Ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и их роль в защитной системе растения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Парфенов, Игорь Александрович

• Парфенов, Игорь Александрович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Парфенов, Игорь Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

2.1. СТРУКТУРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И МЕХАНИЗМ ИХ ДЕЙСТВИЯ

2.2. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ

2.2.1. Классификация и распространение

2.2.2. Молекулярная структура ингибиторов протеиназ

2.2.3. Механизм действия ингибиторов протеиназ

2.2.4. Ингибиторы сериновых протеиназ

2.2.5. Геномная организация генов, кодирующих ингибиторы протеиназ в растениях

2.2.6. Семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца (8КТ1)

2.2.7. Ингибиторы протеиназ из картофеля

2.2.8. Функции ингибиторов протеиназ в растениях

2.2.8.1. Запасные белки растений

2.2.8.2. Участие в контроле эндогенных ферментов

2.2.8.3. Участие в защитных механизмах

2.2.9. Заключение

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Оборудование

3.2. Реактивы и расходные материалы

3.3. Методы

3.3.1. Выделение и очистка белкового ингибитора

3.3.1.1. Осаждение белков из клубней картофеля

3.3.1.2. Гель хроматография водорастворимых белков

3.3.1.3. Ионообменная хроматография белков

3.3.1.4. Определение концентрации белка

3.3.2. Определение ингибирующей активности белков по отношению к протеиназам

3.3.3. Ds-Na-ПААГ-Электрофорез

3.3.4. Определение массы ингибитора и его комплексов

3.3.5. Определение N-концевой последовательности белка

3.3.6. Определение термо - и pH-стабильности белка

3.3.7. Определение фунгицидной активности белка-ингибитора

3.3.8. Выделение РНК

3.3.9. Амплификация кДНК с помощью ОТ-ПЦР

3.3.10. Клонирование продуктов ПЦР

3.3.11. Выделение плазмидной ДНК

3.3.12. Электрофорез ДНК

3.3.13. Секвенирование продуктов ПЦР

3.3.14. Программное обеспечение, использованное для обработки результатов секвенирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей амплифицированных генов

3.3.15. Гетерологичная экспрессия белка

3.3.15.1. Создание генно-инженерной конструкции

3.3.15.2. Трансформация клеток E.coli экспрессионной плазмидой

3.3.15.3. Оптимизация условий экспрессии

3.3.15.4. Препаративная экспрессия

3.3.16. Выделение и очистка рекомбинантного белка РКРЫ-В

3.3.16.1. Ренатурация белка РКРП-В

3.3.16.2. Хроматография рекомбинантного белка

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выделение и очистка белка-ингибитора а-химотрипсина

4.2. Определение молекулярной массы ингибитора и его комплексов с а-химотрипсином и трипсином

4.3. Определение К-концевой последовательности

4.4. Определение рН и термостабильности

4.5. Изучение фунгицидной активности белка РКС1

4.6. Клонирование геномных нуклеотидных последовательностей, кодирующих ингибиторы РКР1-В в картофеле сорта Юбилей Жукова

4.7.Гетерологичная экспрессия белка РКРИ-В

4.8. Аминокислотная последовательность белка РКС1

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ ЕС — классификация ферментов

SKTI - соевый ингибитор трипсина Кунитца (soybean Kunitz trypsin inhibitor)

PKPI - картофельные ингибиторы протеиназ типа Кунитца (potato Kunitz-type proteinase inhibitors)

BBI - ингибитор Бауман-Бирк (Bowman-Birk inhibitor)

PI-I - картофельный ингибитор I (potato inhibitor I)

PI-II - картофельный ингибитор II (potato inhibitor II)

BTI - ингибитор трипсина из ячменя (barley trypsin inhibitor)

SSI - ингибитор субтилизина из стрептомицетов {Streptomyces subtilisin inhibitor)

BPTI - ингибитор трипсина из панкреаса быка (bovine pancreatic Kunitz-type trypsin inhibitor)

CHFI - ингибитор фактора Хагемана из кукурузы (corn Hageman factor inhibitor)

SFTI-I - ингибитор трипсина из подсолнуха (sunflower trypsin inhibitor)

OMSVP3 — третий домен овомукоида выделенный из индейки (third domains of silver pheasant and turkey ovomucoid inhibitor)

CMTI - ингибитор трипсина из тыквы (Cucurbita maxima trypsin inhibitor) IP-3 - ингибитор пепсина 3 из Ascaris suum (Inhibitor of pepsine 3) WAP - сывороточный кислый белок (whey acidic protein)

TIMP - тканевый ингибитор металлопротеиназ (tissue inhibitor metallo-proteinase)

Tap - антикоагулянтный пептид клеща (tick anticoagulant peptide)

MIT - ингибитор трипсина из горчицы (Sinapis alba L.) (mustard inhibitor of trypsin)

WCI - ингибитор химотрипсина из крылатых бобов (winged bean chymotrypsin inhibitor)

МЖК - метилжасмоновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция

ETI - ингибитора трипсина из эритрины Erythrina caffra (Erythrina trypsin inhibitor)

HLE - эластаза из лейкоцитов человека (human leukocyte elastase)

HNE - эластаза из нейтрофилов человека (human neutrophil elastase)

PPE - панкреатическая эластаза свиньи (porcine pancreatic elastase)

Трис - трисгидроксиметиламинометан

Ds-Na - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

ПСА - персульфат аммония

ТЭМЭД - тетраметилэтилендиамид

ВЭЖХ - высокоэффективная гель-хроматография

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и их роль в защитной системе растения»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Протеолитические ферменты (протеиназы, протеазы или пептидазы) - это группа ферментов, которые катализируют гидролиз пептидных связей в белках и пептидах. Они необходимы для жизнедеятельности всех организмов [58]. Очевидно, что регулирование активности протеиназ имеет решающее значение в обмене веществ животных и растений. Один из путей регуляции протеолитических ферментов включает присутствие в клетках животных, растений и микроорганизмов специфических молекул, подавляющих их активность, в том числе и белковой природы. Белки-ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, число видов которых составляет около двух тысяч [148, 176].

Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что структуры молекул белковых ингибиторов протеиназ, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [6, 50]. В связи с этим, изучение новых белковых ингибиторов представляет особый интерес.

В настоящее время известно несколько тысяч аминокислотных последовательностей белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [176]. Несмотря на то, что установлена структура большого числа ингибиторов и механизмы их взаимодействия с протеиназами, для большинства из них точная физиологическая функция не установлена или является малоизученной. Считается, что ингибиторы протеиназ принимают непосредственное участие в регуляции многих биохимических процессов [222]. Так, в растениях они могут обладать несколькими функциями:

выступать в роли запасных белков, контролировать активность эндогенных протеиназ, а также участвовать в защитных реакциях растений. Показано, что белки-ингибиторы растений способны in vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [15, 134, 153, 214]. В связи с развитием современных методов молекулярной биологии и генной инженерии по созданию растений, устойчивых к действию патогенов, изучение белков ингибиторов имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение для сельского хозяйства.

К настоящему времени проведено много исследований и накоплено

достаточное количество данных о белках-ингибиторах, присутствующих в

клубнях картофеля {Solanum tuberosum L.), который является одной из

важнейших мировых сельскохозяйственных культур [32]. Часть этих белков

объединяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz-type

proteinase inhibitors). Установлено, что белки PKPI представлены

многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и С-

концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере,

пять структурных групп, три из которых - PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C -

относительно хорошо изучены [19, 32, 94, 107]. Однако структурные

особенности белков PKPI, определяющие специфичность их взаимодействия с

различными ферментами остаются малоизученными. Несмотря на то, что

накоплено достаточное количество данных о свойствах белков PKPI,

выделенных из клубней различных сортов картофеля, их первичная структура,

как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных

аминокислотных последовательностей белков PKPI восстановлено по

кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически

отсутствуют данные об их свойствах. Таким образом, исследование

взаимосвязи структуры и свойств новых белков PKPI является актуальной

задачей современной биохимии. Кроме того, информация о структуре и

8

функциях ранее не изученных белков, принадлежащих к данному семейству, а также генов, кодирующих их, представляет значительный интерес, поскольку позволит судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.

Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение из клубней картофеля сорта Юбилей Жукова и характеристика новых белков, действующих как высокоэффективные ингибиторы сериновых протеиназ, и кодирующих их генов, а также исследование взаимосвязи структуры и специфичности действия продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи.

1. Провести скрининг белков, обладающих способностью ингибировать сериновые протеиназы, в клубнях картофеля нового сорта Юбилей Жукова, созданного российскими селекционерами. Исходя из полученных данных, идентифицировать белки, относящиеся к подсемейству PKPI.

2. Выделить высокоэффективный ингибитор сериновых протеиназ подсемейства PKPI, охарактеризовать специфичность его действия на протеолитические ферменты: а-химотрипсин, трипсин, субтилизин и папаин. Установить N-концевую последовательность нового белка, изучить его физико-химические свойства и возможное участие в защитной системе картофеля.

3. Выделить и охарактеризовать кДНК, кодирующую новый белок, выделенный из клубней картофеля. Для этого синтезировать олиго-праймеры для амплификации кДНК из генома картофеля.

4. Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии выделенной кДНК в Escherichia coli. Получить рекомбинантный белок, кодируемый новой, ранее неизвестной кДНК, и охарактеризовать специфичность его действия на протеиназы.

Научная новизна и практическая значимость работы; Из картофеля

сорта Юбилей Жукова впервые был выделен и охарактеризован белок,

9

обозначенный PKCI, который одинаково эффективно действовал на а-химотрипсин и трипсин и обладал способностью одновременно связывать оба фермента, образуя с ними тройные комплексы.

Установлена N-концевая последовательность белка PKCI, что позволило отнести его к структурной группе PKPI-B. Исследованы физико-химические свойства белка PKCI и показано, что он обладает высокой термо- и рН-стабильностью. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Вагу, поражающих растения картофеля. Это свидетельствует о возможном его участии в защитной системе растения.

Определена нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей белок PKCI в геноме картофеля. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки структурной группы PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5'-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

Разработан метод экспрессии кДНК PKPIJ-B в Е. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделен, очищен и охарактеризован рекомбинантный белок PKPIJ-B, кодируемый в геноме картофеля сорта Юбилей Жукова кДНК PKPIJ-B. Показано, что рекомбинантный белок одинаково эффективно подавляет активность химотрипсина и трипсина и так же, как и белок PKCI, обладает способностью образовывать с этими ферментами тройные комплексы. Сделано заключение, что белок PKPIJ-B идентичен белку PKCI, который кодируется в геноме картофеля кДНК PKPIJ-В. Это открывает возможности использования выделенной кДНК для создания трансгенных растений, устойчивых к действию фитопатогенных микроорганизмов.

Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы РКР1-В позволило высказать достаточно обоснованное заключение о природе и локализации реактивного центра связывания а-химотрипсина в С-концевой части молекулы белка РКС1, расположенной между остатками Суз147 и Суз 164. Таким образом, выделенный белок РКС1, является «двуглавым» ингибитором трипсина и а-химотрипсина, который содержит два независимых и одновременно действующих реактивных центра. В состав первого реактивного центра, расположенного в Ы-концевой части молекулы ингибитора и ответственного за связывание трипсина, входит А^68-РЬе69, во втором, локализованном в ее С-концевой части и ответственном за связывание химотрипсина, содержится МеИ53-8ег154. Полученные данные позволяют сделать заключение, что отсутствие или присутствие определенных аминокислотных остатков в первичной структуре ингибиторов РКР1 определяет специфичность их действия.

Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченной к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); XXII и XXIII Зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, 2010, 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010" (Москва, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации" (Екатеринбург, 2010); I Всероссийской виртуальной интернет - конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (Казань, 2010); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Петрозаводск, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" (Москва, 2011).

2. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

2.1. СТРУКТУРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И МЕХАНИЗМЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ

Сериновые протеиназы составляют одно из крупнейших суперсемейств гидролаз и объединяют около 200 ферментов [159]. Их характерной особенностью является то, что в состав активного центра входит остаток серина, играющий роль нуклеофила в каталитическом акте. Вследствие структурных особенностей сериновые протеиназы представлены в различных кланах, которые не имеют эволюционного родства. Кланы, в свою очередь, на основании гомологии аминокислотных последовательностей делятся на семейства [175]. В зависимости от расположения аминокислотных остатков в каталитическом центре выделяют 16 кланов сериновых протеиназ (8В, 8С, 8Е, ББ, БН, 81, 8К, 8Р, 8Я, 88, вТ, 8-, РА, РВ, РС). Кланы РА (Ъ/С), РВ (Б/С/Т), РС (Б/С) являются неоднородными и, помимо сериновых (8), содержат цистеиновые (С) и треониновые (Т) протеиназы. В настоящее время выделяют 47 семейств, относящихся к под-подклассу сериновых протеиназ [148]. Наиболее многочисленным и хорошо изученным является семейство химотрипсина 81, входящее в под-клан РА(8). В его состав входит более ста белков с различной функциональной активностью, первичная структура которых известна. Описано более сотни белков семейства 81 [58, 148]. Типичными представителями этого семейства являются а-химотрипсин (ЕС 3.4.21.1), трипсин (ЕС 3.4.21.4) и эластаза(ЕС 3.4.21.36).

Существуют экспериментально обоснованные представления о том, что

в активных центрах фермента можно условно выделить два участка:

субстратсвязывающий и каталитический [2]. По субстратсвязывающему

участку осуществляется образование комплекса субстрата с ферментом, он

ответствен за специфичность фермента. Каталитический центр представляет

12

собой совокупность функциональных групп, которые участвуют в перераспределении электронных плотностей и переносе групп в химическом акте катализа [9].

Механизм катализа сериновых протеиназ был детально изучен с

помощью метода рентгеноструктурного анализа на примере а-химотрипсина,

который является представителем ферментов, осуществляющих активацию

воды при участии имидазольной группы гистидина, сопряженной с

карбоксильной группой аспарагиновой кислоты (рис. 1) [9]. Установлено, что

при взаимодействии а-химотрипсина с субстратом основную роль играет так

называемая «каталитическая триада», состоящая из остатков серина (8ег195),

гистидина (Н1з57) и аспарагиновой кислоты (А8р102) [168]. Эти

аминокислотные остатки расположены в активном центре молекулы фермента

таким образом, что между гидроксильной группой Бег 195 и атомом азота

имидазольного кольца Н1з57 (в положении 3), а также между атомом

кислорода (3-карбоксильной группы Азр102 и атомом азота Н1з57 (в

положении 1) образуются водородные связи, и возникает система переноса

заряда [37] (рис. 1), которая облегчает отделение протона от 8ег195.

Каталитическая триада стабилизируется сетью дополнительных водородных

связей, которые образуются за счёт нескольких высоко консервативных

аминокислотных остатков, окружающих триаду, в частности ТЪг54, А1а56 и

8ег214 [58]. Помимо этих аминокислотных остатков в каталитическом акте

принимает участие амидная группа остатка С1у193, которая вместе с амидной

группой 8ег195 образует так называемую оксианионную впадину (рис. 1) и

дополнительно стабилизирует тетраэдрические интермедиаты [9]. При распаде

промежуточных тетраэдрических интермедиатов образуется ацил-ферментный

интермедиат, существование которого было доказано Хартли и Лилби [90]

еще в 1954 году, и стабилизируется вновь освобождаемый азот имидазольного

кольца Н1з57 (в положение 3). Затем молекула воды вытесняет свободные

полипептидные фрагменты и атакует промежуточный ацил-ферментный

13

интермедиат. В то же время оксианионная впадина стабилизирует второй тетраэдрический интермедиат и при его распаде освобождается новый С-

концевой остаток субстрата [159].

Ацил- ф ер ментный Тэтраэдрнческий

интермедиат интермедиат

Рис. 1. Механизм катализа а-химотрипсином.

Согласно кристаллографическим исследованиям химотрипсин, трипсин и эластаза имеют похожие пространственные структуры, в которых остаток Serl95 занимает одно и то же положение [198]. Но, несмотря на структурное сходство, они обладают различной субстратной специфичностью. Так, химотрипсин расщепляет пептидную связь, образованную карбоксильными группами гидрофобных аминокислотных остатков Phe, Тгр, Туг, трипсин -положительно заряженных остатков, Arg, Lys, а эластаза - нейтральных остатков, Ala, Gly [92].

2.2. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ

2.2.1. Классификация и распространение

Белковые ингибиторы протеиназ представляют собой большую и разнообразную в структурном отношении группу белков, способных образовывать стехиометрические комплексы с протеолитическими ферментами, в результате чего последние утрачивают ферментативную активность. В настоящее время известны аминокислотные последовательности более чем 2500 белков, обладающих способностью ингибировать протеиназы [176]. Ингибиторы протеиназ представлены во всех типах живых организмов, как у эукариот, так и у прокариот [176]. Они обнаружены у 2169 видов организмов [148]. Первые высокоочищенные ингибиторы протеиназ белковой природы из поджелудочной железы быка (Кунитц, BPTI) [130] и семян сои (Кунитц, STI) [131] были выделены Кунитцем и Нортропом. Эти исследования легли в основу дальнейшего изучения природы ингибиторов, их структуры и функций, которые продолжаются и в настоящее время. Выделено, очищено и охарактеризовано большое количество ингибиторов протеиназ растительного и животного происхождения. Полученные данные свидетельствуют о том, что структуры молекул, механизм ингибирования и природа их комплексов с ферментами крайне разнообразна [6, 50].

Ласковским была предложена классификация ингибиторов [133] на основании строения первичных структур их молекул ингибиторов, а также специфичности действия на определенный класс протеиназ. Эта классификация базировалась на данных по гомологии аминокислотных последовательностей, расположения дисульфидных связей и строения реактивных центров. Было выделено 10 семейств ингибиторов:

- семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца или SKTI (Kunitz soybean trypsin inhibitor);

- семейство ингибиторов Бауман-Бирк или BBI (Bowman-Birk inhibitor);

- семейство картофельного ингибитора I (PI-I);

- семейство картофельного ингибитора II (PI-II);

- семейство ингибиторов из тыквы (squash inhibitor family);

- семейство ингибитора трипсина из ячменя или BTI (barley trypsin inhibitor);

- секреторный ингибитор трипсина Казала;

- ингибитор субтилизина из стрептомицетов или SSI (Streptomyces subtilisin inhibitor);

- ингибитор трипсина из панкреаса быка или BPTI (bovine pancreatic Kunitz-type trypsin inhibitor);

- семейство серпинов.

Однако в последние годы появились данные о белковых ингибиторах протеиназ, которые было невозможно отнести ни к одному из предложенных семейств. Были обнаружены белки, имеющие несколько каталитических центров и способные связывать одновременно несколько протеиназ различных классов [97, 144]. Это вызывало затруднения при отнесении их к тому или иному семейству.

В этой связи был предложен другой подход к классификации

ингибиторов протеиназ на основании сходства «единиц ингибирования» в

первичной структуре молекул. «Единица ингибирования» была определена

как участок аминокислотной последовательности, содержащий один

реактивный центр. Удаление любых частей в которой приводит к потере

активности ингибитора [176]. Белок-ингибитор, содержащий только одну

единицу ингибирования, принято называть простым, а белок, имеющий в

своем составе более одной единицы - составным. Число единиц

ингибирования может варьироваться от 2 до 15. Составные ингибиторы,

имеющие сходные единицы ингибирования, были названы гомотипными. Их

количество значительно превышает число гетеротипных. Простые и

17

гомотипные ингибиторы, в состав которых входят гомологичные единицы ингибирования, предложено выделять в отдельные семейства. Гомотипные ингибиторы объединены в 71 семейство. Гетеротипные ингибиторы объединены в 12 семейств, включающие около 50 белков [148].

Каждое семейство ингибиторов имеет собственный идентификатор, образованный литерой "I" и собственным номером (от 1 до 90). В том случае, если существуют данные об очень древних расхождениях внутри семейства, оно может подразделяться на подсемейства [176].

Филогенетически родственные семейства ингибиторов объединяют в кланы. Клан представляет собой группу ингибиторов одного или нескольких семейств, устойчивых в эволюционном плане и обладающих сходной третичной структурой. Каждый клан имеет двухбуквенный идентификатор, первая буква в котором «I» или «J» и добавочная заглавная буква от «А» до «Z». Когда серия от «IA» до «IZ» заполнилась, следующие кланы имели название «JA», «JB» и так делее. Общее количество кланов в настоящее время составляет 39 [148]. В большинстве случаев клан состоит из одного семейства, но существуют и кланы, объединяющие несколько семейств. Например, клан SKTI, обозначенный 1С, состоит из трех семейств: 13 - семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца, представленного в растениях и животных; 148 - семейство клитоципинов (clitocypin) и 185 - макроципинов (macrocypin), обнаруженные только у грибов. В настоящее время, некоторые семейства невозможно отнести к какому-либо клану и такие семейства обозначаются, как принадлежащие к клану I- [148, 176].

Изученные белковые ингибиторы протеолитических ферментов в

большей мере представлены у эукариотических организмов, но они

обнаружены также и у бактерий, вирусов и архей. Следует отметить, что для

последних свойственно наличие уникальных ингибиторов протеиназ с

характерной только для них структурой. Из 71 семейства гомотипных

ингибиторов 62 семейства обнаружены у эукариот. У животных обнаружено

18

41 семейство ингибиторов, при этом 20 из них присутствуют только у животных и не найдены в других организмах. В растительных организмах идентифицировано 21 семейство ингибиторов, девять из которых присутствуют только в растениях. К ним относятся 16 - семейство ингибиторов трипсина и а-амилазы из семян дагуссы (Eleusine coracana L.), 17 - ингибиторы трипсина из тыквы (Momordica charantia L.), 112 - семейство ингибитора Бауман-Бирк из сои {Glycine soja L.) (BBI), 118 - семейство ингибитора трипсина из горчицы (Sinapis alba L.), 120 - семейство ингибитора II из картофеля (PI-II), 137 - ингибиторы металлокарбоксипептидаз из картофеля {Solanum tuberosum L.), 167 - бромеины из ананаса {Ananas comosus L.), 173 - ингибитор трипсина из вероники {Veronica hederifolia L.), 190 — семейство ингибитора трипсина из ночной красавицы {Mirabilis jalapa L.).

2.2.2. Молекулярная структура ингибиторов протеиназ

Молекулы различных семейств ингибиторов протеиназ имеют довольно разнообразные структуры. Они могут быть как а-спирализованными, например, ингибитор фактора Хагемана из кукурузы (CHFI, corn Hageman factor inhibitor), и (3-складчатыми (PI-II, SFTI-I (sunflower trypsin inhibitor) и T1 (trypsin inhibitor from Nicotiana alata)), так и смешанными a/f3 (BPTI, OMSVP3 (third domains of silver pheasant and turkey ovomucoid inhibitor), SSI) или неупорядоченными как ингибитор трипсина из тыквы {Cucurbita maxima L.) (CMTI I, Cucurbita maxima trypsin inhibitor). Структура молекул семейств II (семейство Казала), 12 (BPTI), Il 1 (экотины), ИЗ (эглины и PI-I), 116 (SSI) и 120 (PI-II) [129] поддерживается за счёт внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий и частично за счёт дисульфидных связей, число которых может широко варьироваться. Некоторые из белков-ингибиторов, например, CI-2 и эглин С, не содержат дисульфидных связей [129]. Стабильная структура ингибиторов таких семейств, как 17 (Squash), 112 (BBI), 115 (гирустасин) поддерживается дисульфидными связями [129]. Белок SFTI-1 из семян

19

подсолнуха, ингибирующий трипсин, имеет циклическую структуру. Его структура состоит из двух антипараллельных ß-цепей, имеющих дополнительную поперечную дисульфидную связь. Такая структура гомологична ингибиторам семейства BBI [123]. Природные циклические пептиды обнаружены и среди ингибиторов семейства 17 [64].

Как правило, число и расположение дисульфидных связей в молекулах ингибиторов, принадлежащих к одному семейству, является консервативным. Исследование структур ингибиторов показало, что могут существовать и исключения. Так представители семейства цистатинов 125 имеют или две дисульфидные связи, или не имеют совсем [155]. В связи с этим семейство подразделяется на три подсемейства: цистатина A (I25A), овоцистатина (I25B) и ингибитора металлопротеиназ (I25C) [148]. Семейство SKTI (13) содержит две дисульфидные связи (Cys63-Cysl 10 и Cysl60-Cysl69) за исключением ингибитора из Swartzia pickellii, имеющего в своей структуре только первую из них [59].

Благодаря наличию и строгому расположению дисульфидных связей в молекулах ингибиторов, отдельные участки полипептидных цепей образуют одну или несколько пептидных петель, которые располагаются на поверхности молекулы белка и доступны для взаимодействия с протеиназой. Такая организация структурных элементов молекул ингибиторов называется «петлей связывания» и характерна для большинства семейств ингибиторов.

Большинство белковых ингибиторов протеиназ являются

однодоменными белками, в которых ингибирующий домен содержит один

единственный реактивный центр связывания с ферментом [129]. Такая

структура характерна для всех представителей семейств 17, 111 (экотины), 113

(PI-I и CSCI), 116 (SSI), 133 (Ascaris IP-3), брассианов и ингибиторов из

шелкопряда. В структурах остальных семейств ингибиторов, таких как BBI,

BPTI, PI-II и других, один домен может повторяться от 2 до 15 раз. Молекулы

таких ингибиторов способны независимо связывать несколько молекул

20

протеиназ с реактивными центрами, локализованными в разных доменах [129]. Например, в состав овомукоидов из яиц птиц (II) входит три домена, гомологичных секреторному ингибитору ЬСазала и содержащих по три дисульфидные связи. Каждый из доменов независимо друг от друга способен связывать сериновые протеиназы. Второй домен овомукоида из яиц курицы и утки связывает трипсин, а третий - трипсин, химотрипсин, эластазу, протеазу А и В, и субтилизин [133]. Специфичность действия первого домена не была установлена. Однако известно, что гомологичный ему белок, выделенный из Банкивской джунглевой курицы {Gallus gallus L.), ингибирует эндопротеиназу Lys-C [114]. Известны мультидоменные белки, состоящие из комбинации четырех доменов: сывороточного кислого белка (WAP, whey acidic protein), BPTI, ингибитора Казала и иммуноглобулин-связывающего домена (Ig-домен). Такие ингибиторы могут действовать на протеиназы различных классов: сериновые, аспартатные, цистеиновые и металлопротеиназы [97, 210].

Большинство гомотипных белковых ингибиторов действуют на протеиназы определенного класса. Однако обнаружены белки, способные действовать на протеолитические ферменты различных классов. Например, ингибиторы семейства цистатинов (I25C) способны подавлять активность сериновых [54] и металлопротеиназ [213]. Белки семейства серпинов (14) действуют на сериновые и цистеиновые протеиназы [22], а семейства SKTI (13) - на сериновые, цистеиновые и аспартатные [144].

Ингибиторы протеиназ из различных семейств, несмотря на различия в структуре, как правило, стабильные или даже очень стабильные белки. Они обладают высокой термостабильностью. Так молекула ингибитора BPTI денатурируется при нейтральном pH только при температуре около 100°С и устойчива к действию 6 М гуанидинхлорида [142]. Белки семейства SKTI разрушаются при температуре выше 65°С [129].

2.2.3. Механизм действия ингибиторов протеиназ

Структуры ингибиторов, способы ингибирования, их кинетические и термодинамические параметры, а также природа комплексов фермент-ингибитор очень разнообразны. На основании этих параметров предложены четыре возможных механизма взаимодействия ингибиторов с эндопротеиназами [40]. Первым и наиболее распространенным является субстратоподобный механизм, который включает связывание реактивного центра ингибитора с активным центром фермента с образованием комплекса Михаэлиса. Этот механизм характерен для большинства ингибиторов сериновых протеиназ (рис. 2А) [158].

Второй механизм ингибирования заключается в связывании ингибитора с участком, расположенным в непосредственной близости от активного центра фермента, который остается свободным, но не способным к взаимодействию с субстратом (рис. 2Б). Таким образом, происходит пространственное блокирование участка связывания фермента, делающее невозможным подход молекулы субстрата. Такой механизм ингибирования характерен для ингибиторов цистеиновых протеиназ, цистатинов [108].

Для ингибиторов металлопротеиназ TIMP семейства 135 характерен иной способ подавления активности фермента. При взаимодействии с протеиназой, эти ингибиторы образуют квази-субстратные комплексы. За счет своего N-концевого остатка и пяти пептидных петель, распределенных по всей длине молекулы ингибитора, ингибитор занимает всю зону активного центра металлопротеиназы (рис. 2В) [75, 218].

Четвертый механизм ингибирования характерен для зимогенов протеиназ семейства S1 (рис. 2Г). Он представляет собой аллостерическое взаимодействие протеиназы и ингибитора, в роли которого выступает N-концевой пропептид зимогена (например, IleValGlyGly- в молекуле химотрипсина). Присутствие этого пропептида в молекуле зимогена делает

невозможным образование связи между Т1е16-Азр194 и формировании функциональной петли фермента. Таким образом, пропептид можно рассматривать как ингибитор протеиназы [38, 40].

.п- Г '

* а.Ц. щ

Щ.

I

1ш

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Парфенов, Игорь Александрович

6. ВЫВОДЫ:

1. Из картофеля сорта Юбилей Жукова выделен и охарактеризован новый белок, обозначенный как PKCI, эффективно подавляющий активность а-химотрипсина и трипсина. Белок PKCI содержал два независимо действующих реактивных центра и был способен одновременно связать оба фермента. Установлена N-концевая аминокислотная последовательность белка PKCI, позволившая отнести его к группе белков-ингибиторов PKPI-B.

2. Установлена нуклеотидная последовательность кДНК, обозначенной как PKPIJ-B. Полученный рекомбинантный белок PKPIJ-B действует на протеиназы аналогично белку PKCI. Это с большой степенью вероятности свидетельствует о том, что при развитии клубней картофеля белок PKCI кодируется кДНК PKPIJ-B.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки семейства PKPI-B в картофеле различных сортов, показал, что наиболее вариабельные фрагменты последовательностей расположены в 5'-концевой части молекул и локализуются в одних и тех же участках. Весьма вероятно, что в этих участках и происходили рекомбинации.

4. Восстановлена полная аминокислотная последовательность белка PKCI. Показано, что остаток Metl53 входит в состав реактивного центра связывания химотрипсина, который локализован в С-концевом участке между остатками Cysl47 и Cysl64.

5. Показано, что белок PKCI угнетает рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов F. culmorum и P. infestans (Mont.) de Вагу, поражающих растение картофеля, что свидетельствует об его участии в защитной системе растения при поражении этими патогенами.

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ревина ТА., Парфенов И.А., Гвоздева E.JL, Герасимова Н.Г., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина и трипсина из клубней картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 3. С. 265-272.

2. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Пашковский П.П., Радюкина H.JL, Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующего белок-ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 4. С. 402-407.

3. Valueva Т.A., Parfenov I.A., Revina Т.А., Morozkina E.V., Benevolensky S.V. Structure and properties of the potato chymotrypsin inhibitor // Plant Physiology and Biochemistry. 2012. V. 52. P. 83-90.

4. Ревина T.A., Кладницкая Г.В., Гвоздева E.JI., Парфенов И.А., Валуева Т.А. Специфические ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и кодирующие их гены / Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва. 2009. Т. 1. С. 335.

5. Парфенов И.А., Ревина Т.А. Белок-ингибитор трипсина и химотрипсина из клубней картофеля / Тез. XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2010. С. 48.

6. Парфенов И.А. Новый белок-ингибитор сериновых протеиназ из клубней картофеля / Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2010". Москва. 2010. С. 60.

7. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Фрагмент гена, кодирующий белок ингибитор химотрипсина и трипсина в картофеле / Всероссийская молодежная научная конференция с международным участием "Биология будущего: традиции и инновации". Екатеринбург. 2010. С. 97.

8. Парфенов И.А., Ревина Т.А., Валуева Т.А. Ингибитор химотрипсина из клубней картофеля и кодирующий его ген / I Всероссийская виртуальная интернет - конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий". Казань. 2010. С. 124.

9. Парфенов И.А. Молекулярное клонирование генов, кодирующих белки-ингибиторы сериновых протеиназ в картофеле / Тез. XXIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 2011. С. 52.

10. Парфенов И.А., Валуева Т.А. Новый ингибитор химотрипсина из клубней картофеля. Выделение, очистка и характеристика природного и рекомбинантного белков / V Российский симпозиум "Белки и пептиды". Петрозаводск. 2011. С. 289.

11. Парфенов И.А., Валуева Т.А. Исследование свойств нового ингибитора химотрипсина из клубней картофеля Solanum tuberosum L. / Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова". Москва. 2011. Т. 2. С. 52.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что для различных сортов картофеля характерен свой индивидуальный набор белковых ингибиторов протеиназ, обусловливающих, в частности, степень их адаптации к условиям выращивания. В данной работе проведен скрининг белков, подавляющих активность протеиназ, в картофеле нового сорта Юбилей Жукова, устойчивого к действию фитопатогенных микроорганизмов. Был выделен и детально охарактеризован высокоэффективный ингибитор химотрипсина и трипсина PKCI, обладающий способностью связывать одновременно оба фермента. Выделена кДНК PKPIJ-B и установлена ее нуклеотидная последовательность. Методом гетерологичной экспрессии этой кДНК в клетки Е. coli получен рекомбинантный белок, который был очищен до гомогенного состояния. Изучено его действие на химотрипсин и трипсин. Показано, что рекомбинантный белок идентичен белку PKCI. Это позволило сделать заключение, что в клубнях картофеля сорта Юбилей Жукова белок PKCI кодируется кДНК PKPIJ-B.

Сравнительное исследование последовательностей генов, кодирующих белки семейства PKPI-B в различных сортах картофеля, и кДНК PKPIJ-B показало высокую степень их полиморфизма. Установлено, что наиболее вариабельным является С-концевой участок молекул, расположенный между остатками Cysl47 и Cysl64. Вполне вероятно, что полиморфизм генов PKPI-B является результатом межгенной рекомбинации, направленной на создание новых ингибиторов, которые могли бы участвовать в защите растения от действия фитопатогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Можно предположить, что эволюция белков PKPI-B в картофеле обусловлена адаптацией растений к новым формам патогенных организмов. При этом наряду с обменом участками между генами PKPI, относящимися к одной структурной группе, вероятно, существует также обмен участками между генами различных групп [51]. Полиморфизм генов, кодирующих белки-ингибиторы PKPI в картофеле, по-видимому, связан с одной стороны, с гибридным происхождением многих сортов, а с другой - с высокой скоростью их модификаций в процессе эволюции.

Сравнение аминокислотных последовательностей белков группы PKPI-В позволило высказать достаточно обоснованное заключение о природе и локализации в их молекулах второго реактивного центра связывания а-химотрипсина. Наличие первого реактивного центра, ответственного за взаимодействие с трипсином и находящегося в N-концевой части молекулы PKCI, а второго - в ее С-концевой, создает условия, обеспечивающие возможность одновременного связывания с одной молекулой ингибитора двух различных протеиназ.

Экспериментальные данные, полученные в последние годы, позволяют предположить, что ингибиторы протеолитических ферментов относятся к белкам, участвующим в защитных реакциях растений в ответ на воздействие на них различных видов стрессов. Показано, что белки-ингибиторы PKPI картофеля способны ш vivo подавлять активность экстрацеллюлярных протеиназ патогенных микроорганизмов и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых-вредителей [4, 5, 17, 18, 84, 94, 107, 214]. В ответ на различные повреждения, в том числе и на внедрение фитопатогенов, в растениях индуцируется синтез ингибиторов протеиназ [190]. Модификация ингибиторов протеиназ в тканях является, по-видимому, частью неспецифических реакций растений в ответ на действие фитопатогенов. Об этом свидетельствует и тот факт, что накопление ингибиторов протеиназ в тканях индуцируется элиситорами, в роли которых могут выступать фрагменты клеточных стенок растений и грибов, а также некоторые фитогормоны [80, 124, 189].

Известно, что патогенность микроорганизмов в значительной мере обусловлена активностью внеклеточных протеиназ [12]. В работах нашей

104 лаборатории было показано, что оомицет P. infestans (Mont.) de Вагу при выращивании на среде, содержащей белки из клубней картофеля, продуцирует комплекс сериновых протеиназ с трипсино- и субтилизиноподобной активностью [10]. В то же время в клубнях картофеля в ответ на поражение Р. infestans накапливались белки с молекулярной массой около 20-24 кДа [8, 266]. Токсичность белка-ингибитора PKCI, исследованного в настоящей работе, по отношению к фитопатогенному грибу F. culmorum и оомицету Р. infestans свидетельствует в пользу предположения об его участии в защите картофеля от вредителей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Парфенов, Игорь Александрович, 2012 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Авсенева Т.В., Федуркина Н.В., Мосолов В.В. Ингибитор протеиназы 1, ответственной за инактивацию нитратредуктазы в корнях кукурузы // Физиология растений. 1987. Т. 34. № 1. С. 114 -120.

2. Березин И.В. Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая Школа. 1977. С. 279.

3. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Белки — ингибиторы протеиназ в семенах. Классификация, распространение, структура и свойства // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 3. С. 362-387.

4. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биологической химии. 2002. Т. 42. С. 193-216.

5. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений от патогенных микроорганизмов // Биохимия. 2004. Т. 69. № 11. С. 1600-1606.

6. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В., Ментеле Р. Первичная структура 21 кДа-белка из клубней картофеля // Биохимия.

1999. Т. 64. № п. с. 1489-1498.

7. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Мосолов В.В. Реактивные центры 21 кДа-белка-ингибитора сериновых протеиназ из клубней картофеля //Биохимия. 1999. Т. 64. № 9. С. 1274-1279.

8. Валуева Т.А., Ревина Т.А., Гвоздева Е.Л., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л. Роль ингибиторов протеиназ в защите картофеля. // Биоорган, химия. 2003. Т. 29. №5. С. 499-504.

9. Варфоломеев С.Д., Пожитков А.Е. Активные центры гидролаз: основные типы структур и механизм катализа // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия.

2000. Т. 41. № 3. С. 147-156.

10. Гвоздева E.JI, Иевлева Е.В., Герасимова Н.Г., Озерецковская O.JL, Валуева Т.А. Экзопротеиназы оомицета Phytohpthora infestans II Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 2. С. 194-200.

11. Домаш В.И., Шарпио Т.П., Забрейко С.А., Сосновская Т.Ф. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина высших растений в условиях стресса//Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 353-357.

12. Иевлева Е.В., Ревина Т.А., Кудрявцева H.H., Софьин A.B., Валуева Т.А. Внеклеточные протеиназы фитопатогенного гриба Fusarium culmorum П Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. № 3. С. 338-344.

13. Левина Н.Б., Слепак В.З., Киселев О.Г., Шемякин В.В., Хохлачев A.A. Применение электроблоттинга в качестве метода получения образцов белков и их фрагментов для микросеквенирования // Биоорганическая химия. 1989. Т. 15. № 1. с. 24-31.

14. Люблинская Л.А., Якушева Л.Д., Степанов В.М. Синтез пептидных субстратов субтилизина и их аналогов // Биоорганическая химия. 1977. Т. 3. № 2. С. 273-279.

15. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. № 3. С. 261-282.

16. Мосолов В. В., Валуева Т. А. Ингибиторы протеолитических ферментов при абиотических стрессах у растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 5. с. 501-507.

17. Ревина Т.А., Сперанская A.C., Кладницкая Г.В., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Белок-ингибитор субтилизина из клубней картофеля // Биохимия. 2004. Т. 69. № 10. С. 1345-1352.

18. Ревина Т.А., Кладницкая Г.В., Герасимова Н.Г., Гвоздева Е.Л., Валуева Т.А. Белок-ингибитор трипсина из клубней картофеля. // Биохимия. 2010. Т. 75. № 1.С. 46-51.

19. Сперанская А.С., Криницына А.А., Полтрониери П., Фазано П., Сантино А., Шевелев А.Б., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ типа Кунитца группы В из картофеля: молекулярное клонирование генов // Биохимия. 2005. Т. 70. №3. С. 360-369.

20. Abdeen A., Virgos A., Olivella Е., Villanueva J., Aviles X., Gabarra R., Prat S. Multiple insect resistance in transgenic tomato plants overexpressing two families of plant proteinase inhibitors // Plant Mol. Biol. 2005. V. 57. № 2. P. 189-202.

21. Alexandrov N.N., Brover V.V., Freidin S., Troukhan M.E., Tatarinova T.V., Zhang H., Swaller T.J., Lu Y.P., Bouck J., Flavell R.B., Feldmann K.A. Insights into corn genes derived from large-scale cDNA sequencing // Plant Mol. Biol. 2009. V. 69. № 1-2. P. 179-194.

22. Al-Khunaizi M., Luke C.J., Askew Y.S., Pak S.C., Aske D.J., Cataltepe S., Miller D., Mills D.R., Tsu C., Bromme D., Irving J.A., Whisstock J.C., Silverman G.A. The serpin SQN-5 is a dual mechanistic-class inhibitor of serine and cysteine proteinases // Biochemistry. 2002. V. 41. № 9. P. 31893199.

23. Amirhusin В., Shade R.E., Koiwa H., Hasegawa P.M., Bressan R.A., Murdock L.L., Zhu-Salzman K.. Protease inhibitors from several classes work synergistically against Callosobruchus maculates II J. Insect Physiol. 2007. V. 53. №7. P. 734-740.

24. Antcheva N., Pintar A., Patthy A., Simoncsits A., Barta E., Tchorbanov В., Pongor S. Proteins of circularly permuted sequence present within the same organism: the major serine proteinase inhibitor from Capsicum annuum seeds // Protein Sci. 2001. V. 10. № 11. P. 2280-2290.

25. Appenroth K.J., Augsten H. An improvement of the protein determination in plant tissues with the dye-binding method according to BRADFORD // Biochim. Physiol Pflanzen. 1987. V. 182. № 1. P. 85-89.

26. Apostoluk W., Otlewski J. Variability of the canonical loop conformations in serine proteinases inhibitors and other proteins // Proteins-structure function and genetics. 1998. V. 32. № 4. P. 459-474.

27. Araujo A.P., Hansen D., Vieira D.F., Oliveira C., Santana L.A., Beltramini L.M., Sampaio C.A., Sampaio M.U., Oliva M.L. Kunitz-type Bauhinia bauhinioides inhibitors devoid of disulfide bridges: isolation of the cDNAs, heterologous expression and structural studies // Biol. Chem. 2005. V. 386. № 6. P. 561-568.

28. Arnone M.L, Davidson E.H. The hardwiring of development: organization and function of genomic regulatory systems // Development. 1997. V. 124. № 10. P. 1851-1864.

29. Ashida Y., Matsushima A., Tsuru Y., Hirota T., Hirata T. Isolation and sequencing of a cDNA clone encoding a 20-kDa protein with trypsin inhibitory activity // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V. 64. № 6. P. 1305-1309.

30. Baek K-H., Choi D. Roles of plant proteases in pathogen defense // Plant Pathol. J. 2008. V. 24. № 4. P. 367-374.

31. Baumgartner B., Chrispeels M. Partial characterization of a protease inhibitor which inhibits the major endopeptidase present in the cotyledons of mung beans //Plant Physiol. 1976. V. 58. № 1. P. 1-6.

32. Bauw G., Nielsen H.V., Emmersen J., Nielsen K.L., Jorgensen M., Welinder K.G. Patatins, Kunitz protease inhibitors and other major proteins in tuber of potato cv. Kuras // FEBS J. 2006. V. 73. № 15. P. 3569-3584.

33. Beekwilder J., Schipper B., Bakker P., Bosch D., Jongsma M. Characterization of potato proteinase II reactive site mutants // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. № l.p. l-ll.

34. Benarafa C., Remold-O'Donnell E. The ovalbumin serpins revisited: perspective from the chicken genome of clade B serpin evolution in vertebrates // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. V. 102. № 32. P. 11367-11372.

35. Beuning L.L., Spriggs T.W., Christeller J.T. Evolution of the proteinase inhibitor I family and apparent lack of hypervariability in the proteinase contact loop // J. Mol. Evol. 1994. V. 39. № 6. P. 644-654.

36. Bieth J., Wermuth C.G. The action of elastase on p-nitroanilide substrates // ' Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973. V. 53. № 2. P. 383-390.

37. Blow D.M. Structure and mechanism of chymotrypsin // Acc. Chem. Res. 1976. V. 9. №4. P. 145-152.

38. Bode W. Transition of bovine trypsinogen to a trypsin-like state upon strong ligand-binding. 2. Binding of the pancreatic trypsin-inhibitor and of isoleucine-valine and of sequentially related peptides to trypsinogen and to p-guanidinobenzoate-trypsinogen // J. Mol. Biol. 1979. V. 127. № 4. P. 357-374.

39. Bode W, Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Eur. J. Biochem. 1992. V. 204. № 2. P. 433-451.

40. Bode W., Huger R. Structural basis of the endoproteinase-protein inhibitor interaction // Biochim. Biophys. Acta-Protein structure and molecular enzymology. 2000. V. 1477. № 1-2. P. 241-252.

41. Boisen S. Comparative physico-chemical studies on purified trypsin inhibitors from the endosperm of barley, rye, and wheat // Z. Lebensm. Unters Forsch. 1983. V. 176. № 6. P. 434-439.

42. Boulter D. Insect pest control by copying nature using genetically engineered crops // Phytochemistry. 1993. V. 34. № 6. p. 1453-1466.

43. Brioschi D., Nadalini L.D., Bengtson M.H., Sogayar M.C., Moura D.S., Silva-Filho M.C. General up regulation of Spodoptera frugiperda trypsins and chymotrypsins allows its adaptation to soybean proteinase inhibitor // Insect Biochem. Mol. Biol. 2007. V. 37. № 12. P. 1283-1290.

44. Broadway R.M. Dietary proteinase inhibitors alter complement of midgut proteases // Arch. Insect Biochem. Physiol. 1996. V. 32. № 1. P. 39-53.

45. Brzin J., Popovic T., Drobnic-Kosorok M., Kotnik M., Turk V. Inhibitors of cysteine proteinases from potato // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1988. V. 369. P. 233-238.

46. Cannon S.B., Young N.D. OrthoParaMap: Distinguishing orthologs from paralogs by integrating comparative genome data and gene phylogenies // BMC Bioinformatics. 2003. V. 4. № 35. P. 15.

47. Cannon S.B., Mitra A., Baumgarten A., Yang N.D., May G. The roles of segmental and tandem gene duplication in the evolution of large gene families in Arabidopsis thaliana II PMC Plant Biology. 2004. V. 4. № 10. P. 21.

48. Cater S.A., Lees W.E., Hill J., Brzin J., Kay J., Phylip L.H. Aspartic proteinase inhibitors from tomato and potato are more potent against yeast proteinase A than cathepsin D // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1596. № 1. P. 76-82.

49. Chase T. Jr., Shaw E. p-Nitrophenyl-p'-guanidinobenzoate HC1: a new active site titrant for trypsin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V. 29. № 4. P. 508-514.

50. Christensen S., Sottrup-Jensen L. Characterization of two serpins from bovine plasma and milk // Biochem. J. 1994. V. 303. № 2. P. 383-390.

51. Christeller J.T. Evolutionary mechanisms acting on proteinase inhibitor variability // FEBS J. 2005. V. 272. № 22. P. 5710-5722.

52. Cloutier C., Jean C., Fournier M., Yelle S., Michaud D. Adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata compensate for nutritional stress on oryzacystatin I-transgenic potato plants by hypertrophic behavior and overproduction of insensitive proteases // Arch. Insect Biochem. Physiol. 2000. V. 44. №2. P. 69-81.

53. Conconi A, Smerdon M.J., Howe G.A., Ryan C.A. The octadecanoid signalling pathway in plants mediates a response to ultraviolet radiation // Nature. 1996. V. 383. № 6603. P. 826-829.

54. Cornwall G.A., Cameron A., Lindberg I., Hardy D.M., Cormier N., Hsia N.

The cystatin-related epididymal spermatogenic protein inhibits the serine

114

protease prohormone convertase 2 // Endocrinology. 2003. V. 144. № 3. P. 901-908.

55. Dattagupta J.K., Podder A., Chakrabarti C., Sen U., Dutta S.K., Singh M. Structure of a Kunitz-type chymotrypsin from winged bean seeds at 2.95 A resolution // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 1996. V. 52. № 3. P. 521528.

56. De Meester P., Brick P., Lloyd L.F., Blow D.M., Onesti S. Structure of the Kunitz-type soybean trypsin inhibitor (STI): implication for the interactions between members of the STI family and tissue-plasminogen activator // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1998. V. 54. № 4. P. 589-597.

57. Deshimaru M., Hanamoto R., Kusano C., Yoshimi S., Terada S. Purification and characterization of proteinase inhibitors from wild soja (Glycine soja) seeds // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. № 9. p. 1897-1903.

58. Di Cera E. Serine proteases // IUBMB Life. 2009. V. 61 №. 5. P. 510-515.

59. Do Socorro M., Cavalcanti M., Oliva M.L., Fritz H., Jochum M., Mentele R., Sampaio M., Coelho L.C., Batista I.F., Sampaio C.A. Characterization of a Kunitz trypsin inhibitor with one disulfide bridge purified from Swartzia pickellii II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 291. № 3. P. 635-639.

60. Downing W.L., Mauxion F., Fauvarque M.O., Reviron M.P., de Vienne D., Vartanian N., Giraudat J. A. Brassica napus transcript encoding a protein related to the Kunitz protease inhibitor family accumulates upon water stress in leaves, not in seeds II Plant J. 1992. V. 2. № 5. P. 685-693.

61. Dunsea K.M., Stevensa J.A., Laya F.T., Gasparb Y.M., Heathb R.L., Anderson M.A. Coexpression of potato type I and II proteinase inhibitors gives cotton plants protection against insect damage in the field // PNAS. 2010. V. 107. № 34. P. 15011-15015.

62. Engh R.A., Huber R., Bode W., Schulze A.J. Divining the serpin inhibition mechanism: a suicide substrate springe? // Trends Biotechnol. 1995. V. 13. № 12. P. 503-510.

63. Evans R.J., Pusztai A., Watt W.B., Bauer D.H. Isolation and properties of protein fractions from navy beans (Phaseolus vulgaris) which inhibit growth of rats //Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 303. № 1. P. 175-184.

64. Felizmenio-Quimio M.E., Daly N.L., Craik D.J. Circular proteins in plants: solution structure of a novel macrocyclic trypsin inhibitor from Momordica cochinchinensis II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 25. P. 22875-22882.

65. Fernie A.R., Willmitzer L. Molecular and biochemical triggers of potato tuber development//Plant Physiol. 2001. V. 127. № 4. P. 1459-1465.

66. Filippova I.Ju., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide a chromogenic substrate for thiol proteinase assay // Anal. Biochem. 1984. V. 143. № 2. P. 203-297.

67. Force A., Lynch M., Pickett F.B., Amores A., Yan Y., Postlethwait J. Preservation of duplicate genes by complementary, degenerative mutations // Genetics. 1999. V. 151. № 4. P. 1531-1545.

68. Franco O.L., Rigden D.J., Melo F.R., Grossi-de-Sa M.F. Plant a-amylase inhibitors and their interaction with insect a-amylases. Structure, function and potential for crop protection // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. № 2. P. 397-412.

69. Franco O.L., Dias S.C., Magalhaes C.P., Monteiro A.C., Bloch CJr., Melo F.R., Oliveira-Neto O.B., Monnerat R.G., Grossi-de-Sa M.F. Effects of soybean Kunitz trypsin inhibitor on the cotton boll weevil (Anthonomus grandis) II Phytochemistry. 2004. V. 65. № 1. P. 81-89.

70. Gatehouse A.M.R., Davison G.M., Stewart J.N., Gatehouse L.N., Kumar A., Geoghegan I.E., Birch A.N.E., Gatehouse J.A. Concanavalin A inhibits development of tomato moth (Lacanobia oleracea) and peach-potato aphid (Myzus persicae) when expressed in transgenic potato plants // Mol. Breed. 1999. V. 5. №2. P. 153-165.

71. Gebhardt C., Valkonen J.P.T. Organisation of genes controlling disease resistant in the Potato genome // Annu. Rev. Phytopathol. 2001. V. 39. P. 79102.

72. Gettins P.G. Serpin structure, mechanism, and function // Chem. Rev. 2002 V. 102. № 12. P. 4751-4804.

73. Giri A.P., Harsulkar A.M., Deshpande V.V., Sainani M.N., Guptam V.S., Ranjekar P.K. Chickpea defensive proteinase inhibitors can be inactivated by podborer gut proteinases // Plant Physiol. 1998. V. 116. № 1. P. 393-401.

74. Glaczinski H., Heibges A., Salamini F., Gebhardt K. Members of the Kunitztype protease inhibitor gene family of potato inhibit soluble tuber invertase in vitro II Potato Res. 2002. V. 45. № 2-4. P. 163-176.

75. Gomis-Ruth F.X., Maskos K., Betz M., Bergner A., Huber R., Suzuki K., Yoshida N., Nagase H., Brew K., Bourenkov G.P., Bartunik H., Bode W. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1 //Nature. 1997. V. 389. № 6646. P. 77-81.

76. Goodwin R.L., Baumann H., Berger F.G. Patterns of divergence during evolution of alpha-1-proteinase inhibitors in mammals // Mol. Biol. Evol. 1996. V. 13. №2. P. 346-358.

77. Goodwin R.L., Barbour K.W., Berger F.G. Expression of the alpha 1-proteinase inhibitor gene family during evolution of the genus Mus // Mol. Biol. Evol. 1997. V. 14. № 4. P. 420-427.

78. Gosti F., Bertauche N., Vartanian N., Giraudat J. Abscisic acid-dependent and - independent regulation of gene expression by progressive drought in Arabidopsis thaliana //Mol. Gen. Genet. 1995. V. 246. № 1. P. 10-18.

79. Graham J.S., Pearce G., Merryweatherg J., Titanili K., Ericssonli L.H., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibitors from tomato leaves II. The cDNA-deduced primary structure of pre-inhibitor II // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. № 11. P. 6561-6564.

80. Graham M.Y., Weidner J., Wheeler K., Pelow M.J., Graham T.L. Induced expression of pathogenesis-related protein genes in soybean by wounding and the Phytophthora sojae cell wall glucan elicitor // Physiol. Mol. Plant Pathol. 2003. V. 63. №3. P. 141-149.

81. Green T.R., Ryan C.A. Wound-induced proteinase inhibitor in plant leaves: A possible defense mechanism against insects // Science. 1972. V. 175. № 4023. P. 776-777.

82. Grudkowska M., Zagdanska B. Multifunctional role of plant cysteine proteinases // Acta Biochim. Polonica. 2004. V. 51. № 38. P. 609-624.

83. Gruden K., Strukelj B., Ravnikar M., Poljsak-Prijatelj M., Mavric I., Brzin J., Pungercar J., Kregar I. Potato cysteine proteinase inhibitor gene family: molecular cloning, characterisation and immunocytochemical localisation studies // Plant Mol. Biol. 1997. V. 34. № 2. P. 317-323.

84. Gruden K., Popovic T., Cimerman N., Krizaj I., Strukelj B. Diverse enzymatic specificities of digestive proteases, 'intestains', enable Colorado potato beetle larvae to counteract the potato defense mechanism // Biol. Chem. 2003. V. 384. №. 2. P. 305-310.

85. Gruen L.C., Tao Z.J., Kortt A.A. Stability and physicochemical properties of a trypsin inhibitor from winged bean seed (Psophocarpus tetragonolobus (L)DC) // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 791. № 3. P. 285-293.

86. Grutter M.G., Priestle J.P., Rahuel J., Grossenbacher H., Bode W., Hofsteenge J., Stone S.R. Crystal structure of the thrombin-hirudin complex: a novel mode of serine protease inhibition // EMBO J. 1990. V. 9. № 8. P. 2361-2365.

87. Habu Y., Peyachoknagul S., Umemoto K., Sakata Y., Ohno T. Structure and regulated expression of Kunitz chymotrypsin inhibitor genes in winged bean {Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) // J. Biochem. 1992. V. 111. № 2. P. 249-258.

88. Habu Y., Peyachoknagul S., Sakata Y., Fukushima H., Ohno T. Evolution of a

multigene family that encodes the Kunitz chymotrypsin inhibitor in winged

118

bean: a possible intermediate in the generation of a new gene with a distinct pattern of expression // Mol. Gen. 1997. V. 254. № 1. P. 73-80.

89. Hansen D., Macedo-Ribeiro S., Verissimo P., Yoo Im.S., Sampaio M.U., Oliva M.L. Crystal structure of a novel cysteinless plant Kunitz-type protease inhibitor // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 360. № 4. P. 735-740.

90. Hartley B.S., Kilby B.A. The reaction of p-nitrophenyl esters with chymotrypsin and insulin // Biochem. J. 1954. V. 56. № 2. P. 288-297.

91. He X., Zhang J. Rapid subfiinctionalisation accompanied by prolonged and substantial neofimctionalisation in duplicate genome evolution // Genetics. 2005. V. 169. №2. P. 1157-1164.

92. Hedstrom L. Serine protease mechanism and specificity // Chem. Rev. 2002. V. 102. № 12. P. 4501-4524.

93. Heibges A., Glaczinski H., Ballvora A., Salamini F., Gebhardt C. Structural diversity and organization of three gene families for Kunitz-type enzyme inhibitors from potato tubers {Solanum tuberosum L.) I I Mol. Gen. Genomics. 2003. V. 269. № 4. P. 526-534.

94. Heibges A., Salamini F., Gebhardt C. Functional comparison of homologous members of three groups of Kunitz-type enzyme inhibitors from potato tubers {Solanum tuberosum L.) // Mol. Gen. Genomics. 2003. V. 269. № 4. P. 535541.

95. Herbers K., Prat S., Willmitzer L. Cloning and characterization of a cathepsin D inhibitor gene from Solanum tuberosum L. // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. № 1. P. 73-83.

96. Hilder V.A., Gatehouse A.M.R., Sherman S.E., Barker R.F., Boulter D. A novel mechanism for insect resistance engineered into tobacco // Nature. 1987. V. 330. №6144. P. 160-163.

97. Hiraga K., Suzuki T., Oda K. A novel double-headed proteinaceous inhibitor for metalloproteinase and serine proteinase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 33.25173-25179.

98. Horiguchi T., Kitagishi K. Studies on rice seed protease. V. Protease inhibitors in rice seed // Plant Cell Physiol. 1971. V.12. № 6. P. 907-915.

99. Horisberger M., Tacchini-Vonlanthen M. Ultrastructural localization of Kunitz inhibitor on thin sections of Glycine max (soybean) cv. Maple Arrow by the gold method // Histochemistry. 1983. V. 77. № 1. P. 37-50.

100. Huang H., Qi S.-D., Qi F., Wu C.-A, Yang G.-D., Zheng C.-C. NtKTIl, a Kunitz trypsin inhibitor with antifungal activity from Nicotiana tabacum, plays an important role in tobacco's defense response // FEBS J. 2010. V. 277. № 19. P. 4076-4088.

101. Huang Y., Xiao B., Xiong L. Characterization of a stress responsive proteinase inhibitor gene with positive effect in improving drought resistance in rice // Planta. 2007. V. 226. № 1. P. 73-85.

102. Huntington J. A. Serpin structure, function and dysfunction // J. Thromb. Haemost. 2011. V. 9. № 1. P. 26-34.

103. Innan H. The coalescent and infinite-site model of a small multigene family // Genetics. 2003. V. 163. № 2. P. 803-810.

104. Im H., Ahn H.Y., Yu M.H. Bypassing the kinetic trap of serpin protein folding by loop extension // Protein Sci. 2000. V. 9. № 8. P. 1497-1502.

105. Irie K., Hosoyama H., Takeuchi T., Iwabuchi K., Watanabe H., Abe M., Abe K., Arai S. Transgenic rice established to express corn cystatin exhibits strong inhibitory activity against insect gut proteinases // Plant Mol. Biol. 1996. V. 30. № l.p. 149-157.

106. Irving J.A., Pike R.N., Dai W., Bromme D., Worrall D.M., Silverman G.A., Coetzer T.H., Dennison C., Bottomley S.P., Whisstock J.C. Evidence that serpin architecture intrinsically supports papain-like cysteine protease inhibition: engineering alpha(l)-antitrypsin to inhibit cathepsin proteases // Biochemistry. 2002. V. 41. № 15. P. 4998-5004.

107. Ishikawa A., Ohta S., Matsuoka K., Hattori T., Nakamura K. A family of

potato genes that encode Kunitz-type proteinase inhibitors: structural

120

comparisons and differential expression // Plant Cell Physiol. 1994. V. 35. № 2. P. 303-312.

108. Jenko S., Dolenc I., Guncar G., Dobersek A., Podobnik M., Turk D. Crystal structure of stefin A in complex with cathepsin H: N-terminal residues of inhibitors can adapt to the active sites of endo- and exopeptidases // J. Mol. Biol. 2003. V. 326. № 3. P. 875-885.

109. Jofuku K.D, Goldberg R.B. Kunitz trypsin inhibitor genes are differentially expressed during the soybean life cycle and in transformed tobacco plants // Plant Cell. 1989. V. 1. № 11. P. 1079-1093.

110. Jongsma M.A., Bakker P.L., Peters J., Bosch D., Stiekema W.J. Adaptation of Spodoptera exigua larvae to plant proteinase inhibitors by induction of gut proteinase activity insensitive to inhibition // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995. V. 92. № 17. P. 8041-8045.

111. Johnson P.H. Hirudin: clinical potential of a thrombin inhibitor // Annu. Rev. Med. 1994. V. 45. P. 165-177.

112. Kakade M.L., Rackis J.J., McGhee J.E., Puski G. Determination of trypsin inhibitor activity of soy products; a collaborative analysis of an improved procedure // Cereal Chem. 1974. V. 51. № 3. P. 376-382.

113. Kang S.G., Lee H.J., Park E.H., Suh S.G. Molecular cloning and characterization of cDNAs encoding heterotrimeric G protein alpha and beta subunits from potato (Solatium tuberosum L.) // Mol. Cells. 2002. V. 13. № 1. P. 99-106.

114. Kato I., Schrode J., Kohr W.J., Laskowski M. Jr. Chicken ovomucoid: determination of its amino acid sequence, determination of the trypsin reactive site, and preparation of all three of its domains // Biochemistry. 1987. V. 26. № l.P. 193-201.

115. Khamrui S., Dasgupta J., Dattagupta J.K., Sen U. Single mutation at PI of a chymotrypsin inhibitor changes it to a trypsin inhibitor: X-ray structural (2.15

A) and biochemical basis // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1752. № l.P. 65-72.

116. Kim S., Hong Y.-N., An C.S., Lee K.-W. Expression characteristics of serine proteinase inhibitor II under variable environmental stresses in hot pepper (iCapsicum annuum L.) // Plant Sci. 2001. V. 161. № 1. P. 27-33.

117. Kim M.-H., Park S.-C., Kim J.-Y., Lee S.Y., Lim H.-T., Cheong H., Hahm K.-S., Park Y. Purification and characterization of a heat-stable serine protease inhibitor from the tubers of new potato variety "Golden Valley" // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V. 346. № 3. P. 681-686.

118. Kirchhamer C.V., Bogarad L.D., Davidson E.H. Developmental expression of synthetic cis-regulatory systems composed of spatial control elements from two different genes // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. № 24. P. 13849-13854.

119. Khalf M., Goulet C., Vorster J., Brunelle F., Anguenot R., Fliss I., Michaud D. Tubers from potato lines expressing a tomato Kunitz protease inhibitor are substantially equivalent to parental and transgenic controls // Plant Biotechnol. J. 2010. V. 8. №2. P. 155-169.

120. Knight C.G. The characterization of enzyme inhibition. (Barrett A.J., Salvesen G., eds.). Proteinase inhibitors. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands. 1986. p. 23-51.

121. Koiwa H., Bressan R.A., Hasegawa P.M. Regulation of protease inhibitors and plant defense // Trends Plant Science. 1997. V. 2. № 10. P. 379-384.

122. Kong L., Ranganathan S. Tandem duplication, circular permutation, molecular adaptation: how Solanaceae resist pests via inhibitors // BMC Bioinformatics. 2008. V. 9. № l.P. 22.

123. Korsinczky M.L.J., Schirra H.J., Rosengren K.J., West J., Condie B.A., Otvos

L., Anderson M.A., Craik D.J. Solution structures by 1H NMR of the novel

cyclic trypsin inhibitor SFTI-1 from sunflower seeds and an acyclic permutant

//J. Mol. Biol. 2001. V. 311. № 3. P. 579-591.

122

124. Korth K.L., Stermer B.A., Bhattacharyya M.K., Dixon R.A. HMG-CoA reductase gene families that differentially accumulate transcripts in potato tubers are developmentally expressed in floral tissues // Plant Mol. Biol. 1997. V. 33. №3. P. 545-551.

125. Kramell R., Miersch O., Hause B., Ortel B., Parthier B., Wasternack C. Amino acid conjugates of jasmonic acid induce jasmonate-responsive gene expression in barley {Hordeum vulgare L.) leaves // FEBS Lett. 1997. V. 414. № 2. P. 197-202.

126. Krapp A., Hoffman B., Schafer C., Stitt M. Regulation of the expression of rbcS and other photosynthetic genes by carbohydrates: a mechanism of the sink regulation of photosynthesis // Plant J. 1993. V. 3. № 6. P. 817-828.

127. Krauchenco S., Pando S.C., Marangoni S., Polikarpov I. Crystal structure of the Kunitz (STI)-type inhibitor from Delonix regia seeds // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 312. № 4. P. 1303-1308.

128. Krizaj I., Drobnic-Kosorok M., Brzin J., Jerala R., Turk V. The primary structure of inhibitor of cysteine proteinases from potato // FEBS Lett. 1993. V. 333. № 1-2. P. 15-20.

129. Krowarsch D., Cierpicki T., Jelen F., Otlewski J. Canonical protein inhibitors of serine proteases // Cell. Mol. Life Science. 2003. V. 60. № 11. P. 24272444.

130. Kunitz M., Northrop J. Isolation from beef pancrease of crystalline trypsinogen, trypsin, a trypsin inhibitor and an inhibitor- trypsin compound // J. Gen. Physiol. 1936. V. 19. № 6. P. 991-1007.

131. Kunitz M. Crystallisation of a trypsin inhibitor from soybean // Science. 1945. V. 101. №2635. P. 668-669.

132. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.

133. Laskowski M. Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Ann. Rev. Biochem. 1980. V. 49. P. 593-626.

134. Lawrence P.K., Koundal K.R. Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects // EJB. 2002. V. 5. № 1. P. 93-109.

135. Lee J.S., Brown W.E., Graham J.S., Pearce G., Fox E.A., Dreher T.W., Ahern K.G., Pearson G.D., Ryan C.A. Molecular characterization and phylogenetic studies of a wound-inducible proteinase inhibitor I gene in Lycopersicon species // Proc. Natl. Acad. Sci. U. .S A. 1986. Y. 83 № 19. P. 7277-7281.

136. Ledoigt G., Griffaut B., Debiton E., Vian C., Mustel A., Evray G., Maurizis J.-C., Madelmont J.-C. Analysis of secreted protease inhibitors after water stress in potato tubers // Int. J. Biol. Macromol. 2006. V. 38. № 3-5. P. 268-271.

137. Lievens S., Goormachtig S., Holsters M. Nodule-enhanced protease inhibitor gene: emerging patterns of gene expression in nodule development on Sesbania rostrata II J. Exp. Bot. 2004. V. 55. № 394. P. 89-97.

138. Lipke H., Fraenkel G. The toxicity of corn germ to the meal worm Tenebrio molitor II J. Nutr. 1955. V. 55. № 1. P. 165-178.

139. Lison P., Rodrigo I., Conejero V. A novel function for the cathepsin D inhibitor in tomato // Plant Physiol. 2006. V. 142. № 3. P. 1329-1339.

140. Lynch M., Force A. The probability of duplicate gene preservation by subfunctionalisation // Genetics. 2000. V. 154. № 1. P. 459-473.

141. Lynch M., O'Hely M., Walsh B., Force A. The probability of preservation of a newly arisen gene duplicate // Genetics. 2001. V. 159. № 4. P. 1789-1804.

142. Makhatadze G.I., Kim K.S., Woodward C., Privalov P.L. Thermodynamics of BPTI folding // Protein Science. 1993. V. 2. № 12. P. 2028-2036.

143. Marchetti S., Delledonne M., Fogher C., Chiaba C., Chiesa F., Savazzini A., Giordano A. Soybean Kunitz, C-II and PI-IV inhibitor genes confer different levels of insect resistance to tobacco and potato transgenic plants // Theor. Appl. Genet. 2000. V. 101. № 4. P. 519-526.

144. Mares M., Meloun B., Pavlik M., Kostka Vol., Baudys M. Primary structure of cathepsin D inhibitor from potatoes and its structure relationship to soybean

trypsin inhibitor family // FEBS Lett. 1989. V. 251. № 1-2. P. 94-98.

124

145. Martinez M., Abraham Z., Carbonero P., Diaz I. Comparative phylogenetic analysis of cystatin gene families from arabidopsis, rice and barley // Mol. Genet. Genomics. 2005. V. 273. № 5. P. 423-432.

146. McGurl B., Orozco-Cárdenas M., Pearce G., Ryan C.A. Overexpression of the prosystemin gene in transgenic tomato plants generates a systemic signal that constitutively induces proteinase inhibitor synthesis // Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 1994. V. 91. № 21. P. 9799-9802.

147. McManus M.T., White D.W.R., McGregor P.G. Accumulation of the chymotrypsin inhibitor in transgenic tobacco can affect the growth of insect pests // Transgenic Res. 1994. V. 3. № 1. P. 50-58.

148. MEROPS DATABASE http://merops.sanger.ac.uk

149. Michelmore R.W., Meyers B.C. Clusters of resistance genes in plants evolve by divergent selection and a Birth-and-Death process // Genome Res. 1998. V. 8. № 11. P. 1113-1130.

150. Mikola J., Suolinna E.M. Purification and properties of an inhibitor of microbial alkaline proteinases from barley // Arch. Biochem. Biophys. 1971. V. 144. №2. P. 566-575.

151. Miller E.A., Lee M.C.S., Atkinson A.H.O., Anderson M.A. Identification of a novel four-domain member of the proteinase inhibitor II family from the stigmas of Nicotiana alata II // Plant Mol. Biol. 2000. V. 42. № 2. P. 329-333.

152. Mitsumori C., Yamagishi K., Fujino K., Kikuta Y. Detection of immunologically related Kunitz and Bowman-Birk proteinase inhibitors expressed during potato tuber development // Plant Mol. Biol. 1994. V. 26. № 3.P. 961-969.

153. Mosolov V.V., Loginova M.D., Fedurkina N.V., Benken I.I. The biological significance of proteinase inhibitors in plants // Plant Sci. Lett. 1976. V. 7. № 2. P. 77-80.

154. Moura D.S., Ryan C.A. Wound-inducible proteinase inhibitors in pepper. Differential regulation upon wounding, systemin, and methyl jasmonate // Plant Phys. 2001. V. 126. № 1. P. 289-298.

155. Ochieng J., Chaudhuri G. Cystatin superfamily // J. Health Care Poor Underserved. 2010. V. 21. № 1. P. 51-70.

156. Odeny D.A., Stich B., Gebhardt C. Physical organization of mixed protease inhibitor gene clusters, coordinated expression and association with resistance to late blight at the StKI locus on potato chromosome III // Plant, Cell and Environment. 2010. V. 33. № 12. P. 2149-2161.

157. Oppert B., Morgan T.D., Hartzerb K., Lenarcicc B., Galesac K., Brzinc J., Turkc Vol., Yozad K., Ohtsubod K., Kramera K.J.. Effects of proteinase inhibitors on digestive proteinases and growth of the red flour beetle, Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) II Comp. Biochem. Physiol. Part C. 2003. V. 134. P. 481-490.

158. Otlewski J., Jelen F., Zakrzewska M., Oleksy A. The many faces of protease-protein inhibitor interaction //EMBO J. 2005. V. 24. № 7. P. 1303-1310.

159. Page M.J., Di Cera E. Serine peptidases: classification, structure and function // Cell Mol. Life. Sci. 2008. V. 65 № 7-8. p. 1220-1236.

160. Pando S.C., Oliva M.L.V., Sampaio C.A.V., Di Ciero L., Novello J.C., Marangoni S. Primary sequence determination of a Kunitz inhibitor isolated from Delonix regia seed//Phytochemistry. 2001. V. 57. № 5. P. 625-631.

161.Patankar A.G., Giri A.P., Harsulkar A.M., Sainani M.N., Deshpande V.V., Ranjekar P.K., Gupta V.S. Complexity in specificities and expression of Helicoverpa armigera gut proteinases explains polyphagous nature of the insect pest // Insect Biochem. Mol. Biol. 2001 V. 31. № 4-5. P. 453-464.

162. Pernas M., Sanchez-Monge R., Salcedo G. Biotic and abiotic stress can induce cystatin expression in chestnut // FEBS Lett. 2000. V. 467. № 2-3. P. 206-210.

163. Pompe-Novak M., Polsak-Prijatelj M., Popovic T., Strucelj B., Ravnikar M. Impact of potato cysteine proteinases in plant growth and development // Phys. Mol. Plant Pathol. 2002. V. 60. № 2. P. 71-78.

164. Popovic T., Brzin J. Purification and characterization of two cysteine proteinases from potato leaves and the mode of their inhibition with endogenous inhibitors // Croatica Chemica Acta. 2007. V. 80. № 1. P. 45-52.

165. Pouvreau L., Gruppen H., Piersma S.R., Van Den Broek L.A., Van Koningsveld G.A., Voragen A.G. Relative abundance and inhibitory distribution of protease inhibitors in potato juice from cv. Elkana // J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49. № 6. P. 2864-2874.

166. Pouvreau L., Gruppen H., Van Koningsveld G.A., Van Den Broek L.A.M., Voragen A.G.J. The most abundant protease inhibitor in potato tuber (cv. Elkana) is a serine protease inhibitor from the Kunitz family // J. Agric. Food Chem. 2003. V.51. № 17. P. 5001-5005.

167. Pouvreau L., Gruppen H., Van Koningsveld G.A., van den Broek L.A.M., Voragen A.G.J. Conformational stability of the potato serine protease inhibitor group. J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. № 8. P. 3191-3196.

168. Polgar L. The catalytic triad of serine peptidases // Cell Mol. Life Sci. 2005. V. 62. № 19-20. P. 2161-2172.

169. Piatigorsky J., Wistow G. The recruitment of crystallins: new functions precede gene duplication // Science. 1991. V. 252. № 5009. P. 1078-1079.

170. Qi R.-F., Song Z.-W., Chi C.-W. Structural features and molecular evolution of Bowman-Birk protease inhibitors and their potential application //Acta Biochim. Biophys. Sin. 2005. V. 37. № 5. P. 283-292.

171. Qu L.J., Chen J., Liu M., Pan N., Okamoto H., Lin Z., Li C., Li D., Wang J., Zhu G., Zhao X., Chen X., Gu H., Chen Z.. Molecular cloning and functional analysis of a novel type of Bowman-Birk inhibitor gene family in rice // Plant Physiol. 2003. V. 133. № 2. P. 560-570.

172. Quillien L., Ferrasson E., Molle D., Gueguen J. Trypsin inhibitor polymorphism: multigene family expression and posttranslational modification // J. Protein Chem. 1997. V. 16. № 3. P. 195-203.

173. Rancour J.M., Ryan C.A. Isolation of a carboxypeptidase B inhibitor from potatoes // Arch. Biochem. Biophys. 1968. V. 125. № 1. P. 380-383.

174. Ravichandran S., Sen U., Chakrabarti C., Dattagupta J.K. Cryocrystallography of a Kunitz-type serine protease inhibitor: The 90 K structure of winged bean chymotrypsin inhibitor (WCI) at 2.13 A resolution // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1999. V. 55. №. 11. P.1814-1821.

175. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidases // Biochem. J. 1993. V. 290. № 1. p. 205-218.

176. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem. J. 2004. V. 15. № 378. P. 705-716.

177. Revirón M.P., Vartanian N., Sallantin M., Huet J.C., Pernollet J.C., de Vienne D. Characterization of a novel protein induced by progressive or rapid drought and salinity in Brassica napus leaves // Plant Physiol. 1992. V. 100. № 3. P. 1486-1493.

178. Ribeiro J.K., Cunha D.D., Fook J.M., Sales M.P. New properties of the soybean trypsin inhibitor: inhibition of human neutrophil elastase and its effect on acute pulmonary injury // Eur. J. Pharmacol. 2010. V. 644. № 1-3. P. 238244.

179. Richardson M., Cossins L. Chymotrypsic inhibitor I from potatoes: The amino acid sequences of subunits B, C and D // FEBS Lett. 1974. V. 45. № 1. P. IIIS.

180. Richardson M. Seed storage proteins: the enzyme inhibitors // Methods in Plant Biochemistry. 1991. V. 5. P. 259-305.

181. Richardson J.L., Kröger B., Hoeffken W., Sadler J.E., Pereira P., Huber R., Bode W., Fuentes-Prior P. Crystal structure of the human alpha-thrombin-

haemadin complex: an exosite II-binding inhibitor // EMBO J. 2000. V. 19. № 21. P. 5650-5660.

182. Richardson J.L., Fuentes-Prior P., Sadler J.E., Huber R, Bode W. Characterization of the residues involved in the human alpha-thrombin-haemadin complex: an exosite II-binding inhibitor // Biochemistry. 2002. V. 41. №8. P. 2535-2542.

183. Rickauer M., Fournier J., Esquerré-Tugayé M.T. Induction of proteinase inhibitors in tobacco cell suspension culture by elicitors of Phytophthora parasitica var. nicotianae // Plant Physiol. 1989. V. 90. № 3. P. 1065-1070.

184. Ritonja A., Krizaj I., Mesko P., Kopitar M., Lucovnik P., Strukelj B., Pungercar J., Buttle D. J., Barrett A. J., Turk V. The amino acid sequence of a novel inhibitor of cathepsin D from potato // FEBS Lett. 1990. V. 267. № 1. P. 13-15.

185. Roychaudhuri R., Sarath G., Zeece M., Markwell J. Reversible denaturation of the soybean Kunitz trypsin inhibitor // Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 412. № l.P. 20-26.

186. Rudolph R., Lilie H. In vitro folding of inclusion body proteins // FASEB J. 1996. V. 10. № l.P. 49-56.

187. Ruoppolo M., Amoresano A., Pucci P., Pascarella S., Polticelli F., Trovato M., Menegatti E., Ascenzi P.. Characterization of five new low-molecular-mass trypsin inhibitors from white mustard (Sinapis alba L.) seed // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. № 21. P. 6486-6492.

188. Ryan C.A., Hass G.M., Kuhn R.W. Purification and properties of a carboxypeptidase inhibitor from potatoes // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. № 17. P. 5495-5499.

189. Ryan C.A., Bishop P., Pearce G. A sycamore cell wall polysaccharide and a chemically related tomato leaf polysaccharide possess similar proteinase inhibitor-inducing activities // Plant Physiol. 1981. V. 68. № 3. P. 616-618.

190. Ryan C.A. Protease Inhibitors in plants: genes for Improving defenses against insects and pathogens // Ann. Rev. Phytopathol. 1990. V. 28. P. 425-449.

191. Rydel T.J., Tulinsky A., Bode W., Huber R. Refined structure of the hirudin-thrombin complex // J. Mol. Biol. 1991. V. 221. № 2. P. 583-601.

192. Rydel T.J., Williams J.M., Krieger E., Moshiri F., Stallings W.C., Brown S.M., Pershing J.C., Purcell J.P., Alibhai M.F. The crystal structure, mutagenesis, and activity studies reveal that patatin is a lipid acyl hydrolase with a Ser-Asp catalytic dyad // Biochem. 2003. V. 42. № 22. P. 6696-6708.

193. Sambrook J., Fritch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual / Cold Spring Harbor, New-York.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. V. 3.P. 507-520.

194. Sanchez-Serrano J.J., Keil M., O'Connor A., Schell J., Willmitzer L. Wound expression of a potato proteinase inhibitor II gene in transgenic tobacco plants // EMBO J. 1987. V. 6. № 2. P. 303-306.

195. Shain Y., Mayer A. Activation of enzymes during germination by trypsin-like enzyme lettuce //Phytochemistry. 1968. V. 7. № 9. P. 1491-1498.

196. Shan L., Li C., Chen F., Zhao S., Xia G. A Bowman-Birk type protease inhibitor is involved in the tolerance to salt stress in wheat // Plant Cell Environ. 2008. V. 31. № 8. P. 1128-1237.

197. Shonbaum G.R., Zerner B., Bender M.L. The spectrophotometric determination of the operational normality of an alpha-chymotrypsin solution //J. Biol. Chem. 1961. V. 236. P. 2930-2935.

198. Shotton D.M., Watson H.C. The three-dimensional structure of crystalline Porcine pancreatic elastase // Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. A Discussion on the structures and functions of proteolytic enzymes. 1970. V. 257. № 813. P. 111-118.

199. Simillion C., Vandepoele K., Van Montagu M.C.E., Zabeau M., Van de Peer Y. The hidden duplication past of Arabidopsis thaliana II PNAS. 2002. V. 99. №21. P. 13627-13632.

200. Singh A., Sahi C., Grover A. Chymotrypsin protease inhibitor gene family in rice: Genomic organization and evidence for the presence of a bidirectional promoter shared between two chymotrypsin protease inhibitor genes // Gene. 2009. V. 428. № i_2. p. 9-19.

201. Silverman G.A., Bird P.I., Carrell R.W., Church F. C., Coughlin P. B., Gettins P. G. W., Irving J. A., Lomas D. A., Luke d Cliff J., Moyer R. W., Pemberton P. A., Remold-O'Donnell E., Salvesen G. S., Travis J., Whisstock J. C. The serpins are an expanding superfamily of structurally similar but functionally diverse proteins // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 36. P. 33293-33296.

202. Song H.K., Kim Y.S., Yang J.K., Moon J., Lee J.Y., Suh S.W. Crystal structure of a 16 kDa double-headed Bowman-Birk trypsin inhibitor from barley seeds at 1.9 A resolution // J. Mol. Biol. 1999. V. 293. № 5. V. 11331144.

203. Stiekema W.J., Heidekamp F., Dirkse W.G., van Beckum J., Haan P., ten Bosch C., Louwerse J.D. Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs // Plant Mol. Biol. 1988. V. 11. № 3. P. 255-269.

204. Strukelj B., Pungercar J., Mesko P., Barlic-Maganja D., Gubensek F., Kregar I., Turk V. Characterization of aspartic proteinase inhibitors from potato at the gene, cDNA and protein levels // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. 1992. V. 373. № 7. P. 477-482.

205. Suh S.G., Peterson J.E., Stiekema W.J., Hannapel D.J. Purification and characterization of the 22-kilodalton potato tuber proteins // Plant Physiol. 1990. V. 94. № l.P. 40-45.

206. Sumikawa J.T., Nakahata A.M., Fritz H., Mentele R., Sampaio M.U., Oliva M.L. A Kunitz-type glycosylated elastase inhibitor with one disulfide bridge // Planta Med. 2006. V. 72. № 5. P. 393-397.

207. Sweet R.M., Wright H.T., Janin J., Chothia C.H., Blow D.M. Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at

2.6-A resolution // Biochem. 1974. V. 13. № 20. P. 4212-4228.

131

208. Takahashi N., Terakado K., Nakamura G., Soekmadji C., Masuoka T., Yamasaki M., Hirose M. Dynamic mechanism for the serpin loop insertion as revealed by quantitative kinetics // J. Mol. Biol. 2005. V. 348. № 2. P. 409-418.

209. Teichmann S.A., Babu M.M. Gene regulatory network growth by duplication // Nat. Genet. 2004. V. 36. № 5. P. 492-496.

210. Trexler M., Banyai L., Patthy L. A human protein containing multiple types of protease-inhibitory modules // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. V. 98. № 7. P. 3705-3709.

211. Turra D., Bellin D., Lorito M., Gebhardt C. Genotype-dependent expression of specific members of potato protease inhibitor gene families in different tissues and in response to wounding and nematode infection // J. Plant Physiol. 2009. V. 166. № 7. P. 762-774.

212. Valdés-Rodríguez S., Guerrero-Rangel A., Melgoza-Villagómez C., Chagolla-López A., Delgado-Vargas F., Martínez-Gallardo N., Sánchez-Hernández C., Délano-Frier J. Cloning of a cDNA encoding a cystatin from grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) showing a tissue-specific expression that is modified by germination and abiotic stress // Plant Physiol. Biochem. 2007. V. 45. № 10-11. P. 790-798.

213. Valente R.H., Dragulev B., Perales J., Fox J.W., Domont G.B. BJ46a, a snake venom metalloproteinase inhibitor. Isolation, characterization, cloning and insights into its mechanism of action // EJB. 2001. V. 268. № 10. P. 30423052.

214. Valueva T.A., Revina T.A., Kladnitskaya G.V., Mosolov V.V. Kunitz-type proteinase inhibitors from intact and Phytophtora-infected potato tubers // FEBS L. 1998. V. 426. № 1. P. 131-134.

215. Valueva T.A., Revina T.A., Mosolov V.V., Mentele R. Primary structure of potato Kunitz-type serine proteinase inhibitor // Biol. Chem. 2000. V. 381. № 12. P. 1215-1221.

216. Van der Hoorn R.A.L. Plant proteases: From pheotypes to molecular mechanisms // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 191-223.

217. Van de Locht A. V., Stubbs M. T., Bode W., Friedrich T., Bollschweiler C., Hoffken W., Huber R. The ornithodorin-thrombin crystal structure, a key to the TAP enigma? // The EMBO Journal. 1996. V. 15 № 22. P.6011-6017.

218. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry // Circ. Res. 2003. V. 92. № 8. P. 827-839.

219. Wang Y., Chen X., Qiu L. Novel alleles among soybean Bowman-Birk proteinase inhibitor gene families // Sci. China C. Life Sci. 2008. V. 51. № 8. P. 687-692.

220. Walsh T. A., Twitchell W. P. Two Kunitz-type proteinase inhibitors from potato tubers // Plant Physiol. 1991. V. 97. № 1. P. 15-18.

221. Waxman L., Smith D.E., Arcuri K.E., Vlasuk G.P. Tick anticoagulant peptide (TAP) is a novel inhibitor of blood coagulation factor Xa // Science. 1990. V. 248. № 4955. P. 593-596.

222. Wei Z., Yan Y., Carrell R.W., Zhou A. Crystal structure of protein Z-dependent inhibitor complex shows how protein Z functions as a cofactor in the membrane inhibition of factor X // Blood. 2009. V. 114. № 17. P. 36623667.

223. Williamson V. M., Hussey R. S. Nematode pathogenesis and resistance in plants // Plant Cell. 1996. V. 8. № 10. P. 1735-1745.

224. Woloshuk C.P., Meulenhoff J.S., Sela-Buurlage M., van den Elzen P.J., Cornelissen B.J. Pathogen-induced proteins with inhibitory activity toward Phytophthora infestans II Plant Cell. 1991. V. 3. № 6. P. 619-628.

225. Wong P.P., Kuo T., Ryan C.A. Growth-dependent accumulation and utilization of proteinase inhibitor I in tobacco callus tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 63. № 1. P. 121-125.

226. Wright H.T., Scarsdale J.N. Structural basis for serpin inhibitor activity // Prot. Struct. Function and Genetics. 1995. V. 22. № 3. P. 210-225.

227. Wu Y., Llewellyn D., Mathews A., Dennis E.S. Adaptation of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) to a proteinase inhibitor expressed in transgenic tobacco // Mol. Breed. 1997. V. 3. № 5. P. 371-380.

228. Xu X., Pan S., Cheng S., Zhang B., Mu D., Ni P., Zhang G., Yang S., Li R., Wang J., Orjeda G., Guzman F., Torres M., Lozano R., Ponce O., Martinez D., De la Cruz G., Chakrabarti S.K., Patil V.U., Skryabin K.G., Kuznetsov B.B., Ravin N.V., Kolganova T.V., Beletsky A.V., Mardanov A.V., Di Genova A., Bolser D.M., Martin D.M., Li G., Yang Y., Kuang H., Hu Q., Xiong X., Bishop G.J., Sagredo B., Mejia N., Zagorski W, Gromadka R, Gawor J, Szczesny P, Huang S, Zhang Z, Liang C, He J., Li Y., He Y., Xu J., Zhang Y., Xie B., Du Y., Qu D., Bonierbale M., Ghislain M., Herrera Mdel R., Giuliano G., Pietrella M., Perrotta G., Facella P., O'Brien K., Feingold S.E., Barreiro L.E., Massa G.A., Diambra L., Whitty B.R., Vaillancourt B., Lin H., Massa A.N., Geoffroy M., Lundback S., DellaPenna D., Buell C.R., Sharma S.K., Marshall D.F., Waugh R., Bryan G.J., Destefanis M., Nagy I., Milbourne D., Thomson S.J., Fiers M., Jacobs J.M., Nielsen K.L., Sonderkser M., Iovene M., Torres G.A., Jiang J., Veilleux R.E., Bachem C.W., de Boer J., Borm T., Kloosterman B., van Eck H., Datema E., Hekkert B.L., Goverse A., van Ham R.C., Visser R.G. Genome sequence and analysis of the tuber crop potato // Nature. 2011. V. 475. № 7355. P. 189-195.

229. Yamagishi K., Mitsumori C., Kikuta Y. Nucleotide sequence of a cDNA encoding the putative trypsin inhibitor in potato tuber // Plant Mol. Biol. 1991. V. 17. №2. P. 287-288.

230. Yang L., Fang Z., Dicke M., van Loon J.J., Jongsma M.A. The diamondback moth, Plutella xylostella, specifically inactivates mustard trypsin inhibitor 2 (MTI2) to overcome host plant defense // Insect Biochem. Mol. Biol. 2009. V. 39. № 1. P. 55-61.

231. Yeh K.W., Chen J.C., Lin M.I., Chen Y.M., Lin C.Y. Functional activity of sporamin from sweet potato (Ipomoea batatas Lam.): a tuber storage protein with trypsin inhibitory activity // Plant Mol. Biol. 1997. V. 33. № 3. P. 565570.

232. Zeng X.-H., Wei Y.-M, Jiang Q.-T., Qi P.-F., Zheng Y.-L. SNP analysis and haplotype identification in chymotrypsin inhibitor-2 (CI-2) // Gene of Barley Agricultural Sciences in China. 2009. V. 8. № 1. P. 8-14.