Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Певзнер, Ирина Борисовна

• Певзнер, Ирина Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Певзнер, Ирина Борисовна

Список сокращений.

Введение.

Цель и задачи исследования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Определение и классификация РИБ.

1.2. Токсины из растения омела белая (Viscum album L.).

1.3. Строение вискумина.

1.3.1. Строение А-субъединицы вискумина.

1.3.2. Строение В-субъединицы вискумина.

1.3.3. Взаимодействие между субъединицами вискумина.

1.3.4. Димеризация вискумина.

1.4. Ферментативная активность РИБ.

1.5. Исследование структуры каталитического активного центра РИБ с помощью сайт-направленного мутагенеза.

1.6. Биосинтез РИБ в растительных клетках.

1.7. Физиологическая роль РИБ в растениях.

1.8. Транспорт РИБ II в эукариотических клетках.

1.9. Применение РИБ в медицине.

1.9.1. Биологическая активность экстрактов омелы и их компонентов.

1.9.2. Иммунотоксины и вакцины на основе РИБ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы бактерий, плазмиды, ДНК-модифицирующие ферменты и реактивы

2.2. Выделение нативных токсинов и их субъединиц из растения Viscum album L.

2.3. Выделение токсинов и их субъединиц из растения Ricinus communis.

2.4. Выделение геномной ДНК из растения Viscum album L.

2.5. Клонирование гена предшественника лектина омелы.

2.6. Клонирование фрагмента гена, кодирующего А-субъединицу токсического лектина омелы.

2.7. Клонирование фрагмента гена, кодирующего В-субъединицу токсического лектина омелы.

2.8. Анализ последовательностей клонированного гена и его фрагментов.

2.9. Предсказание антигенных детерминант в А- и В-субъединицах MLI и MLIII

2.10. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.11. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.12. Ренатурация рекомбинантных белков.

2.13. Иммуноблоттинг.

2.14. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.15. Бесклеточная система синтеза белка.

2.16. Оценка углевод-связывающей способности рекомбинантных белков.

2.17. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц MLI и MLIII с помощью сайт-направленного мутагенеза.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование гена иЪшлиз последовательности предшественника токсического лектина омелы.

3.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности гена и сигнальных пептидов предшественника токсического лектина омелы.

3.1.2. Анализ аминокислотной последовательности А-субъединицы токсического лектина омелы.

3.1.3. Анализ аминокислотной последовательности В-субъединицы токсического лектина омелы.

3.2. Получение рекомбинантных субъединиц токсического лектина омелы и исследование их активности.

3.2.1. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы.

3.2.2. Предсказание антигенных эпитопов в А-субъедницах MLI и MLIII.

3.2.3. Экспрессия, ренатурация и иммунохимический анализ рекомбинантной В-субъединицы токсического лектина омелы.

3.2.4. Предсказание антигенных эпитопов в В-субъедницах MLI и MLIII.

3.2.5. Исследование каталитической активности рекомбинантных А-субъединиц токсинов омелы MLI и MLIII.

3.2.6. Исследование углевод-связывающей способности рекомбинантной В-субъединицы токсина омелы MLIII.

3.3. Создание мутантных форм рекомбинантных А-субъединиц MLI и MLIII.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рибосом-инактивирующие белки II типа из омелы: клонирование, экспрессия и структурно-функциональные свойства»

Европейская омела (V. album L.) является паразитом хвойных и лиственных деревьев и кустарников и с древних времен широко используется в медицине как лекарственное растение. Из зеленых частей растения выделяют три изоформы токсических лектинов - MLI (вискумин), MLII и MLIII, которые по своему строению принадлежат к семейству рибосом-инактивирующих белков II типа (РИБ II). РИБ II являются гетеродимерными гликопротеинами, состоящими из двух субъединиц с молекулярной массой каждой около 30 кДа, связанных между собой дисульфидной связью. А-Субъединица токсина является высокоспецифичным ферментом N-гликозидазой и выщепляет остаток аденина в положении 4324 28S рРНК 60S-субъединицы эукариотической рибосомы, приводя к остановке синтеза белка в клетке. В-Субъединица является лектином, который связывается с гликозилированными рецепторами на поверхности клетки и вызывает агглютинацию клеток in vitro, а также способствует интернализации ферментативной субъединицы токсина путем эндоцитоза.

MLI, MLII и MLIII различаются между собой по молекулярной массе, а также углеводной специфичности. MLI специфичен по отношению к галактозе, MLIII - к N-ацетилгалактозамину, a MLII имеет одинаковую аффинность к обоим сахарам. Тем не менее, сравнение аминокислотных последовательностей токсических лектинов омелы говорит о высокой степени их гомологии (>90%).

Токсические лектины омелы присутствуют во всех экстрактах омелы и являются основными их составляющими наряду с вискотоксинами и другими веществами небелковой природы. В настоящее время водные экстракты из листьев омелы белой используются в ряде стран Европы, Азии и Америки в качестве иммуномодулирующих и противоопухолевых препаратов в клинической практике. Токсины омелы MLI и MLIII обладают разной биологической активностью в отношении различных клеток млекопитающих. Чувствительность клетки-мишени к цитотоксическому действию лектинов омелы определяется содержанием гликозилированных рецепторов на ее поверхности. Для изолированных токсических лектинов и полных экстрактов омелы показана способность стимулировать выработку цитокинов как in vitro, так и in vivo. Было найдено, что углевод-связывающая В-субъединица MLI стимулирует активность клеток - естественных киллеров (NK-клеток) in vivo, тогда как А-цепь была в тех же условиях полностью неактивна из-за неспособности связывания с углеводсодержащими клеточными рецепторами. Применение экстрактов омелы в качестве дополнительных препаратов при лечении рака существенно снижает побочное действие химиотерапии.

Ранее нами была получена панель моноклональных антител против трех изоформ нативных ML-токсинов (MLI, MLII и MLIII), что позволило иммунохимически детектировать содержание токсинов и их изолированных субъединиц в фармакологических экстрактах омелы, используемых для терапии онкологических заболеваний. Успех терапии может быть связан с процентным содержанием MLI, MLII и MLIII в различных экстрактах. В настоящее время в Германии проходят клинические испытания препарата рекомбинантного MLI. Рекомбинантный гетеродимерный токсин омелы MLIII предлагается для разработки нового антиопухолевого и иммуномодулирующего препарата, а также для исследования терапевтического эффекта его изолированных субъединиц.

Получение рекомбинантных токсических лектинов омелы и исследование их свойств поможет оценить влияние гликозилирования белка на его структуру и функции, приведет к пониманию процессов ренатурации белков и субъединичной гетеродимеризации. Создание трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантные токсические лектины омелы, поможет оценить роль рибосом-инактивирующих белков II типа в жизни растений.

Каталитические субъединицы растительных токсинов применяют для конъюгирования с адресными молекулами (например, специфическими моноклональными антителами) при создании иммунотоксинов - препаратов направленного действия, способных избирательно элиминировать опухолевые клетки. Рекомбинантные токсины используют для создания генно-инженерных иммунотоксинов, которые имеют преимущества перед химически созданными белковыми конъюгатами из-за меньшей молекулярной массы, отсутствия гликозилирования, а также возможности вводить в них сигнальные последовательности, позволяющие изменить внутриклеточный транспорт и увеличить активность иммунотоксинов.

РИБ II используются в качестве удобной модели для исследования транспорта белков в эукариотических клетках. Во время своего продвижения к рибосоме РИБ II оказываются задействованными в различных механизмах транспорта: рецептор-опосредованном эндоцитозе, прохождении через эндосомальные компартменты, ретроградном переносе в аппарат Гольджи и эндоплазматическом ретикулум и, наконец, транслокации активной ферментативной части токсина из внутриклеточного компартмента в цитозоль. Обычно создают конъюгаты токсических лектинов с флуоресцентными метками с помощью химических методов, а на основе рекомбинантных белков можно создавать химерные молекулы при слиянии генов токсинов и цветных флуоресцирующих белков. Введение в состав рекомбинантных токсических лектинов последовательностей сигнальных пептидов позволяет менять транспорт белков и изучать влияние различных сигнальных последовательностей на его направленность.

Однако при использовании РИБ II в подобных прикладных целях необходимо учитывать их высокую цитотоксичность по отношению к эукариотическим клеткам. Чтобы снизить отрицательное воздействие токсинов на клетки-мишени, предлагается использовать их ферментативно неактивные формы, созданные на основе рекомбинантных генов РИБ II путем внесения точечных мутаций в активный центр А-субъединиц. Получение таких форм токсических лектинов дает возможность изучать детальные механизмы транспорта РИБ II в эукариотических клетках без инактивации синтеза белка в них, приводящей к гибели клеток.

Способность токсинов к трансмембранному переходу дает возможность использовать их при создании генно-инженерных вакцин нового поколения как вектор для доставки в цитоплазму антиген-презентирующих клеток различных вирусных пептидов или опухолевых антигенов для стимуляции иммунного ответа организма против вирусов и других внутриклеточных патогенов или раковых клеток. Такие конъюгированные с токсинами пептиды доставляются внутрь эукариотической клетки и презентируются в составе комплекса с молекулой МНС I, что приводит к стимуляции цитотоксических лимфоцитов, направленных против данного патогена.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было клонирование нового гена токсического лектина омелы MLIII и сравнительное исследование структурно-функциональных свойств рекомбинантных токсинов MLI и MLIII.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Клонировать ген токсического лектина омелы MLIII и экспрессировать его А- и В-субъединицы в клетках Escherichia coli. Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей рекомбинантного токсического лектина омелы MLIII и вискумина (MLI).

2. Изучить иммунохимические свойства ренатурированных рекомбинантных А- и В-субъединиц MLI и MLIII с помощью панели моноклональных антител против токсических лектинов омелы MLI, MLII и MLIII.

3. Исследовать ферментативную активность рекомбинантных А-субъединиц MLI и MLIII в бесклеточной системе синтеза белка. Исследовать углевод-связывающую способность рекомбинантной В-субъединицы MLIII в иммуноферментном анализе с модельным рецептором.

4. Получить мутантные формы рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы MLI и MLIII с заменой ключевых аминокислотных остатков в активном центре ферментов, изучить вклад в каталитическую активность токсинов каждого из измененных остатков.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Певзнер, Ирина Борисовна

Выводы

Клонирован новый ген предшественника токсического лектина из Европейской омелы MLIII. Сравнение аминокислотных последовательностей А- и В-субъединиц вискумина (MLI) и MLIII выявило различные аминокислотные остатки в составе углевод-связывающих сайтов белков, определяющие их специфичность к разным сахарам, а также позволило предсказать поверхностные эпитопы для специфических анти-MLI и анти-MLIII моноклональных антител.

Экспрессированные в клетках Escherichia coli и ренатурированные рекомбинантные А- и В-субъединицы, кодируемые новым геном, эффективно взаимодействуют со специфическими анти-MLIII моноклональными антителами.

Рекомбинантные А-субъединицы токсических лектинов омелы MLI и MLIII ингибируют синтез белка в эукариотической бесклеточной системе, что доказывает наличие у них каталитической рибосом-инактивирующей активности. Рекомбинантная В-субъединица MLIII взаимодействуют с гликозилированным модельным рецептором, что говорит о ее углевод-связывающей способности.

Получены мутантные формы рекомбинантных А-субъединиц токсических лектинов омелы MLI и MLIII со сниженной каталитической активностью. Показано, что наиболее важными аминокислотными остатками в активном центре являются Tyr76, Glul65 и Argl68.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Певзнер, Ирина Борисовна, 2004 год

1. Агапов И.И. Рибосом-инактивирующие белки II типа: структура, внутриклеточный транспорт, биологическая активность, использование для синтеза иммунотоксинов. Дисс. Докт. Биол. Наук. Москва, 1997.

2. Попова Е.Н. Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы. Дисс. Канд. Биол. Наук. Москва, 2004.

3. Тоневицкий А.Г., Агапов И.И., Малюченко Н.В., Мойсенович М.М., Ведяков A.M. (2002) значение области межсубъединичного взаимодействия в А-субъединице вискумина для активности токсина. Молекулярная биология, 36 (4), 1-8.

4. Фаттахова Г.В., Агапов И.И., Солопова О.Н., Мойсенович М.М., Тоневицкий А.Г. (2001) Получение моноклональных антител против изоформ растительного токсина вискумина. Биотехнология, 3, 59-70.

5. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Shamshiev A.T., Pohl E., Pohl P., Palmer R.A., Kirpichnikov M.P. (1997) The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding. FEBS Lett., 402,91-93.

6. Agapov II, Tonevitsky AG, Maluchenko NV, Moisenovich MM, Bulah YS and Kirpichnikov MP (1999b) Mistletoe lectin A-chain unfolds during the intracellular transport. FEBS Lett., 464,63.66.

7. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. (1993) Ribosome-inactivating proteins from plants. Biochim. Biophys. Acta, 1154, 237-282.

8. Barbieri L., Lorenzoni E., Stirpe F. (1979) Inhibition of protein synthesis in vitro by a lectin from Momordica charantia and by other haemagglutinins. Biochem. J., 182, 633-635.

9. Barbieri L., Valbonesi P., Bonora E., Gorini P., Bolognesi A., Stirpe F. (1997) Polynucleotide adenosine glycosidase activity of ribosome-inactivating proteins: effect on DNA, RNA and poly(A). Nuc. Acids Res., 25, 518-522.

10. Bass H.W., Webster C., O'Brian G.R., Roberts J.K., Boston R.S. (1992) A maize ribosome-inactivating protein is controlled by the transcriptional activator Opaque-2. Plant Cell. 1992 Feb;4(2):225-34.

11. Bass H.W., Krawetz J.E., O'Brian G.R., Zinselmeier C., Habben J.E., Boston R.S. (2004) Maize ribosome-inactivating proteins (RIPs) with distinct expression patterns have similar requirements for proenzyme activation. J. Exp. Bot., 55,2219-2233.

12. Beuth J., Stoffel В., Ко H.L., Buss G., Tunggal L., Pulverer G. (1995) Immunoactive effects of various mistletoe lectin-1 dosages in mammary carcinoma patients. Arzneimittelforschung / Drug Res., 45, 505-507.

13. Bowman A. (1990) The everlasting mistletoe and the cardiovascular system. Texas Heart Institute Journal, 17,310-314.

14. Bradley J.L., McGuire P.M. (1990) Site-directed mutagenesis of ricin A chain Trp 211 to Phe. Int. J. Pept. Protein Res., 35, 365-366.

15. Braun J.M., Ко H.L., Schierholz J.M., Beuth J. (2003) Standardized mistletoe extract augments immune response and down-regulates local and metastatic tumor growth in murine models. Anticancer Res., 22(6C), 4187-4190.

16. Burger A.M., Mengs U., Schuler J.B., Fiebig H.H. (2001) Anticancer activity of an aqueous mistletoe extract (AME) in syngeneic murine tumor models. Anticancer Res., 21(3B), 19651968.

17. Bussing A., Regnery A., Schweizer K. (1995) Effects of Viscum album L. on cyclophosphamide-treated peripheral blood mononuclear cells in vitro: sister chromatid exchanges and activation/proliferation marker expression. Cancer Lett., 94, 199-205.

18. Bussing A., Schietzel M. (1999) Apoptosis-inducing properties of Viscum album L. extracts from different host trees, correlate with their content of toxic mistletoe lectins. Anticancer Res., 19, 23-28.

19. Bussing A., Suzart K., Bergmann J., Pfuller U., Schietzel M., Schweizer K. (1996) Induction of apoptosis in human lymphocytes treated with Viscum album L. is mediated by the mistletoe lectins. Cancer Lett 99, 59-72.

20. Cazacu M., Oniu Т., Lungoci C., Mihailov A., Cipak A., Klinger R., Weiss Т., Zarkovic N. (2003) The influence of Isorel on the advanced colorectal cancer. Cancer Biother. Radiopharm., 18, 27-34.

21. Chaddock J.A., Monzingo A.F., Robertus J.D., Lord J.M., Roberts L.M. (1996) Major structural differences between pokeweed antiviral protein and ricin A-chain do not account for their differing ribosome specificity. Eur. J. Biochem., 235,159-166.

22. Chan W.Y., Ng T.B. (2001) Comparison of the embryotoxic effects of saporin, agrostin (type 1 ribosome-inactivating proteins) and ricin (a type 2 ribosome-inactivating protein). Pharmacol. Toxicol., 88, 300-303.

23. Chaudhry В., MuIIer-Uri F., Cameron-Mills V., Gough S., Simpson D., Skriver K., Mundy J. (1994) The barley 60 kDa jasmonate-induced protein (JIP60) is a novel ribosome-inactivating protein. Plant J., 6, 815-824.

24. Chen J.K., Hung C.H., Liaw Y.C., Lin J.Y. (1997) Identification of amino acid residues of abrin-a A chain essential for catalysis and reassociation with abrin-a В chain by site-directed mutagenesis. Prot. Eng., 10, 827-833.

25. Current Protocols in Molecular Biology (1991) (Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A. and Struhl K., eds), Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley & Sons.

26. Day P.J., Ernst S.R., Frankel A.E., Monzingo A.F., Pascal J.M., Molina-Svinth M.C., Robertus J.D. (1996) Structure and activity of an active site substitution of ricin A-chain. Biochemistry, 35,11098-11103.

27. Deresiewicz R.L., Calderwood S.B., Robertus J.D., Collier R.J. (1992) Mutations affecting the activity of the Shiga-like toxin I A-chain. Biochemistry, 31, 3272-3280.

28. Doser С., Doser M., Hulsen H., Mechelke F. (1989) Influence of carbohydrates on the cytotoxicity of an aqueous mistletoe drug and of purified mistletoe lectins tested on human T-leukemia cells. Arzneimittelforschung / Drug Res., 39, 647-651.

29. Eck J, Langer M, Mockel B, Baur A, Rothe M, Zinke H and Lentzen H (1999a) Cloning of the mistletoe lectin gene and characterization of the recombinant A-chain. Eur. J. Biochem., 264, 775-784.

30. Eck J., Langer M., Mockel В., Witthohn K., Zinke H., Lentzen H. (1999b) Characterization of recombinant and plant-derived mistletoe lectin and their B-chains. Eur. J. Biochem., 265, 788797.

31. Elsasser-Beile U., Ruhnau Т., Freudenberg N., Wetterauer U., Mengs U. (2001) Antitumoral effect of recombinant mistletoe lectin on chemically induced urinary bladder carcinogenesis in a rat model. Cancer, 91 (5), 998-1004.

32. Emini E., Hughes J.V., Perlow D.S., Boger J. (1985) Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J. Virol., 55, 836-839.

33. Endo Y., Tsurugi K. (1988) The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. The characteristics of the enzymatic activity of ricin A-chain with ribosomes and with rRNA. J. Biol. Chem., 263, 8735-8739.

34. Endo Y., Tsurugi K., Franz H. (1988) The site of action of the A-chain of mistletoe lectin I on eukaryotic ribosimes. The RNA N-glycosydase activity of protein. FEBS Lett., 231, 378-380.

35. Eschenburg S., Krauspenhaar R., Mikhailov A., Stoeva S., Betzel C., Voelter W. (1998) Primary structure and molecular modeling of mistletoe lectin I from Viscum album. Biochem. Biophys. Res. Coramun,, 247, 367-372.

36. Ferrini J.B., Martin M., Taupiac M.P., Beaumelle B. (1995) Expression of functional ricin В chain using the baculovirus system. Eur. J. Biochem., 233, 772-777.

37. Frankel A., Welsh P., Richardson J., Robertus J.D. (1990) Role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A-chain in enzymatic inactivation of ribosomes. Mol. Cell Biol., 10, 62576263.

38. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. (2003) Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. Semin. Oncol., 30, 545-557.

39. Franz H. (1986) Mistletoe lectins and their A and В chains. Oncology, 43 (Suppl 1), 23-34.

40. Franz H. (1989) Viscaceae lectins. In: Advances in lectin research (Franz H., ed.), Berlin, VEB, Verlag volk und Gesundheit, 2, 28-59.

41. Franz H., Ziska P., Kindt A. (1981) Isolation and properties of three lectins from mistletoe (Viscum album L.). Biochem. J., 195, 481-484.

42. Frigerio L., Roberts L.M. (1998) The enemy within: ricin and plant cells. J. Exp. Bot., 49, 14731480.

43. Funatsu G., Islam M.R., Minami Y., Sung-Sil K., Kimura M. (1991) Conserved amino acid residues in ribosome-inactivating proteins from plants. Biochimie, 73, 1157-1161.

44. Gamier J., Osguthorpe D.J., Robson B. (1978) Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. J. Mol. Biol., 120, 97-120.

45. Girbes Т., Ferreras J.M., Arias F.J., Stirpe F. (2004) Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 4,467-482.

46. Gray A.M., Flatt P.R. (1999) Insulin-secreting activity of the traditional antidiabetic plant Viscum album (mistletoe). J. Endocrinol., 160,409-414.

47. Hajto Т., Hostanska K., Fischer J., Sailer R. (1997) Immunomodulatory effects of Viscum album agglutinin-I on natural immunity. Anticancer Drugs, 8, S43-S46.

48. Hajto Т., Hostanska K., Gabius H.J. (1989) Modulatory potency of the beta-galactoside-specificlectin from mistletoe extract (Iscador) on the host defense system in vivo in rabbits and patients. Cancer Res., 49, 4803-4808.

49. Harley S.M. and Beevers H. (1982) Ricin inhibition of in vitro protein synthesis by plant ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5935-5938.

50. Hartley M.R., Lord J.M. (2004) Cytotoxic ribosome-inactivating lectins from plants. Biochim. Biophys. Acta, 1701,1-14.

51. Hatakeyama Т., Yamasaki N., Funatsu G. (1986) Identification of the tryptophan residue located at the low-affinity saccharide binding site of ricin D. J. Biochem. (Tokyo), 100, 781-788.

52. Hazes В., Read R.J. (1997) Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry, 36, 11051-11054.

53. Heiny B.M., Albrecht V., Beuth J. (1998) Correlation of immune cell activities and beta-endorphin release in breast carcinoma patients treated with galactose-specific lectin standardized mistletoe extract. Anticancer Res., 18, 583-586.

54. Hincha D.K., Bakaltcheva I., Schmitt J.M. (1993) Calactose-specific lectins protect isolated thylakoids against freeze-thaw damage. Plant Physiol., 103, 59-65.

55. Hincha D.K., Pfuller U., Schmitt J.M., (1997) The concentration of cryoprotective lectins in mistletoe (Viscum album L.) leaves is correlated with leaf frost hardiness. Planta, 203, 140144.

56. Hopp T.P. and Woods K.R. (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78 (6), 3824-3828.

57. Hovde C.J., Calderwood S.B., Mekalanos J.J., Collier R.J. (1988) Evidence that glutamic acid 167 is an active-site residue of Shiga-like toxin I. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,2568-2572.

58. Hudak K.A., Dinman J.D., Turner N.E. (1999) Pokeweed antiviral protein accesses ribosomes by binding to L3. J. Biol. Chem., 274, 3859-3864.

59. Hung C.H., Lee M.C., Chen J.K., Lin J.Y. (1994) Cloning and expression of three abrin A-chains and their mutants derived by site-specific mutagenesis in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 219, 83-87.

60. Hutt N., Kopferschmitt-Kubler M.C., Cabalion J., Purohit A., Alt M., Pauli G. (2001) Anaphylactic reactions after therapeutic injection of mistletoe (Viscum album L.). Allergol. Immunopathol. (Madr.), 29 (5), 201-203.

61. Jameson B.A., Wolf H. (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput. Appl. Biosci., 4, 181-186.

62. Janssen O., Scheffler A., Kabelitz D. In vitro effects of mistletoe extracts and mistletoe lectins. Cytotoxicity towards tumor cells due to the induction of programmed cell death (apoptosis). Arzneimittelforschung / Drug Res., 43, 1221-1227.

63. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. (1991) Structure of ricin A-chain at 2.5 A. Proteins, 10, 251-259.

64. Kim Y., Mlsna D., Monzingo A.F., Ready M.P., Frankel A., Robertus J.D. (1992) Structure of a ricin mutant showing rescue of activity by a noncatalytic residue. Biochemistry, 31, 32943296.

65. Kim Y., Robertus J.D. (1992) Analysis of several key active site residues of ricin A chain by mutagenesis and X-ray crystallography. Protein Eng., 5, 775-779.

66. Kourmanova A.G., Soudarkina O.J., Olsnes S., Kozlov J.V. (2004) Cloning and characterization of the genes encoding toxic lectins in mistletoe (Viscum album L.). Eur. J. Biochem., 271, 2350-2360.

67. Kovacs E., Hajto Т., Hostanska K. (1991) Improvement of DNA repair in lymphocytes of breast cancer patients treated with Viscum album extract (Iscador). Eur. J. Cancer, 27, 1672-1676.

68. Kumar M.A., Timm D.E., Neet K.E., Owen W.G., Peumans W.J., Rao A.G. (1993) Characterization of the lectin from the bulbs of Eranthis hyemalis (winter aconite) as an inhibitor of protein synthesis. J. Biol. Chem., 268, 25176-25183.

69. Marsden C.J., Fulop V., Day P.J., Lord J.M. (2004) The effect of mutations surrounding and within the active site on the catalytic activity of ricin A chain. Eur. J. Biochem., 271, 153-162.

70. McGaughy J., Everitt B.J., Robbins T.W., Sarter M. (2000) The role of cortical cholinergic afferent projections in cognition, impact of new selective immunotoxins. Behav. Brain. Res., 115,251-263.

71. Mengs U., Gothel D., Leng-Peschlow E. (2002) Mistletoe extracts standardized to mistletoe lectins in oncology, review on current status of preclinical research. Anticancer Res., 22, 1399-1407.

72. Moisenovich M., Tonevitsky A., Agapov I., Niwa H., Schewe H., Bereiter-Hahn J. (2002) Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells. Eur. J. Cell Biol., 81,529-538.

73. Montfort W., Villafranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S.R., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. (1987) The three-dimensional structure of ricin at 2.8 A. J. Biol. Chem., 262, 5398-5403.

74. Monzingo A.F., Collins E.J., Ernst S.R., Irvin J.D., Robertus J.D. (1993) The 2.5 A structure of pokeweed antiviral protein. J. Mol. Biol., 233, 705-715.

75. Monzingo A.F., Robertus J.D. (1992) X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. J. Mol. Biol., 227, 1136-1145.

76. Moon Y.H., Song S.K., Choi K.W., Lee J.S. (1997) Expression of a cDNA encoding Phytolacca insularis antiviral protein confers virus resistance on transgenic potato plants. Mol. Cells, 7, 807-815.

77. Munishkin A., Wool I.G. (1995) Systematic deletion analysis of ricin A-chain function. Single amino acid deletions. J. Biol. Chem., 270, 30581-30587.

78. Niwa H., Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Saward S., Pfuller U., Palmer R.A. (2003) Crystal structure at 3 A of mistletoe lectin I, a dimeric type-II ribosome-inactivating protein, complexed with galactose. Eur. J. Biochem., 270, 2739-2749.

79. Noakes K.L., Teisserenc H.T., Lord J.M., Dunbar P.R., Cerundolo V., Roberts L.M. (1999) Exploiting retrograde transport of Shiga-like toxin 1 for the delivery of exogenous antigens into the MHC class I presentation pathway. FEBS Lett., 453, 95-99.

80. Ochoska J.R., Piotrowski A. (2002) Biologically active compounds from European mistletoe (Viscum album L.). Can. J. Plant Pathol., 24, 21-28.

81. O'Hare M., Roberts L.M., Thorpe P.E., Watson G.J., Prior В., Lord J.M. (1987) Expression of ricin A-chain in Escherichia coli. FEBS Lett., 216, 73-78.

82. Olsnes S., Refsnes K., Pihl A. (1974) Mechanism of action of the toxic lectins abrin and ricin. Nature, 249, 627-631.

83. Olsnes S., Sandvig K. (1988) How protein toxins enter and kill cells. Cancer Treat. Res., 37, 3973.

84. Olsnes S., Sandvig K., Eiklid K., Pihl A. (1978) Properties and action mechanism of the toxic lectin modeccin, interaction with cell lines resistant to modeccin, abrin, and ricin. J. Supramol. Struct., 9, 15-25.

85. Park C.H., Lee D.W., Kang K.H., Yoon T.J., Kim J.B., Do M.S., Song S.K. (2001) cDNA cloning and sequence analysis of the lectin genes of the Korean mistletoe (Viscum album coloratum). Mol. Cells, 12, 215-220.

86. Peumans W.J., Hao. Q., Van Damme E.J.M. (2001) Ribosome-inactivating proteins from plants: more than RNA N-glycosidases? FASEB J., 15,1493-1506.

87. Peumans W.J., Van Damme E.J.M. (1995) Lectins as Plant Defense Proteins. Plant Physiol., 109, 347-352.

88. Piatak M., Lane J. A., Laird W., Bjorn M.J., Wang A., Williams M. (1988) Expression of soluble and fully functional ricin A-chain in Escherichia coli is temperature-sensitive. J. Biol. Chem., 263, 4837-4843.

89. Pilon M., Schekman R., Romisch K. (1997) Sec61p mediates export of a misfolded secretory protein from the endoplasmic reticulum to the cytosol for degradation. EMBO J., 16, 45404548.

90. Pohl P., Antonenko Y.N., Evtodienko V.Y., Pohl E.E., Saparov S.M., Agapov 1.1., Tonevitsky A.G. (1998) Membrane fusion mediated by ricin and viscumin. Biochim. Biophys. Acta, 1371, 11-16.

91. Prestle J., Schonfelder M., Adam G., Mundry K.-W. (1992) Type 1 ribosome-inactivating proteins depurinate plant 25S rRNA without species specificity. Nuc. Acids Res., 20, 3179> 3182.

92. Ramalingam T.S., Das P.K., Podder S.K. (1994) Ricin-membrane interaction, membrane penetration depth by fluorescence quenching and resonance energy transfer. Biochemistry, 33, 12247-12254.

93. Rapak A., Falnes P.O., Olsnes S. (1997) Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 37833788.

94. Reiter Y. (2001) Recombinant immunotoxins in targeted cancer cell therapy. Adv. Cancer Res., 81,93-124.

95. Ribereau-Gayon G., Dumont S., Muller C., Jung M.L., Poindron P., Anton R. (1996) Mistletoe lectins I, II and III induce the production of cytokines by cultured human monocytes. Cancer Lett., 109,33-38.

96. Richardson P.T., Westby M., Roberts L.M., Gould J.H., Colman A., Lord J.M. (1989) Recombinant proricin binds galactose but does not depurinate 28 S ribosomal RNA. FEBS Lett., 255, 15-20.

97. Roberts L., Smith D. (2002) Targeted toxins. Drug delivery with poisons. The Biochemist, 2, 1820.

98. Roberts L.M., Lamb F.I., Pappin D.J., Lord J.M. (1985) The primary sequence of Ricinus v communis agglutinin. Comparison with ricin. J. Biol. Chem., 260, 15682-15686.

99. Roberts L.M., Tregear J.W., Lord J.M. (1988) Cytotoxic proteins in plants. In: Immunotoxins (Frankel A.E., ed.), Kluwer Academic Publishers, Boston-Dordrecht etc., 81-98.

100. Rutenber E., Robertus J.D. (1991) Structure of ricin B-chain at 2.5 A resolution. Proteins, 10, 260-269.

101. Sandvig K., Olsnes S. (1982) Entry of the toxic proteins abrin, modeccin, ricin, and diphtheria toxin into cells. I. Requirement for calcium. J. Biol. Chem., 257, 7495-7503.

102. Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. (1976) Kinetics of binding of the toxic lectins abrin and ricin to » surface receptors of human cells. J. Biol. Chem., 251, 3977-3984.

103. Sandvig K., van Deurs B. (2000) Entry of ricin and Shiga toxin into cells, molecular mechanisms and medical perspectives. EMBO J., 19, 5943-5950.

104. Sandvig K., van Deurs B. (2002) Transport of protein toxins into cells, pathways used by ricin, cholera toxin and Shiga toxin. FEBS Lett., 529, 49-54.

105. Sargiacomo M., Hughes R.C. (1982) Interaction of ricin-sensitive and ricin-resistant cell lines with other carbohydrate-binding toxins. FEBS Lett., 141, 14-18.

106. Schaller G., Urech K., Giannattasio M. (1996) Cytotoxicity of different viscotoxins and extracts k from the European subspecies of Viscum album L. Phytother. Res., 10, 473-477.

107. Schlossman D., Withers D., Welsh P., Alexander A., Robertus J., Frankel A. (1989) Role of glutamic acid 177 of the ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. Mol. Cell Biol., 9, 5012-5021.

108. Schumacher U., Feldhaus S., Mengs U. (2000) Recombinant mistletoe lectin (rML) is successful in treating human ovarian cancer cells transplanted into severe combined immunodeficient (SCID) mice. Cancer Lett., 150 (2), 171-175.

109. Shaw P.C., Wong K.B., Chan D.S., Williams R.L. (2003) Structural basis for the interaction of E160A-E189A.-trichosanthin with adenine. Toxicon, 41, 575-581.

110. Simpson J.C., Roberts L.M., Romisch K., Davey J., Wolf D.H., Lord J.M. (1999) Ricin A-chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS Lett., 459, 80-84.

111. Soler H.M., Stoeva S., Schwamborn C., Wilhelm S., Stiefel Т., Voelter W. (1996) Complete amino acid sequence of the A-chain of mistletoe lectin I. FEBS Lett., 399, 153-157.

112. Sperti S., Montanaro L., Mattioli A., Testoni G. (1975) Relationship between elongation factor I* and elongation factor II- dependent guanosine triphosphatase activities of ribosomes. Inhibition of both activities by ricin. Biochem. J., 148, 447-451.

113. Stauder H., Kreuser E.D. (2002) Mistletoe Extracts Standardised in terms of Mistletoe Lectins (MLI) in Oncology, Current State of Clinical Research. Onkologie, 25, 374-380.

114. Stein G.M., Pfuller U., Berg P.A. (1999) Recognition of different antigens of mistletoe extracts by anti- mistletoe lectin antibodies. Cancer Lett., 135, 165-170.

115. Stirpe F. (2004) Ribosome-inactivating proteins. Toxicon, 44, 371-383.

116. Stirpe F., Barbieri L., Abbondanza A., Falasca A.I., Brown A.N., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. (1985) Properties of volkensin, a toxic lectin from Adenia volkensii. J. Biol. Chem., 260, 14589-14595.

117. Stirpe F., Barbieri L., Battelli M.G., SoriaM., Lappi D.A. (1992) Ribosome-inactivating proteins from plants, present status and future prospects. Biotechnology (NY), 10,405-412.

118. Stirpe F., Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. (1982) Action of viscumin, a toxic lectin from mistletoe, on cells in culture. J. Biol. Chem., 257,13271-13277.

119. Sweeney E.C., Palmer R.A., Pfuller U. (1993) Crystallization of the ribosome inactivating protein MLI from Viscum album (mistletoe) complexed with beta-D-galactose. J. Mol. Biol., 234, 1279-1281.

120. Sweeney E.C., Tonevitsky A.G., Palmer R.A., Niwa H., Pfueller U., Eck J., Lentzen H., Agapovr11., Kirpichnikov M.P. (1998) Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. FEBS Lett., v 431,367-370.

121. Tahirov Т.Н., Lu Т.Н., Liaw Y.C., Chen Y.L., Lin J.Y. (1995) Crystal structure of abrin-a at 2.14 A. J. Mol. Biol., 250, 354-367.

122. Taylor В.E., Irvin J.D. (1990) Depurination of plant ribosomes by poke weed antiviral protein. FEBS Lett., 273, 144-146.

123. Thepen Т., van Vuuren A.J., Kiekens R.C., Damen C.A., Vooijs W.C., van De Winkel J.G. (2000) Resolution of cutaneous inflammation after local elimination of macrophages. Nat. Biotechnol., 18, 48-51.

124. Tonevitsky A, Agapov I, Chelnokova O, Moisenovich M and Marx U (2002) Comparison between the mechanisms of action of plant toxins ricin and viscumin on the stage of intracellular dissociation. Arzneimittelforschung / Drug Res., 52, 500-505.

125. Tonevitsky A.G., Agapov I.I., Shamshiev A.T., Temyakov D.E., Pohl P., Kirpichnikov M.P. (1996) Imimmotoxins containing A-chain of mistletoe lectin I are more active than immunotoxins with ricin A-chain, FEBS Lett., 392 (2), 166-168.

126. Tregear J.W., Roberts L.M. (1992) The lectin gene family of Ricinus communis, cloning of a functional ricin gene and three lectin pseudogenes. Plant Mol. Biol., 18, 515-525.

127. Turner N.E., Hwang D.J., Bonness M. (1997) C-terminal deletion mutant of poke weed antiviral protein inhibits viral infection but does not depurinate host ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3866-3871.

128. Valentiner U., Pfuller U., Baum C., Schumacher U. (2002) The cytotoxic effect of mistletoe lectins I, II and III on sensitive and multidrug resistant human colon cancer cell lines in vitro. Toxicology, 171, 187-199.

129. Van Damme E.J., Roy S., Barre A., Rouge P., Van Leuven F., Peumans W.J. (1997) The major f elderberry (Sambucus nigra) fruit protein is a lectin derived from a truncated type 2 ribosomeinactivating protein. Plant J., 12, 1251-1260.

130. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W., Olsnes S., Simons K., Griffiths G. (1988) Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell. Biol., 106, 253-267.

131. Analysis of the in planta antiviral activity of elderberry ribosome-inactivating proteins. Eur. J. 4 Biochem., 271, 1508-1515.

132. Vater C.A., Bartle L.M., Leszyk J.D., Lambert J.M., Goldmacher V.S. (1995) Ricin A-chain can be chemically cross-linked to the mammalian ribosomal proteins L9 and LlOe. J. Biol. Chem., 270, 12933-12940.

133. Villafranca J.E., Robertus J.D. (1981) Ricin B-chain is a product of gene duplication. J. Biol. Chem., 256, 554-556.

134. Wacker R., Stoeva S., Pfueller K., Pfueller U., Voelter W. (2004) Complete determination of the A-chain of mistletoe lectin III from Viscum album L. ssp. album. J. Peptide Sci., 10, 138-148.

135. Wang P., Zoubenko O., Turner N.E. (1998) Reduced toxicity and broad spectrum resistance torviral and fungal infection in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein II. Plant, i Mol. Biol., 38, 957-964.

136. Wright H.T., Robertus J.D. (1987) The intersubunit disulfide bridge of ricin is essential for cytotoxicity. Arch. Biochem. Biophys., 256, 280-284.

137. Wu A.M., Chin L.K., Franz H., Pfueller U., Herp A. (1992) Carbohydrate specificity of the receptor sites of mistletoe toxic lectin-I. Biochim. Biophys. Acta, 1117, 232-234.

138. Wu A.M., Wu J.H., Herp A., Chow L.P., Lin J.Y. (2001) Carbohydrate specificity of a toxic lectin, abrin A, from the seeds of Abrus precatorius (jequirity bean). Life Sci., 69(17), 20272038.

139. Xiong J.P., Xia Z.X., Wang Y. (1994) Crystal structure of trichosanthin-NADPH complex at 1.7

140. A resolution reveals active-site architecture. Nat. Struct. Biol., 1, 695-700.

141. Yamasaki C., Nishikawa K., Zeng X.T., Katayama Y., Natori Y., Komatsu N., Oda Т., Natori Y. (2004) Induction of cytokines by toxins that have an identical RNA N-glycosidase activity: Shiga toxin, ricin, andmodeccin. Biochim. Biophys. Acta, 1671, 44-50.

142. Yamasaki S., Furutani M., Ito K., Igarashi K., Nishibuchi M., Takeda Y. (1991) Importance of arginine at position 170 of the A-subunit of Vero toxin 1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxin activity. Microb. Pathog., 11, 1-9.

143. Zarkovic N., Vukovic Т., Loncaric I., Miletic M., Zarkovic K., Borovic S., Cipak A., Sabolovicf S., Konitzer M., Mang S. (2001) An overview on anticancer activities of the Viscum albumextract Isorel. Cancer Biother. Radiopharm., 16(1), 55-62.

144. Zimmermann R., Pfueller U. (1998) Glycosylation pattern of mistletoe lectins. In: COST 98

145. Effect of antinutrients on the nutritional value of legume diets" (Bardocz S., Pfueller U. and Pustzai A., eds), European communities, Brussels, 5, 55-62.

146. Ziska P., Franz H. (1981) Studies on the interaction of the mistletoe lectin I with carbohydrates. Experienta, 37, 219.

147. Zoubenko O., Hudak K., Turner N.E. (2000) A non-toxic pokeweed antiviral protein mutant inhibits pathogen infection via a novel salicylic acid-independent pathway. Plant Mol. Biol., 44, 219-229.

148. Zoubenko O., Uckun F., Hur Y., Chet I., Turner N. (1997) Plant resistance to fungal infection induced by nontoxic pokeweed antiviral protein mutants. Nat. Biotechnol., 15,992-996.r1. Благодарности

149. Автор признателен сотрудникам ФГУП «ГосНИИгенетика» к.б.н. Лобанову Андрею Олеговичу и к.б.н. Сидоруку Константину Васильевичу за дельные советы в вопросах амплификации ПЦР-фрагментов ДНК и молекулярного клонирования.