Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Хазиев, Артур Фатыхович

• Хазиев, Артур Фатыхович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хазиев, Артур Фатыхович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Протеолитические ферменты бактериальной природы, ме- 9 тоды получения и очистки

Глава 2. Способы стабилизации ферментов и сфера их применения

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объекты исследований

3.2. Методы исследований

Глава 4. Разработка способа микробного биосинтеза протеолитиче- 44 ского фермента

4.1. Изучение влияния компонентов питательной среды на рост и 44 продукцию протеазы

4.2. Исследование протеазосинтетической активности Bacillus 47 subtilis ЗН

4.3. Масштабирование процесса культивирования и биосинтеза про- 52 теолитического фермента штаммом-продуцентом Bacillus subtilis ЗН

Глава 5. Разработка способа очистки протеолитического фермента 60 Bacillus subtilis 3 Н

5.1. Очистка протеолитического фермента, полученного в питатель- 60 ной среде с пептоном

5.2. Очистка протеолитического фермента, полученного в питатель- 72 ной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной

Глава 6. Получение стабильных форм протеолитического фермента

6.1. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине

6.2. Образование внутримолекулярных сшивок глютаровым альде- 79 гидом

6.3. Изучение стабильности нативного, иммобилизованного на полиглюкине и сшитого глютаровым альдегидом протеолитического фермента

Глава 7. Изучение свойств различных форм протеолитического 83 фермента

7.1. Влияние величины рН на протеолитическую активность

7.2. Определение субстратной специфичности

7.3. Изучение кинетики протеолиза

7.4. Изучение температурного оптимума

7.5. Молекулярная масса

7.6. Ингибиторный анализ

7.7. Изучение раноочищающего и ранозаживляющего действия про- 93 теолитического фермента

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis»

Актуальность проблемы В современной медицине широко применяются лекарственные препараты, имеющие ферментную природу. В 1996 г мировой объем производства ферментов осуществлен на сумму 1 млрд. долларов [130]. При этом доля ферментов медицинского назначения составляла более 10 % от этой суммы, основным источником их получения являются органы и ткани животных, например: цитохром С из бычьего сердца, панкреатин, трипсин, тестикулярная гиалуронидаза, ацетилхолинэстераза из эритроцитов и т.д. [23, 28,41,102,134], Однако в связи с последними достижениями вирусологии и открытием прионовых заболеваний, по рекомендации ВОЗ, использование препаратов из тканей животных с каждым годом сокращается. Поэтому получение ферментов путем микробиологического синтеза является актуальной проблемой.Из множества известных ферментов микробного происхождения практическое применение в медицине и различных отраслях промышленности нашли протеолитические ферменты. Их доля в мировом производстве равна 60 % [130]. В связи с этим разработке технологических способов получения протеолитических ферментов, продуцируемых микроорганизмами, исследователи уделяют большое внимание [25,28, 38, 71, 94, 106,123, 161], В научной литературе детально представлены способы микробного биосинтеза протеолитических ферментов при культивировании штаммов рода Bacillus с целью получения протеолитических ферментов в лабораторных и в крупномасштабных производствах [29, 36, 55, 60, 77, 94,103], В настоящее время в медицинской промышленности протеазы применяют при производстве питательных сред и органопрепаратов (Церебролизина, Церебролизата, Сирепара). Кроме того, их используют как самостоятельные лекарственные препараты (Террилитин, Терридеказа, Протосубтилин, Стрептокиназа, Мезимфорте, Ируксол, Knol и т,д,) при терапии различных заболеваний органов пищеварения, глаз, сердечно-сосудистой системы, гнойной хирургической патологии, онкологических заболеваний и т.д.С 1989 года в Уфимском НИИВС им. И.И. Мечникова под руководством Д.М.Н., профессора Н.А. Михайловой началось изучение антагонистически активных штаммов Bacillus subtilis. При их культивировании отходом является фильтрат культуральной жидкости, с высокой ферментативной активностью, обусловленной протеолитическими, амилолитическими, липолитическими ферментами.При исследовании продукта биосинтеза Bacillus subtilis 3 И, получившего название Бактилин [114], установлено, что его действие связанно с двумя протеазами - металлопротеазой и минорными примесями сериновой протеазы, имеющими молекулярную массу 29+2 kD, активность в диапазоне рН 6,0-12,0 и субстратную специфичность в отношении большого количества белков.Однако помимо протеаз в комплексе содержатся примеси белковой, липидной, полисахаридной природы, а также остатки минеральных солей, которые, по-видимому, совокупно обусловливают некоторую биологическз^о токсичность Бактилина. Это делает невозможным его медицинское применение.Сушествз^ют различные способы очистки протеолитических ферментов: высаливание, ионообменная, гель- и аффинная хроматографии, избирательная адсорбция на нерастворимых носителях, изофокусирование, электрофорез и т.д. [89,105].В экспериментах многим исследователям удавалось получить высокоочищенные препараты протеаз, комбинируя между собой различные методы.Однако лабораторные методы чрезвычайно трудоемки, малопроизводительны, относительно дороги. Их невозможно полностью адаптировать к условиям промышленного производства [40, 117, 168]. Все это обосновывает необходимость поиска технологически приемлемых путей объединения эффективных способов получения и очистки ферментов.Цель работы Полз^ение, очистка, стабилизация и изучение свойств протеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗН в различных питательных средах при периодическом глубинном гомогенном культивировании.Задачи исследования 1. Подобрать состав питательной среды для получения препарата с оптимальными физико-химическими и биологическими свойствами.2. Изучить протеазосинтетическую активность морфологических вариантов промышленного штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН и выбрать наиболее активные клоны, 3. Определить рациональный способ получения посевного материала.4. Получить стандартный нативный ферментный препарат, содержащийся в культуральной жидкости после выращивания наиболее активного клона Bacillus subtilis ЗН методом периодического глубинного гомогенного культивирования с использованием мочевино-дрожжевой среды и выбранного способа подготовки посевной культуры.5. Разработать оптимальные методы очистки и стабилизации протеолитического фермента.6. Изучить физико-химические свойства и специфическую биологическую активность полученного ферментного препарата.7. Испытать лабораторную схему получения протеолитического фермента в производственных условиях.Научная новизна Научно обоснована промышленная технология получения металлопротеазы Bacillus subtilis ЗН. Повышен уровень биосинтеза протеазы njnrcM отбора и культивирования высокоактивных клонов штамма-продуцента с использованием мочевинодрожжевой среды и рационально подобранной схемы подготовки посевного материала.Подобранные условия культивирования позволили использовать метод ультрафильтрации для эффективной очистки фермента.Показана возможность стабилизации очищенного протеолитического фермента, путем иммобилизации на полиглюкине, а также внутримолекулярной сшивкой глютаровым альдегидом.Очищенная металлопротеаза и ее модифицированные аналоги охарактеризованы по величинам рН и температурных оптимумов, субстратной специфичности, молекулярной массе, кинетике Махаэллиса-Ментен.Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность полученного протеолитического препарата.Практическая значимость работы Разработана промышленная технология получения очищенного протеолитического фермента, включающая следующие стадии: - предварителънзоо очистку дрожжевого экстракта от балластных белков перед приготовлением питательной среды с использованием метода ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш; - выбор высокоактивных клонов штамма-подуцента Bacillus subtilis ЗН по морфологическим характеристикам; - периодическое глубинное гомогенное культивирование производственного штамма Bacillus subtilis ЗН в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной; - освобождение ферментсодержащей культуральной жидкости от микробных клеток методами сепарации и микрофильтрации; - очистку фракции, обладающей протеолитической активностью, от балластных белков методом ультрафильтрации на мембранах с пропускной способностью 15 Ш. Выход протеолитического фермента, полученного по этой технологии, достигает не менее 70 %, а его удельная активность составляет, не менее 40 ПЕ/мг белка.Препарат очищенного протеолитического фермента может быть рекомендован для разработки лекарственного средства с ранозаживляющей активностью.Основные положения, выносимые на защиту 1. Оптимизирован процесс периодического глубинного гомогенного культивирования высокоактивных клонов штамма Bacillus subtilis ЗН, продуцирующего протеазу, с использованием мочевино-дрожжевои питательной среды и рациональной схемы подготовки посевного материала.2. Подобраны условия выделения, очистки, иммобилизации и стабилизации протеазы, обеспечивающие получение препарата с высокой удельной протеолитической активностью, 3. Очищенный стабилизированный протеолитический фермент является металлопротеазой с широким оптимумом величины рН, температуры, а также обладает в опытах in vivo раноочищающим и ранозаживляющим действием.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Хазиев, Артур Фатыхович

выводы

1. Научно обоснована и разработана промышленная технология получения металлопротеазы, синтезируемой Bacillus subtilis ЗНУ которая включает периодическое глубинное гомогенное культивирование и последующую очистку фермента методами мембранного разделения.

2. Оптимизированы параметры процесса культивирования штамма-продуцента, обеспечивающие максимальную продукцию фермента. Выбран оптимальный состав питательной среды по органическому компоненту путем замены пептона мочевиной с добавлением очищенного дрожжевого экстракта. Определен способ подготовки посевного материала, обеспечивающий получение высокоактивной культуральной жидкости при минимальной посевной дозе.

3. Разработан способ получения очищенного фермента, включающий отделение микробных клеток от ферментсодержащей культуральной жидкости без потерь протеолитической активности с помощью микрофильтрации и очистку фермента от неактивных белков с использованием метода ультрафильтрации.

4. Получен стабилизированный протеолитический фермент путем иммобилизации на полиглюкине и сшивки глютаровым альдегидом.

5. Показано, что полученный протеолитический фермент и его модифицированные аналоги являются металлопротеазами с охарактеризованными параметрами (молекулярными массами, оптимальными значениями pH, температуры и спектрами субстратной специфичности).

6. Экспериментально доказана раноочищающая и ранозаживляющая активность протеолитического фермента.

104

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разнообразие свойств протеолитических энзимов, продуцируемых различными микроорганизмами, их прионовая безопасность по сравнению с ферментами животного происхождния, а также обширная область применения требуют пополнения номенклатуры применяемых в практике микробных протеаз.

Основываясь на данных литературы, наиболее перспективными, на наш взгляд, являются ферменты бактерий рода Bacillus. Благодаря генетической и биохимической вариабельности, нетоксичности, авирулентности они наиболее удобны для использования в качестве источника протеаз [29, 36, 54, 60, 77, 94, 103, 156,164].

Известно много способов получения штаммов-продуцентов путем создания мутаций и соответствующей селекции [35].

Однако возможность управления синтетическими свойствами культур путем отбора высокопродуктивных клонов, образующихся при диссоциации штамма-продуцента, позволяет значительно увеличить выход целевого продукта.

По данным литературы бактерии рода Bacillus диссоциициируют на R- и S-формы, образуя при этом несколько типов колоний, отличающихся формой и консистенцией на различных агаризованных средах и чаще всего при выращивании на мясопептонном агаре [16, 19, 25, 26, 110]. Известно, что R- и S-формы, способны образовывать субварианты и отличаются выработкой промышленно-ценных метаболитов.

Наши экспериментальные данные показали, что в процессе гомогенного глубинного культивирования штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН происходило расщепление микробной популяции на R- и S-морфологические варианты. Установлено, что S-вариант имел большую продуктивность по ферменту при выращивании, как на пептонной, так и мочевино-дрожжевой питательной средах.

При дальнейших исследованиях S-варианта обнаружено его способность к расщеплению на несколько типов колоний.

В результате исследования протеазосинтетической активности 200 колоний, находящихся в S-форме, обнаружено, что 6 из них (3 %) проявляли максимальную активность (4-6 ПЕ/мл), которые визуально представляли собой маленькие колонии, размером не более 1 мм, образующие зону гидролиза казеина 12-17 мм.

Для этих клонов исследовали протеазосинтетические свойства. Была установлена идентичность кинетических кривых синтеза протеолитического фермента. Они имели длительные лаг-фазы, соизмеримые экспоненциальные и фазы замедления продукции протеолитического фермента. Отличительной особенностью кинетических кривых 4 и 6 является то, что они не имеют фазы замедления скорости синтеза на изучаемом отрезке времени. Уровень накопления протеолитической активности для клона 4 - составлял 32,7+2,2 ПЕ/мл, а для клона 6 - 35,9+1,8 ПЕ/мл.

Таким образом, нами установлено, что выделение активных клонов из "S-популяции" приводило к 10- кратному увеличению протеазосинтетической активности штамма-продуцента Bacillus subtilis ЗН, по сравнению с исходной культурой.

Для бактерий рода Bacillus в литературе имеются данные об интенсивном потреблении многих неорганических ионов при развитии микробной популяции [74, 108, 112].

Доказано, что отсутствие сульфата железа позволяет микробным клеткам, минуя лаг-фазу, переходить в экспоненциальную фазу роста. При отсутствии сульфата меди лаг-фаза была короткой и составляла 18 ч. Ее продолжительность увеличивалась при выращивании на питательной среде, в которую не добавляли сульфата аммония или сульфата цинка. Удаление из питательной среды фосфата калия и цитрата натрия приводило к снижению количества биомассы, а отсутствие хлорида кальция - к полному подавлению роста клеток.

Таким образом, основными неорганическими компонентами среды, влияющими на процесс накопления биомассы, являются сульфат аммония, цитрат натрия, сульфат цинка, хлорид кальция. Вместе с тем, фосфат калия, может влиять и на продукцию фермента, вызывая замедление клеточного роста.

При исследовании влияния индивидуальных ингредиентов среды на синтез протеазы установлено, что ни один из них не оказывает явного стимулирующего действия.

При масштабировании процесса культивирования штамма-продуцента с использованием промышленного реактора объемом 100 л нами подтверждены закономерности, полученные в лабораторных условиях.

В ходе исследований установлены оптимальные значения параметров процесса культивирования: схема инокуляции реактора, посевная доза от 0,031 до 0,043 млрд кл./мл, давление воздуха 0,2-0,4 кгс/см2. При данных условиях за 25,0+1,2 ч культивирования получали биомассу с концентрацией 15,4+1,4 млрд кл./мл и культуральную жидкость с протеолитической активностью 15,9±1,9 ПЕ/мл.

При проведении следующего этапа исследований основной задачей являлся выбор метода выделения и очистки экзопротеаз, полученных в процессе гомогенного глубинного культивирования на различных питательных средах.

Предложенные рядом авторов [29, 24, 67, 83, 84, 87, 102, 118] методы для выделения и очистки ферментов (сепарирование, центрифугирование, фракционирование) оказались нетехнологичными в силу ряда недостатков: больших потерь объемов материала, трудоемкости, энергоемкости, значительной продолжительности процессов, отсутствия возможности масштабировать.

Отделение микробных клеток от ферментсодержащей культуральной жидкости без потерь протеолитической активности удалось осуществить методом микрофильтрации без механического побуждения.

Наши исследования были проведены в двух направлениях. В начале работы выделение и очистку фермента осуществляли из культуральной жидкости, полученной при выращивании производственного штамма в питательной среде >» с пептоном.

Разделение ферментсодержащей культуральной жидкости гель-хроматографией позволило получить ферментный препарат с удельной активностью 39,5+2,5 ПЕ/мг белка, с выходом 94,4±3,4 %.

Методом ультрафильтрации получили препарат с удельной активностью 2,25+0,08 ПЕ/мг белка, при выходе в пределах 40,7±2,9 %. Низкая степень очистки и выхода фермента указывала на необходимость обратиться к другим методам.

Солевым фракционированием достигли удельной активности фермента, которая составила 21,6±0,6 ПЕ/мг белка при выходе 78,5+2,2 %.

Следующим апробированным методом очистки фермента являлась адсорбция на неорганических гелях гидроокиси алюминия и фосфата кальция. Использование геля гидроокиси алюминия позволило достичь удельной активности 5,6±0,7 ПЕ/мг с выходом 76,6+0,4 %. Более высокие результаты были получены при использовании геля фосфата кальция, при этом удельная активность фермента увеличилась до 10,7±0,8 ПЕ/мг, а выход целевого продукта составил 98,3±1,7 %.

В результате проведенного фракционирования методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе, удельная активность протеолитического фермента увеличилась в 12,78 раз и составила 24,6±1,26 ПЕ/мг белка, а выход протеолитической активности находился в пределах 98,5±0,7 %.

Использование БЕАЕ-целлюлозы позволило достичь активности фермента, соответствующей 6,3±0,3 ПЕ/мг белка, при этом выход продукта составил 89,3+1,2 %.

На следующем этапе отрабатывали технологию очистки культуральной жидкости, полученной при культивировании продуцента в питательной среде с дрожжевым экстрактом и мочевиной.

Разделение ферментсодержащей культуральной жидкости гель-хроматографией позволило получить ферментный препарат с удельной активностью 96,0±2,1 ПЕ/мг белка, при выходе целевого продукта 85,1+2 %.

Методом ультрафильтрации получен препарат с удельной активностью 55,3±0,9 ПЕ/мг белка, при выходе в пределах 74,4±2,1 %.

Полученные нами результаты позволили использовать в дальнейших исследованиях метод ультрафильтрации для выделения протеолитического фермента из культуральной жидкости с дрожжевым экстрактом и мочевиной.

По литературным данным, иммобилизация стабилизирует конформацию фермента, повышая стабильность иммобилизованных ферментов, изменяя его свойства [85, 135,141, 163].

В качестве водорастворимого носителя для иммобилизации использовали полиглюкин, широко используемый в медицине, активированный перйодатом натрия. Иммобилизованный фермент имел активность 80,6±0,4 ПЕ/мл и молекулярную массу 70 kD.

Для стабилизации фермента внутримолекулярными сшивками использовали глютаровый альдегид. Стабилизированный фермент представлял собой мономолекулярную структуру с протеолитической активностью на уровне 69,8+0,6 ПЕ/мл.

На следующем этапе работы изучили свойства металлопротеазы, продуцируемой Bacillus subtilis на мочевино-дрожжевой питательной среде.

Активность нативного фермента выявлена при значениях pH 7,0-9,0. Наибольшая активность иммобилизованного на полиглюкине протеолитического фермента определена при величине pH 7,0. Стабилизированный глютаровым альдегидом фермент имел максимум при значении pH 8,0.

Субстратная специфичность проявлялась в отношении казеина, желатина, коллагена, бычьего сывороточного альбумина, яичного альбумина, трипсина, пепсина. Активность в отношении термически денатурированных белков выше, чем по отношению к нативным белкам.

Экспериментальные данные, полученные в реакции протеолиза казеина, указывали, что при высоких концентрациях субстрата активность протеолитического фермента ниже, чем можно было бы ожидать теоретически по уравнению Михаэлиса-Ментен [61]. Это свидетельствует об ингибировании протеолитической активности избытком субстрата. Иммобилизация протеолитического фермента на полиглюкине и стабилизация его глютаровым альдегидом уменьшала ингибирующее действие субстрата.

Температурный оптимум протеолитической активности нативного фермента отмечен при 52 °С, с повышением температуры его активность резко падала. Фермент, иммобилизованный на полиглюкине, имел температурный оптимум 57 °С, а для фермента, сшитого глютаровым альдегидом,он соответствовал 62 °С.

Время полуинактивации нативного фермента составляло при 37 °С 72 ч. Для фермента, иммобилизованного на полиглюкине составляло 169,5 ч, а для фермента, стабилизированного глютаровым альдегидом - 12,8 ч. Однако при температуре 67 °С активность нативного фермента обнаружить не удалось. Для иммобилизованного на полиглюкине фермента активность обнаруживается в течение 100 мин, а для фермента, стабилизированного глютаровым альдегидом активность регистрировалась в течение 150 мин. Это, очевидно, указывает на стабилизацию молекул фермента.

Ингибирование диизопропилфторфосфтом не оказывало влияния на про-теолитическую активность фермента. Использование этилендиаминтетрауксус-ной кислоты приводило к полной потере активности протеолитического фермента.

При изучении биологической активности протеолитического фермента на модели плоскостной раны выявлено выраженное раноочищающее и ранозажив-ляющее действие. Наибольшей активностью обладал раствор протеолитического фермента в концентрации 25 ПЕ/мл. Эффективность его раноочищающего и ранозаживляющегодействия превосходила таковую у препарата сравнения -коллагеназы КК.

В заключение можно отметить, что ряд вопросов, возникших в процессе работы, требует дальнейшего изучения.

103

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хазиев, Артур Фатыхович, 2004 год

1. Абрамов В.П. Способ непрерывной очистки растворов биологически активных веществ / В.П. Абрамов, И.М. Сороцкин, Л.С. Лукавый // А.с. № 1009097, S.U. опубл. 1980. - Бюл. № 15.

2. Акмарова В.Х. Субтилизин 72 сериновая протеиназа Bacillus subtilis штамма 72, близкая субтилизину Карлсберг / В.Х. Акмарова, Л.Г. Беля-нова, Л.А. Баратова и др. // Биохимия. - 1979. - Т. 44, № 5. - С. 886-891.

3. Алексеева В.В. Применение ультрафильтрации для концентрирования ферментного комплекса Bacillus subtilis 103 / В.В. Алексеева, К.А. Калу-нянц // Ферментная и спиртовая промышленность. 1977. - № 4. - С. 28-33.

4. Алексеева В.В. Выделение и исследование некоторых свойств про-теолитических ферментов Bacillus subtilis штамма 103 / В.В. Алексеева, К.А. Калунянц, А.К. Овчаров // МУб промышленность: Реф. сб. 1975. - № 10. -С. 24-26.

5. Аль-Нури М.А. Некоторые свойства экзопротеазы Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens, способная свертывать плазму крови / М.А. Аль-Нури, Т.А. Острошко, Н.С. Егоров // Микробиология. 1978. - Т. 47, № 5. - С. 900905.

6. Амирханян М.М. Способ выделения ферментных препаратов ами-ноацилазы, амилаз и протеаз из Aspergillus otyzae / М.М. Амирханян, В.М. Степанов, О.М. Амирханян, М.Ф. Еланян I/ А.с. № 1654335, опубл. 1989.

7. Ахапкина И.Г. Штамм Bacillus subtilis продуцент фунгицидного вещества / И.Г. Ахапкина, Л.П. Блинкова, Л.Г. Бутова, И.П. Фомкина // Журн. микробиол. - 1995. - № 17. - с. 91-92.

8. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

9. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами / И.А. Баснакьян. М.: Медицина, 1992. - 188 с.

10. Баснакьян И.А. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / И.А. Баснакьян, В.В. Бирюков, В.М. Кантере. М.: Наука,1985.-291 с.

11. Беленький M.J1. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / M.JI. Беленький. -JL: Медгиз, 1963. С. 81-106.

12. Белокрицкая Г.Ф. Протеаза как усилитель иммунного ответа при иммунизации адсорбированным стафилококковым анатоксином / Г.Ф. Белокрицкая, Ю.В. Дичешко // Журн. микробиол. - 1980. - № 11. - с. 49-52.

13. Березин И.В. Основы физической химии ферментативного катализа / И. В. Березин, К. Мартинек. М.: Высшая школа, 1977. - 233 е.

14. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / Под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека // М.: Изд-во Московского университета, 1976. 296 с.

15. Блохина Т.П. Сравнительное электронно-микроскопическое исследование клеток Bacillus thuringiensis, выращенных в хемостате / Т.П. Блохина, H.A. Кострикина, З.В. Сахарова, В.И. Бирюзова // Микробиология. 1992. - Т. 61,№4.-С. 672-677.

16. Бондарчук A.A. Ферментные свойства комплексных препаратов из Bacillus mesentericus в зависимости от состава питательных сред / A.A. Бондарчук, И.В. Колтукова, В.Т. Васкивнюк // М/б. журнал. 1983. - Т 45, № 2. - С. 9295.

17. Бурханов Н.Д. О структуре матриц на основе производных полисахаридов для иммобилизации биологически-активных веществ / Н.Д. Бурханов, С.М. Югай, М.Ю. Юнусов и др. // Химия природ, соед. 1997. - № 4. - С. 632638.

18. Бурцева Э.И. Влияние состава среды на диссоциацию Bacillus subtilis 82 / Э.И. Бурцева, A.C. Тихомирова // Достижения биотехнол. arpoпром. комплексу: Тез. докл. Всес. конф., Черновцы, 14-16 окт., 1991. Черновцы, 1991.-Т. 1.-С. 86.

19. Быков В.А. Производство белковых веществ: В 8 т. Т. 5. Технология ферментных препаратов / В.А. Быков, М.Н. Манаков, В.И. Панфилов и др. -М.: Высш. шк., 1987. 105 с.

20. Варфаломеев С.Д. Биокинетика: Практический курс / С.Д. Варфа-ломеев, К.Г. Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

21. Василевская И.А. Эластазная активность бактерий рода Bacillus / И.А. Василевская, A.A. Бондарчук, М.Т. Сергейчук // М/б журнал. 1979. - Т. 41,№6. -С. 607-612.

22. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике / К.Н. Веремеенко. Киев; 1971. - 215 с.

23. Веселов И .Я. Протеолитический препарат из культур бактерий Bacillus polymyxa штамма 13-13 / И.Я. Веселов, Т.А. Смирнова, H.A. Балашова // Прикл. биохимия и микробиол. 1975. - Т. 11, № 6. - С. 824-826.

24. Выборных С.Н. Биосинтез микроорганизмами рода Bacillus фибри-нолитических ферментов различного механизма действия / С.Н. Выборных, Н.С. Ландау, Н.С. Егоров // Микробиология. 1990. - Т. 59, вып. 5. - С. 782-789.

25. Выборных С.Н. Колониально-морфологическая изменчивость Bacillus licheniformis 28КА в связи с образованием антибиотиков, экзопротеаз и спор / С.Н. Выборных, Е.В. Парыгин, Н.С. Егоров // Биологические науки. -1991.-№12.-с. 127-134.

26. Высоцкий В.В. Полиморфизм как закономерность развития популяций прокариотных организмов /В.В. Высоцкий, П.Л. Заславская, A.B. Маш-ковцева и др. //Биологические науки. -1991. № 12. - с. 5-18.

27. Глянцев С.П. Сравнительное изучение активности протеолитиче-ских ферментов, применяемых в хирургии для очищения гнойных ран / С.П. Глянцев, Т.В. Саввина // Бюл. Эксперим. биологии и медицины. 1996. -№6.-С. 716-720.

28. Говорунова В.А. Способ получения протеолитических ферментов /

29. В.А. Говорунова, П.В. Бабаева, В.В. Шевцов // A.c. № 3794948. -опубл.30.07.91. Бюл. № 28.

30. ГОСТ 12.1.007-76 Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. ССБТ., М., 1976.

31. Государственная фармакопея СССР. Изд. XI. М.: Медицина, 1987. - Вып. 1. - 333 с.

32. Грачева Н.М. Эффективность нового бактерийного препарата био-спорина при лечении острых кишечных инфекций / Н.М. Грачева, А.Ф. Гаври-лов, А.И. Соловьева//Журн. микробиол. 1996. - № 1. - С. 75-77.

33. Гурвич А.Е. Использование целлюлозных матриц в иммунохимии // Иммуносорбенты и их использование в биотехнологии / А.Е. Гурвич // Имму-носорбенты и их использование в биотехнологии: Сб. тр. М.; 1986. С. 5-22.

34. Данющенкова Н.М. Действие линкомицина, химотрипсина и их сочетаний на течение экспериментальной стафилококковой инфекции / Н.М. Данющенкова, Г.А. Карлович, Т.Ф. Беренштейн // Антибиотики. 1978. - № 4. - С. 330-333.

35. Дебабов В.Г. Современные методы создания промышленных штаммов / В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. М.: Высш. шк., 1988. - С. 81.

36. Дембровская Е.М. Способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов / Е.М. Дембровская, О.С. Кузнецова, Е.П. Яковлева // Пат. № 2054479, R.U. опубл. 1996. Бюл. № 5.

37. Демидюк И.В. Вариант очистки генно-инженерной металлопротеи-назы Bacillus amyloliquefaciens / И.В. Демидюк, E.H. Звонкова, Е.А. Носовская // Биотехнология. 1994. -№ 11-12. - С. 13-15.

38. Демина И.С. Микроорганизмы, синтезирующие ферменты тромбо-литического действия / И.С. Демина, С.В. Лысенко // Биологические науки. -1991.-№9.-С. 136-153.

39. Демина Н.С. Морская бактерия Alteromonas piscicida продуцент ферментов тромболитического действия / Н.С. Демина, Е.Ф. Веслова, Г.П. Га-енко // Известия АН СССР: Серия биология, - 1990. - № 3. - С. 415-419.

40. Демина Н.С. Экзопротеазы культуры Streptomyces lovendulae / Н.С. Демина, С.В. Лысенко // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 4. - С. 458-460.

41. Диксон М. Ферменты: В 3 т. Т. 1. / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982.-340 с.

42. Долгова Г.В. Экспериментальное исследование нового лекарственного препарата для местного применения на основе гентамицина, эритромицина и протеазы С / Г.В. Долгова, В.В. Бережинская, Г.Г. Егоренко // Антибиотики. 1990. - Т. 35, № 9. - С. 28-29.

43. Долгова Г.В. Экспериментальное изучение протеазы С протеоли-тического фермента микробного происхождения / Г.В. Долгова, В.В. Бережинская, Т.П. Свиногеева // Антибиотики. - 1991. - Т. 36, № 1. - С. 29-31.

44. Долидзе Д.А. Исследование комплекса протеолитических ферментов Actinomyces fradiae 119 I Д.А. Долидзе, И.С. Петрова, Р.В. Фениксова // Прикл. биохимия и микробиол. 1974. - Т.10, № 5. - С. 721-726.

45. Дорохов В.В. Специфичность щелочной протеиназы Bacillus mesentericus / В.В. Дорохов, Т.А. Гладких, И.С. Коршунов // Тр. фермент, отд. ВНИИ биосинтеза белковых веществ. 1972. - № 1. - С. 64-65.

46. Дытнерский Ю.И. Баромембранные процессы / Ю.И. Дытнерский. -М.: Химия, 1986.-272 с.

47. Егоров Н.С. Метод диффузии протеолитических ферментов из блоков агара с культурами микроорганизмов / Н.С. Егоров. М.: Наука, 1971. -18 с.

48. Егоров Н.С. Протеолитические ферменты микроорганизмов, обладающие фибринолитической и коагулазной активностями / Н.С. Егоров // Итоги науки и техники. 1978. - № 9. - С. 5-40.

49. Егоров Н.С. Очистка i §ея1а властвост1 протеази Bacillus subtilis var. amyloliquefaciens, здатно i згортати плазму Kpoei / Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури, Т.А. Острошко // М/б журнал. 1977. - № 4. - с. 507-509.

50. Егоров Н.С. Влияние аминокислот на синтез экзопротеазы Bacillus thuringiensis / Н.С. Егоров, Ж.К. Лория, Т.Г. Юдина // Прикл. биохимия и микробиол. 1983. - Т. 19, № 5. - С. 610-614.

51. Егоров Н.С. Способ получения очищенного протеолитического фермента / Н.С. Егоров, Т.Г. Юдина, Ж.К. Лория // Пат. № 732382, СССР. -Опубл. 1980. Бюл. № 17.

52. Ежов В.А. Способ выделения комплекса литических ферментов / В.А. Ежов, Л.В. Троицкая, П.П. Рухлова // A.c. № 1755581, S.U. Опубл. 1995. Бюл. № 23.

53. Ефимов Ю.М. Способ лечения гнойных ран / Ю.М. Ефимов, С.Н. Загребельный, Л.В. Земцова // A.c. № 1936919, СССР. Опубл. 1982. Бюл. № 23.

54. Знаменская Л.В. Биосинтез внеклеточных ферментов Bacillus intermedius / Ю.М. Ефимов, С.Н. Загребельный, Л.В. Земцова // Микробиология. 1986. - Т. 55, вып. 3. - С. 449-454.

55. Знаменская Л.В. Регуляция биосинтеза внеклеточных ферментов Bacillus intermedius 3S-19 / Л.В. Знаменская, Н.В. Феоктистова, И.Ф. Лобашева и др. // Приют, биохимия и микробиол. 1995. - Т.31, № 4. - С. 412-416.

56. Иванова Л.Г. Содержание растворенного кислорода в микробиологических питательных средах / Л.Г. Иванова, А.К. Варгина, И.Д. Горбачев // Журн. микробиол. 1985. - № 8. - С. 22-26.

57. Ильин Г.И. Производство ферментных препаратов микробного синтеза для медицины / Г.И. Ильин, Б.В. Москвичев // Сб. науч. ст.: Ферменты микроорганизмов: Сб. науч. Статей. Ленинград, 1987. - Ч. 2. - 320 с.

58. Имшенецкий A.A. О фибринолитической активности естественных вариантов Bacillus mesentericus / A.A. Имшенецкий, Г.В. Черкесова, И.Д. Касаткина//Микробиология. 1987. - Т. 56, № 9. с. 947-950.

59. Ицкович Е.Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеазы Bacillusintermedius / E.JI. Ицкович, Jl.B. Знаменская, Н.П. Балабан // Микробиология. -1995. Т. 64, № 5. - С. 623-629.

60. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ. / Т. Келе-ти. М.: Мир, 1990. - 350 с.

61. Клепикова Ф.С. Штамм бактерий Bacillus megaterium продуцент металлопротеиназы / Ф.С. Клепикова, Г.Г. Честухина, М.Е. Борматова // A.c. № 1440921, S.U. - Опубл. 1988. Бюл. № 44.

62. Коваленко Э.А. Закономерности биосинтеза гидролаз Bacillus mesentericus на разных средах / Э.А. Коваленко, Н.В. Колтукова, Т.В. Стрель-чина // Прикл. биохимия и микробиол. 1990. - Т. 26, № 4. - С. 528-533.

63. Кованова В.В. Коллагенопластика в медицине / Под ред. В.В. Кова-нова.-М. 1978.-260 с.

64. Койдуш Г.А. Очистка и концентрирование кислой протеазы / Г.А. Койдуш // Ферментная и спиртовая промышленность. 1982. - № 5. - С. 2325.

65. Колтукова Н.В. Стабилизация комплексного ферментного препарата из Bacillus mesentericus двухвалентными катионами металлов / Н.В. Колтукова // М/б. журнал. 1983. - Т. 45. - № 2. - С. 94-95.

66. Колтукова Н.В. Подбор методов выделения протеолитического ферментного комплекса из Bacillus mesentericus, штамма 316 при глубинном выращивании / Н.В. Колтукова, В.Т. Васкивнюк // М/б. журнал. 1980. - Т. 42, №2.-С. 245-251.

67. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Под ред. Е.А. Кост. М.: Медицина. 1975. - 389 с.

68. Кушнер В. П. Конформационная устойчивость и денатурация биополимеров / В. П. Кушнер. Л.: Наука. - 1977. - 230 с.

69. Лазорев Н.В. Воспроизведение заболеваний для экспериментально-терапевтических исследований / Под ред. Н.В. Лазорева. М.: Медгиз. - 1954. -392 с.

70. Ландау Н.С. Особенности накопления в среде и некоторые свойствапротеолитических ферментов, образуемых Nocardia minima / Н.С. Ландау, Н.С. Егоров // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 1. - С. 42-47.

71. Логинова Л.Г. Использование ферментных препаратов (протеазы и амилазы), выделенных из термоустойчивого штамма Bacillus mesentericus / Л.Г. Логинова, В.Г. Бабакина, Г.Я. Калмыкова // Прикл. биохимия и микробиол.- 1965.-Т. 1, № 3. -С. 263-268.

72. Лория Ж.К. Влияние аминокислот на синтез внеклеточных протеаз у Serratia marcescens / Ж.К. Лория, Б. Брюкмер, Н.С. Егоров // Микробиология.- 1977.-№ 1.-С. 41-44.

73. Лысенко C.B. Действие солей металлов на экзопротеазную активность культуры Streptomyces lavendulae / C.B. Лысенко, Н.С. Демина // Прикл. биохимия и микробиол. 1996. - Т. 32, № 2. - С. 228-230.

74. Маркарян А.Н. О субстратной специфичности внутриклеточной се-риновой протеиназы Bacillus subtilis I А.Н. Маркарян, В.И. Остославская, В.К. Швядас // Биохимия. 1980. - Т. 45, № 7. С. 71-75.

75. Мартинек К. Успехи химии / К. Мартинек, И. В. Березин // T. XLIX.- Вып. 5, Май. 1980. - С. 737-762.

76. Мартьянов В.А. Получение высокоактивных препаратов нейтральной протеазы Bacillus subtilis / В.А. Мартьянов, А.Ф. Зябрев, Б.П. Финогенов // Ферменты микроорганизмов: Сб. ст. -М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. С. 175-185.

77. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Меркулов.- Л.: Медицина, 1969. 423 с.

78. Милько Е.С. Нестабильность синтеза практически ценных веществ бактериями и процесс диссоциации / Е.С. Милько // Прикл. биохимия и микробиол. 1990. - Т.26, № 6. - С. 732-742.

79. Милько Е.С. Влияние физико-химических факторов среды на рост диссоциантов некоторых грамположительных бактерий / Е.С. Милько, Н.С. Егоров И Биол. науки. 1992. - № 5. - С. 89-96.

80. Михайлова H.A. Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus / Михайлова Н.А, Кузнецова Т.Н., Зобова Т.И. и др. //

81. Пат. № 2112035, РФ. Опубл. 1998. Бюл. № 15.

82. Морозова И.П. Выделение и характеристика металлопротеиназы Bacillus megaterium / И.П. Морозова, Г.Г. Честухина, М.Е. Борматова // Биохимия. 1993. - Т. 48, № 6. - С. 896-907.

83. Морозова И.П. Металлопротеиназа Bacillus mesentericus штамма В-313 / И.П. Морозова, М.П. Юсупова, М.Ю. Гололобов // Биохимия. 1993. - 58. - № 9. - С. 1420-1429.

84. Неклюдов А.Д. Получение и свойства панкреатина иммобилизованного на карбоксиметилцеллюлозе / А.Д. Неклюдов, А.Н. Иванкин, М.И. Бабурина // Прикл. биохимия и микробиол. 1998. - Т. 34, № 1. - С. 61-65.

85. Нестерова Н.Г. Субстратная специфичность ферментов Bacillus mesentericus / Н.Г. Нестерова, Г.В. Черкесова, Н.Ф. Кириллова // Микробиология. 1989. - Т. 58, № 4. - С. 48-55.

86. Нехотяева Е.В. Внеклеточные гидролазы Bacillus intermedius. Выделение и свойства / Е.В. Нехотяева, М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан. Казань: Казан, университет, 1995. - 18 с.

87. Николаев Ю.А. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Е.С. Милько // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 2. - С. 293-294.

88. Остерман J1.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.

89. Паберит Н.Ю. Способ выделения нейтральной металлопротеазы / Н.Ю. Паберит, М.С. Панк, A.A. Авиксаар // A.c. № 908088, S.U. Опубл. 1980. Бюл. № 16.

90. Паберит Н.Ю. Очистка и свойства нейтральной металлопротеиназы из термофильной бактерии Bacillus brevis / Н.Ю. Паберит, М.С. Панк // Биохимия. 1984. - Т. 49, № 2. - С. 275-281.

91. Павлова Е.С. Очистка культуры Bacillus subtilis 82 перед концентрированием методом ультрафильтрации / Е.С. Павлова, В.А. Кудряшова, Н.С. Погоржельская. М.: ВНИИ Пищ. биотехн., 1989. - 14 с.

92. Парр Г.С. Ультрафильтрационные процессы выделения биологически активных веществ / Г.С. Парр, Т.И. Рожанская. М.: ЦБНТИ Медбиопрома, 1986.-Вып. 6. -32с.

93. Паршина С.Н. Штамм бактерий Bacillus cereus продуцент протео-литических ферментов с тромболитическим действием / С.Н. Паршина, A.A. Имшенецкий, Н.Г. Нестерова //A.c. № 1615177, S.U. - Опубл. 1990. Бюл. № 47.

94. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Перт С. Дж. М.: Мир, 1978. - 330. с.

95. Петрова К.П. Влияние углеводов на биосинтез внеклеточных про-теиназ с молокосвертывающим действием М-вариантом Bacillus subtilis штамма 76 / К.П. Петрова, Т.Н. Антонова, У.А. Николаева // Act. microbiol. bulg. 1991. -№28. -С. 40-45.

96. Позмогова И.Н. Культивирование микроорганизмов в переменных условиях / И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1983. - 104 с.

97. Полянцев Н.И. Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis продуцента пробиотика / Н.И. Полянцев, JI.B. Ропаева, В.В. Подберезный // Пат. № 2100029, RU. - Опубл. 27.12.97. Бюл. № 36.

98. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов / Ф. Прист. -М.: Мир, 1987.- 113 с.

99. Прокопенко Л.Г. Влияние трипсина на иммунный ответ при локализованной стафилококковой инфекции / Л.Г. Прокопенко, Г.А. Чалый // Журн. микробиол. 1984. - № 4. - С. 104-108.

100. Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов / И.Л. Работнова, И.Н. Позмогова. М.: Наука, 1979. - 208 с.

101. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон. М.: Мир, 1987.-411 с.

102. Северин А.И. Металлопротеиназа / А.И. Северин, O.A. Степная, И.С. Кулаев // A.c. № 1594214, S.U. Опубл. 1990. Бюл. № 35.

103. Сиголаева Л.П. Влияние температурного коллапса матрицы на активность иммобилизованного фермента а-химотрипсина / Л.П. Сиголаева, H.A. Еремеев, Н.Ф. Казанская // Биотехнология. 1993. - №5. - С.36-39.

104. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985.358 с.

105. Слабоспицкая А.Т. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов / А.Т. Слабоспицкая, С.С. Кры-мовская, С.Р. Резник // М/б. журнал. 1990. - Т. 52, № 2. - С. 9-14.

106. Смирнов В.В. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации / В.В. Смирнов, А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев и др. // М/б. журнал. 1993. - Т. 55, № 3. - С. 38-44.

107. Смирнов В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: Наукова Думка, 1982. - 280 с.

108. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов / И.Б. Сорокулова // Антибиот и химиотер. 1996. - Т. 41, № 10. - С. 13-15.

109. Стронгин А.Я. Сравнительное изучение множественности экзо-ферментов, продуцируемых различными мутантами Bacillus subtilis / А.Я. Стронгин, A.A. Лукин, Л.С. Изотова и др. // Микробиология. 1977 - Т. XLV1. -Вып. З.-с. 539-546.

110. Стручков В.И. Гнойная рана / В.И. Стручков, A.B. Григорян, В.К. Гостищев. М. - 1975. -311 с.

111. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология / К. Харвуд. -М.: Мир, 1992.-472 с.

112. Хванг С.Т. Мембранные процессы разделения / С.Т. Хванг, К. Коммермейкер. М.: Химия, 1981. - 464 с.

113. Холодная Ж.В. Разработка технологи получения протеолитического ферментного комплекса из бактерий рода Bacillus: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ж.В. Холодная; УфНИИВС им. И.И. Мечникова ГУЛ "Иммунопрепа-рат". Уфа, 1999.-30 с.

114. Чалый Г.А. Иммуностимулирующее и протективное действие препаратов террилитина при стафилококковой инфекции / Г.А. Чалый, Л.Г. Прокопенко, В.В. Вельский // Антибиот. и химиотер. 1988. - Т. 33. - № 5. - С. 362364.

115. Чанг Т. М. Искусственная клетка / Т. М. Чанг. Киев: Наукова думка, 1979. - 204 с.

116. Черкасов А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник. Л.: Химия, 1991. - 240 с.

117. Шагинян К.А. Металлопротеиназа из Bacillus subtilis внеклеточные и внутриклеточные ферменты / К.А. Шагинян, Л.С. Изотова, Ю.В. Йоман-тас // Биохимия. - 1980. -Т. 45, № 11. - С. 2083-2095.

118. Шишкова Э.А. Концентрирование и очистка щелочной протеазы методом ультрафильтрации / Э.А. Шишкова, С.С. Фокина // Прикл. биохимия и микробиол. 1981. - Т. 17, № 2. С. 187-192.

119. Шишкова Э.А. Способ получения очищенной щелочной протеина-зы Bacillus subtilis / Э.А. Шишкова, С.С. Фокина, Л.И. Орещенко // A.c. № 942428, S.U. Опубл. 1980. Бюл. № 32.

120. Bond W.W. Termal profile of a Bacillus species (ATCC 27380) extremely resistant to dry heat / W.W. Bond, M.S. Favero // Appl. Microbiol. 1975. -V. 29.-№6.-P. 859-860.

121. Chen Jie. Sugar-based prtease composition for use with constant-pH borate buffers / Chen Jie. United States Patent № 5494817. - 1996.

122. Claire Vieille, Gregory J. Zeikus. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability / Claire Vieille, Gregory J. Zeikus // Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2001. Vol. 65? № 1. -P. 1-43.

123. Czor R., Bucher T. Crystallised enzymes from the myogen of rabbit skeletal muscle / R. Czor, T. Bucher // Advan. Prot. Chem. 1960. - Vol. 15. - P. 315-415.

124. Damodaran M. The proteolytic system of Bacillus licheniformis / M. Damodaran, V.S. Govindarajan, S.S. Subramanian // Biochim. Biophys. Acta. 1955. -Vol. 17.-P. 99-103.

125. Dijhuizen L. Microbial responses to changes in growth conditions / L. Dijhuizen // Forum Microbiol. 1989. - V. 12. - № 1-2. - P. 40-43.

126. Fukumoto J. Purification and some properties of a neutral proteinase of Bacillus subtilis / J. Fukumoto, T. Yamamoto, K. Ickikacva // Studies on bacterial proteinases // J. Agric. Chem. Soc. 1958. - Vol. 32. - P. 230-233.

127. Godfrey T. Industrial enzymology / T. Godfrey; S. West. 2nd ed., Mac-millan Publisher Inc., Ney York, 1996. - P. 3.

128. Guntelberg A.V. Preparation of crystals containing the plakalbumin -forming enzyme from Bacillus subtilis / A.V. Guntelberg, M. Ottesen // Nature. -1952.-Vol. 170.-P. 802-809.

129. Hagihara B. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis / B. Hagihara, H. Matsubara, M. Nakai // J. Biochem. -1958.-Vol. 45.-P. 185-191.

130. Hall F.F. Multiple proteolytic enzymes of Bacillus licheniformis / F.F. Hall, H.O. Kunkel, J.M. Prescott // Arch. Biochem. Biophys. 1966. - Vol. 114.-P. 145-150.

131. Hartley B.S. Proteolitic enzymes / B.S. Hartley // Annual Rev. Biochem. 1960. - Vol. 29. P. 45-72.

132. Hayashi Sachia. Immobilization of p-fructofroanosidase from Aureo-basidium on DEAE-cellulose / Hayashi Sachia, Sasao Siniji, Takasaki Yoshiuki, Imada Kiyohisa. // J. Ind. Microbiol. 1994. - Vol 13. - № 2. - P. 103-105.

133. Hunt J.A. A comparison of three proteinases from various strains of Bacillus subtilis / J.A. Hunt, M. Ottesen // Biochim. Biophis. acta. 1961. - Vol. 48. -P. 411-415.

134. Keay L. Neutral proteases of the genus Bacillus / L. Keay // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1969. - Vol. 36. - P. 257-262.

135. Kohlmann K.L. Purification and characterization of an extracellular protease produced by Pseudomonas fluoresceins / K.L. Kohlmann, S.S. Nielsen, M.R. Ladisch // J. Dai rysci. 1991. - Vol. 74, № 12. - P. 4125-4136.

136. Kubo M. Mechanism of thermostability in thermolysin analysis of subsite S2 mutant enzymes of thermolysin / M. Kubo, K. Itoh, K. Nishikawa et al. // Letters in Applied Microbiology 1999. - Vol. 28, № 6. - P. 431-438.

137. Lowry O.H. Protein measurement with the folin phenol reagent /

138. O.H. Lowry, H.I. Rosenbrough, A.L. Faar // J. Biol. Chem. 1951. - V. 193. - p. 265275.

139. Maceda-Coronel L. Production of proteolytic enzyme from a local strain of Bacillus subtilis / L. Maceda-Coronel, V.E. Orillaza, L. Arguelles // Philipp. J. Sci. 1974. - Vol. 103, № 3. - P. 149-163.

140. Martinez I. Immobilizacion de trypsina en diferentes soportes / I. Martinez, M. Gonzales // Rev.biol. 1992. - Vol. 6, № 2. - P. 90-95.

141. Matsubara H. Crystalline bacterial proteinase. On the reaction with di-isoproppyl fluorophosphate / H. Matsubara, S. Nishimura // J. Biochem. 1958. -Vol. 45. - P.503.

142. McConn I.D., Tsuru D., Yasunobu K.T. Bacillus subtilis neutral proteinase. A zinc enzyme of high specific activity / I.D. McConn, D. Tsuru, K.T. Yasunobu//J. Biol. Chem. 1964. - Vol. 239. - P. 3706-3708.

143. Melander W. Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: An interpretation of the lyotropic series / W. Melander, C. Horvath // Arch. Biochem. Biophys. 1977. — Vol. 183, № 3. - P. 200-215.

144. Michotey Valerie. Characterization of an endoserine protease secreted by Arthrobacter aureus / Michotey Valerie, Blanco Carlos // Appl. and Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60, № 1. - P. 341-343.

145. Neet K.E. The conversion of serin at the active site of subtilisin to cysteine: a chemical mutation / K.E. Neet, D.E. Koshland // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1966.-Vol. 56.-P. 1606-1609.

146. Nelson, J.M., Criffit E.G.J. (1916) J. Amer. Chem. Soc., 38, 1109.

147. North M.I. Comparative biochemistry of the proteinases of eucaryotic microorganism / M.I. North // Microbiol., Rev. 1982. - Vol, 46. - P. 308-340.

148. Parrado Juan. Immobilization and stabilization keraza, a serine protease from Streptomyces fradiae, by covalent attachment to porous glass / Parrado Juan, Bautista Juan // Biosci. Biotechnol. and Biochem.-1995. -Vol. 59, № 5. P. 906-907.

149. Peek Keith. Thermus sp. purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rf 41A / Peek Keith, Daniel Roym, Menk Colin, Purker Lynne, Coolbear Tim // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 207, № 3.-P. 1035-1044.

150. Phamthi T. Serin neutral proteinase from Bacillus pumilis as metalloenzyme / T. Phamthi, H. Urbanek // Acta microbiol. pol. 1974. - Vol. 36, № 1. - P. 2125.

151. Polgar L. The reactivity of thiol-subtilisin an enzyme containing a synthetic functional group / L. Polgar, M.L. Bender // Biochemistry. 1967. - Vol. 6. - P. 610-615.

152. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus / F.G. Priest // Bacteriol. Rev. 1977. - Vol. 41. - P. 711-753.

153. Qiu Xiubao. Изучение очистки и ряда свойств протеазы из Bacillus pumilus / Qiu Xiubao, Gao Dong, Wang Yingda et al. // Acta microbiol. sin. 1994. -Vol. 34, № 4. - P. 293-300.

154. Rappaport H.P. A Bacillus subtilis proteinase. Production, purification and characterization of a proteinase from a transformable strain of Bacillus subtilis / H.P. Rappaport, W.S. Riggsby, D.A. Holden // J. Biol. Chem. 1965. - Vol. 240.1. P. 78-81.

155. Rodriewicz A. Wykorzystanie bacterii z rodzaju Bacillus do produckcj'i pozakomoakowych proteinaz Cz.II / A. Rodriewicz // Zesz. nauk. AR Wroclawiu Technol. Zyw. 1989. - № 5. - P. 207-217.

156. Ruttlof H. Proteasen aus thermophilen microorganismen / H. Ruttlof // Naturwiss. R. 1978. - Vol. 27, № 2. - P. 123-133.

157. Santos I.A.L. Recovery of alkaline proteases by membrane filtration. Effect of membrane type and addition of submicron sized charged particles / I.A.L. Santos, I.M.S. Cabral, C.C. Cooney // Bioprocess. Eng. 1992. - Vol. 7, № 5. -P. 205-211.

158. Stoeva S.T. Studies on the inhibition of a zinc proteinase from Bacillus mesentericus strain 76 by 1,10 phenanthroline / S.T. Stoeva // Докл. A.H. -1991. T. 44, № 6.-C. 41-44.

159. Strongin A.Y. Dicect comparison of the subtilisin like intracellular protease of the Bacillus licheniformis with the homologous enzymes of Bacillus subtilis / A.Y. Strongin//J. Bacterid.- 1979.-Vol. 137, №2.-P. 1017-1019.

160. Takegawa Kaoru. Purification and characterization of alkaline proteinase from Arthrobacter protophormiae / Takegawa Kaoru, Мои Le Hong, Miyauchi Chiemi, Iwahara Shojiro // Tech. Bull. Fac. Agr. Kagawa Univ. 1993. - Vol. 45, №2.-P. 115-120.

161. Tanford C. The hydrophobic effect: Formation of micelles and biological membranes: 2nd ed. / C. Tanford. New York: Wiley-Interscience, 1980. - 231 p.

162. Van Duzee. Stable liquid enzyme compositions and methods of use / Van Duzee, Barry F. Stone, P. Ralph // United States Pat. № 5,576,278. 1996.

163. Van-Kova H. Stabilization of trypsin by glycosylation / H. Van-Kova, M. Pospililovi, M. Ticha, I. Turkova // Biotechnol. Techn.-1994. Vol. 8, № 6. - P.375.380.

164. Ward O.P. Proteinases / O.P. Ward // in: Microbiol Enzymes and Biotechnology. Applied Science. 1983, London. - P. 251-317.

165. Welker N.E. Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis / N.E. Welker, L.L. Campbell // J. Bacteriol. 1967. - Vol. 94. - P. 11241127.1. БЛАГОДАРНОСТЬ

166. Выражаю глубокую признательность директору Уфимского ФГУП НПО "Микроген" МЗ РФ, филиал "Иммунопрепарат" д.м.н. Алсынбаеву Махамату Махаматуловичу за помощь и советы при выполнении работы, а также сотрудникам лаборатории бактерийных препаратов.