Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Чистюлин, Дмитрий Константинович

• Чистюлин, Дмитрий Константинович
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Чистюлин, Дмитрий Константинович

бактерий

2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов

2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий

2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий

2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков

2.3.2. Пространственная организация молекул поринов

2.3.3. Построение теоретических моделей пространственной структуры 0-баррельных белков

2.4. Способы получения изолированных поринов

2.5. Конформационные переходы изолированных поринов

2.6. Антигенная структура порообразующих белков наружной мембраны

грам орицате л ьных бактерий

2.6.1. Исследование антигенной структуры поринов иммунохимическими методами

2.6.2. Предсказание локализации антигенных детерминант

2.7. Регуляция экспрессии OmpF и ОшрС поринов грамотрицательных

Бактерий

2.8. Характеристика и свойства антигенов Yersinia ruckeri

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Получение неспецифических (OmpF- и ОшрС- подобных) поринов наружной

мембраны Y. ruckeri

3.1.1. Первичная структура ОшрС- и OmpF поринов из Y. ruckeri

3.1.2. Анализ состава фракций пориновых белков наружной мембраны

Y. ruckeri, извлекаемых детергентами различной природы

3.1.2.1 .Экстракция поринов неионным детергентом

октилполиоксиэтиленом

3.1.2.2.Экстракция ионным детергентом SDS и очистка фракции

пориновых белков

3.1.3. Изучение влияния условий культивирования (осмолярности и температуры) на экспрессию OmpF и ОшрС-подобных поринов и их идентификация

3.1.4. Выделение индивидуальных OmpF и ОтрС поринов 7. ruckeri

3.1.5. Технологичный способ получения и очистки OmpF порина 7. ruckeri

3.2. Исследование функциональных свойств OmpF и ОтрС поринов

3.2.1. Характеристика проводимости одиночных каналов OmpF и ОтрС поринов из НМ 7. ruckeri

3.2.2. Порообразующие свойства OmpF порина из НМ Y. ruckeri

3.3. Молекулярная структура и пространственная организация OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri

3.3.1. Характеристика топологических моделей OmpF и ОтрС поринов 7.

ruckeri. Анализ их первичной и антигенной структуры

3.3.2. Сравнительный анализ пространственной структуры OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri

3.3.3. 3D структура мономеров и тримеров OmpF и ОтрС поринов Y.

ruckeri

3.4. Изменения в пространственной структуре OmpF и ОтрС поринов

Y. ruckeri под действием температуры

3.4.1. Сравнительный анализ изменений в молекулярной структуре и микроокружении ароматических флуорофоров в молекулах OmpF и ОтрС поринов в процессе термоденатурации

3.4.2. Мониторинг изменений в пространственной структуре OmpF порина под действием температуры

3.5. Иммунологическая и иммунохимическая характеристика

OmpF порина Y. ruckeri

3.5.1. Иммуногенные и иммунохимические свойства OmpF порина 7.

ruckeri

3.5.2. Определение элементов антигенной структуры OmpF порина 7.

ruckeri

3.5.2.1.Характеристика рекомбинантных мутантных белков OmpF порина из

НМ 7. pseudotuberculosis

3.5.2.2.Элементы антигенной структуры OmpF порина 7. ruckeri

3.6. Взаимодействие OmpF порина 7. ruckeri с клетками эукариот

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1. Материалы

4.2. Приборы и оборудование

4.3. Общие и аналитические методы исследования физико-химических характеристик поринов

4.4. ПЦР амплификация и секвенирование отрС и отрБ генов

4.5. Получение изолированных поринов иерсиний

4.6. Спектроскопические методы исследования пространственной структуры поринов

4.7. Изучение порообразующей активности белка с помощью

техники БЛМ

4.8. Построение теоретических моделей поринов

4.9. Иммунохимические методы

4.10. Исследование взаимодействия поринов с клетками эукариот

5. ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и характеристика порообразующих белков из Yersinia ruckeri»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Yersinia ruckeri - грамотрицательная бактерия, вызывающая иерсиниоз у рыб, известный также как «энтерит, сопровождающийся покраснением рта». Ежегодно этот микроорганизм является причиной больших экономических потерь в индустрии аквакультур. Однако, несмотря на значимость проблемы, пока мало известно как о механизмах патогенеза этого заболевания, так и о функционировании данного микроорганизма в целом, что препятствует разработке мер для эффективной борьбы с ним.

Известно, что порообразующие белки наружной мембраны (порины) играют важную роль в таких аспектах функционирования бактериальных клеток как адаптация к условиям окружающей среды и межклеточные взаимодействия. Бактериальные порины - интегральные Р-структурированные белки, предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул через наружную мембрану (НМ). Особенности структуры и поверхностная локализация в клетке обуславливают наличие у поринов и других функций, отличных от транспортной. Экспонированные на поверхности бактериальной клетки участки полипептидной цепи поринов, так называемые петли, формируют потенциальные сайты взаимодействия с клетками организма-хозяина, в том числе с клетками иммунной системы. Показано, что порины являются высокоиммуногенными компонентами НМ грамотрицательных бактерий. Антитела к ним обнаруживаются в сыворотке крови как после вакцинации, так и при естественном развитии инфекции. В связи с этим, выявление структурных особенностей поверхностных участков молекул поринов и установление их роли в формировании антигенных эпитопов, имеет важное значение для конструирования диагностических и вакцинных препаратов.

Представляет интерес также способность поринов взаимодействовать с клетками эукариот. Так, известно, что порины проявляют свойства индукторов и ингибиторов апоптоза, способны связываться с То11-подобными рецепторами, зачастую обладают высокой цитотоксичностью и способностью влиять на клеточный цикл. Однако биологические свойства порообразующих белков НМ бактерий до сих пор остаются мало изученными.

Кроме вышеназванных задач, имеющих прикладное значение, структурно-функциональные исследования поринов НМ бактерий важны для химии мембранных р-структурированных белков в целом, для выяснения особенностей их пространственной организации, для установления участков структуры, ключевых для поддержания стабильности молекулы этих белков, а также особенностей их сборки и денатурации под действием температуры и химических агентов.

Цели и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции неспецифических поринов бактерий рода Yersinia, проводимого в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ

ДВО РАН им. Г.Б. Елякова. Она посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры и функциональной активности ОшрС и OmpF поринов Y. ruckeri, исследованию процесса денатурации OmpF порина под действием температуры и изучению его иммунобиологических свойств.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• выделить и идентифицировать неспецифические OmpF и ОтрС порины НМ Yersinia ruckeri-,

• изучить влияние условий культивирования на экспрессию этих белков;

• сравнить физико-химические свойства, особенности пространственной организации молекул и функциональную активность OmpF и ОтрС поринов;

• исследовать процесс термоденатурации OmpF порина методами оптической спектроскопии, микрокалориметрии и компьютерного моделирования;

• изучить иммуногенные свойства OmpF порина, выявить общие с поринами иерсиний элементы антигенной структуры;

• исследовать характер взаимодействия OmpF белка с клетками эукариот.

Научная новизна исследования. Впервые выделены индивидуальные OmpF и ОтрС

порины из наружной мембраны Y. ruckeri и проведена сравнительная характеристика их пространственной структуры и функциональной активности. Впервые показано, что термоденатурация OmpF порина проходит в несколько стадий. Впервые показана зависимость экспрессии исследуемых поринов и транскрипции соответствующих генов от условий окружающей среды. Впервые охарактеризованы иммунохимические свойства OmpF порина Y. rucke, выявлены общие антигенные эпитопы OmpF поринов иерсиний. Впервые исследовано влияние поринов Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток человека и нормальных клеток тканей рыб.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данные о высокой иммуногенности OmpF и ОтрС поринов Y. ruckeri при относительно низкой их цитотоксичности, а также обнаружение в структуре белков общих с другими поринами иммунодоминантных эпитопов позволяют рассматривать исследуемые порины как перспективные протективные антигены для борьбы с инфекцией вызываемой Y. ruckeri.

Разработан технологичный способ получения очищенной фракции поринов, исключающий стадию гель-хроматографии. Это стало возможным при использовании ДНКазы из гепатопанкреаса крабов, содержащей примеси протеаз.

Основные положения, выносимые на защиту: • OmpF и ОтрС порины Y. ruckeri подобно неспецифическим поринам наружной

мембраны иерсиний имеют различные физико-химические характеристики,

отличительные особенности первичной и пространственной структуры и образуют в искусственном бислое разные по размеру каналы.

• Транскрипция соответствующих генов и экспрессия исследуемых поринов зависят от условий культивирования бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в среду NaCl и увеличение температуры приводит к появлению заметного количества ОтрС порина.

• Структура OmpF порина обладает аномально высокой для неспецифических поринов термостабильностью и способностью восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя даже после инкубации при 85 °С, температуре необратимого конформационного перехода.

• Процесс термоденатурации тримера OmpF порина имеет несколько стадий, сопровождающихся на начальных этапах обратимыми изменениями в структуре наружных петель, а в дальнейшем перестройками на уровне третичной и четвертичной структуры белка, приводящими к образованию термостабильных мономеров порина. Различия в спектрах триптофановой флуоресценции исследуемых поринов обусловлены особенностями положений Тгр212 в OmpF и Тгр184 в ОтрС порине.

• В петлях L1 и L4 молекулы OmpF порина локализованы иммунодоминантные В-эпитопы, перекрёстно реагирующие с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

• OmpF порин Y. ruckeri имеет низкую цитотоксичность и оказывает влияние на клеточный цикл как злокачественных, так и нормальных клеток. В низких концентрациях белок ингибируют S-стадию клеточного цикла для обоих типов клеток, а высокие концентрации вызывают апоптоз злокачественных клеток.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Структура и свойства порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и методы их исследования

2.1. Строение наружной мембраны грамотрицательных бактерий

Основным структурным компонентом живой клетки являются биологические мембраны, которые поддерживают её структурную целостность и регулируют обменные процессы (поступление питательных веществ и выброс метаболитов). Кроме того, они служат для передачи сигналов между различными функционально важными участками клеточной поверхности.

Цитоплазма клеток грамотрицательных бактерий защищена от окружающей среды 2-мя мембранами - внутренней (цитоплазматической) и наружной. Средний слой, неплотно прилегающий к внутренней мембране, представляет собой специфический биополимер, называемый пептидогликаном (ПГ), который обеспечивает жесткость клеточной стенки микроорганизма [1] (рис. 1). Он является гликопептидом, состоящим из остатков 14-ацетилглюкозамина и И-ацетилмурамовой кислоты, и может быть разрушен под действием лизоцима. Помимо этого, мембраны связаны между собой видимыми в электронный микроскоп зонами адгезии, или зонами контакта (всего в клетке существует 200-400 таких зон) [2].

Столь сложное строение клеточной стенки вызвано условиями обитания грамотрицательных бактерий. Чаще всего это гипотоническое окружение, способное вызвать лизис цитоплазматической мембраны. Например, бактерии сем. ЕтегоЬаМепасеае, обитающие в кишечнике человека, должны обладать каким-либо механизмом защиты цитоплазматической мембраны от детергентного действия желчных солей, жирных кислот и глицеридов. Кроме того, кишечная полость богата протеолитическими и липолитическими ферментами, а также гликозидами [1].

В состав НМ грамотрицательных бактерий входят белки, фосфолипиды и липополисахарид (ЛПС). Содержание этих основных элементов мембраны может весьма различаться, что зависит от вида исследуемых микроорганизмов, условий их культивирования и методов количественной оценки данных компонентов [3, 4, 5]. Фосфолипиды представлены фосфатидилэтаноламином, фосфатидилглицерином и дифосфатидилглицерином, или кардиолипином. ЛПС является специфическим компонентом НМ бактерий, занимая около 45% ее поверхности[6]. По своей химической природе ЛПС представляет собой амфифильную молекулу, содержащую гидрофобный липидный компонент и гидрофильную полисахаридную часть. В НМ бактерий ЛПС прочно, но не ковалентно связан с некоторыми белками (в частности, с поринами) [7].

Рис. 1 - Клеточная стенка грамотрицательных бактерий. 1 — внутренняя, или цитоплазматическая мембрана; 2 — пептидогликановый слой; 3 — периплазматическое пространство; 4 — молекулы белков; 5 — фосфолипид; 6- липополисахарид; 7 — интегральный белок, 8 - наружная мембрана.

В НМ было обнаружено несколько основных типов белков, общее содержание которых достаточно велико. Прежде всего, это интегральные каналообразующие белки, которые обеспечивают поступление в клетку питательных веществ, а, возможно, и выброс продуктов жизнедеятельности, поскольку НМ, в соответствии с химической природой составляющих ее липидов, малопроницаема для гидрофильных веществ. Порообразующие белки, представляют собой своеобразную транспортную систему бактериальной клетки. Они были открыты в 1976 году [8], и с тех пор термин «порины» стал использоваться для обозначения целого класса белков, образующих в НМ диффузионные каналы для осуществления транспорта небольших гидрофильных молекул, участвующих в метаболизме бактерий. Впоследствии порины были обнаружены во всех исследованных видах грамотрицательных бактерий и даже в отдельной группе грамположительных, у которых есть богатая липидами клеточная стенка, подобная бислою. К этой группе относятся коринебактерии, микобактерии и нокардии (Corinebacterium, Micobacterium, Nocardia).

2.2. Общая характеристика порообразующих белков грамотрицательных

бактерий

2.2.1. Физико-химические свойства неспецифических поринов

Классической моделью изучения порообразующих белков является Е. coli. Показано, что в клетках этой грамотрицательной бактерии синтезируются несколько типов поринов, три из которых (OmpF, OmpC, и PhoE) являются основными в количественном отношении [9]. Эти белки относятся к неспецифическим поринам, но проявляют некоторую селективность в отношении диффундирующих веществ: катионов (OmpC и OmpF) и анионов (PhoE). Четвёртый

порин, ЬашВ (мальтопорин), значительно отличается от трёх предыдущих, т.к. является специфическим порином, который служит для переноса мальтозы [10].

Дальнейшие исследования более чем сорока различных поринов позволили выявить их общие структурные и функциональные свойства. Молекулярная масса этих белков варьирует от 28 ООО до 48 ООО Да. Порины являются интегральными р-структурированными белками: содержание этого типа структуры белка достигает 60%. В нативной мембране они присутствуют, как правило, в виде тримеров.

По своим физико-химическим свойствам порины представляют собой слабокислые белки, имеющие необычайно большое для интегральных белков количество полярных аминокислотных (АК) остатков. Водородные и ионные связи, вместе с гидрофобными взаимодействиями, играют существенную роль в стабилизации пространственной структуры поринов как в НМ, так и в изолированном состоянии. Именно этим обусловлена необычайная устойчивость этих белков к протеазам, повышенной температуре и другим денатурирующим факторам [11].

2.2.2. Функциональная активность порообразующих белков наружной мембраны

грамотрицательных бактерий

Наиболее полно к настоящему времени охарактеризованы свойства каналов, образуемых поринами из Е. соН. Эти каналы различаются как по размерам (размеры ОгпрС, ОшрР и РЬоЕ белков составляют 1.3; 1.4 и 1.2 нм соответственно), так и по селективности. Порины в мембране прочно связаны с липополисахаридом (ЛПС), и многие исследователи считают, что это взаимодействие очень важно для проявления функциональной активности белков.

Пориновые каналы характеризуются способностью существовать в 2-х функционально различных состояниях: ион-проводящем открытом и ион-непроводящем закрытом состояниях. Неспецифические порины, такие как ОшрР, способны к спонтанным флуктуациям между этими состояниями, хотя при нейтральных значениях рН и низких значениях мембранных потенциалов открытое состояние является доминирующим [12]. Функциональная значимость этих флуктуаций остаётся до конца невыясненной. Помимо рН среды и потенциала на мембране на «поведение» пориновых каналов существенное влияние оказывает изменение ионного состава среды [13].

Для исследования функциональных свойств поринов наиболее часто используется электрофизиологический метод. Плоские липидные бислои (известные также как черные, или бислойные липидные мембраны, сокращенно БЛМ) с реконструированными в них поринами были первым электрофизиологическим инструментом, примененным для этих целей. Они продолжают широко использоваться как для первоначального обнаружения порообразующей

активности вновь тестируемых пориноподобных белков, так и для характеристики функциональных свойств исследуемых поринов. С помощью техники БЛМ Benz с соавторами [14] исследовали 12 различных поринов из грамотрицательных бактерий E.coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa. Большинство поринов образовывало большие водонаполненные ион-проводящие каналы с проводимостью одиночной поры между 1.5 и 6 нСм в IM KCl. Ионы, используемые для тестирования структуры канала, при движении через пору имели такую же подвижность, что и при свободном движении в растворе. На основании этого проводимость одиночной поры использовали для определения эффективного размера канала исследуемых поринов, разброс полученных значений составил 1.0 - 2.0 нм.

На основании результатов, полученных в ранних работах по изучению функциональных свойств поринов с помощью техники БЛМ [15], было сделано два очень важных вывода. Во-первых, по кривой записи тока невозможно определить изменения в проводимости искусственной мембраны, связанные с закрытием поры, и, во-вторых, зависимость проводимости БЛМ от приложенного напряжения в достаточно широком диапазоне является омической, то есть линейной. Однако при напряжении выше 150 мВ, как показали Schindler и Rosenbusch [16], линейная зависимость тока от потенциала, приложенного к БЛМ, нарушается.

Детальное описание кинетических свойств канала обычно проводят с помощью так называемой техники patch-clamp [17]. Этот метод позволяет исследовать одиночную пору при более низком уровне шума и с большим временным разрешением, нежели техника БЛМ. Стеклянная пипетка диаметром 1-2 мкм помещается на поверхность клетки или липидной везикулы. Участок мембраны («patch» в дословном переводе означает «многослойный(ая) пакет/структура»), содержащий один или несколько каналов, входит внутрь пипетки и при подключении (clamp) мембранного потенциала поток ионов фиксируется с течением времени.

Эта техника с успехом используется в экспериментах на живых клетках и сферопластах [18, 19], а также на липосомах, содержащих фрагменты цитоплазматической и НМ бактерий [20, 21]. В patch-clamp экспериментах порины «ведут себя» иначе, нежели в БЛМ. Так, величина проводимости одиночной поры значительно меньше (< 100 пСм в 100-150 мМ растворе KCl), а каналы остаются открытыми в течение значительно более короткого промежутка времени (20-30 с). Закрытие пор наблюдается при отрицательном потенциале, значительно меньшем по величине, чем в искусственном бислое

2.3. Пространственная структура поринов грамотрицательных бактерий

2.3.1. Методы изучения пространственной структуры белков

Хромофоры белковых молекул (то есть химические группы в молекуле белка, ответственные за поглощение света на определенных длинах волн) можно разделить на три

класса: пептидные группы, боковые группы аминокислотных остатков и простетические группы. Спектроскопические методы исследования вторичной структуры белка основаны на изучении спектров именно пептидных хромофоров, поскольку конформация пептидных групп и определяет тот или иной тип вторичной структуры белка: а-спираль, р -структуру и др. Изучение поглощения света пептидными группами белка обычно проводится в ультрафиолетовом и инфракрасном диапазонах. Как показывают эксперименты, простая адсорбционная спектроскопия белков в неполяризованном ультрафиолетовом свете мало пригодна для анализа вторичной структуры белка. Более ценную информацию можно извлечь из спектров кругового дихроизма белка. Третичная же структура обычно исследуется методом собственной белковой флоуресценции [22].

Спектры кругового дихроизма белков. Белки, как практически все биологические молекулы, вследствие своей пространственной асимметрии обладают оптической активностью. С помощью КД спектроскопии можно получить информацию о целом ряде особенностей пространственной структуры белковой молекулы, и в комбинации с другими методами КД играет значительную роль при изучении процессов сборки-разворачивания белков. Этим вопросам посвящено достаточно много обзоров [23 - 25]

В случае белков главной целью измерения спектров КД является определение содержания в них вторичных структур разных типов. Если доля ароматических аминокислот в белке не очень велика, его оптическая активность в области от 180 до 240 нм определяется главным образом полипептидным остовом. Многочисленные эксперименты показали, что алифатические боковые группы аминокислотных остатков белка также не дают заметного вклада в спектр КД в этой области. Следовательно, в первом приближении белковую молекулу можно рассматривать просто как комбинацию участков полипептидного остова, находящихся в конформациях а-спирали, р-листов, изгибов и неупорядоченной структуры.

Спектры различных типов вторичной структуры белка можно оценить по результатам измерения КД гомополипептидов известной конформации (например, поли-Ь-лизина), после чего определить вклад каждой из структур в спектр КД исследуемого белка. Однако такой подход имеет ряд больших недостатков. Во-первых, участки упорядоченной вторичной структуры модельных гомополипептидов имеют значительно большую длину, чем длина типичных участков в глобулярных белках. Во-вторых, их конформация может сильно отличаться от конформации, наблюдаемой у элементов вторичной структуры реальных белков. Кроме этого, среди гомополипептидов нельзя найти "стандартов" для р-изгибов. И, наконец, хотя вклад в КД от взаимодействий между хромофорами уменьшается как квадрат расстояния между ними, должен существовать определенный вклад от взаимодействия между участками с различной вторичной структурой. Эти взаимодействия нельзя адекватно смоделировать,

рассматривая протяженные гомополимеры, поэтому на практике в качестве базисных берут спектры КД белков, структура которых известна из данных рентгеноструктурного анализа [2629]. Наиболее часто для расчета элементов вторичной структуры белков исследователи используют метод Провенчера [30] и программный пакет Сс1Рго [31].

Собственная белковая флуоресценция. Флоуресцентная спектроскопия является одним из самых высокочувствительных методов, позволяющих детектировать очень низкие концентрации веществ и отличать одно вещество от другого. Основные преимущества флуоресцентных методов, например, при исследовании разворачивания белков заключаются в чувствительности сигнала к микроокружению флуорофора, возможность использования различных характеристик флуоресцентных сигналов, возможность работать широком диапазоне концентраций, в котором отношение сигнал : шум является достаточно высоким, в быстром ответе и возможности приспособления этого метода к различным типам проб и кювет [32]. В связи с этим, флоуресцентная спектроскопия является чрезвычайно информативным методом, позволяющим получать данные о структурных свойствах, конформационной подвижности, положениях флоуресцирующих остатков в анализируемой биомолекуле, а также другие сведения о межмолекулярных взаимодействиях.

В белках флоуресцирующими аминокислотами являются триптофан, тирозин и фенилаланин. При поглощении фотона хромофорной молекулой в ней происходит перераспределение электронной плотности и возрастает дипольный момент. В возбуждённом состоянии молекула может взаимодействовать с растворителем или другими близко расположенными в пространстве АК остатками. Эти взаимодействия специфически изменяют спектр излучаемой энергии, фиксируемый спектрофлуориметром. Полученные таким образом в ходе экспериментов спектры несут информацию о положениях остатков флоурофоров по отношению к другим группам боковых цепей аминокислот. Используя эти спектры можно судить об изменениях третичной и четвертичной структуры белка в процессах его взаимодействия с другими молекулами или под действием денатурирующих агентов, включая температуру [33].

При исследовании денатурации белков наиболее широко используемым флуорофором являются остатки триптофана. Несмотря на то, что индольная группа триптофана характеризуется относительно невысокими значениями коэффициента поглощения и квантового выхода флуоресценции, тем не менее, ее флуоресцентные свойства достаточно чувствительны к микроокружению. И эти преимущества с избытком перекрывают недостатки этого флуорофора при изучении разворачивания белков. В случае нативных белков квантовый выход флуоресценции индивидуальных остатков триптофана в белке, содержащем один остаток триптофана на одну молекулу, колеблется в широком диапазоне 0.01 - 0.40 [34]. Максимум

эмиссии таких белков колеблется от 308 им в случае азурина до приблизительно 350 нм в случае полностью доступного растворителю остатка триптофана [34 - 36]. Флуоресцентные свойства развернутых белков различаются в значительно меньшей степени. Все авторы, которые определяли его получали величину около 0.1, максимум эмиссии триптофановых остатков развернутых белков близок к 350 нм. Таким образом, при разворачивании эмиссия белка обычно сдвигается в сторону больших значений длин волн, а квантовый выход может как снижаться, так и повышаться.

Широкий диапазон квантовых выходов и положений максимума эмиссии триптофановых остатков в белках обусловлен различными типами взаимодействий возбужденных индольных групп с микроокружением в разных белках. Значительное внимание уделялось разработке подходов к интерпретации флуоресцентных характеристик триптофановых остатков в белках, а также связи получаемых данных со структурными особенностями [37 - 40]. Наиболее широко распространенной точкой зрения является предположение о том, что эмиссия триптофановых остатков сдвинута сильнее в область более коротких волн, если индольную группу окружают другие неполярные боковые цепи аминокислот, а батохромный сдвиг объясняется взаимодействием возбужденного состояния с полярными молекулами растворителя или другими полярными функциональными группами. Крайне низкий квантовый выход триптофановых остатков в нативном белке указывает на наличие каких-либо внутримолекулярных реакций тушения. В работах ряда авторов [41 - 43] было показано, что пептидная связь и боковые цепи ряда аминокислот выступают в роли тушителей при непосредственном контакте. Что касается положения максимума флуоресценции, предполагается, что оно может быть связано со степенью электростатической стабилизации и дестабилизации возбужденной индольной группы (в возбужденном состоянии разделение зарядов выше, чем в невозбужденном), а также с наличием заряженных групп в микроокружении флуорофора.

Анализ многочисленных спектров триптофановой флоуресценции белков и данных по тушению флоуресценции внешними факторами позволило Бурштейну с соавторами [44, 45] сформулировать модель дискретных состояний остатков триптофана в белках. Эта модель выделяет пять наиболее вероятных спектральных форм остатков триптофана. Спектральная форма А соответствует излучению невозмущённого индольного хромофора в нейтральном гидрофобном окружении внутри белковой глобулы. Это очень редко встречающаяся в белках форма, обнаруженная пока лишь у двух белков - азурина и бактериородопсина. Она наблюдается, когда непосредственно около индольного кольца нет ни одной полярной группы боковых цепей АК. Спектральная форма 51 соответствует излучению индольного хромофора, локализованного внутри белковой глобулы и образующего эксиплекс 1:1 с какой-то ближней

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Чистюлин, Дмитрий Константинович

4. ВЫВОДЫ

1. Полученные в индивидуальном виде неспецифические OmpF и ОтрС порины наружной мембраны Y. ruckeri являются p-структурированными белками, отличаются особенностями строения и физико-химических свойств, способны образовывать разные по проводимости каналы в липидных мембранах.

2. Выявлена зависимость экспрессии исследуемых поринов и транскрипции соответствующих генов от условий культивации бактерий. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде преимущественно экспрессируется OmpF порин, введение в среду NaCl и повышение температуры приводит к появлению заметного количества ОтрС порина.

3. Обнаружена необычайно высокая для поринов термостабильность OmpF белка НМ Y. ruckeri и его способность восстанавливать функционально активное состояние в присутствии липидного бислоя после инкубации при температуре 85°С.

4. Показано, что процесс термоденатурации нативной формы (тримера) OmpF порина проходит в несколько стадий. На начальных этапах этот процесс сопровождается изменениями в структуре относительно «гибких» наружных петель, а в дальнейшем перестройкой на уровне четвертичной и третичной структуры белка, приводящей к диссоциации порина на мономеры.

5. С помощью иммунохимических методов выявлена локализация в наружных петлях L1 и L4 двух иммунодоминантных В-эпитопов перекрёстно реагирующих с АГ детерминантами OmpF порина Y. pseudotuberculosis.

6. Исследовано влияние OmpF порина Y. ruckeri на клеточный цикл злокачественных клеток (лейкоза крови человека) и клеточных культур тканей рыб. Установлено, что порин в низких концентрациях приводят к S-аресту клеточного цикла, а в высоких вызывают апоптоз злокачественных клеток.

7. Разработан упрощенный метод выделения очищенной фракции порина Y. ruckeri, исключающий стадию гель-хроматографии, пригодный для технологического способа получения белка.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чистюлин, Дмитрий Константинович, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lugtenberg В., Van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other Gram-negative bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 737. N. 1. P. 51-115.

2. Bayer M.E. The fusion sites between outer membrane of bacteria: their role in membrane assembly and virus infection // In: Outer membrane. Biogenesis and function. Inouye M. ed.N.-Y.: Wiley-Interscience. 1979. P. 167-202.

3. Osborn M., Gander J.E., Parisi E., Carson J. Mechanism of assembly of the membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of the cytoplasmic and outer membrane // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. N. 12. P. 3962-3972.

4. Schweizer M., Schwarz H., Sonntag I., Henning U. Mutational change of membrane architecture. Mutants of Escherichia coli K-12 missing major proteins of the outer cell envelope membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 448. N. 3. P. 474-491.

5. De Leij L., Witholt B. Structural heterogeneity of the cytoplasmic and outer membranes of Escherichia coli II Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 471. N. 1. P. 92-104.

6. Smit J., Kamio J., Nikaido H. Outer membrane of Salmonella typhimurium: chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants // J. Bacteriol. 1975. V. 124. N. 2. P. 942-958.

7. Van Alphen L., Verkleij A., Leunissen-Bijvelt J., Lugtenberg B. Architecture of the outer membrane of Escherichia coli. III. Protein-lipopolysaccharide complex in intramembraneous particles // J. Bacteriol. 1978. V. 134. N. 3. P. 1089-1098.

8. Nakae T. Outer membrane of Salmonella. Isolation of protein complex that produces transmembrane channels // J. Biol. Chem. 1976. V. 251. N. 7. P. 2176-2178.

9. Schirmer T.General and Specific Porins from Bacterial Outer Membranes // J. Struct. Biol. 1998. V. 121(2), Pages 101-109

10. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. & Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 593-656.

11. Achouak, W. Multiple facets of bacterial porins / W. Achouak, T. Heulin, J. M. Pages // FEMS Microbiol. Lett. 2001. Vol. 199. P. 1-7.

12. Delcour, A. H. Solute uptake through general porins // Front. Biosci. 2003. Vol. 8. P. 1055-1071.

13. Miiller DJ, Engel A. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy // J Mol Biol. 1999. V.285(4). P. 1347-51.

14. Benz R., Schmid A., Hancock R.E. Ion selectivity of gram-negative bacterial porins // J. Bacteriol. 1985. V. 162. N. 2. P. 722-727.

15. Delcour A.H. Function and modulation of bacterial porins: insight from electrophysiology // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 151. N. 2. P. 115-125.

16. Schindler H., Rosenbusch J. Matrix protein from Escherichia coli outer membranes forms voltage-controlled channels in lipid bilayers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. N. 8. P. 3751-3755.

17. Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann В., Sigworth F J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches //Pflugers Arch. 1981. V. 391. N. 2. P. 85-100.

18. Martinac В., Buechner M., Delcour A.H., Adler J., Kung C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. N. 8. P. 22972301.

19. Duechner M., Delcour A.H., Martinac В., Adler J., Kung C. Ion channel activity in the Escherichia coli outer membrane // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1024. N. 1. P. 111121.

20. Delcour A.H., Martinac В., Kung C., Adler J. A modified reconstitution method used in patch-clamp studies of Escherichia coli ion channels // Biophys. J. 1989. V. 56. N. 3. P. 631-636.

21.Berrier C., Coulombe A., Houssin C., Ghazi A. A patch-clamp study of ion channels of inner and outer membranes and of contact zones of E. coli fused into giant liposomes // FEBS Lett. 1989. V. 259. N. 1. P. 27-32.

22. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Том 2: Методы исследования структуры и функции биополимеров. М: Мир, 1984.

23. Adler A.J., Greenfield N.J., Fasman G.D. Circular dichroism and optical rotatory dispersion of proteins and polypeptides // Methods Enzymol. 1973. V. 27. P. 675-735.

24. Kelly S.M., Price N. C. The application of circular dichroism to studies of protein folding and unfolding // Biochim, Biophys. Acta 1997. V. 1338. P.161-185.

25. Correal D. H. A, Ramos C. H. I. The use of circular dichroism spectroscopy to study protein folding, form and function // African J. Biochem. Res. 2009. Vol.3 .P. 164-173.

26. Saxena V.P., Wetlaufer D.B. A new basis for interpreting the circular dichroic spectra of proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1971 V.68. P. 969-972.

27. Chang C.T., Wu C. -S.C., Yang J.T. Circular dichroic analysis of protein conformation: inclusion of the b-turns // Anal. Biochem. 1978. V. 91. P. 13-31.

28. Verheyden S, Sillen A., Gils A., Declerck P.J., Engelborghs Y.Tryptophan Properties in Fluorescence and Functional Stability of Plasminogen Activator Inhibitor 1 // 2003. V. 85 (1). P. 501-510.

29. Manavalan P., Johnson W.C., Jr. Variable selection method improves the prediction of protein secondary structure from circular dichroism spectra // Anal. Biochem. 1987. V. 167. P. 76-85.

30. Provencher C.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism // Biochemistry. 1981. V. 20. N. 1. P. 34-37.

31.Sreerama N., Woody R.W. Estimation protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON and CDSSTR methods with an expanded reference set. // Anal. Biochem. 2000. V. 287. N. 2. P. 252-260.

32. Эфтинк M.P. Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков // Биохимия. 1998. Е. 63, вып. 3 С. 327-337.

33. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. М.: Наука, 2003, 189 с.

34. Efîtink M.R. The use of fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins // Biophys J. 1994. V. 66(2). P. 482-501.

35. Lakovicz J.R. Principles of fluorescence spectroscopy. 1983. N.-Y.: Plenum Press.

36. Munishkina L. A. Fink A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins // Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes). 2007. V. 1768 (8). P. 1862-1885.

37. Ababou A., Bombarda E. On the involvement of electron transfer reactions in the fluorescence decay kinetics heterogeneity of proteins // Protein Sci. 2001. V. 10(10). P. 2102-2113.

38. Туроверов К. К., Кузнецова И. M., Зайцев В. Н. Интерпретация УФ-флуоресценции азурина на основе данных рентгеноструктурного анализа // Биоорг. химия 1984. Т. 10 (6). С. 792-806.

39. Bajzer Z., Prendegrast F. A model for multiexponential tryptophan fluorescence intensity decay in proteins // Biophys J. 1993 V. 65(6) P. 2313-23.

40. Engelborghs Y. Correlating protein structure and protein fluorescence // J. Fluoresc. 2003. V. 13. P. 1319-1326.

41.Bushueva TL, Busel EP, Burstein EA: Some regularities of dynamic accessibility of buried fluorescent residues to external quenchers in proteins // Arch Biochem Biophys. 1980. V. 204(1). P. 161-166.

42. Reshetnyak Y., Burstein E.A. I. Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins // Biophys J. 2001 V. 81(3). P.710-1734.

43. Royer C.A. Approaches to teaching fluorescence spectroscopy // Biophys J. 1995. V. 68(3). P. 1191-1195.

44. Burstein E.A., Vedenkina N. S., Ivkova M. N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules // Photochem. And Photobiol. 1973. Vol. 18. P. 263-279.

45. Burstein E.A., Permyakov E. A., Yashin VA, Burkhanov SA, Finazzi Agro A. The fine structure of luminescence spectra of azurin // Biochim. Biophys. Acta. 1977. Vol. 491, N l.P. 155-159.

46. Пермяков E. А., Ярмоленко В. В., Калиниченко JI. П., Морозова Л.А., Бурштейн Э.А. Связывание ионов Са2+ с а-лактальбумином коровьего молока // Биофизика. 1982. Т. 27, № 3. С. 380-385.

47. Ramsay G, Ionescu R, Eftink MR. Modified spectrophotometer for multi-dimensional circular dichroism/fluorescence data acquisition in titration experiments: application to the pH and guanidine-HCI induced unfolding of apomyoglobin // Biophys J. 1995. V. 69(2). P.701-707.

48. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Three-dimensional crystals of an integral membrane protein: an initial X-ray analysis //J. Cell Biol. 1980. V. 86. N. 1. P. 327-329.

49. Weiss M.S., Kreusch A., Schiltz E., Nestel U., Welte W., Weckesser J., Schulz G.E. The structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 1.8 Ä resolution // FEBS Lett. 1991. V. 280. N. 2. P. 379-382.

50. Weiss M.S., Wacker Т., Weckesser J., Welte W., Schulz G.E. The three-dimensional structure of porin from Rhodobacter capsulatus at 3 Ä resolution // FEBS Lett. 1990. V. 267. N. 2. P. 268-272.

51. Schulz G.E. The structure of bacterial outer membrane proteins // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1565. N. 2. P. 308-317.

52. Weiss M.S., Abele U., Weckesser J., Welte W., Schiltz E., Schulz G.E. Molecular architecture and electrostatic properties of a bacterial porin // Science. 1991. V. 254. N. 5038. P. 1627-1630.

53.Koebnick R., Locher K.P., van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Microbiol. 2000. V. 37. N. 2. P. 239-253.

54. Schulz G.E. ^-Barrel membrane proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. V. 10. N. 4. P. 443-447.

55. Przybylski M., Glocker M.O., Nestel U., Schnaible V., Blüggel M., Diederichs K., Weckesser J., Schad M., Schmid A., Welte W., Benz R. X-ray crystallographic and mass spectrometric structure determination and functional characterization of succinylated porin from Rhodobacter capsulatus: implications for ion selectivity and single-channel conductance // Protein Sci. 1996 V. 5(8). P. 1477-89.

56. Palva E.T., Randall L.L. Arrangement of protein I in Escherichia coli outer membrane: cross-linking study // J. Bacteriol. 1978. V. 133. N. 1. P. 279-286.

57. Palva, E.T. Cross-linking analysis of the two forms of protein I, a major outer membrane protein of Eschericha coli II J.Bacteriol. 1979. V. 138. N1. P.38-42.

58. Steven AC, Heggeler B, Miiller R, Kistler J, Rosenbusch JP. Ultrastructure of a periodic protein layer in the outer membrane of Escherichia coli II J.Cell.Biol. 1977. V.72. N2. P. 292-301.

59. Jap B.K. Wallia P.J., Gehring K. Structural architecture of an outer membrane channel as determined by electron crystallography //Nature. 1991. V. 350. N. 6314. P. 167-170.

60. Phale P.S., Philippsen A., Kiefhaber T., Koebnik R., Phale V.P., Schirmer T., Rosenbusch J.P. Stability of trimeric OmpF porin: the contributions of the latching loop L2 // Biochemistry. 1998. V. 37. N. 45. P. 15663-15670.

61. Jeanteur D., Lakey J. H,, Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. N. 9. P. 2153-2164.

62. Mapingire OS, Wager B, Delcour AH. Electrophysiological characterization of bacterial pore-forming proteins in planar lipid bilayers // Methods Mol Biol. 2013. V. 966. P.381-396.

63. Sipos L., von Heijne G. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins // Eur. J. Biochem. 1993. V. 213. N. 3. P.1333-1340.

64. Hancock R.E. Role of porins in outer membrane permeability // J. Bacteriol. 1987. V. 169 (3). P. 929-934.

65. Gnanasekarean T.V., Peri S., Arockiasamy F., Krishnaswamy S. Profiles from structure based sequence alignment of porins can identify ^-stranded integral membrane proteins // Bioinformatics. 2000. V. 16. N. 9. P. 839-842.

66. Ferenci T. From sequence alignment to structure prediction: the case of the OmpF porin family//Mol. Microbiol. 1994. V. 14.N. l.P. 188-189.

67. Berven F.S., Flikka K., Jensen H.B., Eidhammer I. BOMP: a program to predict integral P-barrel outer membrane proteins encoded within genomes of Gram-negative bacteria // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. (Web Server). P. W394-W399.

68.Heringa J. Computational methods for protein secondary structure prediction using multiple sequence alignments // Curr. Protein Pept. Sci. 2000. V. 1. N. 3. P. 273-301.

69. Burke D.F., Deane C.M., Nagarajaram H.A., Campillo M., Martin-Martinez M., Mendes J., Molina F., Perry J., Reddy B.V., Soeres C.M., Steward R.E., Williams M., Carrondo M.A., Blundell T.L., Mizuguchi K. An interactive structure-assisted approach to

sequence alignment and comparative modeling // Protein. Struct. Funct. Genet. 1999. V. 37. N. S3. P. 55-60.

70. Jackups R.Jr., Liang J. Interstrand pairing patterns in ^-barrel outer membrane proteins: the positive outside rule, aromatic rescue, and strand registration prediction // J. Mol. Biol. 2005. V. 354. N. 4. P. 979-993.

71. Waldispuhl J., Berger B., Clote P., Steyaert J.M. transFold: a web server for predicting the structure and residue contacts of transmembrane /^-barrels // Nucleic Acid Res. 2006. V. 34. (Web Server). P. W189-W193.

72. Garavito R.M., Rosenbusch J.P. Isolation and crystallization of bacterial porin // Methods Enzymol. 1986. V. 125. N. 2. P. 309-328.

73. Kleinschmidt J.H. Membrane proteins - Introduction // Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. N.8.P. 1527-1528.

74. Eriks L. R. Mayor J.A., Kaplan R.S. A strategy for identification and quantification of detergents frequently used in the purification of membrane proteins // Anal. Biochem. 2003. V. 323. N. 2. P. 234-241.

75. Arachea B.T., Sun Z., Potente N., Malik R., Isailovic D., Viola R.E. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins // Protein Exprès. Purif. 2012. V. 86. P. 12-20.

76. Rosenbusch J.P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. N. 24. P. 8019-8029.

77. Nurminen M. Isolation of porin trimers // In: Enterobacterial surface antigen methods for molecular characterization. II In Korhonen T.K., Dawes E.A., Makela P.H. eds. N.-Y.: Elsevier Science Publ. 1985. P. 293-300.

78. Magliery T. J., Regan L. Combinatorial approaches to protein stability and structure // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 1595-1608.

79. Graddis T.G., Remmele R.L. Jr., McGrew J.T. Designing proteins that work using recombinant technologies // Curr. Pharm. Biotechnol. 2002. V. 3. P 285-297.

80. Buxbaum J.N. Diseases of protein conformation: what do in vitro experiments tell us about in vivo diseases // Trends Biochem. 2003. V. 28. P. 585-592.

81. Daggett V., Fersht A.R. Is there a unifying mechanism for protein folding? // Trends Biochem. Sci. 2003. V. 28. N. 1. P. 18-25.

82. Jaenicke R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions // Eur. J. Biochem. 1991. V. 202. N. 3. P. 715-728.

83.SÍvaraman T., Kumar T.K., Jayaraman G., Han C.C., Yu C. Characterization of a partially structured state in an all /?-sheet protein // Biochem. J. 1997. V. 321. N. 2. P. 457-464.

84. Pawar S.A., Deshpande V.V. Characterization of acid-induced unfolding intermediates of glucose/xylose isomerase // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. N. 21. P. 6331-6338.

85. Van der Woude AD1, Mahendran KR, Ummels R, Piersma SR, Pham TV, Jiménez CR, de Punder K, van der Wei NN, Winterhalter M, Luirink J, Bitter W, Houben EN. Differential detergent extraction of mycobacterium marinum cell envelope proteins identifies an extensively modified threonine-rich outer membrane protein with channel activity // J. Bacteriol. 2013. V. 195(9). P.2050-2059.

86. Rosenbusch J.P. Structural and functional properties of porin channels in E. coli outer membranes // Experientia. 1990. V. 46. N. 2. P. 167-173.

87. Eisele J.L., Rosenbusch J.P. In vitro folding and oligomerization of a membrane protein. Transition of bacterial porin from random coil to native conformation. // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. N. 18. P. 10217-10220

88. Bolla J.-M., Loret E., Zalewsky M., Pages J.-M. Conformational analysis of the Campylobacter jejuni porin // J. Bacteriol. 1995 V. 177. N. 15. P. 4266-4271.

89. Arcidiacono S., Butler M.M., Mello A.M.A Rapid Selective Extraction Procedure for the Outer Membrane Protein (OmpF) from Escherichia coli. Protein Expression and Purification 2002. V. 25. P. 134-137.

90. Hirsch A., Wacker T., Weckesser J.„ Diederichs K., Welte W. Purification, characterization, crystallization, and preliminary X-Ray results from Paracoccus denitrificans porin // Proteins. 1995. V. 23(2). P.282-284.

91. Markovic-Housley Z., Garavito R.M, Effect of temperature and low pH of matrix porin in micellar detergent solutions. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 869. N. 2. P. 158-170.

92. Worobec E.A., Martin N.L., Mecubbin W.D., Kay C.M., Brayer G.D., Hancock R.E. Large-scale purification and biochemical characterization of crystallization-grade porin protein P from Pseudomonas aeruginosa II Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 939. N. 2. P. 366-374.

93. Sugawara E., Ekaterina M. Nestorovich E.M., Bezrukov S.M., H. Nikaido Pseudomonas aeruginosa Porin OprF Existsin Two Different Conformations // J.Biol.Chem. 2006. V.281. P.16220-16229.

94. Minetti C.A.S.A., Tai J.Y., Blake M.S., Pullen J.K., Liang S.M., Remeta D.P. Structural and functional characterization of a recombinant PorB class 2 protein from Neisseria

meningitidis. Conformational stability and porin activity // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 16. P. 10710-10720.

95. Minetti C.A.S.A., Blake M.S., Remeta D.P. Characterization of the structure, function, and conformational stability of PorB class 3 protein from Neisseria meningitidis И J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N. 39. P. 25329-25338.

96. Sukumaran S., Hauser K., Maier E., Benz R., Mantele W. Structure-function correlation of outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans II Biopolymers. 2006. V. 82. N. 4. P. 344-348.

97. Ким Н.Ю. Новикова О.Д., Хоменко B.A., Лихацкая Г.Н., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Функционально значимые конформационные переходы порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Биол. мембраны. 2007. Т. 24. № 2. С. 150-158.

98. Мажуль В.М., Кананович С.Ж. О возможности белка существовать во множестве частично свернутых состояний // Биофизика. 2004. Т. 40. № 3. С. 413-423.

99. Новикова О.Д. Порины рода Yersinia II Успехи в изучении природных соединений. Владивосток: Дальнаука, 1999. С. 178-201.

100. Rawling E.G., Martin N.L., Hancock R.E.W. Epitope mapping of the Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein OprF // Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 1. P. 38-42.

101. Lupi N., Bourgois A., Bernadac A., Laboucarie S., Pages J.M. Immunological analysis of porin polymorphism in Escherichia coli В and K-12 // Mol. Immunol. 1989. V. 26. N. 11. P. 1027-1036.

102. Mutharia L. M., Hancock R. E. Surface localization of Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin protein F by using monoclonal antibodies // Infect Immun. 1983. V. 42(3). P. 1027-1033.

103. Henriksen A.Z., Maeland J.A. Immunogenicity expressed in patients with bacteraemia of an epitope shared by enterobacterial and neisserial porin proteins // APMIS. 1995. V. 103. N. 5. P. 388-394.

104. Дельвиг А.А., Семенов Б.Ф. Механизмы формирования иммунного ответа к пориновым белкам наружной мембраны менингококков серогруппы В // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1997. № 6. С. 92-96.

105. Yamada Н, Oshima N, Mizuno Т, Matsui Н, Kai Y, Noguchi H, Mizushima S.Use of a series of OmpF-OmpC chimeric proteins for locating antigenic determinants recognized by monoclonal antibodies against the OmpC and OmpF proteins of the Escherichia coli outer membrane //J. Biochem. 1987. V. 102. N. 3. P. 455-464.

106. Singh S.P., Singh S.R., Williams Y.U., Jonnes L., Abdullach T. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium II Infect. Immun. 1995. V. 63. N. 12. P. 4600-4605.

107. Норр T.P., Woods K.R. A computer program for predicting protein antigenic determinants // Mol. Immunol. 1983. V. 20. N. 4. P. 483-489.

108. Волышна O.M., Титова M.A., Жмак M.H., Короев Д.О., Обозная М.Б., Волкова Т.Д., Иванов В.Т. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорган, химия. 2002. Т. 28. № 5. С. 387-395.

109. Alcaraz A., Nestorovich Е. М., Aguilella-Arzo М., Aguilella V. М., Bezrukov S. М. Salting out the ionic selectivity of a wide channel: the asymmetry of OmpF // Biophys. J. 2004. V. 87. N. 2. P. 943-957.

110. XueQiao Liu and Thomas Ferenci'Regulation of Porin-Mediated Outer Membrane Permeability by Nutrient Limitation in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2014. V. 196(10). P. 3917-3922.

111. Tomassen J., van der Ley P., van Zzeiji M., Agterberg M. Localization of functional domains in E. coli outer membrane porins // EMBO J. 1985. V. 4. N. 6. P. 1583-1587.

112. Egger L. A., H. Park, Inouye M. Signal transduction via the histidyl-aspartyl phosphorelay //Genes Cells. 1997. V. 2.P. 167-184.

113. Kenney L. J. Structure/function relationships in OmpR and other winged-helix transcription factors // Curr. Opin. Microbiol. 2002. V.5. P.135-141.

114. Slauch J. M., Silhavy T. J. The porin regulon: a paradigm for the two-component regulatory systems In Regulation of Gene Expression in Escherichia coli ed. Lin E. С. C., Lynch S. A. N.Y.: Chapman & Hall. 1996. P. 383-417.

115. Pukklay P., Nakanishi ., Nitta M., Yamamoto K., Ishihama A., Shiratsuchi A. Involvement of EnvZ-OmpR two-component system in virulence control of Escherichia coli in Drosophila melanogaster И BBRC. 2013. V. 438(2). P. 306-311.

116. Chen S., Zhang A., Blyn L. В., Storz G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli //.J. Bacteriol. 2004. V.186. P.6689-6697.

117. Delihas N., Forst S. MicF: an antisense RNA gene involved in response of Escherichia coli to global stress factors // J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P.l-12.

118. Mecsas J., Rouviere P. E., Erickson J. W., Donohue T. J., Gross C. A. The activity of sigma E, an Escherichia coli heat-inducible sigma factor, is modulated by expression of outer membrane proteins // Genes Dev.l 993. V.7. P.2618-2628.

119. Pratt L. A., Silhavy T. J. The response regulator SprE controls the stability of RpoS // Proc. Natl. Acad. Sei. 1996. V. 93. P. 2488-2492.

120. Ferrario M., Ernsting, B. R., Borst D. W., Wiese D. E., Blumenthal R. M., Matthews R. G. The leucine-responsive regulatory protein of Escherichia coli negatively regulates transcription of ompC and micF and positively regulates translation of ompF II J. Bacterid. 1995. V.177. P.103-113.

121. Huang L., Tsui P., Freundlich M. Integration host factor is a negative effector of in vivo and in vitro expression of ompC in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P.5293-5298.

122. Ramani N., Huang L., Freundlich M. In vitro interactions of integration host factor with the ompF promoter-regulatory region of Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1992. V.231. P.248-255.

123. Leslie A. Pratt, Weihong Hsing, Katherine E. Gibson, Thomas J. Silhavy From acids to osmZ: multiple factors influence synthesis of the OmpF and OmpC porins in Escherichia coli H Mol. Microbiol. 1996 V. 20(5). P. 911-917.

124. Mizuno T., Mizushima S. Signal transduction and gene regulation through phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis of the osmotic regulation of the porin genes // Mol. Microbiol. 1990. V. 4. N. 7. P. 1077-1082.

125. Aiba H., Kato N., Tsuzuki M., Mizuno T. Phosphorylation of a bacterial activator protein, OmpR, by a protein kinase, EnvZ, results in stimulation of its DNA-binding ability //J Biochem. 1989. V.106. P. 5-7.

126. Hey de M., Portaller R. Regulation of major outer membrane porin proteins of Escherichia coli K-12 by pH // Mol.Gen.Genet. 1987. V. 208(3). P. 511 -517.

127. Ramani N, Boakye K. Salicylate inhibits the translation and transcription of ompF in Escherichia coli II Can J Microbiol. 2001. V. 47 (11). P.1053-1057.

128. Mizuno T., Chou M.-Y. Inouye, M. A unique mechanism regulating gene expression: translational inhibition by a complementary RNA transcript (micRNA) // Proc Natl Acad Sei USA. 1984. V.81. P. 1966-1970.

129. Schmidt M., Zheung P., Delihas N. // Secondary structures of Escherichia coli antisense micF RNA, the 5'-end of the target ompF mRNA, and the RNA/RNA duplex // Biochemistry. 1995. V.34. P. 3623-3631.

130. Andersen J., Delihas N. micF RNA binds to the 5'-end of ompF mRNA and to a protein from Escherichia coli II Biochemistry. 1990. V. 29. P.9249-9256.

131. Coyer J., Andersen J., Forst S. A., Inouye M.„ Delihas N. micF RNA in ompB mutants of Escherichia coli: different pathways regulate micF RNA levels in response to osmolarity and temperature change // J Bacteriol. 1990. V. 172. P. 4143-^4150.

132. Takayanagi K., Maeda S., Mizuno T. Expression of micF involved in porin synthesis in Escherichia coli: two distinct cis-acting elements respectively regulate micF expression positively and negatively // FEMS Microbiol Let. 1991. V. 67. P. 39-44.

133. Delihas N. Regulating the regulator: MicF RNA controls expression of the global regulator Lrp // Mol. Microbiol. 2012. V. 84(3). P.401-404.

134. Pratt L. A., Hsing W., Gibson K. E., Silhavy T. J. From acids to osmZ: multiple influence synthesis of the OmpF and OmpC porins of Escherichia coli II Mol Microbiol. 1996. V. 20. P. 911-917.

135. Rosner J. L., Chai T. J., Foulds J. Regulation of ompF porin expression by salicylate in Escherichia coli 111. Bacteriol. 1991.V. 173(18). P. 5631-5638.

136. Danese P. N., Oliver K G., Barr R., Bowman G. D., Rick P. D., Silhavy T. J.. Accumulation of the enterobacterial common antigen lipid II biosynthetic intermediate stimulates degP transcription in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 58755884.

137. Langen G. R., Harper J. R., Silhavy T. J., Howard S. P. Absence of the outer membrane phospholipase A suppresses the temperature-sensitive phenotype of Escherichia coli degP mutants and induces the Cpx and crE extracytoplasmic stress responses Hi. Bacteriol. 2001. V. 183. P.5230-5238.

138. Snyder W. B., Davis L. J., Danese P. N., Cosma C. L., Silhavy T. J. Overproduction of NlpE, a new outer membrane lipoprotein, suppresses the toxicity of periplasmic LacZ by activation of the Cpx signal transduction pathway // J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 4216-4223.

139. Batchelor E., Walthers D., J. Kenney L., Goulian M. The Escherichia coli CpxA-CpxR envelope stress response system regulates expression of the porins OmpF and OmpC // J. Bacteriol. 2005. V. 187(16). P. 5723-5731.

140. Ross A. J., Rucker R. R., Ewing W. H. Description of a bacterium associated with redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri) // Can J Microbiol. 1966. V.12(4). P. 763-770.

141. Rucker RR. Redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri) // Bull. Off Int. Epizoot. 1966. V. 65(5). P. 825-830.

142. Hunter V. A., Knittel M. D., Fryer J. L. Stress-induced transmission of Yersinia ruckeri infection from carriers to recipient steelhead trout Salmo gairdneri Richardson // J. Fish Dis.. 1980. V. 3. P. 467-472.

143. Coqet L., Cosette P., Junter G. A., Beucher E., Saiter J, M., Jouenne T. Adhesion of Yersinia ruckeri to fish farm materials: influence of cell and material surface properties. Colloids and surfaces В // Biointerfaces 2002. V. 26. P. 373-378.

144. Willumsen B. Birds and wild fish as potential vectors of Yersinia ruckeri II J. Fish Dis. 1989. V. 12. P. 275-277.

145. Altinok I., Grizzle J. M. Effects of salinity on Yersinia ruckeri infection of rainbow throut and broun throut // J. Aquat. Anim. Health 2001. V. 13. P. 334-339.

146. Fernandes L., Márquez I., Guijarro J. A. Identification of specific in vivo-induced genes in Yersinia ruckeri and analysys of ruckerbactin, a catecholate sideropore iron acquisition system // Appl. Environ. Microbiol. 2004 70, 5199-5207.

147. Gunasena D. K., Komrower J. R., Mac Intyre S. The fish pathogen Yersinia ruckeri possesses a TTS system // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 529. P. 105-107.

148. Fernandes L., Lopez J. R., Secades P., Mendez A., Márquez I., Guijarro J. A. In vitro and in vivo studies of the Yrpl protease from Yersinia ruckeri and its role in protective immunity against enteric red mouth disease of salmonids // Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69. P. 7328-7335.

149. Romalde J. L., Toranso A. E. Pathological activities of Yersinia ruckeri, the enteric redmouth bacterium // FEMS Microbiol. Lett. 1993. V. 112. P. 291-300.

150. Kawula Т. H., Lelivelt M J, Orndorff P. E. Using a new inbred fish model and cultured fish tissue cells to study Aeromonas hydrophila and Yersinia ruckeri pathogenesis // Microb. Pathogen. 1996. V. 20(2). P.l 19-25.

151. Méndez J., Reimundo P., Pérez-Pascual D., Navais R., Gómez E., Guijarro, J.A. A novel cdsAB operon is involved in the uptake of 1-cysteine and participates in the pathogenesis of Yersinia ruckeri II J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 944-951.

152. Новикова О.Д. Хоменко В.А., Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Чистюлин Д.К., Соловьева Т.Ф. Порообразующие белки наружной мембраны некоторых грамотрицательных бактерий. Структура и свойства // Вестник ДВО РАН. 2014. Т.1(173). С.120-134.

153. Вострикова О.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Гузев К.В., Вакорина Т.И., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Структура и функция порообразующих белков бактерий рода Yersinia. I. Выделение и сравнительная

характеристика физико-химических свойств и функциональной активности поринов иерсиний // Биоорган, химия. 2006. Т. 32. № 4. С. 371-383.

154. Новикова О.Д., Набиуллин А.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Выделение и характеристика белков внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis II Химия природн. соедин. 1983. № 3. С. 359-366.

155. Solov'eva T.F., G.N. Likhatskaya, V.A. Khomenko, A.M. Stenkova, N.Y. Kim, O.Y. Portnyagina, O.D. Novikova, E.V. Trifonov, E.A. Nurminski and M.P. Isaeva. A Novel OmpY Porin From Yersinia Pseudotuberculosis: Structure, Channel-Forming Activity and Trimer Thermal Stability // J. Biomolecular Structures and Dynamics. 2011. V. 28. N4. P. 517-533.

156. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиноза и близкие к нему микроорганизмы // Клин, микробиол. антимикроб, химотер 2004. Т 6(1). С. 10-21.

157. Reithmeier R.A.F., Bragg P.D. Purification and characterization of heat-modifiable protein from outer membrane of Escherichia coli И FEBS Lett. 1974. V. 41. N. 2. P. 195-198.

158. Сомов Г. П. , Покровский В. И. , Беседнова Н. Н., Антоненко Ф. Ф. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001. 256 с.

159. Ценева Г.Я. Иерсинии и иерсиниозы. СПб.: Медмассмедиа. 2006.168 с.

160. Schirmer Т. General and specific porins from bacterial outer membranes // J. Struct. Biol. 1998. V. 121(2). P. 101-109.

161. Новикова О.Д., Хоменко B.A., Емельяненко В.И., Лихацкая Т.Н., Зелепуга Е.А., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. OmpC - подобный порин из Yersinia pseudotuberculosis: молекулярная характеристика, физико-химические и функциональные свойства // Биол. мембраны 2011. Т. 28(1). С. 1-16.

162. Cowan S.W., Schirmer Т., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structure explain functional properties of two Escherichia coli porins //Nature. 1992. V. 358. P. 727-733.

163. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Sundara Baalaji N., Katpally U.C., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi II J. Struct. Biol. 2004. V.148. P. 22-33.

164. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Иммунологические свойства неспецифических поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий // Биол. мембраны. 2005. Т. 22(6). С. 435-443.

165. Новикова О.Д., Федореева Л.И., Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Ермак И.М., Лихацкая Г.Н., Мороз С.В., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Влияние способа экстракции порообразующего белка из Yersinia pseudotuberculosis на его макромолекулярную организацию // Биоорган, химия. 1993. Т. 19(5). С. 536-547.

166. Molecular Operating Environment (МОЕ), 2013.08; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2013; http ://www.chemcomp .com

167. Dutzler R., Schirmer T. Crystal structure and functional characterization of OmpK 36, the osmoporin of Klebsiella pneumoniae // J. Structure. 1999. N. 7. P. 425-434.

168. Новикова О.Д., Фролова, Вакорина Т.Н., Г.М., Таранкова З.А., Глазунов В.П., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Конформационная стабильность и иммунохимические свойства иерсинина - основного белка внешней мембраны псевдотуберкулезного микроба//Биоорган, химия. 1989. Т. 15(6). С.763-772.

169. Pattnaik B.R., Ghosh S., Rajeswarib M.R Selective excitation of tryptophans in OmpF: A fluorescence emission study. Biochem Mol. Biol. Int. 1997. V. 42 (1). P. 173181.

170. Сидорова О. В., Исаева М. П., Хоменко В. А., Портнягина О. Ю., Лихацкая Г. Н., Ким Н. Ю., Новикова О. Д., Чистюлин Д. К., Соловьева Т. Ф. Мутантные OmpF-порины Yersinia pseudotuberculosis с делециями наружных петель: создание генетических конструкций, экспрессия, выделение, рефолдинг // Биоорган, химия. 2012. Т. 38(2). С. 156-165.

171. Pages J.-M., Bolla J М, Bernadac A, Fourel D Immunological approach of assembly and topology of OmpF an outer membrane protein of Escherichia coli II Biochimie. 1990. V 72(2-3). P. 169-176.

172. Laver W.G., Air G.M., Webster R.G., Smith-Gills S. J. Epitopes on protein antigens: Misconceptions and realities // Cell 1990. V.61. P. 553-556.

173. IEDB Analysis Resource http://tooIs.immuneepitope.org/main/html/tcell_tools.html

174. Buommino E., Morelli F., Metafora S., Rossano F., Perfetto В., Baroni A. Porin from Pseudomonas aeruginosa induces apoptosis in an epithelial cell line derived from rat seminal vesicles // Infect. Immun. 1999. V. 67. No. 9. P. 4794-4800.

175. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227,N. 5259. P. 680-685.

176. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир. 1982. С. 157.

177. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. N. 3. P. 403^110.

178. Thomson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTALW windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools //Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. N. 24. P. 4876-4882.

179. Чистюлин Д. К., Новикова О. Д., Портнягина О. Ю., Хоменко В. А., Вакорина Т. И., Ким Н. Ю., Исаева М. П., Лихацкая Г. Н., Т. Ф. Соловьева Выделение и характеристика OmpF-подобного порина наружной мембраны Yersinia ruckeri//Биол. мембраны 2012. Т. 29(3). С. 1-9.

180. Winder A. F., Gent W. L. G. / Correction of light-scattering errors in spectrosphotometric protein determinations // 1971. Biopolymers. V.10 (7). P. 12431251.

181. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N., 1973 Fluorescence and the location of try ptophan residuesin protein molecules // Photochem. Photobiol. V. 8. P.263-279.

182. Marquardt D.W. 1963. An algorithm for least-squares estimationof nonlinear parameters // J. Soc. Indust. Appl. Math. V. 11. P. 431-441.

183. Privalov P.L., Potekhin SA. Scanning microcalorimetryin studying temperature-induced changes in proteins // Methods Enzymol. 1986. V. 131 P.4-51.

184. Barltrop JA, Owen TC, Cory AH, Cory JG. 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethylthiazolyl)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium, inner salt (MTS) and related analogs of 3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reducing to purple water-soluble formazans as cell-viability indicators // Bioorg Med Chem Lett. 1991. V. 1. P. 611-614.

185. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry //J Immunol Methods. 1991. V. 139. P.271-279.