Исследование структуры и мембранолитического действия пороформирующих токсинов актиний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, доктор химических наук Монастырная, Маргарита Михайловна

• Монастырная, Маргарита Михайловна
• доктор химических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор химических наук Монастырная, Маргарита Михайловна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. СТРУКТУРА И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ.

2.1. Мишени действия мембраноактивных белков и пептидов.

2.2. Классификация пороформирующих токсинов (ПФТ).

2.3. Основные ступени порообразования.

2.4. а-Пороформирующие токсины.

2.4.1. Колицины бактерии Escherichia coli.

2.4.2. Апоптотические белки Вах и Bcl-xL семейства Вс1-2 белков, ключевых регуляторов апоптоза.:.

2.4.3. Дифтерийный токсин (ДТ) из Corynebacterium diphtheriae.

2.4.3.1. Некоторые биохимические аспекты действия ДТ.

2.4.3.2. Основа структурно-функциональных взаимосвязей ДТ.

2.4.4. Актинопорины - высокомолекулярные цитолизины актиний П-й группы.

2.4.4.1. Классификация цитолизинов актиний.

2.4.4.2. Первичная структура актинопоринов.

2.4.4.3. Вторичная и третичная структуры актинопоринов.

2.4.4.4. Исследование конформационного состояния актинопоринов.

2.4.4.5. Взаимодействие актинопоринов с липидными компонентами мембран.

2.4.4.6. Исследование механизма олигомеризации актинопоринов.

2.4.4.7. Исследование взаимодействия актинопоринов с мембранным интерфейсом, фосфохолиновый сайт связывания.

2.4.4.8. Молекулярный механизм порообразования.

2.5. p-Пороформирующие токсины.

2.5.1. Стафилококковый а-гемолизин из Staphylococcus aureus.

2.5.2. Холестеринзависимые цитолизины (ХЗЦ) грамположительных бактерий.

2.5.2.1. Перфринголизин О из Clostridium perfringens и родственные ХЗЦ.

2.5.2.2. Сайт связывания ХЗЦ с мембранным холестерином.

2.5.2.3. Механизм мембранолитического действия ХЗЦ.

2.5.2.4. Влияние холестерина на олигомеризацию и литическую активность ХЗЦ.

2.5.2.5. Биохимические эффекты ХЗЦ.

2.5.3. Гидрализины - новая группа р-ПФТ гидр семейства Cnidaria.

2.6. Пороформирующие антимикробные пептиды.

2.6.1. Биологическая роль и классификация.

2.6.2. Механизм мембранотропного действия.

2.6.3. Дермасептины.

2.6.4. Мелиттин.

2.6.5. Аламетицин.

2.7. Некоторые аспекты молекулярной организации и функционирования цитоплазматических мембран, определяющие механизм действия мембраноактивных белков и пептидов.

2.7.1. Структурная организация бислоя и функциональная роль липидных микродоменов.

2.7.2. Модуляция изменений цитоскелета клеток-мишеней бактериальными патогенами.

2.7.3. Сравнительная характеристика структурных особенностей водорастворимых мембраноактивных белков и пептидов и мембранных белков цитоплазматических мембран.

2.7.4. Локализация и роль остатков ароматических аминокислот в связывании с мембранным интерфейсом.

2.7.5. Движущие силы фолдинга мембраноактивных пептидов и белков, взаимодействующих с мембраной.

2.8. Перспективы исследования ПФТ и антимикробных пептидов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структуры и мембранолитического действия пороформирующих токсинов актиний»

3.2. Поиск цитолизинов в актиниях тропических и дальневосточных морей.73

3.3. Выделение и очистка цитолизинов актиний.76

3.3.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины (II группа).76

3.3.2. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины (I группа).81

3.3.3. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины (II группа).90

3.3.4. Высокомолекулярный Metridium цитолизин (IV группа).94

3.4. Физико-химические свойства, липидная специфичность и биологическая активность цитолизинов актиний.95

3.4.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины.95

3.4.2. Низкомолекулярные Radianthus цитолизины Rml и Rmll.103

3.4.3. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины.106

3.4.4. Высокомолекулярный Metridium цитолизин.108

3.5. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на модельные мембраны.111

3.5.1. Влияние Radianthus цитолизина RTX-A и Metridium цитолизина на проницаемость липосом.111

3.5.2. Порообразующее действие Radianthus, Oulactis, Metridium цитолизинов на бислойные липидные мембраны (БЛМ).123

3.5.2.1. Высокомолекулярные Radianthus цитолизины.123

3.5.2.2. Высокомолекулярные Oulactis цитолизины.138

3.5.2.3. Низкомолекулярный Radianthus цитолизин Rmll.140

3.5.2.4. Метридиолизин из Metridium senile.142

3.6. Исследование мембранолитического действия цитолизинов на биологические мембраны.147

3.6.1. Действие цитолизинов П-й, 1-й и IV-й групп на эритроциты млекопитающих.147

3.6.2. Действие Radianthus цитолизина RTX-A на яйцеклетки морского ежа

Strongylocentrotus intermedins.152

3.6.3. Изучение проводимости изолированного фрагмента эритроцитарной мембраны, индуцированной цитолизином RTX-A.153

3.6.4. Влияние цитолизина RTX-S II на развитие ооцитов морского ежа Strongylocentrotus intermedius.157

3.7. Исследование липидной специфичности и липид-белкового взаимодействия Radianthus цитолизинов методом дифференциальной сканирующей калориметрии.158

3.8. Установление первичной структуры Radianthus и Oulactis цитолизинов.171

3.8.1. Определение частичной аминокислотной последовательности Oulactis цитолизинов Or-А и Or-G и Radianthus цитолизинов RTX-A, RTX-S II и Rmll методами структурной химии белка.171

3.8.2. Установление полной аминокислотной последовательности Or-А и Or-G. 174

3.8.3. Установление полной аминокислотной последовательности RTX-A.181

3.8.4. Установление полной аминокислотной последовательности RTX-S II.185

3.9. Исследование вторичной структуры и конформационной стабильности актинопорина RTX-S II.189

3.9.1. Пространственная организация нативного актинопорина RTX-S II.189

3.9.2. Влияние различных факторов на конформацию актинопорина RTX-S И.191

3.9.3. Влияние температуры, величины рН и ионной силы раствора на гемолитическую активность RTX-S II.200

3.10. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей Radianthus и Oulactis актинопоринов.203

3.11. Radianthus актинопорины как инструмент количественного определения сфингомиелина в биологических жидкостях и тканях.213

3.12. Заключение.214

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. .215

5. ВЫВОДЫ.233

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.236

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одним из важнейших направлений биоорганической химии и ряда смежных наук является установление молекулярной организации и механизмов функционирования биологических мембран. Изучение защитной и коммуникативной функций биомембран, осуществляемых на уровне клетки и внутриклеточных компартментов, а также ряда процессов, происходящих при их участии - биосинтеза и секреции белков, функционирования систем гормонального ответа и сигнальной трансдукции, биоэнергетических процессов, требует применения широкого набора биохимических инструментов. Общепризнанными и универсальными инструментами исследования цитоплазматических мембран являются высокоспецифичные соединения белковой природы, продуцируемые как прокариотами, так и эукариотами, которые относят к группам а- и р-пороформирующих токсинов (ПФТ), а также антимикробных пептидов. Созданные природой для разрушения мембран клеток-мишеней эти цитолитические токсины представляют собой удивительные структуры, способные существовать как в водорастворимом, так и в мембраносвязанном состоянии, в котором они осуществляют свое мембранолитическое действие. Благодаря установлению первичной структуры и пространственной организации многих ПФТ и мембраноактивных пептидов определена ключевая роль конформационных изменений, претерпеваемых их молекулами при переходе из водорастворимого в мембраносвязанное состояние. Предполагают, что состояние так называемой «расплавленной глобулы», характеризующееся переходом гидрофобных трансмембранных областей молекул из белкового кора в мембрану, ответственно за функциональную активность ПФТ. Очевидно, выяснение природы рецепторного взаимодействия мембраноактивных белков и полипептидов с мембранными белками, впрямую связанное с установлением структуры обеих групп белков, а также молекулярной организации мембран клеток-мишеней, должно способствовать пониманию механизма действия ПФТ.

Одной из широко исследуемых в последние годы моделей ПФТ являются актинопорины - цитолитические токсины, продуцируемые актиниями, морскими ядовитыми кишечнополостными (тип Coelenterata). Совместно с фосфолипазами, нейротоксинами, протеолитическими ферментами и ингибиторами протеиназ они входят в состав ядовитого секрета актиний. Известно, что цито- и нейротоксины выполняют в организме-продуценте алломональную роль, тогда как роль протеаз и их ингибиторов изучена еще недостаточно. Ее выяснение, очевидно, поможет понять механизмы экспрессии полипептидов актиний, в частности пре- и пропептидов цитолизинов, имеющих гомологичные фрагменты аминокислотной последовательности с рядом полипептидов актиний (класс Anthozoa) и других организмов типа Cnidaria, таких как гидры и кораллы (класс Hydrozoa).

Огромный интерес к цитолизинам актиний обусловлен не только возможностью их применения в качестве инструментов исследования биомембран, но и проявляемой ими биологической активностью (например, кардиостимулирующей, антиопухолевой, антипаразитарной), что позволяет использовать цитолизины как модели для дизайна современных высокоспецифичных фармакологических и биотехнологических препаратов направленного действия.

ПФТ актиний являются незаменимыми инструментами и уникальными модельными системами для исследования липид-белковых, белок-белковых и белок-мембранных взаимодействий: их включение в мембрану не требует участия других соединений (например, шаперонов) или транслокона, поскольку вся необходимая для этого информация заключена в их собственной структуре. Кроме того, структурное и функциональное подобие ПФТ некоторым мембранным белкам, таким как порины грамотрицательных бактерий, позволяет использовать их в качестве моделей для изучения механизма действия поринов, поскольку получение последних в кристаллическом виде представляет значительную трудность. В то же время топология исследованных к настоящему времени мембранных белков вносит вклад в понимание механизмов взаимодействия с мембраной мембраноактивных водорастворимых белков. Этот факт, а также наличие ряда противоречий между литературными данными по исследованию структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов и результатами наших исследований диктуют необходимость расширения поиска и установления структуры новых ПФТ актиний.

Заманчивой целью в изучении цитолизинов актиний является установление их экологической и алломональной роли в морском биоценозе, установление структуры анцестрального гена для гомологов и ортологов этих полипептидов, а также выяснение правомерности гипотезы, представляющей актинопорины видовыми или родовыми хемотаксономическими маркерами.

Целью данного исследования являлся поиск новых источников цитолитических токсинов среди актиний низкобореальных и тропических вод, выделение цитолизинов, изучение их свойств, липидной специфичности и механизма действия, а также установление структуры и выяснение структурно-функциональных взаимосвязей цитолизинов (актинопоринов), ингибируемых сфингомиелином.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые в гомогенном состоянии выделено четыре высокомолекулярных сфингомиелинингибируемых цитолизина, отнесенных к группе актинопоринов: два из дальневосточной актинии Oulactis orientalis и два из тропической актинии Radianthus macrodactylus. Из R. macrodactylus выделено также два низкомолекулярных гистаминолитических Radianthus цитолизина, подобных цитолизину из актинии Tealiafelina.

Впервые исследовано мембранолитическое действие высокомолекулярных Radianthus актинопоринов на изолированном фрагменте эритроцита кролика и доказан общий для модельных и биологических мембран механизм литического действия этих полипептидов. Также впервые исследовано действие метридиолизина на модельные мембраны и установлено отсутствие высокой липидной специфичности к мембранному холестерину. Установлено, что в отличие от Radianthus актинопоринов, типичных каналоформеров, метридиолизин в низких концентрациях проявляет канальные свойства, а в высоких - действует подобно поверхностноактивным соединениям.

Установлена первичная структура новых Oulactis и Radianthus актинопоринов, причем впервые - для двух представителей, продуцируемых актинией холодных низкобореальных вод. Установлена аминокислотная последовательность /V-концевого фрагмента одного из низкомолекулярных Radianthus цитолизинов, отличающаяся от аналогичного фрагмента актинопоринов и имеющая 83% подобия с /V-концевым фрагментом ингибитора протеиназ из R. macrodactylus.

Методами сравнительного моделирования предсказана пространственная структура Radianthus и Oulactis актинопоринов. Проведен анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов. Показано, что //-концевые фрагменты аминокислотных последовательностей актинопоринов дальневосточной актинии короче на несколько аминокислотных остатков, что объясняет различия в величине их гемолитической активности.

Полученные результаты позволяют заключить, что Oulactis актинопорины являются уникальными природными моделями для изучения структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов.

Настоящая работа представляет собой первое исследование взаимодействия Radianthus актинопоринов с белковыми компонентами цитоплазматических мембран, в частности с основным структурным белком цитоскелета актином. Согласно результатам, полученным при изучении действия Radianthus актанопорина на яйцеклетки морского ежа, полипептид влияет на процессы полимеризации и/или деполимеризации актина, лежащие в основе клеточной пролиферации. Результаты изучения мембранотропного действия актинопоринов на биологические мембраны и анализ их структурно-функциональных взаимосвязей позволяют предположить, что фармакологические эффекты, проявляемые актипопоринами, обусловлены как их пороформирующим действием, так и рецепторным взаимодействием с белковыми компонентами биологических мембран.

Установление структуры и функции ПФТ важно для решения многих задач и проблем в таких областях научных знаний, как мембранология, клеточная биология и биохимия и др., оно необходимо и для прикладных исследований, так как создает предпосылки к дизайну новых высокоспецифичных фармакологических средств, избирательно действующих на клетки-мишени.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Монастырная, Маргарита Михайловна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые из тропической актинии Radianthus macrodactylus и дальневосточной Oulactis orientalis выделено восемь новых цитолитических токсинов. Согласно физико-химическим характеристикам и липидной специфичности шесть из них отнесены к группе высокомолекулярных цитолизинов актиний, ингибируемых сфингомиелином (актинопоринам), а два - к группе низкомолекулярных цитолизинов, проявляющих антигистаминную активность. Показано, что метридиолизин из дальневосточной актинии Metridium senile, отнесенный ранее к группе цитолизинов, ингибируемых холестерином, не проявляет к этому липиду высокой специфичности.

2. Установлено, что в основе мембранолитического действия цитолизинов на биологические и модельные мембраны лежит специфическое связывание с липидным матриксом мембран и последующее формирование в них потенциалозависимых ионных каналов (пор). Показано, что в отличие от ингибируемых сфингомиелином Radianthus и Oulactis цитолизинов, типичных каналоформеров, Metridium цитолизин в низких концентрациях формирует в мембранах короткоживущие ионные каналы, а в высоких действует подобно поверхностно активным соединениям. Обнаружено, что взаимодействие низкомолекулярных цитолизинов с мембраной обратимо, их пороформирующая активность проявляется в концентрациях на два порядка превосходящих действующие концентрации актинопоринов.

3. Установлены полные аминокислотные последовательности Radianthus актинопоринов RTX-A и RTX-S II и Oulactis актинопоринов Or-А и Or-G. Обнаружена высокая степень гомологии (90% и выше) в первичной структуре актинопоринов актиний, принадлежащих к одному семейству. Установлена частичная аминокислотная последовательность //-концевого фрагмента молекулы низкомолекулярного Radianthus цитолизина Rmll, которая имеет 83% гомологии с аналогичной последовательностью ингибитора протеиназ JnlV из R. macrodactylus.

Впервые показано, что дальневосточная актиния О. orientalis продуцирует актинопорины, имеющие укороченные //-концевые фрагменты.

4. Показано, что Radianthus актинопорины принадлежат к мультигенному семейству, а гены, кодирующие их последовательности, не содержат интронов.

5. Исследована пространственная организация актинопорина RTX-S II на уровне его вторичной и третичной структуры. Показано, что молекула имеет достаточно жесткую третичную структуру и вторичную, отличающуюся высоким содержанием Р-структуры.

6. Показано, что различные денатурирующие факторы (температура, рН среды, ионная сила раствора) влияют на конформационную стабильность и гемолитическую активность полипептида. Обнаружено, что в третичной структуре RTX-S II при увеличении ионной силы раствора, а также при увеличении рН выше 4,0 происходят конформационные изменения, характерные для состояния интермедиата молекулы, называемого «расплавленной глобулой». Данное конформационное состояние благоприятствует увеличению мембранолитической активности актинопорина. Показано, что вторичная структура полипептида достаточно стабильна - сохраняется практически неизменной в широком диапазоне рН (от 2,0 до 11,7). Наблюдаемое в щелочной среде резкое увеличение активности связано, вероятно, с ионизацией остатков тирозина. Происходящая при температуре выше 53°С необратимая денатурация полипептида приводит к полной потере его активности.

7. Методами сравнительного моделирования по аминокислотным последовательностям Radianthus и Oulactis актинопоринов и кристаллографическим данным их прототипов, эквинатоксина II из A. equina и стихолизина II из S. helianthus, предсказаны пространственные структуры Or-А, Ог-G, RTX-A и RTX-S II, которые имеют высокую степень подобия со структурами актинопоринов-прототипов, за исключением N-концевого фрагмента молекул.

8. Анализ структурно-функциональных взаимосвязей актинопоринов показал, что значительные различия в величине гемолитической активности обусловлены различиями в аминокислотной последовательности функционально важных участков молекул, фосфохолинового сайта связывания и //-концевого спирализованного фрагмента, в частности его длины, амфифильности и заряда а.о., экспонированных во внутреннюю полость формируемой поры. Противоречия в интерпретации структурно-функциональных взаимосвязей нативных и мутантных форм актинопоринов, касающиеся значимости положения определенных а.о. в сайте связывания, показывают, что в мембранолитическом действии нативных и мутантных форм актинопоринов имеются существенные отличия.

9. Установлено, что актинопорины оказывают тормозящее действие на развитие ооцитов морского ежа, что свидетельствует об их влиянии на процессы пролиферации клеток, а действие на эритроцитарные мембраны модулирует разрыв связи основного структурного белка цитоскелета, актина, с липидным матриксом. Данные эффекты указывают на то, что фармакологическое действие актинопоринов может быть обусловлено как липид-белковым, так и белок-белковым взаимодействием этих токсинов с компонентами биологических мембран и цитоскелета.

3.12. Заключение

Проведенный анализ структуры и функции актинопоринов тропических и дальневосточной актиний подтвердил экспериментально полученные данные, свидетельствующие о функциональной важности //-концевого фрагмента (его длины, амфифильности и заряда а.о., экспонированных внутрь поры) и фосфохолинового сайта связывания. Вместе с тем появившиеся в результате анализа противоречия в интерпретации структурно-функциональных взаимосвязей этой группы ПФТ требуют проведения дальнейших исследований как с помощью мутантных, так и нативных форм. Помимо этого до сих пор неясно, какие фрагменты молекулы актинопорина включены в процесс олигомеризации, являются ли липидные рафты местом включения актинопоринов в мембраны, какова роль RGD-мотива в молекуле. Не выяснен также молекулярный механизм мембранолитического действия низкомолекулярных цитолизинов и высокомолекулярного метридиолизина. Не вызывает сомнения, что дальнейшее изучение структурно-функциональных взаимосвязей как известных, так и новых представителей цитолизинов актиний, а также их мутантных форм позволит ответить на многие из этих вопросов. Этому будет способствовать также детальное изучение белок-белковых взаимодействий цитолизинов in vitro, а также in vivo на молекулярном уровне с учетом их влияния на клеточные компоненты.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Материалы

В работе были использованы полихром-1 (Олайне, Латвия); Акрилекс П-4, целлюлоза КМ-23 (Reanal, Венгрия), бычий сывороточный альбумин (Reanal, Венгрия); сефадекс G-15 и сефароза 4В (Pharmacia, Швеция); целлюлоза КМ-32 (Whatman, Англия и Serva, ФРГ); ацетонитрил 1 сорта (Криохром, Санкт-Петербур); трихлоруксусная кислота (Merck, ФРГ); реактивы для капиллярного ДНК секвенатора, реактивы для автоматического метода Эдмана (Applied Biosystems, США); трипсин (СПОФА, Чехословакия и Worthington, США); N-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфоновая кислота (HEPES), фосфолипаза К2 из пчелиного яда, фосфолипаза А и фосфолипаза С из С. welcbii (Calbiochem, США); сфингомиелиназа (Boehringer Mannheim, ФРГ); набор стандартов для определения молекулярных масс (Pharmacia, Fine Chemicals АВ, США и Serva, ФРГ); реактивы для электрофореза в ПААГ, 5-диметиламинонафталин-1-сульфохлорид (дансихлорид), наборы стандартных DNS-аминокислот, дицетилфосфат, цетилтриметиламмонийбромид (Serva, ФРГ); реактивы для автоматического анализатора Д-500 (Durum, Pierce, США), триптон, глицерин, гуанидинизотиоцианат, саркозил (ICN Biochemicals, США); агар (Ferak Berlin, Германия); дрожжевой экстракт, глюкоза, тригидроксиметиламинометан (Трис), этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (EDTA), N-6eH30Wi-D,L-аргииина л-нитроанилид (BAPNA), Р-меркаптоэтанол, холестерин, сфингомиелин из мозга быка, L-a-фосфатидилэтаноламин, L-a-фосфатидилхолин из соевых бобов и яичный отечественного производства, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, L-a-димиристоилфосфатидилхолин, a-моноолеин, а-моноэруцин, 1-а-дифосфатидил-£^глицерин, стеариламин (Sigma, США); фосфолипиды из яйцеклеток морского ежа S. intermedius; сыворотка крови (Hyland Division Traveno, Laboratories S.A., Бельгия); родамид В (Wako Pure Chemical Industries, Япония); IPTG, X-Gal (Fermentas, Литва); агароза (BioRad, США); силикагель марки КСК с размером частиц 5-7 мк (Россия); дезоксинуклеозидтрифосфаты, дидезоксинуклеозидтрифосфаты, [a-33P]dATP, эндонуклеазы рестрикции, Т4-ДНК-лигаза, щелочная фосфатаза, Т4полинуклеотидкиназа, Гяд-ДНК-полимераза, олигонуклеотидные праймеры M13F и M13R (Сибэнзим, Новосибирск); олигонуклеотидные Dirl, Dir2, Dir3, Rev праймеры (EuroGene, Москва); RMS-F, C33-39F, C80-85F, C143-148F и C143-148R (синтезированы Н.Н. Мудриком, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН). Все остальные использованные реактивы имели квалификацию "ос. ч".

4.2. Приборы и оборудование

Для ВЭЖХ использовали колонки с обращенной фазой Nucleosil С)8, Silasorb С18 (Sigma Aldrich, США или 10x250 мм, Элсико, НПО Диагностикум), Microsil Cis (Macherey-Nadel, Германия) и колонку с ионообменной смолой Ultropac TSK CM-3SW (21,5x150 мм, LKB, Швеция), а также жидкостной хроматограф Altex 114М Solvent Delivery Module (Beckman, США), детектор 2151 (LKB, Швеция).

Детектирование белков осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvicord 8300 (LKB, Швеция) при длине волны 280 нм и 214 нм.

Аминокислотный анализ проводили на аминокислотном анализаторе D-500 (Durum, США) и Pharmacia-LKB 4151 (Alpha Plus, Швеция).

Для определения молекулярной массы актинопорина RTX-SII использовали время-пролетные масс-спекгрометры (MALDI-TOF MS) Vision 2000 (Termo, Англия) и BIFLEX III (Bruker, Германия).

Капиллярный электрофорез проводили на 270А Capillary Electrophoresis System (Applied Biosystem).

Исследование проницаемости эритроцитов, липосом и яйцеклеток ежа при действии цитолизинов проводили с помощью валиномицинового К+-селективного электрода типа ОР-К-0711Р и ионографа ОР-267 (Radelkis, Венгрия). В качестве электрода сравнения был использован каломельный электрод типа К-701 (Radiometer, Дания), заполненный насыщенным раствором NaCl.

Степень гемолиза эритроцитов цитолизинами рассчитывали по поглощению супернатанта, полученного после центрифугирования суспензии эритроцитов, на фотометре Spectromom-410 (MOM, Венгрия) при 540 нм.

Измерение электрических характеристик БЛМ осуществляли иа высокоомном вольтметр-электрометре ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране e помощью хлор-серебряных электродов, ток на выходе регистрировали усилителем потенциометром КПС-4.

Калориметрические измерения проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (СССР).

Анализ белковых компонентов теней эритроцитов проводили с помощью горизонтального SDS-электрофореза в градиенте плотности ПААГ (5-20%). Гели сканировали на денситометре ДСА-1 (СССР).

Токи через изолированные фрагменты эритроцитарной мембраны в конфигурации «inside-out» регистрировали с помощью усилителя ЕРС-5 (List-electronik, ФРГ). Данные записывали на магнитограф для последующей обработки.

Секвестрование //-концевых фрагментов актинопоринов проводили на секвенаторе модели 477А и Procise модели 492 (Applied Biosystems, США) по программе производителя, для чего осуществляли очистку полипептидов на системе 270А Capillary Electrophoresis System (Applied Biosystem).

УФ-спектры полипепидов снимали на спектрофотометре CECIL СЕ 7250 (Англия).

Спектры КД полипепидов регистрировали на спектрополяриметре (Jasco-500А, Япония).

Спектры флуоресценции актинопорина измеряли на спектрофлуориметре (Hitachi 850, Япония).

Количество остатков тирозина и триптофана в полипептидах оценивали спектрофотометрически по 2-ой производной УФ-спектров поглощения полипептидов иа приборе Сагу 219 (Varian, Англия) и на CECIL СЕ 7250 спектрофотометре (Англия).

Величину рН растворов измеряли на рН-метре (InoLab, ФРГ).

Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе (Eppendorf, Германия).

Секвенирование плазмидных ДНК осуществляли с прямым и обратным М13-праймерами на капиллярном ДНК-секвенаторе (ABI, PRISM™ 310, США).

Рекомбинантные клоны секвенировали с прямым и обратным М13-праймерами с [33Р] dATP на ДНК-секвенаторе версии 2.0 (Amersham, США).

4.3. Сведения о биологическом материале

Актинию R. macrodactylus собирали на литорали Сейшельских островов во время научных экспедиций НИС «Академик Опарин» в 1984-2000 г.г. Образцы актинии замораживали и хранили при -20°С. Актинии О. orientalis и М. senile собирали на глубине до 1 м в заливе Посьета Японского моря (Хасанский район Приморского края) в начале сентября 2002 г. в ходе экспедиции НИС «Академик Опарин» и хранили при температуре -20°С. Вид, определенный как О. orientalis, ранее был описан как A. orientalis [257]. Видовая принадлежность актиний определена к.б.н. С.Д. Гребельным (ЗИН РАН, Санкт-Петербург) и к.б.н. Е.Е. Костиной (ИБМ ДВО РАН, Владивосток). Все выделительные операции проводили при 4°С.

Несколько актиний вида О. orientalis хранили в аквариуме с природной морской водой для последующего выделения из них генетического материала. Щупальца актинии R. macrodactylus для выделения генетического материала, собранные в Желтом море на глубине до 1 м и любезно предоставленные к.б.н. Д.А. Жадан (подводный клуб МГУ «Босфор»), хранили в лизирующем буферном растворе D (4 М гуанидинизотиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% лаурилсаркозил натрия, 0,1 М (З-меркаптоэтанол) до использования.

4.4. Выделение цитолизинов актиний

Приготовление экстракта. Цельные актинии (0,5 кг) гомогенизировали с тремя объемами соответствующего растворителя (вода или этанол), выдерживали на холоде (+4°С) в течение 12 часов, экстракт фильтровали через несколько слоев ткани, а затем центрифугировали при 4000xg (К-23, ГДР) в течение 1 часа. Осадок отбрасывали, супернатант повторно центрифугировали при 10000xg (К-24, ГДР) в течение 2 часов. Липидный слой отбрасывали, прозрачный супернатант диализовали против воды и использовали для определения биологической активности. В случае экстракции этанолом супернатант предварительно упаривали на роторном испарителе при 40°С.

Осаждение ацетоном суммарных водорастворимых фракций полипептидов. 1 кг перемолотых актиний заливали 4 л воды, экстрагировали 12 ч при 4°С, затем центрифугировали 2 ч при 3000 об/мин. Осаждение 50%-ным ацетоном выполняли путем добавления 300 мл охлажденного до -20°С ацетона к 300 мл холодного супернатанта. При добавлении ацетона экстракт медленно перемешивали, а затем 15 мин выдерживали на холоду. Осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин (10 мин). Осаждение 80%-ным ацетоном выполняли добавлением к 540 мл полученного супернатанта 180 мл охлажденного ацетона. После центрифугирования осадок сушили 8-12 ч в вакууме над хлоридом кальция.

Гидрофобную хроматографию водных экстрактов актиний проводили на колонках (4,5x120 см либо 2,6x15 см) с полихромом-1, уравновешенным водой. Элюцию цитолизинов осуществляли водой (1500 мл) со скоростью 120 мл/ч, объем фракций составлял 20 мл, элюцию ингибиторов протеиназ - 40%-ным этиловым спиртом (1200 мл) со скоростью 3 мл/мин, объем фракций составлял 9 мл. Детектирование осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvicord 8300 (LKB, Швеция) при длине волны 280 или 214 нм.

Хроматографию в статическом варианте проводили на воронке Шотта № 4 (объем 300 см3) с целлюлозой КМ-23 (Reanal, Венгрия), уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0. Элюцию осуществляли 0,5 М NaCl в том же буферном растворе.

Обессоливание и гель-фильтрацию проводили на колонках (2,5x30 см) или (3x90 см) с Акрилексом П-4, уравновешенных 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0 при скорости элюции 18 мл/ч. Объем фракций 4,5 мл.

Ионообменную хроматографию цитолизинов проводили на колонке (2,6x50 см) с целлюлозой КМ-32, уравновешенной 0,01 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в линейном градиенте концентрации NaCl (0-0,5 М, общий объем 2 л) в рабочем буферном растворе. Скорость элюции составляла 24 мл/ч, объем фракций - 4,5 мл.

Ионообменную ВЭЖХ цитолизинов проводили на колонке Ultropac TSK CM-3SW (21,5x150 мм), уравновешенной 0,1 М аммоний-ацетатным буферным раствором, рН 6,0, в ступенчатом градиенте от 0,1 до 1 М аммоний-ацетатного буферного раствора, рН 6,0 при скорости элюции 1 мл/мин.

ВЭЖХ на носителе с обращенной фазой сорбента цитолизинов проводили либо на колонке с обращенной фазой Nucleosil Cj8 (4,6x250 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (5-60%) в 0,1%-ном водном растворе ТФУ, рН 2,2 при скорости 1 мл/мин, либо на Nucleosil С|8 (2,0x75 мм) на хроматографе МилиХром А-02 в ступенчатом градиенте от 10 до 65% ацетонитрила в 0,1%-ном водном растворе ТФУ при скорости элюции 200 мкл/мин.

Аффинную хроматографию проводили на колонке (1x10 см) с активированной трипсином сефарозой согласно [348]. Лиофильно высушенные фракции А и Б обессоливали на колонках с Акрилексом П-4 и Полихромом-1 соответственно. Цитолизины фракции А элюировали водой, а ингибиторы фракции Б - 40%-ным этанолом.

Гель-фильтрацию ингибиторов протеиназ проводили на колонке с сефадексом G-15 (1,5x95 см), элюируя активные фракции водой со скоростью 18 мл/ч. Объем фракций составлял 5 мл.

4.5. Общие методы исследования физико-химических характеристик и структуры цитолизинов

Количество белка определяли по методу Лоури [349], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

SDS-электрофорез проводили в вертикальных пластинах (9x12x1 мм) 14%-ого полиакриламидного геля в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия (SDS) или в градиенте плотности ПААГ по методу Лэммли [350].

Молекулярную массу цитолизинов определяли на времяпролетпом масс-спектрометре (MALDI-TOF MS) Vision 2000 (Termo, Англия). Времяпролетные масс-спектры фиксировали в прямом пролете и режиме рефлектора.

Изоэлектрическую точку цитолизинов определяли методом изоэлектрофокусирования [351] на стандартных пластинках (11x15 см) в полиакриламидном геле, содержащем 2%-ный раствор амфолинов с рН 3,5-11,0 (LKB, Швеция).

Капиллярный электрофорез проводили на 270А Capillary Electrophoresis System, (Applied Biosystem); капилляр 75 мкмхЮО нм, Т=39,8°С, U=10 кВ, в 20 мМ натрий-цитратном буферном растворе, рН 2,5.

N-концевые аминокислоты цитолизинов определяли по методу Грея [352]. Дансильные производные аминокислот идентифицировали с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках (5x5 см) с закрепленным слоем силикагеля по методу [353].

Карбоксиметилирование белков осуществляли по методу [264]. Обессоливание полученных препаратов проводили на затемненной колонке с биогелем П-2.

Аминокислотный анализ. Образцы полипептидов (2,5-3 нМ) гидролизовали в запаянных ампулах 24, 48 и 72 ч 5,7 н НС1 (50 мкл) при 110°С. После гидролиза образцы анализировали на аминокислотном анализаторе D-500 (Durum, США) или аминокислотном анализаторе (Pharmacia-LKB 4151 Alpha Plus, Швеция) на колонке Ultropac 8 мкм (0,46x20,0 см) согласно методу [354]. Количество остатков тирозина и триптофана в полипептидах оценивали спектрофотометрически по 2-ой производной УФ-спектров поглощения полипептидов на приборе Сагу 219 (Varian, Англия) или CECIL СЕ 7250 спектрофотометре (Англия) согласно методу [355]. Содержание триптофана определяли также после гидролиза образцов 4 н метансульфокислотой (50 мкл), содержащей 0,2% 3-(2-аминоэтил) индола в течение 24 ч при 110°С.

N-концевую аминокислотную последовательность цитолизинов RTX-S II и RTX-A (10 нмоль) определяли по методу [356] на секвенаторе модели 477А (Applied Biosystems, США). Фенилтиогидантоины аминокислот идентифицировали ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой сорбента Microsil Cig (Macherey-Nadel, Германия). Аминокислотную последовательность цитолизинов Or-А и Or-G определяли па автоматическом секвенаторе белков Procise модели 492 (Applied Biosystems, США) по программе производителя.

Выделение тотальной РНК. Щупальца актинии О. orientalis и R. macrodactylus суспендировали в 200 мкл лизирующего буфера (4 М гуанидинизотиоцианат; 30 мМ ацетат натрия, рН 7,0, 0,5% саркозил, 1%-ный (по объему) p-меркаптоэтанол). После интенсивного встряхивания на вортексе добавляли 160 мкл уравновешенного дистиллированной водой фенола и 160 мкл смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). После интенсивного встряхивания смесь центрифугировали 10 мин при 12000xg, водную фазу переносили в новую пробирку. Экстракцию РНК из водной фазы смесью фенола с хлороформом (1:1) проводили трижды до исчезновения интерфазы. К водной фазе добавляли 2,5 объема этанола. После выдерживания в течение 2 ч при -20°С смесь центрифугировали 20 мин при 12000xg. Осадок, содержащий РНК, промывали, растворяли в 200 мкл воды и использовали для синтеза кДНК. Степень очистки и концентрацию выделенной РНК определяли электрофоретически в 1%-ном агарозном геле.

Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом Smart™ Kit (Clontech, США). Для реакции отбирали по 3 мкг тотальной РНК.

Геномную ДНК из щупалец актинии выделяли по методу [357]. К растертым в порошок в ступке с жидким азотом щупальцам актинии (~1 мг) добавили десять объемов буферного раствора для экстракции: 0,5% SDS, 0,1 М EDTA и 5 мкл (0,5 мг/мл) РНК-азы (Fermentas, Литва) в 10 мМ Трис-HCl буферном растворе, рН 8,0 в случае R. macrodactylus и 4 М гуанидинизотиоцианат, 25мМ цитрат натрия, 0,5% лаурилсаркозил натрия, 0,1 М |3-меркаптоэтаиол в случае О. orientalis и R. macrodactylus). Смесь инкубировали 1 ч при 37°С. Затем к ней добавляли протеиназу К (до конечной концентрации 100 мкг/мл) и инкубировали 3 ч при 50°С. ДНК дважды экстрагировали фенолом, уравновешенным 10 мМ Трис-HCl буферным раствором, рН 8,0, затем смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) и смесью хлороформ:изоамиловый спирт (24:1). На всех стадиях экстракции органическую и водную фазы осторожно перемешивали в течение 10 мин. ДНК осаждали 95%-ным этанолом и растворяли в 100 мкл воды.

Концентрацию ДНК определяли с помощью горизонтального электрофореза в 0,8%-ном агарозном геле, используя буферный раствор, содержащий 40 мМ Трис-ОН, 20 мМ СН3СООН, 1мМ EDTA (рН 8,0). В качестве стандарта использовали ДНК фага X различной концентрации (Сибэнзим, Новосибирск).

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием 50 пМ каждого ген-специфичного праймера (EuroGene, Москва), 2,5 единицы TagSE-полимеразы, буферного раствора для TagSE-полимеразы, раствора дезоксирибонуклеотидов (0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеотида) (SibEnzyme, Новосибирск) и 0,05 мкг ДНК, выделенной из О. orientalis и R. macrodactylus. Реакцию проводили на амлификаторе (Eppendorf, Германия): для ДНК R. macrodactylus при следующих условиях: денатурация - 20 с при 94°С, отжиг - 20 с при 55°С, синтез - 1 мин при 72°С; количество циклов 25; для ДНК О. orientalis (с использованием «hot-start») при следующих условиях: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг - 30 с при 60°С, синтез - 1 мин при 72°С; количество циклов 28.

ПЦР для R. macrodactylus проводили при следующих условиях: денатурация - 4 мин при 95°С; 25 циклов: денатурация - 30 с при 94°С, отжиг - 20 с при 55°С, синтез - 1 мин при 72°С; затем 5 мин при 72°С. Условия при проведении ПЦР 3'-RACE кДНК подбирали экспериментально для каждой пары праймеров.

Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, в качестве стандартов использовали набор нуклеотидов с длинами фрагментов от 100 до 1500 п.о. (Сибэнзим, Новосибирск).

Лигирование. Для лигирования использовали лигазный буфер, лигазу, вектор pTZ19R (Сибэнзим, Новосибирск), обработанный нуклеазой рестрикции Hindll, ПЦР-фрагмент.

Трансформация. К компетентным клеткам, размороженным при 4°С, добавляли 5 мкл лигазиой смеси и инкубировали при той же температуре в течение 30 мин. Затем, после нагревания на водяной бане при 42°С в течение 90 с, добавляли 1 мл нагретой до 37°С среды LB, инкубировали при 37°С 45 мин. Полученные клетки рассевали шпателем на чашки Петри с селективной средой. Чашки инкубировали при 37°С в течение ночи.

Полимеразная цепная реакция колоний. Для ПЦР использовали реакционную смесь, содержащую: TagSE-полимеразный буферный раствор, раствор дезоксирибонуклеотидов, прямой и обратный праймеры M13Dir и M13Rev соответственно, TaqSE-полимеразу. В качестве матрицы использовали супернатант, полученный после лизиса отобранных колоний. Реакцию проводили на амлификаторе (Eppendorf, Германия) при следующих условиях: 10 мин при 95°С; затем 24 цикла: 15 с при 94°С, 15 с при 55°С, 30 с при 72°С; затем 10 мин при 72°С. Концентрацию и длину полученного ПЦР-фрагмента определяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, в качестве стандартов использовали набор нуклеотидов с длинами фрагментов от 100 до 1500 пар оснований.

Выделение плазмид проводили методом щелочного лизиса. В пробирку помещали 2 мл ночной культуры. Клетки осаждали центрифугированием при 14000xg в течение 1 мин, затем тщательно ресуспендировали их в 100 мкл раствора, состоящего из 10 мМ раствора EDTA, 50 мкг/мл РНКазы А, 25 мМ Трис-HCI буфера, рН 8,0, пипетированием. К клеткам добавляли 200 мкл раствора 0,4 М NaOH и 2% ДСН, мягко перемешивали, помещали на 5 мин в лед, добавляли 150 мкл раствора 3 М ацетата калия, рН 5,5, перемешивали мягким переворачиванием пробирки и затем инкубировали во льду 5 мин. После 20 мин центрифугирования смеси при 10000xg супернатант отбирали, добавляли 5 мкл РНКазы (100 мкг/мл) и раствор инкубировали 15 мин при 37°С. Затем к супернатанту добавляли равный объем смеси фенолгхлороформ (1:1), перемешивали, центрифугировали в течение 5 мин при 10000xg. Отбирали водную фазу, добавляли равный объем хлороформа, перемешивали, центрифугировали в течение 5 мин при 10000xg. Для осаждения ДНК к водной фазе добавляли 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия и 2 объема 96% этанола. Полученную смесь инкубировали в течение 20 мин при -20°С, затем центрифугировали в течение 10 мин при 10000xg. Супернатант удаляли, осадок промывали 70%-ным этанолом и растворяли в 30 мкл воды.

Секвенирование. Полученные плазмидные ДНК секвенировали с прямым и обратным М13 праймерами по методу [358] на капиллярном ДНК-секвенаторе (ABI, PRISM1"' 310, США). ПЦР продукт актинии R. macrodactylus очищали также с помощью Wizard DNA Clean-up Purification System (Promega, США), его концы наполняли dNTP и ATP с использованием фрагмента Klenow и Т4 полинуклеотидной киназы. Полученный продукт лигировали в pBlueScript SK+ вектор (Stratagene, США), гидролизованного эндонуклеазной рестриктазой Smal. Аликвоты из лигазного раствора трансформировали в Е. coli XL-1 Blue клетки. Рекомбинантные клоны анализировали, используя стандартные техники, и секвенировали с прямым и обратным М13-праймерами по методу [358] с [33Р] dATP на ДНК-секвенаторе версии 2.0 (Amersham, США).

Компьютерный анализ. Поиск гомологичных последовательностей проводили, используя белковые базы данных, при помощи программы BLASTX

359]. Сравнение аминокислотных последовательностей проводили, используя программу CLASTALW [94,108].

4.6. Спектроскопические методы исследования вторичной структуры и конформационного состояния полипептидов УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре (Cecil СЕ 7200, Англия) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см при ширине щели 1 нм. Поправку на светорассеяние раствора актинопорина RTX-S II проводили, как описано Виндером

1% и Гентом [360]. Удельный коэффициент поглощения (^jCM) определяли по навеске актинопорина, доведённой до постоянного веса. Количество остатков тирозина и триптофана в молекуле RTX-S II рассчитывали из второй производной УФ-спектра поглощения, как описано [323].

Спектры КД регистрировали на спектрополяриметре (Jasco-500A, Япония) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 мм для пептидной области спектра и 1 см для ароматической. Кювету с раствором термостатировали при заданной температуре 25-30 мин до снятия спектра КД. Повторная регистрация спектра при этой же температуре показывала его полное совпадение с зарегистрированным первоначально. Точность температуры составляла ±0,5°С. Во избежание испарения растворителя при высоких температурах в кювету поверх исследуемого раствора наслаивали слой вазелинового масла. рН-Титрование раствора RTX-S II проводили концентрированными растворами NaOH и НС1. Значение рН раствора измеряли на рН-метре (inoLab, Германия). Точность измерения составляла ±0,02. В пептидной области спектра эллиптичность считали как эллиптичность среднего остатка, принимая среднюю молекулярную массу аминокислотного остатка равной 110 Да, в единицах град-см2/дмоль по формуле: [9] = 9Iia6jl-S-110/10-C-l, где S -чувствительность шкалы прибора, С - концентрация белка, мг/мл, 1 -длина оптического пути, мм. В ароматической области эллиптичность считали как молярную эллиптичность [9]м с молекулярной массой актинопорина RTX-S II, равной 19,28 кДа. Калибровку спектрополяриметра проводили по 0,06%-ному водному раствору d-камфора-Ю-сульфоната аммония. Отношение эллиптичности полос при 191 и 290 нм составляло 2,05.

Спектры флуоресценции RTX-S II измеряли на спектрофлуориметре (Hitachi 850, Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Влияние ионной силы на спектры флуоресценции проводили, добавляя рассчитанное количество концентрированного раствора NaCl в кювету с раствором актинопорина. Возбуждение флуоресценции проводили светом с длиной волны 280 и 296 нм. Спектры флуоресценции, корректированные по родамиду В (Wako Pure Chemical Industries, Япония), регистрировали, вычитая рамановскую полосу буферного раствора. Значение интенсивности флуоресценции корректировали на увеличение объема при нагревании и при добавлении концентрированного раствора NaCl. Ширина щели на монохроматорах возбуждения и излучения составляла 5 нм.

Влияние ионной силы и величины рН на гемолитическую активность RTX-S II исследовали, выдерживая актинопорин (27,6 нг) в течение 30 мин при температуре 37°С в первом случае в растворах с концентрацией NaCl от 0 до 0,8 М, а во втором - в 0,01 М натрий-фосфатных буферных растворах со значением рН от 3,88 до 10,25. Конечный объем смеси составлял 20 мкл. Затем в пробы добавляли по 1 мл 0,7%-ной суспензии эритроцитов (3 параллели). Степень гемолиза (в %) определяли, как описано выше относительно контрольных проб, не содержащих актинопорин.

Влияние температуры па гемолитическую активность RTX-S II исследовали, выдерживая RTX-SII (27,6 нг) в 0,01 М натрий-фосфатпом буферном растворе, рН 7,2, в объеме 20 мкл при температурах 25,40, 50 и 60°. Затем в пробы добавляли по 1 мл 0,7%-ной суспензии эритроцитов (3 параллели). Степень гемолиза (в %) определяли, как описано выше относительно контрольных проб, не содержащих актинопорин.

Достоверность различий между полученными независимыми значениями оценивали при помощи критерия Стьюдента с использованием программы для статической обработки данных Statistica for Windows r.5.1 b (StatSoft Inc.). Значение S.D. не превышало 0,5%.

4.7. Биофизические и электрофизиологические методы исследования мембранолитического действия цитолизинов Влияние цитолизинов на проницаемость липосом. Липосомы формировали в два этапа. Вначале готовили многослойные липосомы по методу Бэнгхэма [292], используя раствор липидов в смеси хлороформ-метанол (1:1 по объему). Растворители упаривали до полного удаления, затем добавляли 1 мМ HEPES-Трис буферный раствор, рН 7,4, содержащий 100 мМ КС1. Колбу периодически встряхивали (через каждые 15 мин) в течение 1,5-2 ч. Суспензию оставляли для стабилизации при комнатной температуре на 1 час. Перед работой проводили второй этап подготовки липосом - увеличение степени гомогенности суспензии [284] и создание градиента ионов К+ на мембране [283]. Для этого суспензию липосом «продавливали» через ядерный фильтр с размерами пор 0,6 мкм (Nucleopore, Inc., США), а затем пропускали через колонку 1,5x25 см с грубой фракцией сефадекса G-50 (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция). Содержание ионов К+ в липосомах определяли по выходу К+ при действии тритерпенового гликозида голотурина А [286].

Влияние цитолизинов на ионную проницаемость биологических мембран. Транспорт ионов К+ в суспензии эритроцитов, яйцеклеток морского ежа и липосом измеряли с помощью К+-селективного электрода типа ОР-К-0711Р и ионографа ОР-267 (Radelkis, Венгрия). В качестве электрода сравнения был использован каломельный электрод типа К-701 (Radiometer, Дания), заполненный насыщенным раствором NaCl.

Измерение электрических характеристик БЛМ, модифицированных цитолизинами. БЛМ формировали на отверстии тефлонового стаканчика диаметром 0,25 мм по методу [294]. Ток через БЛМ измеряли высокоомным вольтметр-электрометром ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране с помощью хлорсеребряных электродов (потенциал асимметрии 2-3 мВ). Регистрацию тока на выходе усилителя осуществляли потенциометром КПС-4. Цитолизины добавляли в водную фазу до формирования БЛМ. Температуру в измерительной ячейке поддерживали с помощью термостата с точностью ±0,5°С.

Измерение электрических характеристик эритроцитарной мембраны, модифицированной цитолизином. Действие цитолизина изучали на изолированных мембранных фрагментах эритроцита кролика (размер 6-8 мкм) в конфигурации «inside-out» [304, 305] методом точечной фиксации потенциала [361]. Пипетки заполняли раствором следующего состава: 140 мМ КС1, 2 мМ MgCl2, 1,1 мМ EGTA, 0,55 мМ СаС12 (рСа 7), 10 мМ HEPES-KOH буферный раствор, рН 7,4. Сопротивление пипеток составляло 20-30 МОм. Эритроциты находились в растворе следующего состава: 140 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 1 мМ СаС12, Ю мМ HEPES-NaOH буферный раствор, рН 7,4. Для регистрации токов использовали усилитель ЕРС-5 (List-electronik, ФРГ). Данные записывали на магнитограф для последующей обработки. Опыты проводили при температуре 20-22°С.

Исследование термодинамических характеристик цитолизинов и их липид-белковых и белок-белковых взаимодействий дифференциальной сканирующей калориметрией. Калориметрические измерения проводили с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (СССР). Для измерения базовой линии обе калориметрические ячейки заполняли растворителем. Для измерения теплоемкости одну из ячеек заполняли раствором исследуемого цитолизина. Ошибка измерения составляла не более 5%. Все измерения проводились со скоростью нагревания 1 К/мин. Точность определения температуры соответствовала 0,1 °С. Температура, при которой наблюдалось максимальное теплопоглощение, регистрировалась как температура фазового перехода (Ттах). Энтальпию денатурации (AHd) определяли как отношение площади под эндотермическим пиком перехода образца к площади под калибровочной кривой. Площадь под пиком кривой теплопоглощения определяется как область, ограниченная калориметрической кривой и прямыми линиями, полученными экстраполяцией температурной зависимости теплоемкости до и после термоперехода к Td. Разницу между энергией Гиббса для денатурированного и нативного состояния полипептида, AGd, определяли по уравнению [310]: aGd = AHd ' дСР (Td " Т) + дСР Т (lnTd" lnT) где дСр - изменение теплоемкости денатурации.

Определение кооперативности термообусловленных процессов денатурации проводили по корреляционным тестам [311], основанным на том факте, что для перехода единой кооперативной системы измеряемая AHd должна равняться изменению энтальпии, рассчитанной из параметров калориметрически измеренной теплоемкости (величины эффективной энтальпии денатурации AHV-h или энтальпии Вант-Гоффа) в соответствии с уравнением [310]: дНу-Н =4RTd1'AT где ДТ - полуширина пика теплопоглощения.

Тени эритроцитов получали из консервированной крови человека и свежей крови собаки. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в концентрации 50 тыс. ед./мл. Кровь центрифугировали 5 мин при lOOOxg и при 0-4°С, осадок трижды промывали 5 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 8,0, содержащим 150 мМ NaCl. Эритроциты доводили этим же раствором до 10% гематокрита и разделяли на две части. К одной добавляли цитолизин в количестве 100 мкг/мл эритроцитов. Затем обе суспензии эритроцитов инкубировали 30 мин при 37°С. Контрольный образец эритроцитов центрифугировали в условиях, описанных выше, модифицированные цитолизином эритроциты - при 30000xg в течение 20 мин. Эритроциты в контрольном образце гемолизировали 20-25-кратпым объемом 5 мМ натрий-фосфатного буферного раствора, рН 8,0, и центрифугировали в условиях, описанных выше для модифицированных цитолизином эритроцитов. В обоих случаях осадки промывали 3-4 раза средой, используемой для гемолиза, и дважды - буферным раствором, используемым в дальнейших измерениях.

Для анализа белковых компонентов теней эритроцитов использовали горизонтальный SDS-электрофорез в градиенте плотности ПААГ (5-20%). Гели сканировали на ДСА-1 денситометре (СССР).

4.8. Биологическая активность цитолизинов актиний

Острую токсичность определяли на белых беспородных мышах весом 2022 г внутрибрюшинной инъекцией исследуемой пробы, а также на прибрежных морских крабах Hemigrapsus penicillatus весом 14-18 г инъекцией между телом и ногой. Для количественного определения токсической активности полипептидов использовали величину летальной дозы ЛД50, мг/кг (количество белка, при введении которого у 50% экспериментальных животных наступает летальный исход).

Цитотоксическую дозу определяли модифицированным методом Шрека [362] окрашиванием опухолевых клеток эозином.

Гемолитическую активность цитолизинов определяли на эритроцитах мыши в среде, содержащей 0,9 % NaCl, 1 мМ КС1, 10 мМ глюкозы, 5 мМ трис-НС1 буферный раствор, рН 7,4. Уровень гемоглобина в супернатанте измеряли спектрофотометрически при 540 нм после предварительного охлаждения реакционной смеси и ее центрифугирования для осаждения эритроцитов и их теней на фотометре Spectromom-410 (MOM, Венгрия). За 100%-ный гемолиз (0,9 ОЕ540) принимали лизис 0,7% суспензии эритроцитов (1,2 ОЕ72о) Ю мкл 1% водного раствора голотурина А из морской кукумарии Н. leucospilota (любезно предоставленный лабораторией химии морских природных соединений ТИБОХ ДВО РАН). За одну гемолитическую единицу (ГЕ) принимали количество (мг) белка, вызывающее 50%-ный гемолиз в 1 мл 0,7%-ной суспензии эритроцитов за 30 мин при 37°С.

Определение рН-зависимости гемолитической активности RTX-A.

Цитолизин (2,5 мкг) инкубировали в течение 30 мин при 37°С в 1 мл буферного раствора с заданным значением рН, после чего быстро отбирали 5 мкл раствора и вводили в 0,5%-нуго суспензию (3 мл) эритроцитов кролика. Так как среда для суспендирования эритроцитов имела большую буферную емкость (100 мМ NaCl, 1 мМ КС1, 50 мМ HEPES-трис, рН 7,4), значение рН после добавления цитолизина изменялось не более чем на 0,05. Индуцируемый выход ионов К+ измеряли, как описагго выше.

Ингибирующее действие сфингомиелина определяли по методу [126]. Цитолизины предварительно инкубировали дисперсией сфингомиелина в молярном соотношении 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:50, 1:100 в течение 60 мин. Степень гемолиза эритроцитов, добавленных к липид-белковой смеси, определяли спектрофотометрически при 540 нм по поглощению супернатанта, полученного после центрифугирования суспензии эритроцитов.

Трипсинингибирующую активность полипептидов определяли по методу [263], используя субстрат К-бензоил-0,Ь-аргинина л-нитроанилид (BAPNA), приготовленный как описано ранее [264]. К 50 мкл водного раствора ингибитора добавляли 50 мкл раствора трипсина (100 мкг/мл 0.001 М HCI) и 250 мкл 0,1 М Трис-HCI буферного раствора, рН 8,1. После прединкубации в течение 5 мин при 37°С добавляли 250 мкл раствора субстрата (4 мг BAPNA в 0,3 мл диметилформамида, разбавленного в 10 раз 0,1 М Трис-HCI буферным раствором, рН 8,1). Количество образовавшегося в результате гидролиза п-нитроанилина определяли спектрофотометрически при 410 нм. Измерение проводили относительно контрольного образца, который содержал субстрат, денатурированный фермент и ингибитор в соответствующем разбавлении. За единицу трипсинингибирующей активности (ИЕ) принимали количество белка, необходимое для 50%-ного ингибирования 1 мг трипсина.

Фосфолипазную активность в полипептидных фракциях определяли тонкослойной хроматографией на пластинках с закреплённым слоем SiC>2 по появлению продуктов гидролиза лецитина (sn-фосфатидилхолина) согласно методу [273]. В качестве стандартов использовали лецитин и сфингомиелин (для определения сфингомиелиназной активности). Гидролиз лецитина осуществляли коммерческой фосфолипазой А2 из пчелиного яда и фосфолипазой С из С. welcbii (Calbiochem, США), сфингомиелин гидролизовали стафилококковой сфингомиелиназой (Boeringer Manheim, ФРГ).

Цитотоксическое действие RTX-S II на оплодотворенные яйцеклетки морского ежа S. intermedins определяли по методу [363]. Действие цитолизина испытывали путем добавления RTX-S II в различных концентрациях (10, 25, 50, 100 мкг/мл) в инкубационную смесь к уже развивающимся зародышам, на стадии «поздняя бластула». За стадиями развития наблюдали в бинокуляр и фиксировали их несколько раз в течение инкубационного периода, сравнивая с контролем (эмбрионы в морской воде).

Антигистаминную активность определяли по методу [281] на белых беспородных крысах-самцах весом 52±2 г (по 5 животных в группе), используя 0,1%-ный раствор дигидрохлорида гистамина в физиологическом растворе. Контрольная группа животных получала гистамин, вызывающий микрошок в течение 2 мин. Состояние микрошока характеризовалось первоначально усилением дыхательных движений брюшной стенки животного с последующим участием в дыхательном процессе всех мышц тела, сопровождающимся быстрым движением головы вперед-назад. Раствор смеси Rml и Rmll (в соотношении 1:1) вводили животным внутривенно в дозах от 0,1 до 1 мл.

Аналитические данные. Полученные данные анализировали с помощью /теста Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ±S.D. из трех независимых измерений.

4.9. Компьютерный анализ.

Получение теоретических моделей актинопоринов. Для получения компьютерных моделей методом сравнительного моделирования [364, 365] использовали аминокислотные последовательности актинопоринов RTX-A [321], RTX-S II [265], Ог-А и Or-G [319] (коды Genbank AAW48528, AAW47579, AAW47930 соответственно). Поиск прототипа для исследуемых актинопоринов проводили по базе установленных пространственных структур PDB [366] с помощью автоматического сервера SWISS-MODEL [335, 367, 368]. Выравнивание аминокислотных последовательностей исследуемых акгииопоринов и их прототипов выполняли с помощью модуля CLUSTALW с параметрами BLOSUM62 в составе программы МОЕ [337] и вручную программой SPDBV [333, 335]. Выровненные последовательности исследуемых актинопоринов и их прототипов посылались программой SPDBV [333, 335] на сервер SWISS-MODEL [367, 368], где строились и оптимизировались теоретические модели. Качество полученных теоретических моделей было проверено на сервере программой WhatCheck [369] и с помощью программ МОЕ [337] и Molmol [334]. Элементы вторичной структуры актинопоринов были определены с помощью программы Molmol [334]. Анализ контактов в молекулах актинопоринов проведен с помощью программ МОЕ [337] и SPDBV [333]. Визуализацию молекул актинопоринов проводили с помощью программы Rasmol [336].

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Монастырная, Маргарита Михайловна, 2007 год

1. Alouf J.E. Pore-forming bacterial toxins: an overview // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001. P. 1-14.

2. Gouaux E. Channel-forming toxins: tales of transformation // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7, N 4. P. 566-573.

3. Parker M.W., Pattus F., Tucker A.D., Tsemoglou D. Structure of the membrane-pore-forming fragment of colicin A // Nature. 1989. Vol. 337, N 6202. P. 93-96.

4. Allured V.S., Collier R.J., Carroll S.F., McKay D.B. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa 3.0 A at resolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986. Vol. 83, N5. P. 1310-1324.

5. Li J.D. Crystal structure of insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution // Nature. 1991. Vol. 353, N 6347. P. 815-821.

6. Choe S., Bennett M.J., Fujii G., Curmi P.M., Kantardjieff K.A., Collier R.J., Eisenberg D. The crystal structure of diphtheria toxin // Nature. 1992. Vol. 357, N 6375. P. 216-222.

7. Adams J.M., Cory S. Life-or-death decisions by the Bcl-2 protein family // Trends Biochem. Sci. 2001. Vol. 26, N 1. P. 61-66.

8. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40, N 2. P. 111-124.

9. Parker M.W., Feil S.C. Pore-forming protein toxins: from structure to function // Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. Vol. 88, N 1. P. 91-142.

10. Wiener M., Frcymann D., Ghosh P., Stroud R.M. Crystal structure of colicin la // Nature. 1997. Vol. 385, N 6615. P. 461-464.

11. Athanasiadis A., Anderluh G., Macek P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II Structure. 2001. Vol. 9, N 4. P. 341-346.

12. Kraulis P. MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures // J. Appl. Cryst. 1991. Vol. 24, Pt. 5. P. 946-950.

13. Parker M.W., Buckley J.T., Postma J.P., Tucker A.D., Leonard K, Pattus F., Tsernoglou D. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin and the membrane-channcl states // Nature. 1994. Vol. 367, N 6460. P. 292-295.

14. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux, J.E. Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. 1996. Vol. 274, N5294. P. 1859-1866.

15. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen // Nature. 1997. Vol. 385, N 6619. P. 833— 838.

16. Li J., Koni P.A., Ellar D.J. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus thuringiensis sp. kyushuensis and implications for membrane pore formation //J. Mol. Biol. 1996. Vol. 257, N 1. P. 129-152.

17. Tweten R.K., Parker M.W., Johnson A.E. The cholesterol-dependent cytolysins // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001. P. 114.

18. Rossjohn J., Feil S.C., McKinstry W.J., Tweten R.K., Parker M.W. Structure of a cholesterol-binding, thiolactivated cytolysin and a model of its membrane form // Cell. 1997. Vol. 89, N 5. P. 685-692.

19. Gilbert R.J.C. Pore-forming toxins // Cell Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59, N 5. P.832.844.

20. Palmer M. The family of thiol-activated cholesterol-binding cytolysins // Toxicon. 2001. Vol 39, N11. P. 1681-1689.

21. Howard S.P., Meiklejohn H.G., Shivak D., Jahagirdar R. A TonB-like protein and a novel membrane protein encoding an ATP-binding cassette function together in exotoxin secretion // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 22, N 4. P. 595-604.

22. Lakey J.H., Slatin S.L. Pore-forming colicins and their relatives // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001, P. 131-161.

23. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nature Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10. P. 790-802.

24. Pommier S., Gavioli M., Cascales E., Lloubes R. Tol-Dependent Macromolecule Import through the Escherichia coli Cell Envelope Requires the Presence of an Exposed TolA Binding Motif//J. Bacteriol. 2005. Vol. 187, N 21. P. 7526-7534.

25. Bullock J.O., Kolen E.R. Ion selectivity of colicin El. III. Anion permeability // J. Membr. Biol. 1995. Vol. 144, N 2. P. 131-145.

26. Collarini M., Amblard G., Lazdunski C., Pattus F. Gating processes of channels induced by colicin A, its C-terminal fragment and colicin El in planar lipid bilayers // Eur. Biophys. J. 1987. Vol. 14, N 3. P. 147-153.

27. Slatin S.L., Nardi A., Jakes K.S., Baty D., Duche D. Translocation of a functional protein by a voltagedependent ion channel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. Vol. 99, N 3. P. 1286-1291.

28. Parker M.W., Tucker A.D., Tsernoglou D., Pattus F. Insights into membrane insertion based on studies of colicins // Trends Biochem. Sci. 1990. Vol. 15, N 4. P. 126— 129.

29. Vetter I.R., Parker M.W., Tucker A.D., Lakey J.H., Pattus F., Tsernoglou D. Crystal structure of a colicin N fragment suggests a model for toxicity // Structure. 1998. Vol. 6, N 7. P. 863-874.

30. Duche D., Parker M.W., Gonzalez-Manas J.M., Pattus F., Baty D. Uncoupled steps of the colicin A pore formation demonstrated by disulfide bond engineering // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, N 9. P. 6332-6339.

31. Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. Brominated phospholipids as a tool for monitoring the membrane insertion of colicin A // Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 32. P.7294-7300.

32. Lindeberg M., Zakharov S.D., Cramer W.A. Unfolding pathway of the colicin El channel protein on a membrane surface // J. Mol. Biol. 2000. Vol. 295, N 3. P. 679-692.

33. Lakey J.H., Parker M.W., Gonzalez-Manas J.M., Duche D. Vriend G., Baty D., Pattus F. The role of electrostatic charge in the membrane insertion of colicin A. Calculation and mutation //Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 220, N 1. P. 155-163.

34. Muga A., Gonzalez-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F.P., Surewicz W.K. pH-dependent stability and membrane interaction of the pore-forming domain of colicin A // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268, N 3. P. 1553-1557.

35. Baty D., Lakey J., Pattus F., Lazdunski C. A 136-amino-acid residue COOH-terminal fragment of colicin A is endowed with ionophoric activity // Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 189, N2. P. 409-413.

36. Ghosh P., Mel S.F., Stroud R.M. The domain structure of the ion channel-forming protein colicin la// Nature Struct. Biol. 1994. Vol. 1, N 9. P. 597-604.

37. Garcfa-Saez A.J., Coraiola M., Serra M.D., Mingarro I., Menestrina G., Salgado J. Peptides derived from apoptotic В ax and Bid reproduce the poration activity of the parent full-length proteins // Biophys. J. 2005. Vol. 88, N 6. P. 3976-3990.

38. Antonsson В., Montessuit S., Lauper S., Eskes R., Martinou J.C. Bax oligomerization is required for channel-forming activity in liposomes and to trigger cytochrome с release from mitochondria // Biochem. J. 2000. Vol. 345 (Part 2). P. 271— 278.

39. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis // Science. 1998. Vol. 281, N 5381. P. 1309-1312.

40. Epand R.F., Martinou J.C., Montessuit S., Epand R.M., Yip C.M. Direct evidence for membrane pore formation by the apoptotic protein Bax // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol. 298, N 5. P. 744-749.

41. Suzuki M., Youle R.J., Tjandra N. Structure of Bax: Coregulation of Dimer Formation and Intracellular Localization // Cell. 2000. Vol. 103, N 4. P. 645-654.

42. McDonnell J.M., Fushman D., Milliman C.L., Korsmeyer S.J., Cowburn D. Solution structure of the proapoptotic molecule BID: a structural basis for apoptotic agonists and antagonists // Cell. 1999. Vol. 96, N 5. P. 625-634.

43. Barbato G., Ikura M., Kay L.E., Pastor R.W. Backbone dynamics of calmodulin studied by 15N relaxation using inverse detected two-dimensional NMR spectroscopy: the centralhelix is flexible //Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 23. P. 5269-5278.

44. Grzesiek S., Bax A. Amino-acid type determination in the sequential assignment procedure of uniformly 13C/15N-enriched proteins // J. Biomol. NMR. 1993. Vol. 3, N 2. P. 185-204.

45. Nechushtan A., Smith C.L., Hsu Y.T., Youle R.J. Conformation of the Вах C-terminus regulates subcellular location and cell death // EMBO J. 1999. Vol. 18, N 9. P. 2330-2341.

46. Strauss N., Hendee E.D. The effect of diphtheria toxin on the metabolism of HeLa cells //J. Exp. Med. 1959. Vol. 109, N 2. P. 145-163.

47. Lennox E.S., Kaplan A.S. Action of diphtheria toxin on cells cultivated in vitro // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. Vol. 95, N 4. P. 700-702.

48. Collier R.J. Effect of diphtheria toxin on protein synthesis: inactivation of one of the transfer factors // J. Mol. Biol. 1967. Vol. 25, N 1. P. 83-98.

49. Honjo Т., Nishizuka Y., Hayaishi O. Diphtheria toxin-dependent adenosine diphosphate ribosylation of aminoacyl transferase II and inhibition of protein synthesis // J. Biol. Chem. 1968. Vol. 243, N 13. P. 3553-3555.

50. Van Ness B.G., Howard J.B., Bodley J.W. ADP-ribosylation of elongation factor 2 by diphtheria toxin. Isolation and properties of the novel ribosyl-amino acid and its hydrolysis products // J. Biol. Chem. 1980. Vol. 255, N 22. P. 10717-10720.

51. Drazin R., Kandel J., Collier R.J. Structure and activity of diphtheria toxin-II: attack by trypsin at a specific site within the intact toxin molecule // J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246, N 5. P. 1504-1510.

52. Weiss M.S., Blanke S.R., Collier R.J., Eisenberg D. Structure of the isolated catalytic domain of diphtheria toxin // Biochemistry. 1995. Vol. 34, N 3. P. 773-781.

53. Barbieri J.T., Collier R.J. Expression of a mutant, full-length form of diphtheria toxin in Escherichia coli II Infect. Immun. 1987. Vol. 55, N 7. P. 1647-1651.

54. Madshus I.H., Wiedlocha A., Sandvig K. Intermediates in translocation of diphtheria toxin cross the plasma membrane // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, N 6. P. 2628-2652.

55. Stenmark H., Olsnes S., Madshus I.H. Elimination of the disulphide bridge in fragment В of diphtheria toxin: Effect on membrane insertion, channel formation, and ATP binding // Mol. Microbiol. 1991. Vol. 5, N 3. P. 595-606.

56. Oh K.J., Zhan H., Cui C., Altenbach C., Hubbell W.L., Collier R.J. Conformation of the diphtheria toxin T domain in membranes: a site-directed spin-labeling study of the TH8 helix and TL5 loop II Biochemistry. 1999.Vol. 38, N 32. P. 10336-10343.

57. Silverman J.A., Mindell J.A., Zhan H., Finkelstein A., Collier R.J. Structure-function relationships in diphtheria toxin channels: I. Determining a minimal channel-forming domain//J. Membr. Biol. 1994. Vol. 137, N 1. P. 17-28.

58. Naglich J.G., Metherall J.E., Russell D.W, Eidels L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor // Cell. 1992. Vol. 69, N 6. P. 1051-1061.

59. Lotan A., Fishman L., Zlotkin E. Toxin compartmentation and delivery in the Cnidaria: The nematocyst's tubule as a multiheaded poisonous arrow // J. Exp. Zool. 1996. Vol. 275, N6. P. 444-451.

60. Meinardi E., Florin-Christensen M., Paratcha G., Azcurra J.M., Florin-Christensen J. The molecular basis of self/nonself selectivity of a coelenterate toxin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 216, N 1. P. 348-354.

61. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10. P. 790-802.

62. Elliot R.C., Konya R.S., Vickneshwara K. Isolation of a toxin from the dahlia sea anemone, Tealiafelina L. //Toxicon. 1986. Vol. 24, N 2. P. 117-122.

63. Grotendorst G.R., Hessinger D.A. Enzymatic characterization of the major phospholipase A2 component of sea anemone (Aiptasia pallida) nematocyst venom // Toxicon. 2000. Vol. 38, N 7. P. 931-943.

64. Bernheimer A.W., Avigad L.S., Kim K.S. Comparison of metridiolysin from the sea anemone with thiol-activated cytolysins from bacteria // Toxicon. 1979. Vol. 17, N 1. P. 69-75.

65. Козловская Э.П., Иванов A.C., Мольнар A.A., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus II ДАН СССР. 1984. Т. 277, N 6. С. 1491-1493.

66. Иванов А.С., Мольнар А.А., Козловская Э.П., Монастырная М.М. Действие токсина из Radianthus macrodactylus на проницаемость биологических и модельных мембран // Биол. мембраны. 1987. Т. 4, N 3. С. 243-248.

67. Брежестовский П.Д., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Действие гемолизина из морской анемоны Radianthus macrodactylus на эритроцитарную мембрану //ДАН СССР. 1988. Т. 299, N 3. С. 748-750.

68. Belmonte G., Pederzolli С., Macek P., Menestrina G. Pore formation by the sea anemone cytolysin equinatoxin II in red blood cells and model lipid membranes // J. Membrane Biol. 1993. Vol. 131, N 1. P. 11-22.

69. Michaels D.W. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus I. Formation of transmembrane channels in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555, N 1. P. 67-78.

70. Varanda W., Finkelstein A. Ion and nonelectrolyte permeability properties of channels formed in planar lipid bilayer membranes by the cytolytic toxin from the sea anemone, Stoichactis helianthus II J. Membr. Biol. 1980. Vol. 55, N 3. P. 203-211.

71. Руднев B.C., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная M.M., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1, N 10. С. 1019-1024.

72. Saier M.H. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane solute transporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. Vol. 64, N 2. P. 354-411.

73. Tejuca M., Dalla Serra M., Ferreras M., Lanio M.E., Menestrina G. Mechanism of membrane permeabilization by sticholysin I, a cytolysin isolated from venom of the sea anemone Stichodactyla helianthus II Biochemistry. 1996. Vol. 35, N 47. P. 14947-14957.

74. Blumenthal K.M., Kem W.R. Primary structure of Stoichactis helianthus cytolysin III IIJ. Biol. Chem. 1983. Vol. 258, N 9. P. 5574-5581.

75. Anderluh G., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P., Pungercar J. Equinatoxins, pore-forming proteins from sea anemone Actinia equina, belong to a multigene family // Toxicon. 1999. Vol. 37, N 10. P. 1391-1401.

76. Pungercar J., Anderluh G., Gubensek F., Strukelj B. Sequence analysis of the cDNA encoding the precursor of equinatoxin V, a newly discovered hemolysin from the sea anemone Actinia equina II Biochem. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1341, N 2. P. 105-107.

77. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. Cloning, sequencing and expression of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996. Vol. 220, N 2. P. 437-442.

78. Wang Y., Chua K.L., Khoo H.E. A new cytolysin from the sea anemone, Heteractis magnifica: isolation, cDNA cloning and functional expression // Biochem. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1478, T 1. P. 8-18.

79. Jiang X.Y., Yang W.L., Chen H.P., Tu H.B., Wu W.Y., Wei J.W., Wang J., Liu W.H, Xu A.L. Cloning and characterization of an acidic cytolysin cDNA from sea anemone Sagartia rosea //Toxicon. 2002. Vol. 40, N 11. P. 1563-1569.

80. Simpson R.J., Reid G.E., Moritz R.L., Morton C., Norton R.S. Complete amino acid sequence of tenebrosin-C, a cardiac stimulatory and haemolytic protein from sea anemone Actinia tenebrosa II Eur. J. Biochem. 1990. Vol. 190, N 2. P. 319-328.

81. Shai Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides // Biopolymers. 2002. Vol. 66, N 4. P. 236-248.

82. Takagi J. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)-dependent integrins // Biochem. Soc. Transactions. 2004. Vol. 32 (Pt 3). P. 403-406.

83. Anderluh G., Podlesek Z., Macek P. A common motif in proparts of Cnidarian toxins and nematocyst collagens and its putative role // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1476, N 2. P. 372-376.

84. Anderluh G., Pungercar J., Strukelj В., Macek P., Gubensek F. The coding region of the equinatoxin II gene lacks introns // Croat. Chem. Acta. 1995. Vol. 68, N 3. P. 533542.

85. Spagnuolo A., Zanetti L., Cariello L., Piccoli R. Isolation and characterization of two genes encoding calitoxins, neurotoxic peptides from Calliactis parasitica (Cnidaria) // Gene. 1994 Vol. 138, N 1-2. P. 187-191.

86. Weber J., Klug M., Tardent P. Chemistry of hydra nematocysts // The Biology of Nematocysts / Eds. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. San Diego, CA: Acad. Press, 1988. P. 427-444.

87. Zhang M., Fishman Y., Sher D., Zlotkin E. Hydralysin, a novel animal group-selective paralytic and cytolytic protein from a noncnidocystic origin in hydra // Biochemistry. 2003. Vol. 42, N 30. P. 8939-8944.

88. Menestrina G., Cabiaux V., Tejuca M. Secondary structure of sea anemone cytolysins in soluble and membrane bound form by infrared spectroscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 254, N 1. P. 174-180.

89. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALW windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25, N 24.4876-4882.

90. Holm L., Sander C. Protein folds and families: sequence and structure alignments // Nucl. Acids Res. 1999. Vol. 27, N 1. P. 244-247.

91. Gibrat J.F., Madej Т., Spouge J.L., Bryant S.H. The VAST protein structure comparison method // Biophys. J. 1997. Vol. 72, N 2. P. MP298.

92. Hinds M.G., Zhang W., Anderluh G., Hansen P.E., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: implications for pore formation // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 315, N 5. P. 1219-1229.

93. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C. Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. 1995. Vol. 375, N6529. P. 291-298.

94. Malavasic M., Poklar N., Macek P., Vesnaver G. Fluorescence studies of the effect of pH, guanidine hydrochloride and urea on equinatoxin II conformation // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1280, N 1. P. 65-72.

95. Mancheno J.M., De los Rios V., Del Pozo A.M., Lanio M.E., Onaderra M., Gavilanes J.G. Partially folded states of the cytolytic protein sticholysin II // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol. 1545, N 1-2. P. 122-1531.

96. Anderluh G., Dalla Serra M., Viero G., Guella G., Macek P., Menestrina G. Pore formation by equinatoxin II, a eukaryotic protein toxin, occurs by induction of nonlamellar lipid structures // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, N 46. P. 45216-45223.

97. Anderluh G., Razpotnik A., Podlesek Z., Macek P., Separovic F., Norton R.S. Interaction of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II with model membranes: l9F NMR studies // J. Mol. Biol. 2005 Vol. 347, N 12. P. 27-39.

98. Poklar N. Volker J., Anderluh G., Macek P., Chalikian T.V. Acid- and base-induced conformational transitions of equinatoxin II // Biophys. Chem. 2001. Vol. 90, N 2. P. 103-121.

99. Macek P., Lebez D. Kinetics of hemolysis induced by equinatoxin, a cytolytic toxin from the sea anemone Actinia equina. Effect of some ions and рН II Toxicon. 1981. Vol. 19, N2. P. 233-240.

100. Doyle J.W., Kem W.R. Binding of a radiolabeled sea anemone cytolysin to erythrocyte membranes II Biochim. Biophys. Acta. 1989. Vol. 987, N 2. P. 181-186.

101. Doyle J.W., Kem W.R., Vilallonga F.A. Interfacial activity of an ion channel-generating protein cytolysin from the sea anemone Stichodactyla helianthus II Toxicon. 1989. Vol. 27, N4. P. 465^71.

102. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Molten globule-like state of cytochrome с under conditions simulating those near the membrane surface // Biochemistry. 1996. Vol. 35, N 19. P. 6058-6063.

103. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding // Adv. Protein Chem. 1995. Vol. 47, N 47. P. 83-229.

104. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73, N 2. P. 467-471.

105. Caaveiro J.M., Echabe I., Gutierrez-Aguierre I., Nieva J.L., Arrondo J.L.R., Gonzales-Manas J. Differential interaction of equinatoxin II with model membranes in response to lipid composition // Biophys. J. 2001. Vol. 80, N 3. P. 1343-1353.

106. Zorec R., Tester M., Macek P., Mason W.T. Cytotoxicity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina involves ion channel formation and increase in intracellular calcium activity // J. Membrane Biol. 1990. Vol. 118, N 3. P. 243-249.

107. Bonev B.B., Lam Y.H., Anderluh G., Watts A., Norton R.S., Separovic F. Effects of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II on lipid membranes and the role of sphingomyelin II Biophys. J. 2003 Vol. 84, N 4. P. 2382-2392.

108. Shin M.L., Michaels D.W., Mayer M.M. Membrane damage by a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus. II. Effect of membrane lipid composition in a liposome system // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 555, N 1. P. 79-88.

109. Macek P., Zecchini M., Stanek K„ Menestrina G. Effect of membrane-partitioned n-alcohols and fatty acids on pore-forming activity of a sea anemone toxin // Eur. Biophys. J. 1997. Vol. 25, N3. P. 155-162.

110. Turk Т., Macek P., Gubensek F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II // Biochem. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1119, N 1. P. 1-4.

111. Khoo H.E., Fong C.L., Yuen R., Chen D.S. Stimulation of hemolytic activity of sea anemone cytolysins by 8-anilino-l-naphtalenesulphonate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 232, N 2. P. 422-426.

112. Campos A.M., Lissi E.A., Vergara C., Lanio M.E., Alvarez C., Pazos I., Morera V., Garcia Y., Martinez D. Kinetics and mechanism of Stn I modification by peroxyl radicals //J. Protein Chem. 1999. Vol. 18, N 3. P. 297-306.

113. Malovrh P., Barlic A., Podlesek Z., Macek P., Menestrina G., Anderluh G. Structure-function studies of tryptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein // Biochem. J. 2000. Vol. 346 (Pt 1). P. 223-232.

114. Anderluh G., Macek P., Lakey J.H. Peeking into a secret world of pore-forming toxins: membrane binding processes studied by surface plasmon resonance // Toxicon. 2003. Vol. 42, N 3. P. 225-228.

115. Anderluh G., Pungercar J., Krizaj I., Strukelj В., Gubensek F., Macek P. N-terminal truncation mutagenesis of equinatoxin II, a pore-forming polypeptide from the sea anemone Actinia equina II Protein Eng. 1997. Vol. 10, N 7. P. 751-755.

116. Anderluh G., Barlic A., Potrich C., Macek P., Menestrina G. Lysine 77 is a key residue in aggregation of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina II J. Membrane Biol. 2000. Vol. 173, N 1. P. 47-55.

117. Nicholls A., Sharp K.A., Honig, B. Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons // Proteins. 1991. Vol. 11, N 4. P. 281-296.

118. Esnouf R.M. An extensively modified version of MolScript that includes greatly enhanced coloring capabilities //J. Mol. Graph. 1997. Vol. 15, N 2. P. 132-134.

119. Merritt E.A., Murphy M.E.P. Raster3D version 2. A program for photorealistic molecular graphics // Acta Crystallogr. 1994. Vol. 50 (Pt. 6). P. 869-873.

120. Gutierrez-Aguirre I., Barlic A., Podlesek Z., Мабек P., Anderluh G., Gonzalez-Manas J.M. Membrane insertion of the N-terminal a-helix of equinatoxin II, a sea anemone cytolytic toxin // Biochem J. 2004. Vol. 384 (Pt. 2). P. 421-428.

121. Schiffer M., Edmundson A.B. Use of helical wheels to represent the structures of protein and to identify segments with helical potential // Biophys. J. 1967. Vol. 7, N 2. P. 121-135.

122. Hildebrand A., Pohl M., Bhakdi S. Staphylococcus aureus a-toxin. Dual mechanism of binding to target cells // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, N 26. P. 1719517200.

123. Valeva A., Palmer M., Bhakdi S. Staphylococcal a-toxin: formation of the heptameric pore is partially cooperative and proceeds through multiple intermediate stages // Biochemistry. 1997. Vol. 36, N 43. P. 13298-13304.

124. Kawate Т., Gouaux E. Arresting and releasing Staphylococcal a-hemolysin at intermediate stages of pore formation by engineered disulfide bonds // Protein Sci. 2003. Vol. 12, N5. P. 997-1006.

125. Ward R.J., Leonard K. Staphyloccus aureus alpha-toxin channel complex and the effect of Ca2+ ions on its interactions with lipid bilayers // J. Struct. Biol. 1992. Vol. 109, N 2. P. 129-141.

126. Czajkowsky D.M., Sheng S.T., Shao Z.F. Stapyhlococcal a-hemolysin can form hexamers in phospholipids bilayers // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 276, N 2. P. 325-330.

127. Prevost G., Mourey L., Colin D.A., Menestrina G. Pore-forming bacterial toxins: an overview // Pore-Forming Toxins / Ed. van der Goot F.G. Heidelberg, Germany: Springer, 2001. P. 53-83.

128. Watson K.C., Kerr E.J. Sterol structural requirements for inhibition of streptolysin О activity // Biochem. J. 1974. Vol. 140, N 1. P. 95-98.

129. Kehoe M.A., Miller, L., Walker J.A. Boulnois G.J. Nucleotide sequence of the streptolysin О (SLO) gene: structural homologies between SLO and other membrane-damaging, thiol-activated toxins // Infect. Immun. 1987. Vol. 55, N 12. P. 3228-3232.

130. Polekhina G., Giddings K.S., Tweten R.K., Parker M.W. Insights into the action of the superfamily of cholesterol-dependent cytolysins from studies of intermedilysin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102, N 3. P. 600-605.

131. Getzoff E.D., Tainer J.A., Olson A.J. Recognition and interactions controlling the assemblies of beta barrel domains//Biophys. J. 1986 Vol. 49, N l.P. 191-206.

132. Iwamoto M., Ohno-Iwashita Y., Ando S. Role of the essential thiol group in the thiol-activated cytolysin from Clostridium perfringens II Eur. J. Biochem 1987. Vol. 167, N 3. P. 425-430.

133. Boulnois G.J., Paton J.C., Mitchell T.J., Andrew P.W. Structure and function of pneumolysin, the multifunctional, thiol-activated toxin of Streptococcus pneumoniae II Mol. Microbiol. 1991. Vol.5, N 11. P.2611-2616.

134. Palmer M., Saweljew P., Vulicevic I., Valeva A., Kehoe M., Bhakdi S. Membrane-inserting domain of streptolysin О identified by cysteine scanning mutagenesis // J. Biol. Chem 1996. Vol. 271, N 43. P. 26664-26667.

135. Shatursky O., Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K. The mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel paradigm for pore-forming toxins // Cell. 1999. Vol. 99, N 3. P. 293-299.

136. Heuck A.P., Hotze E.M., Tweten R.K., Johnson A.E. Mechanism of membrane insertion of a multimeric P-barrel protein: perfringolysin О creates a pore using ordered and coupled conformational changes // Mol. Cell. 2000. Vol. 6, N 5. P. 1233-1242.

137. Ramachandran R., Tweten R.K., Johnson A.E. Membrane-dependent conformational changes initiate cholesterol-dependent cytolysin oligomerization and intersubunit p-strand alignment//Nat. Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11, N 8. P. 697-705.

138. Hotze E.M., Heuck A.P., Czajkowsky D.M., Shao Z., Johnson A.E., Tweten R.K. Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of a P-barrel-forming cholesteroldependent cytolysin // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, N 13. P. 11597-11605.

139. Bayley H., Jayasinghe L., Wallace M. Prepore for a breakthrough // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12, N 5. P. 385-386.

140. Alouf J.E., Geoffroy C. The family of the antigenically related, cholesterol-binding («sulphydryl-activated») cytolytic toxins // Sourcebook of Bacterial Protein Toxins / Eds. Alouf J.E., Freer J.J. London, UK: Acad. Press, 1991. P. 147-186.

141. Jacobs Т., Darji A., Frahm N. Rohde M., Wehland J„ Chakraborty Т., Weiss S. Listeriolysin O: cholesterol inhibits cytolysis but not binding to cellular membranes // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 28, N 6. P. 1081-1089.

142. Giddings K.S., Johnson A.E., Tweten R.K. Redefining cholesterol's role in the mechanism of the cholesteroldependent cytolysins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. Vol. 100, N20. P. 11315-11320.

143. Nishibori Т., Xiong H., Kawamura I., Arakawa M., Mitsuyama M. Induction of cytokine gene expression by listeriolysin О and roles of macrophages and NK cells // Infect. Immun. 1996. Vol. 64, N 8. P. 3188-3195.

144. Yoshikawa H., Kawamura I., Fujita M., Tsukada H., Arakawa M., Mitsuyama M. Membrane damage and interleukin-1 production in murine macrophages exposed to listeriolysin О // Infect. Immun. 1993. Vol. 61, N 4. P. 1334-1339.

145. Sher D., Fishman Y., Zhang M., Lebendiker M., Gaathon A., J.M. Mancheno, Zlotkin E. Hydralysins, a New Category of P-Pore-forming Toxins in Cnidaria // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, N 24. P. 22847-22855.

146. Sher D., Knebel A., Bsor Т., Nesher N. Tal Т., Morgenstern D., Cohen E., Fishman Y., Zlotkin E. Toxic polypeptides of the hydra a bioinformatic approach to cnidarian allomones // Toxicon. 2005. Vol. 45, N 7. P. 865-879.

147. Kawashima Y., Nagai H., Ishida M., Nagashima Y., Shiomi K. Primary structure of echotoxin 2, an actinoporin-like hemolytic toxin from the salivary gland of the marine gastropod Monoplex echo II Toxicon. 2003. Vol. 42, N 5. P. 491-497.

148. Papo N. Shai Y. Can we predict biological activity of antimicrobial peptides from their interactions with model phospholipid membranes? // Peptides. 2003. Vol. 24, N 11. P. 1693-1703.

149. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. 1995. Vol. 13. P. 61-92.

150. Lehrer R.I.* Barton A., Daher K.A., Harwig S.S., Ganz Т., Selsted M.E. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of bactericidal activity // J. Clin. Invest. 1989. Vol. P. 84, N 2. P. 553-561.

151. Sipos D., Andersson M., Ehrenberg A. The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI in solution, determined by H1 NMR // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 209, N 1. P. 163-169.

152. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. Vol. 84, N 15. P. 5449-5453.

153. Мог A., Nguyen V.H., Delfour A., Migliore-Samour D., Nicolas P. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of amphibian skin// Biochemistry. 1991. Vol. 30, N 36. P. 8824-8830.

154. Terwilliger T.C., Eisenberg D. The structure of melittin. II. Interpretation of the structure // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257, N 11. P. 6016-6022.

155. Fox R.O., Richards F.M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5 A resolution // Nature. 1982. Vol. 300, N 5890. P. 325-330.

156. Shai Y., Fox J., Caratsch C., Shih Y.L., Edwards C., Lazarovici P. Sequencing and synthesis of pardaxin, a polypeptide from the Red Sea Moses sole with ionophore activity // FEBS Lett. 1988. Vol. 242, N 1. P. 161-166.

157. Allende D., Mcintosh T.J. Lipopolysaccharides in bacterial membranes act like cholesterol in eukaryotic plasma membranes in providing protection against melittin-induced bilayer lysis // Biochemistry. 2003. Vol. 42, N 4. P. 1101-1108.

158. Meyer C.E., Reusser F. A polypeptide antibacterial agent isolated from Trichoderma viride // Experientia. 1967. Vol. 23, N 2. P. 85-86.

159. Hancock R.E., Scott M.G. The role of antimicrobial peptides in animal defenses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97, N 16. P. 8856-8861.

160. Seelig J. Thermodynamics of lipid-peptide interactions // Biochim. Biophys. Acta. 2004. Vol. 1666, N 1-2. P. 40-50.

161. Oren Z., Shai Y. Mode of action of linear amphipathic a-helical antimicrobial peptides // Biopolymers (Peptide Science). 1998. Vol. 47, N 6. P. 451-463.

162. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by a-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462, N 1-2. P. 55-70.

163. Yang L., Harroun T.A., Weiss T.M., Ding L., Huang H.W. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores // Biophys. J. 2001. Vol. 81, N 3. P. 1475— 1485.

164. Ladokhin A.S., White S.H. Interfacial folding and membrane insertion of a designed helical peptide // Biochemistry. 2004. Vol. 43, N 19 . P. 5782-5791.

165. Pouny Y., Rapaport D., Мог A., Nicolas P., Shai Y. Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogues with phospholipid membranes // Biochemistry. 1992. Vol. 31, N 49. P. 12416-12423.

166. Feder R., Dagan A., Мог A. Structure-activity relationship study of antimicrobial dermaseptin S4 showing the consequences of peptide oligomerization on selective cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 6. P. 4230-4238.

167. Habermann E. Bee and wasp venom: the biochemistry and pharmacology of their peptides and enzymes are reviewed // Science. 1972. Vol. 177, N 46. P. 314-322.

168. Dempsey C.E., Butler G.S. Helical structure and orientation of melittin in dispersed phospholipid membranes from amide exchange analysis in situ II Biochemistry. 1992. Vol. 31, N48. P. 11973-11977.

169. Terwilliger T.C., Weissman L., Eisenberg D. The structure of melittin in the form I crystals and its implication for melittin's lytic and surface activities // Biophys. J. 1982. Vol. 37, N 1. P. 353-361.

170. Altenbac h C., Hubbell W.L. The aggregation state of spinlabeled melittin in solution and bound to phospholipid membranes: evidence that membrane-bound melittin is monomeric // Proteins. 1988. Vol. 3, N 4. P. 230-243.

171. Makhatadze G.I., Medvedkin V.N., Privalov P.L. Partial molar volumes of polypeptides and their constituent groups in aqueous solution over a broad temperature range//Biopolymers. 1990. Vol. 30, N 11-12. P. 1001-1010.

172. Lubke K., Matthes S„ Kloss G. Isolation and structure of N 1-formyl melittin // Experientia. 1971. Vol. 27, N 7. P. 765-767.

173. Dawson C.R., Drake A.F., Helliwell J., Hider R.C. The interaction of bee melittin with lipid bilayer membranes // Biochim. Biophys. Acta 1978. Vol. 510, N 1. P. 75-86.

174. Skehel J.J., Wiley D.C. Coiled coils in both intracellular vesicle and viral membrane fusion // Cell. 1998. Vol. 95, N 7. P. 871-874.

175. Meyer C.E., Reusser F. A polypeptide antibacterial agent isolated from Trichoderma viride II Experientia. 1967. Vol. 23, N 2. P. 85-86.

176. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science. 1972. Vol. 175, N 23. P. 720-731.

177. Simons K., Ikonen E. Functional rafts in cell membranes // Nature. 1997. Vol. 387,N 6633. P. 569-572.

178. Brown D.A., London E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275, N 23. P. 17221-17224.

179. Alonso M.A., Millan J. The role of lipid rafts in signalling and membrane trafficking in T lymphocytes // J. Cell Sci. 2001 Vol. 114 (Pt. 2) P. 3957-3965.

180. Brown R.E. Sphingolipid organization in biomembranes: what physical studies of model membranes reveal // J. Cell Sci. 1998. Vol. 11 l(Pt. 1). P. 1-9.

181. Kabouridis P.S., Janzen J., Magee A.L., Ley S.C. Cholesterol depletion disrupts lipid rafts and modulates the activity of multiple signaling pathways in T lymphocytes // Eur. J. Immunol. 2000. Vol. 30, N 3. P. 954-963.

182. Pralle A., Keller P., Florin E.-L., Simons K., Horber J.K.H. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells // J. Cell Biol. 2000. Vol. 148, N 5. P. 997-1007.

183. Stefanova I., Horejsi V., Ansotegui I., Knapp W., Stockinger H. GPI-anchored cell-surface molecules complexed to protein tyrosine kinases // Science. 1991. Vol. 254, N 5034. P. 1016-1019.

184. Wulfing C., Davis M.M. A receptor/cytoskeletal movement triggered by costimulation during T cell activation // Science. 1999. Vol. 282, N 5397. P. 2266-2269.

185. Boyle E.C., Finlay B.B. Bacterial pathogenesis: exploiting cellular adherence // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. Vol. 15, N 5. P. 633-639.

186. Galan J.E. Salmonella interactions with host cells: type III secretion at work // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. Vol. 17. P. 53-86.

187. Barbieri J.T., Riese M.J., Aktories K. Bacterial toxins that modify the actin cytoskeleton // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2002.Vol. 18. P. 315-344.

188. Hayward R.D., Koronakis V. Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella // EMBO J. 1999. Vol. 18, N 18. P. 4926-4934.

189. McGhie E.J., Hayward R.D., Koronakis V. Cooperation between actin-binding proteins of invasive Salmonella: SipA potentiates SipC nucleation and bundling of actin // EMBO J. 2001. Vol. 20, N 9. P. 2131-2139.

190. Stebbins C.E. Structural insights into bacterial modulation of the host cytoskeleton // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. Vol. 14, N 6. P. 731-740.

191. Lilic M., Galkin V.E., Orlova A., VanLoock M.S., Egelman E.H., Stebbins C.E. Salmonella SipA polymerizes actin by stapling filaments with nonglobular protein arms // Science. 2003. Vol. 301, N 5641. P. 1918-1921.

192. White S.H., Wimley W.C. Membrane protein folding and stability: Physical Principles // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1999. Vol. 28. P. 319-365.

193. Koepke J., Ни X.C., Muenke C., Schulten K., Michel H. The crystal structure of the light-harvesting complex II (B800-850) from Rhodospirillum molischianum II Structure. 1996. Vol. 4, N 5. P. 581-597.

194. Meyer J.E.W., Hofnung M., Schulz G.E. Structure of maltoporin from Salmonella typhimurium ligated with a nitrophenyl-maltotrioside // J. Mol. Biol. 1997. Vol. 266, N 4. P. 761-775.

195. McDonnell P.A., Shon К., Kim Y., Opella S.J. fd coat protein structure in membrane environments //J. Mol. Biol. 1993. Vol. 233, N 3. P. 447-463.

196. White S.H., von Heijne G. The machinery of membrane protein assembly // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. Vol. 14, N 4. P. 397-404.

197. White S.H., Ladokhin A.S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure // J. Biol. Chem. 2001 Vol. 276, N 35. P. 32395-32398.

198. Schiffer M., Chang C.H., Stevens F.J. The functions of tryptophan residues in membrane proteins // Protein Eng. 1992. Vol. 5, N 3. P. 213-214.

199. Wimley W.C., White S.H. Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces // Nat. Struct. Biol. 1996. Vol. 3, N 10. P. 842-848.

200. Yau W.-M., Wimley W.C., Gawrisch K., White S.H. The preference of tryptophan for membrane interfaces // Biochemistry. 1998. Vol. 37, N 42. P. 14713-14718.

201. Morrow M.R., Huschilt J.C., Davis J.H. Simultaneous modeling of phase and calorimetric behavior in an amphiphilic peptide/phospholipid model membrane // Biochemistry. 1985. Vol. 24, N 20. P.5396-406.

202. Potrich C., Tomazzolli R., Dalla Serra M., Anderluh G., Malovrh P., Macek P., Menestrina G., Tejuca M. Cytotoxic activity of a tumor protease-activated pore-forming toxin // Bioconjug. Chem. 2005. Vol. 6, N 2. P. 369-376.

203. Menestrina G., Serra M.D., Prevost G. Mode of action of p-barrel pore-forming toxins of the staphylococcal a-hemolysin family // Toxicon. 2001. Vol. 39, N 11. P. 16611672.

204. Burks R.L., Lodge D.M. Cued in: advances and opportunities in freshwater chemical ecology//J. Chem. Ecol. 2002. Vol. 28, N 10. P.1901-1917.

205. Macek P. Polypeptide cytolytic toxins from sea-anemones (Actiniaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. Vol. 5, N 1-3. P. 121-130.

206. Halstead B.W. Poisonous and venomous marine animals of the world. Princeton, N.Y.: Darwin Press, 1978.1216 p.

207. Shiomi K., Ishikawa M., Yamanaka H., Kikuchi T. Isolation and properties of four serine protease inhibitors from water extracts of sea anemone Actinia equina II Nippon Suisan Gakkaishi. 1989. Vol. 55, N 7. P. 1235-1241.

208. Орлов Б.Н., Гелашвили Д.Б. Ядовитые кишечнополостные // Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды; Москва: Высшая школа, 1985. С. 36-54.

209. Hessinger D.A., Lenhoff Н.М. Membrane structure and function. Mechanism of hemolysis induced by nematocyst venom: roles of phospholipase A and direct lytic factor // Arch. Biochem. Biophys. 1976. Vol. 173, N 2. P.603-613.

210. Norton R.S., Мабек P., Reid G.E., Simpson R.J. Relationship between the cytolysins tenebrosin-C from Actinia tenebrosa and equinatoxin II from Actinia equina И Toxicon. 1992. Vol. 30, N 1. P. 13-23.

211. Зыкова T.A., Винокуров JI.M., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus II Биорган. химия. 1984. Т.11, N 3. С. 302-310.

212. Kem W.R. Sea anemone toxins: Structure and action // The Biology of Nematocysts / Eds. Hessinger D.A., Lenhoff H.M. San Diego: Acad. Press, 1988. P. 375— 405.

213. Монастырная M.M., Зыкова T.A., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus //Биоорган, химия. 1999. Т. 25, N 10. С. 733-741.

214. Khoo K.S., Kam W.K., Khoo Н.Е., Gopalakrishnakone P., Chung M.C.M. Purification and partial characterization of two cytolysins from a tropical sea anemone, Heteractis magnifica //Toxicon. 1993. Vol. 31, N 12. P. 1567-1579.

215. Козловская Э.П. Токсины морских актиний: структура и функция: автореф. дис. д-ра хим. наук. Владивосток, 1990. 50 с.

216. Аверинцев В.Г. Актинии залива Посьет Японского моря // Исслед. фауны морей. 1967. Т. 5. С. 62-77.

217. Клышко Е.В., Ильина А.П., Монастырная М.М., БурцеваЮ.В., Костина Е.Е., Зыкова Т.А., Мензорова Н.И., Козловская Э.П. Биологически активные полипептиды и гидролитические ферменты в актиниях низкобореальных вод // Биол. моря. 2003. Т. 29, N3. С. 189-194.

218. Mebs D., Liebrich М., Reul A., Samejima Y. Hemolysins and proteinase inhibitors from sea anemones of the Gulf of Aqaba // Toxicon. 1983. Vol. 21, N 2. P. 257-264.

219. Lenarci6 В., Ritonja A., Strukelj В., Turk В., Turk V. Equistatin, a new inhibitor of cysteine proteinases from Actinia equina, is structurally related to thyroglobulin type-1 domain //J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, N 21. P. 13899-13903.

220. Monastyrnaya М.М., Zykova Т.А., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus //Toxicon. 2002. Vol. 40, N 8. P. 1197-1217.

221. Зыкова T.A., Винокуров JI.M., Маркова Л.Ф., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность трипсинового ингибитора IV из Radianthus macrodactylus II Биоорган, химия. 1985. Т. 11, N 3. С. 293-301.

222. Bernheimer A.W., Avigad L.S. A cholesterol inhibitable cytolytic protein from the sea anemone Metridium senile II Biochim. Biophys. Acta. 1978. Vol. 541, N 1. P. 96-106.

223. Turk T. Cytolytic toxins from sea anemones // J. Toxicol.-Toxin Rev. 1991. Vol. 10 N 3. P. 223-262.

224. Bernheimer A.W., Avigad L.S. Properties of a toxin from the sea anemone Stoichactis helianthus, including specific binding to sphingomyelin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. V. 73, N 2. P. 467-471.

225. Kem W.R., Dunn B.M. Separation and characterization of four different amino acid sequence variants of a sea anemone (Stichodactyla helianthus) protein cytolysin // Toxicon. 1988. Vol. 26, N 11. P. 997-1008.

226. Санина Н.М., Костецкий ЭЛ. Термотропное поведение сфингофосфолипидов морских беспозвоночных // Ж. эволюц. биохим. физиол. 2000. Т. 36, №3. С. 192-197.

227. Gomes Т., Chaves М., Lanio М.Е., Romero L., Wong L. Purification and hemolytic properties of two isotoxins from the sea anemone Stoichactis helianthus (Coelenterata) //Toxicon. 1987. Vol. 25, N 4. P. 361.

228. Vascovsky V.E., Suppes Z.S. Phospholipases of marine invertebrates. I. Distribution of phospholipase A // Сотр. Biochem. Physiol. 1972. V. 43, N 3. P. 601-609.

229. Uechi G., Toma H., Arakava Т., Sato Y. Biochemical and physiological analysis of a hemolytic toxin isolated from a sea anemone Actineria villosa II Toxicon. 2005. Vol. 45, N 6. P. 761-766.

230. Mahnir V.M., Kozlovskaya E.P. Sea anemone Radianthus macrodactylus new source of palytoxin //Toxicon. 1992. Vol. 30, N 11. P. 1449-1456.

231. Giraldi Т., Ferlan I., Romeo D. Antitumor activity of equinatoxin // Chem. Biol. Interact. 1976. Vol. 13, N 3-4.13. P. 199-203.

232. Batista U., Macek P., Sedmak B. The cytotoxic and cytolytic activity of equinatoxin II from the sea anemone Actinia equina II Cell Biol. Int. Rep. 1990. Vol. 14, N 11. P. 1013-1024.

233. Batista U., Macek P., Sedmak B. The influence of equinatoxin II on V-79-379 a cell lines // Period. Biol. 1986. Vol. 88, N 2. P. 97-98.

234. Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A carcinoembryogenic antigen-directed immunotoxin built by linking a monoclonal antibody to a hemolytic toxin // Int. J. Cancer 1989. Vol. 43, N5. P. 926-929.

235. Pederzolli C., Belmonte G., Serra M.D., Macek P., Menestrina G. Biochemical and cytotoxic properties of conjugates of transferrin with equinatoxin II, a cytolysin from a sea anemone // Bioconjugate Chem. 1995. Vol. 6, N 2. P. 166-173.

236. Гацура B.B. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных соединений. Москва: Медицина, 1979. 50 с.

237. Ильина А.П., Монастырная М.М., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика // Биоорган, химия. 2005. Т. 31, N 1.С. 39-48.

238. Иванов А.С. Транспорт хлоридов в митохондриях и поверхностный потенциал мембран: автореф. дис. канд. биол. наук. Москва. 1978.18 с.

239. Olson F., Hunt С.А., Szoka F.C., Vail W.J., Papahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes // Biochim. Bophys. Acta. 1979. Vol. 557, N 1. P. 9-23.

240. Василенко И.А., Боровягин B.JI. Полиморфизм липидов в модельных и биологических мембранах// Биол. мембраны. 1990. Т. 7, N 7. С. 677-701.

241. Barenholz Y., Gatt S. Sphingomyelin: metabolism, chemical synthesis, chemical and physical properties // Phospholipids / Eds. Hawthorne J.N., Ansel G.B. Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier Biomedical Press, 1982. P. 129-177.

242. Марголис Л.Б.б Бергельсон Г.Н. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Москва: Наука, 1986, 240 с.

243. Folch I., Less М., Standley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, N 1. P. 497-509.

244. Bangham A.D., Flemans R., Heard D.H., Seaman G.V.F. An apparatus for microelectrophoresis of small particles // Nature. 1958. Vol. 182, N 4636. P.642-644.

245. Mc Laughlin S.G.A., Szabo G., Eisenman G., Ciani S.M. Surface charge and the conductance of phospholipid membranes //Proc. Nat. Acad. Sci. 1970. Vol. 67, N 3. P. 1268-1275.

246. Muller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution // J. Phis. Chem. 1963. Vol. 67, N 3. P. 534-535.

247. Красильников O.B., Сабиров P.3., Терновский В.И., Ташмухамедов Б.А. Влияние ионного состава среды на динамику образования стафилотоксиновых каналов в БЛМ // Биол. мембраны. 1981. Т. 3, N 10. С. 1057-1061.

248. Чантурия А.Н., Шатурский О.Я., Лишко В.К., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Взаимодействие токсина морской актинии Radianthus macrodactylus с бислойными фосфолипидными мембранами // Биол. мембраны. 1990. Т. 7, N 7. С. 763-769.

249. Соколов Ю.В., Чантурия А.Н., Лишко В.К. Исследование каналообразующих свойств яда паука Steatoda paykulliana II Биофизика. 1984. Т. 29, N 4. С.620-623.

250. Красильников О.В., Сабиров Р.З., Терновский В.И.,Ташмухамедов Б.А. Природа и приближенное математическое описание свойств латротоксинового канала // Биол. мембраны. 1986. Т. 3, N 9, С.936-943.

251. Vakorina T.I., Klyshko E.V., Monastyrnaya M.M. and Kozlovskaya E.P. Conformational stability and hemolytic activity of actinoporin RTX-S II from the sea anemone Radianthus macrodactylus И http://protein.bio.msu.ru/biokhimiva/BM04-164.pdf

252. Williamson P, Antia R, Schlegel RA. Maintenance of membrane phospholipid asymmetry. Lipid-cytoskeletal interactions or lipid pump? // FEBS Lett. 1987. Vol. 219, N 2. P. 316-320.

253. Сигворс Ф., Сакман Б., Heep Э. Регистрация одиночных каналов. Под ред. Сакмана Б., Неера Э. Москва: Мир, 1987. 448 с.

254. Hille В. Ionic channels of excitable membranes. Messachusetts: Sinauer Assoc. Inc., 1984, P. 185-186.

255. Melchior D.L. Lipid domains in fluid membranes: a quick-freeze differential Scanning calorimetry study // Science. 1986. Vol. 234, N 4783. P. 15771580.

256. Shnyrov V.L., Monastyrnaya M.M., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Intern. 1992. Vol. 26, N 2. P. 219-229.

257. Gomez-Fernandez J.C., Goni F.M., Bach D., Restall C.J., Chapman D. Protein-lipid interaction. Biophysical studies of (Ca2+ + Mg2+)-ATPase reconstituted systems // Biochim. Biophys. Acta. 1980. Vol. 598, N 3. P. 502-516.

258. Privalov P.L., Khechinashvili N.N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study // J. Mol. Biol. 1974. Vol. 86, N 3. P. 665-684.

259. Lumry R, Biltonen R. Validity of the «two-state» hypothesis for conformational transitions of proteins // Biopolymers. 1966. Vol. 4, N 8. P. 917-944.

260. Haest C.W.M. Interaction between membrane skeleton proteins and the erythrocyte membrane //Biochim. Biophys. Acta. 1982. Vol. 694, N 4. P. 331-352.

261. Liu S.-C., Derick L.H., Palek J. Visualization of the Hexagonal Lattice in the Eeythrocyte Membrane Skeleton//J.Cell Biol. 1987 Vol. 104, N 3. P. 527-536.

262. Zachowski A., Farve E., Cribier S., Herve P., Devaux H.F. Outside-inside translocation of aminophospholipids in the human erythrocyte membrane is mediated by a specific enzyme// Biochemistry. 1986. Vol. 25, N 9. P. 2585-2590.

263. Chanturiya A.N. Detection of transient capacitance increase associated with channel formation in lipid bilayers // Biochim. Biophys. Acta. 1990. Vol. 1026, N 2. P.248-250.

264. Клышко E.B., Ильина А.П., Лихацкая Г.Н., Исаева М.П., Гузев К.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Липкин А.В., Барсова Е.В., Крыжко И.Б., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А. Актинопорины: структура и функция // Вестник ДВО РАН. 2004. N 3. С. 45-53.

265. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, N 12. P. 5463-5467.

266. Ильина А.П., Монастырная M.M., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis II Биоорган, химия. 2005. Т. 31, N 4. С. 357-362.

267. Козловская Э.П., Клышко Е.В., Ильина А.П., Исаева М.П., Гузев К.В., Зыкова Т.А., Монастырная М.М. Цитолизины актиний // В тр. Объед. междунар. научн. конф. «Новая геометрия природы», Казань, 25 авг.-5 сент. 2003. Казань, 2003. Т. 2. С. 179-183.

268. Вакорина Т.И., Клышко E.B., Монастырная M.M., Козловская Э.П. Конформационная стабильность и гемолитическая активность актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus II Биохимия. 2005. Т. 70, N 7. С. 957-966.

269. Ichikawa Т., Terada H. Determination of phenylalanine, tryptophan and tyrosine in a mixture of amino acid by 2nd derivative spectrophotometry // Chem. Pharm. Bull. 1981. Vol. 29, N 2. P. 438-444.

270. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism // Biochemistry. 1981. Vol. 20. N. 1. P. 33-37.

271. Poklar N., Fritz J., Macek P., Vesnaver G., Chalikian T.V. Interaction of the poreforming protein equinatoxin II with model lipid membranes: a calorimetric and spectroscopic study// Biochemistry. 1999. Vol. 38, N 45. 14999-15008.

272. Веньяминов С.Ю., Косых В.Г., Холодков O.A., Бурьянов Я.И. УФ- и КД-спектры рестрикционной эндонуклеазы EcoRII и ДНК-метилазы EcoRII // Биоорган, химия. 1990. Т. 16, N 1. С. 47-51.

273. Лакович Д. Основы флуоресцентной спектроскопии. Москва: Мир, 1986. 351 с.

274. Эфтинг М.Р. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков // Биохимия. 1998. Т. 63, N 3. С. 327-337.332. http://expasy.org/swiss-model333. http://expasy.org/spdbv

275. Koradi R., Billeter М., Wuthrich К. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graph. 1996. Vol. 14, N 1. P. 51-55.

276. Guex N., Peitsch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. // Electrophoresis. 1997. Vol. 18, N 15. P. 2714-2723.

277. Sayle R.A., Milner-White E.J. RASMOL: biomolecular graphics for all // Trends Biochem. Sci. 1995. Vol. 20, № 9. P. 374-376.337. http://www.chemcomp.com/Corporate Information/MOE.html

278. Chattopadhyay A., Raghuraman H. Application of fluorescence spectroscopy to membrane protein structure and dynamics // Curr. Sci. 2004. Vol. 87, N 8. P. 175-180.

279. Takagi J. Molecular Environment of Integrins. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)-dependent integrins // Biochem. Soc. Trans. 2004. Vol. 32, N 3. P. 403-406.

280. Bunc M., Frangez R., Horvat I., Turk Т., Suput D. Effects of equinatoxins in vivo. Possible role of degranulation of thrombocytes and granulocytes // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. Vol.710. P. 162-167.

281. Suput D., Frangez R., Bunc M. Cardiovascular effects of equinatoxin III from the sea anemone Actinia equina (L.) // Toxicon. 2001. Vol. 39, N 9. P. 1421-142.

282. Piehler J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro II Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. Vol. 15, N 1. P. 4-14.

283. Халилов Э.М., Иванова Л.И. Изменение микровязкости липидного бислоя мембран некоторых злокачественных клеток и перевиваемость опухолей // Биофизика. 1986. Т. 31, N 1. С. 156-157.

284. Халилов Э.М., Ли B.C., Азизова О.А., Саженин Г.И., Алимов Т.А., Арчаков А.И. Структурно-функциональный анализ мембран эритроцитов с различным содержанием холестерина//Вопр. мед. химии. 1982. N 1. С. 81-86.

285. А.с. 942763 СССР, М. Кл. А 61 К 37/02. Способ получения гемолизина / Монастырная М.М., Вожжова Е.И., Козловская Э.П., Еляков Г.Б.; (СССР). № 2981676/28-13; заявл. 20.08.80; опубл. 15.07.82, Бюл. № 26.

286. А.с. 1242826 СССР, МКИ4 G 01 N 33/48, 33/50, 33/68, 33/92. Способ определения сфингомиелина / Монастырная М.М., Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Еляков Г.Б. (СССР). № 3808934/28-14; заявл. 08.10.84; опубл. 07.07.86, Бюл. № 25.

287. Schriewer Н., Jabs H.U., Assmann G. The enzumatic analysis of sphingomyelin in HDL//J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1982. Vol. 20, N 5. P. 305-312.

288. Cuatrecasas P., Wilchek M., Anfinsen C.B. Selective enzyme purification by affinity chromatography// Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1968. Vol. 61, N 2. P. 636-643.

289. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193, N 1. P. 265-275.

290. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, N 5259. P. 680-685.

291. Awdeh Z.L., Williamson A.R., Askonas B.A. Isoelectric focusing in polyacrylamide gel and its application to immunoglobulins // Nature. 1968. V. 219, N 5149. P. 66-68.

292. Grey W.R. End-group analysis using dansyl chloride // Methods in Enzymology / Eds. Hirs C.H.W., Timasheff S.N. N.Y., London: Acad. Pres, 1972. V. 25B. P. 121-139.

293. Беленький Б.Г., Ганкнна E.C., Нестеров B.B. Экспрессный ультрачувствительный метод идентификации N-концевых аминокислот в белках и пептидах с помощью тонкослойной хроматографии // ДАН СССР. 1967. Т. 172. С. 91-93.

294. Allen G. Amino acid analyses // Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Sequencing of Proteins and Peptides / Eds. Burdon R.H., van Knippenberg P.H. Amsterdam, N.Y., Oxford: Elsevier, 1989. P. 40.

295. Ichikawa T, Terada H. Second derivative spectrophotometry as an effective tool for examining phenylalanine residues in proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1977. Vol. 494, N 1. P. 267-270.

296. Hunkapiller M.W., Hood L.E. Direct microsequence analysis of polypeptides using an improved sequenator, a nonprotein carrier (polybrene), and high pressure liquid chromatography//Biochemistry. 1978. Vol. 17, N. 11. P. 2124-2133.

297. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic Acids Res. 1976. Vol. 3, N 9. P. 2303-2308.

298. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, N 12. P. 5463-5467.

299. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215, N 3. P. 403-410.

300. Winder A.F., Gent W.L.G. Correction of light-scattering errors in spectrophotometric protein determinations // Biopolymers. 1971. Vol. 10. N. 7. P. 12431251.

301. Hamill O.P., MartyA., Neher E., Sakman В., Sigworth F.J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pflugers Arch. 1981. Vol. 391, N 2. P. 85-100.

302. Богославская Е.Г., Коган В.Е.Глущенко Н.Н., Ерохин В.Н. Сравнительное изучение противоопухолевого действия полиненасыщенной жирной кислоты и продуктов ее автоокисления // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1976, № 5. С. 734-741.

303. Бузников Г.А., Подмарев В.К. Методы биологии развития. Москва: Наука, 1975. С. 188-222.

304. Sanchez R., Sali A. Advances in comparative protein-structure modelling // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. Vol. 7, N 2. P. 206-214.

305. Baker D., Sali A. Protein structure prediction and structural genomics // Science. 2001. Vol. 294, N 5540. P. 93-96.

306. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, N 1. P. 235-242.

307. Schwede Т., Kopp J., Guex N. Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31, N 13. P. 3381-3385.

308. Peitsch M. C. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling // Biochem. Soc. Trans. 1996. Vol. 24, N 1. P. 274-279.

309. Hooft R.W., Vriend G., Sander C., Abola E.E. Errors in protein structures // Nature. 1996. Vol. 381, N 6580. P. 272.