Получение очищенной коллагеназы CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM и разработка мазей на ее основе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Колпакова, Елена Геннадьевна

• Колпакова, Елена Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Колпакова, Елена Геннадьевна

Список основных сокращений

Введение

Глава 1. Коллагеназа Clostridium histolyticum: свойства, технологии получения, применение в клинической практике (обзор литературы)

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Объект исследования

2.2. Материалы исследования

2.3. Методы оценки физико-химических свойств коллагеназы Clostridium histolyticum

2.4. Методы оценки биологической активности препарата коллагеназы

2.5. Методы для изучения физико-химических свойств мазей

2.5. Биологические методы исследования

2.6. Микробиологические методы исследования

2.7. Статистический анализ результатов

Глава 3. Получение очищенной лиофилизированной коллагеназы Clostridium histolyticum

3.1. Получение концентрированной очищенной коллагеназы

3.2. Получение лиофилизированного препарата

Глава 4. Физико-химические и иммунобиологические свойства коллагеназы Clostridium histolyticum

4.1. Физико-химические свойства

4.2. Иммунобиологические свойства

4.2.1. Изучение элиминации коллагеназы из организма животных в зависимости от способа введения

4.2.2. Экспериментальное изучение токсичности препаратов, содержащих коллагеназу Clostridium histolyticum

4.2.3. Испытание на пирогенность

4.2.4. Экспериментальное изучение аллергенного действия коллагеназы Clostridium histolyticum

Глава 5. Теоретическое и экспериментальное обоснование состава коллагеназосодержащих мазей

5.1. Выбор основ для мазей

5.2. Разработка оптимального состава мазей

5.3. Структурно-механические параметры мазей

5.4. Осмотическая активность мазей

5.5. Характеристика антимикробного действия коллагеназосодержащих мазей

5.6. Изучение стабильности мазей в процессе хранения

5.6.1 .Физико-химическая стабильность

5.6.2.Структурно-механическая стабильность

5.6.3.Антимикробная и микробиологическая стабильность

Глава 6. Изучение эффективности и безвредности мазей с коллагеназой в опытах на животных

6.1. Влияние мазей на раневую инфекцию у кроликов

6.2. Влияние мазей на заживление ожоговых ран

6.3. Морфологическая характеристика инфицированных и ожоговых ран при лечении мазью с коллагеназой

6.4. Влияние мазей на заживление резаных ран

6.5. Противовоспалительное действие мазей

6.6. Местно-раздражающее действие мазей

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение очищенной коллагеназы CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM и разработка мазей на ее основе»

Ферментные препараты находят всё большее применение в различных областях медицины: в хирургии, гинекологии, отоларингологии, офтальмологии, а также в дерматологии и косметологии [46,130,153]. Благодаря способности катализировать гидролиз белковых субстратов, протеолитические ферменты эффективно лизируют некротизированные ткани, гнойные экссудаты, оказывают одновременно противовоспалительное, фибринолитическое и противоотечное действие [72,93,187,211]. Они способствуют безболезненному очищению ран от некротических тканей, избирательно действуют на поврежденные ткани и, в отличие от хирургического очищения ран, не нарушают здоровые участки кожи [2,69,152,214].

К числу таких ферментов относится и коллагеназа Clostridium histolyticum, обладающая способностью гидролизовать в коллагене пептидные связи, образованные глицином и пролином, трудно поддающиеся гидролизу другими ферментными препаратами [219]. Это свойство коллагеназы обусловило использование ее при патологических процессах, ведущих к избыточному образованию соединительных тканей, в частности, в форме кело-идных рубцов, а также для очищения гнойных и ожоговых ран от некротических тканей [169, 181,191,227].

В клинической практике для энзиматического очищения ран много лет успешно применяется мазь "Ируксол", содержащая в своем составе коллаге-назу С.histolyticum, выпускаемая фирмами "Pliva" и "Knoll " [69,116]. В 90-х годах появились две новые разработки фирмы "Knoll" - мази Santyl® и No-vuxol® с коллагеназой С. histolyticum [133,161,236].

В нашей стране выпускается препарат - коллализин, представляющий собой лиофилизированную коллагеназу С. histolyticum в ампулах и используемый, главным образом, в офтальмологии для лечения заболеваний глаз, сопровождающихся образованием рубцовой ткани [86,123].

Отечественных мазей на основе коллагеназы не создано, а лицензионные импортные препараты являются дорогостоящими, что ограничивает их широкое использование в клинической практике. Кроме того, технологии получения очищенной коллагеназы С. histolyticum, а также составы лекарственных форм на ее основе защищены патентами.

Цель работы - разработка промышленного способа получения очищенной коллагеназы С. histolyticum и создание на ее основе иммобилизованных форм в виде мазей.

Основные задачи исследования

1. Разработать промышленную технологию получения очищенной лио-филизированной коллагеназы С. histolyticum с использованием мембранных методов разделения.

2. Изучить физико-химические и иммунобиологические свойства коллагеназы С. histolyticum, полученной по разработанной технологии.

3. Разработать иммобилизованные формы фермента в виде многокомпонентных мазей, обосновать их состав, изучить физико-химические свойства.

4. Провести доклиническое изучение коллагеназосодержащих мазей на моделях инфицированных, ожоговых и резаных ран в экспериментах на животных.

Научная новизна и практическая значимость

1. Разработана оригинальная технология получения очищенной коллагеназы С. histolyticum с использованием мембранных методов разделения. Оформлена Заявка № 99117840/13 (018794) на изобретение «Способ получения коллагеназы С. histolyticum», приоритет от 23.08.99. На технологию производства составлен экспериментально-производственный регламент и Фармакопейная статья предприятия.

2. Впервые произведена оценка безопасности коллагеназы С. histolyticum, включающая характеристику токсичности, пирогенности, аллергенности. Установлено, что коллагеназа, полученная по разработанной технологии, нетоксична, апирогенна и не обладает сенсибилизирующей активностью.

3. Разработаны иммобилизованные формы фермента коллагеназы в виде мазей на гидрофильной основе двух составов: состав 1-е антибиотиком, состав 2 - без антибиотика. Установлено, что разработанные многокомпонентные мази обладают некролитическим, антимикробным, противовоспалительным и дегидратирующим действием, а также стимулируют процессы репарации в ране. Оформлена Заявка № 99117849/14 (018793) на изобретение «Мазь для заживления ожоговых и инфицированных ран», (приоритет от 18.11.99). Составлен экспериментально-производственный регламент на мазь «Колла-гентин», ФСП и проект Инструкции по применению мази.

4. По результатам проведенных клинических и морфологических исследований показано, что мазь «Коллагентин» (состав 1) является более эффективным ранозаживляющим и противовоспалительным средством, чем мазь «Ируксол».

Положения, выносимые на защиту

1. Очищенная коллагеназа, полученная из С. histolyticum по оригинальной технологии с использованием мембранных методов разделения, нетоксична, апирогенна, не обладает сенсибилизирующей активностью и может быть использована в лечебных целях.

2. Мази на гидрофильной основе, содержащие коллагеназу С. histolyticum, обладают некролитическим, антимикробным, противовоспалительным и дегидратирующим действием, а также стимулируют процессы репарации в ране. Мази не оказывают резорбтивного и местно-раздражающего действия.

3. Коллагеназа С. histolyticum в виде гидрофильных мазевых композиций является более эффективным ранозаживляющим средством, чем липофиль-ная мазь «Ируксол».

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Колпакова, Елена Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная промышленная технология получения очищенной коллагеназы С. histolyticum с использованием мембранных методов разделения, обеспечивающая высокий выход целевого продукта. Полученная коллагеназа по степени чистоты не уступает зарубежному аналогу производства фирмы "Sigma" и обладает более высокой степенью чистоты, чем отечественный препарат коллализин.

2. Впервые произведена оценка безопасности очищенной коллагеназы С. histolyticum, включающая характеристику токсичности, пирогенности, аллер-генности. Коллагеназа, полученная по разработанной технологии, нетоксична, апирогенна, не обладает сенсибилизирующей активностью и может быть использована в качестве лечебного средства.

3. Разработаны иммобилизованные формы коллагеназы С. histolyticum в виде мазей на гидрофильной основе. Установлено, что мази на полиэтиле-ноксидной основе обладают более высокой антимикробной активностью в отношении основных возбудителей раневых инфекций, более выраженным осмотическим действием и оптимальными консистентными свойствами.

4. В доклинических испытаниях показано, что многокомпонентные мази на полиэтиленоксидной основе обладают некролитическим, антимикробным, противовоспалительным и дегидратирующим действием, а также стимулируют процессы репарации в ране. При длительном применении мази не оказывают резорбтивного и местно-раздражающего действия.

5. По результатам клинических и морфологических исследований установлено, что коллагеназа С. histolyticum в виде гидрофильных мазевых композиций является более эффективным ранозаживляющим средством, чем ли-пофильная мазь «Ируксол». Разработанная мазь способствует равномерному созреванию грануляций и эпителизации раны, обеспечивает очищение ран и ликвидацию гнойного воспаления в более ранние сроки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Коллагеназа Clostridium histolyticum, обладающая способностью специфически расщеплять молекулу коллагена - основного компонента соединительной ткани, являлась объектом многих исследователей [30,71,138, 156,181]. Как правило, для получения очищенной коллагеназы С. histolyticum использовались многостадийные способы, включающие хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрагеле Ac А34, коллаген-сефарозе, сульфопропилсе-фарозе, сефакриле и сефадексе [139,195,222,143]. Однако все известные способы получения и очистки фермента являются сложными, длительными по времени, не обеспечивающими высокий выход целевого продукта и, вследствие этого, дорогостоящими. Кроме того технологии получения и очистки коллагеназы С. histolyticum защищены патентами.

Целью настоящей работы явилась разработка промышленной технологии очищенной коллагеназы С. histolyticum и создание на ее основе иммобилизованных форм в виде мазей.

В Пермском НПО «Биомед» д.м.н. Н.П. Ефимовой разработана эффективная казеиново-соево-пепсинная среда, обеспечивающая получение коллагеназы С. histolyticum с высокой специфической активностью [14].

Наша задача заключалась в разработке оптимального метода выделения и очистки коллагеназы, полученной при культивировании С. histolyticum 468 (Н) на казеиново-соево-пепсинной среде.

Известно, что для выделения и очистки различных биологически активных соединений успешно используются мембранные методы разделения, являющиеся перспективными и экономически целесообразными [154,197, 215,217].

В связи с этим предпринято изучение возможности использования мембранного разделения (ультрафильтрации, диафильтрации) в разработке способа очистки коллагеназы с целью получения высокоочищенного препарата для лечебных целей.

В результате проведенных исследований разработана технология получения очищенного препарата коллагеназы С. histolyticum, включающая в себя культивирование С. histolyticum на казеиново-соево-пепсинной среде, очистку и концентрирование фильтрата культуры на ультрафильтрационных мембранах с порогом задержания веществ по молекулярной массе 50 кДа, с последующей диафильтрацией дистиллированной водой и 0,9 % раствором хлорида натрия, стерилизующей фильтрацией и лиофильным высушиванием препарата.

Разработанный способ является технологичным, объединяет стадии очистки и концентрирования, упрощает процесс получения фермента, максимально сохраняет специфическую активность и позволяет получить стерильный, апирогенный препарат.

По разработанной технологии были получены 3 экспериментально-производственные серии коллагеназы С. histolyticum в ампулах и изучены физико-химические свойства препарата. Было установлено, что коллагеназ-ная активность в ампуле составляет 0,2-0,3 КЕ, 1 мг препарата содержит 2735 мкг белка, 0,1-0,8 ПА (протеолитической активности). Оптимум рН фермента составляет 6,5-7,2. По показателям активности, растворимости, белку, рН, массовой доли влаги, прозрачности и цветности коллагеназа, полученная по разработанной технологии, аналогична коммерческому препарату колла-лизину, выпускаемому Санкт-Петербургским НИИВС, предназначенному, главным образом, для лечения заболеваний глаз, сопровождающихся избыточным образованием рубцовой ткани. С помощью электрофореза в ПААГ установлено, что полученная коллагеназа по степени чистоты не уступает зарубежному аналогу производства фирмы "Sigma" и обладает более высокой степенью чистоты, чем коллализин.

Следующий раздел наших исследований заключался в изучении иммунобиологических свойств препарата коллагеназы, полученного по разработанной технологии.

На первом этапе исследования проведено изучение кинетики выведения коллагеназы из организма животных. В связи с тем, что широко используемый для изучения фармакокинетики различных веществ метод радиоактивной метки [95] является дорогостоящим и требует специального оборудования, нами разработан сэндвич-вариант ИФА, обладающий высокой чувствительностью и позволяющий определять коллагеназу в следовых количествах [31,146]. При изучении кинетики выведения коллагеназы у кроликов при однократном внутривенном введении установлено, что основное количество фермента выводится из крови кроликов через 6 часов после введения, а через сутки концентрация коллагеназы в крови снижается до нуля. Максимальная концентрация коллагеназы в крови животных при внутримышечном способе введения создается через 6 часов с момента инъекции препарата, через 48 часов препарат в крови не обнаруживается. При подкожном введении препарата максимальная концентрация коллагеназы в крови достигается через 24 часа и полностью фермент выводится из организма животных через 3 суток.

Изучение острой и хронической токсичности препарата проводили в сравнении с коммерческим препаратом коллализином. Результаты сравнительной оценки острой токсичности в тесте отека конечности мышей при введении препаратов в дозах, эквивалентных по белку, свидетельствуют о том, что менее токсичной оказалась коллагеназа. Степень отёка конечности в группе коллализина более чем в 2 раза превышала таковую в группе с коллагеназой (р<0,001).

Сравнение массы животных, получавших разные дозы препарата коллагеназы и коллализина в эксперименте по изучению хронической токсичности, показало, что во все сроки исследования масса подопытных и контрольных животных существенно не различалась (/?>(),05). Это свидетельствует об отсутствии токсичности исследуемых препаратов при длительном введении в дозах, эквивалентных (в пересчете на 1 кг веса) терапевтической и максимальной дозам, рекомендуемым для людей.

Максимально переносимая доза препарата коллагеназы не выявлена из-за низкой токсичности фермента. По этой же причине не удалось установить LD50 для препарата. Проведённые исследования позволяют заключить, что препарат относится к 5 классу токсичности (практически нетоксичен) по классификации Сидорова [107].

В результате исследований аллергенного действия препарата в реакции ГНТ было установлено, что введение коллагеназы в исследуемых дозах не приводило к развитию анафилаксии у морских свинок (р>0,05 по сравнению с контрольной группой). Способность препарата коллагеназы вызывать сенсибилизацию организма изучалась также в реакции ГЗТ на беспородных белых мышах и морских свинках [73]. Показано, что введение коллагеназы в подушечку лапы мышей, предварительно сенсибилизированных инъекцией препарата в ПАФ, не вызывало достоверного увеличения массы лапы по сравнению с контрольной группой (р>0,05). Внутрикожные реакции у морских свинок отсутствовали. Изучение влияния коллагеназы на развитие ГЗТ и ГНТ в тесте конъюнктивальной пробы на морских свинках также не сопровождалось развитием аллергических реакций конъюнктивы во все сроки наблюдения.

Таким образом, на основании проведенных исследований установлено, что коллагеназа С. histolyticum, полученная по разработанной технологии, нетоксична, не вызывает аллергических реакций, не обладает сенсибилизирующей активностью и может быть использована в лечебных целях. Результаты проведенных исследований явились основанием для разработки НТД на препарат: Фармакопейной статьи и «Производственного регламента на кол-лагеназу С. histolyticum очищенную, лиофилизированную», который был утвержден на Научно-техническом Совете НПО «Биомед» (протокол № 1 от 21 января 1999 г.). На способ получения коллагеназы подана Заявка 99117840/13 (018794) на изобретение, приоритет от 23.08.99, признанная патентоспособной.

В клинической практике перспективным направлением является использование иммобилизованных форм ферментов, которые обладают повышенной стабильностью, сниженной антигенностью и пролонгированным действием по сравнению с нативными формами ферментов [34,58,109]. Самую большую группу иммобилизованных протеолитических ферментов (ИПФ) представляют собой мази и гели [1,130]. Известно, что эффективность местного лечения инфицированных ран и ожогов можно повысить путем использования научно обоснованных многокомпонентных мазей, обладающих многонаправленным действием на рану. Это возможно путем создания комбинированных лекарственных форм, где каждый из компонентов оказывает влияние на тот или иной фактор раневого процесса [45,60,65,88].

На первом этапе исследований нами осуществлен скрининг мазевых основ, способных обеспечить максимальное сохранение коллагеназной активности и извлечение коллагеназы из мазевой основы [38]. Установлено, что максимальное извлечение коллагеназы происходит из гидрофильных основ - гелей синтетических или полусинтетических ВМС, таких как Na КМЦ и ПЭО, которые были отобраны для дальнейшего изучения.

По мнению клиницистов, в состав комбинированной мазевой формы для лечения инфицированных ран и ожогов должен входить антимикробный компонент [45. В результате исследований по изучению совместимости коллагеназы с различными антибиотиками мы остановили свой выбор на гента-мицина сульфате и ввели его в мазевую основу в количестве 0,1 %. Гентамицин в настоящее время применяется для лечения гнойных и ожоговых ран, достаточно эффективен против основных возбудителей гнойной инфекции и является, по данным ряда авторов, единственным антибиотиком, который может проникать через ожоговый струп [4,24].

Известно, что структурно-механические параметры оказывают заметное влияние на процесс высвобождения ферментов из мазей, а также на потребительские свойства: намазываемость, фасуемость, способность выдавливаться из туб и т.д. [67,91]. Характер полученных нами реограмм течения мазей позволяет сделать вывод о том, что исследуемые образцы мазей представляют собой вязкопластичные, тиксотропные системы. Значения показателя механической стабильности позволяют предположить наличие в мазях коагуляционных связей, которые после разрушения структуры могут восстанавливаться [104]. В то же время следует отметить, что реограмма течения мази на ПЭО-основе полностью входит в реологический оптимум консистенции для гидрофильных мазей, в то время как реограмма течения мази на Na КМЦ-основе не укладывается в этот диапазон [6].

Осмотическая активность мазей во многом определяет специфическую активность мази, особенно в первой фазе раневого процесса [40]. Результаты исследований осмотической активности разработанных мазей показали, что мази обладают высоким дегидратирующим действием по сравнению с контролем (гипертоническим раствором хлорида натрия). Наиболее выраженными осмотическими свойствами обладает мазь на ПЭО-основе, которая превосходит гипертонический раствор натрия хлорида по силе действия в 35 раз, а по продолжительности действия в 9 раз. Мазь на основе Na КМЦ обеспечивает мягкое по силе (73,3 %) и менее длительное дегидратирующее действие (8 часов) по сравнению с мазью на ПЭО-основе (18 часов).

Более высокой антибактериальной активностью, определенной по отношению к основным возбудителям раневых инфекций (Е. coli, P. aeruginosa, S. aureus, В. subtilis), обладает мазь на ПЭО-основе. МПК препарата в отношении изучаемых штаммов колеблется в пределах от 0,45 до 15,6 мкг/мл, а минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - в пределах от 1,8 до 62,5 мкг/мл. Наибольшую чувствительность к действию этой мази проявляет S. aureus. Мазь на Na КМЦ-основе обладает менее выраженным бактерицидным действием в отношении штаммов стафилококка и кишечной палочки. МБК этого препарата составляет 7,8-125 мкг/мл. В связи с тем, что минимальная бактерицидная концентрация мази на Na КМЦ-основе выше МБК мази на ПЭО-основе, можно сделать вывод, что антибактериальный эффект мази зависит от природы носителя: ПЭО-основа усиливает действие антибиотиков и обладает слабым антимикробным действием.

В процессе хранения изучали физико-химическую, структурно-механическую и микробиологическую стабильность коллагеназосодержащих мазей.

В течение года (срок наблюдения) при температуре +4° С расслоения, изменения цвета и запаха в мазях не наблюдалось. Значения рН водных извлечений мазей также достоверно не изменились. Специфическая активность коллагеназы в течение указанного срока в мазях как на ПЭО-основе, так и на Na КМЦ-основе также осталась на прежнем уровне (р>0,05). Установлено, что после хранения мазей в течение одного года при температуре 4° С их реологические свойства практически не изменились и укладываются в ошибку данной методики определения (4 %). Исследования показали, что мази с коллагеназой, сохраняют антимикробную активность и микробиологическую чистоту на уровне исходных значений в течение 12 месяцев (срок наблюдения).

Таким образом, проведенные исследования стабильности иммобилизованных форм коллагеназы' в виде мазей на гидрофильных основах показали, что разработанные мази по всем показателям соответствуют требованиям, предъявляемым ГФ к мазям [37].

Комплексная оценка экспериментальных исследований показала, что мазь с коллагеназой на ПЭО-основе обладает более высокой антимикробной активностью по сравнению с мазью на Na КМЦ-основе, более выраженным осмотическим действием и обладает оптимальными консистентными свойствами. Мазь на Na КМЦ-основе обладает более «мягким» по силе и менее продолжительным осмотическим действием. Кроме того, гели Na КМЦ вследствие быстрого высыхания образуют на коже тонкую пленку, могут вызвать ее стягивание, образование трещин и прилипают к повязке [42]. Консистентные свойства мази также не укладываются в реологический оптимум для гидрофильных мазей.

Таким образом, согласно нашим данным, оптимальной гидрофильной основой для коллагеназосодержащей мази являются полиэтиленоксиды (ПЭ0400 и ПЭО-1500).

Изучение эффективности мази «Коллагентин» двух составов (состав 1с антибиотиком, состав 2 - без антибиотика) проводили на моделях инфицированных, ожоговых и резаных ран в опытах на животных в сравнении с мазью «Ируксол».

В результате проведенных исследований показано, что под действием коллагеназы, содержащейся в основе мази, в инфицированных ранах уже на вторые сутки отмечается изменение характера некротических тканей, выражающееся в их размягчении. Отмечено сокращение сроков некролиза и появления грануляций в более ранние сроки по сравнению с контрольными группами. Применение разработанных мазей ведет к сокращению сроков заживления ран с 27,4+1,0 суток (контрольная группа с гипертоническим раствором хлорида натрия) до 17+0,4 суток (мазь состава 1) и до 20,0+0,6 суток (мазь состава 2). Использование мазей с коллагеназой ослабляет развитие инфекционно-воспалительного процесса, что выражается снижением лейкоцитоза и нормализацией ректальной температуры. При динамическом бактериологическом мониторинге максимальное снижение микробной обсеменен-ности ран на 5 день лечения отмечено у животных, обрабатываемых мазью состава 1, что свидетельствует о высокой антимикробной активности мази.

На модели стандартных ожоговых ран обнаружено, что по интенсивности лизирующего действия разработанные мази не уступают импортному запатентованному средству - мази "Ируксол" и способствуют более быстрой эпителизации ран. У животных в опытной группе с мазью состава 1 отмечено сокращение сроков появления грануляций (5-6-е сутки) по сравнению с «Ируксолом» (7-9-е сутки). Сроки заживления ожоговых ран сократились при этом с 25,2 +0,4 суток (нелеченые раны) до 18,2+0,2 суток (мазь состава 1) и до 19,8+0,4 суток (мазь состава 2). В контрольных группах животных раны длительное время были покрыты плотным струпом и заживление наступало значительно позднее. Отмечено, что ожоговые раны при лечении мазями с коллагеназой заживали мягким линейным рубцом, избыточного рубцевания не наблюдалось, в то время как в контрольных группах животных рубец был более грубым и большим по размеру.

Морфологическая характеристика инфицированных и ожоговых ран подтвердила клинические данные о том, что мазь "Коллагентин" оказалась эффективным средством для лечения ожоговых и гнойных ран. По сравнению с липофильной мазью "Ируксол", разработанная мазь на гидрофильной основе способствует более равномерному созреванию грануляций и эпители-зации раны, обеспечивает очищение ран от некротических тканей и ликвидацию гнойного воспаления в более ранние сроки.

Согласно литературным данным, аппликации коллагеназы стимули-рют репаративные процессы в ране [160,169]. Экспериментальные данные изучения регенерационных свойств мазей, полученные с помощью метода ранотензиометрии [33,70], свидетельствуют о том, что мазь «Коллагентин» достоверно увеличивает крепость послеоперационного рубца (р<0,001) по сравнению с «Ируксолом» и контрольной группой животных, а, значит, стимулирует заживление резаных ран морских свинок.

В экспериментах по изучению местно-раздражающего действия мази показано, что «Коллагентин» не вызывает местные изменения кожи морских свинок в виде отека и гиперемии в месте втирания мази. Не отмечено и общего резорбтивного действия мази, о чем свидетельствует отсутствие изменения массы животных опытных групп по сравнению с контролем.

142

При изучении противовоспалительной активности коллагеназосодер-жащих мазей на каррагениновой модели экссудативного воспаления [92] показано, что разработанные мази обоих составов обладают отчетливо выраженным противовоспалительным действием и превосходят по этому показателю препарат сравнения - мазь «Ируксол» (р<0,05).

Таким образом, в результате исследований установлено, что мази с коллагеназой обладают некролитическим, антимикробным, противовоспалительным и дегидратирующим действием, а также стимулируют процессы репарации в ране. Мазь состава 1 превосходит по ранозаживляющему действию запатентованное средство - мазь «Ируксол», что подтверждено морфологическими исследованиями. По эффективности мазь состава 2 не уступает препарату сравнения - мази «Ируксол» и превосходит его по противовоспалительному действию. Мазь не содержит в своем составе антибиотик и может быть использована для лечения неосложненных инфицированных, ожоговых и резаных ран, профилактики и лечения келоидных рубцов.

На мазь «Коллагентин» составлена нормативно-техническая документация: экспериментально-производственный регламент «Мазь «Коллагентин», Фармакопейная статья предприятия и Инструкция по применению мази. Подана заявка на изобретение 99117849/ 14 (018793): «Мазь для заживления ожоговых и инфицированных ран», приоритет от 18.11.99 г.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Колпакова, Елена Геннадьевна, 2001 год

1. Адамян А.А., Глянцев С.П. Пролонгированная многокомпонентная терапия - развивающееся направление в комплексном лечении гнойных ран//Хирургия.- 1992. -N. 7/8. - С. 105-116.

2. Адарченко А.А., Красильников А.П., Собещук О.П. Сравнительное исследование активности антибиотиков и антисептиков//Антибиотики и химиотерапия. -1991. Т. 36. - N. 2. - С. 21-23.

3. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Яковлев В.П. Антибактериальная терапия в комплексном лечении и профилактике инфекционных осложнений при ожогах//Русский мед. журнал. 1997. - Т. 5. - N. 24. - С. 32-40.

4. Андреенко Г.В., Лютова Л.В., Руденская Г.Н., Карабасова М.А., Купенко О.Г., Исаев В.А. Фибринолитические и тромболитические свойства препарата морикразы//Вопросы медицинской химии. 1994. - Т. 40, Вып. 3. - С. 43 - 46.

5. Аркуша А.А. Исследование структурно-механических свойств мазей с целью определения оптимума консистенции: Автореф. дис. .канд. фарм. наук-Харьков, 1982.-24 с.

6. А.с 694534 С 12 D 13/10 Способ получения коллагеназы/В.О. Рождественская, А.И. Углева, Т.И. Замыслова. 1979. - 4 с.

7. А.с. 1699350 С 12 N 9/64 Способ очистки коллагеназы/И.Ю. Сахаров, А.А. Артюков, В.И. Березин. 1991- 6 с.

8. А.с. 1820505 А 61 К 9/06 Антимикробное средство "Протэгентин'УЭ.З. Каган, Н.И. Синицина, Л.К. Граковская и др. 1990. - 10 е.: ил.

9. А.с. 1822879 С 12 N 9/58 Способ получения коллагеназы/Н.С. Демина, С.В. Лысенко. 1993. - 6 с.

10. А.с. 2003346 А 61 К 37/54 Композиция для ферментативного гидролиза белков/Р.И. Салганик, A.M. Гончар, А.В. Троицкий. 1993 - 8 с.

11. А.с. 20207432 А 61 К 9/06 Мазь для длительно незаживающих ран/В .Н. Никандров, Е.Д. Белоенко, О.А. Казючиц, Т.Г. Рытик, В.И. Старовойтов. 1995.-8 с.

12. А.с. 2039819 Способ получения коллагеназы/А.А. Артюков, И.Ю. Сахаров. 1995. - 8 с.

13. А.с. 813966 С 12 N Способ получения питательной основы для получения летального токсина Costridium. histolyticum/Jl.Tl. Ефимова.- 1979. -4 с.

14. А.с. А 61 К 37/ 48 N. 17295113 Ранозаживляющее средство/Н.Ф. Масло-ва, Ж.А. Любецкая, Е.Ю. Колесник. 1992. - 6 с.

15. А.с. 1030409 С 12 N 9/64 Способ выделения комплекса протеолитических ферментов из морепродуктов/М.В. Колодзейская, С.А. Кудинов, Л.М. Эпштейн, В.Н. Акулин. 1983. - 6 с.

16. Бахмудов Б.Р. Лечение альвеолита ируксолом//Стоматология. 1988. - Т. 67.- N.4.-C. 82.

17. Безбородов A.M. Исследования по получению ферментов в СССР (об-зор)//Приклад. биохимия и микробиология. 1977.- Т. 13, Вып. 6.- С. 805-818.

18. Белобрагина Г.В. Действие коллагеназы на склероз при различных видах пневмокониоза//Гигиена труда и проф. заболеваний. 1980.- N. 4. - С. 30-33.

19. Белов С.Г. Многокомпонентные мази на гидрофильной основе для профилактики и лечения местной гнойной инфекции: Автореф. дис. . .д-ра. мед. наук Харьков, 1987. - 22 с.

20. Белоус A.M., Цветков Ц.Д. Научные основы технологии сублимационного консервирования. Киев: Наукова Думка, 1985. - 208 с.

21. Березовская И.В., Неугодова Н.П., Долгова Г.В., Ситников А.Г. Отечественный «суверенитет» биологического контроля безопасности иммунобиологических препаратов//Фарматека. 1999. - N. 3. - С. 34-37.

22. Блатун JI.A., Игнатенко С.Н., Жуков А.О. и др. Опыт применения мазей на гидрофильной основе для местного лечения гнойных ран в первой фазе раневого процесса//В кн.: Современные вопросы частной хирургии.- М., 1986.-С. 151-154.

23. Блатун Л.А., СветухинА.М., Митиш В.А. Профилактика госпитальной инфекции при реконструктивно-восстановительных операциях с помощью пролонгированной формы гентамицина на коллагеновой осно-ве//Клинич. фармакология и терапия. 1998. - Т. 7. - С. 18-25.

24. Брок Т. Мембранная фильтрация. М.: Мир, 1987. - 462 с.

25. Венчиков А.И. Основные приёмы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: Медицина, 1974.- 151 с.

26. Веремеенко К.Н. Современное состояние и основные задачи медицинской энзимологии (обзор)//Врачебное дело 1982 N. 8. - С. 8-14.

27. Виноградов В.М., Стрижевский Б.М., Надзьведь М.К. Устройство для измерения силы раневого рубца операционных ран//Здравоохранение Белоруси. -1987. N. 5.- С. 67-68.

28. Власов В.В., Звягин В.И., Штерншис Ю.С. Лечение ран с применением ферментов//Воен.- мед. журнал. 1974.-N. 7 - С. 62-63.

29. Власова Е.В., Соловьёва Н.И. Простой способ получения высокоактивного препарата коллагеназы//Вопросы мед. химии.- 1962. -Т. 8, Вып.4. С. 112-114.

30. Власова Е.В., Соловьёва Н.И., Толовская К.Р. Антигенные и иммуногенные свойства очищенной коллагеназы С. histolyticum//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 1968. - N. 8. - С. 109-112.

31. Герасимова Л.И., Дадашев А.И., Толстых П.И., Эфендиев А.И. Эффективность коллагеназы краба при лечении ожоговых ран//Военно-мед. журнал. 1991. -N. 4. -С. 52-53.

32. Гончар A.M., Коган А.С., Троицкий А.В., Беляев М.Д. Применение им-мозимазы для лечения гнойных ран//Хирургия.- 1990. N. 9- С. 115117.

33. Гончар A.M., Коган А.С., Салганик Р.И. Раневой процесс и иммобилизованные протеолитические ферменты. Новосибирск: Наука, 1986.- 176 с.

34. Горбунов М.Х., Заиконникова И.В., Абдрахманова Н.Г. Устройство для определения прочности на разрыв заживающих ран//Фармакологическая регуляция регенеративных процессов в эксперименте и клинике. Йошкар-Ола. - 1979. - С. 139-140.

35. Гостищев В.К., Толстых П.И., Гамалея Л.А. Динамика микрофлоры гнойных ран при энзимотерапии//Сов. медицина. 1980 .- N. 9 - С. 5256.

36. Государственная Фармакопея СССР. Вып.2. XI изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.

37. Грецкий В.М. Основы для медицинских мазей.- М.: Наука, 1975. 115 с.

38. Гунько В.Г. Разработка состава и технологии многокомпонентной мази для лечения гнойных ран во второй фазе раневого процесса: Автореф. дис. .канд. фарм. наук. Харьков, 1982. - 23 с.

39. Гунько В.Г., Гунько А.А., Мусиенко Н.М. Изучение осмотической активности некоторых мазевых основ//Хим.-фарм. журнал. 1982- N. 3-С. 89-91.

40. Дадашев А.И., Литвин Г.Д. Локальная энзимотерапия ожоговых ран с применением иммобилизованного трипсина//Военно-мед. журнал. -1991.-N. 6.-С. 67-68.

41. Даценко Б.М. Теория и практика местного лечения гнойных ран Киев: Здоровья, 1995.-250 с.

42. Даценко Б.М., Белов С.Г., Рынденко В.Г. К итогам работы Всесоюз. Конф. "Местное лечение ран "//Ортопедия, травматология и протезирование. 1992. - N. 3. - С. 73-75.

43. Даценко Б.М., Белов С.Г., Тамм Т.И. Гнойная рана. Киев: Здоровья, 1985.- 134 с.

44. Даценко Б.М., Перцев И.М., Белов С.Г. Многокомпонентные мази на гидрофильной основе для лечения гнойных ран//Клиническая хирургия. 1984.-N. 1.-С. 10-13.

45. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. - Т. 1-3.

46. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов: Основные положения: РД 42-28-8-89. Москва, 1989. - 31 с.

47. Долгова Г.В., Кивман Г.Я., Неугодова Н.П., Рыков А.С., Еникеева З.Н. Испытание на пирогенность (проект общей статьи для Фармакопеи ХИ)//Фарматека. 1999. - N. 3. - С. 30-34.

48. Завьялов А.И. Коллализин в терапии больных с ограниченной склеро-дермией//Казанский мед. журнал. 1986-Т. 67 - N. 5. - С. 379.

49. Замыслова Т.И. Иммунохимическая оценка лечебного препарата коллагеназы, полученного из CI. histolyticum//В сб. трудов: Разработка препаратов против вирусных и анаэробных инфекций. Томск, 1976. -С. 199-200.

50. Игудин Л.И., Маркман Г.А., Лобань А.С. и др. Полиэтиленгликоли и их использование в медицине и биологии//Журнал микробиологии. 1984. -N. 4.-С. 17-21.

51. Инструкции фармацевтической компании Шеринг-Плау на препараты Гаразон® (GARASONE®) и Дипрогент® (DIPROGENTA ®) для применения в офтальмологии и дерматологии. 2000.- 5 с.

52. Инструкция фармацевтической компании Лек Lek на препарат Кутерид® (KUTERID® G). - 2000 - 2 с.

53. Исаев В.А., Лютова Л.В., Карабасова М.А., Купенко О.Г., Андреенко Г.В., Руденская Г.Н. Ранозаживляющее действие мази с морикра-зой//Вопр. мед. химии. 1994. - Т. 40, Вып. 3. - С. 46-48.

54. Кабачный П.И., Чернобай В.Т., Н.Ф. Маслова, Ж.А. Любецкая Изучение некоторых свойств асперазы//Хим.-фарм. журнал. 1991. - N. 1. - С. 43-47.

55. Каторгина О.А., Фильц М.А. Ферментная терапия в офтальмоло-гии//Офтальмолог. журнал 1972. -N. З.-С. 215-222.

56. Кварикадзе В.В., Канатов Э.П., Машалова Г.М., Левина Л.А. Тест отёка конечности при оценке токсичности коклюшных вакцин// Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. 1980. -N. 7. - С. 63-67.

57. Коган А.С., Морозов С.М., Куликов Л.К. Лечение гнойных ран иммобилизованными протеолитическими ферментами. Иркутск, 1987. - 109 с.

58. Козаренко Т.Д., Зуев С.Н., Муляр Н.Ф. Ионообменная хроматография аминокислот. Новосибирск, 1981.-145 с.

59. Козлова Н.Г. Разработка технологии мазей противовоспалительного, ра-нозаживляющего и противоаллергического действия: Автореферат дис. . канд. фарм. наук. X арьков, 1983. - 22 с.

60. Коллагенопластика в медицине/Под ред. В.В. Кованова и И.А. Сычени-кова. М.: Медицина, 1978. 256 с.

61. Константинов В.А., Кочедыгов Н.И. О дозированном нанесении ожога в эксперименте//Эксперимент. хирургия и анестезиология. 1963.-N.2. -С. 30-31.

62. Корзая Л.И. Острая и хроническая токсичность различных стафилококковых иммунопрепаратов//Журн. микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. 1982. -N. 3. - С. 59-63.

63. Коростелева Л.К. Исследования в области разработки составов и технологии мазей дибутирина и их фармакологическая оценка: Автореферат дис. . канд. фарм. наук. Пермь, 1997. - 21 с.

64. Кузин М.И., Костюченок Б.М., Раны и раневая инфекция. М: Медицина, 1990.-592 с.

65. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Т.В. Бактериологические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине//Вестник АМН СССР.- 1984 .- N. 8.- С. 3-8.

66. Кутузова И.В., Тенцова А.И., Бабанова Н.К. и др. Реологические свойства мазей с ПНЖК микробиологического происхождения//Фармация-1992.-N. З.-С. 12-15.

67. Лебедев О.И. Регуляция репаративных процессов при антиглауматозной хирургии с помощью коллализина//Вестн.офтальмологии. 1989.-Т. 105.-N. З.-С. 4-6.

68. Лекарственные препараты в России: Справочник/М.: «АстраФармСер-вис», 1998.-1600 С.

69. Лужников Е.А. Клиническая токсикология М.: Медицина, 1994.-254 с.

70. Максименко А.В., Коновалова О.Ю., Петров А.Д., Архипова А.Г., Тор-чилин В.П. Сравнительное изучение свойств препаратов нативной и модифицированной коллагеназы//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1988. - N. 3. - С. 294-297.

71. Машковский М.Д. Лекарственные средства.- М.: Медицина, 1994.- 575 с.

72. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. (Издание официальное). МЗ СССР. Фарм. комитет.-М.:, 1988.- 19 с.

73. Методические рекомендации по экспериментальному изучению новых ферментных препаратов, предлагаемых для клинического исследования-М.:, 1981 32 с.

74. Методические рекомендации Фармкомитета РСФСР по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных препаратов для местного лечения гнойных ран. М.:, 1989. - 20 с.

75. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям: методические указания. М.: Информационно - издательский центр Минздрава России, 1998. - 128 с.

76. Михайлова Р.И., Безруков В.М., Комарова З.А. и др. Применение фоно-фореза коллализина в комплексном лечении гипертрофических и кело-идных рубцов лица и шеи//Стоматология .- 1986 Т. 65. - N. 4. - С. 4850 .

77. Мишаров О.С., Абаев Ю.К., Прокопчук Н.Р. Об оценке прочности сращения краев раны//Вестник хирургии. 1984. -N. 11- С. 82-83.

78. Морозов В.Г., Измайлов Г.А. Энзимология гнойных хирургических за-болеваний//Казанский мед. журнал. 1974-N. 2- С. 46-47

79. Морозов В.И., Касавина Б.С., Золотов С.Н., Зеленская С.Н. Первый опыт применения коллагеназы при заболеваниях роговицы//Вестник офтальмологии. 1972. - N. 1. - С. 47-50.

80. Нарцисов Т.В., Старицкий А.В., Василенко Н.И. Местное лечение гнойных ран//Клиническая хирургия. 1992. - N. 1- С. 33-35.

81. Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ: общий обзор//Иммунофер-ментный анализ/Под ред. Нго Т.Т., Ленхофра Г.: Пер с англ. М.: Мир, 1988.-С. 10-35.

82. Неклюдов А.Д., Бабурина М.И., Куликова Е.Ю., Барткова Л.К., Козловская Т.И. Коллагеназная активность ферментного препарата из поджелудочной железы свиней//Хим.-фарм. журнал. 1991.- Т. 25.- N. 10.- С. 65-67.

83. Никитин Е.Е., Звягин И.В. Замораживание и высушивание биологических препаратов. М., 1971- 343 с.

84. Павленко О.А. Наш опыт применения коллализина/Юфтальмология-1986.-N. З.-С. 188.

85. Панкрушева Т.А. Экспериментально-теоретическое обоснование создания мягких лекарственных форм на полимерных основах производных целлюлозы: Автореф. дис. д-ра фарм. наук - М., 1995- 38 с.

86. Перцев И.М., Даценко Б.М., Гунько В.Г. Многокомпонентные мази на гидрофильной основе//Фармация 1990. - N. 5. - С. 73-77.

87. Перепечкина Н.П., Сиротинский А.В., Сиротинская JI.A. Мембранное разделение в совершенствовании вакцинных препаратов. Иллюзии и ре-альность//В кн.: Современная вакцинология: тезисы докладов Пермь, 1998.- С. 77-78.

88. Полонская Л.Б., Борткевич Л.Л. Стекольников Л.И. Производство ферментных препаратов из сырья животного происхождения для медицинских целей//Приклад. биохимия и микробиология 1977. - Т. 13, Вып. 6. - С. 826-836.

89. Пуоджюнене Г.И., Никулыпина Н.И., Пуоджинас А.С. Изучение реологических свойств и процесса высвобождения лекарственных веществ из метилцеллюлозных гелевых основ//Хим.-фарм. журнал. 1989. -N. 10. -Т. XXIII.-С. 1256-1258.

90. Пучкан Л.А., Головкин В.А., Стец В.Р. Биофармацевтическое изучение бутадион-димедроловой мази//Фармация. 1985. -N. 1. - С. 44-47.

91. Рансберг К., Ной С. Энзимы и энзимотерапия- М.: Наука, 1997 67 с.

92. Саркисов Д.С., Пальцын А.А., Музыкант Л.И. и др.//Морфология раневого процесса / Раны и раневая инфекция. -М.: Медицина, 1981.- 688 с.

93. Сахаров И.Ю., Глянцев С.П., Литвин Ф.Е., Гордеев В.Ф. Фармакокине-тическое изучение коллагеназы камчатского краба Paralithod.es сат-tschaticallВопр. мед. химии.- 1994 г. Т. 40, Вып. 3. - С. 18-20.

94. Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е., Артюков А.А. Физико-химические свойства коллатенолитической протеазы камчатского краба//Биохимия. 1992.- Т. 57, Вып. 1. С. 40-45.

95. Семенова В.Д., Николаева A.M., Ефимова Н.П. Использование мембранных методов разделения в изготовлении анатоксина Clostridium perfringenllЖурнал микробиологии, эпидемиол. и иммунобиологии. -1999.-N. 2.- С. 32-36.

96. Системная энзимотерапия: Phlogenzym, Wobenzym, Mulsal/под ред. В.И. Мазурова. Санкт-Петербург, 1996. - 205 с.

97. Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Вирник А.Д. Исследование иммобилизованных протеолитических ферментов на привитых сополимерах целлюлозы различного строения//Приклад. биохимия и микробиология. 1997.- Т. 33.-N. 1.- С. 38-42.

98. Сологуб В.К., Гришина И.А., Борисов В.Г. и др. Лечение больных с термическими поражениями мазями на водорастворимой основе//Хирургия. -1990.-N.6.-C. 30-33.

99. Сологуб В.К., Червенков И., Выгленова Е.И., Заец Т.Д., Лагвилава М.Г., Резницкая Н.И. Энзиматический гидролиз ожогового струпа//Хирургия.- 1983,- N. 3- С. 110-112.

100. Сологуб В.К., Юденич В.В., Лагвилава М.Г. Использование ируксола для лечения ожоговых ран и язв//Хирургия. 1978. - Вып. 4. - С. 113115.

101. Стручков В.И., Гостищев В.К., Стручков Ю.В. Хирургическая инфекция: Руководство для врачей. -М.: Медицина, 1991.- 580 с.

102. Тенцова А.И., Грецкий В.М. Современные аспекты исследования и производства мазей. М.: Медицина, 1980. - 192 с.

103. Теория и практика иммуноферментного анализа/Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. М.: Медицина, 1991- 286 с.

104. Тернова Н.К. Современное состояние и перспективы ферментотера-пии//Врачебное дело. 1984. - N. 4. - С. 6-10.

105. Токсикология новых промышленных химических веществ. М.: Медицина, 1973. - Вып. 13. - 47 с.

106. Толстых П.И., Герасимова Л.И., Дадашев А.И., Эфендиев А.И. Эффективность лекарственных форм трипсина в лечении ожогов//Хирургия. -1991.-N. З.-С. 64.

107. Толстых П.И., Гостищев В.К., Власов Л.Г. Клиническое применение иммобилизованных ферментов в хирургии/ТХирургия- 1985.- N. 9.-С.129-136.

108. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникоенко Ф.А. Показатели нормы у лабораторных животных в токсикологическом эксперименте. М.: Медицина, 19 с.

109. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. МЗ СССР. Фармакологический комитет МЗ СССР. - М., 1985. - 19 с.

110. Трунин М.А., Емельянов А.С. Применение «Ируксола» в хирургической клинике//Хирургия 1982.-N. 8.-С. 93-95.

111. Тутелян В.А., Васильев А.В. IV Всесоюзный симпозиум по мед. энзимо-логии//Вопр.мед. химии 1984- Т. 30, Вып. 5 - С.135 -137.

112. Тюрин Ю.Н., Макаров А.А. Анализ данных на компьютере/Под ред. В.Э. Фигурнова. М.: ИНФРА-М, Финансы и статистика, 1995 - 384 с.

113. Углева А.И., Хаустова И.И. Разработка методики получения бактериальной коллагеназы//Вопр. приклад, иммунологии / ЛНИИВС-1967.-Т. VI. С. 12-113.

114. Удод В.М., Маркелов С.И., Гильгенберг В.А. Применение "Ируксола" при лечении гнойно-некротических заболеваний мягких тка-ней^Здравоохранение Казахстана. 1984. - N. 3. - С. 71-72.

115. Устинова Е.И., Носова Р.А., Александров Е.М., Медведева Р.Г., Голец Н.Г., Александрова Н.И., Безрукавая Т.И. Опыт применения коллализи-на в комплексном лечении больных туберкулезом глаз//Офтальмолог. журнал. 1996.-N. 4.- С. 213-215.

116. Фармакопейная статья 42-2344-99. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских и иммунобиологических препаратов.

117. Фирсов А.А., Геоданян С.В. Фармакокинетика: достижения и тенденция развития//Хим.- фарм. журнал.- 1984. Т. 18. - N. 5. - С. 521- 528.

118. Хаджай Я.И., Оболенцева Г.В., Николаева А.В. и др. Особенности изучения безвредности мазей и суппозиториев//Фармация. 1983. -N. 1, С. 22-26.

119. Хафизова С.Ф., Юркова С.П., Хафизова Г.Т. Ируксол в комплексном лечении болезней пародонта//Мед. журнал Узбекистана. 1989. - N. 4 - С. 15-17.

120. Холодов JI.E., Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. М.: Медицина, 1985.-464 с.

121. Черкасов И.С., Пашковская В.А. Лечение коллализином внутриглазных кровоизлияний//Офтальмолог. журнал. 1989. - N. 5 - С. 289-290.

122. Чернобай В.Т., Кабачный П.И., Рудюк В.Ф., Корчагина Л.Н., Ж.А. Лю-бецкая и др. Аспераза-энзиматический препарат для очищения ран//Хим.-фарм. журнал. 1991.- N.1. - С. 86 - 87.

123. Шаханина Н.Л. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител//В сб. науч. трудов «Биохимия и биофизика микроорганизмов».-Горький, 1981.-С. 15-23.

124. Шляхов Э.Н. Антракс. Кишинев, 1964. - 62 с.

125. Штраух JI. Новые данные о протеолитических ферментах//В сб. науч. трудов «Соврем, биохим. и морфолог, проблемы соед. ткани».- Новосибирск, 1971,- С. 39-49.

126. Яремчук А.Я., Мендель А.К., Карабан Н.И. Клинико морфологическая характеристика гнойных ран при лечении ируксолом//Клин. медицина. -1982.- Вып. 6.- С. 100-103.

127. Яровая Н.Ф. Опыт использования косметического крема, содержащего ферментный препарат коллитин для профилактики возрастных изменений кожи лица//Вестник дерматологии и венерологии. 1986. - N. 2. -С. 18-20.

128. Abatangelo G., Вгип P., Cortivo R. Collagen metabolism and wound contraction / In.: Altmeyer P., Hoffman K., el al. Editors. Wound healing and skin phisiology. Berlin: Springer. -1995.-227 p.

129. Ahle N.W. Enzymatic frostbite eschar debridiment by bromelain//Ann. Emerg. Med.- 1987.-N. 16.-P. 1063-1069.

130. Alvarez O.M, Obregon A.F., Rogers R.S., Bergamo L., Masso J., Black M. Chemical Debridement of Pressure Ulcers: A Prospective, Randomised, Comparative Trail of Collagenase and Papain/Urea Formulations//Wounds.-2000.-V. 12, N. 2. P. 15-25.

131. Argen M.S., Mertz P.M. Are excessive granulation tissue formation and retarded wound contraction due to decreased collagenase activity in wounds in tight-sking mice//Dr. J. Dermatol. 1994. -V. 131.- P. 337-340.

132. Berger M.M. Enzymatic debriding preparations. Ostomy//Wound Manage. -1993.-N 39,-P. 61-66.

133. Bicsak T. and Harper E. Purification of Nonspecific Protease-Free Colla-genases of Clostridium histolyticum/fAnalytical Biochemistry-1985. V. 145, P. 286-291.

134. Bolton L., Fattu A.J. Topical agents and wound healing//Clin. Dermatol. -1994.-N. 7.-P. 22-28.

135. Bond M.D., Van Wart H.E. Characterization of the Individual Collagenases of Clostridium histolyticum//Biochemistry, 1984 -N. 23.- P. 3085-3091.

136. Bond M.D., Van Wart H.E. Purification and Separation of Individual Collagenases of Clostridium histolyticum Using Red Dye Ligand Chromatogra-phy//Biochemistry. 1984. - N. 23. - P. 3077-3085.

137. Bond M.D., Van Wart H.E. Relationship between the Individual Collagenases of Clostridium histolyticum: Evidense for Evolution by Gene Duplica-tion//Biochemistry. -1984. N. 23. - P. 3092-3099.

138. Boxer A., Gottesman N, Bernstein H, et al. Debridement of dermal ulcers and decubiti with collagenase//Geriatrics. 1969. -N. 24. - P. 75-86.

139. Cavanageh T.J., Lakey J.T., Wright M.J., Fetterhoff Т., Wile K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions//Trans. Proc. 1997. - V. 29. - P. 1942-1949.

140. Catalog. Collagenase Santylpackage insert. Knoll laboratories.- 1997. 4 P.

141. Chakraborty R., Chandra A.L. Collagenase of a new streptomycete: its induction and purification//Enzyme and Microb. Technol. 1984. - V. 6, N. 10. -P. 462-466.

142. Clark Michael F., Lister Richard M., Bar-Joseph Moshe. ELISA Tech-niques//Meth. Enzymol. 1986. - V. 118. - P. 742-766.

143. Cohen I.K. How do methods and timing of debridement affect the quality of repear?//J. Trauma. -1984. V. 24. - P. 25-27.

144. Cooper T.W., Bauer E.A., Eisen A. Enzyme-linked immunosorbent assay for human skin collagenase//Collagen and Relat. Res.- 1983.- V. 3, N. 3. P. 205-216.

145. Durham D.R., Fortney D.Z., Nanney L.B. Preliminary evaluation of vibrioly-sin, a novel proteolytic enyme composition suitable for the debridement of burn wound eschar//! Burn Care Rehabit. 1993. -N. 14 - P. 554-558

146. Dziewulski P. Burn wound healing: James Ellsworth Laing memorial essay for 1991// Burns. 1992. - V. 18. - P. 466-470.

147. Faith W.T., Neubeck С. E., Reese E.T. Production and Aplications of En-zymes//Advances in biochemical Engineering/ Ed. by Ghose Т.К. and Fiech-ter.-ch. 4. 1971 .-N. 1.-P. 77-111.

148. Falabella A. Debridiment of wounds//Wounds.-1998. -N. 10 (Suppl C) P. 1-9.

149. Falabella A., Carson P., Eaglstein W.H., Falanga V. The safety and efficacy of a proteolytic ointment in the treatment of chronic ulcers of the lower extremity//! Amer. Acad. Dermatol. 1998.- V. 39. - P. 737-742.

150. Flaschel E., Wandreu ch.Hula M.-R. Ultrafiltration for the separation of bio-catalyst//Adv. Biochem. Eng. 1983. - N. 26. - P. 73-142.

151. Franclin E. Smit, Marilyne E. Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from Clostridium histolyticum and neutral protease. Patent number 5830741, class 435/220. 1998.

152. Grant N.H., Alburn H.E. Studies on the collagenases of Clostridium histolyti-cum/ZKroh. Biochem.& Biophis.- 1959. V. 82. - P. 245-255.

153. Hansbrough JF, Achauer B, Dawson J, et al. Wound healing in partial-thickness burn wounds treated with collagenase ointment versus silver sulfadiazine cream//J. Burn Care Rehabil. 1995. -N. 16.- P. 241-252.

154. Harper E. Collagenases//Ann. Rev. Biochem. 1980.- N. 49.- P. 1063-1087.

155. Harris E.D., Jr. and K. Krane, S.M. Collagenases//New. Eng. J. Med. 1974. -V. 291.- P. 557-169.

156. Hatz RA. Mechanisms of action of collagenase in wound repair/In: Altmeyer P, et al., editor. Wound healing and skin physiology. Berlin: Springer. -1995.- 227 p.

157. Hebda P.A., Flynn K.J., Dohar J.E. Evaluation of the Efficacy of Enzymatic Debriding Agents for Removal of Necrotic Tissue and Promotion of Healing in Porcine Skin Wounds//Wounds. 1998.- V. 10, N. 3. - P. 83-96.

158. Hebda P.A., Klingbeil C.K., Abracham J.A., Fiddes J.C. Basic fibroblast growth factor stimulation of epidermal wound healing in pig//J. Invest. Der-matol.-1990. V. 95. - P. 626-632.

159. Hefley T.J. Utilization of FPLC-purified bacterial collagenase for the isolation of cells from bone//J. Bone.Min. Res. 1987. -N. 2.- P. 505 -510.

160. Herman I.M. Stimulation of human keratinocyte migration and proliferation in vitro: insights into the cellular responses to injury and wound healing// Wounds. 1996. - V. 8, N. 2. - P. 33-43.

161. Hobson D., White E., Anderson L., Lira L. Development and Use of a Quantitative Method to Evaluate the Action of Enzimatic Wound Debriding Agents in vz>//Wounds. 1998. - V. 10, N. 4. - P. 105-110.

162. Ishikawa Т., Nimni M.E. A Modified Collagenase Assay Method Based on the Use of p-dioxane//Anal. Biochem. 1979.- V. 92, N. 1.- P. 136-143.

163. Jeffrey J.J. Collagen degradation/In.: Cohen I.K., Diegelmann R.F., Lindblad W.J.,editors. Wound healing: biochemical and clinical aspects. Philadelphia: WB Saunders Company. -1992.

164. Jung W., Winter H. Considerations for the Use of Clostridial Collagnase in Clinical Practice//Clinical Drag investigations.- 1998.- Y.15, N. 3 P. 245252.

165. Keil В. Vibrio alginolyticus (Achromobacter) collagenase, biosinthesis, function and application/Matrix Suppl. -1992. -N. 1- P. 127-133.

166. Kennedy K.L., Tritch D.L. Debridement/In.: Rrasner D., Kane D.(eds.) Chronic Wound Care, Second Edition. Wayne, PA: Health Management Publications, Inc. 1997.- P. 34-227.

167. Kono T. Purification and partial Characterization of collagenolytic enzymes from Clostridium histolyticum//Biochemistry. 1968. -N. 7 - P. 1106-1116.

168. Laidet В., Letourneur M. Detersion enzymatique des ulceres de jambe par la papaine//Ann. Dermatol. Venerol. -1993. V.12. -P. 148-155.

169. Lee L.K, Ambrus J.L. Collagenase therapy for decubitus ulcers//Geriatrics. -1975. V. 30, N. 8.- P. 91-110.

170. Lemperle G. Experimental and clinical proof of enzymatic wound debridement with collagenase/A^ Annual Meteeng of the European Tissue Repair Society. Oxford, England. 1994. - P. 25-28.

171. Lette А. Микробиологические и технологические аспекты продукции сырой коллагеназы//Журн. гиг. эпидемиол. (Прага). 1974. - V. 18. - N. 4. - С. 477-482.

172. Lette А. Приготовление сырой коллагеназы CI. histolyticum для лечебных целей // Журн. гиг. эпидемиол. (Прага). 1978. - V. 22 - N. 1- С. 56 -63.

173. Levenson S.M. Debriding agents//! Trauma. 1979. - N. 19 (Sll).- P. 928930.

174. Lwebuga-Mucasa J.S., Harper E., Taylor P. Collagenase enzymes from Clostridium: characterization of individual enzymes//Biochemistry. 1976. - N 15.- P. 4736-4739.

175. Levin N., Seifter E., Levenson SM. Enzymatic debridement of burns//Surgical Forum. 1971. - N. 22. - P. 8-57.

176. Mandl I. Bacterial collagenases and their clinical applications//Arzneimittel Forschung.- 1982.-N. 32.-P. 1381-1384.

177. Mandl I., Ferguson L., Zaffuto S. Exopeptidases of Clostridium histolyticum! / Arch. Biochem. Biophys. 1957. - V. 69. - P. 565-581.

178. Mandl I., Keller S., Manachan J. Multiplicity of CI.histolyticum colla-genases//Biochemistry (Washington). 1964. -V. 3, N. 1 l.-P. 1737-1743.

179. Mandl I., MacLennan, J.D., Howes E.L., DeBellis, R.H. and Sohler A. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase from CI. histolyticum//!. Clin. Invest. 1953.- V. 32, N. 12. - P. 1323-1329.

180. McLennan J.D., Mandl I., Howes E.L. New proteolytic enymes from CI. histolyticum//J.Gen. Microbiol. 1958.-N. 18. - P. 1-4.

181. Mekkes J. R., Zeegelaar J. E. Collagenase in a New Gel Formulation Accelerates Wound Cleaning and Healing//Wounds. 1999. -N. 11(5) - P. 117-124.

182. Mekkes J. R., Westerhof W. Image processing in the stady of wound heal-ing//Clinics in Dermathology. 1995. - N. 13. - P. 401-405.

183. Morgan D. An overview of modern wound management products. 1 Intern. Conf. Modern Approaches to the Development of effective Dressing Materials and Polimer Implantants. 1992. - P. 27-30.

184. Moserova J., Konickova Z., Behouncova E., Janecek J. Экспериментальное применение коллагеназы для удаления остатков поврежденной ко-жи//Журн. Гиг. Эпидемиол. (Прага). 1974. - N . 4. - С. 495-496.

185. Musil J., Marova E., Moserova J., Lettl А. Действие бактериальной коллагеназы на здоровую и обожженную свиную кожу in уйго//ЖГЭМИ.- 1974.-N. 4.-С. 489^194.

186. Nakano Р.К., Kawaoi A. Peroxidase labelled antibody. A new method of conjugation//.!. Histochem., Cytochem. - 1974. - V. 22, N. 12. - P. 10841091.

187. Nevery A., Lyons G. J., O'Grady L.R. A spectrophotometric collagenase assay//Anal. Biochem.- 1986. V. 159, N. 2.- P. 390-395.

188. Oppenheim F. Franzblau C. A modified prosedure for the purification of clostridial collagenase//Pref. Biochem.- 1978. V. 8, N. 5. - P. 387- 407.

189. Oshima G., Shimabukuro H., Nagasawa K. Mode of action of bacterial collagenase on a synthetic substrate (Pro-Pro-Gly)5//Bioch. Et Bioph. Acta. -1979. V. 567, N. 2. - P. 392-400.

190. О Sullivan T.J., Epstein A.S., Beatom N.C. Application of ultrafiltration in biotechnology//Chem. Eng. Progr.- 1984. V. 80. -N. 1. - P. 68-75.

191. Parks W.C. Interstitial collagenase in the healing epidermis/In.: Abatengelo S., Donati L., Van Scheidt W., editors. Proteolysis in wound repair. Berlin: Springer. - 1996.- P. 21-25.

192. Peacock E., van Wincle W. Wound Repair.- Philadelphia, Saunders. -1976. -699 p.

193. Peterkofsky B. Bacterial collagenase // Meth. Enzymol. 1982.- V. 82.- P. 453—471.

194. PCT (WO) 94/ 04666 С 12 N 9/50 Method for the purification of collagenase/ Williams Stuart, K. 1993. - 21 p.

195. Porres-Reyes B.H., Blair H.C., Jeffrey J.J., et al. Collagenase production at the border of granulation tissue in a healing wound: macrophage and mesenchymal collagenase production in vivo//Connect. Tissue Res. -1991.- V. 27.- P. 63.

196. Postlethwaite AE, Kang AH. Collagen- and collagen peptide-induced che-motaxis of human blood monocytes//.!. Exp Med. 1976. - N. 143. - P. 129— 307.

197. Rodeheaver G., Baharestani M.M., Brabes M.E.,et al. Wound Healing and wound management: Focus on debridement//Avd. Wound. Care-1994. N. 7. - P. 22-27.

198. Rowan A.D., Christopher C.W., Kelley S.F., Buttle D.J., Ehrlich H.P. de-bridiment of experimental full-thickness skin burns of rats with enzyme fractions derived from pineapple stem//Burns. -1990. N. 16. - P. 243-250.

199. Safarik I. Rapid isolation of microbial proteases // J. Chrom.- 1984. V. 298. -P. 531-533.

200. Sato H., Kameyama S., Murata R. Immunogenicity of highly purified alfa-toxoid of Clostridium ;?er/n«ge«s//JapJ.Med.Sci.Biol.- 1972. V. 25, N. 1. -P. 53-56.

201. Scherer P.R., An assesment of collagenase therapy for dermal ulcerations of the foot//J. Am. Podiatry Assoc. 1980. - V. 74.- P. 25-30.

202. Seifter S., Harper E. The Collagenases/Boyer PD, ed. The Enzymes, New York, Academic Press. 1970. - N. 3. - 649 p.

203. Sieggreen M., Maklebust J. Debridement: Choices and challenges//Adv. Wound. Care. -1997. V. 10, N. 2. - P. 7-32.

204. Sigma product information sheet. No. С 9891. Collagenase, crude, General Use. 1998.-P. 3.

205. Sinclair R.D., Ryan T.J. Proteolytic enzymes in wound healing: the role of enzymatic debridement//Australas J. Dermatol. 1994. -N. 35. - P. 35-43.

206. Sinclair R.D., Ryan T.J. Types of chronic wounds: Indications for enzymatic debridement/In. Westerhof W., Vanscheidt W.(eds.). Proteolytic Enzymes in Wound Healing.- New York: Springer-Verlag GmbH and Co.- 1994 -N. 7-P. 20-35.

207. Short J.L., Kulcullen B.M., Breslan B.K. Ultrafiltration a modern unit op-eration/VBiotech. 84: World Biotech. Rept, 1984. Proc. conf., London May, 1984.- V.l: Europe. Pinner. - 1984. - P. 331-342.

208. Skrabut EM, Hebda PA, Samuels JA, et al. Removal of necrotic tissue with an ananain-based enzyme debriding preparation//Wound Repair Regen. -1996. N. 4. - V. 433. - P. 436-453.

209. Strathmann H. Membranes and membrane processes in biotechnology//Tr. Biothech.- 1985.-V. 3.-N. 5.-P. 112-118.

210. Sugasawara R., Harper E. Purification and characterization of three from Clostridium histolyticum!/Biochemistry. 1984. - V. 23, - N. 22. - P. 51755181.

211. Sunada H., Nagai Y. Mechanism of collagen degradation by collagenase: a transition process of the collagen molecule from collagenase-substrate to ge-latinase-substrate//Biomedical Research. 1983.- V. 4, N. 1. - P 61-70.

212. Takahashi S., Siefter S. New culture condition for Clostridium histolyticum leading to production of collagenase of high specific activity//J. Appl. Bacte-riol.- 1972.-N. 35. P. 647-652.

213. Teodor E., Tcacento L. Clostridium histolyticum collagenase action on bovin collageny/Romanian J. of Biol. Sciences. 1997. - P. 43-47.

214. Thomas A., Harper В., Harper E. Purufication of Nonspecific Protease-Free Collagenase from Clostridium histolyticum!/Anal. Biochem. 1985. -V. 145, N. 2.-P. 286-291.

215. Tijssen P Practice and theory of enzyme immunoassays//Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology.- Amsterdam: Elsevier,1985.-V. 15.-P. 39-279.

216. Tosci S., Caleffi Т., Bocchi A., Papadia F. The biological detersion of wound and burns//l Intern.Conf. Modern Approaches to the Development of effective Dressing Materials and Polimer Implantans. 1992. - P. 39-41.

217. Varma A.O., Bugatch E. Debridement of dermal ulcers and decubiti with collagenase//Surg. Gyn. And Obs. 1973. - V. 136, N. 2. - P. 281-285.

218. Van Wart H.E., Bond M.D. An accurate, quantitative assay for collagenase activity based on Sinergistic hidrolisis of collagen//Anal. Biochem. 1982. -V. 120. - N. l.-P. 151-158.

219. Vetra H., Whittaker D. Hydrotherapy and topical collagenase for decubitus ulcers//Geriatrics. 1975. -V. 30. - P. 53.

220. Vilker V.L., Colton C.K., Smith K.M., Green D.L. / J. Membr. Sci. 1984.-20.-N. l.-P. 63-77.

221. Voller A. Heterogeneous enzyme immunoassays and their applications// Enzyme immunoassay/Ed. Maggio E.T. Florida: CRG Press, Boca Raton-1981,- P. 181-196.

222. Waffle C., Simon R.R., Ioslin C. Moisture-vapour permeble film as an outpatient burn dressing//Burns. -1988. V. 14 - N. 1. - P. 66-72.

223. Walter RJ. Clostridial collagenase. A chemoattractant for human neutrophils//Inflammation. 1986. - N. 10. - P. 347-351.

224. Weber K., Osborn M. The reliability of molecularweight determinations by dodecyl sulfate poliacrylamide gel electrophoresis//!. Biol. Chem. - 1996-V. 244.-P. 4406-4412.

225. Westerhof W. Future prospects of proteolytic enzymes and wound healing/In: Westerhoff W., Vanscheidt W. (eds.) Protelytic Enzymes and Wound Healing. New York, NY: Springer-Verlag GmbH & Co. 1994. - P. 99-102.

226. Westerhof W., van Gincel C.W., Cohen E.B., Mekkes J.R. Prospective randomised study comparing the debriding effect of krill enzymes and a non-enzymatic treatment in venous leg ulcers//Dermatologica. 1990. - V. 181.— P. 293-298.

227. Wolf M.: Der Einfluss von Proteinasen auf Venentzundun-gen//Enzympreparate fur Therapie und Prophylave. Allgemeinmedizin. -1990.-N. 19. P. 173-175.

228. Worthington Catalog. Collagenase from Clostridium histolyticum. 1999. -P. 4

229. Yavuzer R., Latyfodlu O., Ayhan S., Celyk В., Atabay K. Enhanced wound healing using collagenase in guinea pig//Gazi Medical J. 1997. - N. 8.- P. 110-113.

230. Yoshida E., Noda H. Isolation and characterization of collagenases I and II from Clostridium histolyticum/fBioohQm. Biophys. Acta. 1965. -N. 105 - P. 562-565.1. БЛАГОДАРНОСТИ

231. Особо хочу поблагодарить сотрудников лаборатории комбинированных вакцин за всестороннюю помощь в исследованиях.