Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита C в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках эукариот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Орлова, Ольга Владимировна

• Орлова, Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Орлова, Ольга Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Геномная организация вируса гепатита С

1.1.1. Нетранслируемые области

5'иТЯ

З'иТЯ

1.1.2. Белки ВГС

1.1.2.1. Структурные белки

Кор белок ВГС, структурный белок капсида

Белки оболочки ВГС

р7

1.1.2.2. Неструктурные белки

N82

К83иШ4А

Ш4В

Ш5А

Ш5В

1. 2. Жизненный цикл вируса

1.2.1. Проникновение вирусных частиц в клетку

1.2.1.1. Прикрепление и проникновение

СО-81- рецептор

1ЛЭ1Л1 - рецептор

8Я-В1 — рецептор мусорщик

Гликозаминогликаны

1.2.1.2. Выход в цитоплазму и раздевание РНК вирусного генома

1.2.2. Трансляция ВГС и протеолитический процессинг

1.2.3. Репликация ВГС

1.2.4. Сборка вирусной частицы

1.3. Морфогенез вируса гепатита С

1.3.1. Биогенезис гликопротеинов оболочки вируса гепатита С

Посттрансляционный процессинг белков

1.3.2. Гликозилирование гликопротеинов в клетках насекомых

1.3.3. Гликозилирование гликопротеинов в клетках млекопитающих

1.3.4. Ы-гликаны гликопротеинов ВГС и их роль в функционировании белков оболочки вируса

1.4. Методы исследования гликозилирования белков оболочки ВГС

1.4.1. Сайт-направленный мутагенез ДНК

1.4.2. Получение вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых

1.4.3. Использование ВасМат системы в клетках млекопитающих

1.5. Модельные системы для изучения вирусного морфогенеза

1.5.1. Ретровирусные псевдочастицы (НСУрр)

1.5.2. Вирусоподобные частицы (НСУ-ЬР)

1.5.3. Система репликонов ВГС

1.5.3.1. Системы репликации с использованием самореплицирующихся РНК. JFH-1 репликоны ВГС

1.5.3.2. Использование бакуловируса для доставки и капсидирования JFH-1 РНК в клетках Huh-7

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды

2.2. Сайт-направленный мутагенез и создание рекомбинантных конструкций

2.3. Анализ суммарной клеточной ДНК

2.4. Получение микросом

2.5. Электронная микроскопия

2.6. Анализ РНК ВГС с помощью ОТ-ПЦР

2.7. Вестерн-блот и иммуноосаждение

2.8. Анализ гликозилирования - обработка эндогликозидазой Н (Endo Н)

2.9. Получение и очистка вирусоподобных частиц (ВПЧ)

2.10. Центрифугирование в сахарозном градиенте

2.11. Анализ связывания ВПЧ с рецептором CD-81

2.12. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофлуориметрия

2.13. Моделирование трехмерной структуры

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Создание набора векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах N-гликозилирования белков Е1 и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих

3.2. Экспрессия мутантных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С в клетках

эукариот с использованием бакуловирусной системы экспрессии

3.2.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС на экспрессию генов мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих

3.3. Исследование роли гликозилирования белков оболочки ВГС в вирусном морфогенезе в клетках насекомых и млекопитающих

3.3.1. Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование продуктивного комплекса Е1Е2 в клетках SJ9

3.3.2. Влияние N-гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на образование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих

3.3.3. Влияние N-гликанов гликопротеина Е2 ВГС на связывание рекомбинантных вирусоподобных частиц ВГС, полученных в модельной бакуловирусной системе, с рецептором CD-81 в клетках Huh-

7

4. Моделирование пространственной структуры мутантных белков Е1

ВГС

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AcNPV - вирус ядерного полиэдроза Autógrafa californica PBS - фосфатно-солевой буфер SDS - додецилсульфат натрия

SDS-PAGE - полиакриламидный гель электрофорез с использованием SDS

БОЕ - бляшкообразующая единица

БЭС — бакуловирусная система экспрессии

ВГС - вирус гепатита С

ОТ - обратная транскрипция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис — 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диол

ФБС- эмбриональная сыворотка теленка

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭР - эндоплазматический ретикулум

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли гликозилирования белков оболочки вируса гепатита C в вирусном морфогенезе с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках эукариот»

ВВЕДЕНИЕ

По данным ВОЗ каждый 12-й житель нашей планеты заражен вирусом гепатита С (ВГС) и инфекция продолжает распространяться [1]. Гепатит С называют "тихой эпидемией", при этом современные методы лечения ВГС не совершенны, а профилактические вакцины для вируса не созданы. В этой связи необходимы исследования для большего понимания молекулярных механизмов, вовлеченных в вирусную инфекцию. Вирус гепатита С, относящийся к семейству Flaviviridae, отличается высоким генетическим полиморфизмом и, как следствие, наличием 6 генотипов и нескольких десятков субтипов. На территории РФ преобладающим генотипом вируса является 16. Кроме того, у инфицированных пациентов на разных стадиях инфекционного процесса, вирус существует в виде набора близкородственных геномов — квазивидов, способствующих иммунному ускользанию и развитию хронического течения инфекции.

ВГС представляет собой оболочечный РНК-содержащий вирус. Геном вируса кодируется с единственной ORF. Трансляция полипротеинового предшественника осуществляется с IRES, расположенном в нетранслируемой области геномной РНК, который затем процессируется протеазами с образованием структурных и неструктурных вирусных белков. Максимальная гетерогенность генома регистрируется в генах, кодирующих белки оболочки ВГС, что осложняет исследование взаимодействия вируса с клетками и создание вакцин. Мишенью ВГС являются гепатоциты. Связывание вириона ВГС с клетками гепатоцитов происходит посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной оболочки с рецепторами, расположенными на поверхности клетки. Взаимодействуя со спецефическими рецепторами на поверхности клетки, белки оболочки индуцируют слияние вирусной оболочки и мембраны клетки-хозяина. Для

белков, присутствующих на поверхности оболочечных вирусов, характерно N-связанное гликозилирование, которое играет главную роль в биологических функциях этих белков. Белки оболочки ВГС высоко гликозилированы и содержат от 4 до 11 сайтов N-гликозилирования. Несмотря на вариабельность генотипов ВГС, сайты гликозилирования El и Е2 высоко консервативны. Какие сайты гликозилирования участвуют в модификации белка и все ли потенциальные сайты реализуются ш vivo до сих пор не известно. Известно, что наличие N-гликанов способно стабилизировать структуру белка, влиять на специфичность белок-белковых взаимодействий, на сворачивание заякоренных в мембрану секретируемых гликопротеинов. Определенные гликаны гликопротеинов ВГС, в зависимости от штамма, играют решающую роль в процессе инфицирования клетки-мишени. Добавление гликанов на растущий полипротеин сопряжено с фолдингом, при котором гликопротеины специфически взаимодействуют с лектин-подобными шаперонами ЭР в кальнексин-кальретикулиновом цикле, обеспечивая его сворачивание [2,3]. Гликопротеины ВГС накапливаются в люмене ЭР в виде двух форм: правильно свернутых гликопротеинов и в виде агрегатов, стабилизированных дисульфидными связями. Часть белков El и Е2 дегликозилируется, остается в цитозоле и удаляется по убиквитин-протеасомному метаболическому пути.

Обоснованно предполагается, что свойства вириона зависят от

гликозилирования оболочечных белков ВГС в зараженной клетке, их

взаимодействия и характера укладки. Наличие или отсутствие Сахаров на

полипротеине имеет существенное значение в формировании комплексов

Е1Е2, может привести к неправильной укладке димеров и, как следствие,

сборке неинфекционного вириона, неспособного в дальнейшем

инфицировать клетку мишень. Детальное строение вириона, точный

механизм, посредством которого инфекционные частицы вируса

формируются и покидают клетку, остаются недостаточно изученными. Из-за

отсутствия приемлемых для размножения ВГС клеточных культур, до сих

8

пор до конца не выяснены ни природа вирусной частицы, ни роль структурных белков в морфогенезе вируса. В этой связи необходимы исследования, направленные на изучение морфогенеза ВГС. Значительный интерес представляет исследование гликозилирования гликопротеинов вируса, исследование роли "Ы-связанных гликанов в функционировании белков оболочки ВГС, участвующих в формировании вирусных частиц.

Перспективным подходом к изучению морфогенеза ВГС является высокоэффективная бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих, позволяющая получать самособирающиеся, нереплицирующиеся, лишенные генома частицы, морфологически сходные с интактными вирионами. Такие генетические модификации, как сайт-направленный мутагенез, ведущий к удалению сайта посадки Сахаров, позволяют уточнить влияние отдельно взятого гликана на стабильность гликопротеина, его сворачивание, гетеродимеризацию, на сборку вирусной частицы, на способность частицы связываться с поверхностью клетки мишени, выявить роль гликана в репликации вирусного генома.

До сих пор были охарактеризованы гликаны ВГС генотипов 1а и 2а в модельных системах псевдочастиц и в системе с использованием самореплицирующейся РНК. Выявлены значительные различия в функциях отдельных гликанов в пределах различных генотипов и различных модельных системах. Данных по характеристике Сахаров гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС генотипа 1Ь, с использованием модели формирования вирусоподобных частиц в клетках эукариот, до настоящего времени не было.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлось исследование гликозилирования вирусных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С (генотип 16 штамм 2749331Ш), изучение роли 1Ч-связанных гликанов в функционировании белков оболочки ВГС, участвующих в формировании вирусных частиц.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. Создать набор векторных конструкций, содержащих точечные мутации в сайтах N-гликозилирования белков El и Е2 вируса гепатита С, для экспрессии мутантных белков в клетках насекомых и млекопитающих.

2. Разработать условия эффективной экспрессии структурных белков и вирусоподобных частиц ВГС, содержащих точечные мутации в сайтах N— гликозилирования белков El и Е2 ВГС, в клетках насекомых и млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии

3. Исследовать влияние N-связанных гликанов гликопротеинов оболочки вируса гепатита С на их экспрессию, процессинг и формирование вирусоподобных частиц в клетках насекомых и млекопитающих.

4. Провести расчет оптимальной геометрии молекулы белка Ele разным количеством и расположением гликанов методом молекулярной динамики в программе HyperChem для получения компьютерных моделей пространственной структуры мутантных белков El.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Геномная организация вируса гепатита С.

Семейство вирусов Flaviviridae делится на три вида: флавивирусы, пестивирусы и гепатовирусы. Представителями вида флавивирусов являются: вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Денге, японский энцефалит и клещевой вирусный энцефалит. К пестивирусам относят вирус диареи скота, вирус классической лихорадки и вирус пограничной болезни овец. К гепатовирусам, помимо вирусов гепатита А, В, D, Е, G относится и вирус гепатита С с семью генотипами и множеством субтипов [4]. О вирусе гепатита В известно с 1963 года, а о вирусе гепатита А - с 1973. Тогда же был обнаружен неизвестный, не относящийся к вирусам гепатита А и В, вирус, вызывающий посттрансфузионный гепатит у пациентов, которым переливали кровь от доноров, не зараженных известными вирусами, инфицирующими организм. Данный вирус был назван вирусом гепатита non-A-non-B (ни-А-ни-Б). В 1987 году Michael Houghton, Qui-Lim Choo и George Kuo использовали методы молекулярного клонирования для идентификации неизвестного вируса. У больных, зараженных гепатитом ни-А, ни-Б, было выявлено наличие вирусной РНК, характерной для флавивирусов. Последующие исследования позволили идентифицировать обнаруженную РНК и в 1989 году вирус гепатита non-A-non-B переименовали в вирус гепатита С [5,6].

HCV (ВГС) отнесли к роду Hepacivirus, семейства Flaviviridae. Члены семейства Flaviviridae имеют, близкую организацию генома и вирусные характеристики. Все они являются оболочечными вирусами, вирионы которых заключены в липидный бислой, в котором заякорены один либо два обол очечных протеина. Оболочка в виде липиднго бислоя с белками El и Е2 окружает нуклеокапсид, состоящий из многочисленных копий небольшого

белка кор (С или core) и геномной РНК. Геном вирусов Flaviviridae представляет собой положительную цепь РНК размером от 9.6 до 12.3 т.п.н. с открытой рамкой считывания (ORF), кодирующую единственный полипротеиновый предшественник, длиной от 3000 аминокислотных остатков, который под действием клеточных и вирусных протеаз расщепляется на зрелые функциональные вирусные белки. На N-конце полипротеина располагаются структурные белки, на С-конце -неструктурные. Консервативные последовательности РНК-зависимой РНК полимеразы среди всех вирусов семейства Flaviviridae, располагаются на аналогичных местах [7]. ORF на 5' и 3' концах фланкирована нетранслируемыми районами (UTR) длиной в 95-555 и 114-624 п.н. соответственно, играющими важную роль в трансляции полипротеина и репликации РНК (Рис.1) [8].

1800

3600 -р_

5400 -1-

7 го о —I—

0000 I

10800

Вирус Гепатита С 5'UTR

С Е1 Е2 Го NS2

Е

NS3

NS5A

NS5B

34JTR

Пестивирус 5'UTR ,

—| С ЕО Е1 Е2 IMS2 NS3 [g NS4B NS5A

3'UTR

NSSB

У

Вирус желтой лихорадки 5'UTR

ер - С ^ Е HS1 12А 2D NS3 NS4A [>В NS5

3'UTR

Рис.1. Схемы организации геномов гепатовируса (ВГС), пестивируса и флавивируса (вирус желтой лихорадки).

Несмотря на родственное сходство с представителями семейства

Мт^шУ/^аг, ВГС обладает определенными различиями. Этот вирус имеет

узкую специфичность к хозяину и ограниченный тканевый тропизм. Вирус

гепатита С передается редко, не более, чем в 5% случаев. Основной механизм

инфицирования вирусом — гематогенный, парентеральный (прямой контакт с

12

помощью крови). Флавивирусы переносятся москитами и клещами и поражают позвоночных широкого спектра, в том числе людей, не участвующих в вирусном распространении. Ни один из известных пестивирусов не способен инфицировать человека. Инфекции, вызванные флавивирусами, являются преходящими у позвоночных, тогда как инфекции, вызванные вирусом гепатита С, имеют высокий процент трансформации в хронику у людей. Флавивирусы и пестивирусы вызывают сильный адаптивный гуморальный и клеточный иммунный ответ на инфекцию, в то время как гепатит С вызывает иммунный ответ, который не в состоянии предотвратить хроническое заболевание и, в большинстве случаев, не способен защитить от повторного заражения [9]. Flaviviridae транслируются с помощью кэп-последовательности 5'UTR(m7GpppAmp), расположенной после консервативной AG последовательности и относительно коротким участком перед полипротеин-кодирующей области [10]. 5'UTR ВГС не содержит последовательности кэпа и, также как и пестивирусы, формирует комплекс РНК с частью кор-кодирующего домена, образуя внешний сайт посадки рибосомы (IRES), который является непосредственным местом прикрепления 40S субъединицы рибосомы и клеточных факторов трансляции. В то время как 3'UTR флавивирусов высоко структурирован, 3'UTR ВГС менее структурирован, относительно короткий и содержит полиуридиновый участок варьирующейся длины. На рис.2 представлена схема геномной организации ВГС.

А

IRES

о

5-

П.Н. 341 573 576 1089 81 651 1893 162 783 1341 1773

- З'-ОН

139

Н > i Иг 9 у * 7 \ 7

с И Е2 Р7 NS2 N53 NS4A NS4B NS5A RdRp

И

ф Сигнальная пептидаза У NS2/NS3 протеаза V NS3 протеаза

Рис.2. А - схема геномной организации ВГС и Б - схема процессинга полипротеина.

Стрелки обозначают места разрезания полипротеина клеточными и вирусными протеазами.

1.1.1. Нетранслируемые области

5'UTR Структура 5'URT геномной РНК ВГС содержит 341 п.н. и располагается перед инициирующим кодоном трансляции ORF. Это наиболее консервативный район генома [11]. 5'UTR содержит высокоструктурированные домены, включающие различные петли и псевдоузлы [12,13]. Определенные домены вместе с нуклеотидами кор— кодирующей области (с 12 п.н. по 30 п.н.) образуют IRES [14]. IRES геномной РНК ВГС формирует стабильный инициирующий комплекс, непосредственно связывающий 40 S субъединицу рибосомы без дополнительных трансляционных инициирующих факторов. 5'UTR содержит сигналы репликации отрицательной цепи РНК, являющейся промежуточной РНК [15]. Показано, что микроРНК гепатоцитов MiR—122, характерная для клеток печени, связывается с 5'UTR, регулируя репликацию и трансляцию ВГС [16].

3'UTR Область 3'UTR РНК ВГС содержит 225 п.н., состоит из трех участков: вариабельного участка 30-40 п.н., протяженного poly(U)— poly(U/UC) и высококонсервативной области З'Х, длиной 98 п.н. [17,18,19]. 3'UTR взаимодействует с NS5B RdRp и со структурами, расположенными на 3' конце последовательности NS5B [20]. С репликацией РНК связаны З'Х— область и последовательность длиной 52 п.н., располагающаяся выше участка poly(U/C) [21].

1.1.2. Белки ВГС.

Открытая рамка считывания ВГС содержит от 9024 до 9111 п.н. в

зависимости от генотипа. Геном кодирует 11 вирусных белков, структурные

(кор, El, Е2), белок р7, функции которого до конца не определены,

14

неструктурные (N82, N83, №4А, N8413, №5А и Ш4В) и 'Т"белки, которые могут образовываться при смещении рамки считывания в районе кор-белка. Функции белков в жизненном цикле вируса представлены в таблице 1.

Таблица 1. Белки ВГС и их функции в жизненном цикле вируса.

Белки ВГС Функции Молекулярная масса(кДа)

Кор Формирует нуклеокапсид 23 (предшественник) 21 (зрелый)

Р/АЯТ ? 16-17

Е1 Оболочечный Содержит домен связывания 33-35

Е2 Оболочечный Содержит домен связывания Связывание с рецептором 70-72

р7 Ионно-кальциевый канал 7

N82 N82-3 автопротеаза 21-23

N83 Компонент N82-3 и протеаз ШТаза/хеликаза 69

Ш4А протеазный кофактор 6

Ш4В Индуктор мембранной сети 27

Ш5А Репликация РНК за счет формирования репликативного комплекса 56(базальная форма) 58(гиперфосфорилированная форма)

Ш5В РНК-зависимая РНК-полимераза 68

1.1.2.1. Структурные белки.

Кор белок ВГС, структурный белок капсида — РНК связывающий белок,

формирующий вирусный каисид, расположен на N-конце полипептида.

Предшественник зрелого кор-белка, формирующийся после действия

клеточных пептидаз (191 а.к., 23кДа (р23)) подвергается созреванию. В

результате созревания образуются различные формы белка 17 — 23 кДа (р17 -

р23), однако вирусная частица формируется из основного продукта 21кДа

(р21) [22]. Аминокислотная последовательность кор белка содержит три

области: N-концевой гидрофильный домен (домен D1, 120 а.к.), С-концевой

гидрофобный домен (домен D2, 50 а.к.), и сигнальную последовательность

Е1 (последние 20 а.к. С-концевого участка р23) [23]. Домен D1 содержит

множество положительно заряженных аминокислот и способствует

связыванию кор-белка с РНК [24]. Домен D2 отвечает за связывание кор-

белка с мембраной эндоплазматического ретикулума, внешней

митохондриальной мембраной и липидными каплями [25,26]. Как мембран-

связанный, так и мембран-несвязанный кор белок способен димеризоваться

и образовывать мультимерные формы. При экспрессии в различных системах

in vitro (cell-free, клетки млекопитающих, клетки насекомых или бактерии)

кор формирует нуклеокапсид-подобные частицы [27,28,29,30,31,32]. Область

82-102 а.к. гидрофобного домена D1 содержит триптофан богатую

последовательность, которая позволяет кор белку р21 (21кДа)

димеризоваться, в то время как кор белок р23 (23кДа) не способен

формировать нуклеокапсид [33]. Согласно другим данным, область 82—102

а.к. не влияет на сборку капсида, в то время как эта роль отводится двум

участкам на N-конце корового белка в районе 68 а.к. [34]. 75

аминокислотных остатков, располагающихся на N-конце кор белка, также

способны собираться в нуклеокапсидподобные частицы [35]. Помимо

участия в формировании капсида, кор белок взаимодействует с

определенными хозяйскими белками, что, вероятно, имеет большое значение

в жизненном цикле вируса [36]. Кор белок обладает функциями,

стимулирующими рост гепатоцитов путем регуляции транскрипции генов,

16

ответственных за рост, способствуя прогрессированию фиброза [37,38]. Кор белок способен также регулировать активность клеточных генов с-шус и с— йэб и изменять транскрипцию вирусных промоторов вируса гепатита В или вируса БУ40 [39,40].

Белки оболочки ВГС. Гликопротеины Е1 и Е2 являются основными компонентами оболочки вириона ВГС и играют важную роль в процессе связывания и проникновения вируса в клетку [41,42].

Гликопротеины ВГС относятся к семейству трансмембранных белков с 1Ч-концевым внешним доменом и коротким С-концевым гидрофобным анкерным доменом. Трансмембранные домены гликопротеинов Е1 и Е2 ВГС состоят из двух участков гидрофобных аминокислотных остатков, разделенных коротким фрагментом, состоящим из консервативных заряженных остатков. Они участвуют в заякоривании гликопротеинов в мембране, сборке гетеродимера Е1Е2 и отвечают за локализацию в ЭР [43,44].

Трансмембранные домены (ТМ) оболочечных белков ВГС играют важную роль в сборке гетеродимера Е1Е2 [45]. Несмотря на то, что эктодомены оболочечных белков ВГС богаты пролиновыми и цистеиновыми остатками, эти аминокислотные остатки не участвуют в образовании дисульфидных связей [46]. Белок Е2 содержит также высоковариабельный участок НУЮ, в котором 80% аминокислот различаются в зависимости от генотипа [47]. Этот участок является одним из основных нейтрализующих эпитопов ВГС [48]. Несмотря на вариабельность НУШ, физикохимические свойства аминокислотных остатков, входящих в этот участок, и их конформация высококонсервативны, что говорит о важной роли НУЯ1 в жизненном цикле вируса [49].

Поскольку Е2 положительно заряжен, возможно, именно с ним происходит взаимодействие отрицательно заряженных молекул на

поверхности клетки [50,51,52]. Проникновение вириона в клетку происходит, вероятно, путем взаимодействия HVR1 Е2 с несколькими компонентами рецепторного комплекса [53,54].

Посттрансляционные модификации белков оболочки вируса происходят в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Один из наиболее общих типов модификации - это N-гликозилирование, характерно для поверхностных белков оболочечных вирусов. Добавление олигосахарида к пептиду сопряжено с его синтезом, при котором происходит частичное сворачивание белка. Е1 и Е2 - высокогликозилированы и содержат 4-5 и 1011 сайтов гликозилирования соответственно. Количество гликанов зависит от генотипа ВГС [45]. Не все потенциальные сайты N-гликозилирования могут успешно реализовываться. Показано, что сайт EIN6325, имеющий остаток аспарагина в позиции 325, не гликозилируется из-за присутствия Pro и Тгр (Asn-Trp-Ser-Pro), препятствующих присоединению олигосахарида к остатку аспарагина в позиции 325 [55]. Гликозилирование влияет на формирование функционального комплекса Е1Е2 ВГС. После гликозилирования гликопротеины могут либо димеризоваться, с образованием функциональных нековалентных комплексов, либо образовывать дисульфидные мостики и формировать агрегаты, содержащие неправильно свернутые нефункциональные белки. В образовании комплексов участвуют лектин-подобные белки шапероны кальнексин и кальретикулин и связывающий иммуноглубулин белок (BiP) [56].

Гликаны могут влиять на инфекционность вируса. Определенные гликаны гликопротеинов ВГС, в зависимости от штамма, приводят либо к частичной, либо полной потере инфекционности [57,58]. N— гликозилирование гликопротеинов ВГС, вероятно, влияет на репликацию вируса. Было показано, что мутация в сайте ЕШ5з05 снижает вирусную репликацию [58].

В результате рибосомального сдвига рамки считывания на N-конце полипротеина ВГС могут образовываться белки рамки считывания. Антитела к таким белкам были обнаружены у пациентов, больных хроническим гепатитом С [59]. Точные трансляционные механизмы, регулирующие образование белков сдвига рамки и их роль не известны, возможно, они необходимы для вирусной персистенции [60].

р 7. Полипептид р7 (63 а.к.) — интегрированный в мембрану, принадлежит к виропориновому семейству белков, действуя подобно кальциево-ионному каналу [61]. р7 содержит два гидрофобных трансмембранных домена, соединенных одним гидрофильным участком. Мутации или делеции в этих доменах приводят к подавлению инфекционности ВГС [62]. Вероятно, р7 выполняет важную функцию в жизненном цикле вируса, поскольку определенные мутации или отсутствие кодирующей области гена р7, приводят к снижению инфекционности вириона [63]. В то же время некоторые мутации в нуклеотидной последовательности гена р7 способны значительно повысить продукцию вируса [64]. Возможно, белок р7

интегрирован в мембрану вирусной оболочки ВГС [65].

1.1.2.2. Неструктурные белки.

NS2. Трансмембранный белок NS2 (21-23кДа), содержащий две сигнальные последовательности (839-883а.к. и 928-960а.к.), ответственен за ассоциацию с мембраной ЭР [66]. В комплексе с N-концевым доменом белка NS3, NS2 образует функциональную протеазу NS2-NS3, функцией которой является разрезание в позиции NS2/NS3 [67]. В результате автокатализа белок NS2, после отщепления от NS3, по-видимому, не несет самостоятельной биологической функции [68].

NS3 и NS4A. Полифункциональный вирусный белок NS3 (21—ЗОа.к.) обладает двумя каталитическими активностями. На N-конце располагается сериновый протеазный домен, а на С-конце — структурные мотивы, характерные для

РНК- хеликаз. Белки N83 обладают РНК-хеликазной и РНК-стимулируемой нуклеозидтрифосфатазной активностями [69]. N83 хеликаза-ЫТРаза способна связываться с РНК, расплетать двуцепочечные РНК и ДНК путем сочетания расплетания и гидролиза ШТ [70]. Предполагается, что при репликации РНК хеликаза N83 перемещается вдоль нуклеиновых кислот путем изменения конформации белка с использованием энергии гидролиза N7?. Кроме того, хеликазная активность N83, вероятно, регулируется протеазным доменом N83 и РНК-зависимой РНК-полимеразой №5В [71]. №4А — белок размером 54 а.к. является кофактором N83 протеиназы. N83 и №4А образуют стабильный комплекс, для формирования которого необходимы 22 ^концевых аминокислотных остатка [72]. Основной функцией №3-№4А является протеолитический процессинг неструктурнывх белков ВГС.

Ш4В. Гидрофобный белок №4В с молекулярной массой 27 кДа, являясь интегральным мембранным белком, локализован в ЭР. Поскольку протеолиз сайтов 4А/4В и 4В/5А происходит под действием вирусной цитоплазматической протеазы N83, то изначально С— и ^ концы полипептидной цепи №4В располагаются в цитоплазме, однако после процессинга транслоцируются в люмен. №4В состоит из 4 трансмембранных доменов и ^концевой амфипатической спирали, которые отвечают за взаимодействие с мембраной ЭР [73]. Функции №4В изучены крайне мало. №4В служит каркасом для формирования вирусного репликативного комплекса [74]. Предполагается, что №4В регулирует действие РНК-зависимой РНК-полимеразы №5В и индукцию интерлейкина 8, а также учавствует в ингибировании клеточного синтеза [75,76,77].

N85А (56-58кДа) представляет собой цинк-содержащий фосфопротеин. Основными сайтами фосфорилирования №5А являются остатки Серина и Треонина в центральной и С-концевой части белка: 8ег2321 и 8ег2194(р56) либо 8ег2197, 8ег2201 и/или 2204 для гиперфосфорилированной формы

20

(р58). Ы-концевая область N85А (1-30 а.к.) содержит амфипатическую альфа-спираль, которая необходима для локализации в пренуклеарных мембранах и сборки репликативного комплекса [78,79]. В белке обнаруживаются три домена (I, II и III), первый из которых (домен I) содержит нестандартный цинк-связывающий мотив, образованный четырьмя высококонсервативными цистеиновыми остатками [80]. ЗБ-структура домена I предполагает возможность связывания №5А с белком, РНК и мембраной [81]. Детали механизма регуляции репликации ВГС с помощью белка №5А неизвестны. Известно, что для формирования репликативного комплекса необходимо взаимодействие С-конца N8 5А с липидными рафтами внутриклеточных мембран [82]. N85А участвует в ингибировании интерферон-индуцируемой протеинкиназы (РКЯ), делая ВГС устойчивым к интерферону [83]. Предполагается, что №5А может взаимодействовать с №5В, регулируя его активность [84].

Ш5В. РНК зависимая РНК полимераза (65кДа) принадлежит к классу мембранных белков [85]. Его С-концевая область образует альфа-спиральный трансмембранный домен. Кристаллическая структура белка показала, что РНК зависимая РНК полимераза имеет типичную структуру правой руки, которая формируется ^концевыми аминокислотными остатками (530 а.к.) [86]. Взаимодействие между доменами белка приводит к формированию каталитического центра, обеспечивающего синтез +/-РНК ВГС [87]. №5В является основным компонентом репликативного комплекса ВГС, полный состав которого пока не определен. Полимераза способна катализировать синтез РНК по праймер—зависимому и праймер— независимому механизмам [88]. Показано, что №5В непосредственно взаимодействует с другими неструктурными белками вируса. Известно, что №5В взаимодействует с клеточными компонентами. Например, С-концевой район №5В способен взаимодействовать с ^концевым доменом 1гУАР-33 и это взаимодействие является ключевым при формировании репликативного

комплекса [89]. Для репликации вирусного генома необходим а-актинин, взаимодействующий с N8513, который, возможно, также является частью репликативного комплекса [90]. Путем связывания с убиквитин-подобным белком ИРЫС1 №5В деградирует [91].

1. 2. Жизненный цикл вируса.

Низкая эффективность репликации вируса в культуре клеток, отсутствие подходящих клеточных культур и животных моделей затрудняют исследования, направленные на изучение жизненного цикла ВГС. Современные представления о жизненном цикле ВГС представлены на рис.3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Орлова, Ольга Владимировна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Detonating a viral time bomb - the hepatitis C pandemic.// Lancet.—2013— V.381.-P.178

2. Imperiali B., O'Connor S.E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.// Curr. Opin. Chem. Biol.-1999.-V.3.-P.643-649

3. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. Involvement of endoplasmic reticulum chaperones in folding of hepatitis C virus glycoproteins.//.!. Virol— 1998.-V.72.-P.3851—3858.

4. Simmonds P., Becher P., Collett M.S., Gould E.A., Heinz F.X., Meyers G., Monath T., Pletnev A., Rice C.M., Stiasny K., Thiel H.J., Weiner A., Bukh J. Flaviviridae. In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ (eds) Virus taxonomy.//Elsevier. Oxford. -2011.-P. 1003-1020.

5. Choo Q. L., Kuo G., Weiner A. J., Overby L. R., Bradley D. W., Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.// Science.-1989.-V.244.-P.359-362.

6. Kuo G., Choo Q. L., Alter H. J., Gitnick G. L., Redeker A. G., Purcell R. H., Miyamura T., Dienstag J. L., Alter M. J., Stevens C. E. An assay for circulating antibodies to a major etiologic virus of human non-A, non-B hepatitis.// Science. -1989.-V.244.-P.362—364.

7. Miller R. H., Purcell R. H. Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups.// Proc Natl Acad Sci.-1990.-V.87.-P.2057-2061.

8. Thurner C., Witwer C., Hofacker I. L., Stadler P. F. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes.// J. Gen. Virol.-2004.-V.85.-Pl 113-1124.

9. Farci P., Bukh J., Purcell R. H. The quasispecies of hepatitis C virus and the host immune response.// Springer Semin Immunopathol.— 1997.-V.19.-P.5-26.

10. Brinton M. A., Dispoto J. H. Sequence and secondary structure analysis of the 5-terminal region of flavivirus genome RNA.// Virology-1988.-V.162.-P.290-299.

11. Choo Q. L., Richman K. H., Han J. H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby R., Barr P. J. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus.//Proc. Natl. Acad. Sci.- 1991.-V.88-P.2451-2455.

12. Brown E. A., Zhang H., Ping L. H., Lemon S. M. Secondary structure of the 5' nontranslated regions of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs.// Nucleic. Acids. Res.-1992.-V.20.-P.5041-5045.;

13. Wang C., Le S. Y., Ali N., Siddiqui A. An RNA pseudoknot is an essential structural element of the internal ribosome entry site located within thehepatitis C virus 5' noncoding region.// RNA.-1995.-V.1.-P.526-537.

14. Honda M., Ping L. H., Rijnbrand R. C., Amphlett E., Clarke B., Rowlands D., Lemon S. M. Structural requirements for initiation of translation by internal ribosome entry within genome-length hepatitis C virus RNA.// Virology —1996 — V.222.-P.31—42.

15. Friebe P., Lohmann V., Krieger N., Bartenschlager R. Sequences in the 5UTR nontranslated region of hepatitis C virus required for RNA replication.// J. Virol-2001.-V.75.-P. 12047—12057.

16. Chang J., Guo J. T., Jiang D., Guo H., Taylor J. M., Block T. M. Liver-specific microRNA miR-122 enhances the replication of hepatitis C virus in nonhepatic cells.// J. Virol—2008—V.82.-P.8215-8223.

17. Kolykhalov A. A., Feinstone S. M., Rice C. M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis C virus genome RNA.// J. Virol-1996-V.70.-P.3363-3371.

18. Tanaka T., Kato N., Cho M. J., Shimotohno K. A novel sequence found at the 3' terminus of hepatitis C virus genome.// Biochem. Biophys. Res. Commun — 1995.-V.215.-P.744-749.

19. Tanaka T., Kato N., Cho M. J., Sugiyama K., Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of the hepatitis C virus genome.// J. Virol-1996-V.70.-P.3307-3312.

20. Cheng, J. C., Chang M. F., Chang S. C. Specific interaction between the hepatitis C virus NS5B RNA polymerase and the 3' end of the viral RNA.// J. Virol.-l 999.—V.73 -P.7044-7049.

21. Friebe P., Bartenschlager R. Genetic analysis of sequences in the 3'nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication.// J. Virol.-2002.-V.76.-P.5326-5338.

22. Yasui K., Wakita T., Tsukiyama-Kohara K., Funahashi SI., Ichikawa M., Kajita T., Moradpour D., Wands J.R., Kohara M. The native form and maturation process of hepatitis C virus core protein.// J. Virol -1998-V.72(6).-P.6048-6055.

23. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., Rice C.M. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products.// J. Virol. -1993-V.67(3).-P. 1385-1395.

24. Suzuki R., Matsuura Y., Suzuki T., Ando A., Chiba J., Harada S., Saito I., Miyamura T. Nuclear localization of the truncated hepatitis C virus core protein with its hydrophobic C terminus deleted.// J. Gen. Virol.-1995.-V.76.-P.53-61.

25. Schwer B., Ren S., Pietschmann T., Kartenbeck J., Kaehlcke K., Bartenschlager R., Yen T. S., Ott M. Targeting of hepatitis C virus core protein to mitochondria through a novel C-terminal localization motif.// J. Virol—2004— V.78.-P.7958-7968.

26. Suzuki R., Sakamoto S., Tsutsumi T., Rikimaru A., Tanaka K., Shimoike T., Moriishi K., Iwasaki T., Mizumoto K., Matsuura Y. Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein.// J. Virol.-2005.-V.79-P.1271—1281.

27. Baumert T. F., Ito S., Wong D. T., Liang T. J. Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells.// J. Virol—1998—V.72-P.3827-3836.

28. Blanchard E., Brand D., Trassard S., Goudeau A., Roingeard P. Hepatitis C virus-like particle morphogenesis.//J. Virol-2002.-V.76.-P.4073^1079.

29. Blanchard E., Hourioux C., Brand D., Ait-Goughoulte M., Moreau A., Trassard S., Sizaret P.Y., Dubois F., Roingeard P. Hepatitis C virus-like particle budding: role of the core protein and importance of its Asplll.// J. Virol-2003 — V.77.-P. 10131-10138.

30. Dash S., Halim A. B., Tsuji H., Hiramatsu N., Gerber M. A. Transfection of HepG2 cells with infectious hepatitis C virus genome.// Am. J. Pathol-1997-V. 151 -P.363-373.;

31. Klein K. C., Polyak S. J., Lingappa J. R. Unique features of hepatitis C virus capsid formation revealed by de novo cell-free assembly.// J. Virol.-2004.-V.78-P.9257-9269.

32. Shimizu Y. K., Feinstone S. M., Kohara M., Purcell R. H., Yoshikura, H. Hepatitis C virus: detection of intracellular virus particles by electron microscopy.// Hepatology.-l 996.-V.23 .-P.205-209.

33. Nolandt O., Kern V., Muller H., Pfaff E., Theilmann L., Welker R., Krausslich H. G. Analysis of hepatitis C virus core protein interaction domains.// J. Gen. Virol.-l 997.-V.78-P. 1331-1340

34. Klein K. C., Dellos S. R., Lingappa J. R. Identification of residues in the hepatitis C virus core protein that are critical for capsid assembly in a cell-free system.// J. Virol-2005.-V.79.-P.6814-6826.

35. Majeau N., Gagne V., Boivin A., Bolduc M., Majeau J. A., Ouellet D., Leclerc D. The N-terminal half of the core protein of hepatitis C virus is sufficient for nucleocapsid formation.//J. Gen. Virol-2004.-V.85.-P.971-981.

36. McLauchlan, J. Properties of the hepatitis C virus core protein: a structural protein that modulates cellular processes.// J. Viral. Hepat. -2000.-V.7.-P.2-14.

37. Chou A. H., Tsai H. F., Wu Y. Y., Hu C. Y., Hwang L. H., Hsu P. I., Hsu P. N. Hepatitis C virus core protein modulates TRAIL-mediated apoptosis by enhancing Bid cleavage and activation of mitochondria apoptosis signaling pathway.// J. Immunol-2005 -V. 174.-P.2160-2166.

38. Fukutomi T., Zhou Y., Kawai S., Eguchi H., Wands J. R., Li J. Hepatitis C virus core protein stimulates hepatocyte growth: correlation with upregulation of wnt-1 expression.// Hepatology.-2005. V.41.-P. 1096-1105.].

39. Ray R. B., Lagging L. M., Meyer K., Steele R., Ray R. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis C virus core protein.// Virus. Res.-l 995 .-V.37.-P.209-220.

40. Shih C. M., Lo S. J., Miyamura T., Chen S. Y., Lee Y. H. Suppression of hepatitis B virus expression and replication by hepatitis C virus core protein in HuH-7 cells.//J. Virol-1993—V.67.-P.5823-5832.

41. Bartosch B., Dubuisson J., Cosset F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.// J. Exp. Med — 2003.-V.197.-P.633-642.

42. Nielsen S. U., Bassendine M. F., Burt A. D., Bevitt D. J., Toms G. L. Characterization of the genome and structural proteins of hepatitis C virus resolved from infected human liver.// J. Gen. Virol. -2004.-V.85.-P.1497-1507.

43. Cocquerel L., Meunier J. C., Pillez A., Wychowski C., Dubuisson J. A retention signal necessary and sufficient for endoplasmic reticulum localization maps to the transmembrane domain of hepatitis C virus glycoprotein E2.// J. Virol.-l 998.-V.72.-P.2183-2191.

44. Cocquerel L., Wychowski C., Minner F., Penin F., Dubuisson J. Charged residues in the transmembrane domains of hepatitis C virus glycoproteins play a major role in the processing, subcellular localization, and assembly of these envelope proteins.// J. Virol.-2000.-V.74.-P.3623-3633.

45. Op De Beeck A., Montserret R., Duvet S., Cocquerel L., Cacan R., Barberot

B., Le M., Penin F., Dubuisson J. The transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins El and E2 play a major role in heterodimerization.// J. Biol. Chem.-2000.-V.275 -P.31428-31437.

46. Matsuura Y., Suzuki T., Suzuki R., Sato M., Aizaki H., Saito I., Miyamura T. Processing of El and E2 glycoproteins of hepatitis C virus expressed in mammalian and insect cells.// Virology.-1994.-V.205.-P.141-150.

47. Weiner A. J., Christopherson C., Hall J. E., Bonino F., Saracco G., Brunetto M. R., Crawford K., Marion C. D., Crawford K. A., Venkatakrishna S. Sequence variation in hepatitis C viral isolates.// J. Hepatol.-1991.-V.13.-P.6-14.

48. Zibert A., Kraas W., Meisel H., Jung G., Roggendorf M. Epitope mapping of antibodies directed against hypervariable region 1 in acute selflimiting and chronic infections due to hepatitis C virus.// J. Virol-1997.-V.71.-P.4123-4127.

49. Penin F., Combet C., Germanidis G., Frainais P. O., Deleage G., Pawlotsky J. M. Conservation of the conformation and positive charges of hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein hypervariable region 1 points to a role in cell attachment.// J. Virol.-2001.-V.75.-P.5703-5710.

50. Flint M., McKeating J. A. The role of the hepatitis C virus glycoproteins in infection.//Rev. Med. Virol.-2000.-V.10.-P.101-117.

51. Rosa D., Campagnoli S., Moretto C., Guenzi E., Cousens L., Chin M., Dong

C., Weiner A. J., Lau J. Y., Choo Q. L. A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells.// Proc. Natl. Acad. Sci.-1996—V.93 — P. 1759-1763.

52. Barth H., Schafer C., Adah M. I., Zhang F., Linhardt R. J., Toyoda H., Kinoshita-Toyoda A., Toida T., Van Kuppevelt T. H., Depla E. Cellular binding of

117

hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate.// J. Biol. Chem-2003.-V.278.-P.41003-^11012.

53. Bartosch B., Verney G., Dreux M., Donot P., Morice Y., Penin F., Pawlotsky J. M., Lavillette D., Cosset F. L. An interplay between hypervariable region 1 of the hepatitis C virus E2 glycoprotein, the scavenger receptor BI, and high-density lipoprotein promotes both enhancement of infection and protection against neutralizing antibodies.// J. Virol. -V.79.-P.8217-8229.

54. Voisset C., Callens N., Blanchard E., Op De Beeck A., Dubuisson J., Vu-Dac N. High density lipoproteins facilitate hepatitis C virus entry through the scavenger receptor class B type I.// J. Biol. Chem.-2005.-V.280.-P.7793-7799.

55. Meunier J. C., Fournillier A., Choukhi A., Cahour A., Cocquerel L., Dubuisson J., Wychowski C. Analysis of the glycosylation sites of hepatitis C virus (HCV) glycoprotein El and the influence of El glycans on the formation of the HCV glycoprotein complex.//J. Gen. Virol.-1999.-V.80.-P.887-896.

56. Jones D. M., McLauchlan J. Hepatitis C virus: assembly and release of virus particles.// J..Biol. Chem.-2010.-V.285.-P.22733-22739.

57. Goffard A., Callens N., Bartosch B., Wychowski C., Cosset F.L., Montpellier C., Dubuisson J. Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins.// J. Virol.-2005.-V.79.-P.8400-8409

58. Helle F., Vieyres G., Elkrief L., Popescu C.I., Wychowski C., Descamps V., Castelain S., Roingeard P., Duverlie G., Dubuisson J. Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus envelope proteins incorporated into infectious virions.// J. Virol.-2010.-V.84-P. 11905-11915.

59. Walewski J. L., Keller T. R., Stump D. D., Branch A. D. Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame.// RNA.-2001. -V.7.-P.710-721.

60. Baril M., Brakier-Gingras L. Translation of the F protein of hepatitis C virus is initiated at a non-AUG codon in a +1 reading frame relative to the polyprotein.// Nucleic Acids Res.-2005.-V.33.-P. 1474-1486.

61. Carrere-Kremer S., Montpellier-Pala C., Cocquerel L., Wychowski C., Penin F., Dubuisson J. Subcellular localization and topology of the p7 polypeptide of hepatitis C virus.// J. Virol.-2002.-V.76.-P.3720-3730.; Gonzalez M. E., Carrasco L. Viroporins.// FEBS Lett. -2003.-V.552.-P.28-34.

62. Sakai A., Claire M. S., Faulk K., Govindarajan S., Emerson S. U., Purcell R. H., Bukh J. The p7 polypeptide of hepatitis C virus is critical for infectivity and contains functionally important genotype-specific sequences.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003 .-V. 100-P. 11646-11651.

63. Steinmann E., Penin F., Kallis S., Patel A. H., Bartenschlager R., Pietschmann T. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.//PLoS Pathog-2007.-V.3 -P. el03.

64. Russell R. S., Meunier J. C., Takikawa S., Faulk K., Engle R. E., Bukh J., Purcell R. H. Emerson S. U. Advantages of a single-cycle production assay to study cell culture-adaptive mutations of hepatitis C virus.//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. —2008—V.105.-P.4370-4375.

65. Griffin S., Stgelais C., Owsianka A. M., Patel A. H., Rowlands D., Harris M. Genotype-dependent sensitivity of hepatitis C virus to inhibitors of the p7 ion channel.// Hepatology -2008.-V.48.-P. 1779-1790.

66. Yamaga A. K., Ou J. H. Membrane topology of the hepatitis C virus NS2 protein.//J. Biol. Chem.-2002.-V.277.-P.33228-33234.

67. Grakoui A., McCourt D. W., Wychowski C., Feinstone S. M., Rice C. M. A second hepatitis C virus-encoded protease.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA—1993.-V.90.-P. 10583-10587.

68. Franck N., Le Seyec J., Guguen-Guillouzo C., Erdtmann L. Hepatitis C virus NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted for degradation to the proteasome.// J. Virol. -2005.-V.79.-P.2700-2708.

69. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., Jacobsen H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type protease required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions.// J. Virol. -1993.-V.67.-P.3835-3844.

70. Gwack Y., Kim D. W., Han J. H., Choe J. DNA helicase activity of the hepatitis C virus nonstructural protein 3.// Eur. J. Biochem. -1997.-V.250.-P.47-54.

71. Zhang C., Cai Z., Kim Y. C., Kumar R., Yuan F., Shi P. Y., Kao C., Luo G. Stimulation of hepatitis C virus (HCV) nonstructural protein 3 (NS3) helicase activity by the NS3 protease domain and by HCV RNA-dependent RNA polymerase.// J. Virol. -2005.-V.79.-P.8687-8697.

72. Satoh S., Tanji Y., Hijikata M., Kimura K., Shimotohno K. The N-terminal region of hepatitis C virus nonstructural protein 3 (NS3) is essential for stable complex formation with NS4A.// J. Virol -1995.-V.69.-P.4255-4260.

73. Elazar M., Liu P., Rice C. M., Glenn J. S.. An N-terminal amphipathic helix in hepatitis C virus (HCV) NS4B mediates membrane association, correct localization of replication complex proteins, and HCV RNA replication.// J. Virol. -2004.-V.78.-P.11393-11400.

74. Gretton S. N., Taylor A. I., McLauchlan J. Mobility of the hepatitis C virus NS4B protein on the endoplasmic reticulum membrane and membraneassociated foci.// J. Gen. Virol. -2005.-V86.-P.1415-1421.

75. Kato J., Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S. K., Shiratori Y., Omata M. Hepatitis C virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo.// J. Med. Virol. -2002.-V.66.-P. 187-199.

76. Piccininni S., Varaklioti A., Nardelli M., Dave B., Raney K. D., McCarthy J. E. Modulation of the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase activity by the non-structural (NS) 3 helicase and the NS4B membrane protein.// J. Biol. Chem. -2002—V.277.-P.45670-45679.;

77. Kadoya H., Nagano-Fujii M., Deng L., Nakazono N., Hotta H. Nonstructural proteins 4A and 4B of hepatitis C virus transactivate the interleukin 8 promoter.// Microbiol. Immunol. -2005.-V.49.-P.265-273.

78. Elazar M., Cheong K. H., Liu P., Greenberg H. B., Rice C. M., Glenn J. S.. Amphipathic helix-dependent localization of NS5A mediates hepatitis C virus RNA replication.// J. Virol.-2003.-V.77.-P.6055-6061.

79. Penin F., Brass V., Appel N., Ramboarina S., Montserret R., Ficheux D., Blum H. E., Bartenschlager R., Moradpour D. Structure and function of the membrane anchor domain of hepatitis C virus nonstructural protein 5A.// J. Biol. Chem. -

2004.-V.279.-P.40835-40843.

80. Tellinghuisen T. L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A. E., Rice C. M. The NS5A protein of hepatitis C virus is a zinc metalloprotein.// J. Biol. Chem. -2004-V.279.-P.48576-48587.

81. Tellinghuisen T. L., Marcotrigiano J., Rice C. M.. Structure of the zinc-binding domain of an essential component of the hepatitis C virus replicase.// Nature. -

2005.—V.435 -P.374-379.

82. Shi S. T., Lee K. J., Aizaki H., Hwang S. B., Lai M. M. Hepatitis C virus RNA replication occurs on a detergent-resistant membrane that cofractionates with caveolin-2.// J. Virol. -2003.-V.77.-P.416(M168.

83. Gale M. J. Jr., Korth M. J., Katze M. G. Repression of the PKR protein kinase by the hepatitis C virus NS5A protein: a potential mechanism of interferon resistance.// Clin. Diagn. Virol. -1998.-V.10.-P. 157-162.

84. Shimakami, T., Hijikata M., Luo H., Ma Y.Y., Kaneko S., Shimotohno K., Murakami S. Effect of interaction between hepatitis C virus NS5A and NS5B on hepatitis C virus RNA replication with the hepatitis C virus replicon.// J. Virol— 2004.-V.78.-P.2738-2748.

85. Ivashkina N., Wolk B., Lohmann V., Bartenschlager R., Blum H. E., Penin F., Moradpour D. The hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase membrane insertion sequence is a transmembrane segment.// J. Virol. -2002.-V.76.-P. 13 08813093.

86. Ago H., Adachi T., Yoshida A., Yamamoto M., Habuka N., Yatsunami K., Miyano M. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus.// Structure Fold Des-1999.-V.7.-P.1417-1426.

87. Lesburg C. A., Cable M. B., Ferrari E., Hong Z., Mannarino A. F., Weber P. C. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase from hepatitis C virus reveals a fully encircled active site.//Nat. Struct. Biol. -1999.-V.6.-P.937-943.

88. Bressanelli S., Tomei L., Russel A., Incitti I., Vitale R.L., Mathieu M., De Francesco R., Rey F. A. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1999.-V.96.-P.13034-13039.

89. Gao L., Aizaki H., He J. W., Lai M. M. Interactions between viral nonstructural proteins and host protein hVAP-33 mediate the formation of hepatitis C virus RNA replication complex on lipid raft.// J. Virol. -2004.-V.78-P.3480-3488.

90. Hirano M., Kaneko S., Yamashita T., Luo H., Qin W., Shirota Y., Nomura T., Kobayashi K., Murakami S. Direct interaction between nucleolin and hepatitis C virus NS5B.// J. Biol. Chem., -2003.-V.278.-P.5109-5115.

91. Lan S., Wang H., Jiang H., Mao H., Liu X., Zhang X., Hu Y., Xiang L., Yuan Z. Direct interaction between alpha-actinin and hepatitis C virus NS5B.// FEBS Lett,-2003 .-V.554.-P.289-294.

92. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S., Galli G., Falugi F., Petracca R., Weiner A. J., Houghton M., Rosa D., Grandi G., Abrignani S. Binding of hepatitis C virus to CD81.// Science.-l998.—V.282.-P.938-941.

93. Kitadokoro K., Bordo D., Galli G., Petracca R., Falugi F., Abrignani S., Grandi, G., Bolognesi, M. CD81 extracellular domain 3D structure: insight into the tetraspanin superfamily structural motifs.// EMBO J.-2001.-V.20.-P.12-18.

94. Masciopinto F., Campagnoli S., Abrignani S., Uematsu Y., Pileri P. The small extracellular loop of CD81 is necessary for optimal surface expression of the large loop, a putative HCV receptor.// Virus. Res.-2001.-V.80.-P.l-10.

95. Major M. E., Dahari H., Mihalik K., Puig M., Rice C. M., Neumann A. U., Feinstone S. M. Hepatitis C virus kinetics and host responses associated with disease and outcome of infection in chimpanzees.// Hepatology.-2004.-V.39-P. 1709-1720.

96. Flint M., Thomas J. M., Maidens C. M., Shotton C., Levy S., Barclay W. S., McKeating J. A. Functional analysis of cell surface-expressed hepatitis C virus E2 glycoprotein.// J Virol.-1999.-V.73.-P.6782-6790.

97. Drummer H. E., Boo I., Maerz A. L., Poumbourios P. A conserved Gly436-Trp-Leu-Ala-Gly-Leu-Phe-Tyr motif in hepatitis C virus glycoprotein E2 is a determinant of CD81 binding and viral entry.// J. Virol. -2006.-V.80.-P.7844-7853.

98. Owsianka A. M., Timms J. M., Tarr A.W., Brown R. J., Hickling T. P., Szwejk A., Bienkowska-Szewczyk K., Thomson B. J., Patel A. H., Ball J. K. Identification of conserved residues in the E2 envelope glycoprotein of the hepatitis C virus that are critical for CD81 binding.// J.Virol.-2006.-V.80.-P.8695-8704.

99. Helle F., Goffard A., Morel V., Duverlie G., McKeating J., Keck Z. Y., Foung S., Penin F., Dubuisson J., Voisset C. The neutralizing activity of anti-hepatitis C virus antibodies is modulated by specific glycans on the E2 envelope protein.// J. Virol. -2007.—V.81.-P.8101-8111.

100. Falkowska E., Kajumo F., Garcia E., Reinus J., Dragic, T. Hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 glycans modulate entry* CD81 binding and neutralization.// J. Virol-2007.-V.81.-P.8072-8079.

101. Cocquerel L., Kuo C.-C., Dubuisson J., Levy, S. CD81-dependent binding of hepatitis C virus E1E2 heterodimers.// J. Virol.-2003.-V.77.-P. 10677-10683.

102. Cormier E. G., Tsamis F., Kajumo F., Durso R. J., Gardner J. P., Dragic T. CD81 is an entry coreceptor for hepatitis C virus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA-2004.-V. 101 -P.7270-7274.

103. Masciopinto F., Freer G., Burgio V. L., Levy S., Galli-Stampino L., Bendinelli M., Houghton M., Abrignani S., Uematsu Y. Expression of human CD81 in transgenic mice does not confer susceptibility to hepatitis C virus infection.// Virology-2002.-V.304.-P. 187-196.

104. Levy S., Shoham T., The tetraspanin web modulates immune-signalling complexes.//Nat. Rev. Immunol. -2005.-V.5.-P. 136-148.

105. Agnello V., Abel G., Elfahal M., Knight G. B., Zhang, Q. X. Hepatitis C virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1999.-V.96.-P. 12766-12771.

106. Monazahian M., Bohme I., Bonk S., Koch A., Scholz C., Grethe S., Thomssen, R. Low density lipoprotein receptor as a candidate receptor for hepatitis C virus.// J. Med. Virol.-1999.-V.57.-P.223-229.

107. Wunschmann S., Medh J. D., Klinzmann D., Schmidt W. N., Stapleton J. T. Characterization of hepatitis C virus (HCV) and HCV E2 interactions with CD81 and the low-density lipoprotein receptor.// J. Virol.-2000.-V.74.-P. 10055-10062.

108. Chung N. S., Wasan K. M. Potential role of the low-density lipoprotein receptor family as mediators of cellular drug uptake.// Adv. Drug. Deliv. Rev.-2004.-V.56.-P. 1315-1334.

109. Beglova N., Blacklow S.C. The LDL receptor: How acid pulls the trigger.// Trends Biochem. Sci.-2005.-V.30.-P.309-317.

110. Andreo U., Maillard P., Kalinina O., Walic M., Meurs E., Martinot M., Marcellin P., Budkowska A. Lipoprotein lipase mediates hepatitis C virus (HCV) cell entry and inhibits HCV infection.// Cell Microbiol.-2007.-V.9.-P.2445-2456.

111. Kapadia S. B., Barth H., Baumert T., McKeating J. A., Chisari, F. V. Initiation of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and scavenger receptor B type I.// J. Virol. -2007.-V.81.-P.374-383.

112. Grove J., Huby T., Stamataki Z., Vanwolleghem T., Meuleman P., Farquhar M., Schwarz A., Moreau M., Owen J. S., Leroux-Roels G., Balfe P., McKeating J.

A. Scavenger receptor BI and BII expression levels modulate hepatitis C virus infectivity.// J. Virol. -2007.-V.81.-P.3162-3169.

113. Evans M. J., von Hahn T., Tscherne D. M., Syder A. J., Panis M., Wolk B., Hatziioannou T., McKeating J. A., Bieniasz P. D., Rice C. M. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry.// Nature —2007 — V.446.-P.801-805.

114. Maillard P., Huby T., Andreo U., Moreau M., Chapman J., Budkowska A. The interaction of natural hepatitis C virus with human scavenger receptor SR-Bl/Clal is mediated by ApoB-containing lipoproteins.// FASEB J. -2006.-V.20-P.735-737.

115. Barth H., Schafer C., Adah M. I., Zhang F., Linhardt R. J., Toyoda H., Kinoshita-Toyoda A., Toida T., Van Kuppevelt T. H., Depla E. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparin sulfate.// J. Biol. Chem-2003.-V.278.-P.41003-41012.

116. Yagnik A. T., Lahm A., Meola A., Roccasecca R. M., Ercole B. B., Nicosia A., Tramontano A. A model for the hepatitis C virus envelope glycoprotein E2.// Proteins.-2000.-V.40.-P.355-366.

117. Ploss A., Evans M.J., Gaysinskaya V.A., Panis M., You H., de Jong Y.P., Rice C.M., Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required for infection of mouse cells.//Nature. -2009.-V.457.-P.882-886.

118. Van Itallie C. M., Anderson J. M. Claudins and epithelial paracellular transport.//Annu. Rev. Physiol.-2006.-V.68.-P.403-429.

119. Furuse M., Hirase T., Itoh M., Nagafuchi A., Yonemura S., Tsukita S., Tsukita S. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions.//J. Cell. Biol.-l993 .-V. 123 -P. 1777-1788.

120. Benedicto I., Molina-Jimenez F., Barreiro O., Maldonado-Rodriguez A., Prieto J., Moreno-Otero R., Aldabe R., Lopez Cabrera M., Majano P. L. Hepatitis C virus envelope components alter localization of hepatocyte tight junction-associated proteins and promote occludin retention in the endoplasmic reticulum.// Hepatology.-2008.-V.48.-P. 1044-1053.

121. Liu S., Yang W., Shen L., Turner J.R., Coyne C.B., Wang T. Tight junction proteins claudin-1 and occludin control hepatitis C virus entry and are downregulated during infection to preventuperinfection.// J. Virol—2009.-V.83-P.2011-2014.

122. Brazzoli M., Bianchi A., Filippini S., Weiner A., Zhu, Q., Pizza M., Crotta S. CD81 is a central regulator of cellular events required for hepatitis C virus infection of human hepatocytes.// J. Virol.-2008.-V82.-P.8316-8329.

123. Lescar J., Roussel A., Wien M. W., Navaza J., Fuller S. D., Wengler G., Wengler G., Rey F. A. The Fusion glycoprotein shell of Semliki Forest virus: an icosahedral assembly primed for iusogenic activation at endosomal pH.// Cell.— 2001.-V. 105-P. 137—148.

124. Flint M., McKeating J. A. The role of the hepatitis C virus glycoproteins in infection.// Rev. Med. Virol.-2000.-V.10.-P.101-117.

125. Op De Beeck A., Voisset C., Bartosch B., Ciczora Y., Cocquerel L., Keck Z., Foung S., Cosset F. L., Dubuisson J. Characterization of functional hepatitis C virus envelope glycoproteins.// J. Virol.-2004.-V.78.-P.2994-3002.

126. Vieyres G., Dubuisson J., Pietschmann T. Incorporation of hepatitis C virus El and E2 glycoproteins: the keystones on a peculiar virion.// Viruses—2014 — V6.-P.1149-1187.

127. McCaffrey K., Gouklani H., Boo I.,Poumbourios P., Drummer H. E. The variable region of hepatitis C virus glycoprotein E2 have an essential structural role in glycoprotein assembly and virion infectivity.// J. Gen. Virol-2011.-V.92-P.l 12-121.

128. Hsu M., Zhang J., Flint, M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C. M., McKeating J. A. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA—2003—V. 100.-P.7271-7276.

129. Luo G., Xin S., Cai Z. Role of the 5-proximal stem-loop structure of the 5' untranslated region in replication and translation of hepatitis C virus RNA.// J. Virol.-2003.-V.77.-P.3312-3318.

130. Otto G. A., Puglisi J. D. The pathway of HCV IRES-mediated translation initiation.// Cell.-2004.-V.l 19.-P.369-380.

131. Kong L. K., Sarnow P. Cytoplasmic expression of mRNAs containing the internal ribosome entry site and 3' noncoding region of hepatitis C virus: effects of the 3' leader on mRNA translation and mRNA stability.// J. Virol.-2002.-V.76-P. 12457-12462.

132. Otto G. A., Lukavsky P. J., Lancaster A. M., Sarnow P., Puglisi J. D. Ribosomal proteins mediate the hepatitis C virus IRES-HeLa 40S interaction.// RNA.-2002.-V.8.-P.913-923.

133. Ji H., Fraser C. S., Yu Y., Leary J., Doudna J. A. Coordinated assembly of human translation initiation complexes by the hepatitis C virus internal ribosome entry site.// RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2004.-V. 101.-P. 16990-16995.

134. Ali N., Siddiqui, A. Interaction of polypyrimidine tract-binding protein with the 5' noncoding region of the hepatitis C virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation.// J. Virol—1995.-V.69.-P.6367-6375.

135. Hahm B., Kim Y. K., Kim J. H., Kim T. Y., Jang S. K. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L interacts with the 3' border of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus.// J. Virol.-1998.-V.72.-P.8782-8788.

136. Ali N., Siddiqui A. The La antigen binds 5' noncoding region of the hepatitis C virus RNA in the context of the initiator AUG codon and stimulates internal ribosome entry site-mediated translation.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.—1997.-V.94.-P.2249-2254.

137. Spangberg K., Schwartz S. Poly(C)-binding protein interacts with the hepatitis C virus 5" untranslated region.// J. Gen. Virol.-1999.-V.80-P.1371-1376.

138. Kim J. H., Paek K. Y., Ha S. H., Cho S., Choi K., Kim C. S., Ryu S. H., Jang S. K. A cellular RNA-binding protein enhances internal ribosomal entry site-dependent translation through an interaction downstream of the hepatitis C virus polyprotein initiation codon.// Mol. Cell. Biol.-2004.-V.24-P.7878-7890.

139. Zhang J., Yamada O., Yoshida H., Iwai T., Araki H. Autogenous translational inhibition of core protein: implication for switch from translation to RNA replication in hepatitis C virus.// Virology.-2002.-V.293.-P.141-150.

140. Kato J., Kato N., Yoshida H., Ono-Nita S. K., Shiratori Y., Omata M. Hepatitis C virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo.// J. Med. Virol—2002—P.66.—V. 187-199.

141. Imbert I., Dimitrova M., Kien F., Kieny M. P., Schuster C. Hepatitis C virus 1RES efficiency is unaffected by the genomic RNA 3'NTR even in the presence of viral structural or non-structural proteins.// J. Gen. Virol.-2003.-V.84.-P.1549-1557.

142. McLauchlan J., Lemberg M. K., Hope G., Martoglio B. Intramembrane proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus core protein to lipid droplets.// EMBO J.-2002—V.21.-P.3980-3988.

143. Penin F., Dubuisson J., Rey F. A., Moradpour D., Pawlotsky J. M. Structural biology of hepatitis C virus.// Hepatology.-2004.-V.39.-P.5-19.

144. Kapadia S. B., Chisari F. V. Hepatitis C virus RNA replication is regulated by host geranylgeranylation and fatty acids.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2005-V.102.-P.2561-2566.

145. Lindenbach B. D., Rice C. M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function.// Nature.-2005.-V.436.-P.933-938.

146. Bartenschlager R., Frese M., Pietschmann T. Novel insights into hepatitis C virus replication and persistence.// Adv. Virus. Res.-2004.-V.63.-P.71-180.

147. Kapadia S. B., Chisari F. V. Hepatitis C virus RNA replication is regulated by host geranylgeranylation and fatty acids.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2005.-V.102.-P.2561-2566.

148. Shi S. T., Lee K. J., Aizaki H., Hwang S. B., Lai M. M. Hepatitis C virus RNA replication occurs on a detergent-resistant membrane that cofractionates with caveolin-2.// J. Virol.-2003.-V.77.-P.4160-4168.

149. Gao L., Aizaki H., He J. W., Lai M. M. Interactions between viral nonstructural proteins and host protein hVAP-33 mediate the formation of hepatitis C virus RNA replication complex on lipid raft.// J Virol.-2004.-V.78.-P.3480-3488.

150. Egger D., Wolk B., Gosert R., Bianchi L., Blum H. E., Moradpour D., Bienz, K. Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex//. J. Virol.-2002.-V.76.-P.5974-5984.

151. Behrens S. E., Tomei L., De Francesco R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus.// EMBO J.-1996.-V.15-P. 12-22.

152. Zhong W., Uss A. S., Ferrari E., Lau J. Y., Hong Z. De novo initiation of RNA synthesis by hepatitis C virus nonstructural protein 5B polymerase.// J. Virol.-2000.-V.74.-P.2017-2022.

153. Friebe P., Boudet J., Simorre J. P., Bartenschlager R. Kissing-loop interaction in the 3' end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication.// J. Virol.-2005.-V.79.-P.3 80-392.

154. Chang K. S., Luo G. The polypyrimidine tract-binding protein (PTB) is required for efficient replication of hepatitis C virus (HCV) RNA.// Virus. Res-2006.-V.115.-P. 1-8.

155. You S., Stump D. D., Branch A. D., Rice C. M. A cis-acting replication element in the sequence encoding the NS5B RNA-dependent RNA polymerase is required for hepatitis C virus RNA replication.// J. Virol.-2004.-V.78.-P.1352-1366.

156. Murray C. L., Jones C. T., Rice C. M., Architects of assembly: roles of Flaviviridae non-structural proteins in virion morphogenesis.// Nat. Rev. Micro-2008—V.6.-P.699-708.

157. Acosta-Rivero N., Rodriguez A., Musacchio A., Falcon V., Suarez V. M., Chavez L., Morales-Grillo J., Dueñas-Carrera S.. Nucleic acid binding properties and intermediates of HCV core protein multimerization in Pichia pastoris.// Biochem. Biophys. Res. Commun-2004-V.323.-P.926-931.

158. Klein K. C., Dellos S. R., Lingappa J. R. Identification of residues in the hepatitis C virus core protein that are critical for capsid assembly in a cell-free system.// J. Virol-2005.-V.79.-P.6814-6826.

159. Kunkel M., Lorinczi M., Rijnbrand R., Lemon S. M., Watowich S. J. Self-assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis C virus core protein.// J. Virol.-2001.-V.75.-P.2119-2129.

160. Tanaka. Y., Shimoike. T., Ishii K., Suzuki R., Suzuki T., Ushijima H., Matsuura Y., Miyamura, T. Selective binding of hepatitis C virus core protein to synthetic oligonucleotides corresponding to the 5' untranslated region of the viral genome.//Virology-2000-V.270.-P.229-236.

161. Steinmann E., Brohm C., Kallis S., Bartenschlager R., Pietschmann T. Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.//J. Virol.-2008.-V.82.-P.7034-7046.

162. Adair R., Patel A. H., Corless L., Griffin S., Rowlands D. J., McCormick C. J. Expression of hepatitis C virus (HCV) structural proteins in trans facilitates encapsidation and transmission of HCV subgenomic RNA.//J. Gen. Virol-2009-V.90.-P.833-842.

163. Friebe P., Bartenschlager R. Role of RNA structures in genome terminal sequences of the hepatitis C virus for replication and assembly .//J. Virol-2009-V.83.-P.11989-11995.

164. Ishii K., Murakami K., Hmwe S. S., Zhang B., Li, J., Shirakura M., Morikawa K., Suzuki R., Miyamura T., Wakita T., Suzuki T. Trans-encapsidation of hepatitis C virus subgenomic replicon RNA with viral structure proteins.//Biochem. Biophys. Res. Commun.-2008 -V.371.-P.446-450.

165. Cristofari G., Ivanyi-Nagy R., Gabus C., Boulant S., Lavergne J. P., Penin F., Darlix J. L. The hepatitis C virus Core protein is a potent nucleic acid chaperone that directs dimerization of the viral (+) strand RNA in vitro.ll Nucleic. Acids. Res.-2004.-V.32.-P.2623-2631.

166. Boulant S., Montserret R., Hope R. G., Ratinier M., Targett-Adams P., Lavergne J. P., Penin F., McLauchlan J. Structural determinants that target the hepatitis C virus core protein to lipid droplets.// J. Biol. Chem—2006—V.281— P.2223 6-22247.

167. Boulant S., Douglas M. W., Moody L., Budkowska A., Targett-Adams P., McLauchlan J. Hepatitis C virus core protein induces lipid droplet redistribution in a microtubule- and dyneindependent manner.//Traffic-2008-V.9.-P. 1268-1282.

168. Miyanari Y., Atsuzawa K., Usuda N., Watashi K., Hishiki T., Zayas M., Bartenschlager R., Wakita T., Hijikata M., Shimotohno K. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.// Nat. Cell. Biol-2007.-V.9-P.1089-1097.

169. Masaki T., Suzuki R., Murakami K., Aizaki H., Ishii K., Murayama A., Date T., Matsuura Y., Miyamura T., Wakita T., Suzuki T. Interaction of hepatitis C virus nonstructural protein 5A with core protein is critical for the production of infectious virus particles.// J. Virol.-2008.-V.82.-P.7964-7976.

170. Lemon S. M., McKeating J. A., Pietschmann T., Frick D. N., Glenn J. S., Tellinghuisen T. L., Symons J., Furman P. A. Development of novel therapies for hepatitis C.//Antiviral Re.-2010.-V.86.-P.79-92.

171. Jirasko V., Montserret R., Appel N., Janvier A., Eustachi L., Brohm C., Steinmann E., Pietschmann T., Penin F., Bartenschlager R. Structural and functional characterization of nonstructural protein 2 for its role in hepatitis C virus assembly.// J. Biol. Chem.-2008.-V.283.-P.28546-28562.

172. Dentzer T.G., Lorenz I.C., Evans M.J., Rice C.M. Determinants of the hepatitis C virus nonstructural protein 2 protease domain required for production of infectious virus.//J. Virol.-2009.-V.83.-P. 12702-12713.

173. Yi M., Ma Y., Yates J., Lemon S. M. Trans-complementation of an NS2 defect in a late step in hepatitis C virus (HCV) particle assembly and maturation.// PLoS Pathog.-2009.-V.5.-P.el000403.

174. Luik P., Chew C., Aittoniemi J., Chang J., Wentworth P., Dwek R., Biggin P., Venien-Bryan C., Zitzmann N. The 3-dimensional structure of a hepatitis C virus p7 ion channel by electron microscopy.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2009-V.106.-P.12712-12716.

175. Serafino A., Valli M. B., Andreola F., Crema A., Ravagnan G., Bertolini L., Carloni G. Suggested role of the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum for crucial sites of hepatitis C virus replication in human lymphoblastoid cells infected in vitro.// J. Med. Virol.-2013.—V.70.-P.31—41.

176. Gibbons G. F., Wiggins D., Brown A. M., Hebbachi A. M. Synthesis and function of hepatic very-low-density lipoprotein.//Biochem. Soc. Trans-2004-V.32-P.59-64.

177. Nielsen S. U., Bassendine M. F., Martin C., Lowther D., Purcell P. J., King B. J., Neely D., Toms G. L. Characterization of hepatitis C RNA-containing particles from human liver by density and size.//J. Gen. Virol.-2008.-V.89.-P.2507-2517.

178. Corless L., Crump C. M., Griffin S. D., Harris M. Vps4 and the ESCRT-III complex are required for the release of infectious hepatitis C virus particles.// J. Gen. Virol-2010-V.91 -P.362-372.

179. Sanchez-San Martin C., Liu C. Y., Kielian M. Dealing with low pH: entry and exit of alphaviruses and flaviviruses.// Trends Microbiol—2009—V.17.-P.514-521.

180. Op De Beeck A., Cocquerel L., Dubuisson J. Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins// Journal of General Virology.-2001.-V.82.-P.2589-2595.

181. Dubuisson J. Folding, assembly and subcellular localization of HCV glycoproteins.// Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2000.-V.242.-P. 135-148.

182. Lo S.-Y., Selby M. J., Ou J.-H. Interaction between hepatitis C virus core protein and El envelope protein.// J. Virol.-1996.-V.70.-P.5177-5182.

183. Ma H.C., Ke C.H., Hsieh T.Y., Lo S.Y. The first hydrophobic domain of the hepatitis C virus El protein is important for interaction with the capsid protein.// J. Gen. Virol.-2002.-V.83.-P.3085-3092.

184. Nakai K., Okamoto T., Kimura-Someya T., Ishii K., Lim C.K., Tani H., Matsuo E., Abe T., Mori Y., Suzuki T., Miyamura T., Nunberg J.H., Moriishi K., Matsuura Y. Oligomerization of hepatitis C virus core protein is crucial for interaction with the cytoplasmic domain of El envelope protein.// J. Virol.—2006 — V.80.-P.11265-11273.

185. Takikawa S., Ishii K., Aizaki H., Suzuki T., Asakura H., Matsuura Y., Miyamura T. Cell fusion activity of hepatitis C virus envelope proteins.// J. Virol-2000.-V.74.-P.5066-5074.

186. Cocquerel L., Op de Beeck A., Lambot M., Roussel J., Delgrange D., Pillez A., Wychowski C., Penin F., Dubuisson J. Topological changes in the transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins.// EMBO Journal.-2002.-V.21.-P.2893-2902.

187. Russ W. P., Engelman D. M. The GxxxG motif: a framework for transmembrane helix-helix association.// J. Mol. Biol.-2000.-V.296.-P.911-919.

188. Michalak, J. P., C. Wychowski, A. Choukhi, J. C. Meunier, S. Ung, C. M. Rice, and J. Dubuisson. 1997. Characterization of truncated forms of hepatitis C virus glycoproteins. J Gen. Virol. 78 ( Pt 9):2299-2306.

189. Varki A., Cummings R. D., Esko J. D., Freeze H. H., Hart G. W. Essentials of glycobiology./ N.Y.-Cold Spring Harbor Laboratory Press,-2008.

190. Jarvis D. L., Summers M. D. Glycosylation and secretion of human tissue plasminogen activator in recombinant baculovirus-infected insect cells.// Mol. Cell. Biol.-1989.-V.9.-P.214-223.

191. Jarvis D. L. Humanizing recombinant glycoprotein production in the baculovirus-insect cell expression system.// Virology.-2003.-V.310 —P.l—7.

192. Dubuisson J., Duvet S., Meunier J. C., Op De Beeck A., Cacan R., Wychowski C., Cocquerel L. Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein El is dependent on the presence of a downstream sequence on the viral polyprotein.// J. Biol. Chem-2000—V.275.-P.30605-30609.

193. Helenius A., Aebi M. Intracellular functions of N-linked glycans.// Science-2001-V.291-P.2364-2369.

194. Kawar Z., Romero P. A., Herscovics A., Jarvis D. L. N-Glycan processing by a lepidopteran insect alphal,2-mannosidase.// Glycobiology-2000.—V.10.-P.347— 355.

195. Goffard A., Dubuisson J. Glycosylation of hepatitis C virus envelope proteins.// Biochimie-2003 -V.85 -P.295—301.

196. Dubuisson J., Rice C. M. Hepatitis C virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin.// J. Virol -1996.-V.70.-P. 778-786.

197. Kornfeld R., Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides.// Rev. Biochem.-1985.-V.54.-P.631-664.

198. Kalz-Fuller B., Bieberich E., Bause E. Cloning and expression of glucosidase

I from human hippocampus.// Eur. J. Biochem-1995.-V.231.-P.344-351.

199. Arendt C. W., Ostergaard H. L. Identification of the CD45-associated 116-kDa and 80-kDa proteins as the alpha-and beta - subunits of alpha — glucosidase

II .//J. Biol. Chem.-1997.-V.272.-P.13117-13125.

200. Hebert D. N., Foellmer B., Helenius A. Glucose trimming and reglucosylation determine glycoprotein association with calnexin in the endoplasmic reticulum.// Cell—1995—V. 81 -P.425-433.

201. Moremen K. W., Trimble R. G., Herscovics A. Glycosidases of the asparagine-linked oligosaccharide processing pathway.// Glycobiology.—1994 — V.4.-P.113-125.

202. Xianzong S., Donald L. J. Protein JV-Glycosylation in the Baculovirus-Insect Cell System.// Current Drug Targets.-2007.-V8.-P. 1116-1125.

203. Trimble R. B., Moremen K. W., Herscovics A. Glycosidases of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus.// In Guidebook to the Secretory Pathway, SambrookandTooze ScientificPublishers-1992-P. 185-189.

204. Weng S., Spiro R. G. Demonstration that a kifunensine-resistant alpha-mannosidase with a unique processing action on N-linked oligosaccharides occurs in rat liver endoplasmic reticulum and various cultured cells.// Biol. Chem —1993.— V.268.-P.25656-25663.

205. Herscovics A. Structure and function of Class I al,2-mannosidases involved in glycoprotein synthesis and endoplasmic reticulum quality control.// Biochemie-2001—V.83.-P.757-762.

206. Faye L., Gomord V., Fitchette-Laine A. C., Chrispeels M. J. Affinity purification of antibodies specific for Asn-linked glycans containing alpha 1-3 fucose or beta -2 xylose.// Analyt. Biochem.-l 993-V.209.-P. 104-108.

207. Gonzalez D. S., Karaveg K., Vandersall-Nairn A. S., Lai A., Moremen K. W. Identification, expression, and characterization of a cDNA encoding human endoplasmic reticulum mannosidase I, the enzyme that catalyzes the first mannose trimming step in mammalian Asn-linked oligosaccharide biosynthesis.// Biol. Chem.-l 999—V.274.-P.21375-21386.

208. Altmann F., Marz L. Processing of asparagine-linked oligosaccharides in insect cells: evidence for alpha-mannosidase II.// Glycoconj. J.-1995.-V. 12 — P.150-155.

209. Kawar Z., Jarvis D. L. Biosynthesis and subcellular localization of a lepidopteran insect alpha 1,2-mannosidase.// Insect Biochem Mol. Biol-2001 -V.31 .-P.289-297.

210. Vadaie N., Jarvis D. L. Molecular cloning and functional characterization of a Lepidopteran insect beta4-N-acetylgalactosaminyltransferase with broad substrate specificity, a functional role in glycoprotein biosynthesis, and a potential functional role in glycolipid biosynthesis.// J. Biol.Chem.-2004.-V.279.-P.33501-33518.

211. Jarvis D. L., Bohlmeyer D. A., Liao Y. F., Lomax K. K., Merkle R. K., Weinkauf C., Moremen K. W. Isolation and characterization of a class II alpha-mannosidase cDNA from lepidopteran insect cells.// Glycobiology.-1997.-V.7-P.l 13-127.

212. Staudacher E., Altmann F., Wilson I. B., Marz L. Fucose in N-glycans: from plant to man.// Biochim. Biophys. Acta.-1999.-V.1473.-P.216-236.

213. Bencurova M., Hemmer W., Focke-Tejkl M., Wilson I. B., Altmann F. Specificity of IgG and IgE antibodies against plant and insect glycoprotein glycans determined with artificial glycoforms of human transferrin.// Glycobiology — 2004.-V.14.-P.457-466.

214. Jarvis D. L., Finn E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.// Nat. Biotechnol—1996 — V.14.-P. 1288-1292.

215. Koles K., Irvine K. D., Panin V. M., Functional characterization of Drosophila sialyltransferase.// J. Biol. Chem.-2004.-V.279-P.4346-4357.

133

216. Vadaie N., Hulinsky R. S., Jarvis D. L. Identification and characterization of a Drosophila melanogaster ortholog of human betal,4-galactosyltransferase VII.// Glycobiology—2002.-V.12.-P.589-597.

217. Kawar Z. S., Van Die I., Cummings R. D. Molecular cloning and enzymatic characterization of a UDP-GalNAc:GlcNAc(beta)-R betal,4-N-acetylgalactosaminyltransferase from Caenorhabditis elegans.// J. Biol.Chem — 2002—V.277.-P.34924-34932.

218. Helenius J., Ng D. T., Marolda C. L., Walter P., Valvano M. A., Aebi M. Translocation of lipid-linked oligosaccharides across the ER membrane requires Rftl protein.// Nature-2002.-V.415.-P.447-450.

219. Joosten C. E., Shuler M. L. Effect of Culture Conditions on the recombinant Glycoprotein Expressed in Insect Cells.// Biotechnol. Progr.-2003.-V.19.-P.739-749.

220. Kasturi L., Chen H., Shakin-Eshleman S. H. Regulation of N-linked core glycosylation: use of a site-directed mutagenesis approach to identify Asn-Xaa-Ser/Thr sequons that are poor oligosaccharide acceptors.// Biochem. J .-1997-V.323 -P.415-419.

221. Segawa H., Kawakita M., Ishida N. Human and Drosophila UDP-galactose transporters transport UDP-N-acetylgalactosamine in addition to UDP-galactose.//Eur. J. Biochem.-2002.-V.269.-P. 128-138.

222. Seo N. S., Hollister J. R., Jarvis D. L. Mammalian glycosyltransferase expression allows sialoglycoprotein production by baculovirus-infected insect cells.// Prot. Expr. Purif.-2001 -V.22.-P.234-241.

223. Jarvis D.L., Howe D., Aumiller J. J. Novel baculovirus expression vectors that provide sialylation of recombinant glycoproteins in lepidopteran insect cells.// J. Virol-2001 -V.75.-P.6223-6227.

224. Hollister J. R., Grabenhorst E., Nimtz M., Conradt H. O., Jarvis D. L. Engineering the protein N-glycosylation pathway in insect cells for production of biantennary, complex N-glycans.// Biochemistry-2002.-V.41 .-P. 15093-15104.

225. Gu X., Wang D. I. Improvement of interferon-gamma sialylation in Chinese hamster ovary cell culture by feeding of N-acetylmannosamine.// Biotechnol. Bioeng.-1998.-V.58.-P.642-648.

226. Donaldson M., Wood H. A., Kulakosky P. C., Shuler M. L. Use of mannosamine for inducing the addition of outer arm N-acetylglucosamine onto N-linked oligosaccharides of recombinant proteins in insect cells.// Biotechnol. Prog.—1999.-V. 15 .-P. 168-173.

227. Joshi L., Shuler M. L., Wood H. A. Production of a Sialylated N-linked Glycoprotein.// Biotechnol. Progr.-2001 .-V. 17.-P.822-827.

228. Christlet T. H., Biswas M., Veluraja K. Acta Crystallogr.// Biol. Crystallogr-1999.-V.55.-P. 1414-1420.

229. von der Lieth C-W., Bohne-Lang A., Lohman K. K., Frank M. Bioinformatics for glycomics: status, methods, requirements and perspectives.// Brief Bioinform.-2004.-V.5.-P. 164-178.

230. Ferrari J., Gunson J., Lofgren J., Krummen L., Warner T. G. Chinese hamster ovary cells with constitutively expressed sialidase antisense RNA produce recombinant DNase in batch culture with increased sialic acid.// Biotechnol. Bioeng.-1998.-V.60.-P.589-595.

231. Trimble R. B., Moremen K. W., Herscovics A. Glycosidases of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus./ In Guidebook to the Secretory Pathway, Sambrook andTooze ScientificPublishers.-P. 185-218.

232. Chui D., Oh-Eda M., Liao Y.F. Alpha-mannosidase-II deficiency results in dyserythropoiesis and unveils an alternate pathway in oligosaccharide biosynthesis.// Cell.-l 997.-V.90.-P. 157-167.

233. Ellgaard L., Helenius A. ER quality control: towards an understanding at the molecular level.// Cell Biol.-2001.-V.13.-P.431-437.

234. Harduin-Lepers A., Vallejo-Ruiz V., Krzewinski-Recchi M. A., Samyn-Petit B., Julien S., Delannoy P. //Biochimie.-2001.-V.83.-P.727-737.

235. Kim Y. J., Varki A. Perspectives on the significance of altered glycosylation of glycoproteins in cancer.// Glycoconj. J.-1997.-V.14.-P.569-576.

236. Takahashi M., Tsuda T., Ikeda Y., Honke K., Taniguchi N. Role of N-glycans in growth factor signaling.// Glycoconj. J.-2004.-V.20.-P.207-212.

237. Hooper L.V., Wong M. H., Thelin A., Hansson L., Falk P. G., Gordon J. I. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine.// Science.-2001 .-V.291 .-P.881-884.

238. Dall'Olio F. The sialyl-alpha2,6-lactosaminyl-structure: biosynthesis and functional role.// Glycoconj. J.-2000.-V.17.-P.669-676.

239. Hollister J. R., Shaper J. H., Jarvis D. L. Stable expression of mammalian beta 1,4-galactosyltransferase extends the N-glycosylation pathway in insect cells.// Glycobiology.-1998.-V.8-P.473—480.

240. Allen S., Nairn H. Y., Bulleid N.J. Intracellular folding of tissue-type plasminogen activator: effect of disulfide bond formation on N-linked glycosylation and secretion.// J. Biol. Chem.-1995.-V.270.-P.4797-^804.

241. Whitley P., Nilsson I. M., von Heijne G. A nascent secretory protein may traverse the ribosome/endoplasmic reticulum translocase complex as an extended chain.//J. Biol. Chem.-1996.-V.271.-P.6241-6244.

242. Jefferis R. Glycosylation of recombinant antibody therapeutics.// Biotechnol Prog-2005-V.21.-P.11-16.

243. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J., Hahn Y. S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes.// J. Virol-1997-V.71.-P.697-704.

244. Dubuisson J., Hsu H. H., Cheung R. C., Greenberg H. B., Russell D. G., Rice C. M. Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis viruses.// J. Virol—1994—V.68.-P.6147-6160.

245. Trombetta E. S. Helenius A. Lectins as chaperones in glycoprotein folding.// Curr. Opin. Struct Biol—1998.-V.8.—P.587—592.

246. Wormald M. R., Dwek R.A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.// Struct, Fold Des-1999.-V.7.-P. 155-160.

247. Hutchison C. A., Phillips S., Edgell M. H., Gillham S., Jahnke P., Smith M. Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.// J. Biol. Chem-1978-V.253.-P.6551-6560.

248. Vallette F., Mege E., Reiss A., Adesnik M. Construction of mutant and chimeric genes using the polymerase chain reaction.// Nucleic Acids Res.-1989.-V.17.-P.723-733.

249. Hemsley A., Arnheim N., Toney M. D., Cortopassi G., Galas D. J. A simple method for sitedirected mutagenesis using the polymerase chain reaction.// Nucleic Acids Res.-l 989.-V. 17.-P.6545-6551.

250. Higuchi R., Krummel В., Saiki R. K. A general method of in vitro preparation and speci fi с mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions.// Nucleic Acids Res.-1988.-V.16.-P.7351-7367.

251. Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K., Pease L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction.// Gene — 1989.-V.77-P.51-59.

252. Landt O., Grunert H. P., Hahn U. A general method for rapid site-directed mutagenesis using the polymerase chain reaction.// Gene.-1990.-V.96.-P.125-128.

253. Ke S. H., Madison E. L. Rapid and effcient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.// Nucleic Acids Res-1997—V.25-P.3371—3372.

254. Друца И. JI., Кабердин В. Р., Королева О. Н., Шилов И. О. Эффективный метод направленного введения мутации в плазмиды и клонирование однотяжевых фрагментов ДНК.//Биоорган. химия.-1991.-V.17.-P. 1487—1493.

255. Latham Т., Galarza J. М., Formation of wild-type and chimeric influenza viruslike particles following simultaneous expression of only four structural proteins.// J. Virol.-2001 -V.75 -P.6154-6165.

256. Wang J.W., Roden R.B. Virus-like particles for the prevention of human papillomavirus-associated malignancies.// Expert Rev. Vaccines—2013—V.12 — P.129-141.

257. Smith G.E., Summers M.D., Fraser M.J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.// Mol. Cell. Biol — 1983.-V.3.-P.2156—2165.

258. Adang M.J., Miller L.K. Molecular cloning of DNA complementary to mRNA of the baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: location and gene products of RNA transcripts found late in infection.// J. Virol.— 1982.-V.44.-P.782-793.

259. Wickham T.J., Davis Т., Granados R.R., Shuler M.L., Wood H.A. Screening of insect cell lines for the production of recombinant proteins and infectious virus in the baculovirus expression system.// Biotechnol. Prog.-1992.-V.8.-P.391-396.

260. Liu F., Wu X., Li L., Liu Z., Wang Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles.// Successes and challenges Protein Expression and Purification.-2013.-V.90.-P. 104-116.

261. Tao P., Luo M., Zhu D., Qu S., Yang Z., Gao M., Guo D., Pan Z. Virus-like particle vaccine comprised of the HA, NA, and Ml proteins of an avian isolated H5N1 influenza virus induces protective immunity against homologous and heterologous strains in mice.// Viral Immunol.-2009.-V.22.-P.273-281.

262. Metz S.W., Gardner J., Geertsema C., Le T.T., Goh L., Vlak J.M., Suhrbier A., Pijlman G.P. Effective chikungunya virus-like particle vaccine produced in insect cells.// PLoS Negl. Trop. Dis.-2013.-V.7.-P.e2124

263. Di Martino B., Marsilio F., Roy P. Assembly of feline calicivirus-like particle and its immunogenicity.// Vet. Microbiol.-2007.-V.120.-P. 173-178.

264. Tsukamoto H., Kawano M.A., Inoue T., Enomoto T., Takahashi R. U., Yokoyama N., Yamamoto N., Imai T., Kataoka K., Yamaguchi Y., Handa H. Evidence that SV40 VP1-DNA interactions contribute to the assembly of 40-nm spherical viral particles.// Genes Cells-2007.-V.12.-P. 1267-1279.

265. Belyaev A. S., Roy P. Development of baculovirus triple and quadruple expression vectors: co-expression of three or four bluetongue virus proteins and the synthesis of bluetongue virus-like particles in insect cells.// Nucleic Acids Res.-l 993.-V.21 .-P. 1219-1223.

266. Sokolenko S., George S., Wagner A., Tuladhar A., Andrich J.M., Aucoin M.G. Coexpression vs. co-infection using baculovirus expression vectors in insect cell culture: benefits and drawbacks.// Biotechnol. Adv.-2012.-V.30.-P.766-781.

267. Chaabihi H., Ogliastro M.H., Martin M., Giraud C., Devauchelle G., Cerutti M. Competition between baculovirus polyhedrin and plO gene expressionduring infection of insect cells.// J. Virol.-1993.-V.67.-P.2664-2671.

268. Trowitzsch S., Palmberger D., Fitzgerald D., Takagi Y., Berger I. MultiBac complexomics.// Expert Rev. Proteomics-2012-V.9.-P.363-373.

269. Hitchman R.B., Possee R.D., Crombie A.T., Chambers A., Ho K., Siaterli E., Lissina O., Sternard H., Novy R., Loomis K., Bird L.E., Owens R.J., King L.A. Genetic modification of a baculovirus vector for increased expression in insect cells.// Cell Biol. Toxicol.-2010.-V.26.-P.57-68.

270. Ailor E., Betenbaugh M.J. Modifying secretion and post-translational processing in insect cells.// Curr. Opin. Biotechnol.-1999.-V.10.-P.142-145.

271. Nakajima M., Kato Т., Kanamasa S., Park E.Y. Molecular chaperone-assisted production of human alpha-l,4-N-acetylglucosaminyltransferase in silkworm larvae using recombinant BmNPV bacmids.// Mol. Biotechnol.-2009.-V.43-P.67-75.

272. Okada Т., Ihara H., Ito R., Nakano M., Matsumoto K., Yamaguchi Y., Taniguchi N., Ikeda Y. N-Glycosylation engineering of lepidopteran insect cells by the introduction of the betal,4-N-acetylglucosaminyltransferase III gene.// Glycobiology-2010.-V.20.-P. 1147-1159.

273. Palmberger D., Wilson I.B., Berger I., Grabherr R., Rendic D. SweetBac: a new approach for the production of mammalianised glycoproteins in insect cells.// PLoS C)ne.-2012.-V.7-P.e34226.

274. Hofmann C., Sandig V., Jennings G., Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors.//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1995.-V.92-P. 10099-10103.

275. Boyce F. M,. Bucher N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.//Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1996.-V.93.-P.2348-2352.

276. Shoji I., Aizaki H., Tani H. Efficient gene transfer into various mammalian cells, including non-hepatic cells, by baculovirus vectors.// J. Gen. Virol—1997-V.78.-P.2657-2664.

277. Белжеларская С. H. Бакуловирусные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых и млекопитающих.// Молекулярная биология—2011.—V45 -Р. 142-159.

278. Ни Y. С. In: Insect Viruses./ Biotechnological Applications-2006. Edited by Bonning ВС. Elsevier, NY.

279. Lee H-P., Ни Y-C. Expression Systems.// Methods Express.-2007.-P.262-276.

280. Ни Y. C., Tsai С. Т., Chang Y. J., Huang J. H. Enhancement and prolongation of baculovirus-mediated expression in mammalian cells: focuses on strategic infection and feeding.// Biotechnol Prog.-2003.-V.19.-P.373-379.

281. Clay W. C., Condreay J. P., Moore L. B. Recombinant baculoviruses used to study estrogen receptor function in human osteosarcoma cells.// Assay Drug Dev. Technol-2003 .-V. 1 .-P. 801-810.

282. Wang K. C., Wu J. C., Chung Y. C., Ho Y. C., Chang M. D., Hu Y. C. Baculovirus as a highly efficient gene delivery vector for the expression of hepatitis delta virus antigens in mammalian cells.// Biotechnol. Bioeng—2005 — V.89.-P.464-473.

283. Ramos L., Kopec L. A., Sweitzer S. M. Rapid expression of recombinant proteins in modified CHO cells using the baculovirus system.// Cytotechnol — 2002-V.38.-P.37-41.; Ames R., Fornwald J., Nuthulaganti P. BacMam recombinant baculoviruses in G protein-coupled receptor drug discovery.// Receptors Channels.-2004.-V. 10.-P.99-107.

284. Pfohl J. L., Worley J. F., Condreay J. P. Titration of KATP channel expression in mammalian cells utilizing recombinant baculovirus transduction.// Receptors Channels.-2002.-V.8.-P.99-l 11.

285. Cheng T., Xu C. Y., Wang Y. B., Chen M., Wu T., Zhang J. A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus.// World J Gastroenterol.-2004.-Vl 0.-P. 1612-1618.

286. Condreay J. P., Witherspoon S. M., Clay W. C., Kost T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector.// Proc Natl Acad Sci USA.-1999.-V.96.-P. 127-132.

287. Venkaiah B., Viswanathan P., Habib S., Hasnain S. E. An additional copy of the homologous region (hrl) sequence in the Autographa californica multinucleocapsid polyhedrosis virus genome promotes hyperexpression of foreign genes.// Biochemistry .-2004.-V.43 .-P.8143-8151.

288. Viswanathan P., Venkaiah B., Kumar M. S., Rasheedi S., Vrati S., Bashyam M. D. The homologous region sequence (hrl) of Autographa californica multinucleocapsid polyhedrosis virus can enhance transcription from non— baculoviral promoters in mammalian cells.// J. Biol. Chem.-2003.-V.278.-P.564-571.

289. Ho Y. C., Chen H. C., Wang K. C., Hu Y. C. Highly efficient baculovirusmediated gene transfer into rat chondrocytes.// Biotechnol Bioeng-2004-V.88-P.643-651.

290. Hsu C. S., Ho Y. C., Wang K. C., Hu Y. C. Investigation of optimal transduction conditions for baculovirus-mediated gene delivery into mammalian cells.// Biotechnol Bioeng.-2004.-V.88.-P.42-51.

291. Ernst W., Grabherr R., Wegner D., Borth N., Grassauer A., Katinger H. Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library.//Nucleic. Acids. Res.-1998.-V.26.-P. 1718-1723.

292. Aoki H., Sakoda Y., Jukuroki K., Takada A., Kida H., Fukusho A. Induction of antibodies in mice by a recombinant baculovirus expressing pseudorabies virus glycoprotein B in mammalian cells.// Vet. Microbiol.-1999.-V.68.-P. 197-207.

293. Facciabene A., Aurisicchio L., La Monica N. Baculovirus vectors elicit antigen-specific immune responses in mice.// J. Virol.-2004.-V.78.-P.8663-8672.

294. Abe T., Takahashi H., Hamazaki H., Miyano-Kurosaki N., Matsuura Y., Takaku H. Baculovirus induces an innate immune response and confers protection from lethal influenza virus infection in mice.// J. Immunol.-2003.-V.171.-P.l 133— 1139.

295. Gronowski A. M., Hilbert D. M., Sheehan K.C., Garotta G., Schreiber R. D. Baculovirus stimulates antiviral effects in mammalian cells.// J. Virol.—1999 — V.73.-P.9944-9951.

296. Ye G. J., Vaughan K. T., Vallee R. B., Roizman B. The herpes simplex virus 1 U(L)34 protein interacts with a cytoplasmic dynein intermediate chain and targets nuclear membrane.// J. Virol.-2000.-V.74.-P.1355-1363.

297. McCormick C. J., Challinor L., Macdonald A., Rowlands D. J., Harris M. Introduction of replicationcompetent hepatitis C virus transcripts using a tetracycline-regulable baculovirus delivery system.// J. Gen. Virol-2004—V.85 — P.429^139.

298. Nicholson L. J., Philippe M., Paine A. J., Mann D. A., Dolphin C. T. RNA interference mediated in human primary cells via recombinant baculoviral vector.// Mol. Ther.-2005.-V.l 1.-P.638-644.

299. Petit M. A., Lievre S. M., Peyrol S. S., Berthillon D. P., Ruigrok R. W., Trepo C. Enveloped particles in the serum of chronic hepatitis C patients.// Virology — 2005-V.336.-P. 144-153.

300. Picard F., Buffeteau T., Desbat B., Auger M., Pezolet M. Quantitative orientation measurements in thin lipid films by attenuated total reflection infrared spectroscopy.// Biophys. J.-1999.-V.76.-P.539-551.

301. Kirnbauer R., Booy F., Cheng N., Lowy D. R., Schiller J. T. Papillomavirus LI major capsid protein self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic.//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-1992.-V.89.-P.12180-12184.

302. Gheysen D., Jacobs E., Thiriart F. F. de C., Francotte M., Thines D., De W. M. Assembly and release of HIV—1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells.// Cell.-1989.-V.59.-P. 103-112.

303. Murata K., Lechmann M., Qiao M., Gunji T., Alter H. J., Liang T. J. Immunization with hepatitis C virus-like particles protects mice from recombinant hepatitis C virus-vaccinia infection.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A—2003.-V. 100.-P.6753-6758.

304. Steinmann D., Barth H., Gissler B., Schurmann P., Adah M. I., Gerlach J. T., Pape G. R., Depla E., Jacobs D., Maertens G., Patel A. H., Inchauspe G., Liang T. J., Blum H. E., Baumert T. F. Inhibition of hepatitis C virus-like particle binding to target cells by antiviral antibodies in acute and chronic hepatitis CM J. Virol-2004.-V.78.-P.9030-9040.

305. Ait-Goughoulte M., Hourious C., Patient R., Trassard S., Brand D., Roingeard P.

306. Lohmann V., Korner F., Koch J., Herian U., Theilmann L., Bartenschlager R. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.// Science-1999.-V.285.-P. 110-113.

307. Bartenschlager R, Lohmann V. Replication of hepatitis C virus. Replication of hepatitis C virus.//J. Gen. Virol.-2000.-V.81.-P.1631-1648.

308. Khromykh A. A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: construction and applications.// J. Virol.-1997.-V.71.-P.1497-1505.

309. Mittelholzer C., Moser C., Tratschin J. D., Hofmann M. A. Generation of cytopathogenic subgenomic RNA of classical swine fever virus in persistently infected porcine cell lines.// Virus Res.-1997.-V.51.-P.125-137.

310. Woerz I., Lohmann V., Bartenschlager R. Hepatitis C virus replicons: dinosaurs still in business?// Journal of Viral Hepatitis.-2009.-V16.-P.l-9.

311. Pietschmann T., Zayas M., Meuleman P., Long G., Appel N., Koutsoudakis G., Kallis S., Leroux-Roels G., Lohmann V., Bartenschlager R. Production of infectious genotype lb virus particles in cell culture and impairment by replication enhancing mutations.// PLoS Pathog.-2009.-V.5.-P.e 1000475.

312. Lohmann V., Korner F., Dobierzewska A, Bartenschlager R. Mutations in hepatitis C virus RNAs conferring cell culture adaptation.// J. Virol.-2001.-V.75-P.1437-1449.

313. Lohmann V., Hoffmann S., Herian U., Penin F., Bartenschlager R. Viral and cellular determinants of hepatitis C virus RNA replication in cell culture.// J. Virol—V.77.-P.3007-3019.

314. Friebe P., Boudet J., Simorre JP, Bartenschlager R. Kissing-loop interaction in the 3' end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication.// J. Virol-2005—V.79.-P.380-392.

315. Blight K. J., McKeating J. A., Rice C. M. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.// J. Virol—2002-V.76.-P. 13001-13014.

316. Zhong J., Gastaminza P., Cheng G., Kapadia S., Kato T., Burton D. R., Wieland S. F., Uprichard S. L., Wakita T., Chisari F. V. Robust hepatitis C virus infection in vitro.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2005.-V.102.-P.9294-9299.

317. Bukh J., Pietschmann T., Lohmann V. Mutations that permit efficient replication of hepatitis C virus RNA in Huh- 7 cells prevent productive replication in chimpanzees.// Proc Natl Acad Sci U S A.-2002.-V.99.-P. 14416-14421.

318. Kato T., Furusaka A., Miyamoto M., Date T., Yasui K., Hiramoto J., Nagayama K., Tanaka T., Wakita T. Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient.// J. Med. Virol.-2001.-V.64.-P.334-339.

319. Wakita T., Pietschmann T., Kato T., Date T., Miyamoto M., Zhao Z., Murthy K., Habermann A., Krausslich H. G., Mizokami M., Bartenschlager R., Liang T. J. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.// Nat. Med.-2005.-V. 11 .-P.791-796.

320. Kato T., Date T., Miyamoto M. Efficient replication of the genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon.// Gastroenterology.-2003—V. 125.-P. 18081817.

321. Scheel T. K., Gottwein J. M., Jensen T. B. Development of JFHl-based cell culture systems for hepatitis C virus genotype 4a and evidence for cross-genotype neutralization.// Proc Natl Acad Sci U S A.-2008.-V.105.-P.997-1002.

322. Jones C. T., Murray C. L., Eastman D. K., Tassello J., Rice C. M. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.// J Virol-2007.-V.81 .-P.8374-83 83.

323. Yi M., Villanueva R. A., Thomas D. L., Wakita T., Lemon S. M. Production of infectious genotype la hepatitis C virus (Hutchinson strain) in cultured human hepatoma cells.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2006.-V.103.-P.2310-2315.

324. Khromykh A. A., Varnavski A. N., Westaway E. G. Encapsidation of the flavivirus kunjin replicon RNA by using a complementation system providing Kunjin virus structural proteins in trans.//J. Virol.-1998.-V.72.-P.5967-5977.

325. Jones C. T., Patkar C. G., Kuhn R. J. Construction and applications of yellowfever virus replicons.// Virology-2005.-V.331 -P.247-259.

326. Hanna S. L., Pierson T. C., Sanchez M. D., Ahmed A. A., Murtadha M. M., Doms R. W. N-linked glycosylation of west nile virus envelope proteins influences influences particle assembly and infectivity.// J. Virol.-2005.-V.79-P. 13262-13274.

327. Pacini L., Graziani R., Bartholomew L., De Francesco R., Paonessa G. Naturally occurring hepatitis C virus subgenomic deletion mutants replicate efficiently in Huh-7 cells and are trans-packaged in vitro to generate infectious defective particles.//J. Virol.-2009.-V.83.-P.9079-9093.

328. Masaki T., Suzuki R., Saeed M. Production of infectious hepatitis C virus by using RNA polymerase Imediated transcription.// J. Virol.-2010.-V.84.-P.5824-5835.;

329. Suzuki R., Saito K., Kato T. Trans-complemented hepatitis C virus particles as a versatile tool for study of virus assembly and infection.// Virology—2012 — V.432.-P.29-38.

330. Sugiyama K., Suzuki K., Nakazawa T. Genetic analysis of hepatitis C virus with defective genome and its infectivity in vitro.ll J. Virol—2009.-V.83.-P.6922-6928.

331. Long G., Hiet M. S., Windisch M. P., Lee J. Y., Lohmann V., Bartenschlager R. Mouse hepatic cells support assembly of infectious hepatitis С virus particles.// Gastroenterology -2011 -V. 141 .-P. 1057-1066.

332. Widjojoatmodjo M. N., Van Gennip H. G., Bouma A., Van Rijn P. A., Moormann R. J. Classical swine fever virus E(rns) deletion mutants: trans-complementation and potential use as nontransmissible, modified, liveattenuated marker vaccines.// J. Virol.-2000.-V.74.-P.2973-2980.

333. Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning./ A Laboratory Manual-1982. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press.

334. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System./ Instruction Manual-1993. St. Louis, Life Technologies, Inc., Monsanto Corp. Res.

335. Белжеларская С. H., Королева Н. Н., Попенко В. В., Друца В. JL, Орлова О. В., Рубцов П. М., Кочетков С. Н. Характеристика структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, синтезированных в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы экспрессии.// Молекулярная биология.-2010.-V.44.-P. 107-119.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю искреннюю сердечную благодарность

Светлане Николаевне Белжеларской за полученные знания, помощь при проведении исследования и при написании диссертации, конструктивную критику и терпеливое руководство. Ваше обучение, советы и постоянная поддержка бесценна;

Заведующему лаборатории Петру Михайловичу Рубцову за участие и профессиональные советы при обсуждении результатов;

Валерию Львовичу Друца за участие и помощь в экспериментальной работе;

Владимиру Сергеевичу Прасолову, Павлу Владимировичу Спирину и Владимиру Ивановичу Попенко за деятельное сотрудничество;

Наконец я хотела бы поблагодарить моих коллег в Лаборатории молекулярно-генетических основ эндокринной регуляции ИМБ РАН за создание стимулирующей рабочей атмосферы.