Получение и сравнительная характеристика рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сидорова, Ольга Вениаминовна

• Сидорова, Ольга Вениаминовна
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сидорова, Ольга Вениаминовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Состав и строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2 Порины наружной мембраны грамотрицательных бактерий.

1.2.1 Общая характеристика.

1.2.2 Структура и функция поринов.

1.2.3. Использование физико-химических методов для характеристики пространственной структуры поринов.

1.3 Получение и свойства рекомбинантных поринов.

1.3.1. Экспрессия рекомбинантных белков.

1.3.2. Механизмы фолдинга белков.

1.3.2.1. Фолдинг белков in vivo.

1.3.2.2. Методы рефолдинга белков in vitro.

1.3.3. Сайт-направленный мутагенез.

1.3.4. Исследование свойств мутантных поринов.

1.3.4.1. Потенциалозависимость.

1.3.4.2. рН — чувствительность.

1.3.4.3. Чувствительность к антибиотикам.

1.4. Иммунологические свойства порообразующих белков грамотрицательных бактерий.

1.4.1. Антигенные свойства нативных поринов.

1.4.2. Иммунологические свойства нативных поринов.

1.4.3. Иммунологические свойства рекомбинантных поринов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Экспрессия и выделение рекомбинантного OmpF порина наружной мембраны

Y. pseudotuberculosis.

2.2. Рефолдинг и сборка рекомбинантного порина.

2.3 Пространственная структура полученных рекомбинантных белков.

2.4. Функциональная активность рекомбинантных поринов.

2.5. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинантного OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

2.5.1. Изучение иммуногенной активности РБ-1.

2.5.2. Применение рекомбинантного мономера порина в качестве диагностического антигена.

2.6. Предсказание антигенных детерминант неспецифических поринов патогенных видов иерсиний и иммунохимическая характеристика соответствующих им синтетических пептидов.

2.6.1. Предсказание антигенно-активных участков OmpF порина К pseudotuberculosis.

2.6.2. Предсказание Т- и В-клеточных эпитопов неспецифических поринов патогенных видов иерсиний.

2.6.3. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включаю-щих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний.

2.7. Получение и характеристика мутантных поринов с делециями наружных петель.

2.7.1. Компьютерное моделироване мутантных форм OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

2.7.2.Сайт-направленный мутагенез.

2.7.3. Выделение и рефолдинг мутантных форм рекомбинантного OmpF порина.

2.7.4. Пространственная структура мутантных поринов.

2.7.5. Функциональная активность мутантных поринов.

2.7.6. Иммунохимическая характеристика мутантных поринов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и сравнительная характеристика рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм»

Порообразующие белки (порины) наружной мембраны (НМ) грамотрица-тельных бактерий существуют в интактной мембране в виде гомотримеров, образуют водонаполненные поры, или каналы, через которые осуществляется транспорт низкомолекулярных веществ. Особенности структуры поринов и их поверхностная локализация обуславливают наличие у них многочисленных функций, отличных от транспортной. С одной стороны, порины представляют собой молекулы-мишени для иммунной системы организма-хозяина, с другой — выступают как факторы вирулентности и патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в организме.

Получение рекомбинантных белков в клетках Е. coli в виде телец включения (ТВ), которые представляют собой ассоциаты нерастворимых интермедиа-тов белка - широко распространенный подход, используемый для получения индивидуальных белков в препаративных количествах. Недостатком данного метода является то, что белки в составе подобных ассоциатов не обладают функциональной активностью, поэтому для использования рекомбинантных белков в практических целях требуется восстановление их пространственной структуры.

Изменяя структуру белка с помощью сайт-направленного мутагенеза и наблюдая за изменением его свойств, можно определить функциональную значимость тех или иных участков белковой молекулы. Известно, что поверхностно локализованные структурные элементы молекулы порина, так называемые наружные петли, входят в состав антигенных детерминант, а также участвуют в стабилизации тримеров белка и модуляции проводимости пориновых каналов.

Получение рекомбинантного OmpF порина Yersinia pseudotuberculosis и его мутантных форм, несущих делеции участков наружных петель, является актуальной научной задачей. Изучение взаимосвязи между структурой, функциональными и антигенными свойствами мутантных белков позволит, во-первых, расширить фундаментальные представления о свойствах поринов и, во-вторых, открыть новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иер-синиями.

Целью данной работы явилось установление взаимосвязи между отдельными элементами (участками наружных петель) пространственной и антигенной структуры OmpF поринашз Y. pseudotuberculosis и его функциональными свойствами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга рекомбинантного порина. Характеристика пространственной структуры полученных интермедиа-тов рефолдинга (мономера и тримера) белка. Изучение порообразующих ^ иммунобиологических свойств рекомбинантного порина. Апробация возможности его использования в качестве антигена для диагностики псевдотуберкулеза.

2. Расчет антигенных В- и Т-клеточных эпитопов, входящих в состав аминокислотной последовательности поринов, патогенных для человека иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y pestis, Y. enterocolitica), и синтез соответствующих этим участкам пептидов. Характеристика синтетических пептидов как иммуно-генов и диагностических антигенов.

3. Сайт-направленный мутагенез белок-кодирующего участка ompF гена порина с целью создания экспрессионных конструкций, несущих в себе делеции петельных участков аминокислотной последовательности OmpF порина Y. pseudotuberculosis. Экспрессия, выделение и подбор условий рефолдинга му-тантных белков. Характеристика пространственной структуры полученных ин-термедиатов рефолдинга» (мономера и тримера) мутантных поринов. Изучение их функциональных и иммунохимических свойств. фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицерином и дифосфатидилглицери-ном, или кардиолипином. ЛПС, занимающий около 45% поверхности НМ бактерий, является специфическим компонентом. По своей химической природе ЛПС представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент и гидрофильную полисахаридную часть. В НМ бактерий ЛПС прочно, но не ковалентно связан с некоторыми белками (в частности, с поринами) [2].

В НМ, по сравнению с внутренней, обнаружен небольшой набор белков, содержание которых достаточно велико. Прежде всего, это интегральные кана-лообразующие белки, которые обеспечивают поступление в клетку питательных веществ, а, возможно, и выброс продуктов жизнедеятельности, поскольку в соответствии с химической природой составляющих ее липидов НМ малопроницаема для гидрофильных веществ. Порообразующие белки, представляющие собой своеобразную транспортную систему, были открыты в 1976 году [3]. С тех пор термин «порины» стал использоваться для обозначения целого класса белков, образующих в НМ диффузионные каналы для осуществления неспецифического транспорта небольших гидрофильных молекул, участвующих в метаболизме бактерий. Впоследствии порины были обнаружены во всех исследованных видах грамотрицательных бактерий [4].

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сидорова, Ольга Вениаминовна

ВЫВОДЫ

1. Из трансформированных клеток Е. coli получен рекомбинантный OmpF по-рин наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis в мономерной форме (РБ-1). С помощью ионообменной хроматографии в присутствии детергента Zwittergent 3-14 осуществлена сборка полученного мономера в олигомерную структуру (рекомбинантный тример РБ-2).

2. Методами оптической спектроскопии охарактеризована пространственная структура полученных рекомбинантных белков. Показано, что вторичная структура поринов отличается высоко» стабильностью и способностью к ре-натурации. Для третичной структуры этих белков характерна высокая степень пластичности, и её формирование в значительной степени зависит от условий выделения и/или рефолдинга.

3. Изучены иммунобиологические свойства рекомбинантного мономера по-рина. Установлено, что РБ-1 вызывает продукцию IgG антител как в смеси с адъювантом Фрейнда, так и в растворе неионного детергента Zwittergent 3-14. Продемонстрирована эффективность использования РБ-1 в качестве диагностического антигена в ИФА тест-системе для выявления острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулёза.

4. С помощью компьютерных программ рассчитаны антигенные Т- и В- эпито-пы поринов патогенных видов иерсиний и синтезированы соответствующие этим участкам пептиды. Изучены иммунобиологические свойства полученных пептидов и показана возможность их использования как диагностических антигенов для верификации иерсиниозов.

5. С помощью сайт-направленного мутагенеза получены плазмиды, несущие мутантные ompF гены порина Y. pseudotuberculosis. Наличие делеций петель LI, L6 и L8 подтверждено секвенированием.

6. Проведена экспрессия мутантных белков с делециями петель LI, L6 h L8. Из трансформированных клеток Е. coli штамма Rosetta получены белки с данными мутациями. Подобраны условия выделения и рефолдинга мономерной и тримерной форм мутантных белков.

7. Выявлены особенности пространственной структуры мутантных поринов. Показано, что все мутантные белки имеют выраженную, но менее жесткую (по сравнению с полноструктурным рекомбинантным ОшрР порином) третичную структуру. Отсутствие наружных петель петель Ы, Ь6 и Ь8 приводит к изменению соотношения элементов регулярной вторичной структуры по-рина. Обнаружено, что только отсутствие петли Ы снижает термоустойчивость мутантного белка.

8. Фунциональная активность полученных полноструктурного и мутантных поринов изучена с помощью техники бислойных липидных мембран. Показано, что отсутствие петель 1Л, Ь6 и Ь8 не влияет на размер каналов ОшрР порина псевдотуберкулезного микроба.

9. Изучение антигенных свойств мутантных поринов показало, что наружные петли Ь1, Ь6 и Ь8 не участвуют в формировании антигенных детерминант ре-комбинантного порина. Тем не менее, участок аминокислотной последовательности белка, соответствующий петле Ь8, входит в состав конформацион-ных антигенных детерминант нативного тримера порина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сидорова, Ольга Вениаминовна, 2011 год

1. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that produces transmembrane channels // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. P. 21762178.

2. Cowan S. W., Schirmer Т., Rummel G., Steriert M., Ghosh R., Pauptit R. A., Jansonius J. N., Rosenbusch'J. P. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins // Nature. 1992. V. 358. P. 727-733.

3. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. & Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 593-656.

4. Prilipov A., Prashan S., Phale R., Widner C., Jurg P., Rosenbusch J.P. Identification and characterization of two quiescent porin genes, nmpC and ompN, in Escherichia coli BE // J. Bacteriol. 1998. V. 180. N. 13. P. 3388-3392.

5. Achouak W., Heulin T. Pages J.M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. Is. 1. P. 1-7.

6. Palva E.T. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a-major outer membrane protein of Eschericha coli II J.'Bacteriol. 1979. V. 138: N. LP. 3842.

7. Benson S.A., Occi L.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K-12 // J. Mol. Biol. 1988. V. 20. N. 4. P. 961-970.

8. O.Basle A., Qutub R., Mehrazin M., Wibbenmeyer J., Delcour A. Deletions of single extracellular loops affect pH sensitivity, but not voltage dependence, of the E. coli porin OmpF// Prot. Engineering, Design and Selection. 2004. V. 17. N. 9. P. 665-672.

9. Delcour A.H. Solute uptake through general porins // Front. Biosci. 2003. N. 8. P. 1055-1071 .

10. Фрайфелдер Д. Физическая бохимия. М.: «Мир», 1980. 582 с.

11. Minetti C.A.S.A., Tai J.Y., Blake M.S., Pullen J.K., Liang S.M., Remeta D.P. Structural and functional characterization of a recombinant PorB class 2 protein from Neisseria meningitides / // J. Biol. Chem. 1997. N 272. P. 1071010720.

12. Пермяков E.A. Метод собственной люминесценции белка.М.: «Наука»,2003.190 с.

13. Studier F. W., Moffatt B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. V. 189. N. l.P. 113-130.

14. Dubendorff J.W., Studier F.W. Creation of a T7 autogene: cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase under control of its cognate promoter // J. Mol. Biol. 1991. V. 219.1. 1. P. 61-68.

15. Betts S., King J. There's a right way and a wrong way: In vivo and in vitro folding, misfolding and subunit assembly of the P22 tailspike // Structure. 1999. N. 15. P. 131-139.

16. Blackwell J.R., Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form // FEBS Lett. 1991. N. 295. P. 10-12.

17. Singh J.P.N., Verma R. Cloning and molecular characterization of outer membrane protein A (ompA) gene from Mycobacterium bovis II Microbiol. Immunol. 2008. N. 52. P. 410-417.

18. Kumar V.S., Gautam V., Balakrishna K., Kumar S. Overexpression, purification and immunogenicity of recombinant porin proteins of Salmonella enterica serovar typhi {Salmonella typhi) // J. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 19. N. 9. P. 1034-1040

19. R. Singh, P.K. Gupta, V. Durga; P. Rao. Expression and characterization of the major outer membrane protein (OmpH) of Pasteurella multocida P52 from Escherichia coli.// Vet. Arhiv. 2009. V.79. N.6. P. 591-600

20. Hockney R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli II Trends biotechnol. 1994. N. 12. P. 456-463.

21. Parra L.P., Reyes F., Acevedo J.P., Salazar A., B.A. Andrews, J.A. Asenjo. Cloning and fusion expression of a cold-active lipase from marine Antarctic origin//Enz. and Microbial; Technol. 2008. V. 42.1. 4. P. 371-377.

22. Kapust R.B., Waugh D.S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting solubility of polypeptides to which it is fused 11 Protein Sei. 1999. N. 8. P. 1668-1674.

23. Mogensen J.E., Otzen D.E. Interactions between folding factors and bacterial outer membrane proteins // J. Mol. Microbiol. 2005. N. 57 (2). P. 326-346.

24. Cantor R.S. The influence of membrane lateral pressures on simple geometric models of protein conformatioanal equillibria // Chem. Phys. Lipids. 1999. N. 101. P. 45-56.

25. Курганов Б.И., Топчиева И.Н. Рефолдинг белков с участием искусственных шаперонов // Биохимия. 1998. Т.63. №. 4. С. 491-499.

26. Курганов Б.И. Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шапе-ронной активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков // Биохимия. 2002. Т. 67. №. 4. С. 492-507

27. Hartl F.U., Hayer-Hartl М. Molecular chaperones in the cytosole: from nascent chain to folded protein // Science. 2002. V.295. P.1852-1858.

28. Van der Berg В., Ellis R.J., Dobson C. Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation // EMBO J. 1999. V.18. P. 6927-6933.

29. Solomon В., Schwarz F. Chaperone-like effect of monoclonal antibodies on refolding of heat-denatured carboxypeptidase // J. Mol. Recognit. 1995. V. 8. N. -1-2. P. 72-76.

30. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Popov V.O. Antibodies as specific chaperones //Biochem. 2002. V. 291. N.4. P. 959-963

31. Воробьёва Е.В., Дмитренок А.С., Дмитренок П.С., Исаков В.В., Красикова И.Н., Соловьёва Т.Ф. Структура необычного липида А из морской бактерии Marinomonas communis АТСС 27118Т // Биоорган, химия. 2005. Т.31. № 4. С. 404-413.

32. Galanos C., Freudenberg I.A., Reutter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin // Proc. Natl. Sci. USA. 1979. V. 76. N.ll. P. 5939-5943.

33. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N., Takayama K., Raetz C.R.H. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. V.256. P. 19490-19497.

34. Moran A. Structure bioactivity relationships of bacterial endotoxins // J. Toxicol.-ToxinRev. 1995. V. 14. N. 1. P. 47-83.

35. Sen K., Nikaido H. In vitro trimerization of OmpF porin secreted by sphero-plasts of Escherichia coli И Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. N. 87. P. 743747.

36. Schindler M., Rosenbusch J.P. Structural transitions of porin, a transmembrane protein // FEBS Lett. 1984. V. 173. N. 1. P. 85-89.

37. Datta может убрать ссылку?

38. Sen К., Nikaido H. Trimerization of an in vitro synthesized OmpF porin of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1991. V. 266. N. 17. P. 11295-11300.

39. Bogdanov M., Dowhan W. Lipid-assisted protein folding II J. Biol. Chem. 1999. N. 274. P. 36827-36830.

40. N. Cosby, S. Lesley. Site-directed mutagenesis // Promega Notes. 1997. N. 61. P. 12

41. Edelheit O., Hanukuglu A., Hanukuglu I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies // BMC Biotechnol. 2009. V. 9. N. 61.

42. Liu H., Naismith J.H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol // BMC Biotechnol. 2008. V. 8.N. 91.

43. Kunkel T.A., Loeb L.A., Goodman M.F. On the fidelity of DNA replication. The accuracy of T4 DNA polymerases in copying phi XI74 in vitro II J. Biol. Chem. N. 259. P. 1539-45.

44. Li J., Li C., Xiao W., Yuan D., Wan G., Ma L. Site-directed mutagenesis by combination of homologous recombination and Dpnl digestion of the plasmid template in Escherichia coli II Anal. Biochem. 2008. V. 373. N. 2. P. 389-391

45. Shenoy A.R., Visweswariah S.S. Site-directed mutagenesis using a single mutagenic nucleotide and Dpnl digestion of template DNA // Anal. Biochem. 2003. V. 319. N. 2. P. 335-336.

46. Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) Catalog #200523

47. Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) Catalog #200524

48. Lewis M.K., Thompson D.V. Efficient site-directed in vitro mutagenesis using ampicillin selection //Nucl. Acids Res. 1990. N. 18. P/ 3439.

49. Bohnsack R.N. Site-directed mutegenesis using positive antibiotic selection // Meth. Mol. Biol. 1996. N. 57. P. 1-12.

50. Vavra S., Brondyk W.H: // Promega Notes. 1996. N. 58. P. 30.

51. Altered Sites II in vitro Mutagenesis Systems Technical Manual- #TM001, Promega Corp.

52. Higuchi R., Krummel B., Saiki R. A' general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study, of protein' and1 DNA intarac-tions // Nucl. Acids Res. 1988. N. 16. P. 7351

53. Shimada A. PCR-based site-directed mutagenesis // Meth. Mol. Biol. 1996. N. 57. P. 157-165.

54. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed, mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene. 1989. N. 77. P. 51-59.

55. Horton R.M., Hunt H.D., Ho S.N., Pullen J.K., Pease L.R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension // Gene. 1989. N. 77. P. 61-68.

56. Sarkar, Sommer S.S. The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis // BioTechniques. 1990. N. 8. P. 404-407.

57. Schindler H., Rosenbusch J.P. Matrix protein from Escherichia coli outer membranes forms voltage-controlled channels in lipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. N. 75. P. 3751-3755.

58. Basle A., Delcour A.H., Benz R. Bacterial and Eukaryotic Porins // Wiley-VCH. Weinheim. 2004. P. 79-98

59. Eppens E.F., Saint N., Van Gelder P., van Boxtel R., Tommassen J. . Role of the constriction loop in the gating of outer membrane porin PhoE of Escherichia coli IIFEBS Lett. 1997. N. 415. P. 317-320.

60. Phale P.S., Schirmer T., Prilipov A., Lou K.L., Hardmeyer A., Rosenbusch J.P. Voltage gating of E. coli porin channels: Role of the constriction loop // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 6741-6745.

61. Müller D.J., Engel A. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 13471351.

62. Todt J.C., McGroarty EJ. Effects of pH on bacterial porin structure. Involvement of HIS21 in a pH induced conformational change // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 189. P. 1498-1502.

63. Nestorovich E.M., Rostovtseva T.K., Bezrukov S.M. Residue ionization and ion transport through OmpF channels // Biophys. J. 2003. V. 85. P. 3718-3729.

64. Kuusi М., Nurminen М., Saxon Н., Valtoneri М., Makela Р.Н. Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonelesis of mice // Infect. Immun. 1979. V. 25. P. 857-562.

65. Neary J.M., Yi K.S., Karalus R.J., Murphy T.F. Antibodies to loop 6 of the P2 porin protein of nontypeable Haemophilus influenzae are bactericidal against multiple strains // Infect. Immun. 2001. V.69. P. 773-778.

66. Chin J.C., Dai J., Watts J.E. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa membrane proteins in experimentally infected sheep // Vet. Microbiol. 1995. V. 43. P. 21-32.

67. Vonspecht B.U., Lucking H.C., Blum В., Schmitt A., Hungerer K.D., Domdey

68. H. Safety and immunogenity of a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein I vaccine in human volunteers // Vaccine. 1996. V. 14. N. 12. P. 11111117.

69. Jansen C., Kuipers B., van der Biezen J., de Cock H., van der Ley P., Tomassen J. Immunogenicity of in vitro folded outer membrane protein PorA of Neisseria meningitidis II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. V. 27. P. 227-233.

70. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Enhancement by a serum factor of the immunoaccessibility of an Enteribacterial porin protein domain // APMIS. 1991. V. 99. P. 49-54.

71. Gupta S., Xia D., Jiang M., Lee S., Pernis. A.B. Signaling pathways mediated by the TNF- and cytokine-receptor families target a common cis-element of the IFN regulatory factor 1 promoter // J. Immunol. 1998. V. 161. N. 11. P. 5997-6004.

72. Wetzler L.M., Ho Y., Reiser H. Neisserial porins induce B lymphocytes to express costimulatory B-2 molecules and proliferate // J. Exp. Med. 1996. V. l.P. 1151-1159.

73. Massari P., Ho Y., Wetzler L.M. Neisseria meningitidis porin PorB interacts with mitochondria and protects cells from apoptosis// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97 (16). P. 9070-9075.

74. Elkins C., Barkley K.B., Carbonetti N.H., Coimbre H.J., Sparling P.F. Immunobiology of purified'recombinant outer membrane porin protein I of Neisseria gonorrhoeae II Mol. Microbiol. 1994. V. 14. P. 1059-1075.

75. Peeters C.C.A.M., Claassen I. J.T.M., Schuller M., Kersten G.F.A., van der Voort E.V.R., Poolman J.T. Immunogenicity of various presentation formsof Рог A outer membrane protein of Neisseria meningitidis in mice // Vaccine. 1999. V. 27. P. 2702-2712.

76. Wright J.C., Williams J.N., Christodoulides M., Heckeis J.E. Immunization with the recombinant PorB outer membrane protein induced a bactericidal immune response against Neisseria meningitidisS II Infect. Immun. 2002. V. 70. N. 8. P. 4028-4034.

77. Shaw J., Grund V., Durling L., Crane D., Caldwell H.D. Outer membrane protein antigen elicit a CD4+-type 2 rather than type 1 immune response that is not protective // Infect. Immun. 2002. P. V. 70. N. 3. 1097-1105.

78. Mansouri E., Blome-Eberwein S., Gabelsberger J., von Specht B.U. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003. V. 37. N. 2-3. P. 161-166.

79. Humphries H.E., Christodoulides M., Heckels J.E. // Protein Expression and Purification. 2002. N. 26. P. 243-248.

80. Qi H.L., Tai J.Y., Blake M.S. Expression of large amounts of neisserial porin proteins in Escherichia coli and refilding of the proteins into native trimers // Infect, and Immunity. 1994. V. 62. N. 6. P. 2432-2439.

81. Koebnik R., Locher K.P., Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Vicrobiol. 2000. V. 37. N. 2. P. 239-253.

82. Provencher S.W., Glocker J. Estimation of globularcal В outer membrane vesicle vaccine // Infect. Immun. 2002. V.70. N.2. P. 584-590

83. Ценева Г.Я., Солодовников Н.Ю., Воскресенская E.A. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клин, микробиол. антимикроб, хим. 2002. Т. 4. № 3, С. 248-266

84. FEMS Microbiol. Lett. 2001. V. 199. P. 1-7.

85. Tusnady G.E., Dosztanyi Z., Simon I. Transmembrane proteins in the Protein Data Bank: identification and classification. //Bioinformatics. 2004. V. 20. P. 2964-2972.

86. Гузев K.B., Исаева М.П., Новикова О.Д. и др. Молекулярная характеристика ompf-подобных поринов патогенных Yersinia II Биохимия. 2005. Т. 70. В. 10. С. 1338-1345.

87. Maksyutov A.Z., Zagrebeinaya E.S. ADEPT: a computer program for prediction of protein antigenic determinants// Comput. Appl. Biosci. 1993. V. 9. P. 291-297.

88. Neary J.M., Murphy T.F. Antibodies directed at a conserved motif in loop 6 of outer membrane protein P2 of nontypeable Haemophilus influenzaerecognize multiple strains in immunoassays // FEMS Immunol, and Med. Mi-crobiol.//2006. V. 46. P. 251-259.

89. Maksyutov AZ, Bachinskii AG, Bazhan SI, Ryzhikov EA, Maksyutov ZA. Exclusion of HIV epitopes shared with human proteins is prerequisite for designing safer AIDS vaccines // J Clin Virol. 2004 Dec;31 Suppl l:S26-38.

90. Singh H., Raghava G.P.S. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites //Bioinformatics. 2001. V. 17. P. 1236-1237.

91. Rammensee H.G., Bachmann J., Emmerich N.P.N., Bachor O.A., Stvanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. // Immunogenetics. 1999. V. 50. P. 213-219.

92. Reche P.A., Reinherz E.L. Enhancement to the RANKPEP resource for the prediction of peptide binding to MHC molecules using profiles. // J. Mol. Biol. 2003. V. 331. P. 623-641.

93. Гузев K.B., Исаева М.П., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Рассказов В.А. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia II Биохимия. 2005. Т. 70. Вып. 10. С. 1338- 1345.

94. Вольпина О.М., Титова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. С. 387-395.

95. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Sundara Baalaji N., Umesh C.K., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi. 11 J. Struct. Biol. 2004. V. 148. P. 22-33.

96. Стенкова A.M. Молекулярно-генетическая характеристика OmpF поринов бактерий рода Yersinia и разработка ПЦР тест-системы для идентификации патогенных видов: автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток. 2009. 24 с.

97. МОЕ (Molecular Operating Environment): http://www.chemcomp.com/Co^orateInformation/MOE.htm/

98. SPDBV: http://expasy.org/spdbv

99. Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007. N. 24. P. 1596-1599.

100. Winder A.F., Gent W.L.G. Correction of light-scattering errors in spec-trophotometric protein determinations // Biopolymers. 1971. V. 10. N. 7. P. 1243-1251.

101. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N. Fluorescence and the location of triptophan residues in protein molecules // Photochem. Photobiol. 1973. N. 8. P. 263-279.

102. Marquardt D.W. An algorithm for least-squares estimation og nonlinear parameters // J. Soc. Indust. Appl. Math. 1963. N. 11. P. 431-441.

103. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitution of cell membrane structure in vivo and its transformation inti an excitable system. // Nature. 1962. V. 194. P.979-980.

104. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227. N. 5259. P. 680-685.

105. Sandt C.H., Wang Y.-D., Wilson R.A., Hill C.W. Escherichia coli strains with nonimmune immunoglobulin-binding activity // Infect. Immun. V. 65. N. 11. P. 4572-4579.

106. Маниатис Т., Фрич 3, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир,. 1984. 480 е.