therapy [Текст]. / С. Hernandez, A.S. Cetner, J.E. Jordan, S.N. Puangsuvan, J.K. Robinson // J Am Dermatol. - 2008. - Vol.59.-P.363-380.

91. Hellyer TJ. Strand displacement amplification and the PCR for monitoring response to treatment in patients with pulmonary tuberculosis [Текст] / T.J. Hellyer, T.W. Fletcher, J.H. Betes [et аГ\ II J Inter Dis.-1996.-Vol.l73.-P.934-41.

92. Hill PC, Quantitative T cell assay reflects infectious of Mycobacterium tuberculosis in an endemic case contact model [Текст] / P. С. Hill, A. Fox, D.J. Jeffries [et al\ II Clin Infect Dis. - 2005.-Vol.40.-P.273-8

93. Hirano T. Biological and clinical aspects of interleukin 6 [Текст] / Т. Hirano, S. Akira, T. Taga, T. Kishimoto // Immunol Totay. - 1990.-Vol.ll.-P.443-9.

94. Ho JL. Interleukin-4 inhibits human macrophage activation by tumor necrosis factor, granulocyte-monocyte colony-stimulating factor, and interleukin-3 for antileishmanial activity and oxidative burst capacity [Текст] / J.L. Ho, S.H. He, M.J. Rios, E.A. Wick // J Infect Dis. - 1992.-Vol.165.-P.344-51.

95. Houghton R.L. Use of Multiepitope Polyproteins in Serodiagnosis of Actiye Tuberculosis [Текст] / R.L. Houghton, M.J. Lodes, D.C. Dillon, L.D. Reynolds, C.H. Day, P.D.[et al\ II Clin diagn Lab Immmmunol. - 2002. - V. 9(4).-P. 883-891.5.

96. Jackett P.S. Specificity of antibodies to immunodominant mycobacterial antigens in pulmonary tuberculosis [Текст] / P.S. Jackett, G.H. Bothamley, H.V. Batra [et al\. II J Clin Microbiol. - 1988. - V.26. - P.2313-2318.

97. Julian E. Serodiagnosis of tuberculosis: comparison of immunoglobulin A (IgA) response to sulfolipid I with IgG and IgM responses to 2,3-diacyltrehalose, 2,3,6-triacyltrehalose, and cord factor antigens [Текст]. / E. Julian, L. Matas, A. Perez [et ai]. II J Clin Microbiol. - 2002. - V.40. - P.3782-3788.

98. Kanaujia G.V. Detection of early secretory antigenic target-6 antibody for diagnosis of tuberculosis in non-human primates [Текст] / G.V. Kanaujia, M.A. Garcia, D.M. Bouley [et аГ\. II Comp Med. - 2003. - V.53. -P.602-606.

99. Kato T. Proteolytic conversion of SAT3 alpha to STAT3 gamma in human neutrophils: role of granule-derived serine proteases [Текст] / Т. Kato, E. Sakamoto, H. Kutsuna, A. Kimura-Eto [et al\ II J Biol Chem. - 2004.-Vol.279. -P.31076-80.

100. Kent L. Demonstration of homology between IS6110 of Mycobacterium tuberculosis and DNAs of other Mycobacterium spp.? [Текст] /

L. Kent, T.D. McHugh, O. Billington, W.J. Dale, S.H. Gillespie // J Clin Microbiol.-l 995.-Vol.33 .-P.2290-3.

101. Kurup VP. Immunology of allergic bronchopulmonary aspergillosis[TeKCT] / V.P Kurup // Indian J Chest Dis Allied Sci-2000.-Vol.42.-P.225-37.

102. Laal S. Surrogate marker of preclinical tuberculosis in human immunodeficiency virus infection: antibodies to an 88-kDa secreted antigen of Mycobacterium tuberculosis [Текст]. / S. LaaL, K.M. Samanich, M.G. Sonnenberg [et at\. IIJ Infect Dis. - 1997. - V.176. - P.133-143.

103. Lalvani A. Enhanced contact tracing and the spatial tracking of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells [Текст] / A. Lalvani, A.A. Pathan, H. Durkan [et аГ\ II Lancet. - 2001.-Vol.357.-P.2017-21.

104. Lawn SD. Evaluation of a commercial immunodiagnostic kit incorporating lipoarabinomannan in the serodiagnosis of pulmonary tuberculosis in Ghana [Текст] / S.D. Lawn E.H. Frimpong, E. Nyarko // Trop Med Int Heath. - 1997.-Vol.2.-P.978-81

105. Levitz S.M. Mechanisms of resistance of A. fumigatus Conidia to killing by neutrophils in vitro [Текст] / S.M. Levitz, R.D. Diamond [et al\ II J Infect Dis.-l 985 .-Vol. 187.-P. 117-23.

106. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4.- Nature [Текст] / U.K Laemmli // London. - 1970. -V.227 - P.680-685.

107. Li L.F. Serodiagnosis of tuberculosis by enzyme-linked immunosorbent assay for anti-A60 and anti-A38 [Текст] / L.F. Li, M.C. Lin M, N. H. Chen [et al\. II Changgeng Yi Xue Za Zhi. - 1998. - V.21. - P.258-264.

108. Liang L. The right place at the right time: novel B7 family members regulate effector T cell responses [Текст] / L. Liang, W.C Sha // Curr Opin Immunol.-2002.-Vol. 14. - P.384-90.

109. Lichtenauer-Kaligs EG. Severe Mycobacterium bovis BCG infections in large of novel IL-12 receptor betal deficient patients and evidence for the existence of partial IL-12 receptor betal deficiency [Текст] / E.G. Lichtenauer-Kaligs, T. de Boer, F.A. Verreck [et al\. II Eur J Immunol-2003.-Vol. 33.-P.59-69.

110. Maeda J. Local production and localization of transforming growth factor-beta in tuberculous pleurisy [Текст] / J.Maeda, N. Ueki, T. Ohkawa [et al\. // Clin Exp Immunol—1993.-Vol.92.-P.32-8.

111. Malen H. Comprehensive analysis of exported proteins from Mycobacterium tuberculosis H37Rv [Текст] / H. Malen, F. S. Berven, К. E. Fladmark, H.G Wiker // Proteomics. - 2007. - V.7. - P. 1702-1718.

112. Manca C. Differential monocyte activation underlies strain-specific Mycobacterium tuberculosis pathogenesis [Текст] / С. Manca, M. В Reed, S. Freeman [et al\. И Infect Immun. - 2004.-Vol 72.-P.5511-4.

113. Maggi E. Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and IL-4 on the in vitro development of human Thl and Th2 clones [Текст] / E. Maggi, P. Parronchi, R. Manetti [et al\. II J Immunol. 1992.-Vol.l48.-P.1274-82.

114. Maheshwari A. Diagnostic utility of estimation of mycobacterial antigen A60 specific immunoglobulins in serum and CSF in adult neurotuberculosis [Текст] / A. Maheshwari, H.L. Gupta, S. Gupta [et al\. II J Commun Dis. - 2000. - V.32. - P.54-60.

115. Mastroeni P. Immunity to systemic Salmonella infections [Текст] / P. Mastroeni // Curr Mol Med.-2002.-Vol.2.-P.393-406.

116. Masungi C. Differential T and В cell responses against Mycobacterium tuberculosis heparin-binding hemagglutinin adhesin in infected healthy individuals and patients with tuberculosis [Текст]. / С. Masungi, S. Temmerman, J. P. Van Vooren [et al\. // J Infect Dis. - 2002. - 185. - P.513-520.

117. Mathema В. Molecular epidemiology of tuberculosis: current insights [Текст] / В. Mathema, N.E. Kurepina, P.J Bifani, B.N. Kreiswirth // Clin. Microbiol. Rev.- 2006. - Vol.19. -P.658-685.

118. Menozzi F.D., Identification of a heparinbinding hemagglutinin present in mycobacteria [Текст] / F.D Menozzi, J.H. Rouse, M. Alavi [et af\. II J Exp Med. - 1996. - V.184. - P.993-1001.

119. Mori T, Specific detection of tuberculosis infection: an interferon-gamma-based assay using new antigens [Текст] / Т. Mori, M. Sakatani, F. Yamagishi [et al\ll Am J Respir Crit Care Med. - 2004.-Vol.l70.-P.59-64

120. Mukherjee S. Potential Serological Use of a Recombinant Protein That Is a Replica of a Mycobacterium tuberculosis Protein Found in the Urine of Infected Mice [Текст] / S. Mukherjee, N. Daifalla N, Y. Zhang Y, J. Douglass [et al\ II Clin diagn Lab Immmmunol. - 2004. - V. 11(2).-P. 280-286.

121. Mukherjee P. The RD1-encoded antigen Rv3872 of Mycobacterium tuberculosis as a potential candidate for serodiagnosis of tuberculosis [Текст] / P. Mukherjee, M. Dutta M, P. Datta [et al\. II Clin Microbiol Infect. - 2007. -V.13. - P.146-152.

122. Nagai S. Isolation and partial characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium tuberculosis [Текст] / S. Nagai, G.H. Wiker, M. Harboe, M. Kinomoto // Infect Immun. - 1991. - V.59. - P.372-382

123. Nicholson L.B. T cell recognition of self and altered self-antigens [Текст] / B.L. Nicholson, V.K. Kuchroo // Crit Rev Immmunol. -1997.-Vol. 17.-P .449-62.

124. O'Toole R. A two-component regulator of universal stress protein expression and adaptation to oxygen starvation in Mycobacterium smegmatis [Текст] / R.A O'Toole, M.J Smeulders, M. C. Blokpoel [et al\. 11 J Bacteriol. -2003.-V.185.-P.1543-1554.

125. Parket LC. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 agonists regulate CCR expression in human monocytic cells [Текст]. / C.L Parket, M.K Whyte, S.N Vogel, S.K Dower, I. Sabroe // J Immunol.-2004.-Vol.l72.-P.4977-86.

126. Pethe K. The heparin-binding haemagglutinin of M. tuberculosis is required for extrapulmonary dissemination [Текст] / К. Pethe, S. Alonso, F. Biet [et al\. // Nature. - 2001. - V.412. - P.l90-194.

127. . Pethe K. Mycobacterium smegmatis lamininbinding glycoprotein shares epitopes with Mycobacterium tuberculosis heparin-binding haemagglutinin [Текст] /. К. Pethe, V. Puech, M. Daffe [et al\ II Mol Microbiol.

- 2001. - V.39. - P.89-99.

128. Proud D. Human rhinovirus infection induces airway epithelial cell production of human beta-defensin 2 both in vitro and in vivo [Текст]. / D.Proud, S.P Sanders, S. Wiehler // J Immunol.-2004.-Vol.l72.-P.4637-45.

129. Raja A. Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis [Текст]. / A. Raja, K.R Uma Devi, B. Ramalingam [et al\. II Clin Diagn Lab Immunol. - 2002. - V.9. - P.308-812.

130. Ramalingam B. Cloning, expression, and purification of the 27 kDa (MPT51, Rv3803c) protein of Mycobacterium tuberculosis [Текст] / В. Ramalingam, A.R Baulard,C. Locht [et at\. II Protein Expr Purif. - 2004 - V.36.

- P53-60.

131. von Reyn CF,. New vaccines for the prevention of tuberculosis [Текст] / C.F von Reyn, J.M Vuola // Clin Infect Dis - 2002. - Vol 35.- P. 465474.

132. Roman F. Deglycosylation of the 45/47 Kilodalton Antigen Complex of Mycobacterium tuberculosis Decreases Its Capacity To Elicit In Vivo or In Vitro Cellular Immune Responses [Текст] / F. Roman, С. Horn, P. Pescher, A. Namane, M. Riviere [et at] II Infection and Immunity. - 1999. -V.67 № 11. - P.5567-5572

133. Rook GA. Cytokines and the Koch phenomenon [Текст] / G.A Rook, R. al Attiyah // Tubercle.-1991.-Voll.72- P.13-20.

134. Samanich K.M. Delineation of human antibody responses to culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis [Текст] / K.M Samanich, J.T Belisle, M.G Sonnenberg [et aî\. И J Infect Dis. - 1998. - V.178. - P.l534-1538

135. Samanich K.M. Sérodiagnostic potential of culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis [Текст] / K.M Samanich, M.A Keen, V.D Vissa [et ai\. II Clin Diagn Lab Immunol. - 2000.V.7. - P.662-668.

136. Senol G. Humoral immune response against 38-kDa and 16-kDa mycobacterial antigens in tuberculosis[TeKCT] / G. Senol, O.F. Erer, Y.A. Yalcin, M. Coskun. [et al\ II Eur Respir J. - 2007. - V.29. P.143-148.

137. Singh K.K. Immunogenicity of the Mycobacterium tuberculosis PPE55 (Rv3347c) protein during incipient and clinical tuberculosis [Текст] / K.K Singh, Y. Dong Y, S. A Patibandla [ et al\. // Infect Immun. - 2005. - V.73.

- P.5004-5014.

138. Schaible U.E. CD1 molecules and CDl-dependent T cells in bacterial infections: a link from innate to acquired immunity? [Текст] / U.E Schaible, S.H Kauffmann // Semin Immunol.-2000.-Vol.l2.-P.527-35.

139. Shams H. Characterization of a M. tuberculosis peptide that is recognized by human CD4+ and CD8+ N cells in the context of multiple HLA alleles [Текст] / H. Shams, P. Klucar, S.E Weis [et ai]. II J. Immunol. - 2004.-Vol.173.-P.1966-77.

140. Silva V.M. Factors associated with humoral response to ESAT-6, 38 kDa and 14 kDa in patients with a spectrum of tuberculosis [Текст] / V.M Silva, G. Kanaujia , M.L Gennaro, D. Menzies // Int J Tuberc Lung Dis. - 2003.

- V.7. - P.478-484.

141. Somoskovi A. False-positive results for M. celatum with the AccuProbe M. tuberculosis complex assay [Текст] / A. Somoskovi, J.E Hotaling, M. Fitzgenerald [et at\. II J Clin Microbiol. - 2000.-Vol.38-P.2743-5.

142. Stenger S. Differential effects of cytolytic T cell subsets on intracellular infection [Текст] / S. Stenger, R.J Mazzaccaro, K. Uyemura. // Science.-1997.-Vol.276.-P.1684-7.

143. Strieter RM. Cytokines in innate host defense in the lung [Текст] / R.M Strieter, J.A Belperio, M.P Keane // J Clin Invest.-2002.-Vol.109.-P.699-705.

144. Sumi M.G. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by a dot immunobinding assay to detect mycobacterial antigen in cerebrospinal fluid specimens [Текст] / M.G Sumi, A. Mathai, C. Sarada, V.V Radhakrishnan // J Clin Microbiol. - 1999. - V.37. - P.3925-3927.

145. Suman L. Human humoral responses to antigens of Mycobacterium tuberculosis:Immunodominanca of High-Molecular-Mass antigens [Текст] / L. Suman, M.S Karen, M.G Sonnenberg, S. Zolla-Pazner [et al] // Clin. And Diag. Lab. Immun. - 1997. - V.4(l). - P.49-56.

146. Tasneem S. Crossreactivity of SLE autoantibodies with 70 kDa hsp of M.tuberculosis. [Текст] / S. Tasneem, N. Islam, R. Ali // Microbiol Immunol-2001 .Vol.45 .-P.888-92.

147. Theilmann L. Alpha tumor necrosis factor in the serum of patients with sarcoidosis, tuberculosis or bronchial cancer [Текст] / L. Theilmann, U. Meyer, B. Kommerell, R. Dierkesmann, A. Moller // Pneumologie-1990.-Vol.44.-P.735-8

148. Tsuyuguchi I. Increase of TCR y/5-bearing Tcells in cord blood factor [Текст] /1. Tsuyuguchi, H. Kawassumi, C. Ueta, I. Yano, S. Kishimoto // Infect Immmun Immun. -1991.-Vol.59-.P.3053-9

149. Ulrichs Т. New insights into the function of granulomas in human tuberculosis [Текст] / Т. Ulrichs, S.H. Kaufmann // J Pathol. - 2006. - Vol.208.-P.261-269.

150. Vassallo R. Mechanisms of defence in the lung: lessons from Pneumocystis carinni pneumonia [Текст] / R. Vassallo, C.F Thomas, Z. Jr.

Vuk-Pavlovic, A.H Limper // Sarcoidosis Vase Diffuse Lung Dis-2000.-Vol.l7.-P.130-9.

151. Verbon A. Serum concentration of cytokines in patients with active ТВ and after treatment [Текст] / A. Verbon, N. Juffermans, S.J Van Deventer, P. Speelman [etal\ //ClinExp. Immunol.-1999.-Vol.ll5.-P.110-3.

152. Verbon A. Antigens in culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis: epitopes defined by monoclonal and human antibodies [Текст] /

A. Verbon, S. Kuijper, H.M Jansen, P. Speelman, A.H Kolk // J Gen Microbiol. - 1990.-Vol.l36.-P.955-64

153. Waters W.R. Antigen recognition by serum antibodies in white-tailed deer (Odocoileus virginianus) experimentally infected with Mycobacterium bovis [Текст] / R.W Waters, M.V Palmer, J.P Bannantine, D.L Whipple , R. Greenwald, J. Esfandiari, P. Andersen [et al\ II Clin diagn Lab Immmmunol. - 2004. - V.l 1(5). - P.849-855

154. World Health Organization. The Stop ТВ Strategy, case reports, treatment outcomes and estimates of ТВ burden".Global tuberculosis control / epidemiology, strategy, financing - 2009. - P.187-300.

155. Wang B.L. Antibody response to four secretory proteins from Mycobacterium tuberculosis and their complex antigen in ТВ patients [Текст] /

B.L Wang, Y. Xu, Z.M Li, Y.M Xu [et al\ И Int J Tuberc Lung Dis. - 2005. -V.9(12). - P.1327-1334.

156. Wang J. A mutation in the insulin 2 gene induces diabetes with severe pancreatic beta-cell dysfunction in the Mody mouse [Текст] / J.A Wang, T. Takeuchi, S. Tanaka [etal]. II J Clin Invest.-1999.-Vol. 103.-P.27-37.

157. Wayne L.G. Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease [Текст] / L.G Wayne // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. - 1994. -V.13. - P.908-914.

158. Weldingh K. Assessing the sérodiagnostic potential of 35 Mycobacterium tuberculosis proteins and identification of four novel

serological antigens [Текст] / К. Weldingh, I. Rosenkrands, L.M Okkels [et al\. I IJ Clin Microbiol. - 2005. - V.43. - P.57-65.

159. Weber. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis [Текст] / Weber, M Osborn // J. Biol. Chem. - 1969. V.244 P.4406-4412.

160. Wiker H.G. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobacterium tuberculosis [Текст] / H.G Wiker, M. Harboe // Microbiol Rev. -1992.-V.56.-P.648-661.

161. Yuan Y. III. Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: function of the mycobacterial alpha-crystalline homolog [Текст] / Y. Yuan, D.D Crane, C.E Barry // J Bacteriol. - 1996. -V.178. - P.4484-4492.

162. Yuan Y. The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages [Текст]. / Y. Yuan, D.D Crane, R.M Simpson [et al\. II Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. - V.95. - P.9578-9583