Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Ткачева, Екатерина Сергеевна

• Ткачева, Екатерина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ткачева, Екатерина Сергеевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Пороформирующие токсины. Классификация

1.2. Актинопорины

1.2.1. Физико-химические характеристики и структура актинопоринов

1.2.2. Механизм действия актинопоринов

1.2.3. Перспективы изучения механизма действия актинопоринов

1.2.4. RGD-мотив актинопоринов

1.3. Связь структуры актинопоринов и функции. Сайт-направленный мутагенез

1.4. Мультигенные семейства актинопоринов

1.5. Актинопорин-подобные белки (АПБ)

1.6. Фармакологические исследования актинопоринов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение актинопоринов из актинии Heteractis crispa

3.2. Клонирование генов актинопоринов

3.3. Филогенетический анализ последовательностей актинопоринов

3.4. Экспрессия, выделение, функциональная активность рекомбинантных актинопоринов

3.5. Сайт-направленный мутагенез

3.6. Структурно-функциональный анализ актинопоринов - представителей семейств Hct-A и Hct-S

3.6.1. Компьютерное моделирование рекомбинантного актинопорина rHct-S3

3.6.2. Выяснение функциональной значимости а. о. рекомбинантных актинопоринов при порообразовании

3.6.3. In silico исследование комплекса актинопорина с лигандом, фософорилхолином

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

АПБ - актинопорин-подобный белок

БЛМ - бислойные липидные мембраны

БСА - Бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецилсульфат натрия

ИПТГ (IPTG) - изопропил-р-Б-тиогалактозид

МД - молекулярная динамика

п,н. - пары оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

ПФТ - пороформирующий токсин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СМ - сфингомиелин

ФХ -фосфатидилхолин

X - холестерин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АР-1 и NF-кВ ядерные факторы - факторы транскрипции

GST - глутатион трансфераза

IOR С5 - раковый антиген толстого кишечника

IOR-T6 - антиген, экспрессируемый на зрелых Т-лимфоцитах

Р1(4,5)Р2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата

РОС-связывающий сайт - фосфорил холиновый сайт связывания актинопорина с мембраной

RGD-мотив - трипептид (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота)

RMSD (root mean square deviation) - среднеквадратичное отклонение

SRP - поверхностный плазмонный резонанс

ТМ-домен - трансмембранный домен

X-Gal - 5 -бром-4-хлориндолил-(3-Д-галактозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa»

ВВЕДЕНИЕ

Актинопорины - белковые цитолизины (20 кДа), продуцируемые ядовитыми морскими кишечнополостными актиниями, принадлежат к группе а-пороформирующих токсинов (а-ПФТ) (Parker and Feil, 2005). Огромный интерес исследователей к этим белкам обусловлен наличием у них уникальной пространственной структуры - высоко консервативного фолда р-сэндвича и N-концевой a-спирали, способных претерпевать конформационные перестройки при переходе белка из водорастворимого в мембраносвязанное состояние, в котором он осуществляет свое пороформирующее действие. С мембранолитическим действием связывают широкий спектр биологической активности актинопоринов: противоопухолевой, кардиостимулирующей, дерматонекротической,

антипаразитарной (Turk, 1991). В последние годы а-ПФТ актиний используют для создания на их основе потенциальных фармакологических агентов - химерных молекул, представляющих собой иммуноконьюгаты актинопоринов (либо их фрагментов, например, N-концевого участка) с лигандами (моноклональными антителами, гормонами или факторами роста) (Tejuca et al., 2009). Действие этих конъюгатов направлено на биологические мишени, мембраны опухолевых и паразитарных клеток. а-ПФТ являются незаменимыми инструментами исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран (Чантурия и др., 1990; Shnyrov et al., 1992; Parker and Feil, 2005). Проявляемые актинопоринами фармакологические эффекты свидетельствуют о том, что эти белки связываются не только с липидными, но и с белковыми компонентами мембран, интегринами, посредством RGD-мотива (трипептида: аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), что может быть использовано для получения противоопухолевых агентов нового поколения.

Повышенный интерес к изучению взаимосвязи структуры и функции актинопоринов связан, в первую очередь, с необходимостью более глубокого понимания механизма действия этих мембраноакгивных белков, играющих важное экологическое значение и алломональную роль в морском биоценозе. Дальнейшего изучения требует также феномен мультигенности актинопоринов, обнаруженный недавно у актинии Heteractis magnifica (Wang et al., 2008). В настоящее время

перспективным и актуальным методом исследования является сайт-направленный мутагенез, который позволяет выяснить ключевую роль аминокислотных остатков актинопоринов в функционально значимых участках молекулы, вовлеченных в различные этапы порообразования (N-концевой а-спирализованный фрагмент, фосфорилхолиновый (РОС)-сайт связывания и RGD-мотив).

Целью данной работы было установление структурно-функциональных взаимосвязей представителей мультигенных семейств пороформирующих токсинов актинии Heteractis crispa. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

(1) выделить и идентифицировать нативные актинопорины;

(2) получить нуклеотидные последовательности и установить на их основе аминокислотные последовательности актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S;

(3) создать генетические конструкции генов актинопоринов для гетерологичной экспрессии в бактериальной системе и получить рекомбинантные белки;

(4) определить физико-химические характеристики рекомбинантных белков и сравнить их с характеристиками нативных актинопоринов;

(5) выполнить сайт-направленный мутагенез функционально значимого участка молекулы актинопорина - RGD-мотива;

(6) провести структурно-функциональный и филогенетический анализ актинопоринов.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Пороформирующие токсины. Классификация

Взаимодействие живых организмов друг с другом и со средой обитания, а также многочисленные процессы функционирования любой клетки организма, включая биосинтез и секрецию белков, функционирование систем гормонального ответа и сигнальной трансдукции, биоэнергетические процессы и ряд других осуществляются посредством преодоления первичного барьера, которым являются клеточные мембраны. Эти сложные структурные образования ответственны также за защитную и коммуникативную функции, нарушение которых приводит к гибели клетки и/или всего организма. В процессе эволюции большинство организмов (включая человека) приобрело способность вырабатывать соединения белковой природы, которые организм-продуцент использует для защиты от внешних врагов и нападения на другие организмы благодаря способности этих соединений изменять проницаемость мембран клеток-мишеней (Parker and Feil, 2005). Наиболее интересными представителями таких соединений являются пороформирующие токсины (ПФТ), продуцируемые, помимо грамположительных бактерий, морскими кишечнополостными, актиниями. Встраиваясь в мембрану клетки-мишени, ПФТ образуют в ней пору, проницаемую для катионов, воды и небольших органических молекул (Андреева-Ковалевская, 2008). Образование трансмембранных пор в клеточных мембранах мишеней является эффективным путем уничтожения этих клеток.

Огромный интерес исследователей к ПФТ обусловлен их уникальной пространственной структурой, позволяющей им существовать как в водорастворимом, так и в мембраносвязанном состоянии, в которое они переходят благодаря конформационным перестройкам, претерпеваемым ими в присутствии цитоплазматических мембран. Способность ПФТ включаться в гидрофобный кор мембраны и формировать в ней поры, меняя тем самым ее проницаемость, дает возможность использовать эти белки в качестве инструментов исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран (Чантурия, 1990; Shnyrov et al., 1992).

В соответствии со структурными элементами, включающимися в мембрану и формирующими пору, ПФТ принято классифицировать как а-ПФТ и ß-ПФТ (Рис. 1)

(Lesieur et al., 1997; Gouaux, 1997). Типичными представителями а-ПФТ являются колицины, бактериальные токсины Escherichia coli (Parker et al., 1989), экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa (Allured et al., 1986), инсектицидные 5-эндотоксины Cry типа грамположителыюй бактерии Bacillus thuringiensis (Li, 1991), дифтерийный токсин из Corynebacterium diphtheriae (Choe et al., 1992), апоптотические белки семейства Bcl-2 (Adams and Cory, 2001) и актинопорины из морских кишечнополостных, актиний (Anderluh and Macek, 2002) (рис. 1).

Рис. 1. Ленточные диаграммы ЗЭ-структур некоторых представителей а-ПФТ: (А) колицин la из Е. coli (Wiener et al., 1997), (Б) экзотоксин А из Р. aeruginosa (Allured et al., 1986), (В) Cry инсектицидный б-эндотоксин из В. thuringiensis (Li, 1991), (Г) дифтерийный токсин из С. diphtheriae (Choe et al., 1992), (Д) эквинатоксин II из Actinia equina (Athanasiadis et al., 2001). Темным цветом выделены сх-спирализованные пороформирующие домены (А - Г) и RGD-мотив эквинатоксина II (Д). Структуры получены с помощью компьютерной программы MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).

Как правило, а-ПФТ содержат 3 домена: рецепторсвязывающий, энзиматический (ферментный) и трансмембранный (ТМ) (рис. 1, А-Г). Поры, формируемые траисмембранным доменом а-ПФТ, содержат несколько а-спирализованных шпилек (десять у колицинов А и N) (Parker and Feil, 2005), за исключением однодоменных актинопоринов, имеющих одну N-коицевую а-спираль (рис. 1, Д). Установлено, что а-спирализованные шпильки отвечают за начальную стадию проникновения токсина в мембрану по, так называемому, «зонтичному механизму» (рис. 2) (Parker and Feil, 2005).

А

Б

Рис. 2. Схема механизма формирования поры а-ПФТ. (А) «зонтичная» модель: включение ТМ домена колицина А в липидный бислой происходит в результате конформанионной перестройки двух a-спиралей (а8 и а9 - обозначенных на рисунке синим цветом). (Б) модель формирования поры актинопорином: N-концевая ос-спираль (показана синим цветом) претерпевает конформационые изменения, включается в липидный бислой и формирует совместно с липидами мембраны тороидальную пору (Anderluh and Lakey, 2008).

Полипептиды, относящиеся к группе р-ПФТ, состоят, как и большинство а-ПФТ, из нескольких доменов, но, в отличие от последних, при включении ТМ домена в мембрану их две а-спирализованные шпильки меняют конформацию и перестраиваются в (3-тяжи, которые затем образуют олигомерные поры р-баррельного типа (рис. 3).

а б

В

о

щ

Домен2

Домен 4

гробогащекная петля

Рис. 3. (А) механизм формирования пор ß-ПФТ (на примере холестерин-зависимого цитолизина). Четыре а-спирали ТМ домена (показаны синим цветом) ß-ПФТ трансформируются в две ß-шпильки которые встраиваются в липидный бислой. Этот процесс происходит после аггрегации молекул токсина, их олигомеризации и формирования состояния «предпоры» в плоскости мембраны и завершается формированием поры (Anderluh and Lakey, 2008). (Б) ленточная диаграмма перфринголизина О (Rossjohn et al., 1997). Черным цветом отмечены ТМ регионы в домене 3, темно-серым обозначен мембран-связывающий домен. Модель получена с помощью программы MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).

ß-ПФ'Г включают аэролизин, который продуцируют три вида грамотрицательных бактерий семейства Aeromonas (Parker et al., 1994), а-гемолизин из Staphylococcus aureus (Song et al., 1996), цитотоксин из Pseudomonas aeruginosa

(Parker and Feil, 2005), защитный антиген сибирской язвы из Bacillus anthracis (Petosa et al., 1997), ряд инсектицидных 6-эндотоксинов из Bacillus thuringiensis (Cyt типа) (Li et al., 1996) и холестерин-зависимые цитолизины, продуцируемые грамположительными бактериями родов Clostridium. Bacillus, Streptococcus, Listeria и Arcanobacterium (Tweten et al., 2001). Характерная для ß-ПФТ высокая стабильность молекулы обеспечивается образованием водородных связей между ß-тяжами. ß-Баррельные поры, формируемые в липидной мембране, стабильны и обладают низкой проводимостью. В отличие от а-пороформирующих токсинов для формирования поры ß-пороформирующими токсинами требуется большее количество мономеров: от 6-8 молекул перфинголизина, стафиллококкового ПФТ до 40 молекул аэролизина и антигена сибирской язвы (Parker and Feil, 2005).

Поры, формируемые амфифильными а-спирализованными N-концевыми фрагментами а-ПФТ, представляют собой очень лабильные тороидальные структуры с внутренней гидрофильной и внешней гидрофобной стороной (Malovrh et al., 2003). Мульти-белковые структуры пор, образуемых в мембране ß-ПФТ, являются чрезвычайно стабильными за счет многочисленных гидрофобных взаимодействий а.о. внешней гидрофобной стороны ТМ доменов с липидным кором мембраны (рис. 4) (Iacovache et al., 2008).

ТЫ домен

Рис. 4. Поры, сформированные в липидной мембране Eqtll (а-ПФТ) (Kristan et al., 2009) и стафилококковым у-гемолизином (ß-ПФТ) (Joubert et al., 2006).

1.2. Актинопорины

Актинопорины - семейство эукариотических а-ПФТ, продуцируемых актиниями (Athanasiadis et al., 2001., Hinds et al., 2002., Mancheno et al., 2003). В отличие от большинства бактериальных трех- и двухдоменных а-ПФТ, актинопорины - небольшие (-20 кДа) однодоменные белки. Установлено, что они совместно с другими токсичными белками и полипептидами, такими как фосфолипазы А2 (40

кДа), нейротоксины (5 кДа), протеиназы (14 кДа), иигибиторы протеиназ (6 кДа) экспрессируются в нематоцистах актиний, специализированных ядовитых органеллах кишечнополостных (Cnidaria), находящихся в щупальцах актинии. Тем не менее, согласно некоторым данным (Meinardi et al., 1995), эти биологически активные белки обнаружены также и в их теле. Предполагают (Basulto et al., 2006), что физиологическая функция актипопоринов - защита от внешних врагов и нападение на жертв, а также участие в процессах пищеварения.

1.2.1. Физико-химические характеристики и структура актипопоринов

К настоящему времени из различных видов актиний выделено и охарактеризовано около трех десятков индивидуальных актипопоринов (Масек, 1992; Wang et al., 2000; Samejima et al., 2000; Jiang et al., 2002; Alegre-Cebollada et al., 2007b; Bellomio et al., 2009; Razpotnik et al., 2009; Monastyrnaya et al., 2010; Uechi et al., 2010; Hu et al., 2011). Полипептидная цепь актинопоринов (молекулярная масса ~20 кДа) содержит (кроме Oulactis актинопоринов) от 175 до 179 а.о. (рис. 5). За исключением кислого актинопорина Srcl из S. rosea (pl 4,7) все известные представители семейства являются основными белками, в аминокислотном составе которых обычно отсутствуют остатки цистеина (Масек, 1992; Anderluh and Масек, 2002; Alegre-Cebollada et al., 2007в). Белки обладают высокой гомологией аминокислотных последовательностей (от 60 до 80%) (рис. 5) и имеют ряд характерных особенностей. Рентгеноструктурным и ЯМР-спектроскопическим анализом эквинатоксина II и стихолизина II установлено (Athanasiadis et al., 2001; Hinds et al., 2002; Mancheño et al., 2003), что N-концевой участок молекулы актинопорина (17-26 а.о. у Eqtll и 14-23 а.о. у Stnll, (рис. 6)) находится в виде a-спирали. Аналогичные N-концевые а-спиральные участки имеют аминокислотные последовательности мелиттина (цитолизин из яда пчелы) (Habermann, 1972) и пептида SV5 (Paramyxovirus) -небольших молекул антимикробных пептидов (26 и 27 а.о. соответственно), проявляющих гемолитическую активность (Belmonte et al., 1993).

1 _ ______100

Eqtll (1) SADVAGAVIDGASLSFDILKTVLEALGNVKRKIAVGVDNESGKTWTALNTYFESGTSDIVLPHKVPHGKALLYNGQKDRGPVATGAVGVLAYLMSDGNTL

EqtIV (1) SVAVAGAIIKGAALTFNVLQTVLKALGDISRKIAVGVDNESGKTWTALNTYFRSGTSDIVLPHKVPHGKALLYNGQKDRGPVATGAVGVLAYAMSDGNTL

EqtV (1) SVAVAGAVIEGATLTFNVLQTVLKALGDISRKIAVGIDNESGMTWTAMNTYFRSGTSDVILPHTVPHGKALLYNGQKDRGPVATGVVGVLAYAMSDGNTL

Ten-C (1) SADVAGAVIDGASLSFDILKTVLEALGNVKRKIAVGVDNESGKTWTALNTYFRSGTSDIVLPHKVPHGKALLYNGQKDRGPVATGAVGVLAYLMSDGNTL

HmglII (1) SAALAGTIIEGASLGFQXLDKVLGELGKVSRKIAVGVDNESGGSWTALNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGRKDTGPVATGAVAAFAYYMSNGHTL

HmT (1) SAALAGTIIAGASLGFQILDKVLGELGKVSRKIAIGVDNESGGSTTALNAYFRSGTGDVILPEFVPNQKALLYSGRKDTGPVATGAVAAFAYYMSNGHTL

RTX-SII (1) SAALAGTITLGASLGFQILDKVLGELGKVSRKIAVGVDNESGGSWTALNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGRKDTGPVATGAVAAFAYYMSNGHTL

RTX-A (1) —ALAGAIXAGASLTFQILDKVLAELGQVSRKIAIGIDNESGGSWTAMNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGRKNRGPDTTGAVGALAYYMSNGNTL

Stnl (1) -SELAGTIIDGASLTFEVLDKVLGELGKVSRKIAVGIDNESGGTWTALNAYFRSGTTDVILPEWPNTKALLYSGRKSSGPVATGAVAAFAYYMSNGNTL

Stnll (1) --ALAGTIIAGASLTFQVLDKVLEELGKVSRKIAVGIDNESGGTWTALNAYFRSGTTDVILPEFVPNTKALLYSGRKDTGPVATGAVAAFAYYMSSGNTL

SrcI (1) -KISGGTVIAAGRLTLDLLKTLLGTLGSISRKIAIGVDNETGGLITGNNVYFRSGTSDDILPHRVETGEALLYTARKTKGPVATGAVGVFTYYLSDGNTL

Avt-1 (1) SAAVAGAVIAGGELALKXLTKILDEIGKIDRKIAIGVDNESGLKWTALNTYYKSGASDVTLPYEVENSKALLYTARKSKGPVARGAVGVLAYKMSSGNTL

PSTX-20A (1) SAAVAGAVIAGGELALKILTKILDEIGKIDRKIAIGVDNESGLKWTALNTYYKSGASDVTLPYEVENSKALLYTARKSKGPVARGAVGVLAYKMSSGNTL

Ucl (1) SVAIAGAVIEGAKLTFGILEKXLTVLGDINRKIAIGVDNESGREWTAQNAYFFSGTSDVVLPASVPNTKAFLYNAQKDRGPVATGVVGVLAYSLSNGNTL

Bp-1 (1) SLAVAGAVIEGGNLVMSVLDRILEAIGDVNRKIAIGVENQSGKSWTAKNTYFRSGTSDVVLPHSVPSGKALLYDGQKTRGPVATGWGVFAYAMSDGNTL

FraC (1) -ADVAGAVIDGAGLGFDVLKTVLEALGNVKRKIAVGIDNESGKTWTAMNTYFRSGTSDIVLPHKVAHGKALLYNGQKNRGPVATGVVGVIAYSMSDGNTL

Or-A (1) -----------— ATFRVLAKVLAELGKVSRKIAVGVDNESGGSWTALNAYFRSGTTDVILPDLVPNQKALLYRGGKDTGPVATGVVGVLAYAMSDGNTL

Or-G (1) -----GAIIAGAALGFNVHQTVLKALGQVSRKIAIGVDNESGGTWTALNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALLYSGQKDTGPVATGAVGVLAYYMSDGNTL

101 _ _ _ 180

Eqtll (101) AVLFSVPYDYNWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYESLYYNLSPE^RGDNGWHTRNLG-YGLKSRGFMNSSGHAILEIHVSKA

EqtIV (101) AVLFSVPYDYNWYSNWWNVRIFKGRRRADQRMYEQLYYYLSPFRGDNGWHERHLG-YGLKSRGFMNSGGQAILEIHVTKA

EqtV (101) AVLFSIPFDYNLYSNWWNVKVYKGHRRADQRMYEELYYNLSPFRGDNGWHNRDLG-YGLKGRGFMNSSGQSILEIHVTKA

Ten-C (101) AVLFSVPYDYNKYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYEELYYNLSPFRGDNGWHTRNLG-YGLKSRGFMNSSGHAILEIHVSKA

HmglII (101) GVMFSVPFDYNFYSNWWDVKVYSGKRRADQGMYEDMYYG-NPYRGDNGWHQKNLG-YGLRMKGIMTSAGEAILQIRISR-

HmT {101) GVMFSVPFDYNFYSNWWDVKVYSGKRRADQGMYEDMYYG-NPYRGDNGWHQKNLG-YGLRMKGIMTSAGEAILQIKISR-

RTX-SII {101) GVMFSVPFDYNLYSNWWDVKIYSGKRRADQAMYEDMYYG-NPYRGDNGWHQKNLG-YGLKMKGIMTSAVEAILEIRISR-

RTX-A (99) GVMFSVPFDYNLYSNWWDVKVYSGKRRADQAMYEDLYYS-NPYRGDNGWHQKNLG-YGLKMKGIMTSAGEAIMEIRISR-

Stnl (100) GVMFSVPFDYNWYSNWWDVKIYPGKRRADQGMYEDMYYG-NPYRGDNGWYQKNLG-YGLRMKGIMTSAGEAKMQIKISR-

Stnll (99) GVMFSVPFDYNWYSNWWDVKIYSGKRRADQGMYEDLYYG-NPYRGDNGWHEKNLG-YGLRMKGIMTSAGEAKMQIKISR-

SrcX (100) AVLFSVPFDYNFYSNWWNVKIYSGKRNADYDMYHELYYDANPFEGDDTWEYRYLG-YGMRMEGYMNSPGEAILKITVMPD

Avt-1 (101) AVMFSVPFDYNLYSNWWNVKXYDGEKKADEKMYNELYNNNNPIKPST-WEKRDLGKDGLKLRGFMTSNGDAKLVIHIEKS

PSTX-20A (101) AVMFSVPFDYNLYTNWWNVKIYDGEKKADEKMYNELYNNNNPIKPSI-WEKRDLGQDGLKLRGFMTSNGDAKLVIHIEKS

Ucl (101) GILFSVPYDYNLYSNWWNIKLYKGIKRADRDMYNDLYYYAHPHKGDNGWHENSLG-FGLKSKGFMTSSGQTILQIRVSRA

Bp-1 (101) AVMFSIPYDYNLYSNWWNVKTYSGMKRADQSMYEDLYYHASPFKGDNGWHSRNLG-YGLKCRGFMNSSGAAKLEIHVSRA

FraC (100) AVLFSVPYDYNWYSNWWNVRVYKGQKRADQRMYEELYYHRSPFRGDNGWHSRGLG-YGLKSRGFMNSSGHAILEIHVTKA

Or-A (88) AILFSVPYDYNLYSNWWNVKVYSGKRRADQGMSEDLSYG-NPYGGDNGWHARKLA-YGLKERGFMKSSAQSILEIHATKA

Or-G (96) GVMFSVPFDYNLYSNWWDVKVYRGRRRADQAMYEGLLYG-IPYGGDNGWHARKLG-YGLKGRGFMKSSAQSILEIHVTKA

Piic. 5. Множественное выравнивание а.к. последовательностей актинопоринов различных видов актиний. Eqtll, EqtIV. EqtV: эквинатоксины из Actinio equina (Swiss-Prot, P61914. Q9YIU9, Q93I09); Ten - тенеброзин из Actinio tenebrosa (Swiss-Prot, P61915); HmglII (Swiss-Prot, Q9U6X1), HmT (Wang et al., 2000; Samejima et al., 2000)-магнификализины из Heteractis magnifica; RTX-A (Swiss-Prot, P58691) и RTX-S11 (Swiss-Prot, P0C1F8) - актинопорины из Heleractis crispa (=Radianthus macrodactylus); Stnl и Stnll - стихолизины из Stichodactylo helianthus (Swiss-Prot, P81662, P07845); Srcl - кислый цитолизин из Sagartia rosea (Swiss-Prot. Q86FQ0); Avtl - актинопорин из Actineria villosa (Swiss-Prot, Q5R231)/ PsTX-20A - актинопорин из Phyllodiscus semoni (Swiss-Prot, Q8IAE2); Ucl - актинопорин из Urticina crassicornis (Swiss-Prot, C9EIC7); Bp-1 - актинопорин из Anthopleura asiatica (Swiss-Prot, C5NSL2); FraC - актинопорин из Aclinia fragacea (Swiss-Prot, B9W5G6). Or-A (Swiss-Prot, Q5I4B8) и Or-G (Swiss-Prot, Q5I2BI) —актинопорины из Oulactis orienthalis. Идентичные а.о. во всех последовательностях показаны на сером фоне.

Во всех известных последовательностях актинопоринов присутствует трипептид, содержащий остатки аргинина, глицина и аспарагиновой кислоты, так называемый ИХЮ-мотив (144-146 а.о. для ЕяШ) (рис. 6). Этот трипептид встречается также в глобулярных белках внеклеточного матрикса и других адгезивных белках. Как правило, он распознается рядом мембранных белков, интегринов, рецепторов клеточной адгезии (Така£к 2004).

Рис. 6.11ространственная модель структуры Eqtll из A. equina (Athanasiadis el al., 2001). (A) ленточная диаграмма ЗЭ-структуры Eqtll (вид боковой стороны молекулы, обрамленной с противоположных сторон а-спиралями, «А и аВ). Черным цветом выделен RGD-мотив (Argl44-Glnl45-Aspl46), серым показаны экспонированные наружу остатки Trpl 12 и Trpl 16, входящие в состав ароматического кластера (расположен на большой петле, соединяющей (36 и [37 стренды, и на спирали аВ), a также Lys77, участвующий в процессе олигомеризации. (Б) вид сверху на структуру (3-сэндвича молекулы Eqtll, состоящую из двух симметричных (3-листов, каждый из которых содержит по шесть [3-стрендов и одну а-спираль. Размеры молекулы указаны возле стрелок.

Характерной особенностью актинопоринов является также наличие высоко консервативного участка, содержащего остатки триптофана и тирозина (последовательность 104-FSVPYDYNWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYEELYY-138) (положение остатков для Eqtll). Следует отметить, что подобный участок аминокислотной последовательности, обогащенный ароматическими остатками (458-ECTGLAWEWWRDV-470), обнаружен в ТМ-домене р-ПФТ перфинголизина О, холестерин-зависимого цитолизина из грамположительной бактерии С. perfringens (Heuck et al., 2000).

Пространственные структуры актинопоринов Eqtll, Stnll и FraC, находящихся в водорастворимом и в связанном с мембраной состоянии, детально изучены (Athanasiadis et al., 2001; Hinds et al., 2002; Mancheno et al., 2003; Mechaly et al., 2011). Установлено, что ЗО-структура актинопорина представляет собой (3-сэндвич, состоящий из 10-12 р-тяжей, фланкированных двумя а-спиралями, которые

А

Б

с

32 А

располагаются с обеих сторон р-кора. Одна из спиралей расположена на И-концевом участке молекулы (рис. 7).

С ( с.

€7 « 174 165 152

й Н11Я i

,, ; 4¡ , 2' |Ч0] .9 18]

Ш1и

I

п

2» 166 161 »46

t

I

t II 1

И из И и®

BIS

14 ЧЧ ы

\=и

J114 1« Ы «

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Ткачева, Екатерина Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. Из актинии Я. crispa выделен в индивидуальном состоянии новый актинопорин Hct-S4, молекулярная масса которого согласно данным MALDI TOFMS составляет 19414±10 Да. Определена аминокислотная последовательность его N-концевого фрагмента (20 аминокислотных остатков).

2. Установлены нуклеотидные последовательности генов и на их основе выведены аминокислотные последовательности 42 актинопоринов, принадлежащих к двум высокогомологичным мультигенным семействам, с N-концевыми остатками аланина (Hct-A семейство) и серина (Hct-S семейство).

3. Проведен филогенетический анализ всех известных аминокислотных последовательностей актинопоринов. Показано, что на филодереве они объединяются в семь кластеров. Актинопорины Н. crispa группируются в четыре кластера. Представители семейств актинопоринов Hct-A и Hct-S не формируют собственных, но входят в состав одних и тех же кластеров. Предполагается, что дивергенция актинопоринов семейства Stichodactylidae произошла до разделения видов на Я. crispa и Я magnifica.

4. Получено семь рекомбинантных форм актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S, отличающихся аминокислотными последовательностями, а также величинами гемолитической активности. Установлено, что рекомбинантный белок rHct-A2 также как и нативный актинопорин RTX-A вызывает дискретные флуктуации тока, характерные для проводящих структур - ионных каналов.

5. Проведен сайт-направленный мутагенез RGD-мотива, получены три мутантные формы актинопоринов в виде телец включения.

6. На основании структурно-функционального анализа определены ключевые для функциональной активности актинопоринов из Я. crispa заряженные аминокислотные остатки в N-концевых фрагментах и ароматические остатки РОС-связывающего сайта.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ткачева, Екатерина Сергеевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Андреева-Ковалевская Ж. И,, Солонин А. С., Синева Е. В., Терновский В. И. Пороформирующие белки и адаптация организмов к условиям окружающей среды // Успехи биол. химии. 2008. Т. 48, С. 267-318.

Ильина А.П., Монастырная М.М., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis oríentalis: выделение и частичная характеристика // Биоорган, химия. 2005. Т. 31, № 1. С. 39-48.

Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus // ДАН СССР. 1984. Т. 277, № 6. С. 1491-1493.

Косинский Ю.А., Пырков Т.В., Луценко С.В., Ефремов Р.Г. Предсказание структуры комплексов белок-лиганд: от компьютерной модели к биологической функции // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2006. Т. L, № 2. 36-44.

Монастырная М.М., Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus П Биоорган, химия. 1999. Т. 25, № 10. С. 733-741.

Руднев В.С., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1, № 10. С. 1019-1024.

Чантурия А.Н., Шатурский О.Я., Лишко В.К., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Взаимодействие токсина морской актинии Radianthus macrodactylus с бислойными фосфолипидными мембранами // Биол. мембраны. 1990. Т. 7, N 7. С. 763-769.

Adams J.M., Согу S. Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family // Trends Biochem. Sci. 2001. Vol. 26, N 1. P. 61-66.

Alegre-Cebollada J, Cunietti M, Herrero-Galán E, Gavilanes J.G., Martínez-del-Pozo A. Calorimetric scrutiny of lipid binding by sticholysin II toxin mutants. // J. Mol. Biol. 2008. Vol. 382, P. 920-930.

Alegre-Cebollada J., Clementi G., Cunietti M., Porres C., Oñaderra M., Gavilanes J.G., and Martínez del Pozo A. Silent mutations at the 5'-end of the cDNA of actinoporins from the sea anemone Stichodactyla helianthus allow their heterologous overproduction in Escherichia coli II J. Biotechnol. 2007a. Vol. 127, P. 211-221.

Alegre-Cebollada J., Lacadena V., Oñaderra M., Mancheño J.M., Gavilanes J.G., Martínez-del-Pozo A. Phenotypic selection and characterization of randomly produced non-haemolytic mutants of the toxic sea anemone protein sticholysin II // FEBS Lett. 2004. Vol. 575, P. 14-18.

Alegre-Cebollada J., Martínez-del-Pozo A., Gavilanes J.G., Goormaghtigh E. Infrared spectroscopy study on the conformational changes leading to pore formation of the toxin sticholysin II // Biophys. J. 20076. Vol. 93. P. 3191-3201.

Alegre-Cebollada J., Oñaderra M., Gavilanes J.G., and Martinez del Pozo A. Sea anemone actinoporins: the transition from a folded soluble state to a functionally active membrane-bound oligomeric pore // Curr. Prot. And Peptide Sci. 2007b. Vol. 8, P. 558-572.

Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa 3.0 Á at resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. Vol. 83, N 5. P. 1310-1324.

Alvarez C., Casallanovo F., Shida C.S., Nogueira L.V., Martínez D., Tejuca M., Pazos I.F., Lanio M.E., Menestrina G., Lissi E., Schreier S. Binding of sea anemone pore-forming toxins sticholysins I and II to interfaces-Modulation of conformation, activity, and lipid-protein interaction // Chem. Phys. Lipids. 2003. Vol. 122. P. 97-105.

Anderluh G., Barlic A., Krizaj I., Menestrina G., Gubensek F., Macek P. Avidin-FITC topological studies with three cysteine mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 242. P. 187-190.

Anderluh G., Barlió A., Podlesek Z., Macek P., Pungercar J., Gubensek F., Zecchini M.L., Serra M.D., Menestrina G. Cysteine-scanning mutagenesis of an eukaryotic pore-forming toxin from sea anemone. Topology in lipid membranes // Eur. J. Biochem. 1999a. Vol. 263. P. 128-136.

Anderluh G., Barlic A., Potrich C., Macek P., Menestrina G. Lysine 77 is a key residue in aggregation of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina // J. Membrane Biol. 2000. Vol. 173. P. 47-55.

Anderluh G., Dalla-Serra M., Viero G., Guella G., Macek P., Menestrina G. Pore formation by equinatoxin II, a eukaryotic protein toxin, occurs by induction of nonlamellar lipid structures // J. Biol. Chem. 2003a. Vol. 278, N 46. P. 45216-45223.

Anderluh G., Gôkçe I., Lakey J.H. Expression of proteins using the third domain of the Escherichia coli periplasmic-protein TolA as a fusion partner // Protein Expression and Purification 28: 173-181.Protein Expr. Purif. 20036. Vol. 28. P. 173-181.

Anderluh G., Krizaj I., Strukelj B., GubenSek F., Macek P., Pungercar J. Equinatoxins, pore-forming proteins from sea anemone Actinia equina, belong to a multigene family // Toxicon. 19996. Vol. 37, N 10. P. 1391-1401.

Anderluh G., Lakey J.H., Disparate proteins use similar architectures to damage membranes // Trends in biochem. Sci. 2008. Vol. 33. P. 482-490.

Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40, N 2. P. 111-124.

Anderluh G., Pungercar J., Krizaj I., Strukelj B., Gubensek F., Macek P. N-terminal truncation mutagenesis of equinatoxin II, a pore-forming polypeptide from the sea anemone Actinia equina II Protein Eng. 1997. Vol. 10, P. 751-755.

Anderluh G., Pungerëar J., Strukelj B., Macek P., Gubensek F. Cloning, sequencing and expression of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996. Vol. 220. P. 437-442.

Anderluh G., Razpotnik A., Podlesek Z., Macek P., Separovic F., Norton R.S. Interaction of the eukaiyotic pore-forming cytolysin equinatoxin II with model membranes: 19F NMR studies II J. Mol. Biol. 2005. Vol. 347, N 12. P. 27-39.

Athanasiadis A., Anderluh G., Macek P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina H Structure. 2001. Vol. 9, N 4. P. 341-346.

Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A carcinoembryogenic antigen-directed immunotoxin built by linking a monoclonal antibody to a hemolytic toxin // Int. J. Cancer. 1989. Vol. 43, N 5. P. 926-929.

Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A new immunotoxin built by linking a hemolytic toxin to a monoclonal antibody specific for immature T lymphocytes // Int. J. Cancer. 1988. Vol. 42. P. 568-571.

Bae H., Kim M., Sicher R., Bae H. J., Bailey B. Necrosis- and ethylene-inducing

peptide from Fusariun oxysporum induces a complex cascade of transcripts associated with signal transduction and cell death in Arabidopsis // Plant Physiol. 2006. Vol. 141. P. 1056-1067.

Bakrac B., Gutierrez-Aguirre I., Podlesek Z., Sonnen A.F.-P., Gilbert R.J.C., Macek P., Lakey J.H., and Anderluh G. Molecular determinants of sphingomyelin specificity of a eukaryotic pore-forming toxin // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, N. 27. P. 18665-18677.

Barlie A., Gutierrez-Aguirre I., Caaveiro J.M.M., Cruz A., Ruiz-Arguello M.B., Perez-Gil J., Gonzalez-Manas J.M. Lipid phase coexistence favours membrane insertion of equinatoxin-II, a poreforming toxin from Actinia equina II J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, N 33. P.34209-34216.

Basulto A., Perez V.M., Noa Y., Varela C., Otero A.J., Pico M.C. Immunohistochemical targeting of sea anemone cytolysins on tentacles, mesenteric filaments and isolated nematocysts of Stichodactyla helianthus // J. Exp, Zool. A Comp. Exp. Biol. 2006. Vol. 305. P. 253-258.

Batista U., Jezernik K. Morphological changes of V-79 cells after equinatoxin II treatment // Cell Biol. Int. Rep. 1992. Vol. 16, N 2. P. 115-123.

Batista U., Jezernik K., Macek P., Sedmak B. Morphological evidence of cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II // Period. Biol. 1987. Vol. 89. P. 347-348.

Batista U., Macek P., Sedmak B. The cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina I I Cell Biol. Int. Rep. 1990. Vol. 14. N 11. P. 1013-1024.

Bellomio A., Morante K., Barlie A., Gutierrez-Aguirre I., Viguera A.R., Gonzalez-Mafias J. M. Purification, cloning and characterization of fragaceatoxin C, a novel actinoporin from the sea anemone Actinia fragacea II Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 869-880.

Belmonte G., Menestrina G., Pederzolli C., Krizaj I., Gubensek F., Turk T., Macek P. Primary and secondary structure of a pore-forming toxin from the sea anemone, Actinia equina L., and its association with lipid vesicles I I Biochim. Biophys. Acta. 1994. Vol. 1192, N2. P. 197-204.

Belmonte G., Pederzolli C., Macek P., Menestrina G. Pore formation by the sea anemone cytolysin equinatoxin II in red blood cells and model lipid membranes // J. Membrane Biol. 1993. Vol. 131. P. 11-22.

Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone

Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P. 467-471.

Bikadi Z., Hazai E. Application of the PM6 semi-empirical method to modeling proteins enhances docking accuracy of AutoDock // Journal of Cheminformatics. 2009. http://www.jcheminf.c0m/c0ntent/l/l/i5.

Birck C., Damian L., Marty-Detraves C., Lougarre A., Schulze-Briese C., Koehl P., Fournier D., Paquereau L. and Samama J. P. A new lectin family with structure similarity to actinoporins revealed by the crystal structure of Xerocomus chrysenteron lectin XCL // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 344. P. 1409-1420.

Blumenthal K.M., Kem W.R. Primary structure of Stoichactis helianthus cytolysin III // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258, N 9. P. 5574-5581.

Bonev B.B., Lam Y.H., Anderluh G., Watts A., Norton R.S., Separovic F. Effects of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II on lipid membranes and the role of sphingomyelin // Biophys. J. 2003. Vol. 84, N 4. P. 2382-2392.

Buck C.A, Horwitz A.F. Integrin, a transmembrane glycoprotein complex mediating cell-substratum adhesion // J. Cell Sci. Suppl. 1987. Vol. 8. P. 231-250.

Bunc M., Drevensek G., Budihna M., Suput D. Effects of equinatoxin II from Actinia equina (L.) on isolated rat heart: The role of direct cardiotoxic effects in equinatoxin II lethality // Toxicon. 1999. Vol. 37. P. 109-123.

Bunc M., Frangez R., Horvat I., Turk T., Suput D. Effects of Equinatoxins in vivo. Possible role of degranulation of thrombocytes and granulocytes // Ann. NY Acad. Sci. 1994. Vol. 710. P. 162-167.

Burke R.D., Murray G., Rise M., Wang D. Integrins on eggs: the beta C subunit is essential for formation of the cortical actin cytoskeleton in sea urchin eggs // Developmental Biology. 2004. Vol. 265, N 1. P. 53-60.

Caaveiro J.M., Echabe I., Gutierrez-Aguierre I., Nieva J.L., Arrondo J.L.R., Gonzales-Manas J. Differential interaction of equinatoxin II with model membranes in response to lipid composition // Biophys. J. 2001. Vol. 80. P. 1343-1353.

Choe S., Bennett M.J., Fujii G., Curmi P.M., Kantardjieff K.A., Collier R.J., Eisenberg D. The crystal structure of diphtheria toxin // Nature. 1992. Vol. 357, N 6375. P. 216-222.

Damian L., Fournier D., Winterhalter M., Paquereau L. Determination of

thermodynamic parameters of Xerocomus chrysenteron lectin interactions with N-acetylgalactosamine and Thomsen-Friedenreich antigen by isothermal calorimetry // BMC Bioehem. 2005. Vol. 6. P. 11.

De los Rios V., Mancheño J.M., Lanio M.E., Oftaderra M., Gavilanes J.G. Mechanism of the leakage induced on lipid model membranes by the hemolytic protein Sticholysin II from the sea anemone Stichodactyla helianthus // Eur. J. Bioehem. 1998. Vol. 252. P. 284-289.

De los Rios V., Mancheño J.M., Martínez del Pozo A., Alfonso C., Rivas G., Ofiaderra M., Gavilanes J.G. Sticholysin II, a cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus, is a monomer-tetramer associating protein // FEBS Lett. 1999. Vol. 455, N 1-2. P. 27-30.

De los Ríos V., Oftaderra M., Martinez-Ruiz A., Lacadena J., Mancheño J.M., Martínez-del-Pozo A., and Gavilanes J.G. Overproduction in Escherichia coli and purification of the haemolytic protein sticholysin II from sea anemone Stichodactyla helianthus H Protein Expr. Purif. 2000. Vol. 18. P. 71-76.

Doyle J.W., Kem W.R., Vilallonga F.A. Interfacial activity of an ion channelgenerating protein cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1989. Vol. 27. P. 465-471.

Drevensek G., Budihna M., Suput D., Bunc M. Nicardipine dose dependently reduces the effect of equinatoxin II on coronary flow in isolated porcine heart // Pflugers. Arch. 2000a. Vol. 440. P. 145-146.

Drevensek G., Bunc M., Budihna M., Suput D. Lowering of the coronary flow in isolated rat heart by equinatoxin II depends upon extracellular Ca2+ concentration // Pflugers. Arch. 20006. Vol. 439. P. 150-151.

Eisenberg D., Schwarz E., Komaromy M. and Wall R. Analysis of membrane and surface protein sequences with the hydrophobic moment plot // J. Mol. Biol. 1984. Vol. 179. P. 125-142.

Fauchere J., and Pliska V. Hydrophobic parameters pi of amino-acid side chains from the partitioning of N-acetyl-amino-acid amides // Eur. J. Med. Chem. 1983. Vol. 8. P. 369375.

Fedorov S., Dyshlovoy S., Monastyrnaya M., Shubina L., Leychenko E., Kozlovskaya E., Jin J.O, Kwak J.Y., Bode A.M., Dong Z., Stonik V. The anticancer effects

of actinoporin RTX-A from the sea anemone Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) I I Toxicon. 2010. Vol. 55. P. 811-817.

Fellbrich G., Romanski A., Varet A., Blume В., Brunner F., Engelhardt S., Felix G., Kemmerling В., Krzymowska M., Nürnberger Т. NPP1, a Phytophthora-associated trigger of plant defence in parsley and Arabidopsis // Plant J. 2002. Vol. 32. P. 375-390.

García-Ortega L., Alegre-Cebollada J., García-Linares S., Bruix M., Martinez-del-Pozo Á.» Gavilanes J.G. The behavior of sea anemone actinoporins at the water-membrane interface // Biochimica et Biophysica Acta 2011. Vol. 1808. P. 2275-2288.

García-Sáez A.J., Buschhorn S.B., Keller H., Anderluh G., Simons K. and Schwille P. Oligomerization and pore formation by Equinatoxin II inhibit endocytosis and lead to plasma membrane reorganization // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. P. 37768-37777.

Gijzen M., Nürnberger Т. Nepl-like proteins from plant pathogens: recruitment and diversification of the NPP1 domain across taxa // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 1800-1807.

Gouaux E. Channel-forming toxins: tales of transformation // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7, N 4. P. 566-573.

Gutiérrez-Aguirre I., Barlic A., Podlesek Z., Macek P., Anderluh G., González-Mañas J.M. Membrane insertion of the N-terminal a-helix of equinotoxin II, a sea anemone cytolytic toxin // Biochem. J. 2004. Vol. 384. P. 421-428.

Gutiérrez-Aguirre I., Trontelj P., Macek P., Lakey J.H., Anderlug G. Membrane binding of zebrafish actinoporin-like protein: AF domains, a novel superfamily of cell membrane binding domains // Biochem J. 2006. Vol. 398. P. 381-392.

Habermann E. Bee and wasp venoms // Science. 1972. Vol. 177. P. 314-322.

Haubner R., Wester H.J., Reuning U., Senekowitsch-Schmidtke R., Diefenbach В., Kessler H., Stocklin G., Schwaiger M. Radiolabeled avp3 integrin antagonists: a new class of tracers for tumor targeting // J. Nucl. Med. 1999. Vol. 40. P. 1061-1071.

Heuck A.P., Hotze E.M., Tweten R.K., Johnson A.E. Mechanism of membrane insertion of a multimeric p-barrel protein: perfringolysin О creates a pore using ordered and coupled conformational changes // Mol. Cell. 2000. Vol. 6, N 5. P. 1233-1242.

Heuck A.P., Tweten R.K., Johnson A.E. P-Barrel pore-forming toxins: intriguing dimorphic proteins // Biochem. 2001. Vol. 40. P. 9065-9073.

Hinds M.G., Zhang W., Anderluh G., Hansen P.E., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: Implications for pore formation. J. Mol. Biol. 2002. Vol. 315. P. 1219-1229.

Hong Q., Gutierrez-Aguirre I., Barlic A., Malovrh P., Kristan K., Podlesek Z., Macek P., Turk D., Conzales-Manas J.M., Lakey J.H. Two-step membrane binding by Equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone, involves an exposed aromatic cluster and a flexible helix // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 41916-41924.

Hristova K., White S.H. Determination of the hydrocarbon core structure of fluid dioleoylphosphocholine (DOPC) bilayers by x-ray diffraction using specific bromination of the double-bonds: effect of hydration // Biophys. J. 1998. Vol. 74. P. 2419-2433.

http://expasy.org/spdbv

http://heliquest.ipmc.cnrs.fr

http://www.chemcomp.com/CorporateInformation/MOE.html

Hu B, Guo W, Wang Lh, Wang Jg, Liu Xy, Jiao Bh. Purification and characterization of gigantoxin-4, a new actinoporin from the sea anemone Stichodactyla Gigantea II Int J Biol Sci. 2011. Vol. 7, N 6. P. 729-739.

Humprey W., Dalke A., Schulten K. VDM: Visual molecular dynamics // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14. P. 33-38.

Iacovache I., Van der Goot G.F., Pernot L. Pore formation: an ancient yet complex from attack // Biochimica et Biophysica Acta. 2008. Vol. 1778. P. 1611-1623.

Il'ina A., Lipkin A., Barsova E., Issaeva M., Leychenko E., Gusev K., Monastyrnaya M., Lukyanov S., Kozlovskaya E. Amino acid sequence of RTX-A's isoform actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2006. Vol. 47, N 5. P. 517520.

Janssen M.L., Oyen W.J., Dijkgraaf I., Massuger L.F., Frielink C., Edwards D.S., Rajopadhye M., Boonstra H., Corstens F.H., Boerman O.C. Tumor targeting with radiolabeled avp3 integrin binding peptides in a nude mouse model // Cancer Research. 2002. Vol. 62. P. 6146-6151.

Jiang X., Chen H., Yang W., Liu Y., Liu W., Wei J., Tu H., Xie X., Wang L., Xu A. Functional expression and characterization of an acidic actinoporin from sea anemone Sagartia rosea II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003a. Vol. 312. P. 562-570.

Jiang X., Peng L., Yang W., Tang X., Liu W., Xu A. Expression and purification of

Src I from sea anemone Sagartia rosea as a recombinant non-fusion protein // Protein Expression and Purification. 20036. Vol. 32. P. 161-166.

Jiang X.Y., Yang W.L., Chen H.P., Tu H.B., Wu W.Y., Wei J.W., Wang J., Liu W.H, Xu A.L. Cloning and characterization of an acidic cytolysin cDNA from sea anemone Sagartia rosea I I Toxicon, 2002. Vol. 40, N 11. P. 1563-1569.

Joubert O., Viero G., Keller D., Martínez E., Colin D.A., Monteil H., Mourey L., Dalla Serra M., Prevost G. Engineered covalent leucotoxin heterodimers from functional pores: insights into S-F interactions // Biochem. J. 2006. Vol. 396. P. 381-389.

Kamoun S.A catalogue of the effector secretóme of plant pathogenic oomycetes // Annu. Rev. Phytopathol. 2006. Vol. 44. P. 41-60.

Khoo H.E., Lim J.P.C., Tan C.H. Effects of sea anemone {Heteractis magnifica and Actinia equina) cytolysins on synaptosomal uptake of GABA and choline // Toxicon. 1995. Vol. 33. P. 1365-1371.

Khoo K.S., Kam W.K., Khoo H.E., Gopalakrishnakone P., Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnifica // Toxicon, 1993. Vol. 31, N 12. P. 1567-1579.

Klyshko E.V., Issaeva M.P., Monastyrnaya M.M., Il'ina A.P., Guzev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actiniporins from the sea anemone Radianthus macrodactilus I I Toxicon. 2004. Vol. 44, N 3. P. 315-324.

Kohno Y., Satoh H., Iguchi A., Nagai H. Characterization of a new hemolytic protein toxin from the sea anemone Anthopleura asiatica 11 Fish Sci. 2009. Vol. 75. P. 1049-1054.

Koradi R., Billeter M., Wüthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14, N 1. P. 51-55.

Kozlov S., Grishin E. The mining of toxin-like polypeptides from EST database by single residue distribution analysis // BMC Genomics. 2011. Vol. 12. N 88.

Kraulis P. MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures // Journal of applied crystallography. 1991. Vol. 24, N 5. P. 946-950.

Kristan K., Podlesek Z., Hojnik V., Gutierrez-Aguirre I., Guncar G„ Turk D., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Macek P., Anderluh G. Pore formation by equinatoxin, an eukaryotic pore-forming toxin, requires a flexible //-terminal region and a stable (3-sandwich // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, N 45. P. 46509-46517.

Kristan K., Viero G., Dalla Serra M., Macek P., Anderluh G. Molecular mechanism of pore formation by actinoporins // Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 1125-1134.

Kristan K., Viero G., Macek P., Dalla Serra M., Anderluh G. The Equinatoxin N-Terminus is transferred across planar bilayers and helps to stabilise the transmembrane pore // FEBS J. 2007. Vol. 274. P. 539-550.

Kumar S., Dudley J., Nei M., Tamura K. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences // Briefings in Bioinformatics. 2008. Vol. 9. P. 299-306.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-682.

Lanio M.E., Morera V., Alvarez C., Tejuca M., Gomez T., Pazos F., Besada V., Martinez D., Huerta V., Padron G., Chavez M. Purifcation and characterization of two hemolysins from Stichodactyla helianthus II Toxicon. 2001. Vol. 39. P. 187-194.

Lee K.H., Hong S.Y., Oh J.E., Kwon M., Yoon J.H., Lee J., Lee B.L., Moon H.M. Identification and characterization of the antimicrobial peptide corresponding to C-terminal beta-sheet domain of tenecin 1, an antibacterial protein of larvae of Tenebrio molitor I I Biochem. J. 1998. Vol. 334. P. 99-105.

Lesieur C., Vecsey-Semjem B., Abrami L., Fivaz M., Gisou van der Goot F. Membrane insertion: The strategies of toxins (Review) // Mol. Membr. Biol. 1997. Vol. 14, N 2. P. 45-64.

Lewis R.J., Garcia M.L, Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10. P. 790-802.

Li J., Koni P.A., Ellar D.J. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus thwingiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation 11 J. Mol. Biol. 1996. Vol. 257, N 1. P. 129-152.

Li J.D. Crystal structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thwingiensis at 2.5 A resolution //Nature. 1991. Vol. 353, N 6347. P. 815-821.

Linder R., Bernheimer A.W., Kim K.S. Interaction between sphingomyelin and a cytolysin from the sea anemone Stoichactis helianthus II Biochim. Biophys. Acta. 1977. Vol. 467, N 3. P. 290-300.

Liu H., Naismith J.H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol // BMC Biotechnol. 2008. V. 8. N. 91.

Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fearr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent I I J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

Macek P. Polipeptide cytolytic toxins from sea anemones (Actinaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. Vol. 5. P. 121-129.

Macek P., Belmonte G., Peterzolli C., Menestrina G. Mechanism of action of equinatoxin II, a cytolysin from the sea anemone Actinia equina L. belonging to the family of actinoporins // Toxicology. 1994. Vol. 87. P. 205-227.

Macek P., Lebez D. Kinetics of hemolysis induced by equinatoxin, a cytolytic toxin from the sea anemone Actinia equina. Effect of some ions and pH I I Toxicon. 1981. Vol. 19, N 2. P. 233-240.

Macek P., Zecchini M., Stanek K., Menestrina G. Effect of membrane-partitioned n-alcohols and fatty acids on pore-forming activity of a sea anemone toxin // Eur. Biophys. J. 1997. Vol. 25, N 3. P. 155-162.

Macek P., Zecehini M., Pederzolli C., Serra M.D., Menestrina G. Intrinsic tryptophan fluorescence of equinatoxin II, a pore-forming polypeptide from the sea anemone Actinia equina L., monitors its interaction with lipid membranes // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 234. P. 329-335.

Malovrh P., Barlic A., Podlesek Z., Macek P., Menestrina G., Anderluh G. Structure-function studies of tryptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. J. 2000. Vol. 346. P. 223-232.

Malovrh P., Viero G., Dalla Serra M., Podlesek Z., Lakey J.H., Macek P., Menestrina G., Anderluh, G. A novel mechanism of pore formation. Membrane penetration by the N-terminal amphapathic region of equinatoxin // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N 25. P. 22678-22685.

Mancheño J.M., Martín-Benito J., Gavilanes F., Vázquez L. A complementary microscopy analysis of Sticholysin II crystals on lipids films; atomic force and transmission electron characterizations // Biophys. Chem. 2006. Vol. 119. P. 219-223.

Mancheño J.M., Martín-Benito J., Martínez-Ripoll M., Gavilanes J. G., Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy structures of sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation. // Structure. 2003. Vol. 11. P. 1319-1328.

Martín-Benito J., Gavilanes F., De los Rios V., Mancheño J.M., Fernández J.J., Gavilanes J.G. Two dimentional crystallization on the lipid mololayers and three-

dimensional structure of sticholysin II, a cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus 11 Biophys. J. 2000. Vol. 78. P. 3186-3194.

Mechaly A.E., Bellomio A., Gil-Cartón D., Morante K., Valle M., González-Mafias J.M., and D.M. Guérin. Structural insights into the oligomerization and architecture of eukaryotic membrane pore-forming toxins // Structure. 2011. Vol. 19. P. 181-191.

Meinardi E., Florin-Christensen M., Paratcha G., Azcurra J.M., Florin-Christensen J. The molecular basis of self/nonself selectivity of a coelenterate toxin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 216, N 1. P. 348-354.

Meunier F.A., Frangez R., Benoit E., Ouanounou G., Rouzaire-Dubois B., Suput D., Molgo J. Ca(2+) and Na(+) contribute to the swelling of differentiated neuroblastoma cells induced by equinatoxin-II // Toxicon. 2000. Vol. 38. P. 1547-1560.

Michaels D.W. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stichodactyla helianthus. I. Formation of transmembrane channels in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555. P. 67-78.

Migues P.V., Leal R.B., Mantovanni M., Nicolau M., Gabilan N.H. Synaptosomal glutamate release induced by the fraction Be-2 from the venom of the sea anemone Bunodosoma caissarum //NeiroReport. 1999. Vol. 10. P. 67-70.

Monastyrnaya M,, Leychenko E., Issaeva M., Likhatskaya G., Zelepuga E., Kostina E., Trifonov E., Nurminski E., Kozlovskaya E. Actinoporins from the sea anemones, tropical Radianthus macrodactylus and northern Oulactis orientalis: comparative analysis of structure-function relationships // Toxicon. 2010. Vol. 56. P. 1299-1314.

Monastyrnaya M.M., Zelepuga E.A., Leuchenko E.V., Likchatskaya G.N., Agafonova I.G., Fedorov S. N., Kozlovskaya E.P. Sea anemone actinoporin interaction with membranes: why and how? // 9th 1ST Asia Pacific meet, on animal, plant and microbial toxins. 201 l.P. 75.

Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.W., Shwets T.W., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 1197-1217.

Muller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phys. Chem. 1963. Vol. 67. P. 534-535.

Nagai H., Oshiro N., Takuwa-Kuroda K., Iwanaga S., Nozaki ML, Nakajima T.A. A new polypeptide toxin from the nematocyst venom of an Okinawan sea anemone Phyllodiscus semoni (Japanese name "unbachi-isoginchaku") // Biosei. Biotechnol. Biochem. 2002. Vol. 66, N 12. P. 2621-2625.

Norton R.S., Bobek G., Ivanov J.O., Thomson M., Beer E.F., Mortiz R.L., Simpson R.J. Purification and characterization of proteins with cardiac stimulatory and hemolytic activity from the sea anemone Actinia tenebrosa // Toxicon. 1990. Vol. 28. P. 29-41.

Ojima I., Chakravarty S., Dong Q. Antithrombotic agents: from RGD to peptide mimetics // Bioorgan. Med. Chem. 1995. Vol. 3, N. 4. P. 337-360.

Olivera B.M., Rivier J.; Clark C., Ramilo C.A., Corpuz G.P., Abogadie F.C., Mena E.E., Woodward S.R., Hillyard D.R., Cruz L.J. Diversity of Conus neuropeptides // Science. 1990. Vol. 249. P. 9257-263.

Olsson M.H.M., S0ndergard C.R., Rostkowski M., Jensen J.H. PROPKA3: Consistent Treatment of Internal and Surface Residues in Empirical pKa predictions // Journal of Chemical Theory and Computation. 2011. Vol. 7, N 2. P. 525-537.

Ottman C., Luberacki B., Küfner I., Koch W., Brunner F., Weyand M., Mattinen L.. Pirhonen M., Anderluh G., Seitz H. U., Nürnberger T., Oecking C. A common toxin fold mediates microbial attack and plant defence // Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2009. Vol. 106, P, 10359-10364,

Parker M.W., Buckley J.T., Postma J.P., Tucker A.D., Leonard K„ Pattus F., Tsernoglou D. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin and the membrane-channel states //Nature. 1994. Vol. 367, N 6460. P. 292-295.

Parker M.W., Feil S.C. Pore-forming protein toxins: from structure to function // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. Vol. 88, N 1. P. 91-142.

Parker M.W., Pattus F., Tucker A.D., Tsernoglou D. Structure of the membrane-pore-forming fragment ofcolicin A // Nature. 1989. Vol. 337, N 6202. P. 93-96.

Pazos F., Valle A., Martinez D., Ramirez A., Calderon L., Pupo A., Tejuca M., Morera V., Campos J., Fando R., Dyszy F., Schreier S., Horjales E.» Alvarez C, Lanio M.E., Lissi E. Structural and functional characterization of a recombinant sticholysin I (rSt I) from the sea anemone Stichodactyla helianthus // Toxicon. 2006. Vol. 48, N 8. P. 1083-1094.

Pazos I.F., Martinez D., Tejuca M., Valle A., del Pozo A., Alvarez C., Lanio M.E., Lissi E.A. Comparison of pore-forming ability in membranes of a native and a recombinant

variant of Sticholysinll from Stichodactyla helianthus // Toxicon, 2003. Vol. 42. P. 571-578.

Pemberton C.L., Salmond G.P.C. The Nepl-like proteins: a growing family of microbial elicitors of plants necrosis // Mol. Plant. Pathol. 2004. Vol. 5. P. 353-359.

Penton D., Perez-Barzaga V., Diaz I., Reytor M.L., Campos J., Fando R., Calvo L., Cilli E.M., Morera V., Castellanos-Serra L.R., Pazos F., Lanio M.E., Alvarez C., Pons T.,Tejuca M. Validation of a mutant of the pore-forming toxin sticholysin-I for the construction of proteinase-activated immunotoxins // PEDS. 2011. Vol. 24. N. 6. P. 485-93.

Peterzolli C., Belmonte G., Dalla Serra M., Macek P., Menestrina G. Biochemical and Cytotoxic Properties of Conjugates of Transferrin with Equinatoxin II, a Cytolysin from a Sea Anemone // Bioconjugate Chem. 1995. Vol. 6. P. 166-173

Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen // Nature. 1997. Vol. 385, N 6619. P. 833-838.

Poklar N., Lah J., Salobir M., Madek P., Vesnaver G. pH and temperature-induced molten globule-like denatured states of equinatoxin II: a study by UV-melting, DSC, far-and near-UV CD spectroscopy, and ANS fluorescence // Biochemistry. 1997. Vol. 36, N 47. P.14345-14352.

Potrich C., Tomazzolli R., Dalla Serra M., Anderluh G., Malovrh P., Ma6ek P., Menestrina G., Tejuca M. Cytotoxic activity of a tumor protease-activated pore-forming toxin // Bioconjug. Chem. 2005. Vol. 6, N 2. P. 369-376.

Ramachandran R., Tweten R.K., Johnson A.E. Membrane-dependent conformational changes initiate cholesterol-dependent cytolysin oligomerization and intersubunit p-strand alignment // Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, N 8. P. 697-705.

Ramos O.H.P., Kauskot A., Cominetti M.R., Bechyne I., Salla Pontes C.L., Chareyre F., Manent J., Vassy R., Giovannini M., Legrand C., Selistre-de-Araujo H.S., Crepin M., Bonnefoy A. A novel avb3-blocking disintegrin containing the RGD motive, DisBa-01, inhibits bFGF-induced angiogenesis and melanoma metastasis // Clin. Exp. Metastasis. 2008. Vol. 25. P. 53-64.

Razpotnik A., Krizaj I., Kem W.R., Ma5ek P., Turk T. A new cytolytic protein from the sea anemone Urticina crassicornis that binds to cholesterol- and sphyngomyelin-rich membranes // Toxicon. 2009. Vol. 53. P. 762-769.

Rossjohn J., Feil S.C., McKinstry W.J., Tweten R.K., Parker M.W. Structure of a

cholesterol-binding, thiolactivated eytolysin and a model of its membrane form // Cell. 1997. Vol. 89, N 5. P. 685-692.

Saier M.H. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane solute transporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. Vol. 64, N 2. P. 354^411.

Saier M.H.J., McCaldon P. Statistical and functional analyses of viral and cellular proteins with N-terminal amphipathic alpha-helices with large hydrophobic moments: importance to macromolecular recognition and organelle targeting // J. Bacterid, 1988. Vol. 170, N 5. P. 2296-2300.

Saitou. N., Nei. M. The Neighbor-joining Method: A New Method for Reconstructing Phylogenetic Trees // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4, N 4. P. 406-425.

Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning: laboratory manual. New York: "Cold Spring Harbor Laboratory Press". 2001. 3rd ed. pp. 131-158.

Samejima Y., Yanagisaws M., Aoki-Tomomutsu Y., Iwasaki E., Ando J., Mebs D. Amino acid sequence studies on cytolytic toxins from sea anemone Heteractis magnified, Entacmaea quadricolor and Stichodactyla mertensii (Anthozoa) // Toxicon. 2000. Vol. 38, N 2. P. 259-264.

Schiffer M., Edmundson A. B. Use of helical wheels to represent the structures of proteins and to identify segments with helical potential // Biophys. J. 1967. Vol. 7, N 2. P. 121-135.

Schwede T., Kopp J., Guex N., Peitsch M. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server // Nucl Acids Res. 2003, Vol. 31. P. 3381-3385.

Seelig J. Thermodynamics of lipid-peptide interactions // Biochim. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1666, N 1-2. P. 40-50.

Shnyrov V.L., Monastyrnaya M.M., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Intern. 1992. Vol. 26, N 2. P. 219-229.

Soletti R.C., Alves T., Vernal J., Terenzi H., Anderluh G., Borges H.L., Gabilan N.H., Moura-Neto V. Inhibition of MAPK/ERK,PKC and CaMKII signaling blocks cytolysin-induced human glioma cell death // Anticancer Res. 2010. Vol. 30. P. 1209-1215.

Soletti R.C., de Faria G.P., Vernal J., Terenzi H., Anderluh G., Borges H. L., Moura-Neto V., Gabilan N. H., Potentiation of anticancer-drug cytotoxicity by sea anemone pore-forming proteins in human glioblastoma cells // Anticancer Drugs. 2008. Vol. 19, P. 517-

Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux, J.E. Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. 1996. Vol. 274, N5294. P. 1859-1866.

Suput D. In vivo effects of cnidarian toxins and venoms // Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 1190-1200.

Suput D,, Frangez R., Bunc M. Cardiovascular effects of equinatoxin III from the sea anemone Actinia equina (L.) // Toxicon. 2001. Vol. 39. P. 1421-1427.

Takagi J. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)-dependent integrins // Biochem. Soc. Transactions. 2004. Vol. 32. P. 403-406.

Tejuca M., Anderluh G., Dalla Seira M. Sea anemone cytolysins as toxic components of immunotoxins // Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 1206-1214.

Tejuca M,, Anderluh G., Macek P., Alvarez C., Lanio M. E., Marcet R., Torres D., Sarracent J., Dalla Serra M., Menestrina G. Antiparasite activity of sea anemone cytolysins on Giardia duodenalis and specific targeting with anti-Giardia antibodies. Int. J. Parasitol. 1999. Vol. 29. P. 489-498.

Tejuca M., Diaz I., Figueredo R., Roque L., Pazos F., Martinez D., Iznaga-Escobar N., Perez R., Alvarez C., Lanio M.E. Construction of an immunotoxin with the pore forming protein StI and ior C5, a monoclonal antibody against a colon cancer cell line // Intern. Immunopharm. 2004. Vol. 4. P. 731-744.

Tejuca M., Serra M.D., Ferraras M., Lanio M.E., Menestrina G. Mechanism of membrane permeabilisation by sticholysin I, a cytolysin isolated from the venom of the sea anemone Stichodactyla helianthus II Biochemistry. 1996. Vol. 35. P. 14937-14957.

Turk T. Cytolytic toxins from sea anemones // J. Toxicol.-Toxin Rev. 1991. Vol. 10 N 3. P. 223-262.

Turk T., Macek P., Gubensek F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1119. P. 1-4.

Tweten R.K., Parker M.W., Johnson A.E. The cholesterol-dependent cytolysins // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer. 2001. P. 114.

Uechi G., Toma H., Arakawa T, Sato Y. Molecular cloning and functional expression of hemolysin from the sea anemone Actineria villosa II Protein Expr. Purif. 2005. Vol. 40.

P.379-384.

Uechi G., Toma H., Arakawa T., Sato Y. Molecular characterization on the genome structure of hemolysin toxin isoforms isolated from sea anemone Actineria villosa and Phyllodiscus semoni II Toxicon. 2010. Vol. 56. P. 1470-1476.

Valcarcel C.A., Dalla Serra M., Potrich C., Bernhart I., Tejuca M., Martinez D., Pazos F., Lanio M.E., Menestrina G. Effects of lipid composition on membrane permeabilization by sticholysin I and II, two cytolysins of the sea anemone Stichodactyla helianthus I I Biophys. J. 2001. Vol. 80, N 6. P. 2761-2774.

Vonk F.J., Jackson K., Doley R., Madaras F., Mirtschin P.J., Vidal N. Snake venom: From fieldwork to the clinic // Bioessays. 2011. Vol. 33. P. 269-279.

Wang Y., Chua K.L., Khoo H.E. A new cytolysin from the sea anemone Heteractis magnified: isolation cDNA cloning and functional expression // Biochem. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1478. P. 9-18.

Wang Y., Yap L.L., Chua K.L., Khoo H.E. A multigene family of Heteractis magnificalysins (HMgs) II Toxicon. 2008, Vol. 51. P. 1374-1382.

White K.L., Passipieri M., Bunch T.D., Campbell K.D., Pate B. Effects of arginine-glycine-aspartic Acid (RGD) containing snake venom peptides on parthenogenetic development and in vitro fertilization of bovine oocytes // Molecular Reproduction and Development. 2007. Vol. 74. P. 88-96.

White S.H., Wimley W.C. Membrane protein folding and stability: Physical Principles // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999. Vol. 28. P. 319-365

Wiener M., Freymann D., Ghosh P., Stroud R.M. Crystal structure of colicin la // Nature. 1997. Vol. 385, N 6615. P. 461^64.

Wimley W.C., White S.H. Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces // Nat. Struct. Biol. 1996. Vol. 3, N 10. P. 842-848.

Zorec R., Tester M., Macek P., Mason W.T. Cytotoxicity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina involves ion channel formation and increase in intracellular calcium activity // J. Membrane Biol. 1990. Vol. 118, N 3. P. 243-249.