Поиск новых внутриклеточных взаимодействий белка S100A4(MTS1) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Кошелев, Юрий Алексеевич

• Кошелев, Юрий Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кошелев, Юрий Алексеевич

Оглавление.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Литературный обзор. ФУНКЦИИ БЕЛКА МТ81(8100А4) В

НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ.

Связь экспрессии белка 8100А4(МТ81) с метастазированием опухолей.

Белок 8100А4(МТ81) - представитель семейства Б100.

Структура гена 8100А4 и регуляция его экспрессии.

Тканевая. .локализация. .8100А4.

8100А4 в гладкомышечных клетках артерий.

Роль 8100А4 в прогрессии артрита.

8100А4 в клетках нервной ткани.

Роль 8100А4 в ремоделировании внеклеточного матрикса.

Влияние 8100А4 на минерализацию костной ткани.

Внутриклеточные взаимодействия 8100А4.

8100А4 и р53.

Взаимодействие ТЦНМ ПА и 8100А4.

Другие внутриклеточные взаимодействияя 8100А4.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск новых внутриклеточных взаимодействий белка S100A4(MTS1)»

Сегодня известно, что в основе некоторых, фенотипически не похожих друг на друга - патологических, изменений? тканей млекопитающих, лежат нарушения в одних и тех же молекулярных механизмах и сигнальных путях. Обнаружение таких сигнальных путей помогает пролить свет на роль некоторых молекул, участие которых в развитии той или иной патологии на фенотипическом уровне было давно и достоверно показано; Один из таких примеров — это; белок S100A4(MTS 1), известный; маркер и индуктор инвазивности опухолевых клеток. Сегодня; активно изучается; его: роль в' развитии таких патологий, как артрит, гипертрофия миокарда, гипертрофия гладкомышечного слоя легочных артерий, почечный фиброз и др. В основе всех перечисленных патологий; лежит ненормальное ремоделирование тканей в ответ на внешние воздействия; и молекулярные механизмы регуляции?клеточной подвижности играют здесь не последнюю роль. Множество экспериментов достоверно: показали, что белок S100A4(MTS1) увеличивает клеточную подвижность, и инвазию опухолевых клеток, но; по-видимому, через те же молекулярные механизмы он может быть вовлечен в развитие указанных выше патологий, не связанных с развитием опухолей.

Две наиболее обоснованные; экспериментально; гипотезы о механизме влияния S100A4 на увеличение инвазивности клеток основаны на- его способности, во-первых, регулировать , динамику сборки-разборки миозиновых филаментов in vitro и, во-вторых, индуцировать экспрессию и секрецию активных форм; некоторых разрушающих внеклеточный матрикс металлопротеаз, как через взаимодействие с гипотетическими мембранными рецепторами- так и через активацию тканевого активатора плазминогена непосредственно на клеточной поверхности. Однако, обе эти гипотезы недостаточны для объяснения феномена индукции белком 8100А4 инвазивности опухолевых клеток. К тому же, эти гипотезы не объясняют, каким образом 8100А4(МТ81) влияет на уровень экспрессии некоторых важных с точки зрения онкологии генов: Е-кадгерина и ВшрЗ (белок семейства Ьс1-2). На наш взгляд, для 8100А4 существует, как минимум, еще один (или несколько) сигнальный путь, в котором задействованы малые ГТФазы семейств Сс1с42 и Кас1, или другие белки.

В настоящей работе мы попытались выявить новые внутриклеточные взаимодействия белка 8100А4(МТ81), которые могли бы пролить свет на его роль в указанных выше явлениях на молекулярном уровне.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было обнаружение новых внутриклеточных взаимодействий белка 8100А4(МТ81), потенциально способных влиять на увеличение инвазивности опухолевых клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать протокол проведения аффинной хроматографии с ковалентно иммобилизованным белком 8100А4(МТ81), позволяющей выявить его возможные «мишени» среди цитоплазматических белков опухолевых клеток.

2. Обнаружить и идентифицировать белки, способные селективно связываться с данным аффинным сорбентом в физиологических условиях.

3. Для наиболее интересных, с точки зрения цели исследования, белков провести дополнительные эксперименты, подтверждающие возможность их взаимодействия с белком 8100А4(МТ81).

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе выполнения работы были получены совершенно новые и оригинальные результаты. Впервые (среди опубликованных работ) была налажена методика поиска новых взаимодействий для 8100А4 на аффинном сорбенте, что позволило обойти ряд принципиальных ограничений, характерных для других методов обнаружения межбелковых взаимодействий. С помощью этого метода было обнаружено селективное взаимодействие белка 8100А4 с септиновыми олигомерами из цитоплазматической фракции клеточного лизата высокоинвазивной опухолевой линии С8МЬ-100 (карциносаркома молочной железы мыши, метастазирующая в легкие). Это взаимодействие происходит в присутствии кальция, что характерно для взаимодействия 8100А4(МТ81) с его другими известными мишенями, например, тяжелой цепью не мышечного миозина типа ПА (ТЦНМ-11А). На аффинном сорбенте выделяется олигомер (филамент) состава 8ер12/7/11 в примерном соотношении мономеров как 1:1:1, что согласуется с другими работами по межбелковым взаимодействиям септинов. Необходимым и достаточным для взаимодействия с 8100А4 является наличие септина 7 в составе олигомера 8ер12/7/11, что подтверждается в других экспериментах. Интересно, что при использовании лизата неинвазивной клеточной линии того же происхождения, С8МЬ-0 (карциносаркома молочной железы мыши, не образующая метастазов), паттерн аффинно выделяемых белков изменяется. При этом ТЦНМ-11А присутствует в обоих случаях. Клетки указанных линий отличаются не только по своему метастатическому потенциалу, но и по морфологии при выращивании в культуре. Различия в паттерне выделяемых на аффинном матриксе септинов могут отражать различия в структуре и динамике септиновых филаментов состава 8ер12/7/11 для клеток указанных линий.

Практическая ценность данной работы состоит в том, что она выявляет новую мишень для белка 8100А4 внутри клетки, предполагая его участие в совершенно новых сигнальных путях, что позволяет составить более полную картину влияния данного белка на метастатический потенциал опухолевых клеток на молекулярном уровне и точнее выявить его роль в таких процессах, как прогрессия опухолей и развитие некоторых других патологий (артрит, почечный фиброз, гипертрофия миокарда и артерий).

Литературный обзор.

ФУНКЦИИ БЕЛКА МТ81(8100А4) В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ.

Связь экспрессии белка МТ81 с метастазированием опухолей.

Сегодня осталось не так много белков, играющих ключевые роли в канцерогенезе, для которых не выявлены молекулярные механизмы их участия в этом процессе. Один из таких примеров представлен в этом обзоре - это белок МТ81 (8100А4), являющийся одним из маркеров и индукторов метастатического фенотипа опухолевых клеток. Около 20 лет назад кДНК гена, кодирующего белок 8100А4, из различных видов млекопитающих была независимо клонирована несколькими научными группами, как следствие, сам ген и белок имеют несколько названий: метастазин 1 (МТ81), рЕЬ98, р9Ка, 42А, 8100А4, САРЬ и кальваскулин [1-9].

Экспрессия нового гена интенсивно изучалась в контексте его влияния на метастатический потенциал опухолевых клеток, и, как оказалось, по прошествии десятка лет, первоначальное название, метастазин-1 (МТ81), было дано в лаборатории Г.П. Георгиева очень удачно [1]. Многочисленные иммуногистохимические исследования уровня экспрессии 8100А4 достоверно показали его увеличение в различных видах опухолей человека и прямую связь высокого уровня экспрессии этого гена с частотой метастазирования таких опухолей и низким процентом выживших пациентов. Так, например, при исследовании 350 первичных опухолей на 1-ой и 2-ой стадиях рака легкого на наличие в них белка 8100А4 [10,11] была установлена высокая степень корреляции (Р<0.0001) между наличием в опухолях данного белка и смертностью пациентов в течение 19 лет. Выживали 80% пациентов, чьи опухоли не экспрессировали 8100А4, и лишь 11% пациентов при наличии 8100А4. Связь экспрессии белка 8100А4 и метастазирования была показано для не мелкоклеточного рака легкого [12], рака предстательной железы [13], рака мочевого пузыря [14], аденокарциномы поджелудочной железы [15], первичного рака желудка [16], для некоторых меланом [17] и др.

При анализе изменений уровня генной экспрессии в клетках аденокарциномы поджелудочной железы были проскринированы кДНК 7 746 генов[18], и был обнаружен существенно (в 40 раз) более высокий уровень экспрессии гена 8100А4 относительно нормальных клеток. Аналогичные результаты были получены в эксперименте по скринингу 9 932 различных кДНК из клеточных линий агрессивных метастазирующих опухолей поджелудочной железы [19], а также в аналогичных экспериментах с опухолями иного происхождения [20]. Наконец, используя протеомный подход, был выявлен более высокий уровень экспрессии белка 8100А4 в метастазирующих линиях гепатокарциномы, по сравнению с неметастазирующими линиями того же происхождения [21].

Опыты с использованием генно-инженерных конструкций на опухолевых клеточных линиях также показали связь между экспрессией 8100А4 и приобретением метастатического фенотипа раковыми клетками. Введение конструкций, экспрессирующих 8100А4 в клетки неметастазирующей опухоли молочной железы крысы, приводило к формированию такими клетками метастазов при подкожных инъекциях их в здоровое животное [22]. В экспериментах с клетками легочной карциномы Льюиса, обладающими высокой способностью давать метастазы, было обнаружено резкое снижение их инвазивности in vitro после введения в них конструкции, экспрессирующей РНК, ингибирующую трансляцию S100A4 [23].

Эксперименты с трансгенными мышами также дают подтверждающие рассматриваемую гипотезу результаты. У мышей с введенной в геном конструкцией, экспрессирующей S100A4 под контролем специфического для молочной железы вирусного промотора, наблюдался нормальный фенотип, но при скрещивании их со штаммом GRS/A, для особей которого характерна высокая частота образования опухолей молочной железы, редко дающих метастазы, получалось потомство, страдающее метастазирующими опухолями молочной железы [24].

Приведенные факты убедительно доказывают, что белок метастазин-1 (MTS 1), обозначаемый так же, как S100A4, CAPL, pEL98, 18А2, р9Ка, 42А, CAPL, кальваскулин, является одним из индукторов формирования метастатического фенотипа опухолевых клеток.

Белок S100A4(MTS1) - представитель семейства S100.

Белки семейства S100 представляют собой маленькие (10-12 кДа), связывающие ионы кальция молекулы, существующие в виде не ковалентных параллельных (для членов семейства, чья трехмерная структура была установлена) гомодимеров (S100A4) [25]. Полипептид S100A4 состоит из 101 а. о. (аминокислотного остатка). Некоторые представители семейства могут образовывать гетеродимеры: S100A4/S100A1, S100A8/S100A9, S100A6/S100B, S100A1/S100P и т.д.). Вторичная структура для всех членов семейства однотипна и сформирована четырьмя а-спиралям, соединенными петлями сравнимой длины. Главная особенность, присущая только этому семейству кальций-связывающих белков, состоит в наличие двух связывающих ионы кальция доменов (на мономер) типа EF-руки, одна из которых типична для ряда других семейств и состоит из 12 аминокислотных остатков (KD = 10-50 jaM) [25], располагаясь ближе к С-концу мономера, а другая, находящаяся на N-конце, состоит из 14 аминокислотных остатков и считается псевдо EF-рукой, связывающей ионы кальция гораздо менее прочно (KD = 200-500 |аМ). Псевдо EF-рука сформирована петлей между а-спиралями 1 и 2, а каноническая EF-рука - петлей между а-спиралями 3 и 4 (Рис.1) [25]. Первичная последовательность белков семейства S100 идентична на 25-65%, в зависимости от сравниваемой пары белков. Основная масса различий находится в линкере, соединяющем EF-руки и на протяженном С-конце. Связывание ионов кальция псевдо EF-рукой приводит лишь к незначительным конформационным изменениям в структуре молекулы S100, тогда как связывание ионов кальция канонической EF-рукой приводит к повороту спирали 3 относительно спирали 4 и делает более доступными гидрофобные аминокислотные остатки спирали 3 и 4, а также протяженного С-концевого региона. Гидрофобные остатки в петле 4, особенно F72 , Y75, F78 и L79 важны для формирования интерфейса димеризации, которая происходит in vitro с Kd = 1-2 мкМ [26]. Для S100A4 С-концевой регион существенно отличается по первичной последовательности от такового у других членов семейства S100, и, по-видимому, имеет наибольшее значение для узнавания специфического для S100A4 набора белков-мишений [27].

C-terminal loop

C'-terminal loop

Рис.1 Вторичная структура димера белка 8100А4 по данным спектроскопии ЯМР [25].

Структура гена 8100А4 и регуляция его экспрессии.

Из 25 обнаруженных на сегодня у человека генов семейства Б100, 21 (8100А1-8100А18, йсЫЛуНп, Ыа^^пп и герейп) образуют кластер, находящийся в хромосомном локусе 1ц21. В геноме мыши аналогичный кластер генов находится в локусе 3£3. Ген 8100А4 находится между генами 8100АЗ и 8100А5. Секвенирование гена т1з1 человека показало, что он состоит из трех интронов и четырех экзонов, из которых первые два не кодируют аминокислотной последовательности, а у мыши ген т/^У состоит из трех экзонов и двух интронов [28]. Первый экзон гена т1ь1 у мыши мал и тоже не кодирует транслируемой последовательности, а все цис-регуляторные элементы были найдены в первом интроне (Рис.2). Среди них оказались как хорошо известные негативные и позитивные регуляторы, так и новые регуляторные элементы [29-31].

Рис.2 Расположение регуляторных элементов в первом интроне Оказалось, что первый элемент АР-1 метилирован в клетках неметастазирующей линии СБМЬ-О, не экспрессирующих МТ8-1, и представляет собой в метилированном состоянии негативный регуляторный элемент умеренной силы, связывающий белки семейства .Тип и Боб [30]. В клетках линии СЭМЬ-ЮО, обладающих высокой способностью давать метастазы и высоким уровнем экспрессии МТ8-1, этот сайт не метилирован и не активен [30]. Непосредственно перед сайтом АР-1 был обнаружен защищенный в клетках линии С8МЬ-100, но не в клетках линии СЭМЬ-О, участок длиной в 16 пар нуклеотидов, обладающий энхансерной активностью [29]. Однако, связывающиеся с этим участком белки не были идентифицированы.

Основной регуляторный элемент, в 40 раз повышающий уровень экспрессии репортерного гена, находящийся в первом интроне между нуклеотидами +780 и +916, представляет собой сложную мозаику сайтов, обладающих разнонаправленным влиянием на уровень эксперссии гена (рис. 3) [32].

ОТкВ + р2 0 О/КИС к=э1 +ЛА

Ар1 МэЬр СВБ АР1 (РгаЛипБ) kB Sa Sp1-J AP2 Sp-Ml

TM 7M ?»• 117 »a« IM MX 444 »4« III «44

CBF Sp1-Ill API

GQGCCAGGGCCTGGTQC7frGTGGT^GAGCT(3^GGGAC^GAQTAAGCTQA.TgG i i i III Г I s из ■■• m toa im ioi

Рис. 3. Строение основной части регуляторного элемента, расположенного в первом интроне гена mtsl(Cohn 2001) [32].

Первым на этом участке расположен элемент, подобный по своей последовательности сайту для NF-kB. Этот сайт действительно связывает гетеродимеры белков NF-kB/ Reí: р50/р50 и р50/р65, а также белок р200 [31]. Однако, введение точечных замен в этот сайт, отменяющих связывание белков NF-kB/Rel: р50/р50 и р50/р65, не влияло на активность энхансера, тогда как мутации, отменяющие связывание белка р200, лишали этот элемент энхансерной активности, причем in vivo данный сайт был защищен только в клетках линии CSML-100, но не в клетках линии CSML-0, не экспрессирующих MTS1 [31]. Позднее было показано, что р200 представляет собой ДНК-связывающий белок, KRC, из семейства ZAS [33].

Через 10 пар нуклеотидов от сайта связывания KRC расположен участок +810-839, обозначенный как Sa, защищенный от метилирования в обеих упоминавшихся выше клеточных линиях. С этой последовательностью могут взаимодействовать белки семейства Msbp. В экспериментах с репортерными конструкциями, в которых область +801-830 была удалена, не было замечено каких-либо значимых изменений уровня экспрессии гена-репортера при транзиторных трансфекциях, но было обнаружено уменьшение этого уровня в стабильно трансфицированных клонах [34]. Каким образом эта последовательность влияет на активность целого энхансера, не препятствуя связыванию КРС [32], остается невыясненным.

Все три сайта 8р1, несмотря на наличие одной замены относительно консенсусной последовательности, связывают белки 8р1 и 8рЗ из ядерных белковых экстрактов обеих клеточных линий, однако, при транзиторных трансфекциях репортерных конструкций на энхансерную активность в клетках линии С8МЬ-100 существенное влияние (в 6 раз) оказывает лишь сайт 8р1-1, а в клеточной линии С8МЬ-О — сайт8р1-П [32]. По данным тех же авторов, сайт АР-2 не вносит заметного вклада в активацию транскрипции гена гг^! в указанных клеточных линиях, так как уровень экспрессии белков-активаторов, связывающихся с этим сайтом, там очень низкий.

В положении +880-891 находится сайт связывания белка СВР, представляющего гетеродимер, состоящий из повсеместно представленной Р-субъединицы и набора различных а-субъединиц, кодируемых тремя различными генами, СВРА1, СВБА2 и СВР АЗ [35]. В клетках линии С8МЬ-100 с этим регуляторным элементом взаимодействует гетеродимер СВРА1-СВРР, повышая на 50% энхансерную активность участка +782-916, тогда как в клетках линии С8МЬ-0 субъединицы СВРА1 и СВРА2 не экспрессируются на детектируемом уровне, и данный регуляторный элемент не работает [32]. Последним в данном энхансере является сайт АР-1 в положении +902-908. Он активно работает в клетках линии С8МЬ-100, где высок уровень экспрессии белков Рга-1, Рга-2 и .Тип-Б, в отличие от клеток линии С8МЬ-0, где уровень экспрессии указанных белков низок, причем синхронная экспрессия белков СВРА1 и Рга-1 в клетках линии CSML-0 при1 их оптимальном соотношении в 6 раз увеличивает уровень экспрессии репортерного гена в конструкции, содержащей участок энхансера +782-916 [32].

Наконец, следует упомянуть о белке-репрессоре Каизо, связывающем симметрично метилированные цитозины в последовательности CGCGCCCAACG, находящейся в положении +837-847 в энхансере гена mtsl [36]. Поскольку его связывание в данном случае опосредованно метилированием, прямого влияния на экспрессию он, очевидно, не оказывает.

Совсем недавно появились неоспоримые доказательства влияния сигнального пути через комплекс, связанный с Е-кадгерином, на репрессию гена mtsl, которое давно предполагалось, исходя* из работы японских авторов [37], показавших семикратное уменьшение количества мРНК гена mtsl в клетках опухолевой линии G-415 GB (рак мочевого пузыря) после трансфекции в них экспрессирущей Е-кадгерин конструкции. Был обнаружен новый регуляторный элемент, находящийся в положении -671- -673 (TTTTGTT), связывающий комплекс Р-катенина с TCF, что приводит к резкому увеличению уровня экспрессии S100A4 и, как следствие, к увеличению подвижности in vitro и инвазивности in vivo опухолевых клеток [38]. Эта работа настолько корректная и ясная, что выводы, сделанные в ней, не вызывают никаких сомнений.

Интерес представляет также влияние транскрипционного фактора CBFA-1, отвечающего за дифференцировку остеобластов и уровень минерализации соединительной ткани [39]. В периодонтальном лигаменте экспрессия S100A4 через неустановленный молекулярный механизм предотвращает минерализацию этой ткани [40], но при этом уровень экспрессии таких генов как CBFA-1 и Osx, необходимых для минерализации, остается неизменным [41]. Как согласуется активирующее экспрессию S100A4 действие CBFA-1 с ингибирующим минерализацию влиянием самого S100A4, остается непонятным. Очевидно, что потребуется целый ряд экспериментов, чтобы понять в деталях, через какие молекулярные механизмы внешние сигналы управляют в разных тканях уровнем экспрессии гена mtsl, и как сам S100A4 способен регулировать экспрессию других генов.

Тканевая локализация S100A4.

Сегодня о тканевой специфичности экспрессии гена mtsl известно, если не все то очень многое: Пожалуй, самым логичным выглядит его высокий уровень экспрессии в клетках способных к активному перемещению в организме: Т-лимфоцитах, макрофагах, гранулоцитах [42, 43]. S100A4 обнаружен в астроцитах белого вещества [44], фибробластах периодонтального лигамента [40]; кератиноцитах различных эипдермальных тканей [45, 46], гладкомышечных клетках [47], дифференцирующихся мезенхимальных клетках [41, 46, 48]. Главной-задачей в каждом из перечисленных случаев является обнаружение сигнальных путей с участием S100A4.

S100A4 b гладкомышечных клетках артерий.

S100A4 был обнаружен во внеклеточном пространстве гладкомышечного слоя стенки аорты быка, где он был распределен вдоль фибрилл тропоэластина, взаимодействуя с гликопротеином MAGP-36 [47]. Данный* гликопротеин гомологичен порцину и взаимодействует с S100A4 in vitro в присутствии ионов кальция [47]. Гладкомышечные клетки аорты в культуре проявляли способность конститутивно секретировать S100A4 [47]. Какое биологическое значение: в,данной ткани имеет секреция S100A4 до настоящего времени не известно.

Экспрессия S100A4 была обнаружена в. гладкомышечном* слое легочной артерии, а также внутренних артерий? легких в ответ на длительную гипоксию, которая сопровождалась утолщением интимы артерий за счет гиперплазии гладкомышечных клеток [49]. Ранее было показано, что такого рода патологические изменения в стенках артерий, вызванные хроническим воспалением, различной этиологии, можно существенно уменьшить, блокируя сигнальный путь через: RAGE [50]. Развитию подобной патологии в легочной артерии приводит также чрезмерная активация сигнального пути через серотониновый рецептор и транспортер серотонина (SERT) [51], которые в норме экспрессируются в гладкомышечных клетках артерий. Было установлено; что стимуляция культивируемых клеток PDGF (10 нг/мл), либо рекомбинантным S100A4 (500 нг/мл или 25 нМ), либо серотонином (10 мМ) приводит к семикратному увеличению скорости пролиферации клеток и к двукратному увеличению их подвижности in vitro относительно контроля. При этом добавление серотонина (10 мМ) приводит к повышению концентрации внеклеточного S100A4 в 2 раза; а уровень мРНК S100A4 увеличивается в 3.5 раза относительно контроля. Активность серотонинового транспортера также необходима для увеличения уровня экспрессии S100A4. Авторы, полагают, что секретируемый: S100A4 действует на RAGE (Reseptor for Advanced Glycasion End products); аутокринно или паракринно, что приводит к повышенной: пролиферации и подвижности гладкомышечных клеток [51]: Однако' следует учесть, что в норме гладкомышечные клетки артерий экспрессируют другой лиганд RAGE, относящийся к семейству белков S100, - белок S100B, и уровень его экспрессии возрастает по мере прогрессии патологического разрастания гладкомышечного слоя стенок артерий, причем это разрастание ингибируется выключением тем или иным способом сигналов через RAGE [50]. В культуре гладкомышечных клеток S100B сходным образом влияет на их миграцию и пролиферацию [50]. Возможность действия S100A4 на сигнальный путь через RAGE была показана при исследовании молекулярных механизмов, лежащих в основе развития артрита.

Роль S100A4 в прогрессии артрита.

Было обнаружено, что S100А4 экспрессируется в синовиальных фибробластах больных ревматоидным артритом, детектируется в их синовиальной жидкости [52], а также в хондроцитах хряща больных остеопоритом, причем уровень его экспрессии возрастает по мере прогрессии патологии, но не детектируется в норме [48]. Исследования, выполненные на культуре синовиальных фибробластов, выделенных из биопсийного материала больных ревматоидным артритом, показали, что при добавлении в культуральную среду олигомерной формы рекомбинантного S100A4 в концентрациях 1-4 мкг/мл происходит увеличение в 4-8 раз уровня мРНК металлопротеаз ММР-1, ММР-3, ММР-9, ММР-13 [52].

В культуре таких хондроцитов внеклеточный рекомбинантный S100A4 стимулировал увеличение уровня экспрессии активной металлопротеазы ММР-13 [48]. Действие S100A4 почти полностью блокировалось добавлением в среду 10 мкг/мл растворимой формы RAGE (sRAGE) или МпТВАР (250 мкМ), ингибитора активных форм кислорода (ROS) [48]. Стимулирование хондроцитов белком S100A4 приводило к быстрому, детектируемому уже через 15-30 минут, повышению уровня фосфорилирования таких киназ, как. ERK 1/2, р38, Рук2 и JNK , а позднее белка; NF-kB [48]. Интересно, что фосфорилирование киназы Pyk2, ERK 1/2, белка NF-kB (р65), а.также индуцированный белком S100A4 синтез ММР-13 блокировались ингибитором высвобождения внутриклеточного кальция, ВАРТА-АМ, но не нифедипином, блокатором потенциалзависимых кальциевых каналов [48]. Индукция ММР-13 блокировалась также ингибиторами МАР-киназ РВ 98059 и SP-600125. Эти факты могут свидетельствовать о более сложном, чем только через активацию RAGE, сигнальном» пути, задействованном в данной системе, где пресекаются- сигналы, приводящие к образованию ROS, выходу внутриклеточного кальция и активации МАР-киназ.

Методом ко-преципитации было показано, что RAGE из лизата описанных выше хондроцитов может взаимодействовать с S100A4, и это взаимодействие блокируется добавлением в среду избытка растворимой формы рецептора, sRAGE [48]

Следует особенно подчеркнуть, что в данной работе использовались хондроциты больных остеопоритом людей, и не ставился параллельный эксперимент с хондроцитами здоровых. Дело в том, что противоречия, наблюдаемые при использовании разных модельных систем; где либо выявлено непосредственное взаимодействие S100A4 с RAGE на фоне активации данного сигнального; пути, либо - нет, можно объяснить наличием полиморфизма данного рецептора в сайте,.связывающем лиганд, как это показано для S100A12, уровень экспрессии которого повышен в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом, но не обнаруживается у больных остеоартритом, причем уровень экспрессии этого белка хорошо корелирует со степенью развития патологии [53]. У данных больных обнаруживается вариант RAGE с заменой G82S в сайте, связывающем лиганд, что приводит к повышению аффинности взаимодействия S100A12 с таким вариантом рецептора и увеличивает воспалительный ответ, а индивиды с таким генетическим вариантом RAGE являются предрасположенными к развитию ревматоидного артрита [54]. Возможно, что S100A4 эффективно взаимодействует лишь с некоторыми полиморфными вариантами этого рецептора, способствуя развитию патологии, но не оказывает влияния в норме.

S100A4 в клетках нервной ткани.

Экспрессия S100A4 была детектирована иммуногистохимическими методами в астроцитах белого вещества спинного мозга, и уровень этой экспрессии мог существенно повышаться после повреждения спинных отростков [55]. В экспериментах на культурах астроцитов белого вещества было установлено, что снижение уровня экспрессии S100A4 методом РНК-интерференции повышает скорость миграции астроцитов и уровень экспрессии металлопротеаз МТ1-ММР и ММР-9 [56]. При создании механическим способом участка свободного от культивируемых клеток, быстрая миграция и восполнение клеточного монослоя происходит лишь в случае подавления экспрессии данного белка, тогда как исходные клетки, экспрессирующие S100A4, не заполняют свободную область, образуя лишь гипертрофированные выросты в ее направлении [57]. Снижение уровня экспрессии S100A4 с использованием ингибиторной РНК в астроцитах при совместном культивировании с ними нейронов дорсальных ганглиев приводит к более быстрому росту нейритов, чем в случае с использованием исходных астроцитов, экспрессирующих S100A4

58]. Положительное влияние S100A4 на дифференцировку нейронов гиппокампа и рост их аксонов в культуре было показано в работе

59], где использовались димерная и олигомерная фракции S100A4 в концентрациях 5-10 мкМоль. По невыясненным причинам только олигомерная фракция оказывала стимулирующий рост аксонов эффект. В более поздней работе, выполненной в той же научной группе под руководством Е.М. Луканидина, было показано, что положительное влияние олигомерной формы S100A4 на рост аксонов в культуре нейронов гиппокампа происходит через рецептор, сопряженный с белком класса Gq/11, который активирует PLC-P, что приводит к быстрой активации неселективных катионных каналов и потенциал-зависимых кальциевых каналов Т - и L - типа, быстрому входу ионов кальция внутрь клетки и, в конечном итоге, к запуску механизмов, осуществляющих изменение формы нейрона

60]. Было также показано, что связывание с гепарансульфатом, являющимся полисахаридной частью мембранных протеогликанов, необходимо для активации данного сигнального пути и роста аксонов.

Таким образом, в данной работе показано, что рецептором для S100A4 может являться один из членов семейства GPCR (G-Protein Coupled Receptor}, передающий сигнал через белок класса Gq/11.

Однако, остается невыясненным один очень важный вопрос: «Что представляют собой олигомерные формы S100A4, и существуют ли они в тканях и клетках млекопитающих?» В самом деле, гиперэкспрессия эукариотического белка в бактериальной клетке может приводить к образованию агрегатов с неправильно сформированной третичной структурой. В случае S100A4 образуется большое количество растворимого белка, но при этом около 10-20% от его общей массы оказывается в высокомолекулярной (250' кДа) фракции после гель-фильтрации, и именно эта фракция, а не та, что соответсвует димерной'форме характерной для нативного S100A4, обладает описанным биологическим эффектом [59]. Следует отметить, что в последней работе [60] под сомнение ставится возможность S100A4 выступать в роли лиганда RAGE в отсутствии патологии. Амфотерин и S100A12, известные лиганды RAGE, оказывали на рост нейронов гиппокампа такое же влияние, как и S100 A4, однако, их эффект ингибировался антителами к внеклеточной части RAGE для обоих лигандов, но не для S100A4, а действие S100A4 строго ингибировалось блокаторами сигнального пути через GPCRs. S100A12 in vitro легко блокировал связывание олигомерной и димерной форм S100A4 с иммобилизованным RAGE, и по данным плазмонного резонанса связывание обеих форм S100A4 с RAGE давало идентичные сигналы. Все это заставляет критически относиться к данным результатам, ставя под сомнения некоторые выводы и воспринимая «биологические эффекты» олигомерных форм S100A4 скорее как артефакт, чем явление живой природы.

Роль S100A4 в ремоделировании внеклеточного матрикса.

Выше уже было сказано о влиянии внеклеточного S100A4 на уровень экспрессии ММР-13 в хондроцитах и уровень экспрессии ММР-9 в нейронах. Неудивительно, что немало работ было посвящено изучению влияния S100A4 на экспрессию MMPs (металлопротеазы вне клеточного матрикса) и их тканевых ингибиторов (TIMPs) и привязке выявленных изменений к способности опухолевых клеток к метастазированию. Например, ингибирование экспрессии 8100А4 методом РНК-интерференции в клетках нейробластомы приводило к снижению уровня мРНК ММР-2 и уменьшению подвижности и инвазивности данных клеток [61]. Осуществляемое тем же методом уменьшение изначально высокого уровня экспрессии 8100А4 в клетках линии РС-3 аденокарциномы предстательной железы приводило к значительному снижению пролиферативного уровня, и высокой инвазивности этих клеток. Параллельно наблюдалось значительное уменьшение исходно высокого уровня экспрессии ММР-9, которое являлось, по данным из экспериментов с использованием репортерных конструкций, следствием уменьшения активности промотора соответствующего гена [62]. Эксперименты на клеточных культурах не всегда давали однозначные результаты. Так при репрессии 8100А4 с помощью специфического к его мРНК рибозима в клетках остеосаркомы в фазе экспоненциального роста резко снижался уровень экспрессии Т1МР-1 и МТ1-ММР, тогда как в состоянии клеточного монослоя никакой кореляции не наблюдалось. Более того, уровень экспрессии ММР-2 не зависел в пределах ошибки метода детекции от уровня экспрессии 8100А4 на любой фазе роста, но наблюдалось снижение протеолитической активности ММР-2 в культуральной среде [63]. Во всех клонах при снижении уровня экспрессии 8100А4 увеличивался уровень мРНК Т1МР-2; а инвазивность клеток, измеренная при прохождении их через фильтр, покрытый Матригелем в камере Бойдена, снижалась на 25-60 % относительно контроля.

Некоторые авторы склонны интерпретировать подобного рода результаты как доказательство того, что 8100А4 увеличивает метастатическую способность опухолевых клеток именно через повышение активности металлопротеаз, разрушающих матрикс, но, в зависимости от условий и происхождения клеточных линий, такая связь не всегда существует. Например, стабильно трансфицированные конструкциями, экспрессирующими S100A4, клоны из опухоли молочной железы мыши не проявляют корреляции между уровнем экспрессии ММР-2 , ММР-9 и инвазивностью, как in vitro при прохождении через Матригель, так и in vivo после инъекции в молочную железу «голых» мышей [64]. Однако, в этих экспериментах обнаруживается прямая кореляция между уровнем экспрессии S100A4 и инвазивностью, как in vitro, в камере Бойдена, так и in vivo. Особенно важно то, что лишь клоны с умеренным или высоким уровнем экспрессии S100A4 дают метастазы в легкие, несмотря на то, что уровень эксперссии в них ММР-2 и ММР-9, примерно, такой же, как в клонах, экспрессирующих малые количества S100A4 [64]. Очевидно, что S100A4 регулирует еще какие-то важные для метастазирования процессы.

Добавление олигомерной, но не димерной формы S100A4 к культуре эндотэлиальных клеток SVEC 4-10 приводит к повышению уровня экспрессии ММР-13 (коллагеназа-3) и ММР-11, при этом повышается уровень экспрессии тканевых ингибиторов металлопротеаз, TIMP1 и TIMP2, но резко понижается уровень экспрессии ингибитора активатора плазминогена урокиназного типа, PAI-1 [65]. Повышение уровня активности ММР-13 во внеклеточной среде относительно контроля, где не было внеклеточного S100A4, было достоверно показано методом зимограции. Опять же вызывает сомнение активность только олигомерных форм S100A4.

Весьма интригующей оказалась способность внеклеточного S100A4 участвовать в активации тканевого активатора плазминогена

66]. Работа была выполнена с использованием клеточной линии эпителиального происхождения НСЕС и рекомбинатных белков, тестированных на способность активировать плазминоген in vitro. Предпосылкой к ней явились данные о том, что S100A10, единственный член семейства S100, не способный связывать ионы кальция, взаимодействует на цитоплазматической мембране клеток с аннексином II, и образование этого гетеротетрамера приводит к активации тканевого активатора плазминогена (t-PA). Ко-иммунопреципитация in vitro рекомбинантных белков S100A4 и аннексина II показала, что взаимодействие происходит в присутствии ЕГТА, и для него важны первые 26 а.о. аннексина, где содержатся сайты для фосфорилирования S25 протеинкиназой С (РКС) и Y23 тирозинкиназой pp60src [66]. Использованные в работе клетки экспрессировали, но не секретировали S100A4 и ко-преципитировать указанные два белка из клеточного лизата авторам не удалось. Однако добавление в среду 1мкМ рекомбинантного S100A4 не только приводило к резкому изменению формы клеток, но и позволяло в присутствии ЕГТА ко-преципитировать из культуральной среды аннексии II. Эффект S100A4 на форму клеток проявлялся уже при концентрациях 10 нМ, а активация плазминогена на клеточной поверхности становилась заметной при добавлении S100A4 в концентрации 50-100 нМ, сопровождавшемся двумя отмывками клеток перед измерением активности. В бесклеточной системе S100A4 (1 мкМ) в присутствии ЕГТА и тканевого активатора плазминогена (t-PA) увеличивал скорость конверсии плазминогена в плазмин в 11 раз, понижая Km в 10 раз и увеличивая каталитическую эффективность t-PA, определяемую как Vmax/Km, в 7.6 раза [66].

Примерно, такие же значения указанных величин наблюдались в случае замены 8100А4 на БЮОАЮ.

Эффект 8100А4 полностью блокировался добавлением избытка 6-аминокапроновой кислоты или заменой двух лизинов на С-конце на остатки лейцина, свидетельствуя о том, что этот участок последовательности 8100А4 ответственен за связывание плазминогена. В культуре клеток активация 1>РА блокировалась добавлением избытка пептида из 15 а. о., соответствующих первым 15 а. о., в молекуле аннексина II [66]

Остаются без ответа некоторые вопросы, возникающие при анализе приводимых в статье фактов, поэтому данную работу следует рассматривать как начальный этап в изучении данного взаимодействия. Молекулярный механизм влияния 8100А4 на регуляцию экспрессии и активации металлопротеаз пока остается не выясненным до конца, как и вопрос о значимости такой регуляции для повышения метастатического потенциала опухолевых клеток.

Влияние 8100А4 на минерализацию костной ткани.

Неожиданный и интересный эффект экспрессии белка 8100А4 наблюдается в периодонтальном лигаменте; который представляет собой тонкий слой неминерализованной соединительной ткани между эмалью зуба и алвеолярной костной тканью челюсти. Клетки периодонтального лигамента обнаруживают самый высокий в челюстных тканях уровень экспрессии 8100А4, который во внеклеточном пространстве располагается вдоль фибрилл внеклеточного матрикса, возможно, в комплексе с белком МАР массой 36 кДа [40], как это было ранее обнаружено в гладкомышечном слое стенки аорты. В челюстных тканях мРНК

S100A4 детектируеся также в одонтобластах, гладкомышечных клетках мелких артерий пульпы и остеобластах, непосредственно прилегающих к периодонтальному лигаменту [40]. В культуре клетки периодонтального лигамента секретируют S100A4. При добавлении рекомбинантного S100A4 в культуру клеток костного мозга в концентрации 50мкг/мл (2.5 мкМ) происходит существенное снижение количества очагов минерализации, а при увеличении его концентрации до 100 мкг/мл, наблюдается полное блокирование минерализации внеклеточного матрикса [40]. На сколько точно отражает ситуацию в периодонтальном лигаменте in vivo действие высоких концентраций S100A4 на культуру клеток, остается непонятным. В культуре клеток периодонтального лигамента при ингибировании экспрессии S100A4 методом введения малых ингибиторных РНК, специфичных к мРНК S100A4, наблюдается увеличение экспрессии остеопонина, остекальцина, транскрипционных факторов Runx2/Cbfal и Osterix - маркеров характерных для остеобластов [67]. При дифференцировке остеобластов в клеточной культуре уровень экспрессии S100A4 устойчиво снижается, достигая к 21-му дню уровня, не детектируемого с помощью антител, а уровень минерализации внеклеточного матрикса, наоборот, возрастает, достигая максимума, к концу указанного временного интервала [41]. Таким образом, есть основания полагать, что S100A4 может участвовать в сигнальном пути, регулирующем степень дифференцировки остеобластов и, как следствие, уровень минерализации ткани.

Внутриклеточные взаимодействия S100A4.

S100A4 и р53.

Было известно, что S100B, член семейства S100, in vitro способен связывать р53 и предотвращать его агрегацию в тетрамеры [68]. В группе Е. М. Луканидина попытались исследовать взаимодействие S100A4 и р53 in vivo и in vitro. В отличие от не давшей положительного результата ко-иммунопреципитации этих белков из лизата клеток, помеченных радиоактивным метионином, было обнаружено взаимодействие S100A4 и р53 при ко-иммунопреципитации рекомбинантных белков in vitro, в которой кроме полноразмерного р53 использовались его- домены. Методом иммуноблотинга было обнаружено, что S100A4 копреципитировался с полноразмерным р53 и с его С-концевым фрагментом (289-390 'а. о.). Идентичный результат был получен с использованием технологии overlay, где S100A4, связавшийся с р53 и его фрагментами, детектировался на мембране соответствующими антителами. При использовании хроматрографии« на глутатион-сефарозе, где в качестве сорбированого белка выступал GST-p53, а растворимым являлся S100A4, в отсутствии какого-либо неспецифического конкурента и отмывок высокосолевым буфером оказалось, что полноразмерный р53 взаимодействует с S100A4 в несколько раз сильнее, чем усеченная форма, без остатков 364-393, представляющих собой домен негативной регуляции данного белка, в котором находятся сайты фосфорилирования по S392 для киназы GK II и S371, S376, S378 для- PKG. In vitro рекомбинантный S100A4 ингибирует фосфорилирование р53 киназой РКС, но не GK II. Ингибирование фосфорилирования р53 в этом сайте может иметь регуляторное значение, хотя in vivo этот вопрос не изучался [69].

Однако, при изучении взаимодействия S100A4 и фрагментов р53 методом измерения флуоресцентной анизотропии и с использованием аналитического < ультрацентрифугирования оказалось, что взаимодействие с фрагментом 367-393 обладает очень высокой константой' диссоциации (Kd = 0.001), тогда как взаимодействие с фрагментами 325-355 (домен, ответственный, за" тетрамеризацию р53) и 293-393 имеют Kd = 17 мкМ и Kd = 10 мкМ, соответственно [70]. Для более корректного сравнения результатов этих, двух независимых экспериментов не хватает исследования констант диссоциации с участием небольшого участка аминокислотной последовательности, 355-367 а. о. , чтобы сделать окончательные выводы о том, с каким участком р53 связыается S100A4, но на основании того, что избыток пептида 325-355 в 6 раз повышает Kd его комплекса с S100A4', а мутантный пептид L344P, не способный тетрамеризоваться, не изменяет Kd комплекса при увеличении концентрации этого пептида (Kd = 35 мкМ), авторы предполагают взаимодействие S100A4 с доменом, ответственным за тетрамеризацию р53 (325-355), а не с регуляторным доменом (377393).

Неожиданной оказалась способность S100A4 ингибировать связывание р53 с участком- промотора гена р21 в EMSA (ElectroMobility Shift Assay), так как нет опубликованных достоверных данных об ядерной локализации S100A4, причем действие S100A4 полностью, блокировалось, добавлением ЕГТА. В' клетках линии CSML-0, не экспрессирующих S100A4, активность люциферазы под промотором гена р21 снижалась на 60% относительно контроля (без экзогенного S100A4) при ко-трансфекции данной репортерной конструкции с вектором, экспрессирующим S100A4, а в клетках линии VMR-liv активность люциферазы снижалась только на 35% в аналогичном эксперименте. При использовании промотора гена Вах активность люциферазы повышалась на 40% (CSML-0) и 25% (VMR-liv) [69]. Интересно, что в этой же работе авторы вызывали апоптоз при трансфекции в указанные клеточные линии вектора, экспрессирующего S100A4. Авторы проводят идею о том, что S100A4 выступает вместе с р53 в качестве проапоптотического фактора и, кроме приведенных здесь экспериментов, подтверждают свою мысль, давая подборку из 25-ти опухолевых клеточных линий, в которых не наблюдается совместной экспрессии wt-p53 и S100A4 - только порознь [69]. Эксперименты с генетическим нокаутом mtsl показали, что в ответ на гамма-облучение уровень экспрессии р21 в селезенке был в 2.5 раза выше, а гена Ьах в 2 раза выше, у мышей дикого типа по сравнению с нокаутными по mtsl мышами [71]. В тимусе уровень экспрессии упомянутых генов был примерно одинаков у нокаутных по mtsl и нормальных мышей, а процент апоптотических ядер в селезенке после облучения был в 1.5 раза выше у мышей дикого типа [71]. Интересно, что у нокаутных мышей в 10% случаев наблюдались спонтанные неметастазирующие опухоли, в которых р53 был нефункционален, несмотря на отсутствие S100A4 у данных животных. К сожалению, ни в» лаборатории Е.М. Луканидина, ни в какой-либо другой лаборатории за последние пять лет не было получено опубликованных результатов исследований, подтверждающих достоверность наблюдаемых in vitro молекулярных взаимодействий, описанных выше, в ситуации in vivo, поэтому остается под вопросом сам факт прямого взаимодействия р53 и S100A4 в клетке и биологическое значение этого взаимодействия.

Эксперименты с трансфицированными клеточными линиями и генетическим нокаутом mtsl дали противоречивые результаты, которые могут быть интерпретированы по-разному, в том числе, с помощью совершенно не связанных с прямым взаимодействием указанных белков схем передачи сигналов в клетке, приводящих к активации или ингибированию транскрипционной функции р53. Дальнейшего развития тема о взаимодействии S100A4 с р53 не получила, несмотря- на' огромное количество работ и прогресс в изучении этого важнейшего (р53) белка.

Взаимодействие тяжелой цепи не мышечного миозина IIA и S100A4.

Самым первым из, обнаруженных белков-партнеров S100A4 оказался не мышечный миозин второго типа, точнее его тяжелая цепь, обозначаемая в дальнейшем как ТЦНМ-ПА. Этот белок ко-преципитировался антителами к S100A4 в присутствии ионов кальция из клеточного лизата линии CSML100, ко-мигрировал в сахарозном градиенте и обнаруживал ко-локализацию в клетке [72].

Сайт связывания S100A4 с ТЦНМ-ПА расположен на С-конце в области 1909-1924 а. о. и содержит внутри себя сайт связывания РКС, при этом S100A4 ингибирует фосфорилирование Serl917 этой киназой [73, 74], а также ингибирует фосфорилирование Serl944 киназой СК II [75]. Фосфорилирование по этим сайтам ингибирует сборку миозиновых филаментов, образованных как ТЦНМ-ПА, так; и ТЦНМ-ПВ, причем фосфорилирование Serl917 не влияет на взаимодействие с S100A4, несмотря на его нахождение внутри сайта связывание, а вот фосфорилирование Ser 1944 уменьшает аффинность взаимодействия с S100A4 в 6.5 раз [76]. S100A4 проявляет на порядок большее сродство к олигомеру ТЦНМ-ПА, чем к олигомеру ТЦНМ-ПВ, повышая критическую концентрацию полимеризации ТЦНМ-ПА в 11 раз [74]. S100A4 способен in vitro почти полностью деполимеризовывать фосфорилированные РКС филаменты ТЦНМ-ПА, ингибируя их сборку и ускоряя разборку, но не влияет на динамику сборки-разборки ТЦНМ-ПА, фосфорилированных по Ser 1944 киназой СК II [76]. Таким способом может осуществляться тонкая- регуляция динамики миозиновых филаментов в клетке, зависимая, в том числе, и от внутриклеточной концентрации ионов кальция и магния [76]. Мутантные формы S100A4, содержащие замены Asp 66 Asn , Glu 33 Gin и не способные связывать ионы кальция, перестают in vivo связывать ТЦНМ-IIA, хотя остаются способными димеризоваться и сохранять характерную внутриклеточную локализацию [77].

Другие внутриклеточные взаимодействияя S100A4.

Общеизвестно, что возможность физического взаимодействия двух белков in vitro, либо в двугибридной системе еще не означает их биологически значимого взаимодействия in vivo, но на первоначальном этапе исследования эти данные, несомненно, представляют интерес. Для S100A4 на сегодняшний день существует ряд подобных фактов, пока не получивших дальнейшего подтверждения своей биологической значимости.

S100A4 взаимодействует с S100A1 в двугибридной системе [78], а также in vivo по данным, полученным с использованием метода FRET [79]. Константа диссоциации комплекса S100A4/S100A1, измеренная in vitro, равна 0.3 мкМ, и она в два раза меньше, чем константа диссоциации комплекса S100A4/S100A4 [79].

При эквимолярных концентрациях эти два белка в растворе образуют гетеродимер, который не способен диссоциировать филаменты, образованные ТЦНМ-IIA и существенно снижать степень фосфорилирования ТЦНМ-IIA in vitro протеин-киназой! С [79]. Эффект S100A1 проявлялся in vivo. Когда клетки линии Rama 37, изначально экспрессирующие только S100A4, были трансфицированы вектором, экспрессирующим S100A1, частота образования метастаз после их инъекции сингенным мышам снижалась в четыре раза, а частота метастазирования в мышцы в два раза по сравнению с таковыми при инъекции клеток исходной, не трансфицированной, линии Rama 37 [79]. Существует ли в норме в клетках организма такой гетеродимер, и может ли он играть какую-то роль, как, например, гетородимер S100A8/S100A9, на данный момент неизвестно.

S100A4 был ко-преципитирован с липрином-pi из клеточных лизатов линии CSML100, экспрессирующей высокий уровень, S100A4, или из клеточной линии VMR-liv с индуцируемой тетрациклином системой экспрессии. S100A4 [80]. В этих линиях S100A4 мог быть ко-преципитирован антителами к липрину-|31, и их внутриклеточная ко-локализация хорошо обнаруживалась с помощью соответствующих антител [80]. S100A4 связывается с С-концевым участком в районе 938-1005 а.о. и способен ингибировать in vitro фосфорилирование липрина-pi на этом участке протеин-киназами С и СК II [80]. Интересно; что при этом происходило интенсивное фосфорилирование самого! S100A4, что вызывает некоторые подозрения на артефакт. Липрин-pl способен взаимодействовать с трансмембранной тирозин-фосфатазой LAR, которая, в свою очередь, формирует комплекс с белком Trio, содержащим домены, регулирующие обмен гуаниновых нуклеотидов в ГТФ-азах семейства Rae и Rho, хорошо известных регуляторов клеточной формы и подвижности [81]. К сожалению, дальнейшего развития эта работа не получила.

В двугибридной системе- было обнаружено взаимодействие S100A4 с интересным белком CCN3/NOV [82], представителем группы CCN, состоящей из 6-ти гомологичных членов, которые участвуют в таких фундаментальных процессах, как ангиогенез, хондрогенез и заживление ран.

Наконец, методом аффинной хроматографии из клеточного лизата линии NIH ЗТЗ на матриксе с GST-тропомиозином 2 был выделен S100A4, который в присутствии ионов кальция связывается с участком 39-107 тропомиозина-2 [83]. Дальнейшего развития эта работа не получила.

Заключение.

За последние 10 лет исследований были накоплены факты, опираясь на которые можно сегодня более-менее обоснованно предполагать, через какие молекулярные механизмы S100A4 мог бы способствовать формированию метастатического потенциала опухолевых клеток. Очевидно, что для этого белка существует не только внутриклеточная роль и соответствующий ей набор белков-партнеров, но и внеклеточная, предусматривающая наличие для него рецепторов на клеточной поверхности и белков-партнеров из внеклеточного пространства, представляющих собой либо компоненты внеклеточного матрикса, либо некие растворимые лиганды, как например, CCN3. Не имея классического сигнала внеклеточной локализации, S100A4 мог бы секретироваться неканоническим путем, в котором задействованы комплексы, содержащие аннексии II и S10013, как показано в случае секреции FGF-1 и IL-la (Mandinova 2003). Наиболее вероятным кандидатом на роль рецептора для S100A4, по крайней мере, при таких описанных выше патологиях, как ревматоидный артрит, является RAGE. Не исключено, что рецептором для S100A4 может быть один (или несколько) из представителей огромного семейства рецепторов, сопряженных с G-белками (GPCRs). Как S100A4 осуществляет регуляторные функции внутри клетки, изменяя, например, уровень экспрессии Е-кадгерина или некоторых металлопротеаз и их ингибиторов, и имеются ли таковые в отношении экспрессии других белков, на сегодняшний день точно неизвестно. Среди эффекторных механизмов, имеющих непосредственное отношение к клеточной подвижности, в которых задействован' S100A4, известен лишь один: регуляция сборки-разборки филаментов немышечного миозина IIA. Представляется весьма вероятным, что для индукции метастатического фенотипа необходимо участие S100A4 в нескольких различных регуляторных и эффекторных процессах. Когда эти процессы будут изучены на молекулярном уровне, и роль S100A4 в них будет достоверно установлена, тогда, наверное, можно будет точно ответить на вопрос о том, как S100A4 способствует повышению инвазивности опухолевых клеток.

Интересно, нокаутные по mtsl мыши живут и размножаются, не проявляя каких-то заметных отклонений от нормы, за исключением аномального соотношения самцов и самок в потомстве (2:1 против 1.09: 1 в норме), что может свидетельствовать либо об избыточности функции S100A4 в организме, либо об его участии в тонкой настройке каких-то свойств клеток определенных типов (84). К сожалению, данные о каких-то тонких различиях клеток из мышей дикого типа и из нокаутных мышей пока не опубликованы, если они имеются вообще, но эксперименты с иммортализованными фибробластами нокаутных мышей в культуре и in vivo вывели исследования на новый уровень, на котором главным предметом изучения стало взаимодействие опухолевых клеток с клетками опухолевой стромы и клетками микроокружения опухоли. Оказалось, что при подкожных инъекциях нокаутным мышам клеток карциносаркомы молочной железы мыши, CSML-100, дающих метастазы в легкие в 100% случаев в организме мышей дикого типа, первичные опухоли развиваются лишь у 45% нокаутных по mtsl животных, а метастазов не наблюдается вообще. (Naaman С 2004). Не исключая возможности иммунного ответа организма нокаутных мышей на S100A4, присутствующий в клетках CSML-100, следует отметить, что подобные эксперименты с клетками CSML-0, не обладающими способностью метастазировать в мышах дикого типа и экспрессировать S100A4, но образующими в них первичные опухоли в 100% случаев, выявили снижение на 26% частоты опухолеобразования в нокаутных мышах [84]. Более того, подкожная ко-инъекция иммортализованных эмбриональных фибробластов дикого типа (mtsl +/+) с клетками CSML-100 в организм нокаутных мышей повышала частоту образования первичных опухолей до 67%, тогда как использование подобных фибробластов из эмбрионов нокаутных мышей - до 50% (против 45% в случае инъекции только клеток CSML-100). Гистологическое исследование опухолей, сформированных клетками линии CSML-100, выявило резкие отличия в расположении и обильности элементов опухолевой стромы в нокаутных мышах и мышах дикого типа. В мышах дикого типа опухоли были обильно инфильтрированы макрофагами, миофибробластами и имели хорошо развитую сеть капилляров, тогда как в опухолях, сформировавшихся в нокаутных мышах, капилляры были редки, а макрофаги, лимфоциты, и миофибробласты концентрировались на периферии опухоли [84]. К сожалению, авторы не приводят данных о гистологическом исследовании опухолей, сформированных в нокаутных мышах и мышах дикого типа клетками линии С8МЬ-0 и клетками С8МЬ-100 при их ко-инъекции с иммортализованными эмбриональными фибробластами дикого типа (МЕР), а также опухолей, сформированных клетками линии УМЯ , не экспрессирующими 8100А4 и способными давать метастазы в легкие и печень в 100% случаев при их подкожной инъекции в организм мышей дикого типа. Клетки линии УМЕ. интересны тем, что стимулируют резкое увеличение секреции 8100А4 клетками МЕБ при совместном культивировании или добавлении их культуральной среды, к отдельно культивируемым клеткам МЕБ [85]. Совместное культивирование изменяет форму клеток УМЯ , придавая им более распластанный фенотип с большим количеством фокальных контактов и актиновых стресс-фибрил. Подобного рода изменения возникают при добавлении в культуральную среду клеток УМЫ рекомбинантного 8100А4, приводя также к накоплению в среде через 24 часа активной формы ММР-13, но в случае использования высокомолекулярных агрегатов 8100А4 [85]. Эти факты поднимают вопрос о причинах резкого уменьшения случаев опухолеобразования в нокаутных по мышах и роли 8100А4, но ответить на этот вопрос коректно не представляется возможным, так как отсутствует ряд необходимых для этого экспериментов, часть из которых указана выше: Авторы приводят значения концентраций 8100А4, вымываемого из удаленных опухолей при различных, но не всех необходимых для корректных выводов, вариантах их формирования. Разница концентраций 8100А4 между опухолями, сформированными клетками CSML-100 (100% животных с первичными опухолями и метастазами) в мышах дикого типа и нокаутных мышах при ко-инъекции клеток MEF составляет всего лишь 25% в пользу последних. При этом опухоли в нокаутных мышах при ко-инъекции клеток MEF дикого типа образуются в 67% случаев и. в 50% случаев, когда используются MEF из нокаутных мышей, и где концентрация S100A4 почти вдвое ниже [85]. При этом следует учесть, что клетки MEF дикого типа обладают гораздо большей подвижностью и инвазивностью in vitro, чем клетки MEF из нокаутных мышей [85]. Так что же повышает на 30% (67% по сравнению с 50%) частоту формирования первичных опухолей в нокаутных мышах: повышение в 2 раза концентрации S100A4 в опухоли или наличие в ней еще в процессе формирования, иммортализованных высокоинвазивных эмбриональных фибробластов, экспрессирующих S100A4? В данном случае можно лишь спекулировать на том, что клетки указанных типов у взрослых нокаутных мышей имеют пониженную пластичность и способность к проникновению в первичную опухоль, где изначально отсутствуют элементы стромы, и это не зависит от наличия внеклеточного S100A4 в первичной опухоли (опять же, нет гистологических данных по опухолям, сформированным клетками линии CSML-0 в нокаутных мышах и мышах дикого типа). Очень жаль, что эксперименты с нокаутными мышами носили спонтанный характер и не были доведены до логического конца.

На этапе эмбрионального развития, возможно, существует дублирование функций S100A4 за счет экспрессии каких-то других белков, может быть, из семейства S100, но во взрослом организме эти белки не экспрессируются или экспрессируются слабо, что снижает инвазивность определенных типов клеток, как внутри опухоли, так и в нормальных тканях, а это влечет за собой образование редуцированной стромы внутри опухоли, пониженной инфильтрации ее макрофагами, основными источниками БОБ!, который стимулирует ангиогенез в первичной опухоли.

Интересно, что клетки линии УМЫ, введенные внутривенно, не формируют метастазы в мышах дикого типа, но при трансфекции в них вектора, экспрессирующего 8100А4, они приобретают способность давать множественные метастазы в легкие и печень в 100% случаев, хотя при подкожных инъекциях они это делают и без трансфекции в них указанного вектора [85].

Описанные в последней главе эксперименты, несмотря на их логическую незавершенность, позволяют предполагать, что для индуцируемого белком 8100А4 метастазирования определенных типов опухолей необходимо его наличие как внутри, так и вне клетки, причем это может относиться не только к опухолевым клеткам, но и к определенным типам здоровых клеток организма, вступающих в сложные межклеточные взаимодействия друг с другом. Может быть, недалек тот день, когда ответы будут найдены.

Материалы и методы. Ферменты и реактивы.

В работе использовались ферменты, производимые фирмами Fermentas (Litvenia), Promega (USA), Gibco (USA) и реактивы производства фирм Sigma (USA) и Merck (Germany). Олигонуклеотиды были заказаны в фирме Syntol (Москва).

Плазмидные векторы.

В работе были использованы плазмидные векторы pQE30 (Qiagen) и pET30f (Novagen).

Штаммы бактерий.

Для амплификации рекомбинантных плазмид был использован штамм Е. coli XL1 Blue MRF'. Для экспрессии белков использовался штамм Е. coli XL1 Blue MRF' (в случае белка S100A4(MTS1), или штамм BL21 DE3 (в случае септинов).

Агарозный гель-электофорез ДНК.

Гель-электрофорез ДНК проводили в 0.4 - 1.5 % агарозном геле, содержащем буфер ТАЕ (Tris-Acetate-EDTA) с 0.5% бромистым этидием. ДНК детектировали с помощью трансиллюминатора в ультрафиолете (302 нм).

Трансформация клеток Б. coli с использованием СаСЬ.

Для трансформации с использованием СаСЬ компетентные клетки приготовляли как описано в [103]. Одной бактериальной колонией инокулировали 1-5 мл среды LB и растили в течение ночи.

Затем выросшей культурой инокулировали среду LB (при соотношении 1:100) и растили до СЮбоо 0.3-0.5 (-5x107 клеток/мл) при 37°С с постоянным перемешиванием. По достижении культурой нужной плотности клеточную массу охлаждали во льду в течение 10 мин., клетки осаждали центрифугированием при 4000g, 4°С в течение 5 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 1/2 исходного объема охлажденного на льду раствора 50 мМ MgCb, 10 мМ Tris-HGl, pH 8.0. После центрифугирования (4000g, 4°С, 5 мин.) клетки ресуспендировали в 1/2 исходного объема охлажденном во льду раствора (50 мМ СаСЬ, ЮмМ Tris-HCl, рН8.0) и осаждали центифугированием при 4000g, 4°С, 5 мин. Клетки ресуспендировали в 1/15 исходного объема (50 мМ СаС12, 10 мМ Tris-HCl, pH 8.0) и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для,трансформации к 100 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл лигированной смеси ДНК (1 мкг). Смесь клеток с ДНК инкубировали на льду 60 мин. Пробирку быстро помещали в водяную баню при 42°С на 90 сек. для теплового шока и обратно в лед. Затем добавляли 1 мл среды LB и инкубировали на 37°С в течение часа для экспрессии генов устойчивости к антибиотикам. Затем различные разведения клеток высевали на чашки с агаром и соответствующим антибиотиком и растили на 37°С в течение ночи. Полученные колонии использовали для наращивания ночных культур и выделения плазмид.

Трансформация клеток Б. coli электропорацией.

Для приготовления компетентных клеток для электропорации одной колонией1 инокулировали 2.5 мл LB и растили в течение ночи. Затем ночной культурой инокулировали среду LB (1:100) и растили клетки до СЮ6оо-0.5-0.8. Клетки охлаждали во льду в течение 15-30 мин. и центрифугировали 5 мин. на 4000g, 4°С. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 исходном объеме охлажденной стерильной воды (Mili-Q). После центрифугирования в том же режиме клетки ресуспендировали в S1/2 исходного объема воды, центрифугировали, ресуспендировали в охлажденном 10% глицерине и быстро замораживали в жидком азоте в виде аликвот по 40< мкл. Компетентные клетки хранили на -70 °С. Перед трансформацией клетки оттаивали на льду и добавляли к ним' 1 мкл ДНК (10-100 нг). Смесь переносили в охлажденные кюветы (0.1 см) и помещали в электропоратор. Использовали следующие параметры: 2.4кВ, 25mkF, 400 Ом. После электропорации добавляли 1 мл среды SOC и качали клетки в среде при 37°С в течение 1 часа без антибиотиков. После этого клетки высевали в различных разведениях на покрытые LB-агаром чашки Петри с соответствующим антибиотиком. Клетки растили в течение ночи.на 37°С, отбирали колонии и выделяли из них плазмиды.

Выделение плазмидной ДНК.

Плазмидную ДНК выделяли по стандартной методике щелочным лизисом [103]. Полученный из 3-5 мл ночной культуры культуры клеточный осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 1 (25 мМ трис-HCl рН 8,0; 50 мМ глюкоза; 10 мМ ЭДТА), затем добавляли 400 мкл раствора 2 (0,2 M NaOH; 1% SDS), осторожно перемешивали и инкубировали 5 мин во льду. Добавляли 300 мкл 3 M ацетата калия рН 4,8, интенсивно перемешивали и инкубировали 30 мин. на льду. Плотную белую-массу (высоко молекулярная ДНК и клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 5 мин. К супернатанту добавляли 400 мкл 40% (вес/вес) раствора ПЭГа, перемешивали и инкубировали во льду в течение 1 часа. После центрифугирования при 14.000 об/мин в течение 5 мин. осадок плазмидной ДНК растворяли в 100 мкл Н20. Примеси полисахаридов осаждали 200 мкл 7,5 М ацетата аммония, рН 7.5 в течение 5 мин при -70 С. После центрифугирования к супернатанту, содержащему плазмидную ДНК добавляли 0,6 объема изопропанола и инкубировали 1 минуту при комнатной температуре. После центрифугирования при 14.000 об/мин в течение 10 минут осадок плазмидной ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в 50 мклНгО.

Получение поликлональной антисыворотки к белку 8100А4(МТ81).

Раствор очищенного рекомбинантного белка МТ81 мыши был использован для иммунизации кролика. Первую иммунизацию животного проводили подкожно, с добавлением полного адъюванта Френда. Две следующие иммунизации проводились подкожно с интервалом в две недели, с добавлением неполного адъюванта Френда. Для каждой иммунизации использовалось 200 мкг рекомбинантного белка. Кровь для получения сыворотки брали из краевой вены уха спустя 1-2 недели после последней иммунизации. После выдержки при + 4 °С в течение ночи свернувщуюся кровь центрифугировали (15 мин) при 3000 об/мин. К супернатанту добавляли сухой сульфат аммония до 50% от насыщения и оставляли на ночь на -20 °С. Затем иммуноглобулины осаждали центрифугированием 20 минут при 3000 об/мин. Осадок растворяли в фосфатном буфере для дальнейшей аффинной очистки антител к 8100А4.

Культивирование клеточных линий CSML-100 и CSML-0.

Клетки культивировали в инкубаторе с 5% С02 при 37°С в 25 см и 75 см. пластиковых флаконах в среде DMEM (Gibco) с 10% FCS (Gibco) в присутствие 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл канамицина. При пересаживании на новый матрас клетки промывали и десорбировали с пластика раствором Версена (Gibco). Для проведения хроматографии и других экспериментов клетки замораживали в жидком азоте и хранили при - 70°С.

Электрофорез в ДСН/ПААГ.

Разделение белков проводилось в денатурирующем ПААГ различной процентности (толщина геля 0.75 - 1.5 мм) по Лэммли в камере для вертикального электрофореза (Stratagene). Состав электродного буфера: 20 мМ Tris, 0.2 М глицин,рН" 8.3, 0.1% ДСН. Электрофорез осуществляли в режиме постоянного тока: 15 мА в концентрирующем геле, 20 мА - в режиме разделения. Длина разделяющего геля 10 см.

Состав гелей: концентрирующий гель содержал 5 % сополимера акриламид-бисакриламид (19:1), 0.125 М Трис НС1 рН 6.8, 0.1% ДСН; разделяющий гель содержал необходимый в каждом конкретном случае процент (от 5 до 15) сополимера акриламид-бисакриламид (19:1) или его градиент (от 5 до 15, например), 0.75М Tris-HCl, рН 8.8 и 0.1% ДСН.

В качестве стандартов молекулярных весов использовались Prestained High-Range Protein Molecular Weight Markers (Gibco). После окончания гель-электрофореза белки в геле окрашивали либо переносились на мембрану.

Окрашивание осуществляли водным раствором 0.25% Кумасси R-250, содержащим 45% этанола, 10% уксусной кислоты в течение 1 часа или ночи, а затем гель отмывали водным раствором 10% уксусной кислоты для выявления окрашенных белковых полос.

Электроперенос белков на мембрану.

Электроперенос осуществляли на мембрану PVDF (Amersham), предварительно смоченную в метаноле. Перенос проводили в аппарате для полусухого электроблоттинга Т70 Semi- Dry Transfer Unit (Hoefer Scientific) при постоянном токе 100 мА в течение 1-го часа в Трис-глициновом буфере (20 мМ Tris, 0.2 M глицин, pH 8.5), содержащем 20 % метанола.

Иммуноблотинг.

Анализ проводили по стандартной методике. После электропереноса, мембраны, содержащие исследуемые образцы, блокировали в буфере TBS-T, содержащем 3% BS А или 5% (по массе) обезжиренного сухого молока в течение ночи и затем окрашивали поликлональными кроличьими антителами к рекомбинантному MTS1 мыши (разведение 1: 2 000 в буфере TBS-T, 3% BSA) в течение 1 часа. После отмывки избытка не связавшихся антител с помощью пятикратной промывки (по 5 мин) буфером TBS-Т, мембраны инкубировали в течение 1 часа с вторичными козлиными анти-кроличьими антителами фирмы Gibco (USA) (разведение 1:5000), конъюгированными с пероксидазой хрена. После пятикратной промывки мембраны (по 5 мин.) буфером TBS-T детекцию иммунного окрашивания проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ECL (Amersham).

В случае детекции белков, содержащих эпитоп FLAG, использовались в качестве первичных антител мышиные поликлональные антитела к данному эпитопу фирмы Sigma в* разведении 1:1000,' а'вжачестве вторичных, козлиные антитела фирмы Gibco (USA) к иммуноглобулинам: мыши; коньюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:5000. В остальном протокол не менялся.

Выделение рекомбинантного белка S100A4 с помощью металлохелатной хроматографии.

Векторы, с транслируемой частью? кДНК мышиного или человеческого генов S100A4 на основе плазмиды pQE-ЗО, где на N-конце продуцируемого белка находится последовательность из шести; остатков гистидина, позволяющая производить, очистку белка на; сефарозе Ni-NTA фирмы Qiagen, были любезно предоставлены профессором* Луканидиным Е.М. Трансформированные одним, из данных векторов« клетки Е. Coli, штамма XL-1 Blue, высевались на твердую среду LB с ампицииллином (100 мкг/мл), и одна из выросших колоний высевалась на ночь, в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Ночная культура (3 мл) высевалась в 400- мл такой же среды, и клетки наращивались до оптической; плотности OD60o =0.6-1.0 при 37С°. Затем в культуру добавлялся EPTG в концентрации 1 мМ, и клетки инкубировались еще 5 часов при постоянном перемешивании на 37С°. Осажденные клетки лизировались 30 мин: на льду в фосфатном буфере с: лизоцимом (1мг/мл) (50 мМ фосфата натрия, pH 8.0, ЗООмМ хлорида натрия; 5 мМ ß-меркаптоэтанола, 0.1% Tween 20). После обработки клеток ультразвуком и центрифугирования при 14 ООО g 15 мин. супернатант наносился» на сефарозу Ni-NTA фирмы Qiagen и инкубировался при постоянном перемешивании 1 час на 4С°. После промывки-матрикса: 50-ю объемами того же фосфатного; буфера, но без лизоцима, примесные белки элюировались» тем же буфером, но с добавлением имидазола до концентрации 60 мМ,. а затем; элюировался целевой белок при- повышении» концентрации! имидазола- до ЮОмМ. В зависимости от дальнейших целей; выделенный S100А4 диализовали против подходящего буфера; концентрировали; на ячейках фирмы; Amicon , проверяли чистоту выделенного белка с помощью электрофореза по Лэмли с последующим окрашиванием геля кумасси R-250 .

Выделение септинов Sept6 и Sept? на Ni-NTA сефарозе.

Бицистронный вектор на основе плазмиды рЕТ-ЗОа, содержащий в первом цистроне транслируемую часть к-ДНК септина 6 человека с шестью остатками гистидина на N-конце, а во втором -септина 7 человека, не несущего дополнительных аминокислотных последовательностей, был любезно предоставлен американскими¿ друзьями из лаборатории профессора Macara GI (University of Virginia Scool of Medicine). Данный вектор содержит ген? устойчивости к канамицину, и все процедуры, проделанные для получения культуры, продуцирующей; данные белки,, были практически идентичны таковым, как в случае экспрессии белка S100A4(MTS1), за исключением использования в качестве антибиотика 25 мкг/мл канамицина, а в качестве штамма-хозяина BL21 DE3. Наработка белка производилась при концентрации IPTG 0.5 мМ, при 18С° в течение

16 часов при постоянном перемешивании. Белок из клеточной культуры выделяли по тому же протоколу, что и S100A4.

Приготовление аффинного сорбента, 8100А4-сефарозы.

Очищенный белок ковалентно сорбировался на BrCN-сефарозу 4В фирмы Pharmacia в количестве 2мг на 1 мл активированного матрикса: Пришивка проводилась при рН 8.5 в отсутствии тиоловых восстановителей в 0.1 М фосфатном буфере с 0.6 М NaGl и 0.1% Tween 20 в течение 1-2 часов при 25С°, с таким расчетом, чтобы с матриксом успевало связаться около 50% введенного в реакцию белка. Не прореагировавшие активные группы матрикса инактивировались 0.2М О-метил-глицином в том же буфере, но с 1мМ Р-меркаптоэтанолом в течение ночи при 4С°. Полученный, матрикс промывался высокосолевым буфером с рН 4,2 (50 мМ ацетат натрия, 0.6 М хлорид натрия, 0.1% Tween 20 , 5мМ Р-меркаптоэтанол ), а затем буфером с рН 8.0 ( 50мМ Tris-HCl, 0.6 М хлорид натрия, 0.1% Tween 20, 5мМ Р-меркаптоэтанол, 0.02% азид натрия). В этом буфере аффинный сорбент хранился до использования при 4С°.

Очистка поликлональных антител к S100A4 на аффинном сорбенте.

Переосажденную с сульфатом аммония поликлональную антисыворотку, полученную вышеописанным способом, после диализа против в фосфатного буфера (30 мМ фосфат натрия рН 7.5, 0.2 М хлорид натри, 0.1%Tween 20) наносили на аффинный сорбент, MTSl-сефарозу 4В, уравновешенный тем же буфером, при перемешивании в течение 2 часов и температуре 25С°. Затем сорбент промывали 50-тью объемами буфера нанесения и 20-тью объемами такого же буфера с добавлением хлорида натрия до 1М. Оставшиеся на матриксе антитела элюировали буфером, содержащим 75 мМ цитрата натрия рН 2.5, 0.5 М хлорида натрия и 0.1%Tween 20. В элюат немедленно добавляли ЮОмМ фосфатный буфер до получения рН 7.5. Элюат аликвотили и хранили при -70 С0. Качество антител проверяли методом иммуноблоттинга, как описано выше.

Проведение аффинной- хроматографии с цитоплазматической фракцией клеточного лизата.

300-500 млн. клеток линии CSML-100 (карциносаркома молочной железы мыши с высокой частотой метастазирования в легкие) или CSML-0 (карциносаркома молочной железы мыши, не дающая метастазов) были обработаны ультразвуком на льду в течение 2 мин. в 50мМ имидазольном буфере рН 7.5 , содержащем также 0.1% Triton XI00, 0.1% Tween 20, 150мМ NaCl, 0.45М сахарозой, 2мМ ЭДТА, 5мМ Р-меркаптоэтанолом с добавлением коктейля- ингибиторов протеаз фирмы Sigma. В результате последовательных этапов центрифугирования: 15 000 об./мин. (цф; Эппендорф)Юмин и 80000g (Гчас) на ультрацентрифуге Beckman; были удалены из лизата обломки клеток и все мембранные везикулы. Супернатант инкубировали с 8100А4-сефарозой и контрольным матриксом; 2часа. Контрольный матрикс представлял собой равную по объему аликвоту активированной BrCN-сефарозы, в; которой активные группы были инактивированы тем же раствором; что и на аффинном сорбенте, но белок к: этому матриксу не пришивался. Все указанные, выше процедуры выполняли- при +4-+8 С°. Далее контрольная и опытная: колонки промывались 30 мМ имидазольным буфером рН 7.5, содержащим также 0.1% Tween 20, 200мМ NaCl, 2мМ Р-меркаптоэтанол в количестве 50 объемов от общего объема матрикса. Затем проводилась последовательная элюция белков, сорбировавшихся на колонках, тем же буфером, но с последовательным добавлением: 0.5М NaCl; 0.5NaCl и ЗОмМ' ЭДТА; 2-пропанола до 30% После диализа и концентрирования на ячейках фирмы Amicon элюаты анализировались методом электрофореза по Лэмли в полиакриламидном геле различной процентности.

Идентификация белков методом пептидного фингер-принта.

Белки, селективно связавшиеся с аффинным матриксом при проведении хроматографии на 8100А4-сефарозе ( элюат с ЭДТА ), после разделения в денатурирующем ПААГ соответствующей процентности подвергались масс-спектрометрической идентификации методом пептидного фингерпринта с использованием метода трипсинолиза в ПААГ. Несколько белков, образовавших окрашенные полосы достаточной для анализа интенсивности, были идентифицированы на коммерческих условиях в институте им. Ореховича согласно отработанному в данной лаборатории протоколу трипсинолиза и масс-спектрометрии. Пептидные спектры анализировались с помощью программы MASCOT на сайте www.matrixsciense.com.

Аффинная хроматография с использованием Ni-NTA сефарозы.

Септины 6 и 7, экспрессированные с помощью бицистронного вектора в штамме BL21DE3, выделяются на Ni-NTA сефарозе, как описано выше, но элюция белков с матрикса ЮОмМ имидазолом не производится. Вместо этого полученный аффинный сорбент используется для проведения хроматографии с цитоплазматической частью клеточного лизата линии С26 в соответствии с вышеизложенным протоколом проведения аффинной хроматографии на 8100А4-сефарозе. В качестве контроля используется равная по объему аликвота Ni-NTA сефарозы, на которую лизат бактериальных клеток, экспрессировавших рекомбинантные септины, не наносился. В данном случае контроль проводится для детекции неспецифического взаимодействия эндогенного 8100А4 из клеток линии С26 с №-1ЧТА сефарозой. После отмывок аффинного и контрольного матрикса буфером , содержащим 50 мМ Тпб-НС1 рН 7.5, а также 0.1% Тлуееп 20, 200мМ №0, 2мМ (3-меркаптоэтанол , производится отмывка высокосолевым буфером (1М хлорид натрия, 40 мМ имидазол рН 7.5, 0.1% Т\^ееп 20), а затем с матрикса элюируются септины буфером, содержащим 50 мМ ЭДТА. Точно такая же отмывка производится для контрольной колонки.

Наличие белка МТ81 в элюатах с контрольного и аффинного матрикса, а также соотношение сигналов в элюатах и «проскоке» с аффинной колонки определяется методом иммуноблотинга с использованием поликлональных кроличьих антител к Б100А4 и кита ЕСЬ-р1ш ( АтегвИат), как было описано выше.

Результаты и их обсуждение.

Поиск новых взаимодействий белка 00А4(МТ51) методом аффинной хроматографии. Предпосылки. Получение аффинного сорбента.

Исследования по данной теме ведутся в небольшом числе лабораторий в мире, тем не менее, прогресс в исследованиях за последние 10 лет значителен. Сейчас все большее внимание уделяется внеклеточной роли белка 8100А4, как определяющей его влияние на поведение опухолевых и нормальных клеток при развитии ряда патологий. Однако, точная внутриклеточная роль белка 8100А4, обильно представленного в цитоплазме и в подмембранном компартменте остается до сих пор не выясненной. Более того, ситуация выглядит тупиковой даже для такой давно известной и неоспоримой» мишени 8100А4, как тяжелая цепь не мышечного миозина типа ПА. Не нашли продолжения работы, в которых в качестве белков-мишений для 8100А4 выступали: р53, липрин-р, тропомиозин, СС№, метионин-аминопептидаза-2. Вместе с тем, участие 8100А4 в каких-то регуляторных механизмах внутри клетки представляется очевидным и экспериментально ' подтвержденным. Причем, это касается не только регуляции динамики цитоскелета, но и экспрессии таких генов, как Е-кадгерин и Вшр-3 [86].

В данной работе для выявления новых взаимодействий, белка 8100А4 была использована аффинная хроматография, достоинством, которой, по сравнению с другими методами скрининга, является участие в эксперименте большинства молекул цитоплазматического компартмента в нативном состоянии и отсутствие ограничений, характерных для дрожжевой двугибридной системы и экспрессионных фаговых библиотек. К недостаткам такого метода следует отнести невозможность выявить взаимодействия с низкокопийными белками, так как разница в копийности различных белков в клетках высших эукариот может составлять семь порядков. Но в данном случае ставка делалась на то, что обильно представленный в цитоплазме белок S100A4 будет взаимодействовать с обильно или умеренно представленными в цитоплазме белками.

Был использован вектор на основе плазмиды pQE-30, содержащий кДНК белка S100A4 мыши с шестью гистидиновыми кодонами на N-конце, Белок был экспрессирован в штамме XL1 Blue и очищен на металлохелатном матриксе, агарозе Ni-NTA, согласно рекомендованному фирмой производителем протоколу. Выход белка, примерно, 95-98% чистоты составил 20 мг на 400 мл клеточной культуры (Рис. 4). Белок был стабилен в водно-солевом буфере и использовался в дальнейшем для получения антител и создания аффинного матрикса.

Рис.4 Очищенный на металлохелатном матриксе рекомбинантный S100A4(MTS1), в 15% денатурирующем ПААГ. Представлены образцы белка, сошедшего с матрикса в буфере, содержащем 100 мМ имидазола, нагрузка белка составляет примерно 10 и 5 мкг на дорожку. Чистота выделенного белка соответствует, примерно, 95%.

15 кДа

Главной проблемой при изготовлении аффинного матрикса было сохранение нативности иммобилизованного белка и недопущение неспецифической агрегации белков цитоплазматической фракции на матриксе, как аффинном, так- и контрольном (без пришивки S100A4) во время проведения хроматографии. Матриксы с триазиновой активацией и активацией? периодатным окислением оказались очень активны, что приводило к денатурации пришитого белка, и появлению белков в контроле. Хороший результат был достигнут при- пришивке S100A4 на. активированную бромцианом, сефарозу 4В (Farmacia) после оптимизации условий пришивки. Реакция проводилась в течение 1 часа при +25G, при рН 8.0. Выход составлял 50%, а конечное содержание пришитого белка около 1.5-2.0 мг/мл матрикса. Именно, при умеренной активности матрикса; коротком' времени реакции- и относительно невысокой концентрации» белка: S100A4 получался, аффинный сорбент, на котором белок S100A4 оставался в состоянии близком к нативному.

Аффинная хроматография на 8100А4-сефарозе.

В хроматографии использовалась цитоплазматическая фракция лизата клеток линий GSML-100 и CSML-0. Эти клетки имеют общее происхождение: (карциносаркома молочной железы мыши), но клетки линии GSML-100 экспрессируют высокий уровень белка S100А4 и метастазируют в легкие в 100% случаев, а клетки линии CSML-0 не экспрессируют S100A4 на детектируемом уровне и не дают метастазов. Морфология* клеток при; выращивании в культуре: различается (Рис; 5)

Клетки разрушались ультразвуком (при +4°С), цитоплазматическая фракция, представляла собой супернатант после центрифугирования в течение 1 часа при 80 000g (при +4°С).

1 2

Рис.5. Клетки линии СБМЬ-ЮО и линии СБМЬ-О при выращивании в культуре. 1 -СБМЫ), 2 - СБМЬ-ЮО.

Аффинный матрикс инкубировался с этим супернатантом при +8°С 2 часа. Оптимальное количество клеток для одного эксперимента составляло, примерно, 300-500 млн., учитывая невысокую эффективность выделения конечного продукта, необходимость подбора условий разделения белков в ПААГ и минимальное количество белка (1пМоль) пригодное для масс-спектрометри ческой идентификации. Схема проведения хроматографии была построена, исходя из свойства 8100А4, существующего преимущественно в виде гомо-димера, при связывании ионов кальция увеличивать доступность ряда гидрофобных остатков, образующих гидрофобный кластер в спирали IV, и что в таком состоянии этот белок взаимодействует с известными белками-мишенями (полипептидная цепь 8100А4 состоит из 101 а.о., образуя 4 альфа-спирали, соединенные петлями, каждая из которых содержит один домен типа ЕБ-руки, связывающий ион кальция) (Рис.1). При уходе ионов кальция это специфическое взаимодействие существенно ослабевает. Поэтому, после промывки буфером нанесения (150мМ №С1) не специфически сорбированные на 8100А4-сефарозе белки (за счет ионно-парных взаимодействий) элюировались буфером, содержащим 1М ЫаС1, в котором гидрофобное взаимодействие только усиливалось, а затем следовала элюция высокосолевым буфером (0.6М ЫаС1), содержащим 40 мМ ЭДТА. Элюированные белки концентрировались и анализировались в градиентном ПААГ (Рис.6). Аналогичные данные, полученные при оптимизации условий приготовления аффинного сорбента не приводятся.

250

100 75

50 37

1 2 3 4 5

Рис. 6. Электрофорез в градиентном, 7.5-10 % ПААГ белков, элюированных буфером, содержащим ЭДТА, с контрольного и аффинного матриксов. Окраска Кумасси 11-250.

1 - маркер молекулярного веса, 2 и 4 - элюаты с контрольного матрикса при проведении хроматографии с лизатами клеток СБМЬ-О и СБМЬ-ЮО, соответственно. 3 и 5 - элюаты с аффинного матрикса при проведении хроматографии с лизатами клеток С8МЬ-0 и СБМЬ-ЮО, соответственно.

Идентификация элюированных с аффинного сорбента белков.

Для идентификации белков был проведен электрофорез в более крутом градиенте и с большей белковой нагрузкой, чтобы увеличить шансы на идентификацую белков в некоторых слабо окрашенных зонах и иметь возможность более точно вырезать близко расположенные зоны, например, между полосами 7 и 2 , над полосой 3 и под полосой 7 в дорожке 5 (Рис. 7). Окрашенные Кумасси R-250 полосы, обозначенные цифрами, были вырезаны и подвергнуты трипсинолизу с последующей масс-спектрометрической идентификацией методом пептидного фингер-принта в Институте Физико-Химической Медицины им. Ореховича. Номера белков соответствуют номерам полос, указанных на рисунке, а полосы, в которых были обнаружены идентичные белки, обозначены одинаковыми номерами.

На примере белка, идентифицированного в полосе №2, можно легко убедиться в достоверности идентификации. Им оказался Sept 2 (Nedd 5) или септин 2 , Мг 41566 Да, gil 16924010 (код в базе данных NCBI).

Перекрывание последовательности септиина 2 пептидами из полученного масс-спектра составило 61%, а количественная оценка соответствия спектра пептидов данному белку равнялась 109 очкам (для хроматографии с лизатом клеток линии CSML-0, где количество этого белка невелико), при соответствии р < 0.05 ( для не случайного совпадения) уровню в 79 очков ( нижний предел значимости совпадения).

Рис. 7. Электрофорез в градиентном 7.5-12 % ГТААГ белков, элюированных буфером, содержащим ЭДТА, с контрольного и аффинного матриксов.

1 и 5 - элюаты с аффинного матрикса при проведении хроматографии с лизатами клеток CSML-100 и CSML-0, соответственно; 3 - маркер молекулярного веса (такой же, как на Рис.3); 2, 4 - элюаты с контрольного матрикса при проведении хроматографии с лизатами клеток CSML-100 и CSML -О, соответственно.

В приведенной ниже таблице №1 показано положение пептидов в последовательности идентифицированного белка (Start - End) их массы в дальтонах, отклонение массы пептида от расчетной (рргп -миллионные доли процента), последовательности а.о. в пептидах и возможные модификации при проведении электрофореза.

Таблица 1. Пептиды, соответствующие септину 2 (Sept2).

Start - End Mass ppm Sequence

4-29 2952.64 56 QQPTQFINPETPGYVGFANLPNQVHR

35-50 1670.80 -29 GFEFTLMWGESGLGK

35-50 1686.81 -17 GFEFTLMWGESGLGK Oxidation (M)

51-66 1881.95 -26 STLINSLFLTDLYPER

78-91 1603.75 -43 TVQIEASTVEIEER

97-116 2171.10 24 LTWDTPGYGDAINSRDCFK

117- 128 1513.67 -54 TIISYIDEQFER

129- 138 1203.50 -64 YLHDESGLNR

129 - 139 1359.61 -49 YLHDESGLNRR

175 - 183 952.57 -51 VNIVPVIAK

198 - 209 1481.71 -57 RILDEIEEHSIK

199 - 209 1325.62 -54 ILDEIEEHSIK

210-229 2437.12 17 IYHLPDAESDEDEDFKEQTR

233 - 249 1759.93 -19 ASIPFSWGSNQLIEAK

257 - 275 2285.15 11 LYPWGWEVENPEHNDFLK

278 - 300 2862.49 47 TMLITHMQDLQEVTQDLHYENFR

278 - 300 2878.54 66 TMLITHMQDLQEVTQDLHYENFR

Oxidation (М)

278 - 300 2894.51 58 TMLITHMQDLQEVTQDLHYENFR

20xidation (М)

332 -338 894.40 15 MQEMIAR Oxidation (M)

Характерным положительным фактором является наличие в спектре пептидов, содержащих, как окисленные, так и не окисленные остатки метионинов (в одном и том же пептиде), и присутствие характерных для трипсина недощеплениий по сайтам КК и Ш1.

Пептиды, способные образовываться после трипсинолиза ( щепление после К и R) и имеющие массу от 0.8 до 3 кДа присутствуют по всей длине белковой цепи, как в теоретическом, так и в реальном спектре. С теоретическими пептидными спектрами других белков спектр не совпадает со значимой вероятностью. Для всех идентифицированных септинов были получены спектры, обладающие такими же свойствами.

Белок №7. Sept7 (cdclO) или септин 7, Мг 50617 Да, gi|28173550.

Перекрывание последовательности септиина 7 пептидами из полученного масс-спектра составило 54% (Таблица №2), а количественная оценка соответствия спектра пептидов данному белку равнялась 165 очкам, при соответствии р < 0.05 ( для не случайного совпадения) уровню в 79 очков.

Таблица №2. Пептиды, соответствующие септину 7.

Start-End Mass ppm Sequence

2-13 1233.63 12 SVSARSAAAEER

14-25 1305.60 -22 SVNCGTMVAQPK Propionamide (C)

26 -42 1953.96 -11 NLEGYVGFANLPNQVYR

26 -43 2082.00 -36 NLEGYVGFANLPNQVYRK

47 -63 1826.91 -19 RGFEFTLMVVGESGLGK

47 -63 1842.92 -14 RGFEFTLMWGESGLGK Oxidation (M)

48-63 1670.86 7 GFEFTLMWGESGLGK

48-63 1686.85 7 GFEFTLMWGESGLGK Oxidation (M)

64-86 2607.38 27 STLINSLFLTDLYSPEYPGPSHR

138-147 1243.53 -25 FEDYLNAESR

158-181 2780.52 44 VQCCLYFIAPSGHGLKPLDIEFMK

Propionamide (С)

187-195 980.67 23 VNIIPLIAK

222 - 235 1757.81 41 IYEFPETDDEEENK

222 - 238 2097.98 -1 IYEFPETDDEEENKLVK

266-286 2534.23 20 QYPWGVAEVENGEHCDFTILR

Propionamide (С)

292 -298 872.46 30 THMQDLK

292-310 2377.07 -12 THMQDLKDVTNNVHYENYR

292 -310 2393.19 41 THMQDLKDVTNNVHYENYR

Oxidation (М)

299-310 1523.65 -24 DVTNNVHYENYR

334 - 344 1345.64 -6 SPLAQMEEERR

334 - 344 1361.66 7 SPLAQMEEERR Oxidation (М)

345 -351 842.51 64 EHVAKMK

372-381 1188.56 -54 LKDSEAELQR

389-395 839.48 50 NLEAQHK

403 - 408 809.41 57 QFEEEK

403 -416 1792.78 -24 QFEEEKANWEAQQR

409-416 1002.47 -4 ANWEAQQR

417-425 1074.55 -4 ILEQQNSSR

Белок№3. верП 1 (септин 11), Мг.49310 Да, ш|57634518. Перекрывание последовательности септиина 11 пептидами из полученного масс-спектра составило 51% (Таблица №3), а количественная оценка соответствия спектра пептидов данному белку равнялась 160 очкам, при соответствии р < 0.05 ( для не случайного совпадения) уровню в 79 очков.

Таблица № 3. Пептиды, соответствующие септину 11

Start - End Mass ppm Sequence

15- 34 2140.23 57 NLSLSGHVGFDSLPDQLVNK

35- 54 2132.06 23 STSQGFCFNILCVGETGIGK

Propionamide (С)

55 - 79 2807.51 63 STLMDTLFNTKFESDPATHNEPGVR

66- 79 1555.77 38 FESDPATHNEPGVR

84- 93 1224.61 21 SYELQESNVR

96- 110 1619.91 31 LTIVDTVGFGDQINK

138 - 146 1152.56 17 SLFNYHDTR

163 - 171 1050.54 -47 SLDLVTMKK Oxidation (M)

176 - 184 980.67 17 VNIIPIIAK

280 -286 876.44 15 VNMEDLR

293 -298 880.43 4 HYELYR

309 -326 2071.06 51 DTDPDSKPFSLQETYEAK

327 -336 1233.69 24 RNEFLGELQK

328 -336 1077.57 8 NEFLGELQK

343 -348 811.40 2 QMFVMR

343 -348 827.41 22 QMFVMR Oxidation (M)

387 -397 1351.68 31 ELEEEVSNFQK

400 -418 1957.13 64 AAAQLLQSQAQQSGAQQTK

В дальнейшем проверялась способность S100 A4 взаимодействовать только: с септинами, но для полноты картины необходимо перечислить ряд других идентифицированных; белков, тем более, что судить о нативности аффинного сорбента мы можем лишь по косвенным признакам; которые в данном; случае позволяют считать проведенный эксперимент корректным.

Белок № 9. В обеих хроматографиях идентифицирован, как тяжелая цепь не мышечного миозина типа ILA (ТЦНМ), Мг 226217 Да, gi|73921193. Это давно известная мишень белка S100A4, и их взаимодействие детально изучено на молекулярном уровне [72];

Белок №8М1рисутствует только в эксперименте с клетками линии CSML-100 и идентифицирован, как тяжелая цепь цитоплазматического динеина первого типа;, Мг 531710 Да, gi| 134288917.

Ранее публикаций о возможности взаимодействия этих белков не: поступало, и в данной работе этот вопрос тоже остается открытым, так как дополнительные эксперименты, для его подтверждения »не проводились.

Белок № 5. Широко известный шаперон, Hsp 70, Мг 72378 Да, (gi| 121570), способный взаимодействовать с широким спектром молекул, в число которых входит и S100A4; как было показано ранее [87],

Белок №1. Актин-гамма: (Мг. 3 8: кДа) - обычный фоновый? белок большинства аффинных хроматографий с цитоплазматической фракцией.

Следует отметить небольшое присутствие бетта-тубулина (между полосами 7 и 3 при хроматографии с лизатами клеток линии CSML-100) и альфа-тубулина (Полоса № 4), являющихся в данном случае такими же фоновыми белками, как и актин. Важным является то обстоятельство, что тубулины и актин присутствуют в обоих элюатах в минорных количествах, а аффинный сорбент селективно выбирает септины из множества обильно представленных в цитоплазматическом компартменте белков, среди которых септины далеко не самые многокопийные, и набор выделенных септинов соответствует их ранее известному сочетанию при образовании септиновых гетеро-олигомеров и филаментов. При агрегации белков цитоплазматического компартмента, как правило, многократно преобладают актины и тубулины и присутствует множество других белков во всем диапазоне молекулярных масс в существенных количествах. В контроле же, практически, не видно четких окрашенных зон, кроме двух, которые не были достоверно идентифицированы ввиду малого.количества материала. Обращает на себя внимание и то обстоятельство, что в обоих экспериментах выделяется сопоставимое колическтво септина 7 и ТЦНМ IIA, но паттерны выделенных септинов различается между клеточными линиями, проявляя явное преобладание септина 7 (линия CSML-0) и близкое к 1:1:1 соотношение септинов 2/7/11 (линия CSML-100), согласующееся с публикациями по реконструкции септиновых филаментов in vitro [88, 89, 90, 91]. Все вышесказанное дает повод считать, что хроматография, проведенная по разработанному протоколу, вполне коректна, а аффинный сорбент близок к нативному состоянию. Тем не менее, эти данные требуют подтверждения с помощью других экспериментов, в которых необходимо участие эндогенного белка S100A4 в нативном состоянии: при отсутствии дополнительных эпитопов и ковалентных связей с каким-либо матриксом.

Взаимодействие эндогенного S100A4 с рекомбинантными септинами Sept6^ и Sept7.

Свойства молекул септинов.

У млекопитающих на сегодняшний день обнаружено 14 септинов [92], не считая сплайс-варианты, молекулы которых устроены по общему сходному принципу: компактный глобулярный домен, около 4 нм в диаметре, связывающий ГДФ/ГТФ, на N-конце и фибриллярный домен типа «coiled-coil» на С-конце, примерно, 15 нм. [89]. Септины способны образовывать гетеро- и гомо-димеры и гетеро-олигомеры различного состава, именно благодаря фибриллярному домену, а структуры- более высокого порядка образуются за счет взаимодействия глобулярных доменов, находящихся в молекулах септинов, составляющих соседствующие филаменты [93, 89, 94]. В данном случае мы имеем дело с гетеро-олигомером состава Sept2/7/ll. Септин 7 является основой для формирования гетеро-олигомеров различного состава, тогда как септин 2 может образовывать монополимер самостоятельно. Септин 11 может быть заменен на другие гомологичные ему септины: Sept8 или Sept б [95]. По результатам проведенной аффинной хроматографии связывание с S100A4, в первую очередь, может происходить через септин 7. При использовании рекомбинантного септина 7 в экспериментах по проверке его способности селективно взаимодействовать с эндогенным S100A4 из опухолевых клеток основная трудность заключается, в том, что в клетках Е. coli рекомбинантный септин 7 продуцируется преимущественно в виде нерастворимого продукта, и в индивидуальном состоянии септин 7 склонен агрегировать в физиологических солевых условиях. Проблема агрегации этого септина возникает и при его экспрессии в клетках наксекомых. С другой стороны, септин 2 является убиквитарным для клеток млекопитающих, а септины 6 и 11 присутствуют во многих, если не в подавляющем большинстве, типах клеток. Поэтому при использовании метода ко-иммунопреципитации септина 7, например, мы будем иметь дело с гетеро-олигомером септинов состава: Sept2/7/6, Sept2/7/ll, Sept2/7/8, Sept5/7/ll или Sepr7/9b/ll[93, 94, 96], a при создании аффинного матрикса на основе септина 7 необходима экспрессии его в Е. coli с использованием бицистронного вектора, экспрессирующего другой септин, способный образовывать с септином 7 растворимые гетеро-димеры, например, Sept, 11 или Sept 6.

Выделение рекомбинантных септинов, Sept6 и Sept7, с использованием бицистронного вектора.

Было принято решение ко-экспрессировать септины 6 и 7 в клетках E.coli и провести аффинную хроматографию с лизатом клеток, экспрессирующих S100A4, на SeptT7/Sept6-Ni-NTA-arapo3e.

Был использован- бицистронный вектор на основе плазмиды рЕТ-30, содержащий в первом цистроне Sept6 с шестигистидиновым эпитопом на N-конце, а во втором - Sept7 без дополнительных посторонних аминокислотных остатков,

Экспрессия септинов осуществлялась в штамме BL21DE3: Белки выделялись на металлохелатном матриксе, агарозе Ni-NTA. Септин 6 сорбировался, на матриксе за счет эпитопа из 6-ти гистидинов, а септин 7 образовывал с септином 6 гетеро-димер. Выход белка, примерно, 90% чистоты в элюатах с 80мМ имидазолом составлял около 2 мг с 200 мл культуры клеток (Рис. 8).

Рис.8. Выделение септинов 6 и 7 на М-ЫТА агарозе с бицистронного использованием вектора. Электрофорез выделенных белков в 12% ПААГ.

Выделенные белки использовались сразу же для проведения аффинной хроматографии.

Поликлональные кроличьи антитела к 8100А4 (МТ81).

Антитела к 8100А4(МТ81) были получены в результате иммунизации кролика рекомбинантным 8100А4 и очищены на аффинном матриксе, 8100А4-сефарозе СЬ6-В. Специфичность антител проверялась методом иммуноблотинга. В качестве образцов использовался рекомбинантный 8100А4 и лизаты клеточных линий: С26 и С8МЫ00, экспрессирующих высокий уровень данного белка, а также линии НЕК 293, не экспрессирующей белок 8100А4 (Рис. 9).

2 3 4

Рис.9 Обнаружение белка 8100А4 в лизатах клеточных линий с помощью кроличьих, аффинно очищенных поликлональных антител.

1. Лизат клеток линии СБМЫОО

2. Лизат клеток линии С26

3. Лизат клеток линии НЕК 293.

4. Рекомбинантный белок 8100А4 (20 нг)

Из данного эксперимента можно сделать вывод, что используемые в работе антитела к белку 8100А4 обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Они были использованы в дальнейшей работе.

Проведение аффинной хроматографии на 8ер1б/8ер17-М-]ЧТА-агарозе.

Целью данного эксперимента была проверка возможности взаимодействия димера рекомбинантных септинов, 8ер1б/8ер17, с эндогенным 8100А4, обильно экспрессируемым опухолевыми клетками линии С26. При приготовлении аффинного матрикса выделенные септины, 8ер1б/8ер17, оставались сорбированными на металлохелатном матриксе (около 200-300 мкг/мл), так как элюция 80 мМ имидазолом в данном случае не проводилась. Полученный таким образом аффинный сорбент использовался в течение суток для проведения аффинной хроматографии по той же схеме, что и для 8100А4-сефарозы, но с добавлением отмывки 40мМ имидазолом перед отмывкой буфером с 1М хлоридом натрия. При элюции буфером, содержащим 50 мМ ЭДТА, септины вместе с сорбировавщимися на них белками оказывались в элюате. Элюаты с аффинного и контрольного сорбентов, а также «проскок» с аффинного сорбента (не связавшиеся белки) анализировались методом иммуноблоттинга с использованием описанных выше поликлональных антител к белку 8100А4(МТ81) (Рис. 10).

15 кДа -----

12 3

Рис.10. Иммуноблоттинг элюатов с поликлональными антителами к Б100А4 (МТ81).

1-элюат в буфере, содержащем ЭДТА, с аффинного сорбента, 2- «проскок» с аффинного сорбента, 3- элюат в буфере, содержащем ЭДТА, с контрольного (без септинов 6 и 7) сорбента.

По результатам иммуноблоттинга можно сделать вывод, что более половины эндогенного 8100А4 из цитоплазматической фракции клеточного лизата селективно сорбировалось на аффинном матриксе. В контроле сигнал практически отсутствует. При этом следует учесть, что часть септинов (10-20%) элюируется с матрикса при отмывке 40 мМ имидазолом. При анализе элюатов в ПААГ, окрашенных Кумасси Я-250, не наблюдалось видимой агрегации цитоплазматических белков на аффинном и контрольном матриксе. Таким образом, можно заключить, что достаточно эффективная сорбция эндогенного 8100А4 происходит именно на септинах. Интересно отметить, что при диализе против низкосолевого буфера (около4 150 мМ ИаС1) 8100А4 через несколько суток перестает детектироваться на иммуноблоттинге, но заметного уменьшения количества септинов > в растворе не наблюдается. Известно, что некоторые сетиновые гетеродимеры и мономеры склонны выпадать в осадок при понижении ионной силы буфера (50 мМ №01), особенно септин 7. В этом плане интересным представляется эксперимент по реконструкции септиновых филаментов in vitro в присутствии S100A4.

Аффинная хроматография с использованием очищенных рекомбинантных белков: S100A4, Sept6 и Sept7.

Лизаты клеток, использованных в работе клеточных линий, представляют собой сложные смеси белков, среди которых присутствуют и различные септины. Аффинная хроматография с использованием очищенных белков представляется в данном исследовании необходимым этапом. Для ее проведения был использован аффинный сорбент, представляющий собой S100A4-сефарозу, приготовленную тем же способом, как и в первом эксперименте (4 мг S100A4 на мл, матрикса). Данный сорбент (0.7 мл) инкубировался в 3 мл буфера (40мМ Tpis-HCl рН 7.5, 0.2 M NaCl, 5мМ (З-меркаптоэтанол, 0.1% Tween-20) содержащего 30 мкг/мл рекомбинантного гетеро-димера Sept6/7 или 30 мкг/мл рекомбинантного гетеро-димера Sept6/7 и 1.5 мг/мл рекомбинантного S100A4 (конкурент за связывание с аффинным сорбентом). Затем сорбент промывался по той же схеме, как и в первой аффинной хроматографии , и элюаты в буфере с 50 мМ ЭДТА анализировались в ПААГ, окрашенном Кумасси R-250 (Рис.11).

50 кДа

Рис. 11. Аффинная; хроматография иа S100A4-сефарозе с рекомбинантными Sept6/7. Элюаты в буфере с ЭДТА в отсутствии растворимого S100A4 (дорожка 1), и в присутствии 1.5 мг/мл 8100А4 (дорожка 2) во время инкубации S100А4-сефарозы с рекомбинантными Sept6/7.

1 2

В данном эксперименте наблюдается конкуренция между растворимым S100A4 и иммобилизованным на матриксе за связывание с рекомбинантными септинами, присутствующими в растворе. Это подтверждает способность S100A4 селективно взаимодействовать с димером состава Sept7/6 вообще и с Sept7 в частности.

Дальнейшие перспективы.

Изучение деталей межмолекулярного взаимодействия S100А4 и Sept7 in vitro осложняется низкой растворимостью последнего. Даже простые эксперименты с аффинной хроматографией рекомбинантных белков не могут быть коректно интерпретированы при использовании мономеров Sept? и Sept6, так как Sept6 в индивидуальном состоянии склонен к агрегации в физиологических солевых условиях, а его взаимодействие с аффинным матриксом при концентрации хлорида натрия равной 0.5М может быть артефактом используемой системы. Перебор сочетаний септиновых гетеро-димеровя тоже приводит к ситуации, когда наличие второго септина ставит новые вопросы, как в случае с белком* Вог§3 [97, 98], не давая однозначного ответа о возможности взаимодействия того или другого септина с 8100А4 в мономерном состоянии. Эту ситуацию может разрешить только кристаллографическое исследование молекулярного комплекса указанных белков или использование большого набора мутантных молекул септина 7 и 11. Остается полагаться на результаты аффинной хроматографии с лизатами клеток линии СБМЬ-О, где относительное количество септина 7 убедительно свидетельствует в пользу его способности взаимодействовать с 8100А4 без участия септина 2 и 11. Однако, это не говорит о неспособности септина 11 или септина 6 образовывать комплексы с. 8100А4. Следует помнить, что эксперименты по аффинной хроматографии, с чистыми рекомбинантными белками-чреваты артефактами и сами по себе не являются доказательством? возможности взаимодействия данных белков; в клетке. А при использовании клеточных лизатов выделяется набор септинов, формирующих гетеро-олигомеры различного состава.

Так как в данной работе ставилась задача: выявления феномена как такового, то трудоемкие эксперименты по ¿его детализации, по-видимому, лягут в основу дальнейшего, исследования.

Еще одной проблемой является слабая изученность на молекулярном уровне функции» септиновых филаментов в клетках млекопитающих и практически полное отсутствие информация' о сигнальных путях, регулируемых с участием гетеро-филаментов различного состава (8ер12/6/7, 8ерг2/11/7, 8ер14/5/8, 8ерг4/9Ь/11 и т.д.). Наши знания на сегодня ограничиваются лишь связью клеточного фенотипа или феномена (цитокинез [99], эндоцитоз, образование аксонов нейронов [100], организация микротрубочек [101] и структур более высокого порядка [102,103]) с присутствием того или иного септина в соответствующем компартменте и влиянием малых ГТФ-аз семейств Cdc42 [89, 98, 104] и Rho [105] на организацию некоторых септиновых структур. Молекулярный механизм этого влияния на сегодняшний день не известен, так же как механизм регулирования- динамики и локализации септиновых филаментов через фосфорилирование отдельных септинов [106, 107, 108, 109]. В этой ситуации представляет интерес способность S100A4 ингибировать фосфорилирование по Ser 1917 ТЦНМ IIA протеинкиназой С [73,74], и наличие сайта фосфорилирования для данной киназы в аннексине II, именно в том районе, через который происходит его взаимодействие с S100A4 [66]. Более того, S100A4 способен ингибировать сборку филаментов, образованных ТЦНМ IIA, взаимодействуя с данным, белком через его С-концевой участок типа «coiled coil» [74, 75]. Домен с такой же вторичной структурой принимает участие в образовании гетеро-димеров септинов 2/6/7.

В свете изучения феномена инвазии опухолевых и нормальных клеток, нас, прежде всего, интересует Sept7, являющийся незаменимым компонентом большинства известных сегодня вариантов септиновых гетеро-филаментов. Делеция гена этого септина приводит к неспособности мицелия С. Albicans проникать в почечный эпителий инфицированных мышей [110], а ингибирование его экспрессии с помощью siRNA в клетках нейронов гиппокампа приводит к образованию редуцированных и неправильно сформированных аксонов [111]. В этих не связанных, на первый взгляд, явлениях может быть заложен эволюционно консервативный механизм управления структурой и временной организацией больших участков цитоплазмы под клеточной мембраной, идущий от дрожжей до клеток высших эукариот. Возможно, что в формировании выростов цитоплазмы и определении их дальнейшей судьбы важную роль играют комплексы, формирующиеся на филаментах, образованных Sept2/7/ll, Sept2/7/6 или другим сочетанием септинов. Пока неизвестно, является ли Sept7 в данных структурах [112] только незаменимым «строительным материалом» или через него может осуществляться какая-то регуляция. Достижение прогресса в понимании этих молекулярных событий представляется весьма интригующей задачей. выводы.

1. Разработан протокол проведения аффинной хроматографии, с помощью которой возможен поиск и идентификация цитоплазматических белков, способных селективно взаимодействовать с S100A4(MTS1).

2. Впервые было обнаружено селективное взаимодействие с S100A4-сефарозой септинов Sept2, Sept7 и Septll, а также тяжелой цепи цитоплазматического динеина первого типа.

3. Паттерн септинов, выделяемых на 8100А4-сефарозе из цитоплазматической фракции лизата клеток линии CSML-0, не формирующих метастазы, отличается от паттерна, наблюдаемого в аналогичном эксперименте с использованием клеток линии CSML-100, обладающих высоким метастатическим потенциалом.

4. Аффинная хроматография на 8100А4-сефарозе в совокупности с хроматографией на Sept7/Sept6-Ni-NTA-ceфapoзe подтверждают возможность специфического взаимодействия эндогенного белка S100A4, экспрессируемого опухолевыми клетками, с гетеро-димерами и гетеро-олигомерами септинов, содержащими Sept7.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Ebralidze A'., Tulchinsky Е., Grigorian М. et al. Isolation and characterization of a gene specifically expressed in different metastatic cells and whose deduced gene product has a high degree of homology to,a Ca2+-binding protein family.// Genes Dev. 1989. V. 3(7). P. 1086-93.

2. Strutz F., Okada H., Lo C. W., et al. Identification and characterization of a fibroblast marker: FSP1 // Ji Cell Biol. 1995. V.130. P. 393-405.

3. Tulchinsky E., Ford H. L., Kramerov D., et al. Transcriptional analysis of the mtsl gene with specific reference to 54л flanking sequences. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA.1992.V. 89. №. 19. P. 9146-9150.

4. Jackson-Grusby L. L., Swiergiel J., and Linzer D. I. A growth-related mRNA in cultured mouse cells encodes a placental calcium binding protein. //Nucleic Acids Res. 1987. V. 15(16). P. 6677-6690.

5. Barraclough R., Savin J., Shyam K. et al. Molecular cloning and sequence of the gene for p9Ka a cultured myoepithelial cell protein with strong homology to S-100, a calcium-binding protein. // J. Mol. Biol. 1987.V. 198. P. 13-20.

6. Polans A.S., Palczewski K., Asson-Batres M.A. et al. Purification and primary structure of Capl, an S-100-related calcium-binding protein isolated from bovine retina. // J Biol. Chem. 1994. V. 269(8). P. 6233-40.

7. Masiakowski P., and Shooter E. M. Nerve growth factor induces the genes for two proteins related to a family of calcium-binding proteins in PC-12 cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988. V. 85. P. 1277-1281.

8. Engelkamp, D., Schafer, B. W., Erne, P. et al. S100 alpha, CAPL, and CACY: molecular cloning and expression analysis of three calcium-binding proteins from human heart. // Biochemistry. 1992. V. 31(42). P. 10258-64.

9. Watanabe, Y., Kobayashi, R., Ishikawa, T. et al. Isolation and characterization of a calcium-binding protein derived from mRNA termed» p9Ka, pEL-98, 18A2, or 42A by the newly synthesized vasorelaxant W-66 affinity chromatography. // Arch Biochem Biophys. 1992. V. 292(2). P: 563-9.

10. Rudl'and PS, Platt-Higgins A, Renshaw C. et al. Prognostic significance of the metastasis-inducing protein S100A4 (p9Ka) in human breast cancer. // Cancer Res. 2000. V. 60(6). P. 1595-603.

11. Platt-Higgins AM, Renshaw CA, West CR, et al. Comparison of the metastasis-inducing protein S100A4 (p9ka) with other prognostic markers in human breast cancer. // Int J Cancer. 2000. V. 89(2). P. 198-208.

12. Kimura K, Endo Y, Yonemura Y. et al. Clinical significance' of S100A4 and E-cadherin-related adhesion molecules in non-small cell lung cancer. // Int J Oncol. 2000. V. 16(6). P. 1125-31.

13. Saleem M, Adhami VM, Ahmad N. et al. Prognostic significance of metastasis-associated protein S100A4 (Mtsl) in prostate cancer progression and chemoprevention regimens in an autochthonous mouse model. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11(1). P. 147-53.

14. Davies BR, O'Donnell M, Durkan GC. et al. Expression of S100A4 protein is associated with metastasis and reduced survival in human bladder cancer. // J Pathol. 2002. V. 196(3). P. 292-9.

15. Rosty C, Ueki T, Argani P. et al. Overexpression of S100A4 in pancreatic ductal adenocarcinomas is associated with poor differentiation and DNA hypomethylation. //Am J Pathol. 2002. V. 160(1). P. 45-50.

16. Yonemura Y, Endou Y, Kimura K. et al. Inverse expression of S100A4 and E-cadherin is associated with metastatic potential in gastric cancer. // Clin Cancer Res. 2000. V. 6(11). P. 4234-42.

17. Andersen K, Nesland JM, Holm R. et al. Expression- of S100A4 combined with reduced E-cadherin expression predicts patient outcome in malignant melanoma. // Mod Pathol. 2004. V. 17(8). P. 990-7.

18. Ryu B., Jones J., Blades N.J. et al. Relationships and differentially expressed genes among1 pancreatic cancers examined by large-scale serial analysis of gene expression.// Cancer Res. // 2002. V. 62(3). P. 819-26.

19. Missiaglia E, Blaveri E, Terris B. et al. Analysis of gene expression in cancer cell lines identifies candidate markers for pancreatic tumorigenesis and metastasis. // Int J Cancer. 2004. V. 112(1). P. 100-12.

20. Sato N., Fukushima N., Maitra A. et al. Gene expression profiling identifies genes associated with invasive intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas. // Am J Pathol. 2004. V. 164(3). P. 903-14.

21. Cui J.F., Liu Y.K., Pan B.S. et al. Differential proteomic analysis of . human hepatocellular carcinoma cell line metastasis-associated proteins. // J Cancer Res Clin Oncol. 2004. V. 130(10). P. 615-22.

22. Davies B.R., Barraclough R., Davies M.P. et al. Production of the metastatic phenotype by DNA transfection in a rat mammary model. // Cell Biol Int. 1993. V. 17(9). P. 871-9.

23. Takenaga K., Nakamura Y., Sakiyama S. Expression of antisense RNA to S100A4 gene encoding an SlOO-related calcium-binding protein suppresses metastatic potential of high-metastatic Lewis lung carcinoma cells. // Oncogene. 1997. V. 14(3). P. 331-7.

24. Ambartsumian N.S., Grigorian M.S., Larsen I.F. et al. Metastasis of mammary carcinomas in GRS/A hybrid mice transgenic for the mtsl gene. //Oncogene. 1996. V. 13(8). P. 1621-30.

25. Vallely K.M., Rustandi R.R., Ellis K.C. Solution structure of human Mtsl (S100A4) as determined by NMR spectroscopy. // Biochemistry. 2002. V. 41(42). P. 12670-80. 26. Tarabykina S., Scott D.J., Herzyk P. et al. The dimerization interface of the metastasis-associated protein S100A4 (Mtsl): in vivo and in-vitro studies. // J Biol Chem. 2001. V. 276(26). P. 24212-22.

27. Zhang S., Wang G., Liu D. The C-terminal region of S100A4 is important for its metastasis-inducing properties. // Oncogene. 2005. V. 24(27). P. 4401-11.

28. Tulchinsky E.M., Grigorian M.S., Ebralidze A.K. et al. Structure of gene mtsl, transcribed in metastatic mouse tumor cells. // Gene. 1990. V. 87(2). P. 219-23.

29. Tulchinsky E., Kramerov D., Ford H.L. et al. Characterization of a positive regulatory element in the mtsl gene. // Oncogene. 1993. V. 8(1). P. 79-86.

30: Tulchinsky EM, Georgiev GP, Lukanidin EM. Novel AP-1 binding site created by DNA-methylation. //Oncogene. 1996. V. 12(8). P. 1737-45.

31. Tulchinsky E., Prokhortchouk E., Georgiev G. et al. A kappaB-related binding site is an integral part of the mtsl gene composite enhancer element located in the first intron of the gene. // J Biol Chem. 1997. V. 272(8). P. 4828-35.

32. Cohn M.A., Hjelmso I., Wu L.C. et al. Characterization of Spl, AP-1, CBF and KRC binding sites and minisatellite DNA as functional elements of the metastasis-associated mtsl/S100A4 gene intronic enhancer.Nucleic Acids Res. 2001. V. 29(16). P. 3335-46.

33. Hjelmsoe I., Allen C.E., Cohn M.A. et al. The kappaB and V(D)J recombination signal sequence binding protein KRC regulates transcription of the mouse metastasis-associated gene S100A4'/mtsl. // J Biol Chem. 2000. V. 275(2). P. 913-20.

34. Prokhortchouk E.B., Prokhortchouk A.V., Rouzov A.S. et al. A minisatellite "core" element constitutes a novel, chromatin-specific activator of mtsl gene transcription. // J Mol Biol. 1998. V. 280(2). P. 227-36.

35. Ito Y. Oncogenic potential of the RUNX gene family: 'overview1. // Oncogene. 2004. V. 23(24). P: 4198-208. Review.

36. Prokhortchouk A., Hendrich B., Jorgensen H. et al. The pl20 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. // Genes Dev. 2001. V. 15(13). P. 1613-8.

37. Kohya N., Kitajima Y., Jiao W. et al. Effects of E-cadherin transfection on gene expression of a gallbladder carcinoma cell line: repression of MTS1/S100A4 gene expression. // Int J Cancer. 2003 . V. 104(1). P. 44-53.

38. Stein U, Arlt F, Walther W. et al.The metastasis-associated gene S100A4 is a novel target of beta-catenin/T-cell factor signaling in colon cancer. // Gastroenterology. 2006. V. 131(5). P. 1486-500.

39. Komori T., Yagi H., Nomura S. et al. Targeted disruption of Cbfal results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. // Cell. 1997. V. 89(5). P. 755-64.

40. Duarte W.R, Iimura T., Takenaga K. et al. Extracellular role of S100A4 calcium-binding protein in the periodontal ligament. // Biochem Biophys Res Commun. 1999. V. 255(2). P. 416-20.

41. Duarte W.R, Shibata T., Takenaga K et al. S100A4: a novel negative regulator of mineralization and osteoblast differentiation. // J Bone Miner Res. 2003. V. 18(3). P. 493-501.

42. Grigorian M.S., Tulchinsky E.M., Zain S., et al. The mtsl gene and control of tumor metastasis. // Gene. 1993. V. 135(1-2). P. 229-38.

43. Takenaga K., Nakamura Y., Sakiyama S. Cellular 1 ocalization of pEL98 protein, an SlOO-related calcium binding protein, in fibroblasts and its tissue distribution analyzed by monoclonal antibodies. // Cell Struct Funct. 1994. V. 19(3). P. 133-41.

44. Kozlova E.N., Lukanidin E. Metastasis-associated mtsl (S100A4) protein is selectively expressed, in white matter astrocytes and is up-regulated after peripheral nerve or dorsal root injury. // Glia. 1999. V. 27(3). P. 249-58.

45. Eckert L., Broome A.M, Ruse M. et al. SI00 proteins in the epidermis. // J Invest Dermatol. 2004. V. 123(1). P. 23-33. Review.

46. Kawakita T., Espana E.M., He H. et al. Intrastromal invasion by limbal epithelial cells is mediated by epithelial-mesenchymal transition activated byair exposure. // Am. J Pathol. 2005. V. 167(2). P. 381-93.

47. Watanabe Y., Usuda N., Tsugane S. et al. Calvasculin, an encoded protein from mRNA termed pEL-98, 18A2, 42A, or p9Ka, is secreted by smooth muscle cells in culture and exhibits Ca(2+)-dependent binding to 36-kDa microfibril-associated glycoprotein. // J Biol Chem. 1992. V. 267(24). P. 17136-40.

48. Yammani R.R., Carlson C.S., Bresnick A.R. et al. Increase in production of matrix metalloproteinase 13 by human articular chondrocytes due to stimulation with S100A4: Role of the receptor for advanced glycation end products // Arthritis Rheum. 2006. V. 54(9). P. 2901-11.

49. Kwapiszewska G., Wilhelm J., WolffS. Expression profiling of laser> microdissected intrapulmonary arteries in hypoxia-induced pulmonary > hypertension. // Respir Res. 2005. V. 6. P. 109.

50. Sakaguchi T., Yan S.F/, Yan S.D., Central role of RAGE-dependent neointimal expansion in arterial restenosis. // J Clin Invest. 2003. V. 111(7). P. 959-72.

51. Lawrie A., Spiekerkoetter E., Martinez E.C. et al., Interdependent serotonin transporter and receptor pathways regulate S100A4/Mtsl, a gene associated with pulmonary vascular disease. // Circ Res. 2005. V. 97(3). P. 227-35.

52. Senolt L., Grigorian M., Lukanidin E. et al. S100A4 is expressed at site of invasion in rheumatoid arthritis synovium and modulates production of matrix etalloproteinases. // Ann Rheum Dis. 2006. V. 65(12):1645-8.

53. Foell D., Roth J. Proinflammatory SI00 proteins in arthritis and autoimmune disease. // Arthritis Rheum. 2004. V. 50(12). P. 3762-71.

54. Hofmann M.A., Drury S., Hudson B.I. et al. RAGE and arthritis: the G82S polymorphism amplifies the inflammatory response. // Genes Immun. 2002. V. 3(3). P. 23-35.

55. Kozlova E.N., Lukanidin E. Metastasis-associated mtsl (S100A4) protein is selectively expressed in white matter astrocytes and is up-regulated after peripheral nerve or dorsal root injury. // Glia. 1999. V. 27(3). P. 249-58.

56. Takenaga K., Kozlova E.N. Role of intracellular S100A4 for migration of rat astrocytes. // Glia. 2006. V. 53(3). P. 313-21.

57. Fang Z., Forslund N., Takenaga K. et al. Sensory neurite outgrowth on white matter astrocytes is influenced by intracellular and extracellular S100A4 protein. // J Neurosci Res. 2006. V. 83(4). P. 619-26.

58. Fang Z., Duthoit N., Wicher G. et al. Intracellular calcium-binding protein S100A4 influences injury-induced migration of white matter astrocytes. // Acta Neuropathol (Berl). 2006. V. 111(3). P. 213-9.

59. Novitskaya V., Grigorian M., Kriajevska M. et al. Oligomeric forms of the metastasis-related Mtsl (S100A4) protein stimulate neuronal differentiation in cultures of rat hippocampal neurons. // J Biol Chem. 2000. V. 275(52). P. 41278-86.

60. Kiryushko D., Novitskaya V., Soroka V. Molecular mechanisms of Ca(2+) signaling in neurons induced by the S100A4 protein. // Mol Cell Biol. 2006. V. 26(9). P. 3625-38.

61. Gao X.N., Tang< S.Q., Zhang X.F. S100A4 antisense oligodeoxynucleotide suppresses invasive potential of neuroblastoma cells. // J Pediatr Surg. 2005. V. 40(4). P. 648-52.

62. Saleem M., Kweon M.H., Johnson J.J. S100A4 accelerates tumorigenesis and invasion of human prostate cancer through' the transcriptional regulation of matrix metalloproteinase 9. // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V. 103(40). P.14825-30.

63. Bjornland K., Winberg J.O., Odegaard O.T. Et al. S100A4 involvement in metastasis: deregulation of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in osteosarcoma cells transfected with an anti-S100A4 ribozyme. // Cancer Res. 1999. V. 59(18). P. 4702-8.

64. Jenkinson S.R., Barraclough R., West C.R., Rudland P.S. 100A4 regulates cell motility and invasion in an in vitro model for breast cancer metastasis. // Br J Cancer. 2004. V. 90(1). P. 253-62.

65. Schmidt-Hansen B., Ornas D., Grigorian M. Extracellular S100A4(mtsl) stimulates invasive growth of mouse endothelial cells and modulates MMP-13 matrix metalloproteinase activity. // Oncogene. 2004. V. 23(32). P. 5487-95.

66. Semov A., Moreno M.J., Onichtchenko A. Metastasis-associated protein S100A4 induces angiogenesis through interaction with Annexin II and accelerated plasmin formation. // J Biol Chem. 2005. V. 280(21). P. 20833-41.

67. Kato C., Kojima T., Komaki M. et al. S100A4 inhibition by RNAi up-regulates osteoblast related genes in periodontal ligament cells. // Biochem Biophys Res Commun. 2005. V. 326(1). P. 147-53.

68. Baudier J., Delphin C., Grunwald D. Characterization of the tumor suppressor protein p53 as a protein kinase C substrate and a SI00b-binding protein. //Proc Natl Acad Sci USA. 1992. V. 89(23).

P: 11627-31.

69. Grigorian M., Andresen S., Tulchinsky E. et al. Tumor suppressor p53 protein is a new target for the metastasis-associated Mtsl/S100A4 protein: functional consequences of their interaction. // J Biol Chem. 2001. V. 276(25). P. 22699-708.

70. Fernandez-Fernandez M.R., Veprintsev D.B., Fersht A.R. Proteins of the SI00 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102(13). P. 4735-40.

IV. Naaman C., Grum-Schwensen B., Mansouri A. et al. Cancer predisposition in mice deficient for the metastasis-associated' Mtsl(S100A4) gene. // Oncogene. 2004. V. 23(20). P. 3670-80.

72. Kriajevska M.V., Cardenas M.N., Grigorian M. et al. Non-muscle myosin heavy chain as a possible target for protein encoded by metastasis-related mtsl gene. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 19679-19682.

73. Kriajevska M., Tarabykina S., Bronstein I. et al. Metastasis-associated Mtsl (S100A4) protein modulates protein kinase C phosphorylation of the heavy chain of nonmuscle myosin. // J Biol Chem. 1998. V. 273(16). P. 9852-6.

74. Li Z.H., Spektor A., Varlamova O. et al. Mtsl regulates the assembly of nonmuscle myosin-IIA. // Biochemistry. 2003. V. 42(48). P. 14258-66.

75. Kriajevska M., Bronstein I.B., Scott D.J. et al. Metastasis-associated protein Mtsl (S100A4) inhibits CK2-mediated phosphorylation and selfassembly of the heavy chain of nonmuscle myosin. // Biochim Biophys Acta. 2000. V. 1498(2-3). P. 252- 29.

76. Dulyaninova N.C., Malashkevich V.N., Almo S.C. et al. Regulation of myosin-IIA assembly and Mtsl binding by heavy chain phosphorylation. // Biochemistry. 2005. V. 44(18): P. 6867-76.

77. KimE.J., Helfman D.M. Characterization of the metastasis-associated protein, S100A4. Roles of calcium binding and dimerization in cellular localization and interaction with myosin. // J Biol Chem. 2003. V. 278(32). P. 30063-73.

78. Tarabykina S., Kriajevska M:, Scott D.J. et al. Heterocomplex formation between metastasis-related protein S100A4 (Mtsl) and S100A1 as revealed by the yeast two-hybrid system. // FEBS Lett. 2000. V. 475(3). P: 187-91.

79. Wang G., Zhang S., Fernig D.G. et al. Mutually antagonistic actions of S100A4 and S100A1 on» normal and metastatic phenotypes. // Oncogene. 2005. V. 24(8). P. 1445-54.

80. Kriajevska M., Fischer-Larsen M., Moertz E. et al. Liprin- betal, a member of the family of LAR transmembrane tyrosine phosphatase-interacting proteins, is a new target for the metastasis-associated protein S100A4(Mtsl). // J Biol Chem. 2002. V. 277(7). P. 5229-35.

81. Debant A., Serra-Pages C., Seipel K. et al. The multidomain protein Trio binds the LAR transmembrane tyrosine phosphatase, contains a protein kinase domain, and has separate rac-specific and rho-specific guanine nucleotide exchange factor domains. // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93(11). P. 5466-71.

82. Li C.L., Martinez V., He B. et al. A role for CCN3 (NOV) in calcium signaling. // Mol Pathol. 2002. V. 55(4). P. 250-61.

83. Takenaga K, Nakamura Y, Sakiyama S. et al. Binding of pEL98 protein, an SlOO-related calcium-binding protein, to nonmuscle tropomyosin. //J Cell Biol. 1994. V. 124(5). P. 757-68.

84. Grum-Schwensen B., Klingelhofer J., Berg C.H. Suppression of tumor development and metastasis formation in mice lacking the S100A4(mtsl>gene. // Cancer Res. 2005. V. 65(9). P. 3772-80.

85. Schmidt-Hansen B., Klingelhofer J., Grum-Schwensen B. et al. Functional significance of metastasis-inducing S100A4(Mtsl) in tumorstroma interplay. // J Biol Chem. 2004. V. 279(23). P. 24498-504.

86. Mahon PC., Baril P., Bhakta V., et al. S100A4 contributes to the suppression of BNIP3 expression, chemoresistance, and inhibition of apoptosis in pancreatic cancer.// Cancer Res. 2007. Vol. 67(14).

P. 6786-95.

87. Sashchenko LP, Dukhanina EA, Yashin DV., et al. Peptidoglycan recognition protein tag7 forms a cytotoxic complex with heat shock protein 70 in solution and in lymphocytes. // J Biol Chem. 2004. Vol. 279(3).

P. 2117-24.

88. Sheffield PJ., Oliver CJ., Kremer BE., et al. Borg/septin interactions and the assembly of mammalian septin heterodimers, trimers, and filaments. // J Biol Chem. 2003. Vol. 278(5). P. 3483-8.

89. Low C., Macara IG. Structural analysis of septin 2, 6, and 7 complexes. // J Biol Chem. 2006; Vol. 281(41). P. 30697-706.

90. Kinoshita M., Field CM., Coughlin ML., et al. Self- and actin-templated'assembly of Mammalian septins. // Dev Cell. 2002. Vol. 3(6). P. 791-802.

91. Mendoza M., Hyman A., Glotzer M. GTP binding induces filament assembly of a recombinant septin. //Curr Biol. 2002. Vol. 12(21). P. 185863.

92. Macara IG., Baldarelli R., Field CM., et al. Mammalian septins nomenclature. // Mol Biol Cell. 2002. Vol. 13(12). P. 4111-3.

93. Versele M., Gullbrand B., Shulewitz MJ., et al. Protein-protein interactions governing septin heteropentamer assembly and septin filament organization in Saccharomyces cerevisiae. //Mol Biol Cell. 2004. Vol. 15(10). P. 4568-83.

94. Nagata K., Asano T., Nozawa Y., et al. Biochemical and cell biological analyses of a mammalian septin complex, Sept7/9b/ll. // J Biol Chem. 2004. Vol. 279(53). P. 55895-904.

95. Hanai N., Nagata K., Kawajiri A., et al. Biochemical and cell biological characterization of a mammalian septin, Septll. // FEBS Lett. 2004. Vol. 568(1-3). P. 83-8.

96. Blaser S., Roseler S., Rempp H., et al. Human endothelial cell septins: SEPT 11 is an interaction partner,of SEPT5. // J Pathol. 2006. Vol. 210(1). P.103-10.

97. Joberty G., Perlungher RR., Sheffield PJ., et al. Borg proteins control septin organization and are negatively regulated by Cdc42. // Nat Cell Biol. 2001. Vol. 3(10). P. 861-6.

98. Joberty G., Perlungher RR., Macara IG. The Borgs, a new family of Cdc42 and TCI0 GTPase-interacting proteins. // Mol Cell Biol. 1999. Vol. 19(10). P. 6585-97.

99. Joo E., Surka MC., Trimble WS. Mammalian SEPT2 is required for scaffolding nonmuscle myosin II and its kinases. // Dev Cell. 2007. Nov. Vol. 13(5). P.677-90

100. Tada T., Simonetta A., Batterton M., et al. Role of Septin cytoskeleton in spine morphogenesis and dendrite development in neurons. //Curr Biol. 2007. Vol. 17(20). P. 1752-8.

101. Kremer BE., Haystead T., Macara IG. Mammalian septins regulate microtubule stability through interaction with the microtubule-binding protein MAP4. //Mol. Biol. Cell. 2005. Vol. 16(10). P. 4648-59.

102. Gladfelter AS., Kozubowski L., Zyla TR., Lew DJ. Interplay between septin organization, cell cycle and cell shape in yeast. // J Cell Sci. 2005. Vol. 118(Pt 8). P. 1617-28.

103. Ihara M., Kinoshita A., Yamada S., et al. Cortical organization by the septin cytoskeleton is essential for structural and mechanical integrity of mammalian spermatozoa. //Dev Cell. 2005. Vol. 8(3). P. 343-52.

104. Garcia Z, Silio V, Marqués MA PI3K activity-independent function of p85 regulatory subunit in control of mammalian cytokinesis.

EMBO J. 2006 Oct 18;25(20):4740-51.

105. Nagata K., Inagaki M. Cytoskeletal modification of Rho guanine nucleotide exchange factor activity: identification of a Rho guanine nucleotide exchange factor as a binding partner for Sept9b, a mammalian septin. //Oncogene. 2005. Vol. 24(1). P. 65-76.

106. Sinha I., Wang YM., Philp R., et al. Cyclin-dependent kinases control septin phosphorylation in Candida albicans hyphal development. // Dev Cell. 2007. Vol. 13(3). P. 421-32

107. She YM., Huang YW, Zhang L., Trimble WS. Septin 2 phosphorylation: theoretical and mass spectrometric evidence for the existence of a single phosphorylation site in vivo. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004. Vol. 18(10). P. 1123-30.

108. Dobbelaere J., Gentry MS., Hallberg RL., Barrai Y. Phosphorylation-dependent regulation of septin dynamics during the cell cycle. // Dev Cell. 2003. Vol. 4(3). P. 345-57.

109. Tang CS., Reed SI. Phosphorylation of the septin cdc3 in gl by the cdc28 kinase is essential for efficient septin ring disassembly. // Cell Cycle. 2002. Vol. 1(1). P. 42-9.

110. Warenda AJ., Kauffman S., Sherrill TP., et al. Candida albicans septin mutants are defective for invasive growth and virulence.// Infect Immun. 2003. Vol. 71(7). P. 4045-51.

111. Xie Y., Vessey JP., Konecna A., et al. The GTP-binding protein Septin 7 is critical for dendrite branching and dendritic-spine morphology. //Curr Biol. 2007. Vol. 17(20). P. 1746-51.

112. Sirajuddin M., Farkasovsky M., Hauer F., et al. Structural insight into filament formation by mammalian septins.// Nature. 2007. Vol. 449. P.

311-5.