Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Портнягина, Ольга Юрьевна

• Портнягина, Ольга Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Портнягина, Ольга Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Порообразующие белки наружной мембраны (НМ) и их биологические свойства

1.1. Структура и функции НМ грамотрицательных бактерий 5

12. Основные белки НМ грамотрицательных бактерий 7

1.3. Структура и функциональные особенности порообразующих белков 10

1.4. Биологические свойства порообразующих белков НМ грамотрицательных бактерий 13

1.4.1. Антигенная характеристика белков НМ грамотрицательных бактерий

1.4.1.1. Антигенные детерминанты белков 14

1.4.1.2. Структура антигенных детерминант поринов 16

1.4.2. Иммуногенные свойства поринов 17

1.4.3. Порины как протективные антигены 19

1.4.4. Протективные свойства антител к поринам 21

1.4.5. Другие виды биологической активности поринов 22

1.4.6. Взаимодействие поринов с антибиотиками 25

1.5. Иммунодиагностика псевдотуберкулеза 27-29 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Материалы и методы исследования

2.1. Выделение порообразующего белка из НМ Y. pseudotuberculosis

2.1.1. Культивирование клеток Y. pseudotuberculosis

2.1.2. Первичная обработка биомассы клеток

2.1.3. Получение порообразующего белка 30

2.2. Физико-химические методы 32

2.3. Аналитические методы

2.4. Иммунологические методы

2.4.1. Получение антисывороток * 33

2.4.2. Получение сывороток крови

2.4.3. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.4.4. Реакция связывания антигена со специфической антисывороткой в ИФА 34

2.4.5. Иммуноблоттинг

2.5. Биологические методы 35

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3. Иммунобиологические свойства лорообразующего белка НМ Yersinia pseudotuberculosis Ъ

3.1. Выделение и характеристика белка-порина из НМ Y. pseudotuberculosis Ъ

3.1.1. Иерсинин - основной белок НМ Y. pseudotuberculosis 37

3.1.2. Получение иерсинина и его физико-химическая характеристика 38

3.2. Иммунохимические свойства иерсинина 43

3.2.1. Иммуногенные свойства иерсинина 44

3.2.2. Антигенная структура молекулярных форм (тримера и мономера) иерсинина 46

3.2.3. Динамика иммунного ответа на различные молекулярные формы иерсинина 51

3.2.4. Иерсинин - видо- и родоспецифический антиген рода Yersinia 55

3.2.5. Протективные свойства иерсинина 60

3.2.6. Участие иерсинина в патогенезе псевдотуберкулеза 64

4. Тест-система для диагностики псевдотуберкулеза 66

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis»

Взаимоотношения поверхностных структур бактериальной клетки с макроорганизмом являются определяющими в развитии инфекционного процесса. Организация, стабильность и барьерная функция наружной мембраны (НМ) очень важны для целостности, роста и жизнеспособности самой бактериальной клетки. НМ защищает клетку от неблагоприятных факторов и обеспечивает обмен с окружающей средой питательными веществами и продуктами метаболизма. Транспорт малых гидрофильных молекул (до 600 Да) через НМ осуществляется с помощью большого числа водонаполненных трансмембранных пор, образованных белками НМ, доминирующими в количественном отношении и названными поринами в соответствии с их специфической функцией. Выяснение механизма функционирования НМ тесно связано с изучением структуры и свойств мембранных белков. Установление биологической функции мембранных белков, как отдельных компонентов НМ бактерий, представляет не только теоретический интерес, но и связано с решением целого ряда прикладных вопросов, таких как создание эффективных вакцинных препаратов и усовершенствование диагностики заболеванийЛоверхностные белки НМ грамотрицательных бактерий играют заметную роль в патогенезе инфекции: способствуют адгезии (и, возможно, инвазии) бактерий, влияют на характер иммунного ответа. Неослабевающее внимание к ним объясняется целым рядом иммунологических особенностей данных белков. Во-первых, среди них, как правило, находятся белки, специфические для данного рода или вида микроорганизма, т.е. являющиеся иммунологическими маркерами. Во-вторых, они относятся к высоко иммуногенным компонентам микробных клеток, и определение антител к ним используется при диагностике инфекционных заболеваний. Кроме того, многие поверхностные белки оказывают ярко выраженное протективное действие. Объектом нашего исследования является псевдотуберкулезный микроб Yersinia pseudotuberculosis, вызывающий дальневосточную скарлатиноподобную лихорадку, или экстраинтестинальный иерсиниоз. В результате многолетних исследований нами были получены и обобщены многочисленные экспериментальные данные, касающиеся структуры и функции отдельных компонентов бактериальной мембраны, а также их роли в инициировании и развитии бактериальной инфекции. Детальное изучение их иммунобиологических свойств необходимо для решения проблем, связанных с профилактикой и лабораторной диагностикой этого заболевания.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Порообразующие белки наружной мембраны (НМ) и их биологические свойства

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Портнягина, Ольга Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Выделены и охарактеризованы различные молекулярные формы иерсинина. Показано, что олигомеры белка представляют собой частично развернутые молекулы с нестабильной третичной структурой. Для вторичной структуры иерсинина, которая сохраняется в различных денатурирующих условиях, характерно преобладание (3-структуры.

2. У иерсинина выявлено наличие двух типов антигенных детерминант: «конформационные», формирующиеся на уровне четвертичной структуры белка, и «составные», которые определяются аминокислотной последовательностью белка и его вторичной структурой.

3. Индукция антител к иерсинину имеет волнообразный характер, типичный для белковых антигенов, и зависит от дозы вводимого препарата и молекулярной формы белка. В процессе формирования иммунного ответа к иерсинину уменьшается количество антител, специфичных к «конформационным» детерминантам, и возрастает количество антител к «составным» детерминантам.

4. Иерсинин является протективным антигеном, участвующим в обеспечении гуморальных и клеточных факторов защиты макроорганизма.

5. Показано, что иерсинин участвует в патогенезе псевдотуберкулезной инфекции, способствуя увеличению адгезии и инвазии бактерий псевдотуберкулеза в клетки.

6. Иерсинин является родо- и видоспецифическим антигеном, дающим в иммуноферментном анализе низкий уровень перекреста с другими представителями семейства ЕМегоЬаМепасеае.

7. Обнаружено, что по своим свойствам термоденатурированный мономер иерсинина является наиболее подходящим антигеном для целей иммунодиагностики и вакцинопрофилактики.

8. На основе иммуноферментного анализа с использованием термоденатурированного мономера иерсинина в качестве антигена разработана новая видоспецифическая тест-система для определения антител в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом.

9. Разработан новый, упрощенный метод выделения термоденатурированного мономера иерсинина - диагностического антигена из псевдотуберкулезного микроба, пригодный для получения белка на технологических установках в условиях опытного производства.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Портнягина, Ольга Юрьевна, 2000 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологический исследованиях. J1. 1962.

2. Берзофски Д.А., Берковер А.Д. Взаимодействие антиген-антитело. В кн.: Иммунология; Под. ред. У. Пола. М.: Мир. 1989. С.58-59.

3. Бобровник С.А. Динамика взаимодействия моноклональных антител с иммобилизованным на платах антигеном. // Укр. Биохим. журн.1998. Т.70. N3. С.118-128.

4. Дельвиг A.A., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В. // Журн. микробиол. иэпидемиол. 1997. N6. С.92-96.

5. Дробков В.И., Дармов И.В. Иммунохимические методы диагностики псевдотуберкулеза. //Клин, лабор. диагност. 1993. N.5. С.3-7.

6. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк. 1991.

7. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная иммунология: Пер. с нем. М.: Мир. 1982. Т.2. С. 267.

8. Иванов Б.П., Петров А.Б. Повышение иммуногенности пептидных вакцин: Актуальные проблемы создания и применения иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики инфекционных болезней. Пермь, 1993. Т.1. С. 35-53.

9. Кавун Э.М., Скок М.В., Комиссаренко C.B. Иммунологическое распознавание цитохрома С: динамика антителообразования, механизмы регуляции. //Докл. АН СССР. 1988. Т.302. N.l. С.246-248.

10. Королюк А.М., Головачева С.Н. Опыт приготовления сухого эритроцитарного антигенного препарата и применение его для серологической диагностики псевдотуберкулеза. // В кн.: Тез. докл. 16-го Всесоюз. Съезда микробиол. иэпидемиол. М. 1972. Ч. 1. С. 298.

11. Маурер г. Диск-электрофорез. М.: Мир. 1971. С. 94.

12. Навашин С.М., Сазыкин Ю.О. Фундаментальные основы создания новых эффективных антибиотиков. // Антибиотики и химиотерапия. 1992. Т 37. N. 4. С. 5-11.

13. Новикова ОД, Зыкова Т.А., Ядыкина Г.М., Глазунов В.П., Соловьева ТФ., Оводов Ю.С. Изучение иерсинина основного полипептида наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. //Биол. мембраны. 1985. Т. 2. N.7. С. 714723.

14. Новикова О.Д., Набиуллин А.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Выделение и характеристика белков внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis. И Химия природ, соедин. 1983. N. 3. С. 359-364.

15. Петровская В.Г. Генетические основы вирулентности патогенных и условно патогенных бактерий. // Журн. микробиол. и эпидемиол. 1984. N. 7 С. 77-85.

16. Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Биологические свойства эндотоксинов грамотрицательных бактерий. // Успехи современной биологии. 1980. Т. 90. Вып. 1(4). С. 62-79.

17. Супотницкий М.В. Эффективное патентование средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. // Биотехнология. 1997. N. 9-10. С.56-79.

18. Филиппович Ю.Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. Практикум по общей химии. М. Просвещение. 1975. С. 85-89.

19. Achouak w., Pages J.M., De Mot R., Molle G., Heulin. A major outer membrane protein of Rachnella aquatis functions as a porin and root adhesin. // J. Bacterid. 1998. V. 180. N. 4. P. 909-913.

20. Alberti S., Marques G., Hernandezalles S., Rubires X., Tomas J.M., Vivanco F., Benedi V. Interaction between complement subcomponent Clq and the Klebsiella pneumoniae porin OmpK36. // Infection and Immunity. 1996. V. 64. N. 11. P. 57195725.

21. Aldea M., Herrero E., Estevo M.I., Guerrero R. Surface-density of major outer membrane proteins in Salmonella typhimurium in different growth conditions. // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 120. N. 8. P. 355-367.

22. Atassi M.Z. Precise determination of the entire antigenic structure of lysozime. // Immunochem. 1978. V. 15. P. 909-936.

23. Atassi M.Z. Antigenic structure of mioglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. // Immunochem. V. 12. P.423-438.

24. Barlow D.J., Edwards M.S., Thornton J.M. Continuous and discontinuous protein antigenic determinants. //Nature. 1986. V. 322. P. 757-748.

25. Benjamin D.C., Berzofsky J.A., East I.J. The antigenic structure of proteins: a reappraisal. // Annu. Rev. Immunol. 1984. V. 2. P. 67-101.

26. Benson S.A., Occi J.L.L., Sampson B.A. Mutations that alter the pore function of the OmpF porin of Escherichia coli K-12. // J. Mol. Biol. 1988. V. 203. N. 4. P. 961970.

27. Benz R.; Bauer K Permeation of hydrophilic molecules through the outer membrane of gram-negative bacteria. Review on bacterial porins. // Eur.J.Biochem. 1988. V. 176. N. 1. P. 1-19.

28. Bornet C., Davi-Regli A., Bosi C., Bollet C., Pages J.M. Imipenem resistance of Enterobacter aerogens mediated by outer membrane permeability. // J. Clin, microbiol. 2000. V. 38. N. 3. P. 1048-1052.

29. Braun V., Rehn K. Chemical characterization special distribution and function of a lipoprotein of the Escherichia coli cell wall. // EurJ.Biochem. 1969. V. 10. N. 2. P. 426-438.

30. Chakrabarti S R., Chaudhuri K.,Sen K., Pas J. Porins of Vibrio cholerae: Purification and characterization of OmpU. //J. Bacteriol. 1996. V. 178. N. 2. P. 524-530.

31. Charrel R.N., Pages J.M., Demicco P., Mallea M. Prevalense of outer membrane porin alteration in beta-lactam-antibiotic-resistant Enterobacter aerogens. II Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 1996. V. 40. N. 12. P. 2854-2858.

32. Chen R., Kramer C., Schmidmayr W., Henning U. Primary structure of major outer membrane protein I of Escherichia coli B/r. // Proc.Nat. Acad. Sei. USA. 1979. V. 76. N. 10. P. 5014-5017.

33. Chevalier J., Pages J.M., Mallea M. In vivo modification of porin activity conferring antibiotic resistance to Enterobacter aerogens. I I Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1999. V. 266. N. 1. P. 248-251.

34. Chin J.C., Dai J., Watts J.E. Antibody response against Pseudomonas aeruginosa membrane proteins in experimentally infected sheep. // Veterinary Microbiol. 1995. V. 43. N. l.P. 21-32.

35. Currie J.A., Marshall J.D., Crozier D. // J. Infect. Dis. 1966. V. 116. P. 117-122.

36. Delcour A. Function and modulation of bacterial porins: insights from electrophysiology. //FEMS Microbiol. Lett. 1997. V.151. P.115-125.

37. Donaldson D.M., Roberts R.R., Lausen H.S., Tew J.C. Interrelationship between serum beta-lysin, lysozime, and the antibody-complement system in lilling Escherichia coli. II Infect. Immun. 1974. V. 10. P. 657-666.

38. Dubois M., Gillis K.A., Hamilton J.K., Rebera P.A., Smith F. Calorimetric method for determinated of sugars and related substances. // Analyt. Chem. 1956. V. 28. N.2. P. 350-356.

39. Elkins C., Barkley K.B., Carbonetti N.H., Coimbre H. J., Sparling P.F. Immunobiology of purified recombinant outer membrane porin protein of Neisseria gonorrhoeae. // Molecular Microbiol. 1994. V. 14. N. 5. P. 1059-1075.

40. Fernandes P.V., Kim K., Cundy K.R., Huang N.N. Antibody to cell envelope proteins of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients. //Infect. Immun. 1981. V. 33. N. 2. P. 527-532.

41. Galdiero M., Delero G.C., Donnarumma G., Marcatili F., Galdiero F. Interleukin 1 and Interleukin-4 gene expression in human monocytes stimulated with Salmonella tuphimurium porins. // Immunology. 1995. V. 86. N. 4. P. 612-619.

42. Hedatrom R.C., Pavlovskis O.R., Galloway R. Antibody response of infected mice to outer membrane proteins of Pseudomonas aeruginosa II Infect. Immun. 1984. V. 41. N. l.P. 49-53.

43. Henning U., Schmidmayer W., Hindennach I. Major proteins of the outer cell envelope membrane of Escherichia coli Kl 2, multiple species of protein I. // Mol. Gen. Genet. 1977. V. 154. N. 3. P. 293-298.

44. Henriksen A.Z., Maeland J.A. A conserved domain on enterobacterial porin protein analyzed by monoclonal-antibody. // APMIS. 1991. V. 99. P. 49-57.

45. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Enhancement by a serum factor of the immunoaccessibility of an Enterobacterial porin protein domain. // APMIS. 1991. V. 99. P. 703-710.

46. Hindennach J., Henning U. The major proteins of the Escherichia coli outer cell envelope membrane. Preparative isolation of all major membrane proteins. // Eur.J.Biochem. 1975. V. 59. N. 1. P.207-213.

47. Howell S., Crine Ph. Type VI membrane proteins? // TIBS. 1996. V.21. P. 171-172.

48. Huang,HJ.; Hancock,R.E.W. The role of specific surface loop regions in determining the function of the imipenem-specific pore protein OprD of Pseudomonas aeruginosa. // J. Bacteriol. 1996 V. 178. N. 1. P. 3085-3090.

49. Joshihara E., Gotoh N., Nishino T., Nakae T. Protein D-2 porin of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane bears the protease ativity. // FEBS Lett. 1996. V. 30. N. 394(2). P. 179-182.

50. Karch H., NixdorfF K. Antibody producting cell responses to an isolated outer membrane protein and to complexes of phospholipids from Proteus mirabilis. H Infect.Immun. 1981. V. 31. N. 3. P. 862-867.

51. Knapp W., Steuer W., Untersuchugen über den nachweis komplementbilder und agglutinierendez antikorper genen Pasteurella pseudotuberculosis in sera infizieter und Immunisierter menschen und tiere. // Lschr. Immun. Exp. Ther. 1956. Bd. 113. S. 370375.

52. Kouhen R., Bernadac A., Pages J.M. Colicin N interaction with sensitive Escherichia coli cells: in situ and kinetic approaches. // Res. Microbiol. 1998. V. 149. N. 9. P. 645651.

53. Kouhen R., Pages J.M. Dynamic aspects of colicin N translocation throught the Escherichia coli outer membrane. //J.Bacteriol. 1996. V. 178. N. 17. P. 5316-5319.

54. Kuusi M., Nurminen M., Saxon H.,Valtonen M., Makela P.H. Immunization with major outer membrane proteins in experimental salmonelesis of mice. // Infect. Immun. 1979. V. 25. N. 3. P. 857-862.

55. Luckey M., Nickaido H. Specificity of diffusion channels produced by Vphage receptor protein of Esherichia coli. //Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 77. N. LP. 167-171.

56. Lugtenberg B., Van Alpen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and outer gram-negative bacteria. // Biochem. Biophys. Acta. 1983. V. 737. N. LP. 51-115.

57. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucari S., Pajes J.-M. Immunilogical analysis of porin polymorphism in Escherichia coli B and K-12. // Mol. Immunol. 1989. V. 26. N. 11. P. 1027-1036.

58. Lutwiche P., Exner M.M., Hancock R.E.W., Trust T. J. A conserved Aeromortas-porin provides protective immunity to rainbow-trout. // Infection and Immunity, 1995. V.63, N58. P.3137-3142.

59. Maier C., Bremer E., Schmid A., Benz R. Pore-forming activity of the Tsx protein from the outer membrane of Escherichia coli. II J.Biol. Chem. 1988. V. 263. N. 5. P. 2493-2499.

60. Makiikola O., Heesemann J., Toivanen A., Granfors K. High frequency of Yersinia antibodies in healthy populations in Finland and Germany. // Rheumatology Internat. 1997. V. 16. N. 6. P. 227-229.

61. Mallea M., Chevalier J., Boraet C., Eyraud A., Davi-Regli A., Bollet C., Pages J.M. Porin alteration and active efflux: two in vivo drug resistance strategies used by Enterobacteraerogens. //Microbiology. 1998. V. 144. N. 11. P. 3003-3009.

62. Manavalan P., Johnson W.C. Sensitivity of circular dichroism to protein tertiary structure class. //Nature. 1983. V. 305. N. 27. P. 3738-3744.

63. Marandi M.V., Mittal K.R. Role of outer membrane protein H (OmpH)- and OmpA specific monoclonal antibodies fromhybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella multocida. //Infection and Immunity. 1997. V. 65. N. 11. P. 4502-4508.

64. Markwell M.A.K., Haas S.M., Biebes L.L., Tolbert N.E. A modification of the procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. // Anal. Biochem. 1978. V. 87. N. 1. P. 206-210.

65. Meghji S., Henderson B., Naiz S.P., Tufano M.A. Bacterial porins stimulate bone resorption. //Infect, and Immun. 1997. V. 65. N. 4. P. 1313-1316.

66. Mizuno T., Cheu U.Y., Inoyue A. A comparative study on the genes for three porins of the Escherichia coli outer membrane. DNA sequence of the osmoregulated OmpC gene. //J.Biol. Chem. 1983. V. 258. N. 21. P. 6932-6940.

67. Muthukkumar S., Muthukkarupan V.R. Detection of porin antigen in serum for early diagnosis of mouse infections with Salmonella typhimurium. II FEMS Microbiol. Immunol. 1992. V. 89. N. 3. P. 147-153.

68. Muller D.J., Engel A. Voltaje and pH induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy. // J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P. 1347-1351.

69. Nakae T. Identification of the major outer membrane protein of Escherichia coli that produces transmembrane channels in reconstituted vesicle membranes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 71. N. 3. P. 877-884.

70. Nakamura K., Mizushima S. Effect of heating in dodecyl sulfate solution on the conformation and electrophoretic mobility of isolated major outer membrane proteins from Escherichia coli K-12. // J.Biochem. 1975. V. 80. N. 6. P. 1411-1422.

71. Palva E.T., Randall L.L. Arrangement of protein I in Escherichia coli outer membrane: cross-linking study. //J.Bacteriol. 1978. V. 133. N. 1. P. 279-286.

72. Palva E.T., Randall L.L. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a major outer membrane protein of Escherichis coli. // J.Bacteriol. 1979. V. 138. N. 1. P. 254256.

73. Provencher C.W., Glocker J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 33-37.

74. Ranling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF. // Infect, and Immun. 1995. V. 63. N. 1. P. 38-42.

75. Reeves P. The genetics of outer membrane proteins. In: Bacterial outer membranes. Biogenesis and functions. // Ed. Inouye M. New York: Wiley Interscience. 1979. P.255-291.

76. Reithmeier R.A.F., Bragg P.D. // Cross-linking of the proteins in the outer membrane of Escherichia coli. //Biochem.Biophys.Acta. 1977. V. 466. N. 2. P. 245-254.

77. Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecylsulfate binding. // J.Biol.Chem. 1974. V. 249. N. 10. P. 8019-8029.

78. Rosgue W.J., Coughlin R.T., McGroarty E.J. Lipopolysaccharide tightly boynd to porins monomers and trimers from Escherichia coli. II J.Bacteriol. 1987. V. 169. N. 9. P. 4003-4010.

79. Roy. S., Biswas T. Splenocyte proliferation by porin of Shigella dysenteriae type 1 and inhibition of bacterial invasion of Hela cell by anty-porin antibody. // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 141. N. 1. P. 25-29.

80. Rudel T., Schmid A.3 Benz R., Kolb H.A., Lang F., Meyer T.F. Modulation of Neisseria porin (PorB) by cytolitic ATP/GTR of target cells: Parallels between pathogenaccomodation and mitochondrial endosymbiosis. // Cell. 1996. V. 85. N. 3. P. 391-402.

81. Schindler M., Rosenbusch J.P. Structural transitions of porin, a transmembrane protein. //FEBS Lett. 1984. V. 173. N. 1. P. 85-89.

82. Schweizer M., Hindennach I., Garten W., Henning U. Major proteins of Escherichia coli outer cell envelop membrane. Interaction of protein II* with lipopolisaccharide. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 82. N. 1. P. 211-217.

83. Steven A.C., Ten Heggeler B., Muller R., Risten J., Rosenbusch J.P. Ultrastructure of a periodic protein layer in the outer membrane of Escherichia coli. // J.Cell.Biol. 1977. V. 72. N. 2. P. 292-301.

84. Towbin H., Staehelin T., Gordon tlectrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 76. P. 4350-4354.

85. Van Der Ley P., Strugve M., Tomassen J. Topology of outer membrane pore protein Pho E of Escherichia coli. Identification of cell surface-expoced amino-acids with the aid of monoclonal antibodies. // J.Biol. Chem. 1986. V. 261. N. 26. P. 1222212225.

86. Vangelder P., Decock H., Tommassen J. Detergent-induced folding of the outermembrane protein PhoE, a pore protein induced by phosphate limitation. // Europ. Biochem. 1994. V. 15. N. 226(3). P. 783-787.

87. Vonspecht B.U., Lucking H.C., Blum B., Schmitt A., Hungerer K.D., Domdey H. Safety and immunogenity of a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein I vaccine in human volunteers. // Vaccine. 1996. V. 14. N. 12. P. 1111-1117.

88. Wetzler L.W., Ho Y., Reiser H. // Neisserial porins induce B lymphocytes to express costimulatory B-2 molecules and proliferate. // J. Exp. Med. 1996. V. 1. N. 183(3). P. 1151-1159.

89. Схема 1. Выделение иерсинина новым способом.

90. Навеска высушенной ацетоном микробной массы 1. Тритон Х-100 (2% раствор, 1,5 ч, 4°С) 2. Центрифугирование, 5 ООО об./мин, 15 мин. 3. Отмывка от детергента, 15 ООО об./мин 15 мин (двукратно).

91. Супернатант белки цитоплазматической мембраны1. Осадок1. Ферментолиз.

92. Обработка осадка ДНК азой (5 мг ДНК -азы, 15 ч, 37°С) 2. Центрифугирование, 15 ООО об./мин, 60 мин.

93. Супернатант нуклеиновые кислоты1. Осадок

94. Супернатант -белки, растворимые в саркозилате натрия1. Осадок

95. Получение комплекса ПГ-белок 1. Обработка осадка ДСН (2% раствор, 45 мин, 50® С) 2. Центрифугирование, 15 000 об./мин, 60 мин. 3. Отмывка от детергента, 15 000 об./мин, 60 мин (двукратно).

96. Супернатант белки, растворимые в ДСН и НК1. Осадок ПГ -белок

97. Получение термоденатурированного мономера иерсинина. Диссоциация комплекса ПГ-белок (2% раствор ДСН ,7 мин, 100° С) 2. Центрифугирование, 15 000 об./мин, 60 мин. 3. Отмывка от детергента, 15 000 об./мин, 60 мин (двукратно).

98. Супернатант фракция белка - порина И-1У1. Диализ, лиофилизация.

99. Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования1. Российской Федерации

100. Определение антител в сыворотках людей методом иммуноферментного анализа для диагностики псевдотуберкулеза

101. Методические указания МУ 3.1.1.001 -98

102. Утверждены и введены в действие: решением комиссии по санитарно-эпидемическому нормированию при Центре Госсанэпиднадзора в Приморском крае от 28.06.98 г. Постановлением Главного государственного санитарного врача по Приморскому краю от 24.10.98 г.

103. Вводится впервые на территории Приморского края.

104. Предназначены для сотрудников диагностических, иммунологических и биохимических лабораторий, врачей- инфекционистов общей поликлинической и лечебной сети.1. Перепечатка разрешается

105. Для лабораторной диагностики псевдотуберкулеза используют бактериологические и серологические методы. Бактериологические методы, к сожалению, малоэффективны, так как обеспечивают лишь позднее выявление заболевания.

106. Обнаружено, что иерсинин является видоспецифическим антигеном рода Yersinia, дающим в ИФА низкий уровень перекреста с другими представителями энтеробактерий.

107. В зависимости от условий выделения иерсинин может быть получен в двух молекулярных формах: термолабильной тримерной и термостабильной мономерной с кажущимися молекулярными массами 110 и 40 кДа соответственно.

108. Инструкция по применению метода ИФА для серодиагностики псевдотуберкулеза1. Принцип метода

109. В основе предлагаемой тест системы для диагностики псевдотуберкулеза лежит метод иммуноферментного анализа (непрямой, неконкурентный анализ антител).

110. Список приборов и реактивов для проведения ИФА1. рН-метр (рН-150)

111. Комплект пипеток автоматических: 20-200 мкл, 200-1000 мкл, 5 мкл, 303000 мкл (многоканальная)

112. Комплект пипеток лабораторных

113. Сканирующий спектрофотометр5. Магнитная мешалка6. Шкаф термостатируемый

114. Микротитровальные планшеты из полистирола1. Список реактивов

115. Реактивы отечественные, используемые без предварительной очистки:1. Кислота серная , хч2. Натрия гидроокись , хч3. Натрий хлористый, чда

116. Натрий фосфорнокислый однозамещенный, 2 водный, чда

117. Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 12 водный, чда6. Натрий углекислый, хч

118. Натрий углекислый кислый, хч8. Кислота лимонная

119. Перекись водорода, 30% , хч10. О-фенилендиамин, ч1. Реактивы импортные:

120. Твин-20, (Merck, Германия)

121. Приготовление растворов для проведения анализа

122. Раствор №1. Буфер карбонат-бикарбонатный (0,01 М, рН 9,25) для нанесения антигена на планшет (твердый носитель): 1,59 г Na2CC>3 и 2,93 г NaHC03 в 1 л Н20. Раствор хранят не более месяца при 4° С.

123. Раствор №2. Буфер фосфатно-солевой (0,02 М, рН 7,2): 5,68 г Na2HP04 , 6,24 г NaH2P04 , 11,2 г NaCl в 2 л Н20.

124. Раствор №2"а" для разведения исследуемой сыворотки и отмывки планшетов: раствор №2 (1000 мл) + 0,5 мл Твин-20 (или Твин-80). Раствор не хранят.

125. Раствор №2"б" для разведения конъюгата: раствор №2 (100 мл) + 0,25 мл Твин-20 (или Твин-80). Раствор не хранят.

126. Раствор №3. Буфер цитратно-фосфатный (рН 5,0): 49,3 мл 0,2 М двузамещенного фосфорнокислого натрия (1,42 г на 50 мл Н20) и 50,7 мл 0,1 М лимонной кислоты (2,1 г на 100 мл Н20). Раствор хранят при 4°С не более месяца.

127. Раствор №4. Субстрат-индикаторный раствор: 10 мл раствора №3 + 4 мг О-фенилендиамина, готовят не ранее, чем за 10 мин до использования. В полученный раствор добавляют 0,005 мл 30% Н2Ог непосредственно перед внесением в лунки планшета. Раствор не хранят.

128. Раствор №5. Раствор серной кислоты (0,5 М): 1 мл концентрированной Н2804 растворяют в 15 мл НгО. Раствор используют для остановки ферментативной реакции. Раствор хранят при комнатной температуре1. Получение сывороток крови

129. Методика выявления специфических антител в сыворотках крови больных людей

130. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена в концентрации 2,5 мкг в мл. Адсорбцию антигена проводят в течение 18-20 ч при 4° С (или 2 ч при 37° С).

131. Раствор из лунок удаляют сильным встряхиванием и промывают трехкратно дистиллированной водой и раствором №2"а", попеременно. На каждом этапе планшет выдерживают по 3 мин. После отмывки планшеты высушивают на воздухе.

132. Во все лунки планшета вносят по 250 мкл раствора №2"б" (дляпредотвращения неспецифического взаимодействия меченных антител сантигеном). Инкубируют планшеты 18-20 ч при4°С.

133. Раствор из лунок удаляют и промывают, как указано в п. 2.

134. Раствор из лунок удаляют и промывают, как указано в п. 2.

135. В каждую лунку планшета вносят по 70 мкл субстрат-индикаторного раствора №4, выдерживают 30 мин в темноте при комнатной температуре.

136. Реакцию останавливают внесением во все лунки планшета 30 мкл раствора №5.

137. В лунках планшета, где прошла реакция, появляется окрашивание раствора от желтого до оранжево-коричневого. В лунках, где исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, субстрат-индикаторный95раствор бесцветен или слабоокрашен.

138. Результаты реакции учитывают, сравнивая окраску в опытных и контрольных лунках или определяя интенсивность окрашивания с помощью спектрофотометра при длине волны 492-495 нм.

139. Результаты реакции выражают как отношение ОП исследуемой пробы к ОП контроля (P/N). Положительной считают пробу с Р / N > 2,1.

140. При постановке ИФА необходимы следующие контроли на планшете:

141. Контроль неспецифического связываниялунки Е-1, F-1,G-1, Н-1). В данных лунках значение ОП окрашенного раствора не должно превышать значения 0,2.жтй£жш Фщшмр.ш1. ИЛ ИЗОБРЕТЕНИЕ2153172

142. Российским агентством по патентам и: товарным знакам на основании Патентного: закона Российской Федерации, введенного в действие 14 октября 1992 года, выдан настоящий патент на изобретение

143. СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА1. Патентообладагель(ли):см. на оборотепо заявке № 98122085, дата поступления: 02.12.1998 /л Приоритет от 02.12.1998 Автор(ы) изобретения:см. на оиороше

144. Патент действует на всей территории Российской Федерации в течение 20 лет с 2 декабря 1998 г. при условии своевременной уплаты пошлины за поддержание патента в силе

145. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерацииг. Москва, 20 июля 2000 г.ШШ