Ферменты липоксигеназного каскада: структурная характеристика, каталитические свойства, молекулярная эволюция тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, доктор биологических наук Гоголев, Юрий Викторович

• Гоголев, Юрий Викторович
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Гоголев, Юрий Викторович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Оксилипины как биологически активные соединения.

1.2. Метаболизм оксилипинов.

1.3. Общая характеристика липоксигеназ.

1.4. Специфичность действия липоксигеназ.

1.5. Модели специфичности действия липоксигеназ.

1.6. Третичная структура липоксигеназ.

1.7. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3).

1.8. Общая характеристика ферментов Р450.

1.9. Общая характеристика ферментов семейства CYP74.

1.10. Структурная организация ферментов семейства CYP74.

1.11. Алленоксидсинтазы.

1.12. Гидропероксидлиазы.

1.13. Дивинилэфирсинтазы.

1.14. Эпоксиалкогольсинтазы.

1.15. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP и монооксигеназ Р450.

1.16. Локализация ферментов CYP74.

1.17. Регуляция экспрессии генов ферментов липоксигеназного каскада.

1.18. Молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада.

1.18.1. Общие представления о молекулярной эволюции.

1.18.2. Классификация и молекулярная филогения липоксигеназ.

1.18.3. Классификация цитохромов семейства CYP74.

1.18.4. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений.

1.18.5. Молекулярная филогения ферментов CYP74.

1.19. Постановка цели исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методы биоинформатики.

2.2. Подготовка растительного материала.

2.3. Выделение тотальной РНК из листьев растений.

2.4. Реакция обратной транскрипции и получение двуцепочечной кДНК.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле.

2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.8. Молекулярное клонирование ДНК.

2.8.1. Характеристика бактериальных штаммов.

2.8.2. Среды для культивирования бактерий.

2.8.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.8.4. Перенос плазмид в компетентные клетки Е. coli.

2.8.5. Клонирование ПЦР-фрагментов.

2.8.6. Клонирование полноразмерных кДНК.

2.8.7. Клонирование целевых генов в экспрессирующие векторы.

2.9. Сайт-направленный мутагенез клонированных генов.

2.10. Наработка и очистка рекомбинантных белков.

2.10.1. Выращивание культур продуцентов и индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.10.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

2.10.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.11. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов.

2.12. Получение препаратов из растительного материала и подготовка субстратов.

2.12.1. Получение препаратов ацетонового порошка семян.

2.12.2. Получение препаратов свободных жирных кислот.

2.12.3. Получение препаратов гидроперекисей жирных кислот.

2.13. Кинетические исследования реакций липоксигеназного каскада.

2.14. Анализ продуктов реакций липоксигеназного каскада методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.14.1. Хроматография на обращенной фазе.

2.14.2. Хроматография на нормальной фазе.

2.15. Спектральные исследования.

2.15.1. Подготовка образцов для ГХ-МС.

2.15.2. Проведение экспериментов по ГХ-МС.

2.15.3. Получение спектров оптического поглощения.

2.15.4. Получение ЯМР-спектров.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение рекомбинантного фермента 2тЬОХЗ.

3.1.1. Экспрессия 2тЬОХЗ в бактериальном продуценте.

3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента 2тЬОХЗ.

3.2. Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии гтЬОХЗ и ОтЬОХ1.

3.3. Участие (78)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути.

3.4. Направленная модификация первичной структуры 2тЬОХЗ.

3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOXЗ.

3.4.2. Окисление линолевой кислоты мутантными формами гтЬОХЗ.

3.4.3. Окисление сложных липидов 2т1Х)ХЗ и ZmLOXЗAla562Gly.

3.5. Моделирование механизма ферментативного действия 2тЬОХЗ.

3.5.1. Трехмерная модель 2тЬОХЗ.

3.5.2. Модели позиционирования субстратов в активном центре липоксигеназ.

3.6. Клонирование гена алленоксидсинтазы томата LeAOS3.

3.7. Получение очищенного рекомбинантного фермента LeAOS3.

3.8. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3.

3.9. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

3.10. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона.

3.11. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты при участии

Le АО S3.

3.12. Характеристика специфичности действия LeAOS3 (CYP74C) и алленоксидсинтазы кукурузы ZmAOS (CYP74A).

3.13. Превращение окиси аллена LeAOS3 in situ.

3.14. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой LeAOS3.

3.15. Исследование доменов LeAOS3 и гидроперксидлиазы люцерны MtHPL методом сайт-направленного мутагенеза.

3.15.1. Определение домена IHCD в первичной структуре ферментов CYP74.

3.15.2. Выбор позиций и аминокислотных замен в полипептидной цепи LeAOS3.

3.15.3. Анализ продуктов катализа мутантных форм LeAOS3.

3.15.4. Выбор сайтов и аминокислотных замен в полипептидной цепи MtHPL.

3.15.5. Сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL.

3.16. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца.

3.17. Выявление и клонирование кДНК CYP74B16.

3.18. Получение препарата рекомбинантного белка CYP74B16.

3.19. Идентификация фермента CYP74B16.

3.20. Исследование кинетических параметров реакций, катализируемых ЬиБЕБ.

3.21. Сравнение 1дЮЕ8 с другими членами подсемейства СУР74В.

3.22. Направленная модификация первичной структуры ЬиОЕБ.

3.23. Каталитические свойства ЬиБЕ8 Е292С.

3.24. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада.

3.24.1. Филогенетический анализ липоксигеназ.

3.24.2. Филогенетический анализ цитохромов СУР74.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ферменты липоксигеназного каскада: структурная характеристика, каталитические свойства, молекулярная эволюция»

Постановка проблемы и ее актуальность.

Липоксигеназный каскад является источником физиологически активных соединений - оксилипинов. У высших растений оксилипины отвечают за регуляцию роста, дифференциацию клеток, морфогенез, а также участвуют в индукции органогенеза и формировании системной устойчивости к различным экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2001, ПоЬ е? а1., 2002; БШшре, РешБпег, 2006]. Кроме высших растений оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у некоторых бактерий, бурых водорослей, красных водорослей, а также у представителей кораллов, хордовых и пластинчатых (ТпсИор1ах асИгаегет) [Ьее е/ а1, 2008].

Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада, обеспечивающими разнообразие продуктов, являются липоксигеназы и ферменты уникального семейства СУР74 суперсемейства Р450. Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстратов Сго-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений в основном катализируют превращение С^-жирных кислот (линолевой и а-линоленовой кислоты). У многих видов растений, животных и микроорганизмов определены нуклеотидные последовательности генов липоксигеназ. Однако лишь некоторые из них клонированы с целью исследования функциональных белковых продуктов. Продукты первичной липоксигеназной реакции - гидроперекиси жирных кислот - преобразуются ферментами СУР74: алленоксидсинтазами (АОС), гидропероксидлиазами (ГПЛ), дивинилэфирсинтазами (ДЭС). Исследования последних лет показали, что большинство ферментов СУР74 являются дегидразами (АОС и ДЭС) и изомеразами (ГПЛ). В то же время, большое разнообразие неизученных генов СУР74 в геномах различных организмов свидетельствует о вероятности существования других типов катализа. К настоящему времени охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, в то время как клонировано лишь 5 генов ДЭС разных видов растений, принадлежащих двум родам. Существует мнение, что ферменты этого класса не имеют широкого распространения в природе. Тем не менее, круг организмов, обладающих дивиниловыми эфирами, неуклонно расширяется.

Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в современном агропромышленном производстве. Оксилипины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В настоящее время некоторые рекомбинантные ферменты липоксигеназного каскада нашли свое применение в биотехнологии для производства компонентов в парфимерной и пищевой промышленности. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа ферментов липоксигеназного каскада, исследование молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.

Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабораториях мира, позволил во многом выяснить критические параметры первичной и третичной структур активных центров ферментов. Существенно расширено представление о механизмах ферментативного катализа. Опираясь на данные рентгеноструктурного анализа, изучения молекулярной структуры и динамики белковых молекул и фермент-субстратных комплексов, во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и ферментов СУР74 остается недостаточно охарактеризованным.

В зависимости от региоизомеров продуктов реакции липоксигеназы растений разделяются на (95)- и (13£)-специфичные. Предложенные модели взаимодействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в частности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недостаточным. Неисследованным остается вопрос об участии в липоксигеназном каскаде растений других ненасыщенных жирных кислот, кроме линолевой и а-линоленовой, в том числе жирных кислот гексадеканового ряда, составляющих до 20 % от общего количества липидов в 16:3 растениях [Тагшевоп, Яе1(1 1971; Моп§гапё е? а1., 2005].

Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ предусматривает их первичное возникновение по отношению к цитохромам. Однако отсутствие какой-либо функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в существовавший ранее метаболический процесс с другим источником данного субстрата, в том числе неферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Филогения и систематика ферментов СУР74 остается на стадии разработки. Использование стандартных алгоритмов классификации для данного семейства приводит к объединению в систематические группы функционально не связанных ферментов. С другой стороны, некоторые ферменты - типичные представители СУР74 по биохимическим характеристикам - не удовлетворяют молекулярным критериям принадлежности к семейству, в связи с чем предложено включить эти ферменты в одноименный «клан». При этом данный клан рассматривается как продукт поздней эволюции растений, появление которого было связано с выходом растений на сушу. Однако недавние открытия липоксигеназного каскада у широкого круга организмов, включающего животных, бурых водорослей и прокариот, свидетельствуют о древнем происхождении этого ферментативного пути и его фундаментальном физиологическом значении на ранних этапах развития жизни.

Обнаруживаемые противоречия могут быть следствием малой изученности ферментов СУР74. Так, у классического объекта - льна-долгунца (Ыпит тиайььтит Ь.), с которого началось изучение ферментов данного семейства, недавно были выявлены новые оксилипины - необычные изомеры дивиниловых эфиров и их производные - линолипины. Было показано, что инкубация линолевой и а-линоленовой кислот, либо их 13-гидроперекисей, с экстрактом листьев льна приводит к образованию (9Д, 11 102)-12-( 10-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой, либо (92,1 \Е, 102, 302)-12-( 10,30-гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой кислот, соответственно, в качестве основных продуктов [СЬесЬе1кт а!., 2008]. Однако попытки выделения из корней и побегов этого растения фермента, ответственного за синтез дивиниловых эфиров, оказывались безрезультатными. На повестке дня стоит вопрос о поиске гена кодирующего данный фермент и получение последнего в виде рекомбинантного белка.

Выяснение эволюционных процессов, обусловливающих возникновение сложных реакционных комплексов, является одним из фундаментальных вопросов эволюции живых систем. С точки зрения молекулярной филогении ферменты липоксигеназного каскада представляют удобную модель, которая позволяет проследить коэволюцию двух типов ферментов, осуществляющих цепь сопряженных реакций. Детерминированность липоксигеназного каскада в относительно небольшом количестве направлений биосинтеза оксилипинов при одновременной пластичности ферментов, способных к конверсии при минорных модификациях первичной структуры, дает возможность экспериментальной реконструкции эволюционных процессов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является выяснение механизмов каталитического действия ферментов липоксигеназного каскада и построение филогенетической модели, описывающей эволюционное развитие этих механизмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Структурно-функциональная характеристика рекомбинантной липоксигеназы ZmLOX3 кукурузы {Zea mays).

2. Получение мутантных форм ZmLOX3; сравнение реакций превращения линолевой кислоты и других субстратов при участии фермента дикого типа и его мутантных форм.

3. Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и липоксигеназы GmLOXl сои (Glycine max) с субстратами на основании экспериментальных данных и компьютерного моделирования.

4. Выявление особенностей механизма каталитического действия рекомбинантной алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата {Lycopersicon esculentum) в сравнении с алленоксидсинтазами подсемейства CYP74A.

5. Выявление, характеристика и клонирование открытой рамки считывания гена, кодирующего фермент, ответственный за биосинтез (а>5 Z)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.); получение рекомбинантного фермента, его структурно-функциональная характеристика.

6. Получение мутантных форм LeAOS3 и фермента, ответственного за биосинтез (со52)-этероленовой кислоты у льна-долгунца (Linum usitatissimum L.), с модификациями каталитически важных доменов. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

7. Получение мутантных форм классического представителя подсемейства CYP74C - гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula); сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

8. Проведение эволюционного анализа генетической информации, накопленной в отношении ферментов липоксигеназного каскада.

9. Построение филогенетических моделей, отражающих молекулярную эволюцию ферментов липоксигеназного каскада высших растений и их таксономическое положение.

Научная новизна работы

На основании результатов компьютерного моделирования и экспериментальных данных определены факторы, влияющие на специфичность окисления субстратов при участии (95}- и (135)-липоксигеназ растений ^тЬОХЗ и ОтЬОХ1, соответственно). Показано, что позиционирование субстратов в активном центре ОтЬОХ1 и гтЬОХЗ различается, однако в обоих случаях субстрат погружается в активный центр метальной концевой группой; инверсии субстрата под действием внешних факторов не происходит. Специфичность действия 2шЬОХЗ не определяется ориентацией субстрата в активном центре, а детерминируется объемом активного центра, его пространственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа.

Выявлены консервативные участки полипептидной цепи гтЬОХЗ и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на каталитические свойства фермента. В результате единичной аминокислотной замены получена мутантная форма 2тЬОХЗ с измененной региоспецифичностью.

Впервые показано, что алленоксидсинтаза ЬеА083 подсемейства СУР74С цитохромов Р450, является многофункциональным ферментом и катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Показано, что продуктами ЬеАОБЗ являются (9£)-а-кетол и рацемическая смесь цис- 10-оксо-11-фитоеновой кислоты (г/мс-Ю-ОФЕК).

Выявлен ген дивинилэфирсинтазы ГдЮЕБ льна-долгунца (Ыпит ткаШзтит Ь.), клонирована его открытая рамка считывания. ЬиОЕБ идентифицирована как первый фермент подсемейства СУР74В, гомологичный 13-гидропероксидлиазам, входящим в состав данного подсемейства, и, вместе с тем, являющийся дивинилэфирсинтазой. На сегодняшний день ЬиОЕБ является единственной известной 13-гидропероксид-специфичной дивинилэфирсинтазой.

Проведен сравнительный анализ первичных и третичных структур монооксигеназ Р450 и представителей семейства СУР74; выявлены гипотетические детерминанты катализа - сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих консервативные последовательности у ферментов с разным типом катализа - алленоксидсинтаз, гидропероксидлиаз и дивинилэфирсинтаз. Смоделированы модификации первичной структуры алленоксидсинтазы ЬеАОБЗ томата, гидропероксидлиазы М1НРЬ люцерны, дивинилэфирсинтазы ЬиБЕБ льна; проведен сайт-направленный мутагенез соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм ферментов. Впервые показано изменение механизмов каталитического действия ферментов семейства СУР74 в результате замены аминокислотных остатков, находящихся вблизи гема. Получены мутантные формы алленоксидсинтазы ЬеАОЗЗ, обладающие гидропероксидлиазной активностью, что означает конверсию дегидразного типа реакции в изомеразный. Впервые дивинилэфирсинтаза ЬиБЕ8 превращена в алленоксидсинтазу, которая превращает 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты в 12-оксо-10,15-фитодиеновую кислоту и а-кетол.

Проведенные превращения ферментов СУР 74 могут служить подтверждением дивергенции генов СУР74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Научно-практическая значимость работы

Результаты работы вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов липоксигеназной сигнальной системы - оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений а также в формировании ответа на стрессовые факторы. Многие оксилипины являются физиологически активными, летучими бактерицидными соединениями.

В экономическом аспекте актуальны исследования липоксигеназного каскада масличных и зерновых культур, таких как подсолнечник, кукуруза, рис. Высокое значение имеет изучение липидного обмена лекарственных растений и технических культур, таких как лен, хлопок, чеснок, горчица, табак. Оксилипины определяют ценные технологические, органолептические и лечебные свойства растений, которые могут быть востребованы в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

Разработаны системы получения и препаративной очистки липоксигеназ и цитохромов растений. Применение технологии рекомбинантных ДНК и различных систем экспрессии дает возможность получения рекомбинантных белков данных классов для использования в промышленности. Использование гидропероксидлиазы актуально для производства Сб и С9 летучих альдегидов, которые являются составляющими ароматов фруктов и овощей, например, «запаха свежескошенной травы», «дынного аромата», «запаха огуречной свежести». Эти натуральные соединения являются коммерчески ценными для парфюмерной и пищевой промышленности. Дивиниловые эфиры могут быть использованы в качестве антимикробных и фунгицидных, в то же время природных соединений, позволяющих бороться с заболеваниями растений, не ухудшая качества сельскохозяйственной продукции. Продукты алленоксидсинтазного пути являются сигнальными молекулами, при обработке которыми может быть повышено качество и количество урожая. Новые рекомбинантные ферменты с измененными каталитическими свойствами могут ч быть использованы для создания генетически модифицированных растений, удовлетворяющих требованиям современного сельскохозяйственного производства и стать основой инновационных технологий переработки сырья с использованием биокатализаторов, в том числе иммобилизованных ферментов. Характеристика представителей семейства белков дает возможность провести их более точную классификацию, позволяет ответить на многие фундаментальные вопросы эволюции и экологии.

Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в области биоинженерии. Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования

Работа проводилась с 2004 по 2013 гг. в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов -эндогенных биорегуляторов растений» (гос. per. номер: 01200901959). Исследования поддержаны грантами РФФИ № 09-04-00915-а, 09-04-12222-офим; программой фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (рук. акад. А.Н. Гречкин); грантами президента РФ для поддержки ведущих научных школ НШ-5492.2008.4, НШ

6992.2010.4, НШ № 6992.2010.4, НШ 825.2012.4 «Сигнальные системы: геномные и протеомные исследования формирования иммунитета» (рук. акад И.А. Тарчвский, акад. А.Н. Гречкин), Федеральной целевой программой «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров» (ГК № 14.740.11.0797 от 30.10.2010). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту

1. Липоксигеназа гшЬОХЗ кукурузы проявляет ^^-специфичность при окислении линолевой кислоты в нейтральных и щелочных условиях в диапазоне рН 6,5-9,5. Анализ моделей взаимодействия липоксигеназ с субстратами показал, что для 7т1Х)ХЗ характерен единственный способ позиционирования субстрата в активном центре, обусловленный проникновением жирной кислоты в субстрат-связывающий карман метальной концевой группой. Аминокислотный остаток А1а562, расположенный в активном центре 7шЬОХЗ, важен для проявления региоспецифичности действия; замена аланина на меньший по размерам глицин приводит к частичному проявлению (13Л)-региоспецифичности.

2. Специфичность действия липоксигеназ высших растений не обнаруживает строгой взаимосвязи с общей первичной структурой, что характерно для липоксигеназ животных, грибов и прокариот.

3. 13-специфичные липоксигеназы являются анцесторной группой по отношению к 9-специфичным липоксигеназам, которые образовались монофилетически до дивергенции однодольных и двудольных растений.

4. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства СУР74А, фермент ЬеАОЗЗ, принадлежащий подсемейству СУР74С, является многофункциональным. ЬеАОЗЗ катализирует синтез, гидролиз и циклизацию окиси аллена. Первичный продукт ЬеАОБЗ, окись аллена, после высвобождения из активного центра захватывается тем же ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно - стереоспецифический гидролиз с образованием (97?)-а-кетола и циклизацию с образованием рацемической г/мс-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

5. Фермент ЬиБЕБ льна является единственной дивинилэфирсинтазой, классифицируемой по общей первичной структуре как член подсемейства СУР74В цитохромов Р450, до сих пор включавшего только 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы. Дивинилэфирсинтаза ЬиЕ)Е8 льна обладает строгой 13-региоспецифичностью к субстрату; предпочтительным субстратом для нее является 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты, основным продуктом является (ю52)-этероленовая кислота.

6. В формировании определенного типа катализа ферментов семейства СУР74 принципиальная роль принадлежит центральному домену 1-спирали и ЕЯЯ-триаде.

7. Все ферменты семейства СУР74 относятся к одной близкородственной филогенетической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций. Семейство СУР74 сформировалось на ранних этапах эволюции цитохромов Р450 до дивергенции эукариот от последнего общего предка. Предковая форма ферментов СУР74 высших растений дала начало трем большим группам. Первая включала 13-ГПЛ, вторая - 13-АОС, третья - 9/13-АОС, 9-АОС и 9/13-ГПЛ. Дивинилэфирсинтазы являются эволюционно наиболее молодыми ферментами, имеющими полифилетическое происхождение, не завершившееся формированием таксономически обособленных единиц. Субстратная специфичность наряду с типом катализируемой реакции является существенным таксономическим признаком представителей семейства СУР74; дивинилэфирсинтазы связаны с родственными группами общей субстратной специфичностью.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы доложены на 2-ом Международном симпозиуме «Сигнальные системы растительных клеток: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006); на конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (США, Солт-Лейк-Сити, 2007); на Международном симпозиуме «Растительные липиды и оксилипины» (Казань, 2008); на 2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Испания, Вальядолид, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на Всероссийской конференции «Устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды» (Иркутск, 2009); на 35-м и 36-ом конгрессах FEBS (Прага, Чешская республика, 2009; Турин, Италия, 2011); на VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); на V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на 3-ем Международном симпозиуме «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011); а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2006 -2012 гг.).

По результатам работы опубликовано четырнадцать статей в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях, а также пятьдесят тезисов докладов на российских и международных научных мероприятиях.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Гоголев, Юрий Викторович

288 ВЫВОДЫ

1. Показано, что ферменты ггпЬОХЗ и ОтЬОХ1 являются специфичными (98)- и (138)-липоксигеназами. Условия реакции не оказывают влияния на специфичность действия данных ферментов.

2. Показано, что мутантная форма гшЬОХЗ А1а56201у при окислении линолевой кислоты проявляет измененную региоспецифичность действия, образуя (13/?)-гидроперекиси наряду с (95)-гидроперекисями, что связано с изменением объема полости активного центра.

3. Созданы трехмерные модели взаимодействия субстратов (жирных кислот и сложных липидов) с активными центрами липоксигеназ 2шЬОХЗ и ОшЬОХ1, согласно которым 9- и 13-специфичность липоксигеназных реакций не определяется позиционированием субстрата, а детерминируется архитектурой ферментов.

4. Показано, что первичная структура большинства липоксигеназ определяет специфичность ферментативной активности; исключение составляют липоксигеназы высших растений у которых взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и региоспецифичностью действия не выявляется. Липоксигеназы, обладающие 9-специфичностью являются монофилетичной группой, произошедшей из 13-специфичных липоксигеназ у цветковых растений перед дивергенцией однодольных и двудольных.

5. Показано участие (75)-гидроперекиси гексадекатриеновой кислоты в липоксигеназном каскаде растений: при участии дивинилэфирсинтазы табака и алленоксидсинтазы кукурузы (75)-гидроперекись превращается в дивиниловый эфир (динор-колнеленовую кислоту) и а-кетол, соответственно.

6. Показано, что алленоксидсинтаза ЬеАОБЗ, принадлежащая подсемейству СУР74С, является мультифункциональным ферментом и, в отличие от алленоксидсинтаз подсемейства СУР74А, катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена. Гидролиз протекает стереоспецифично с образованием (9Ы)-а-кетола; циклизация приводит к образованию рацемической смеси ^ис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

7. Клонированы нуклеотидные последовательности, соответствующие трем полноразмерным мРНК генов подсемейства СУР74В, обнаруженным в транскриптоме листьев льна (Ыпит ия^аНяятит Ь.), инокулированных клетками фитопатогенного штамма РеШЬаМегшт МгозерНсит БСМКНЗ. Получен очищенный препарат функционально активного рекомбинантного фермента СУР74В16 (ОепВапк ГО: Нд286277.1).

8. Определены кинетические параметры 1лЮЕ8, в соответствии с которыми новый фермент является строго 13-гидропероксид-специфичным; предпочтительным субстратом 1лЮЕ8 является 13-гидроперекись а-линоленовой кислоты, основным продуктом катализируемой реакции (со52)-этероленовая кислота. Фермент СУР74В16 идентифицирован как 13-специфичная дивинилэфирсинтаза, которой присвоено тривиальное название ЬиБЕ8. По критериям молекулярной филогении ЬиБЕБ относится к подсемейству СУР74В, включавшему до настоящего времени исключительно 13-гидропероксид-специфичные гидропероксидлиазы.

9. Выявлены сайты, определяющие механизм каталитического действия ферментов СУР74. На основе анализа первичной и третичной структуры белков впервые проведены конверсии ферментов разных функциональных групп. В результате аминокислотной замены Е292в в центре

I-спирали ЬиЕ)Е8 проведена конверсия дивинилэфирсиназы в алленоксидсинтазу. Замены аминокислотных остатков Р2951, К3028, 8297А и Т366У в полипептидной цепи ЬеА083 привели к превращению алленоксидсинтазы (дегидразы) в гидропероксидлиазу (изомеразу). Мутации М£НРЬ Б2841 и N2857 привели к появлению продуктов гомолитической фрагментации углеродного остова - (92,11£)-13-оксотридекадиеновой и (97)

II-оксоундеценовой кислот.

10. В результате объединения ферментов СУР74 животных, споровых и цветковых растений в отдельную монофилетическую группу, гомологичную цитохромам Р450 прокариот и нитчатых грибов, показано древнее происхождение семейства СУР74, имевшее место до дивергенции последнего общего предка эукариот. Данное семейство могло участвовать в начальных этапах эволюции цитохромов Р450.

11. Показано, что в эволюции ферментов СУР74 высших растений появление монофилетической группы 13-ГПЛ (подсемейства СУР74В, СУР74Б) происходило одновременно с появлением 13-АОС споровых (подсемейство СУР740). Следующим этапом явилось образование группы, включающей 13-АОС цветковых (СУР74А), 9/13-АОС (подсемейство СУР74А*), 9-АОС и 9/13-ГПЛ (подсемейство СУР74С).

12. Показано, что дивинилэфирсинтазы имеют полифилетическое происхождение на поздних этапах эволюции семейства СУР74 и не образуют таксономически обособленной единицы; выделение данных ферментов в отдельные подсемейства (СУР74Б, СУР74Н) является условным.

13. Показано, что субстратная специфичность и тип катализа являются существенными таксономическими признаками представителей семейства СУР74, отражающими распределение по филогенетическим группам; дивинилэфирсинтазы связаны с близкородственными группами общей субстратной специфичностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря прогрессу геномных технологий, база данных первичной структуры белков, в том числе, ферментов липоксигеназного каскада, увеличивается лавинообразно. Постепенно накапливается информация об условиях экспрессии соответствующих генов в растениях. В то же время, работы по клонированию генов растений остаются достаточно трудоемкими и часто завершаются поверхностной характеристикой рекомбинантного белка. Так, субстратные предпочтения липоксигеназ растений, регио- и стереоспецифичность их действия не достаточно изучены, что препятствует выяснению общих закономерностей 9- и 13-липоксигеназных путей. В результате проведенных ранее экспериментов с различными субстратами [Чечеткин и др., 2009] выяснено, что для ZmLOX3 определяющим фактором соответствия субстрата является расстояние от карбоксильного конца до центра пентадиеновой группировки. Высокая скорость и специфичность реакции сохраняются, если это расстояние такое же, как у линолевой кислоты, что наблюдается в случае гексадекадиеновой кислоты. Такую закономерность можно объяснить заякориванием карбоксильной группы субстрата на поверхности фермента. Стерические препятствия для правильного позиционирования субстрата в активном центре фермента могут быть причиной потери регио- и стереоспецифичности диоксигенирования. Полученные экспериментальные данные согласуются с построенной нами моделью позиционирования субстрата в активном центре липоксигеназ, согласно которой расположение пентадиеновой группировки может определяться лимитированным объемом субстрат-связывающего кармана фермента. Таким образом, окисление субстратов с удлиненной цепью оказывается затрудненным, что проявляется в снижении скорости, но не специфичности реакции.

Ранее сообщалось, что замена одного аминокислотного остатка в сайте Коффа приводила к смене регио- и стереоспецифичности действия 13-специфичных липоксигеназ [Coffa, Brash, 2004]. В то же время, нами показано, что мутация Ala562Gly 9-специфичной липоксигеназы ZmLOX3 изменяет лишь региоспецифичность фермента [Чечеткин и др., 2011]. Кроме того, получены данные о возможности окисления 9-специфичными липоксигеназами сложных липидов [Чечеткин и др., 2009]. Таким образом, результаты нашего исследования указывают на ограниченность теории специфичности липоксигеназ, связанной с ориентацией субстрата в активном центре, и необходимость разработки новой модели, основанной на признании того, что субстрат погружается в активный центр только метальной концевой группой.

Нами показано в экспериментах in vitro, что ZmLOX3 стерео- и региоспецифично катализирует превращение гексадекатриеновой кислоты с образованием (75)-гидроперекиси [Осипова и др., 2010а]. Это расширяет представление о роли ZmLOX3 в метаболизме липидов (рис. 91). При этом 7-гидроперекись гексадекатриеновой кислоты обнаружена как в 16:3 растениях, так и 18:3 растениях [Осипова и др., 2010а]. Присутствие данного оксилипина в 18:3 растениях можно объяснить либо результатом (3-окисления 18:3 до 16:3 и последующим образованием гидроперекиси с помощью 9-специфичной липоксигеназы либо результатом (3-окисления 9-гидроперекиси 18:3. Однако в последнем случае, наряду с 7-гидроперекисью 16:3, в растениях должны выявляться и гидроперекиси жирных кислот с более короткой цепью, которые обнаружены не были. Таким образом, образование 7-гидроперекиси 16:3 не является случайным, хотя физиологическая роль данного оксилипина не выявлена.

Согласно полученным результатам, 7-гидроперекись 16:3 может вовлекаться в последующие реакции липоксигеназного каскада. Так, дивинилэфирсинтаза табака in vitro преобразует данный субстрат в новый оксилипин - динор-колнеленовую кислоту, алленоксидсинтаза кукурузы в а-кетол - 7-гидрокси-8-оксо-10(2),12(2)-гексадекадиеновую кислоту. Также показано, что GmLOXl может использовать в качестве субстрата 16:3, оон г rs v r7cooh

98)-гидроперекись, V9-.13-гидроперекисиУ оон rs

Ч, соон оон r5

СООН соон гидроперекись

13^-гидроперекись, (13-, 9-гидроперекиси^

IZmLOX3l оон r7cooh

9$)-гидроперекись кк

Ala562Gly

2-ЛФХ lZmlOX3i

1-МЛГ сложные липиды

R/==\/ 4RaC00H

20 :2

ZmLOX3 г ^

22:2 t„COOH г оон д

I (n+/-2j rs™4^ s*9cooh

11-.12-, 13-.14

ZmLOX3l свободные жирные кислоты (п-2) 18:2 18:3 оону3 16:2, ^ 0Л оон.^З *

С 4ой(п+/-2)^ r9 v^r11cooh гидроперекиси л rs/=n^\?hcooh ---хЦЗ-,17-гидроперекиси/

ООНП /„ Т ООН, -.1 к7с00н 1Н2 ^ к7соон ^

9^-гидроперекись о^ (95)-гидроперекись оон п-2)Г (П-2М ю ^ я7соон га***^ ^ кбсос*-(9Б)-ги д роп ереки сь (75)- гидроперекись

Рис. 91. Схема липоксигеназных реакций, катализируемых при участии ZmLQX?> и ее мутантной формы А1а56201у. образуя 11-гидроперекись, которая участвует в липоксигеназном каскаде. Использование в качестве субстрата гексадекатриеновой кислоты липоксигеназами, принадлежащими к филогенетически отдаленным группам и различающимися по специфичности действия, предполагает существование еще не известной физиологической роли этих новых оксилипинов. Полученные результаты открывают новые возможности исследования гексадеканоидного липоксигеназного пути и механизмов регуляции специфичности действия липоксигеназ.

В липоксигеназном каскаде липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74 действуют координировано. В связи с этим, логичным продолжением исследования, посвященного 9-специфичной липоксигеназе, явилось изучение 9-специфичной алленоксидсинтазы LeAOS3, обладающей необычными свойствами. Известно, что большинство АОС катализируют образование из гидроперекисей жирных кислот окисей аллена [Tijet, Brash, 2002]. Окиси аллена, образуемые в результате действия алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, претерпевают спонтанный гидролиз и, в гораздо меньшей степени, спонтанную циклизацию. АОС картофеля и томата, принадлежащие подсемейству CYP74C представляют собой исключения. Среди продуктов реакций, катализируемых этими ферментами, наряду с а-кетолом наблюдается значительное количество циклопентенонов [Hamberg, 2000; Itoh et al., 2002].

Синтез короткоживущей окиси аллена в качестве первичного продукта является общей функцией АОС, в том числе LeAOS3 [Hamberg, 2000; Itoh et al., 2002]. В то же время, характер дальнейших превращений окиси аллена в присутствии LeAOS3 необычен. Во-первых, время полужизни окиси аллена зависит от концентрации LeAOS3. Чем выше концентрация LeAOS3, тем меньше время полужизни 9,Ю-ЭОД. Во-вторых, когда концентрация LeAOS3 достигает значения насыщения, происходит полное превращение 9-ГПОД через 9,Ю-ЭОД в Ю-ОФЕК и а-кетол за 20 секунд при 0 °С. В-третьих, а-кетол образуется стереоспецифично (9R). Окончательными продуктами являются (9Я)-а-кетол и рацемическая г/мс-10-оксо-11-фитоеновая кислота (рис. 58).

Приведенный путь метаболизма жирных кислот характерен не только для томата. Другими авторами было выявлено, что аналогичные пути превращения жирных кислот в циклопентеноны и кетолы характерны для ряда растений, в том числе имбиря, ландыша и подсолнечника [Ogorodnikova et al., 2008]. Биологическое значение данного пути еще предстоит выяснить.

Настоящее исследование было бы не полным без рассмотрения вопросов, касающихся механизма реакции, филогении и систематики дивинилэфирсинтаз. Эта группа ферментов наименее изучена из всех ферментов липоксигеназного каскада (за исключением эпоксиалкогольсинтаз, включение которых в CYP74 еще окончательно не признано). Несколько десятков ГПЛ и АОС были клонированы и охарактеризованы. В то же время, до настоящей работы было клонировано только пять генов ДЭС. При этом четыре охарактеризованных фермента относятся к растениям семейства пасленовых (томат [Itoh, Howe, 2001], картофель [Stumpe et al., 2001] табак [Fammartino et al., 2007]) и достаточно сходны по своим свойствам. Один весьма своеобразный фермент принадлежит растению семейства лилейных (чеснок [Stumpe et al., 2008]). Некоторые исследователи полагают, что дивинилэфирсинтазы не получили широкого распространения в растениях. В настоящей работе впервые описана рекомбинантная 13-специфичная ДЭС, LuDES (CYP74B16), которая обладает высокой степенью сходства к 13-ГПЛ (CYP74B) и отличается от всех ранее описанных ДЭС по субстратной специфичности, продуктам реакции и органоспецифичности экспрессии гена. Следует отметить, что LuDES, вероятно, не единственная ДЭС, катализирующая образование (со52)-этероленовой кислоты или родственных (со52)-дивиниловых эфиров. Такие дивиниловые эфиры были обнаружены в растениях рода Ranunculus и у бурых водорослей рода Laminaria [Proteau, Gerwick, 1993]. Сходный дивиниловый эфир с (Z,^-бутадиеновым фрагментом был обнаружен ранее в красной водоросли Polyneura latissima [Grechkin, 2002]. Соответствующие ДЭС остаются совершенно не изученными. Они могут оказаться либо ортологами ЬиБЕБ, либо представителями других, в том числе, новых подсемейств СУР74.

В молекулярной филогении, связанной с систематикой ферментов, тип каталитической реакции принято ассоциировать с определенным подсемейством. Результаты данной работы показывают, что в случае семейства СУР74 это соответствие не соблюдается. Так, подсемейство СУР74С содержит и АОС, и ГПЛ, подсемейство СУР74В включает ГПЛ и ДЭС (рис. 90). Кроме того, члены подсемейства СУР74В имеют степень идентичности более 55% по отношению к представителям подсемейства СУР74С. Таким образом, подсемейства СУР74Э и СУР74Н выделены лишь по функциональному признаку. Формально в соответствии с принятыми критериями принадлежности к подсемейству (50 - 55 % сходства первичной структуры), СУР74С и СУР74Б, СУР74А* и СУР74Н следовало бы рассматривать как единые подсемейства.

Круг секвенированных геномных последовательностей стремительно расширяется. При этом темпы молекулярного клонирования и функционального изучения рекомбинантных белков все более отстают от геномного секвенирования. На основании информации о первичной структуре белков появляются новые подсемейства и даже семейства. Однако пример настоящей работы показывает, что даже среди совершенно однородных подсемейств появляются ферменты (такие как ЬиБЕБ) с каталитической функцией, принципиально отличной от той, которая может быть предсказана по особенностям первичной структуры и формальным критериям классификации, основанным на сходстве аминокислотных последовательностей [Гоголев и др., 2011].

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются монооксигеназами, и для них характерно использование двух субстратов: окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства СУР74 является отсутствие необходимости в молекулярном кислороде в качестве субстрата. В реакции участвует кислород гидропероксигруппы окисленной жирной кислоты. Соответственно, центральный домен I-спирали ферментов CYP74 является вырожденным. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода и переносе электронов у монооксигеназ, в последовательностях CYP74 отсутствуют. Было высказано предположение, что функция центрального домена I-спирали CYP74 заключается во взаимодействии с гидроперекисной группировкой субстрата. Кроме того, исходя из сопоставления первичных структур и расположения относительно гема другого консервативного домена ферментов CYP74, ERR-триады, были предсказаны входящие в его состав аминокислотные остатки, важные для определения специфичности катализа.

Сделанные теоретические заключения были проверены с помощью сайт-направленного мутагенеза. Результатом этих экспериментов послужили конверсии ферментов CYP74. Единичные мутации LeAOS3 F295I, K302S, T366Y и S297A превратили АОС (дегидразу) в ГПЛ (изомеразу). Это свидетельствует о роли данных консервативных аминокислот центрального домена I-спирали в специфичной функции фермента. Замена аспарагиновой кислоты на аргинин (D359R) в ERR-триаде не привела к изменениям в механизме катализа. Таким образом, роль этого домена еще не определена.

Результаты данной работы по сайт-направленному мутагенезу LeAOS3 и MtHPL частично подтверждают гипотезу о том, что предковый фермент CYP74 обладал активностью ГПЛ. К настоящему времени, кроме выявленного нами домена IHCD, Раманом с сотр. определен еще один сайт, от которого зависит тип катализа CYP74 [Lee et al., 2008]. Многочисленные мутации, проведенные нами и другими исследователями, в этих каталитически важных сайтах MtHPL не привели к изменению каталитического механизма. В то же время, четыре из пяти мутаций в LeAOS3 превратили данный фермент из дегидразы в изомеразу. Учитывая, что реверсии к исходному фенотипу встречаются чаще, чем образование нового, можно предположить, что гидропероксидлиазная активность является таким первичным фенотипом. В свою очередь, алленоксидсинтазная и дивинилэфирсинтазная реакции формируются в процессе видоизменения базовой гидропнроксидлиазной реакции в результате влияния боковых групп некоторых новых аминокислот. Результатом мутаций является устранение этого влияния в той или иной степени и, как следствие, возвращение к базовому типу катализа. Все мутации ЬеАОБЗ Р2951, Б297А, К3028 и Т366У привели к появлению гидропероксидлиазной, но не дивинилэфирсинтазной, активности, как можно было ожидать в случае мутантов Р2951 и Б359К. По-видимому, для превращения АОС в ДЭС не достаточно минорных модификаций в результате точечных мутаций.

Исходя из анализа первичной структуры ЬиБЕБ, можно было предположить, что этот фермент является природным мутантом 13-ГПЛ. В связи с этим, нами была предпринята попытка направленной модификации ЬиОЕБ, моделирующей реверсию данной мутации. Сопоставление первичных последовательностей 1-спирали представителей семейства СУР74В позволяло ожидать приобретение ферментом ЬцБЕБ Е292в гидропероксидлиазной активности. Однако фермент полностью утратил активность дивинилэфирсинтазы и приобрел активность алленоксидсинтазы. Полученный результат кажется неожиданным, хотя он подтверждает важную роль домена ШСО в определении типа катализа СУР74. Кроме того, не отрицая базовой роли гидропероксидлиазной реакции для ферментов СУР74, он вписывается в модель эволюции семейства СУР74, предполагающей последовательное превращение ферментов ГПЛ —> АОС —> ДЭС.

Полученные экспериментальные данные подтверждают результаты сравнительного анализа первичной структуры цитохромов семейства СУР74, выявившие существенные аминокислотные остатки в определенных позициях. Результаты сайт-направленного мутагенеза вносят существенный вклад в представление об эволюции ферментов СУР74 и цитохромов в целом. На рисунке 92 представлена схема реакций, осуществляемых ферментами СУР74. На схеме выделены стадии, критичные для изменений катализа, полученных нами экспериментально.

ООН

R, ГПО(ДГГ) ш

Fe эпоксиаллильныи радикал

ДОС (LeAOS3, LuDESE292G) алкоксильный радикал

ДЭС (LuDES), ГПЛ (MtHPL, LeAOS3F295l, -K302S, -T366Y, -S297A)

7 R' O цикпопентенон альдегид ю-оксожирная кислота

Рис. 92. Общая схема реакций, катализируемых ферментами CYP74 дикого типа и их мутантными формами. Выделены стадии реакций, в которых происходит переключение типа катализа в результате единичных аминокислотных замен. Алленоксидсинтазу LeAOS3 и ее мутантные формы инкубировали с 9-ГПОД; R, = -(СН2)6СООН, R2 = -(СН2)4СН3. Ферменты LuDES и MtHPL и их мутантные формы инкубировали с 13-ГПОТ; R) = -СН=СНСН2СН3, R2 = -(СН2)7СООН.

Все ферменты - АОС, ГПЛ и ДЭС в качестве первого этапа катализа осуществляют расщепление 0-0 связи с образованием эпоксиаллильного радикала. Тип катализа определяется дальнейшими превращениями субстрата в зависимости от свойств фермента. Эпоксиаллильный радикал подвергается новому присоединению кислорода (ГПЛ) или одноэлектронному окислению протонированным феррильным центром с последующей потерей протона (АОС, ДЭС). При конверсии ДЭС в АОС дегидразная ферментативная активность сохраняется, но реализуется она в разные фазы перегруппировки образовавшегося эпоксиаллильного радикала (по Си или Со). При конверсии АОС в ГПЛ тип катализа радикально меняется. Однако и в том и другом случае значительными оказываются тонкие изменения структуры фермента. В эволюционной ретроспективе подобные изменения были связаны с блокировкой повторного присоединения кислорода к эпоксиаллильному радикалу, что привело к трансформации изомеразной реакции в дегидратазную. Это может служить объяснением многочисленных реверсий АОС-ГПЛ, нарушающих такую блокировку.

Насколько нам известно, до настоящей работы [Торогкоуа а1., 2008, Топоркова и др., 2010а] и одновременно выполненного исследования [Ьее е^ а1, 2008], в литературе не было примеров принципиального изменения механизма катализа ферментов в результате единичных замен аминокислотных остатков. Полученная серия превращений ферментов СУР74 позволяет заключить, что нами разработан алгоритм направленных модификаций первичной структуры белков данного семейства, с высокой вероятностью изменяющие их каталитические свойства. Этот алгоритм является синтетическим и включает общие этапы: построение филогенетических моделей, анализ третичной структуры белков, изучение механизма катализа. Промежуточным результатом служит определение консервативных, каталитически важных доменов, положения субстрата относительно активного центра, выявление роли отдельных аминокислотных остатков в зависимости от их свойств и пространственного расположения. На завершающем этапе должно быть осуществлено моделирование предполагаемых каталитических свойств белка с измененной структурой. Результаты проведенных экспериментов подтверждают эффективность используемого алгоритма и открывают возможности для целенаправленного изменения каталитического действия ферментов СУР74.

Полученные данные подтверждают эволюционное происхождение семейства СУР74 от единого предкового гена в результате дупликации и последующей дивергенции. Интересным вопросом, который мы не могли оставить без внимания, является возраст предполагаемого предкового гена, отделившегося от других членов суперсемейства Р450. Обнаружение представителей семейства не только у растений, но также у животных и прокариот дают основание отнести время образование такого предкового гена ко времени существования последнего общего предка эукариот. Результаты расчета эволюционных дистанций также свидетельствуют о древнем происхождении семейства и соответствии его филогенетической модели общей эволюции живых существ, у которых обнаружены ферменты СУР74. Таким образом, предположение о существенной роли горизонтального переноса генов СУР74 в эволюционной истории семейства является не обоснованным.

Несмотря на то, что в настоящее время липоксигеназы представлены достаточно широко, их эволюционная история связана, в основном, с эукариотическими организмами (рис. 86). По всей вероятности, широкое распространение липоксигеназ не являлось обязательным условием для возникновения ферментов СУР74. Не нуждаясь в молекулярном кислороде, эти ферменты могли появиться раньше, в период преобразования восстанавливающей атмосферы в окислительную, выполняя репаративные функции, связанные с элиминацией гидроперекисей. Протекторная функция могла принадлежать и первыми липоксигеназам, способным перехватывать кислород и передавать его цитохромам в виде гидроперекисей. В этом случае два железосодержащих белка могли пройти путь коэволюции, на протяжении которого их протекторная функция трансформировалась в метаболическую и сигнальную; в итоге был сформирован современный липоксигеназный каскад. Другое направление эволюции цитохромов Р450, вероятно, было связано с кооперацией этих ферментов с переносчиками электронов и усложнением реакции за счет формирования серии промежуточных комплексов в процессах поэтапного восстановления и окисления железа. Проверить экспериментально подобные предположения не представляется возможным. Однако можно отметить, что у современных растений липоксигеназный сигнальный каскад является частью фитоиммунитета и активизируется при повреждениях клеток, связанных с последующими окислительными событиями, в том числе такими драматичными, как окислительный взрыв (Тарчевский, 2002).

Проведенная нами реконструкция эволюции семейства СУР74 а также изменение региоспецифичности окисления липоксигеназы ZmLOXЗ свидетельствует о том, что тонкие изменения структуры ферментов могут существенным образом модифицировать их основные каталитические свойства. Это означает, что высокий потенциал структурной и функциональной (фенотипической) изменчивости не всегда определяет темпы молекулярной эволюции. Востребованность продукта является главным фактором успешного и быстрого закрепления новых каталитических свойств, в то время как адаптация к новым субстратам и интеграция в сопряженные процессы, требующие модификации сходных типов катализа, играют второстепенную роль в молекулярной филогении. Таким образом, поворотным пунктом в эволюции ферментов следует считать события, обеспечивающие выбор партнеров по коэволюции. Это обуславливает дивергенцию ферментов в связи с их принадлежностью к новым биохимическим процессам и одновременно расширяет спектр каскадов реакций, свойственных клеткам данного вида, увеличивая его физиологические возможности. При этих событиях возрастает вероятность скачкообразных изменений скорости эволюции, вызывающих сбои молекулярных часов, что часто обнаруживается при филогенетических построениях.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Гоголев, Юрий Викторович, 2013 год

1. Георгиев, Г.П. Метод быстрого выделения высокополимерной дезоксирибонуклеиновой кислоты / Г.П. Георгиев // Биохимия. 1959. - Т. 24. -Н. 3,- С. 472-480.

2. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. М.: Мир, 1988. -538 с.

3. Гоголев, Ю. В. Выявление и первичная характеристика нового цитохрома СУР74В1 льна {Ыпит шМаИзйтит) / Ю. В. Гоголев, С. С. Горина, Н. Е. Гоголева, Я. Ю. Топоркова, Л. Ш. Мухтарова, И. Р. Чечеткин, А. Н. Гречкин // Доклады АН. 2011.- Т. 440. - С. 540-543.

4. Лось, Д. А. Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот / Д. А. Лось // Успехи биологической химии. 2001. -Т. 41.-С. 163—198.

5. Лукашов, В. В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ: учеб. пособие / В. В. Лукашов. Бином. Лаб. знаний, 2009. - 256 с.

6. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. - 480 с.

7. Осипова, Е. В. Рекомбинантная 9- липоксигеназа кукурузы: экспрессия, очистка и свойства / Е. В. Осипова, Р. И. Чечеткин, Ю. В. Гоголев, Н. Б. Тарасова // Биохимия. 20106. - Т. 75. - С. 968-983.

8. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1981.-288 с.

9. Патрушев, Л. И. Искусственные генетические системы. Т. 1. Генная и белковая инженерия/ Л. И. Патрушев. М.: Наука, 2004. - с. 530.

10. Тарчевский, И. А. Метаболизм растений при стрессе (избранные труды) / И. А. Тарчевский. Казань.: Фэн, 2001. - 448 с.

11. Тарчевский, И. А. Сигнальные системы клеток растений / И. А. Тарчевский. Москва.: Наука, 2002. - 296 с.

12. Топоркова, Я. Ю. Изменение катализа ферментов подсемейства CYP74C в результате сайт-направленного мутагенеза / Я. Ю. Топоркова, Е. В. Осипова, ji. Ш. Мухтарова, Ю. В. Гоголев, А. Н. Гречкин // Доклады АН. -2010а.-Т. 435.-С. 117-120.

13. Чечеткин И. Р. Регио- и стереоспецифичность рекомбинантной липоксигеназы-2 сои / И. Р. Чечеткин., Ф. К. Мухитова, Ю. В. Гоголев, А. Н. Гречкин // Доклады РАН. 2007. - Т. 415. - С. 829-831.

14. Чечеткин, И. Р. Специфичность окисления гомологов линолевой кислоты липоксигеназами растений / И. Р. Чечеткин, Е. В. Осипова, Н. Б. Тарасова, Ф. К. Мухитова, М. Хамберг, Ю.В. Гоголев, А. Н. Гречкин // Биохимия. 2009. - Т. 74. - С. 1052 - 1059.

15. Acosta, I. R. Jasmonates /1. R. Acosta, E. E. Farmer // The Arabidopsis Book.-2010.-V. 8-P. 1-13.

16. Altschul, S. F, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs / S. F. Altschul, T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D. J. Lipman // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

17. Andreou, A. Biosynthesis of oxylipins in non-mammals / A. Andreou, F. Brodhun, I. Feussner // Progress in Lipid Research. 2009a. - V. 48. - P. 148— 170.

18. Andreou, A. Z. On the substrate binding of linoleate 9-lipoxygenases / A. Z. Andreou, E. Hornung, S. Kunze, S. Rosahl, I. Feussner // Lipids. 2009b. - V.44.-P. 207-215.

19. Andreou, A. Z. Properties of a mini 9R-lipoxygenase from Nostoc sp. PCC 7120 and its mutant forms / A. Z. Andreou, M. Vanko, L. Bezakova, I. Feussner // Phytochemistry. 2008. - V.69. - PI 832-1837.

20. Augustin, J. M. Molecular activities, biosynthesis and evolution of triterpenoid saponins / J. M. Augustin, V. Kuzina, S. B. Andersen, S. Bak // Phytochemistry. 2011. - V. 72. - P. 435-457.

21. Bak, S. Cytochromes P450 / S. Bak, F. Beisson, G. Bishop, B. Hamberger, R. Hofer, S. Paquette, D. Werck-Reichhart // The Arabidopsis Book. -2011. V. 9.-P. 1-56.

22. Ballare, C. L. Jasmonate-induced defenses: a tale of intelligence, collaborators and rascals / Trends Plant Science. 2011. - V. 16. - P. 249-257.

23. Bate, N. J. C-6-volatiles derived from the lipoxygenase pathway induce a subset of defense-related genes / N. J. Bate, S. J. Rothstein // The Plant Journal. -1998.-V. 16.-P. 561-569.

24. Bateman, A. The PLAT domain: a new piece in the PKD1 puzzle / A. Bateman, R. Sandford // Current Biology. 1999. - V. 9. - P. 588-590.

25. Baysal, T. Lipoxygenase in fruits and vegetables: a review / T. Baysal, A. Demirdoven // Enzyme and Microbial Technology. 2006. - V. 40. - P. 491

26. Beisson, F. Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis / F. Beisson, Y. Li-Beisson, M. Pollad // Current Opinion in Plant Biology.-2012.-V. 15.-P. 329-337.

27. Belkner, J. The oxygenation of cholesterol esters by the reticulocyte lipoxygenase / J. Belkner, R. Wiesner, H. Kuhn, V. Z. Lankin // FEBS Letters -1991.-V. 279.-P. 110-114.

28. Belkner, J. The rabbit 15-lipoxygenase preferentially oxygenates LDL cholesterol esters, and this reaction does not require vitamin E / J. Belkner, H. Stender, H. Kuhn // The Journal of Biological Chemistry. 1998. - V. 273. - P. 23225-23232.

29. Bell, C. D. The age of the angiosperms: a molecular timescale without a clock / C. D. Bell, D. E. Soltis, P. S. Soltis // Evolution. 2005. - V. 59. - P. 12451258.

30. Bernart, M. W. Unprecedented oxylipins from the marine green alga Acrosiphonia coalita / M. W. Bernart, G. G.Whatley, W. H. Gerwick // Journal of Natural Products. 1993. - V. 56. - P. 245-259.

31. Berney C. A molecular time-scale for eukaryote evolution recalibrated with the continuous micro fossil record / C. Berney, J. Pawlowski // Proceedings of the Royal Society B. 2006 - V. 273. - P. 1867-1872.

32. Bernroitner, M. Occurrence, phylogeny, structure, and function of catalases and peroxidases in cyanobacteria / M. Bernroitner, M. Zamocky, P.G. Furtmuller, G.A. Peschek, C. Obinger // Journal of Experimental Botany. 2009. -V. 60. - P. 423-440.

33. Bhardwaj, P. K. Lipoxygenase in Caragana jubata responds to low temperature, abscisic acid, methyl jasmonate and salicylic acid / P. K. Bhardwaj, J. Kaur, R. C. Sobti, P. S. Ahuja, S. Kumar // Gene. 2011. - V. 483. - P. 49-53.

34. Blee, E. Envelope membranes from spinach chloroplasts are a site of metabolism of fatty acid hydroperoxides / E. Blee, J. Joyard // Plant Physiology. -1996.-V. 110.-P. 445-454.

35. Blee, E. Phytooxylipins and plant defense reactions / E. Blee // Progress in Lipid Research. 1998. - V. 37. - P. 33-72.

36. Boeglin, W. E. Investigation of substrate binding and product stereochemistry issues in two linoleate 9-lipoxygenases / W. E. Boeglin, A. Itoh, Y. Zheng, G. Coffa, G. A. Howe, A. R. Brash // Lipids. 2008. - V. 43. - P. 979-987.

37. Bonaventure, G. Transduction of wound and herbivory signals in plastids / G. Bonaventure, I. T. Baldwin // Communicative & Integrative Biology. -2010.-V.3.- P. 313-317.

38. Borngraber, S. Phenylalanine 353 is a primary determinant for the positional specificity of mammalian 15-lipoxygenases / S. Borngraber, R. J. Kuban, M. Anton, H. Kuhn // Journal of Molecular Biology. 1996. - V. 264. - P. 11451153.

39. Borngraber, S. Shape and specificity in mammalian 15-lipoxygenase active site / S. Borngraber, M. Browner, S. Gillmor, C. Gerth, M. Anton, R. Fletterick, H. Kuhn // The Journal of Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - P. 37345-37350.

40. Boyington, J. C. The three-dimensional structure of an arachidonic acid 15-lipoxygenase / J. C. Boyington, B. J. Gaffney, L. M. Amzel // Science. 1993. -V. 260.-P. 1482-1486.

41. Brash, A. R. Analysis of a specific oxygenation reaction of soybean lipoxygenase-1 with fatty acids esterified in phospholipids / A. R. Brash, C. D. Ingram, T. M. Harris // Biochemistry. 1987. - V. 26. - P. 5465-5471.

42. Brash, A. R. Autoxidation of methyl linoleate: identification of the bis— ally lie 11-hydroperoxide // Lipids. 2000. -V. 35. - P. 947-952.

43. Brash, A. R. Isolation and characterization of natural allene oxides: Unstable intermediates in the metabolism of lipid hydroperoxides / A. R. Brash, S.

44. W. Baertschi, C. D. Ingram, T. M. Harris // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1988. - V. 85. - P. 3382-3386.

45. Brash, A. R. Lipoxygenases: occurrence, functions, catalysis, and acquisition of substrate / A. R. Brash // The Journal of Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - P. 23679-23682.

46. Brash, A. R. Mechanistic aspects of CYP74 allene oxide synthases and related cytochrome P450 enzymes / A. R. Brash // Phytochemistry. 2009. - V. 70. -P. 1522-1531.

47. Brodhun F. Identification of PpoA from Aspergillus nidulans as a Fusion Protein of a Fatty Acid Heme Dioxygenase/Peroxidase and a Cytochrome P450 / F. Brodhun, C. Gobel, E. Hornung, I. Feussner // J Biol Chem. 2009. - V. 284(18). -P. 11792-11805.

48. Broun, P. Catalytic plasticity of fatty acid modification enzymes underlying chemical diversity of plant lipids / P. Broun, J. Shanklin, E. Whittle, Ch. Somerville // Science. 1998. - V. 282. - P. 1315-1317.

49. Butovich, I. A. Enzyme-catalyzed and enzyme-triggered pathways in dioxygenation of 1-monolinoleoyl-rac-glycerol by potato tuber lipoxygenase /1. A. Butovich, C. C. Reddy // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. -V. 1546. - P. 379398.

50. Caldelari, D. A rapid assay for the coupled cell free generation of oxylipins / D. Caldelari, E. E. Farmer // Phytochemistry. 1998. - V. 47. - P. 599604.

51. Casey, R. New frontiers in food enzymology: recombinant lipoxygenases / R. Casey, S. I. West, D. Hardy, D. S. Robinson, Z. Wu, R. K. Hughes // Trends in Food Science & Technology. 2000. - V. 10. - P. 297-302.

52. Catchen, J. M. Postlethwait JH. Automated identification of conserved synteny after whole-genome duplication / J. M. Catchen, J. S. Conery // Genome

53. Res. -2009. V. 19.-P. 1497-1505.

54. Cavalier-Smith, T. Deep phylogeny, ancestral groups and the four ages of life / T. Cavalier-Smith // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2010. - V. 365. - P. 111-132.

55. Chechetkin, I. R. A lipoxygenase-divinyl ether synthase pathway in flax (Linum usitatissimum L.) leaves / I. R.Chechetkin, A. Blufard, M. Hamberg, A. N. Grechkin // Phytochemistry. 2008. - V. 69. - P. 2008-2015.

56. Chechetkin, I. R. The novel pathway for ketodiene oxylipin biosynthesis in Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus) tubers / I. R. Chechetkin, N. V. Medvedeva , A. N. Grechkin // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. - V. 1686. -P. 7-14.

57. Chechetkin, I. R. Unprecedented pathogen-inducible complex oxylipins from flax linolipins A and B /1. R. Chechetkin, F. K. Mukhitova, A. S. Blufard, A. Y. Yarin, L. L. Antsygina, A. N. Grechkin // The FEBS Journal. - 2009. -V. 276. -p. 4463-4472.

58. Chechetkin, I.R. Oxidation of glycerolipids by maize 9-lipoxygenase and its A562G mutant / I.R. Chechetkin, E.V. Osipova, L.L. Antsygina, Y.V. Gogolev, A.N. Grechkin // Chem. Phys. Lipids 2011. - V. 164. - P. 216-220.

59. Chen, X. Y. Expression, purification, and characterization of a recombinant 5-lipoxygenase from potato tuber / X. Y. Chen, P. Reddanna, G. R.

60. Reddy, R. Kidd, G. Hildenbrandt, C. C. Reddy // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1998. -V. 243. - P. 438^43.

61. Choi, J. Conformational flexibility in mammalian 15S-lipoxygenase: Reinterpretation of the crystallographic data / J. Choi, J. K. Chon, S. Kim, W. Shin // Proteins. 2008. - V. 70. - P. 1023-1032.

62. Christopher, J. Isolation of an isozyme of soybean lipoxygenase / J. Christopher, E. Pistorius, B. Axelrod // Biochimica et Biophysica Acta. 1970. - V. 198. -P.12-19.

63. Coffa, G. A comprehensive model of positional and stereo control in lipoxygenases / G. Coffa, C. Schneider, A. R. Brash // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005a. - V. 338. - P. 87-92.

64. Coffa, G. Discovery of an ll(i?)- and 12(5)-lipoxygenase activity in ovaries of the mussel Mytilus edulis / G. Coffa, E. M. Hill // Lipids. 2000. - V. 35. -P. 1195-1204.

65. Copley, S. Evolution and the Enzyme / S. D. Copley Boulder,

66. Colorado: Elsevier, 2010.-48 p.

67. Cowley, T. Local and systemic effects of oxylipins on powdery mildew infection in barley / T. Cowley, D. Walters // Pest Management Science. 2005. - V. 61.-P. 572-576.

68. Creelman, R. A. Biosynthesis and action of jasmonates in plants / R. A. Creelman, J. E. Mullet // Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 1997. -V. 48. - P. 355-381.

69. Cresnar, B. Cytochrome P450 enzymes in the fungal kingdom / B. Cresnar, S. Petric // Biochimica et Biophysica Acta. Proteins & Proteomics. -2011. -V. 1814.-P. 29-35.

70. Dayhoff, M.O. A model of Evolutionary Change in Proteins / M. O. Dayhoff, R. Schwartz, B. C. Orcutt // Atlas of protein sequence and structure. -1978.-V 5.-P. 345-358.

71. Delporte, A. Jasmonate response of the Nicotiana tabacum agglutinin promoter in Arabidopsis thaliana / A. Delporte, N. Lannoo, G. Vandenborre, M. Ongenaert, E. J. Van Damme // Plant Physiology and Biochemistry 2011. - V. 49. -P. 843-851.

72. Demole, E. Isolement et determination de la structure du jasmonate de methyle, constituant odorant caractéristique de l'essence de jasmin / E. Demole, E. Lederer, D. Mercier // Helvetica Chimica Acta. 1962. - V. 45. - P. 679-685.

73. Denisov, I. G. Structure and chemistry of cytochrome P450 / I. G. Denisov, T. M. Makris, S. G. Sligar, I. Schlichting // Chemical Reviews. 2005. -V. 105.-P. 2253-2277.

74. Di Giulio M. The universal ancestor and the ancestors of Archaea and Bacteria were anaerobes whereas the ancestor of the Eukarya domain was an aerobe/ M. Di Giulio // Journal of Evolutionary Biology. 2007 - V. 20(2). - P. 543-548.

75. Farmer, E. E. Octadecanoid-derived signals in plants / E. E. Farmer, C.

76. A. Ryan // Trends in Cell Biology. 1992. - V. 2. - P. 236-241.

77. Felsenstein J. Confidence limits on phytogenies: An approach using the bootstrap / J. Felsenstein // Evolution. 1985. - V. 39. - P. 783-791.

78. Feng, B. Molecular analysis of lipoxygenase (LOX) genes in common wheat and phylogenetic investigation of LOX proteins from model and crop plants /

79. B. Feng, Z. Dong, Z. Xu, X. An, H. Qin, N. Wu, D. Wang, T. Wang // Journal of Cereal Science. 2010. - V. 52. - P. 387-394.

80. Feussner, I. The lipid body lipoxygenase from cucumber seedlings exhibits unusual reaction specificity /1. Feussner, H. Kuhn // FEBS Letters. 1995. -V. 367.-P. 12-14.

81. Feussner, I. The lipoxygenase pathway /1. Feussner, C. Wasternack // Annual Reviews of Plant Biology. 2002. - V. 53. - P. 275-297.

82. Feyereisen, R. Arthropod CYPomes illustrate the tempo and mode in P450 evolution / Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Proteins & Proteomics. -2011.-V. 1814.-P. 19-28.

83. Feyereisen, R. Insect CYP Genes and P450 Enzymes / R. Feyereisen // Insect Molecular Biology and Biochemistry / L. I. Gilbert. Academic press: 2012. -P. 236-316.

84. Fuller, M. Activity of soybean lipoxygenase isoforms against esterified fatty acids indicates functional specificity / M. Fuller, H. Weichert, A. Fischer, I. Feussner, H. Grimes // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2001. - V. 388. -P. 146-154.

85. Funk, M. O. Oxygenation of trans polyunsaturated fatty acids by lipoxygenase reveals steric features of the catalytic mechanism / M. O. J. Funk, J. C. Andre, T. Otsuki // Biochemistry. 1987. - V. 2621. - P. 6880-6884.

86. Gan, Q. F. Defining the arachidonic acid binding site of human 15-lipoxygenase: molecular modelling and mutagenesis / Q. F. Gan, M. F. Browner, D. L. Sloane, E. Sigal // The Journal of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - P. 25412-25418.

87. Gao, X. Maize 9-lipoxygenase ZmLOX3 controls development, root-specific expression of defense genes, and resistance to root-knot nematodes / X.

88. Gao, J. Starr, C. Gobel, J. Engelberth, I. Feussner, J. Tumlinson, M. Kolomiets // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2008. - V. 21. - P. 98-109.

89. Gardner, H. W. Oxygenation of (3Z)-nonenal to (2E)-4-hydroxy-2-nonenal in the broad bean (Vicia faba L) / H. W. Gardner, M. Hamberg // The Journal of Biological Chemistry. 1993. -V. 268. - P. 6971-6977

90. Gardner, H. W. Biocatalysis by the plant lipoxygenase pathway: oxygenated fatty acid production and hydroperoxide lyases / H. W. Gardner, A. N. Grechkin // Lipid Biotechnology / T. M. Kuo, H. W. Gardner. NY: Marcel Dekker, 2002.-P. 157-182.

91. Gardner, H. W. Oxygen radical chemistry of polyunsaturated fatty acids / H. W. Gardner // Free Radical Biology and Medicine. 1989. - V. 7. - P. 65-86.

92. Gardner, H. W. Soybean lipoxygenase-1 enzymically forms both (95)-and (13iS)-hydroperoxides from linoleic acid by a pH-dependent mechanism / H. W. Gardner // Biochimica et Biophysica Acta. 1989. - V. 1001. - P. 274-281.

93. Garssen, G. J. An anaerobic reaction between lipoxygenase, linoleic acid and its hydroperoxides / G. J. Garssen, J. F. Vliegenthart, J. Boldingh // The Biochemical Journalournal. 1971. - V. 122. - P. 327-332.

94. Glickman, M. H. Lipoxygenase reaction mechanism: demonstration thathydrogen abstraction from substrate precedes dioxygen binding during catalytic turnover / M. H. Glickman, J. P. Klinman // Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 12882-12892.

95. Gobel, C. Lipid peroxidation during the hypersensitive response in potato in the absence of 9-lipoxygenases / C. Gobel, I. Feussner, S. Rosahl // The Journal of Biological Chemistry. 2003. - V. 278. - P. 52834-52840.

96. Gobel, C. Methods for the analysis of oxylipins in plants / C. Gobel, I. Feussner // Phytochemistry. 2009. - V. 70. - P. 1485-1503.

97. Gobel, C. Oxylipin profiling in pathogen-infected potato leaves / C. Gobel, I. Feussner, M. Hamberg, S. Rosahl // Biochimica et Biophysica Acta. -2002.-V. 1584.-V. 55-64.

98. Gotoh, O. Evolution, structure and gene regulation of cytochrome P-450 / O. Gotoh, Y. Fujii-Kuriyama // Frontiers in Biotransformation / K. Ruckpaul, H. Rein. Berlin: Akademie-Verlag, 1989. -V. 1. - P. 195-243.

99. Gotoh, O. Possible steroid binding site common to adrenal cytochrome P-450scc and prostatic steroid binding protein / O. Gotoh, Y. Tagashira, K. Morohashi, Y. Fujii-Kuriyama // FEBS Letters. 1985. - V. 188. - P. 8-10.

100. Gotoh, O. Substrate recognition sites in cytochrome P450 Family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences / O. Gotoh // The Journal of biological chemistry. 1992. - V. 267.-P. 83-90.

101. Goulitquer, S. Release of volatile aldehydes by the brown algal kelp Laminaria digitata in response to both biotic and abiotic stress / S. Goulitquer, A. Ritter, F. Thomas, C. Ferec, J. P. Salaun, P. Potin // Chembiochem. 2009. - V.10(6).-P. 977-982.

102. Graner, G. Screening of oxylipins for control of oilseed rape (Brassica napus) fungal pathogens / G. Graner, M. Hamberg, J. Meijer // Phytochemistry. -2003.-V. 63.-P. 89-95.

103. Grechkin, A. N. Biocatalysis by the plant lipoxygenase pathway hydroperoxide-metabolizing enzymes / A. N. Grechkin, H. W. Gardner // Lipid Biotechnology / T. M. Kuo, H. W. Gardner. NY: Marcel Dekker, 2002. - P. 183201.

104. Grechkin, A. N. Divinyl ether synthase from garlic (Allium sativum L.) bulbs: sub-cellular localization and substrate regio-and stereospecificity / A. N. Grechkin, M. Hamberg // FEBS Letters. 1996. - V. 388. - P. 112-114.

105. Grechkin, A. N. Formation of cyclopentenones from all-(E) hydroperoxides of linoleic acid via allene oxides. New insight into the mechanism of cyclization / A. N. Grechkin, M. Hamberg // FEBS Letters. 2000. - V. 466 - P. 6366.

106. Grechkin, A. N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway / A. N. Grechkin // Progress in Lipid Research. 1998. - V. 37.-P. 317-352.

107. Grechkin, A. N. The "heterolytic hydroperoxide lyase" is an isomerase producing a short-lived fatty acid hemiacetal / A. N. Grechkin, M. Hamberg // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. - V. 1636. - P. 47-58.

108. Grechkin, A. N. The lipoxygenase pathway in garlic {Allium sativum L.) bulbs: detection of the novel divinyl ether oxylipins / A. N. Grechkin, F. N. Fazliev, L .S. Mukhtarova// FEBS Letters. 1995. -V. 371. - P. 159-162.

109. Grechkin, A. N. Cyclization of natural allene oxide fatty acids. The anchimeric assistance of P,y—double bond beside the oxirane and the reaction mechanism / A. N. Grechkin // Biochimica et Biophysica Acta. 1994. - V. 1213. -P. 199-206.

110. Grechkin, A. N. Detection of a pathway from linoleate to a novel cyclopentenone: cis-12-oxo-10-phytoenoic acid in sunflower roots / A. N. Grechkin, A. V. Ogorodnikova, O. I. Gnezdilov, L. S. Mukhtarova // ChemBioChem. 2007. - V. 8. - P. 2275-2280.

111. Grechkin, A. N. Hydroperoxide lyase and divinyl ether synthase / A. N. Grechkin // Prostaglandins & Other Lipid Mediators. 2002. - V. 68-69. - P. 457470.

112. Grechkin, A. N. On the mechanism of biosynthesis of divinyl ether oxylipins by enzyme from garlic bulbs / A. N. Grechkin, A. V. Ilyasov, M. Hamberg // European Journal of Biochemistry. 1997. - V. 245. - P. 137-142.

113. Grechkin, A. N. The lipoxygenase pathway in tulip (Tulipa gesneriana): detection of the ketol route / A. N. Grechkin, L. S. Mukhtarova, M. Hamberg // The Biochemical Journalournal. 2000. - V. 352. - P. 501-509.

114. Green, M. T. C-H bond activation in heme proteins: the role of thiolate ligation in cytochrome P450 / M. T. Green // Current Opinion in Chemical Biology.-2009. V. 13.-P. 84-88.

115. Guengerich, F. P. Mechanisms of cytochrome P450 reactions / F. P. Guengerich, E. M. Isin // Acta Chimica Slovenica. 2008. - V. 55. - P. 7-19.

116. Guengerich, F. P. Mechanisms of cytochrome P450 substrate oxidation: MiniReview / F.P. Guengerich // Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. -2007. V. 21.-P. 163-168.

117. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 enzymes / F. P. Guengerich // Comprehensive Toxicology. 2010. - V. 4. - P. 41-76.

118. Hada, T. Discovery of 5R-lipoxygenase activity in oocytes of the surf clam, Spisula solidissima / T. Hada, L. L. Swift, A. R. Brash // Biochimica et Biophysica Acta. 1997. - V. 1346. - P. 109-119.

119. Hamberg, M. A pathway for biosynthesis of divinyl ether fatty acids in green leaves / M. Hamberg // Lipids. 1998. - V. 33. - P. 1061- 1071.

120. Hamberg, M. Absolute configuration of 12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid / M. Hamberg, O. Miersch, G. Sembdner // Lipids. 1988. - V. 23. - P. 521— 524.

121. Hamberg, M. Allene oxide cyclase: a new enzyme in plant lipid metabolism / M. Hamberg, P. Fahlstadius // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1990. -V. 276. - P. 518-526.

122. Hamberg, M. An epoxy alcohol synthase pathway in higher plants: biosynthesis of antifungal trihydroxy oxylipins in leaves of potato / M. Hamberg // Lipids. 1999. - V. 34. - P. 1131-1142.

123. Hamberg, M. Biosynthesis and conversions of fatty acid allene oxides / M. Hamberg, M. A. Hughes // Advances in prostaglandin, thromboxane, and leukotriene research. 1989. - V. 19. - P. 64-69.

124. Hamberg, M. Biosynthesis of 12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid: identification of an allene oxide cyclase / M. Hamberg // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1988. - V. 156. - P. 543-550.

125. Hamberg, M. Biosynthesis of new divinyl ether oxylipins in Ranunculus plants / M. Hamberg // Lipids. 2002. - V. 37. - P. 427-433.

126. Hamberg, M. Hidden stereospecificity in the biosynthesis of divinyl ether fatty acids / M. Hamberg // FEBS Journal. 2005. - V. 272. - P. 736-743.

127. Hamberg, M. Isolation and structures of two divinyl ether fatty acids from Clematis vitalba / M. Hamberg // Lipids. 2004. - V. 39. - P. 565-569.

128. Hamberg, M. Mechanism of corn hydroperoxide isomerase: detection of 12,13(S)-oxido-9(Z),ll-octadecadienoic acid / M. Hamberg // Biochimica et Biophysica Acta. 1987. - V. 920. - P. 76-84.

129. Hamberg, M. New cyclopentenone fatty acids formed from linoleic and linolenic acids in potato / M. Hamberg // Lipids. 2000. - V. 35. - P. 353-363.

130. Hamberg, M. On the specificity of the oxygenation of unsaturated fatty acids catalyzed by soybean lipoxidase / M. Hamberg, B. Samuelsson // The Journal of Biological Chemistry. 1967. - V. 242. - P. 5329-5335.

131. Hamberg, M. Oxylipin pathway to jasmonates: biochemistry and biological significance / M. Hamberg, H. W. Gardner // Biochimica et Biophysica Acta. 1992.-V. 1165.-P. 1-18.

132. Hamberg, M. Synthesis of 3-oxalinolenic acid and beta-oxidation-resistant 3-oxa-oxylipins / M. Hamberg, I. R. Chechetkin, A. N. Grechkin, I. P. de Leyn, C. Castresana, G. Bannenberg // Lipids. 2006. - V. 41. - P. 499-506.

133. Hannemann, F. Cytochrome P450 systems biological variations of electron transport chains / F. Hannemann, A. Bichet, K. M. Ewen, R. Bernhardt // Biochimica et Biophysica Acta. - 2007. - V. 1770. - P. 330-344.

134. Hatanaka, A. The biogeneration of green odour by green leaves / A. Hatanaka//Phytochemistry. 1993. -V. 34. - P. 1201-1218.

135. Hatanaka, A. The fresh green odor emitted by plants / A. Hatanaka // Food Reviews International. 1996. -V. 12. - P. 303-350.

136. Hawkins, D. J. Eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus,contain a prominent (11/?) and (127?) lipoxygenase activity / D. J. Hawkins, A. R. Brash // The Journal of Biological Chemistry. 1987. - V. 262. - P. 7629-7634.

137. Heath, R. J. Roles of the FabA and FabZ b-hydroxyacyl-acyl carrier protein dehydratases in Escherichia coli fatty acid biosynthesis / R. J. Heath, C. O. Rock // The Journal of Biological Chemistry. 1996. - V. 271. - P. 27795-27801.

138. Henikoff, S. Amino acid substitution matrices from protein blocks / S. Henikoff, J. G. Henikoff // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992. -V. 89. - P. 10915-10919.

139. Heydeck, D. On the reaction of wheat lipoxygenase with arachidonic acid and its oxygenated derivatives / D. Heydeck, R. Wiesner, H. Kuhn, T. Schewe // Biomedica biochimica acta. 1991. -V. 50. - P. 11-15.

140. Hofmann, E. The crystal structure of Arabidopsis thaliana allene oxide cyclase: insights into the oxylipin cyclization reaction / E. Hofmann, Ph. Zerbe, F. Schaller // The Plant Cell. 2006. - V. 18. - P. 3201-3217.

141. Holtman, W. L. Lipoxygenase-2 oxygenates storage lipids in embryos of germinating barley / W. L. Holtman, J. C. Vredenbregt-Heistek, N. F. Schmitt, I. Feussner // European Journal of Biochemistry. 1997. - V. 248. - P. 452-458.

142. Hornung, E. Identification of an amino acid determinant of pH regiospecificity in a seed lipoxygenase from Momordica charantia / E. Hornung, S. Kunze, A. Liavonchanka, G. Zimmermann, D. Kuhn, K. Fritsche, A. Renz, H. Kuhn,

143. Feussner // Phytochemistry. 2008. - V. 69. - P. 2774-2780.

144. Howe G. A. Oxylipin metabolism in response to stress / G.A. Howe, A.L. Schilmiller // Current Opininion Plant Biology. 2002. - V. 5. - P. 230-236.

145. Huang, F.-C. Cloning and characterization of a 9-lipoxygenase gene induced by pathogen attack from Nicotiana benthamiana for biotechnological application / F.-C. Huang, W. Schwab // BMC Biotechnology. 2011. - V. 11. - P. 1-15.

146. Huang, J. Mechanisms by which T7 lysozyme specifically regulates T7 RNA polymerase during different phases of transcription / J. Huang, J. Villemain, R. Padilla, R. J. Sousa // Molecular Biology. 1999. - V. 293. - P. 457-475.

147. Huang, L. S. Linoleoyl lysophosphatidic acid and linoleoyl lysophosphatidylcholine are efficient substrates for mammalian lipoxygenases / L. S. Huang, M. R. Kim, T. S. Jeong, D. E. Sok // Biochimica et Biophysica Acta. 2007. -V. 1770.-P. 1062-1070.

148. Huang, L. S. Linoleoyl lysophosphatidylcholine is an efficient substrate for soybean lipoxygenase-1 / L. S. Huang, M. R. Kim, D. E. Sok // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2006. - V. 455. - P. 119-126.

149. Huang, L. S. Regulation of lipoxygenase activity by polyunsaturated lysophosphatidylcholines or their oxygenation derivatives / L. S. Huang, M. R. Kim, D. E. Sok // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008. - V. 56. - P. 78087814.

150. Hughes, M. A. Investigation of the mechanism of biosynthesis of 8-hydroxyeicosatetraenoic acid in mouse skin / M. A. Hughes, A. R. Brash // Biochimica et Biophysica Acta. 1991. - V. 1081. - P. 347-354.

151. Biochemical Journalournal. 2006b. - V. 395. - P. 641-652.

152. Hughes, R. Mutagenesis and modelling of linoleate-binding to pea seed lipoxygenase / R. Hughes, D. Lawson, A. Hornostaj, S. Fairhurst, R. Casey // European Journal of Biochemistry. 2001a. - V. 268. - P. 1030-1040.

153. Humphrey, W. F. VMD Visual Molecular Dynamics / W. F. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten // Journal of Molecular Graphics and Modelling. -1996.-V. 14.-P. 33-38.

154. Inoue, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids / H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama // Gene. 1990. - V. 96. - P. 23-28.

155. Itoh, A. Identification of a jasmonate-regulated allene oxide synthase that metabolizes 9-hydroperoxides of linoleic and linolenic acids / A. Itoh, A. L.

156. Schilmiller, B. C. McCaig, G. A. Howe // The Journal of Biological Chemistry. -2002. V. 277. - P. 46051-46058.

157. Itoh, A. Molecular cloning of a divinyl ether synthase. Identification as a CYP74 cytochrome P-450 / A. Itoh, G. A. Howe // The Journal of Biological chemistry. 2001. -V. 276. - P. 3620-3627.

158. Ivanov, I. Molecular enzymology of lipoxygenases / I. Ivanov, D. Heydeck, K. Hofheinz, J. Roffeis, V. B. O'Donnell, H. Kuhn, M. Walther // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2010. - V. 503. - P. 161-174.

159. Ivanov, I. Structural biology of mammalian lipoxygenases: Enzymatic consequences of targeted alterations of the protein structure /1. Ivanov, M. Walther // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. - V. 338. - P. 93101.

160. Jamieson, G. R. The occurrence of hexadeca-7,10,13-trienoic acid in leaf lipids of angiosperms / G. R. Jamieson, E. H. Reid // Phytochemistry. 1971. -V. 10.-P. 1837-1843.

161. Jang, S. Regiochemical and stereochemical evidence for enzyme-initiated catalysis in dual positional specific maize lipoxygenase-1 / S. Jang, T. Huon, K. Kim, E. Um, O. Han // Organic Letters. 2007. - V. 9. - P. 3113-3116.

162. Javaux, E. J. TEM evidence for eukaryotic diversity in mid-Proterozoic oceans / E. J. Javaux, A. H. Knoll, M. R. Walter // Geobiology. 2004. - V. 2. - P. 121-132.

163. Jiang, Z. D. Novel oxylipins from the temperate red alga Polyneura latissima: evidence for an arachidonate 9(S)- lipoxygenase / Z. D. Jiang, W. H. Gerwick // Lipids. 1997. - V. 32.-P. 231-235.

164. Jiang, Z. D. 5-Lipoxygenasederived oxylipins from the red alga Rhodymeniapertusa / Z. D. Jiang, S. O. Ketchum, W. H. Gerwick // Phytochemistry. -2000. V. 53.-P. 129-133.

165. Kaessmann, H. RNA-based gene duplication: mechanistic and evolutionary insights / H. Kaessmann, N. Vinckenbosch, M. Long // Nature Reviews Genetics. -2009. V. 10.-P. 19-31.

166. Kato, T. Appearance of new lipoxygenases in soybean cotyledons after germination and evidence for expression of a major new lipoxygenase gene / T. Kato, H. Ohta, K. Tanaka, D. Shibata // Plant Physiology. 1992. - V. 98. - P. 324330.

167. Kelly, D. E. The CYPome (Cytochrome P450 complement) of Aspergillus nidulans / D. E. Kelly, N. Krasevec, J. Mullins, D. R. Nelson // Fungal Genetics and Biology. 2009. - V. 46. - P. 53-61.

168. Kemper, B. Structural basis for the role in protein folding of conserved proline-rich regions in cytochromes P450 / B. Kemper // Toxicology and Applied Pharmacology. -2004. -V. 199. P. 305-315.

169. Kim, S. J. An efficient eyelopentenone formation via an allene oxide / S. J. Kim, J. K. Cha // Tetrahedron Letters. 1988. - V. 29. - P. 5613-5616.

170. Kishimoto, K. Components of C6-aldehyde-induced resistance in Arabidopsis thaliana against a necrotrophic fungal pathogen, Botrytis cinerea / K. Kishimoto, K. Matsui, R. Ozawa, J. Takabayashi / Plant Science. 2006. - V. 170. -P. 715-723.

171. Knapp, M. J. Kinetic studies of oxygen reactivity in soybeanlipoxygenase-1 / M. J. Knapp, J. P. Klinman // Biochemistry. 2003. - V. 42. - P. 11466-11475.

172. Knapp, M. J. Steric control of oxygenation regiochemistry in soybean lipoxygenase-1 / M. J. Knapp, F. P. Seebeck, J. P. Klinman // Journal of the American Chemical Society. -2001. -V. 123. P. 2931-2932.

173. Koda, Y. Possible involvement of jasmonic acid in various morphogenic events / Y. Koda // Physiologia Plantarum. 1997. - V. 100. - P. 639-646.

174. Koljak, R. Identification of a naturally occurring peroxidase-lipoxygenase fusion protein / R. Koljak, O. Boutaud, B.-H. Shieh, N. Samel, A. R. Brash // Science. 1997. - V. 277. - P. 1994-1996.

175. Kuhn, H. Structural basis for the positional specificity of lipoxygenases / H. Kuhn // Prostaglandins & Other Lipid Mediators. 2000. - V. 62. - P. 255-270.

176. Kuhn, H. Structural biology of mammalian lipoxygenases: enzymatic consequences of targeted alterations of the protein structure / H. Kuhn, J. Saam, S. Eibach, H. G. Holzhutter, I. Ivanov, M. Walther // Biochemical and Biophysical

177. Research Communications. 2005. - V. 338. - P. 93-101.

178. Lambert, C. ESyPred3D: prediction of proteins 3D structures / C. Lambert, N. Leonard, X. De Bolle, E. Depiereux // Bioinformatics. 2002. - V. 18. -P. 1250-1256.

179. Lang I, A lipoxygenase with linoleate diol synthase activity from Nostoc sp. PCC 7120 /1. Lang, C. Gobel, A. Porzel, I. Heilmann, L.Feussner // Biochemical Journal. 2008 - V. 410(2) - P. 347-357.

180. Laudert, D. Allene oxide synthase: a major control point in Arabidopsis thaliana octadecanoid signalling / D. Laudert, E. W. Weiler // Plant Journal. 1998. -V. 15.-P. 675-684.

181. Lee, D. S. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosynthesis enzymes / D. S. Lee, P. Nioche, M. Hamberg, C. S. Raman // Nature. -2008. V. 455. - P. 363-370.

182. Li, Y. The biosynthesis of cutin and suberin as an alternative source of enzymes for the production of bio-based chemicals and materials / Y. Li, F. Beisson // Biochimie. 2009. - V. 91. - P. 685-691.

183. Liavonchanka, A. Lipoxygenases: Occurrence, functions and catalysis / A. Liavonchanka, I. Feussner // Journal of Plant Physiology. 2006. - V. 163. - P. 348—357.

184. Lindberg, R. L. Alteration of mouse cytochrome P450coh substratespecificity by mutation of a single amino-acid residue / R. L. Lindberg, M. Negishi // Nature 1989. - V. 339. - P. 632-634.

185. Liitcke, H. A. Selection of AUG initiation codons differs in plants and animals / H. A. Liitcke, K. C. Chow, F. S. Mickel, K. A. Moss, H. F. Kern, G. A. Scheele // The EMBO Journal. 1987. - V. 6. - P. 43^18.

186. Maccarone, M. In vitro oxygenation of soybean biomembranes by lipoxygenase-2 / M. Maccarone, P. G. M. van Aarle, G. A. Veldink, J. F. G. Vliegenthart // Biochimica et Biophysica Acta. 1994. - V. 1190. - P. 164-169.

187. Martinis, S. A. A conserved residue of cytochrome P—450 is involved in heme-oxygen stability and activation / S. A. Martinis, W. M. Atkins, P. S. Stayton, S. G. Sligar // Journal of the American Chemical Society. 1989. - V. 111. - P. 9252-9253.

188. Matsui, K. Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is a cytochrome P450 (CYP74B) / K. Matsui, M. Shibutani, T. Hase, T. Kajiwara // FEBS Letters. 1996. - V. 394. - P. 21-24.

189. Matsui, K. Fatty acid 9- and 13-hydroperoxide lyases from cucumber / K. Matsui, C. Ujita, S. Fujimoto, J. Wilkinson, B. Hiatt, V. Knauf, T. Kajiwara, I. Feussner // FEBS Letters. 2000. - V. 481. - P. 183-188.

190. Maucher, H. Allene oxide synthases of barley (Hordeum vulgare cv. Salome): tissue specific regulation in seedling development / H. Maucher, B. Hause , I. Feussner, J. Ziegler, C. Wasternack // The Plant Journal. 2000. - V. 21. - P. 199213.

191. McConn, M. The critical requirement for linolenic acid is pollen development, not photosynthesis, in an Arabidopsis mutant / M. McConn, J. Browse // Plant Cell. 1996. - V. 8. - P. 403^16.

192. McGrath, M. E. Crystal structure of phenylmethanesulfonyl fluoride-treated human chymase at 1.9 A / M. E. McGrath, T. Mirzadegan, B. F. Schmidt // Biochemistry. 1997. -V. 36. - P. 14318-14324.

193. Meyer, A. Occurrence of the plant growth regulator jasmonic acid in plants / A. Meyer, O. Miersch, C. Buttner, W. Dathe, G. Sembdner // Journal of Plant Growth Regulation. 1984. - V. 3. - P. 1-8.

194. Minor, W. Crystal structure of soybean lipoxygenase L-l at 1.4 A resolution / W. Minor, J. Steczko, B. Stec, Z. Otwinowski, J. T. Bolin, R. Walter, B. Axelrod // Biochemistry. 1996. -V. 35. -P. 10687-10701.

195. Mizuno, K. A new 9-lipoxygenase cDNA from developing rice seeds / K. Mizuno, T. Iida, A. Takano, M. Yokoyama, T. Fujimura // Plant and Cell

196. Physiology.-2003.-V. 44.-P. 1168-1175.

197. Mizutani, M. Unusual P450 reactions in plant secondary metabolism / M. Mizutani, F. Sato // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2011. - V. 507. -P. 194-203.

198. Mongrand, S. Chemotaxonomy of the Rubiaceae family based on leaf fatty acid composition / S. Mongrand, A. Badoc, B. Patouille, C. Lacomblez, M. Chavent, J. J. Bessoule // Phytochemistry. 2005. - V. 66. - P. 549-559.

199. Morant, M. Plant cytochromes P450: tools for pharmacology, plant protection and phytoremediation / M. Morant, S. Bak, B. L. Moller, D. Werck-Reichhart // Current Opinion of Biotechnology. 2003. - V. 14. - P. 1511-1562.

200. Mosblech, A. Oxylipins: structurally diverse metabolites from fatty acid oxidation / A. Mosblech, I. Feussner, I. Heilmann // Plant Physiology and Biochemistry. 2009. - V. 47. - P. 511-517.

201. Mueller, M. J. Signaling in the elicitation process is mediated through the octadecanoid pathway leading to jasmonic acid / M. J. Mueller, W. Brodschelm,

202. E. Spannagl, M. H. Zenk // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1993. - V. 90. - P. 7490-7494.

203. Mukhtarova, L. S. Hydroperoxide lyase cascade in pea seedlings: nonvolatile oxylipins and their age and stress dependent alterations / L. S. Mukhtarova,

204. F. K. Mukhitova, Y. V. Gogolev, A. N. Grechkin // Phytochemistry. 2011. - V. 72. -P. 356-364.

205. Murray, J. J. Rabbit reticulocyte lipoxygenase catalyzes specific 12(5) and 15(5) oxygenation of arachidonoyl-phosphatidylcholine / J. J. Murray, A. R. Brash // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1988. - V. 265. - P. 514-523.

206. Nagano, S. Crystallographic study on the dioxygen complex of wildtype and mutant cytochrome P450cam / S. Nagano, T. L. Poulos // The Journal of Biological Chemistry. -2005. -V. 280. P. 31659-31663.

207. Narvaez-Vasquez, J. Positional specificity of a phospholipase A2 activity induced by wounding, systemin, and oligosaccharide elicitors in tomato leaves / J. Narvaez-Vasquez, J. Florin-Christensen, C. A. Ryan // Plant Cell. 1999. -V. 11.-P. 2249-2260.

208. Nawrath, C. Pathways for the synthesis of polyesters in plants: cutin, suberin, and polyhydroxyalkanoates / C. Nawrath, Y. Poirier // Advances in Plant Biochemistry and Molecular Biology. 2008. - V. 1. - P. 201-239.

209. Neau, D. B. The 1.85 A structure of an 8^-lipoxygenase suggests a general model for lipoxygenase product specificity / D. B. Neau, N. C. Gilbert, S. G. Bartlett, W. Boeglin, A. R. Brash, M. E. Newcomer // Biochemistry. 2009. - V. 48. -P. 7906-7915.

210. Nei, M. Molecular Evolution and Phylogenetics / M. Nei, S. Kumar -New York.: Oxford University Press, 2000 - 340 p.

211. Nelson, D. R. A P450-centric view of plant evolution / D. R. Nelson, D. Werck-Reichhart // The Plant Journal. 2011. - V. 66. - P. 194-211.

212. Nelson, D. R. Cytochrome P450 and the individuality of species / D. R. Nelson // Arch. Biochem. Biophys. 1999. - V. 369. - P. 1-10.

213. Nelson, D. R. Cytochrome P450 nomenclature / D. R. Nelson // Biomedical and Life Sciences. 2004. - V. 107. - P. 14-24.

214. Nelson, D. R. The cytochrome P450 genesis locus: the origin and evolution of animal cytochrome P450s / D. R. Nelson, J. V. Goldstone, J. J. Stegeman // Philosophical Transactions of The Royal Society B. 2013. - V. 368. -P. 1-22.

215. Nelson, M. J. Structural characterization of alkyl and peroxyl radicals in solutions of purple lipoxygenase / M. J. Nelson, R. A. Cowling, S. P. Seitz // Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 4966-4973.

216. Noordermeer, M. A. Fatty acid hydroperoxide lyase: a plant cytochrome P450 enzyme involved in wound healing and pest resistance / M. A. Noordermeer, G. A. Veldink, J. F. Vliegenthart // ChemBioChem. 2001. - V. 2. - P. 494-504.

217. Ogorodnikova, A. V. Detection of divinyl ether synthase in Lily-of-the-Valley {Convallaria majalis) roots / A. V. Ogorodnikova, L. R. Latypova, F. K. Mukhitova, L. S. Mukhtarova, A. N. Grechkin // Phytochemistry. 2008. - V. 69. -P. 2793-2798.

218. Ohno S. Evolution by gene duplication / S. Ohno. New York: Springer-Verlag, 1970.-P. 160.

219. Oldham, M. Insights from the X-ray crystal structure of coral 8R— lipoxygenase: calcium activation via A C2-like domain and a structural basis of product chirality / M. Oldham, A. Brash, M. Newcomer // J Biol Chem. 2005a. -V. 280.-P. 39545-39552.

220. Omura, T. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. evidence for its hemoprotein nature / T. Omura, R. Sato // The Journal of Biological Chemistry. 1964. - V. 239. - P. 2370-2378.

221. Ou, W. B. Molecular mechanism for osmolyte protection of creatine kinase against guanidine denaturation / W. B. Ou, Y. D. Park, H. M. Zhou / European Journal of Biochemistry. 2001. - V. 268. - P. 5901-5911.

222. Paquette, S. M. Intron-exon organization and phylogeny in a large superfamily, the paralogous cytochrome P450 genes of Arabidopsis thaliana / S. M. Paquette, S. Bak, R. Feyereisen // DNA Cell Biology. 2000. - V. 19. - P. 307-317.

223. Peña-Cortes, H. Aspirin prevents wound-induced gene-expression in tomato leaves by blocking jasmonic acid biosynthesis / H. Peña-Cortes, T. Albrecht, S. Prat, E. W. Weiler, L. Willmitzer // Planta. 1993. - V. 191. - P. 123-128.

224. Perez-Gilabert M. Oxidation of dilinoleoyl phosphatidylcholine by lipoxygenase 1 from soybeans / M. Perez-Gilabert, G. A. Veldink, J. F. Vliegenthart // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1998. - V. 354. - P. 18-23.

225. Picado-Leonard, J. Homologous sequences in steroidogenic enzymes, steroid receptors and a steroid binding protein suggest a consensus steroid-binding sequence / J. Picado-Leonard, W. L. Miller // Molecular Endocrinology. 1988.1. V. 2.-P. 1145-1150.

226. Piotrowska, A. Conjugates of abscisic acid, brassinosteroids, ethylene, gibberellins, and jasmonates / A. Piotrowska, A. Bajguz // Phytochemistry. 2011. -V. 72.-P. 2097-2112.

227. Piotrowska, A. Jasmonic acid as modulator of lead toxicity in aquatic plant Wolffia arrhiza (Lemnaceae) / A. Piotrowska, A. Bajguz, B. Godlewska-Zylkiewicz, R. Czerpak, M. Kaminska // Environmental and Experimental Botany. -2009.-V. 66.-P. 507-513.

228. Porta, H. Lipoxygenase in bacteria: a horizontal transfer event? / H. Porta, M. Rocha-Sosa // Microbiology. 2001. - V. 147. - P. 3199-3200.

229. Posada, D. Selecting the best-tif model of nucleotide substitution / D Posada, K. A. Crandall // Systems Biology. 2001. - V. 50. - P. 580-601.

230. Poulos, T. L. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam / T. L. Poulos, B. C. Finzel, A. J. Howard // Journal of Molecular Biology. 1987. -V. 195.-P. 687-700.

231. Poulos, T. L. Structures of cytochrome P450 enzymes / T. L. Poulos, E. F. Johnson // Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (3d ed.) / P.R. Ortiz de montellano NY: Plenum Press, 2005 - P. 87-114.

232. Poulos, T. L. The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450 / T. L. Poulos, B. C. Finzel, I. C. Gunsalus, G. C. Wagner, J. Kraut// The Journal of Biological Chemistry. 1985. -V. 260. - P. 16122-16130.

233. Prigge, S. T. Structure conservation in lipoxygenases: structural analysis of soybean lipoxygenase- 1 and modeling of human lipoxygenases / S. T. Prigge, J.

234. C. Boyington, B. J. Gaffhey, L. M. Amzel // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 1996. - V. 24. - P. 275-291.

235. Proteau, P. J. Divinyl ethers and hydroxy fatty acids from three species of Laminaria (brown algae) / P. J. Proteau, W. H. Gerwick // Lipids. 1993. - V. 28. - P. 783-787.

236. Quaglia, M. Role of pathogen-induced volátiles in the Nicotiana tabacum-Golovinomyces cichoracearum interaction / M. Quaglia, M. Fabrizi, A. Zazzerini, C. Zadra // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. - V. 52. - P. 920.

237. Regdel, D. On the reaction specificity of the lipoxygenase from tomato fruits / D. Regdel, H. Kuhn, T. Schewe // Biochimica et Biophysica Acta. 1994. -V. 1210.-P. 297-302.

238. Rensing, S. A. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants / S. A. Rensing, D. Lang, A. D. Zimmer, A. Terry, A. Salamov et al. // Science. 2008. - V. 319. - P. 64-69.

239. Riendeau, D. Pseudoperoxidase activity of 5-lipoxygenase stimulated by potent benzofuranol and N-hydroxyurea inhibitors of the lipoxygenase reaction /

240. D. Riendeau, J. P. Falgueyret, J. Guay, N. Ueda, S. Yamamoto // The Biochemical Journal. 1991. - V. 274. - P. 287-292.

241. Rzhetsky, A. A simple method for estimating and testing minimum evolution trees / A. Rzhetsky, M. Nei // Molecular Biology and Evolution. 1992. -V. 9.-P. 945-967.

242. Saitou, N. The neighbor-joining mrthod: a new method for reconstruction phylogenetic trees / N. Saitou, M. Nei // Molecular Biology and Evolution. 1987. - V. 4. - P. 426-425.

243. Samuelsson, B. Leukotrienes and lipoxins: structures, biosynthesis, and biological effects / B. Samuelsson, S. E. Dahlen, J. A. Lindgren, C. A. Rouzer, C. N. Serhan // Science. 1987. - V. 237. - P. 1171-1176.

244. Schaller, A. Enzymes in jasmonate biosynthesis structure, function, regulation / A. Schaller, A. Stintzi // Phytochemistry. - 2009. - V. 70. - P. 15321538.

245. Schenkman, J. B. Spectral analyses of cytochromes P450 / J. B. Schenkman, I. Jansson // Methods in Molecular Biology. 2006. - V. 320. - P. 1118.

246. Schewe, T. Enzymology and physiology of reticulocyte lipoxygenase: comparison with other lipoxygenases / T. Schewe, S. M. Rapaport, H. Kuhn // Advances in enzymology and related areas of molecular biology. 1986. - V. 58. P. 191-272.

247. Schimind, W. M. CapSelect: a highly sensitive method for 5' CAP dependent enrichment of full length cDNA in PCR mediated analysis of mRNAs / W. M. Schimind, M. W. Mueller // Nucleic Acids Research. 1999. - V. 21 - P. 31 -32.

248. Schlichting, I. The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomicresolution /1. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A. M. Stock, S. A. Maves et al. // Science. 2000. - V. 287. - P. 1615-1622.

249. Schneider, C. Catalytic properties of allene oxide synthase from flaxseed (Linum usitatissimum L.) / C. Schneider, P. Schreier // Lipids. 1998. - V. 33.-P. 191-196.

250. Shibata, D. . Primary structure of soybean lipoxygenase L-2 / D. Shibata, J. Steczko, J. E. Dixon, P. C. Andrews, M. Hermodson, B. Axelrod // The Journal of Biological Chemistry. 1988. -V. 263. - P. 6816-6821.

251. Shibata, D. Nucleotide sequences of a soybean lipoxygenase gene and the short intergenic region between an upstream lipoxygenase gene / D. Shibata, T. Kato, K. Tanaka // Plant Molecular Biology. 1991. - V. 16. - P. 353-359.

252. Sirim, D. Prediction and analysis of the modular structure of cytochrome P450 monooxygenases / D. Sirim, M. Widmann, F. Wagner, J. Pleiss // BMC Structural Biology. 2010. - V. 10. - P. 1-12.

253. Sivasankar, S. B. Expression of allene oxide synthase determines defense gene activation in tomato / S. B. Sivasankar, B. Sheldrick, S. J. Rothstein // Plant Physiology. 2000. - V. 122. - P. 1335-1342.

254. Skrzypczak-Jankun, E. Structure of soybean lipoxygenase L3 and a comparison with its LI isoenzyme / E. Skrzypczak-Jankun, L.M. Amzel, B.A. Kroa, M.O.J. Funk // Proteins. 1997. -V. 29. P. 15-31.

255. Skrzypczak-Jankun, E. Three-dimensional structure of a purple lipoxygenase / E. Skrzypczak-Jankun, R. A. Bross, R. T. Carroll, W. R. Dunham, M. O. Funk // Journal of the American Chemical Society. 2001. - V. 123. - P. 1081410820.

256. Sloane, D. L. A primary determinant for lipoxygenase positional specificity / D. L. Sloane, R. Leung, C. S. Craik, E. Sigal // Nature. 1991. - V. 354. -P. 149-152.

257. Song, W. C. Purification of an allene oxide synthase and identification of the enzyme as a cytochrome P-450 / W. C. Song, A. R. Brash // Science. 1991. - V. 253.-P. 781-784.

258. Stumpe, M. A pathogen-inducible divinyl ether synthase (CYP74D) from elicitor-treated potato suspension cells / M. Stumpe, R. Kandzia, C. Gobel, S. Rosahl, I. Feussner // FEBS Letters. 2001. - V. 507. - P. 371-376.

259. Stumpe, M. Divinyl ether synthesis in garlic bulbs / M. Stumpe, J.-G. Carsjens, C. Gobel, I. Feussner // Journal of Experimental Botany. 2008. - V. 59. -P. 907-915.

260. Stumpe, M. Formation of oxylipins by CYP74 enzymes / M. Stumpe, I. Feussner // Phytochemistry Review. 2006. - V. 5. - P. 347-357.

261. Sudharshan E. Involvement of cysteine residues and domain interactions in the reversible unfolding of lipoxygenase-1 / E. Sudharshan, A. G. Rao // The Journal of Biological Chemistry. 1999. - V. 274. - P. 35351-35358.

262. Suza, W. P. Exploring the impact of wounding and jasmonates on ascorbate metabolism / W. P. Suza, C. A. Avila, K. Carruthers, S. Kulkarni, F. L. Goggin, A. Lorence // Plant Physiology and Biochemistry. 2010. - V. 48. - P. 337-350.

263. Tijet, N. Aliéné oxide synthases and aliéné oxide / N. Tijet, A.R. Brash // Prostaglandins Other Lipid Médiat. 2002. - V. 68-69. - P. 423^132.

264. Tromas, A. Recent progress in auxin biology / A. Tromas, C. Perrot-Rechenmann // Comptes Rendus Biologies. 2010. - V. 333. - P. 297-306.

265. Ullrich, V. Thoughts on thiolate tethering. Tribute and thanks to a teacher / Archives of Biochemistry and Biophysics. 2003. - V. 409. - P. 45-51.

266. Vick, B. A. Biosynthesis of jasmonic acid by several plant species / B. A. Vick, D. C. Zimmerman//Plant Physiology. 1984. -V. 75. - P. 458^61.

267. Vick, B. A. Formation of 12-18-0.oxo-cis-10, cis-15-phytodienoic acid from 13[18-0]hydroperoxylinolenic acid by hydroperoxide cyclase / B. A. Vick, P. Feng, D. C. Zimmerman // Lipids. 1980. - V. 15. - P. 468-471.

268. Vick, B. A. Pathways of fatty acid hydroperoxide metabolism in spinach leaf chloroplasts / B. A. Vick, D. C. Zimmerman // Plant Physiology. 1987. - V. 85.-P. 1073-1078.

269. Weber, H. Dinor-oxo-phytodienoic acid: a new hexadecanoid signal in the jasmonate family / H. Weber, B. A. Vick, E. E. Farmer // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1997. - V. 94. - P. 10473-10478.

270. Weber, H. Divinyl ether fatty acid synthesis in late blight-diseased potato leaves / H. Weber, A. Chetelat, D. Caldelari, E. E. Farmer // The Plant Cell. -1999.-V. 11.-P. 485—493.

271. Wellman C.H. The invasion of the land by plants: when and where? /

272. Wellman, C.H. // New Phytologist. 2010. - V. 188. - P. 306-309.

273. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450 : physiology and molecular biology / D. Werck-Reichhart, S. Bak, S. Paquette // The Arabidopsis Book / C.R. Somerville, E.M. Meyerowitz. Rockville, MD: American Society of Plant Biologists. - 2002. - P. 1-28.

274. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450: a success story / D. Werck-Reichhart, R. Feyereisen // Genome Biology. 2000. - V. 1. - P. 1-7.

275. Whelan, S. A general empirical model of protein evolution derived from multiple protein families using a maximum-likelihood approach / S. Whelan, N Goldman // Molecular Biology and Evolution. 2001. - V. 18. - P. 691-699.

276. Williams, P. A. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity / P. A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E. F. Johnson, D. E. McRee // Molecular Cell. 2000. - V. 5.-P. 121-131.

277. Wilson, R. A. Cultivar-dependent expression of a maize lipoxygenase responsive to seed infesting fungi / R. A. Wilson, H. W. Gardner, N. P. Keller // MPMI. 2001. - V. 14.-P. 980-987.

278. Xu, Y. Upregulation of a tonoplast-localized cytochrome P450 during petal senescence in Petunia inflata / Y. Xu, H. Ishida, D. Reisen, M.R. Hanson // BMC Plant Biology. 2006. - V. 6. - P. 1-18.

279. Yamamoto, S. Arachidonate 12-lipoxygenases / S. Yamamoto, H. Suzuki, N. Ueda // Progress in Lipid Research. 1997. - V. 36. - P. 23^1.

280. Yamamoto, S. Mammalian lipoxygenases: molecular structures and functions / Biochimica et Biophysica Acta. 1992. - V. 1128. - P. 117-131.

281. Yao, M. mRNA expression profiles of P450 3A enzymes in the liver and small intestine of the domestic pig / M. Yao, M. Dai, Z. Liu, W. Cui, D. Li, H. Zhanq, J. Li, Y. Liu, Z. Yuan // Research in Veterinary Science. 2012. - V. 93. - P. 360-365.

282. Zhang X. Mechanism of inhibition of bacteriophage T7 RNA polymerase by T7 lysozyme / X. Zhang, F. W. Studier // Journal of Molecular Biology. 1997. - V. 269. - P. 10-27.

283. Zhang, L. Y. Specificity of two lipoxygenases from rice: unusual regiospecificity of a lipoxygenase isoenzyme / L. Y. Zhang, M. Hamberg // Lipids.1996.-V. 31.-P. 803-809.

284. Zharkikh, A. Estimatin of confidence in phylogeny: the complete-and-partial bootstrap technique / A. Zharkikh, W. H. Li // Molecular Phylogenetics and Evolution. 1995. - V. 4 - P. 44-63.

285. Ziegler, J. On the specificity of allene oxide cyclase / J. Ziegler, C. Wasternack, M. Hamberg // Lipids. 1999. - V. 34. - P. 1005-1015.

286. Ziegler, J. Purification and characterization of allene oxide cyclase from dry corn seeds / J. Ziegler, M. Hamberg, O. Miersh, B. Parthier // Plant Physiology.1997.-V. 114.-P. 565-573.

287. Zimmer, A. Dating the early evolution of plants: detection and molecular clock analyses of orthologs. / A. Zimmer, D. Lang, S. Richardt, W. Frank, R. Reski, S. A. Rensing // Mol. Genet. Genomics. 2007. - V. 278. - P. 393-402.

288. Zimmerman, D. C. Characterization of a prostaglandin-like metabolite of linolenic acid produced by a flaxseed extract / D. C. Zimmerman, P. Feng // Lipids.- 1977.-V. 13.-P. 313-316.

289. Zimmerman, D. C. Identification of traumatin, a wound hormone, as 12-oxo-trans-10—dodecenoic acid / D. C. Zimmerman, C. A. Coudron // Plant Physiology. 1979.-V. 63.-P. 536-541.

290. Zimmerman, D. C. A new product of linoleic acid oxidation by a flaxseed enzyme / D. C. Zimmerman // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1966. - V. 23. - P. 398-^02.