Индукторы болезнеустойчивости на основе хитозана для защиты от грибных и вирусных болезней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Куликов, Сергей Николаевич

• Куликов, Сергей Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Куликов, Сергей Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Хитина и хитозан - биогенные элиситоры

1.2 Хитин и хитозан: химическое строение и свойства

1.3 Взаимодействие хитина с растительным организмом

1.4 Взаимодействие хитозана с растительным организмом

1.5 Элиситорная активность хитина и хитозана

1.5.1 Ионные потоки

1.5.2 Активные формы кислорода и азота

1.5.3 Вторичные метаболиты

1.5.4 Ферменты

1.6 Элиситорная активность хитина и хитозана в отношении грибных заболеваний

1.7 Биопрепараты на основе хитина и хитозана в защите растений от грибов

1.8 Элиситорная активность хитина и хитозана в отношении вирусных заболеваний

1.9 Биологическая активность хитозана, связь с химической структурой

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

• 2.1 Материалы и методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде

3.2 Полевые испытания препаратов

3.2.1 Биометрические показатели посевов картофеля

3.2.2 Микологический анализ почвы

3.2.3 Распространённость и развитие заболеваний растений

3.2.4 Структура комплекса микромицетов филлосферы

3.2.5 Микологический анализ клубней картофеля

3.2.6 Продуктивность картофеля и качество урожая

3.3 Противовирусная активность хитозана на растениях

3.3.1 Противовирусная активность хитозана на растениях фасоли

3.3.2 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N. tabacum cv. Samsun nn

3.3.3 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N. tabacum cv. Samsun NN

3.3.4 Индукция хитозаном РНК-зависимой РНК-полимеразной активности в изолированных протопластах табака

3.3.5 Противовирусная активность МРЗ-белка и РНКазы в комплексе с хитозаном на растениях табака

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукторы болезнеустойчивости на основе хитозана для защиты от грибных и вирусных болезней»

Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Особенности структуры хитозана обуславливают ряд привлекательных свойств этого поликатиона -гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, а также иммуномодулирующие свойства.

Актуальность темы. Метод индуцирования неспецифической устойчивости у растений с помощью хитозановых элиситоров является ф одним из перспективных способов защиты сельскохозяйственных культр от грибных болезней. Метод основан на индуцировании врождённых защитных механизмов растения. Под действием хитозана происходит фенотипическая иммунокоррекция растений, в результате чего изменяется функционирование растительной ткани, связанное с уровнем экспрессии защитных генов. Такой механизм действия хитозанового элиситора в наименьшей степени влияет на полезную микрофлору агроценоза и обуславливает его экологическую безопасность.

Одной из уникальных биологических активностей хитозана является его способность индуцировать устойчивость у растений к вирусным

• заболеваниям.

Для хитозана, который является сополимером глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, а также в силу специфики его получения характерна структурная неоднородность. Это обстоятельство существенно сказывается на его иммуномодулирующих свойствах, зависящих от особенностей структуры биополимера. До настоящего времени данные о связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими ® свойствами носят разрозненный и не систематический характер.

Целью настоящей работы являлось изучение свойств низкомолекулярного хитозана и препаратов на его основе как индукторов устойчивости к грибным и вирусным заболеваниям.

Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:

- оценить влияние препарата АгроХит на основе низкомолекулярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок;

- провести сравнительный анализ влияния препарата АгроХит на микоценоз картофельных посадок в сравнении с другими препаратами;

- оценить влияние физико-химических свойств хитозана на его противовирусную активность в растениях;

- выявить возможные механизмы противовирусной защиты растений, индуцируемые хитозаном.

Научная новизна работы. Проанализировано влияние препарата на основе низкомолеклярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Проведён сравнительный анализ влияния элиситорного препарата на основе низкомолекулярного хитозана на микоценоз картофельных посадок в сравнении с препаратами, обладающих другими механаизмами действия. Показано, что в сравнении с биопрепаратом Триходермин и химическими пестицидами, элиситорный препарат на основе хитозана в большей степени влияет на патогенные грибы поражающие наземные части растений картофеля - Phytophthora sp. и Alternaria sp. и наиболее щадящим образом воздействует на непатогенную сапротрофную микрофлору, обнаруживая тем самым наименьший побочный эффект.

Показана способность хитозана индуцировать устойчивость у растений фасоли к заражению вирусом мягкой мозаики фасоли (ВММФ). Установлена молекулярная масса полимера хитозана, обладающая наибольшей противовирусной акивностью.

Проведена оценка влияния молекулярной массы и степени ф деацетилирования хитозана на его противовирусные свойства в растениях табака при заражении их вирусом табачной мозаики (ВТМ). В изолированных протопластах табака показан, индукцированный хитозаном, синтез белка с молекулярной массой 125-130 кДа, предположительно РНК-зависимой РНК-полимеразы, и усиление данной ферментативной активности. Что позволяет предположить механизм противовирусной защиты растений как хитозан индуцируемое замалчивание генов.

Практическая значимость работы. Предложена оригинальная схема получения низкомолекулярного хитозана в бессолевых условиях для производства препарата АгроХит.

Показано, что элиситорный препарат АгроХит на основе хитозана снижает численность таких грибных вредителей картофеля как Phytophthora, Alternaria и Oospora, одновременно оказывая минимальное воздействие на непатогенную сапротрофную микофлору картофельных посадок. Предложено применять элиситорные препараты на основе хитозана для обработки сельскохозяйственных культур для уменьшения масштабов # применения синтетических фунгицидов.

Способность хитозана индуцировать устойчивость у растений к заражению вирусами является предпосылкой к созданию противовирусных препаратов. Выяснение механизмов защиты растений от вирусов позволит осознанно создавать эффективные антивирусные препараты.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах.

Структура и объём диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел с обсуждением экспериментальных результатов, выводы, список литературы, приложение. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 4 рисунка, библиографию из 125 наименований.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Куликов, Сергей Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана в бессолевых условиях и получена опытная ф партия препарата АгроХит — индуктора болезнеустойчивости и росторегулятора растений.

2. Проведена оценка влияния препарата АгроХит на основе низкомолекулярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Обнаружено, что обработка АгроХитом снижает численность патогенных грибов родов Phytophthora, Alternaria и Oospora.

3. Установлено, что препарат АгроХит в сравнении с Триходермином и синтетическими пестицидами в меньшей степени влияет на сапротрофную микофлору. Препарат на основе триходермы был особенно эффективен против Fusarium sp. Синтетические пестициды, подавляя большинство патогенных и сапротрофных грибов, существенно изменяли структуру сообщества сапротрофных микромицетов, что способствовало увеличению численности патогенов родов Oospora и Geotrichum.

4. Установлено, что у растений фасоли и табака хитозан индуцирует устойчивость к заражению вирусами. Наибольшей эффективностью подавления вирусной инфекции в растениях фасоли обладал хитозан с молекулярной массой 1-2 кДа, а в растениях табака хитозан с молекулярной массой 5-15 кДа.

5. Показано, что в протопластах табака хитозан индуцирует активность клеточной РНК-зависимой РНК-полимеразы, что может являться одним из механизмов противовирусной устойчивости у растений.

6. Методом электрофореза в полиакриламидном геле показано, что комплексообразование хитозана и MF3-белка Pseudomonas fluorescens происходит за счёт электростатического взаимодействия. Элиситорное действие MF3-белка обусловлено возможностью образования комплекса с хитозаном.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Куликов, Сергей Николаевич, 2006 год

1. Ильина А.В., Ткачёва Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин• Г20х // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. - Т.38. - №1. - С.5-13.

2. Rege R.R, Block L.H. Chitosan processing: influence of process parameters during acidic and alkaline hydrolysis and effect of the processing sequence on the resultant chitosan's properties // Carbohydrate research. 1999. -V.321. - №3-4. - P.235-245.

3. Shibuya N., Kaku H., Kuchitsu K., Maliarik M.J. Identification of a novel high-affinity binding site for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the membrane fraction from suspension-cultured rice cells // FEBS Lett. 1993. -329.-№ 1-2.-P.75-78.

4. Ito Y., Kaku H., Shibuya N. Identification of a high-affinity binding protein for N-acetylchitooligosaccharide elicitor in the plasma membrane of suspension-cultured rice cells by affinity labeling // Plant J. 1997. - V.12. - №2. -P.347-356.

5. Day R.B., Okada M., Ito Y., Tsukada K., Zaghouani H., Shibuya N., Stacey G. Binding site for chitin oligosaccharides in the soybean plasma membrane // Plant Physiol. 2001. - V.126. - №3. - P.l 162-1173.

6. Stacey G., Shibuya N. Chitin recognition in rice and legumes // Plant and Soil. 1997. - V.194. - P.161-169.

7. Saito M., Chikazawa Т., Matsuoka H., Nishizawa Y., Shibuya N. Elicitor action via cell membrane of a cultured rice cell demonstrated by the single-cell transient assay // J. Biotechnol. 2000. - V.76. - № 2-3. - P.227-232.

8. Hadwiger L.A., Beckman J.M. Chitosan as a component of Pea-Fusarium interactions // Plant Physiol. 1980. - V.66. - P.205-211.

9. Yamada A., Shibuya N., Kodama O., Akatsuka T. Induction of phytoalexin formation in suspension-cultured rice cells by N-acetylchitooligosaccharides // Biosci. Biotech. Biochem. 1993. - V.57. - №3. -P.405-409.

10. Staehelin C., Granado J., Muller J., Wiemken A., Mellor R.B., Felix G., Broughton W.J., Boiler T. Perceptin of Rhyzobium nodulation factors by tomato cells and inactivation by root chitinases // PNAS. 1994. - V.91. - P.2196-2200.

11. Young D.H., Kohle H., Kauss H. Effect of chitosan on membrane permeability of suspension-cultured Glycine max and Phaseolus vulgaris cells // Plant Physiol. 1982. - V.70. - P. 1449-1454.

12. Hadwiger L.A., Beckman J.M., Adams M.J. Localization of fungal components in the Pea-Fusarium interaction detected immunochemically with anti-chitosan and anti-fungal cell wall antisera// Plant Physiology. 1981. - V.67. -P. 170-175.

13. Choi J. J., Klosterman S.J., Hadwiger L.A. A Comparison of the effects of DNA-damaging agents and biotic elicitors on the induction of plant defense genes, nuclear distortion, and cell death // Plant Physiol. 2001. - V.l25. - P.752-762.

14. Schwochau M.E., Hadwiger L.A. Regulation of gene expression by actinomycin D and other compounds which change the conformation of DNA // Arch. Biochem. Biophys. 1969. -V.134. - P.34-41.

15. Hadwiger L.A., Schwochau M.E. Specificity of DNA intercalating compounds in the control of phenylalanine ammonia lyase and pisatin levels // Plant Physiol. 1971. - V.47. - P.346-351.

16. Parsons M.A., Hadwiger L.A. Photoactivated psoralens elicit defense genes and phytoalexin production in the pea plant // Photochem. Photobiol. -1998.- V.67. -P.438-445.

17. Granado J., Felix G., Boiler T. Perception of fungal sterols in plants (subnanomolar concentrations of ergosterol elicit extracellular alkalinization in tomato cells) // Plant Physiol. 1995. - V.l07. - №2. - P.485-490.

18. Lapous D., Mathieu Y., Guern J., Lauriere C. Increase of defense genetranscripts by cytoplasmic acidification in tobacco cell suspension // Planta. -1998. V.205. - P.452-458.

19. Young D.H., Kauss H. Release of calcium from suspension-cultured Glycine max cells by chitosan, other polycations, and polyamines in relation toф effects on membrane permeability // Plant Physiol. 1983. V.73. - P.698-702.

20. Lecourieux D., Mazars C., Pauly N., Ranjeva R., Pugin A. Analysis and effects of cytosolic free calcium increases in response to elicitors in Nicotiana plumbaginifolia cells // Plant Cell. 2002. - V.14. - P.2627-2641.

21. Dolmetsch R.E., Lewis R.S., Goodnow C.C., Healy J.I. Differential1. О Aactivation of transcription factors induced by Ca response amplitude and duration //Nature. 1997. - V.386. - P.855-858.

22. Yang Т., Poovaiah B.W. A calmodulin-binding/CGCG box DNA-binding protein family involved in multiple signaling pathways in plants // J. Biol. Chem. 2002. V.277. - P.45049-45058.

23. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. - V.105. - № 2. - P.467-472.

24. Degousee N., Triantaphylides C., Montillet J.L. Involvement ofoxidative processes in the signaling mechanisms leading to the activation of glyceollin synthesis in soybean // Plant Physiol. 1994. - V. 10. - P.945-952.

25. Lamb C., Dixon R.A. The oxidative burst in plant disease resistance //

26. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. - V.48. - P.251-275.

27. Zhao J., Hu Q., Guo Y.Q., Zhu W.H. Elicitor-induced indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cell cultures is related to Ca2+-influx and the oxidative burst//Plant Sci. 2001. - V.l 61. - P.423-431.

28. Thoma I., Loeffler c., Sinha A.K., Gupta M., Krischke M., Steffan B. Cyclopentenone isoprostanes induced by reactive oxygen species trigger defense gene activation and phytoalexin accumulation in plants // Plant J. 2000. - V.34. -P.363-375.

29. Lin W., Ни X., Zhang W., Rogers W.J., Cai W. Hydrogen peroxide mediates defence responses induced by chitosans of different molecular weights in rice // J. Plant Physiol. 2005. - V.162. - №8. - P.937-944.

30. Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований // Биохимия. 1998. - Т.63. - №7. - С.867-869.

31. Ванин А.Ф. Оксид азота: регуляция клеточного метаболизма без ^ участия системы клеточных рецепторов // Биофизика. 2001. - Т.46. - №4.1. С.631-641.

32. Hausladen A., Stamler J.S. Nitric oxide in plant immunity // PNAS. -1998. V.95. - P.10345-10347.

33. Delledone M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance //Nature. 1998. - V.394. - №6. - P.585-588.

34. Durner J., Wendehenne D., Klessig D.F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose // PNAS. 1998. -V.95. №17. - P.10328-10333.

35. Ильинская Л.И., Озерецковская О.Л. Продукты липоксигеназного окисления жирных кислот как сигнальные молекулы в индуцированнии устойчивости растений // Прикл. Биохим. Микробиол. 1998. - Т.34. - №5. -С.467-479.

36. Obara N., Hasegawa М., Kodama О. Induced volatiles in elicitor-treated and rice blast fungus-inoculated rice leaves // Biosci. Biotechnol. Biochem. -2002. 66. - №12. - 2549-2559.

37. Дячок Ю.В., Дмитриев А.П., Гродзинский Д.М. Роль Са2+ как вторичного мессенджера в индукции синтеза фитоалексинов и каллозы в культуре клеток Allium сера L. // Физиология растений. 1997. - Т.44. - №3. -С. 385-391.

38. Kendra D.F., Hadwiger L.A. Characterisation of the smallest chitosan oligomer that is maximally antifungal to Fusarium solani and elicits pisatin formation in Pisum sativum II Experimental Mycology. 1984. - V.8. - P.276-281.

39. Khan T.A., Peh K.K., Ch'ng H.S. / Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods // J. Pharm. Pharm. Sci. -2002. V.5. - №3. - P.205-212.

40. Roby D., Gadelle A., Toppan A. Chitin oligosaccharides as elicitors of chitinase activity in melon plants // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. -V.143. - №3. - P.885-892.

41. Ghaouth A.E., Arul J., Grenier J., Benhamou N., Asselin A., Belanger R. Effect of chitosan on cucumber plants: supression of Pythium aphanidermatum and induction of defense reactions // Phytopathology. 1994. - V.84. - №3. -P.313-320.

42. Mauch F., Hadwiger L.A., Boiler T. Antifungal hydrolases in pea tissue // Plant Physiol. 1988. - V.87. - P.325-333.

43. Keen N.T., Yoshikawa М. p-l,3-endoglucanase from soybean releases elicitor-active carbohydrates from fungus cell walls // Plant Physiol. 1983. -V.71. P.460-465.

44. Wan J., Zhang S., Stacey G. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway in Arabidopsis by chitin // Molecular Plant Pathology. 2004. -V.5. - №2. P.125-135.

45. ESTs // Plant Mol. Biol. 2003. - V.52. - №3. -P.537-551.

46. Bhaskara Reddy M.V., Arul J., Angers P., Couture L. Chitosan treatment of wheat seeds induces resistance to Fusarium graminearum and improves seed quality // J. Agric. Food Chem. 1999. - V.47. - №3. - P.1208-1216.

47. Benhamou N., Theriault G. Treatment with chitosan enhances resistance of tomato plants to the crown and root rot pathogen Fusarium oxysporum f. sp.

48. Radicis-lycopersici // Physiol. Mol. Plant Pathol. 1992. - V.41. - P.33-52.

49. US Patent 4964894 «Plant growth regulators derived from chitin».

50. US Patent 5733851 «Formulation and procedure to increase resistance of plants to pathogenic agents and environmental stress».

51. US Patent 5374627 «Methods for protecting vegetables, turfgrass, rice and fruit trees from fungi and bacteria».

52. US Patent 6524998 «Biological compositions and methods for enhancing plant growth and health and producing disease-suppressive plants».

53. Pospieszny H., Atabekov J.G. Effect of chitosan on the hypersensitive reaction of bean to alfalfa mosaic virus // Plant Science. 1989. - V.62. - P.29-31.

54. Pospieszny H., Struszczyk H., Chirkov S.N., Atabekov J.G. New application of chitosan in agriculture // Chitin world / Eds. Karnicki Z.S., Brzaski M.M., Bykovski P.J., Wojtasz-Pajak A. Gdynya: Wirshafitsverlag NW. 1995, P.246-254.

55. Pospieszny H., Struszczyk H., Cajza M. Biological activity of Aspergillus-degraded chitosan // Chitin Enzymology / Ed. R.A.A.Muzzarelli. Atec Edizioni, 1996. V.2. - P. 385-389.

56. Pospieszny H. Inhibition of tobacco mosaic virus (TMV) infection by chitosan // Phytopath. Polonica. 1995. - V.22. - №10. - P.69-74.

57. Pospieszny H., Chirkov S., Atabekov J. Induction of antiviral resistance in plants by chitosan // Plant Science. 1991. V.79. - P.63-68.

58. Surguchova N.A., Varitsev Yu.A., Chirkov S.N. The inhibition of systemic viral infections in potato and tomato plants by chitosan treatment // J. Russ. Phytopathol. Soc. 2000. - V.l. - P.59-62.

59. Chirkov S.N., Surguchova N., Atabekov J.G. Chitosan inhibits systemic infections caused by DNA-containing plant viruses // Arch. Phytopath. Pflanz. -1994.-V.29.-P.21-24.

60. Pospieszny H. Antiviroid activity of chitosan // Crop Protection. 1997. V.16. - №2. - P.105-106.

61. Чирков C.H. Противовирусная активность хитозана // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. - Т.38. - №1. - С.5-13.

62. Чирков C.H., Сургучёва H.A., Атабеков И.Г. Стимуляция синтеза клеточных белков и ингибирование вирусной инфекции хитозаном в изолированных протопластах табака // Доклады Академии Наук. 1995. -Т.341. - №6. - С.836-838.

63. Schiebel W., Haas В., Marinkovic S., Klanner A., Sanger H.L. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. I. Purification and physical properties // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - №16. - P. 11851-11857.

64. Schiebel W., Haas В., Marinkovic S., Klanner A., Sanger H.L. RNA-directed RNA polymerase from tomato leaves. II. Catalytic in vitro properties. // J. Biol. Chem. 1993. - V.268. - №16. - P.l 1858-11867.

65. Schiebel W., Pelissier Т., Riedel L., Thalmeir S., Schiebel R., Kempe D., Lottspeich F., Sanger H.L., Wassenegger M. Isolation of an RNA-directed RNA polymerase-specific cDNA clone from tomato // Plant Cell. 1998. - V.l0. - №12. - P.2087-2101.

66. Xie Z., Fan В., Chen C., Chen Z. An important role of an inducible RNA-dependent RNA polymerase in plant antiviral defense // PNAS. 2001. -V.98. - №11. - P.6516-6521.

67. Sathiyabama M., Balasubramanian R. Chitosan induced resistance components in Arachis hypogaea against leaf rust caused by Puccinia arachidis Speg // Crop Protection. 1998. - V.l7. - №4. - P.307-313.

68. Dalmay Т., Hamilton A., Rudd S., Angell S., Baulcombe D.C. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required forposttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus // 2000.-V.101.-P.543-553.

69. Kuchitsu K., Kikuyama M., Shibuya N. N-acetylchitooligosaccharides, biotic elicitor for phytoalexin production, induce transien membrane depolarization in suspension-cultured rice cells // Protoplasma. 1993. V.174. -P.79-81.

70. Kukiyama M., Kuchitsu K., Shibuya N. Membrane depolarization induced by N-acetylchitooligosaccharide elicitor in suspension-cultured rice cells // Plant Cell Physiol. 1997. - V.38. №8. - P.902-909.

71. Felix G., Baureithel K., Boiler T. Desensitization of the perception system for chitin fragments in tomato cells // Plant Physiol. 1998. - V.117. -№2.- P.643-650.

72. Khan W., Prithiviraj В., Smith D.L. Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanine ammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves // J. Plant Physiol. 2003. - 160. - №8. - P.859-863.

73. Kauss H., Jeblick W., Domard A. The degrees of polymerization and N-acetylation of chitosan determine its ability to elicit callose formation insuspension cells and protoplast of Catharanthus roseus II Planta. 1989. - V.178.- P.385-392.

74. Чирков C.H., Сургучёва H.A., Гамзазаде А.И., Поспешны Г. Сравнительная эффективность производных хитозана при подавлении вирусной инфекции растений // Доклады Академии Наук. 1998. - Т.360. -№2. - С.271-273.

75. Struszczyk М.Н., Pospieszny Н., Schanzenbach D., Peter M.G. Progress on chemistry and application of chitin and its derivatives. // Ed. Struszchyk H. Lodz: Polish Chitin Society. 1998. - V.5. - P.71-77.

76. Hadwiger L.A., Ogawa Т., Kuyama H. Chitosan polymer sizes effective in inducing phytoalexin accumulation and fungal suppression are verified with synthesized oligomers // Mol. Plant Microbe Interact. 1994. - V.7. - №4. P.531-533.

77. Чирков C.H. Противовирусные свойства хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. - С.327-338.

78. Kim H.J., Chen F., Wang X., Rajapakse N.C. Effect of chitosan on the biological properties of sweet basil {Ocimum basilicum L.) // J. Agric. Food Chem. 2005. - V.53. - №9. - P.3696-3701.

79. Тагер A A // Физико-химия полимеров. M.: Химия, 1968. - 536с.

80. Koping-Hoggard М., Mel'nikova Y.S., Varum К.М., Lindman В., Artursson P. Relationship between the physical shape and the efficiency of oligomeric chitosan as a gene delivery system in vitro and in vivo II J. Gene Med.- 2003. V.5. - №2. - P.130-141.

81. Ильина A.B., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом целловиридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т.39. - №3. - С.237-277.

82. Sashiwa Н., Saimoto Н., Shigemasa Y., Ogawa R., Tokura S. Distribution of the acetamide group in partially deacetylated chitins // Carb. Polymers. 1991. - V.l6. - P.291-296.

83. Il'ina A.V., Tatarinova N.Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kurssanovii // Process Biochemistry. 1999. - V.34. - P.875-878.

84. Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research. 1999. - V.320. - P.257-260.

85. Lin H., Wang H., Xue C., Ye M. Preparation of chitosan oligomers by immobilized papain // Enzyme and Microbial Technology. 2002. - V.31. -P.588-592.

86. Ikeda I., Sugano M., Yoshida K., Swaki K., Iwaamoto Y., Hatano K. Effects of chitosan hydrolyzates on lipid absorption and on serum and liver lipid concentration in rats // J. Agric. Food Chem. 1993. - V.41. - № 3. - P.431-435.

87. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. 1991. - V.13. - №5. - P.281-285.

88. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. - 281с.

89. Bell А.А., Hubbard J.C., Davis R.M., Subbarao K.V., Liu L. Effects ofchitin and chitosan on the incidence and severity of fusarium yellows of celery // Plant Dis. 1998. - V.82. - №3. - P.322-328.

90. Воловик A.C., Глёз B.M., Замотаев А.И., Зейрук В.Н., Литун Б.П. // Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. М.: Агропромиздат, 1989.-205с.

91. ГОСТ 11856-66 «Картофель семенной, отбор образцов и методы определения посевных качеств».

92. ГОСТ 7194-69 «Картофель свежий, отбор пробы и методы определения качества».

93. Karasev A.V., Chirkov S.N., Kaftanova A.S., Miroshnichenko N.A., Surgucheva N.A., Fedotina V.L. // Intervirology. 1989. -V.30. - P.285-293.

94. Aiba S. Preparation of N-acetylchitooligosaccharides by hydrolysis of chitosan with chitinase followed by N-acetylation. // Carbohydr. Res. 1994. -V.265. - №2. - P.323-328.

95. Il'ina A.V., Tikhonov V.E., Albulov A.I., Varlamov V.P. Enzymic preparation of acid-free-water-soluble chitosan // Process Biochemistry. 2000. -V.35. P.563-568.

96. Гамзазаде А.И. Структурная неоднородность как фактор изменчивости свойств хитина и хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. - С.112-118.

97. Ding S.W., Li Н., Lu R., Li F., Li W.X. RNA silencing: a conserved antiviral immunity of plants and animals // Virus Res. 2004. - V.102. - №1. -P.109-115.