Урокиназа и плазмин в регуляции адгезии моноцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Арефьева, Татьяна Игоревна

• Арефьева, Татьяна Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Арефьева, Татьяна Игоревна

Список сокращений, встречающихся в тексте диссертации

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Атеросклероз и рестеноз — это воспаление? Моноциты в патогенезе атеросклероза

Моноциты в патогенезе рестеноза

Взаимодействие моноцитов с компонентами сосудистой стенки

Этапы миграции лейкоцитов в стенку сосуда

Факторы, способствующие адгезии и миграции моноцитов в атеросклеротической бляшке

Молекулы адгезии моноцитов и их участие в миграции клеток в стенку сосуда ■■••';

Авидность лейкоцитарных интегринов - соотношение «количества» и «качества»

Интегрины Мас-1 и VLA-4 в регуляции эффекторных функций моноцитов

Система активации плазминогена в адгезии и миграции моноцитов

Экспрессия компонентов фибринолитической системы моноцитами/макрофагами

Система рецептор урокиназы - урокиназа в адгезии и миграции моноцитов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Урокиназа и плазмин в регуляции адгезии моноцитов»

Моноциты/макрофаги играют центральную роль в регуляции воспалительных реакций в стенке сосуда на всех этапах атерогенеза. Адгезия моноцитов на активированном эндотелии и последующая их миграция в интиму являются наиболее ранними признаками атеросклеротического процесса. В атероме моноциты, дифференцируясь в макрофаги, продуцируют цитокины и факторы роста, которые способствуют миграции гладкомышечных клеток и синтезу ими белков внеклеточного матрикса - процессам, вызывающим рост атеросклеротической бляшки. Синтезируемые моноцитами матриксные металлопротеиназы ответственны за дестабилизацию атеросклеротической бляшки, а тканевой фактор - за последующее тромбообразование, лежащее в основе развития острых коронарных синдромов. Моноциты принимают участие в ремоделировании артерии, возникающем в ответ на ее механическое повреждение. Существуют подтверждения того, что моноцитарная инфильтрация поврежденной стенки сосуда является пусковым механизмом роста неоинтимы после ангиопластики.

Моноцитарные интегрины Мас-1 и VLA-4 участвуют в адгезии и миграции моноцитов в местах хронического и острого повреждения сосудистой стенки, т.к. являются рецепторами для молекул адгезии эндотелиальных и гладкомышечных клеток, тромбоцитарных гликопротеинов, фибрин/фибриногена и фибронектина. Необходимым условием интегрин-зависимой адгезии клеток является увеличение авидности интегринов, сопровождающееся экспозицией дополнительных молекул на поверхности клетки и повышением аффинности связывания индивидуальных молекул с соответствующими лигандами. Адгезия моноцитов, опосредованная интегринами Мас-1 и VLA-4, сопровождается активацией каскада внутриклеточной сигнализации, приводящему к экспрессии генов «раннего ответа», в том числе тканевого фактора и ряда провоспалительных цитокинов.

Система урокиназного пути активации плазминогена тесно связана с адгезией и миграцией моноцитов. Локализация урокиназы и плазминогена на поверхности моноцитов с помощью соответствующих рецепторов и сайтов связывания обеспечивает околоклеточный протеолиз, необходимый для инвазии. Способность рецептора урокиназы связываться с витронектином и его участие в регуляции авидности интегринов, в частности лейкоцитарных (32-интегринов Мас-1, определяют его функцию как координатора адгезии клеток. Помимо этого, урокиназа и образующийся под ее действием плазмин обладают стимулирующим действием на моноциты, которое связано с активацией латентных факторов роста и цитокинов, а также с прямым действием этих молекул на клетку.

К началу данного исследования в литературе отсутствовали данные об экспрессии урокиназы, рецепторов урокиназы, интегринов Мас-1 и YLA-4 моноцитами больных с коронарным атеросклерозом и рестенозом. Не было определено участие урокиназы в Мас-1-зависимой адгезии моноцитов, а также в стимуляции «эффекторных» функций моноцитов, в частности, в индукции прокоагуляционной активности, опосредованной тканевым фактором.

Целью работы было исследование роли урокиназы в регуляции адгезии и прокоагуляционной активности моноцитов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать содержание урокиназы в плазме и количество урокиназы, ассоциированной с моноцитами крови, у больных с коронарным атеросклерозом и рестенозом и здоровых доноров.

2. Определить экспрессию рецепторов урокиназы, интегринов Мас-1 и VLA-4 моноцитами крови больных с коронарным атеросклерозом и рестенозом и здоровых доноров.

3. Изучить влияние урокиназы и плазмина на прокоагуляционную активность моноцитов, опосредованную тканевым фактором.

4. Исследовать влияние урокиназы на адгезию моноцитов на фибронектине и фибриногене.

Научная новизна.

Получены данные о повышенном содержании урокиназы в плазме и на моноцитах крови при коронарном атеросклерозе. Изучена зависимость адгезии моноцитарных клеток на фибриногене от присутствия в среде урокиназы и плазмина. Определены молекулы, принимающие участие в адгезии моноцитов на фибриногене и продуктах его плазминового протеолиза. Показано, что урокиназа и плазмин не оказывают влияния на прокоагуляционную активность моноцитов, связанную с экспрессией тканевого фактора. Получены данные об увеличении мембранной экспозиции интегринов Мас-1 и VLA-4 активированными моноцитами крови больных с рестенозом после коронарной ангиопластики по сравнению с пациентами без рестеноза.

Практическая значимость.

Данные настоящего исследования способствуют выяснению молекулярных механизмов адгезии и миграции моноцитов в очагах острого и хронического повреждения сосудистой стенки. Полученные результаты позволяют определить новые мишени для поиска маркеров и предикторов рестеноза после коронарной ангиопластики.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Атеросклероз и рестеноз - это воспаление?

Этиология и патогенез коронарного атеросклероза - предмет постоянных дискуссий и споров. Тем не менее, ряд клинических и экспериментальных данных позволяет рассматривать атеросклероз как хроническое воспалительное заболевание. Показано, что воспаление играет существенную роль на всех этапах морфогенеза атеросклеротической бляшки, на стадиях ее инициации и прогрессирования, а обострение воспалительной реакции приводит к эрозии или изъязвлению бляшки [Ross, 1993, 1999; Koenig, 1999; Libby, 2000]. С помощью патоморфологических и иммуногистохимических методов было выявлено накопление «клеток воспаления», преимущественно моноцитов/макрофагов, в бляшках различных типов [Ross, 1993, 1999]. Активация этих клеток и их взаимодействие друг с другом приводит к локальной продукции, главным образом, макрофагами, факторов, оказывающих митогенное и хемотаксическое действие на клетки сосудистой стенки, обладающих прокоагуляционной активностью, и ряда протеолитических ферментов, способствующих дестабилизации бляшки. Воспалительная реакция при атеросклерозе ограничивается не только участком поврежденной стенки сосуда. Она также имеет системные проявления, характеризующиеся увеличением концентрации в плазме крови белков острой фазы, растворимых молекул адгезии, цитокинов, а также появлением в кровотоке активированных лейкоцитов.

Если участие воспалительных клеток в атерогенезе является хорошо документированным, то их роль в рестенозе - локальном сужении просвета сосуда после ангиопластики - остается спорной. Тем не менее, многие авторы рассматривают рестеноз как следствие воспалительной реакции, возникающей в ответ на повреждение артериальной стенки. Об этом свидетельствует наличие лейкоцитов, преимущественно моноцитов, в участках рестеноза у человека [Komatsu et al., 1998; Farb et al., 1999], a также данные о том, что подавление способности моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов к миграции из крови в ткани предупреждает рестеноз у экспериментальных животных [Lumsden et al., 1997; Furukawa et al., 1999; Rogers et al., 1998]. Предложена гипотеза, согласно которой воспалительная инфильтрация поврежденного участка сосуда инициирует клеточные реакции, приводящие, в конечном итоге, к формированию рестеноза [Biasucci et al., 1999; Orford et al., 2000; Simon et al., 2000].

В настоящее время роль воспаления в атерогенезе и рестенозе активно изучается как с этиологической, так и с патогенетической точки зрения. Остается открытым вопрос о том, какие именно антигены вызывают активацию иммунокомпетентных клеток в атеросклеротической бляшке. Тщательный анализ системных воспалительных маркеров при атеросклерозе необходим для определения факторов, свидетельствующих о повышенном риске острых коронарных состояний и рестеноза после ангиопластики. Решение этих задач имеет большое практическое значения для выбора адекватных методов лечения атеросклероза и профилактики его осложнений, а также для предупреждения рестеноза у больных после ангиопластики.

Моноциты в патогенезе атеросклероза.

Моноциты присутствуют в поврежденной стенке сосуда на всех этапах атерогенеза. Уже на стадии жировой полоски наблюдается накопление моноцитов в субэндотелиальном пространстве. Более того, показано, что рекрутирование моноцитов в стенку артерии может играть ключевую роль в инициировании атерогенеза у экспериментальных животных. Так, следствием мутаций в гене МСР-1 (monocyte chemoattractant protein - 1), вызывающего миграцию моноцитов в очаг воспаления [Rollins, 1996], является существенное уменьшению размеров атеросклеротических повреждений артерий у мышей, подверженных атеросклерозу (дефицитных по аполипопротеину Е или имеющих ген аполипопротеина В человека) [Boring et al., 1998; Gosling et al., 1999].

В атероме моноциты дифференцируются либо в пенистые клетки, нагруженные липидами [Munro et al., 1987], либо в активированные макрофаги, продуцирующие воспалительные цитокины, факторы роста, протеолитические ферменты, а также тканевой фактор, обладающий прокоагуляционной активностью [Marukami, Yamada, 1996; Ryden L, Hamsten A, 1997]. Многие из этих веществ оказывают повреждающее действие на эндотелиальные клетки, что сопровождается локальной вазоконстрикцией, пристеночным тромбообразованием и активацией гладкомышечных клеток, в которых значительно повышается синтез белков внеклеточного матрикса [Ross, Fuster, 1996] (Рисунок 1). Макрофагальные цитокины и факторы роста, в частности, трансформирующий фактор роста -(3, могут оказывать также прямое действие на гладкомышечные клетки стенки сосуда, вызывая их миграцию в область атеросклеротической бляшки и трансформацию из сократительного фенотипа в секреторный [Assoian et al., 1987; Bjorkerud, 1991].

Зрелая бляшка состоит из зоны некроза, содержащей клеточные осколки и липиды, и покрывающей ее фиброзной шапочки. Воспалительные клетки локализуются преимущественно в краевых областях, т.е. в местах, где наиболее часто происходят разрывы и изъязвления [Kishikawa et al., 1993; Moreno et al., 1994]. Стабильность бляшки зависит от соотношения уровней синтеза и деградации макромолекул, главным образом, коллагена, которые образуют фиброзную шапочку. Синтез коллагена осуществляют гладкомышечные клетки, а его деградация связана с активностью макрофагов, которые вырабатывают протеазы, расщепляющие матриксные белки, в частности металлопротеиназы, катепсины, активаторы плазминогена [Libby et al., 1996]. Таким образом, обострение воспаления, сопровождающееся накоплением моноцитов/макрофагов в интиме сосуда, является основной причиной дестабилизации атеросклеротической бляшки.

Разрушение бляшки приводит к тромбозу, который вызван экспозицией тромбогенных факторов компонентам циркулирующей крови. Основным инициатором коагуляции, запускающим процесс тромбообразования при повреждении стенки сосуда, является т.н. тканевой фактор [Fuster et al., 1992]. Тканевой фактор - это мембранный гликопротеин, активирующий VII фактор свертывания крови, который, в свою очередь, активирует IX и X факторы и таким образом запускает коагуляционный каскад. Показано, что содержание тканевого фактора увеличено в «нестабильных» бляшках по сравнению со «стабильными бляшками» [Moreno et al., 1996; Ogawa, 1999]. При тщательном анализе распределения тканевого фактора в атеросклеротической бляшке оказалось, что этот гликопротеин преимущественно содержится в зонах скопления макрофагов и, в меньшей степени, гладкомышечных клеток [Jander et al., 2001]. Среди клеток крови, только активированные моноциты способны синтезировать тканевой фактор [Rickles et al., 1995]. Экспрессия тканевого фактора моноцитами наблюдается в ответ на действие провоспалительных и хемотаксических агентов, при дифференцировке моноцитов в макрофаги. Так, синтез тканевого фактора в моноцитах стимулируют бактериальный липополисахарид, фактор некроза опухоли - а, интерлейкин - 1, тромбин [Edgington et al., 1991], хемокин МСР-1 [Nielken et al., 1991], связывание молекул адгезии (3r и (Зг- интегринов [Fan, Edgington, 1991; Fan et al., 1995], контакт с активированными Т-лимфоцитами [Mach et al., 1997] и тромбоцитами при образовании моноцит-тромбоцитарных комплексов [Celi et al., 1994].

Эти данные свидетельствуют о наличии непосредственной связи между обострением воспаления и возникновением разрывов и тромбозов в пораженных атеросклерозом артериях. Моноциты/макрофаги играют ведущую роль в этих процессах, являясь одновременно источником прокоагуляционных факторов и факторов, дестабилизирующих бляшку. Совместное культивирование эндотелия и моноцитов индуцирует экспрессию тканевого фактора в эндотелиальных клетках [Napoleone et al., 1997], что объясняет, вероятно, возникновение тромбозов на ранних этапах атерогенеза при инфильтрации моноцитами стенки сосуда.

Обострение воспаления в стенке сосуда сопровождается системными проявлениями, о чем свидетельствует появление в циркуляции активированных лейкоцитов, в частности, моноцитов. Базальная экспрессия цитокинов интерлейкинов-1 и -6 и МСР-1 и тканевого фактора моноцитами больных с нестабильной стенокардией увеличена по сравнению с соответствующими показателями при стабильной стенокардии [Jude et al., 1994; Lee et al., 1999]. В плазме больных с нестабильной стенокардией обнаружено повышенное содержание неоптерина - метаболита птеридина, синтезируемого макрофагами в ответ на стимуляцию цитокинами [Hamerlinck, 1999]. Отмечена связь между концентрацией неоптерина в крови и выявленной ангиографически степенью поражения коронарных артерий [Garcia-Moll et al., 2000]. Активированные моноциты и гранулоциты с увеличенной экспозицией молекул адгезии (32-интегринов Мас-1 (CD1 lb/CDl 8), были обнаружены в крови, полученной из коронарного синуса больных после приступа нестабильной стенокардии [Mazzone et al., 1993; deServi et al., 1996]. Увеличение плотности (32-интегринов Мас-1 и LFA-1 (CDlla/CD18) на поверхности моноцитов и гранулоцитов, также (3]-интегрина VLA-4 (CD49d/CD29) и иммуноглобулин-подобных молекул адгезии ICAM-1 (CD54) на моноцитах отмечено в остром периоде инфаркта миокарда [Meisel et al., 1998]. Эти изменения, по мнению авторов, могут способствовать адгезии лейкоцитов на эдотелии в очагах ишемии. Взаимодействие (32-интегринов моноцитов и гранулоцитов с ICAM-1 моноцитов также может привести к образованию лейкоцитарных агрегатов и, как следствие, к наблюдаемым при инфаркте миокарда микроциркуляторым нарушениям. На сегодняшний день, однако, не ясно, является ли активация лейкоцитов причиной или следствием обострения атеросклероза и, следовательно, можно ли с помощью этих показателей прогнозировать развитие острых коронарных синдромов.

Моноциты в патогенезе рестеноза.

Одним из современных методов лечения ишемической болезни сердца является коронарная ангиопластика. Благодаря постоянному совершенствованию техники и оборудования, ангиопластике подвергаются все более сложные поражения артерий. К сожалению, вслед за восстановлением диаметра просвета сосуда нередко следует его локальное сужение (рестеноз), формирующееся в течение 3-6 месяцев у 30-40% больных [Libby, Ganz, 1997, Polterauer et al., 2000]. Патогенез рестеноза до конца неясен. Согласно существующим представлениям, в его основе могут лежать два принципиальных механизма - гиперплазия неоинтимы и отрицательное ремоделирование артерии, под которыми подразумевают уменьшение диаметра сосуда параллельно с ростом неоинтимы [Schwartz et al., 1998]. Однако стентирование коронарных артерий, специально разработанное для предупреждения отрицательного ремоделирования [Самко, 1998; Савченко с соавт., 2000], хотя и уменьшило частоту рестеноза, но не привело к его полному предупреждению, что позволяет рассматривать избыточное образование неоинтимы как основную причину рестеноза [Hoffmann et al., 1996; Ross, 1999]. Согласно недавно опубликованным результатам клинических и экспериментальных исследований, к гиперплазии неоинтимы приводит неспецифическая воспалительная реакция в поврежденной стенке артерии. Об этом свидетельствуют данные иммуногистохимического анализа, показавшие, что в области рестеноза у человека преобладают «клетки воспаления» - моноциты и макрофаги [Moreno et al., 1996b; Komatsu et al., 1998; Farb et al., 1999]. Кроме того, наблюдаемое во время ангиопластики появление в кровотоке активированных лейкоцитов (моноцитов и гранулоцитов) и лейкоцит-тромбоцитарных комплексов [Mickelson et al., 1996; Serrano et al., 1997; Inoue et al., 1998], а также увеличение концентрации в плазме провоспалительного цитокина интерлейкина-6 [Hojo et al., 2000], хемокина МСР-1 [Cipollone et al., 2001] и макрофагального колиниестимулирующего фактора [Hojo et al., 2001] оказалось более выраженным у тех больных, у которых впоследствии наблюдались ангиографические и/или клинические признаки рестеноза.

В экспериментальных моделях баллонной ангиопластики и стентирования у животных обнаружено, что деэндотелизация стенки сосуда приводит к быстрому накоплению в ней моноцитов, которые продуцируют факторы, стимулирующие миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток, образующих неоинтиму [Rogers et al., 1996]. Показано, что толщина неоинтимы прямо пропорциональна степени инфильтрации стенки сосуда мононуклеарными клетками крови - моноцитами и лимфоцитами [Kornowski et al., 1998]. Наконец, ингибирование моноцитарного хемокина МСР-1 [Furukawa et al., 1999] и интегринов VLA-4 [Lumsden et al., 1997] и Mac-1 [Rogers et al., 1998] - молекул, необходимых для адгезии и миграции лейкоцитов в тканях, - а также введение потенциального «инактиватора» моноцитов интерлейкина-10 [Feldman et al., 2000] предотвращало рестеноз у животных.

Несомненно, рестеноз у человека может быть комплексным процессом, в развитии которого задействованы как компоненты крови, так и сосудистой стенки. Литературные данные свидетельствуют о существенной роли воспаления в формировании рестеноза и позволяют рассматривать моноциты крови как один из основных объектов исследования. Действительно, моноциты могут накапливаться в поврежденной в ходе ангиопластики стенке сосуда и способствовать гиперплазии неоинтимы, т.к. являются источником факторов роста и цитокинов, оказывающих хемотаксическое и митогенное действие на другие клетки сосудистой стенки. Моноциты/макрофаги продуцируют прогеолитические ферменты, расщепляющих матриксные белки и таким образом способствующие клеточной миграции, а также активные соединения кислорода, повреждающие клетки сосудистой стенки. В связи с этим анализ способности моноцитов к адгезии и миграции в тканях и синтезу биологически активных веществ является крайне важным для выяснения механизмов рестеноза и выявления факторов риска его развития.

Взаимодействие моноцитов с компонентами сосудистой стенки.

Этапы миграции лейкоцитов в стенку сосуда.

Миграция лейкоцитов в очаг воспаления представляет собой сложный процесс, который зависит от уровня активации клеток и особенностей их взаимодействия с компонентами сосудистой стенки - эндотелием, гладкомышечными клетками и белками межклеточного матрикса. Согласно современным представлениям [Fabbri et al., 1999], выход лейкоцитов из сосудистого русла через эндотелий происходит в несколько этапов (Рисунок 2). Сначала - это «роллинг», или т.н. краевое стояние лейкоцитов, обусловленное взаимодействием селектинов и их углеводных лигандов на поверхности эндотелия и лейкоцитов. Роллинг продолжается до тех пор, пока лейкоциты не подвергаются воздействию цитокинов, главным образом хемокинов (хемотаксических цитокинов), локально секретируемых клетками сосудистой стенки в очаге воспаления. Под действием этих факторов

Рисунок 2. Этапы миграции лейкоцитов в стенку сосуда. повышается аффинность лейкоцитарных интегринов, которые обеспечивают прочное прикрепление лейкоцитов к эндотелию и последующую миграцию клеток в стенку сосуда. Наконец, продукция лейкоцитами протеолитических ферментов необходима для преодоления клетками барьеров из белков внеклеточного матрикса.

Факторы, способствующие адгезии и миграция моноцитов в атеросклеротической бляшке.

Контакт с эндотелием - необходимое условие для выхода лейкоцитов из кровотока и их миграции в стенку сосуда. В системе циркуляции лейкоциты пассивно перемещаются с потоком крови, поэтому в крупных сосудах, в том числе в коронарных артериях, выход лейкоцитов из циркуляции наиболее вероятен в зонах, где «сила смыва» невысока или имеет обратное направление [Nerem, Levesque, 1983]. Поэтому одной из причин, объясняющих «очаговую» природу атеросклероза, считают локальное изменение скорости кровотока, например, в местах бифуркаций, способствующее более длительному контакту лейкоцитов с эндотелием и т.о. увеличивающее вероятность миграции клеток крови в стенку сосуда.

Показано, что в области атеромы моноциты способны к формированию адгезивных контактов с эндотелиальными клетками [Ross, 1993; Poston, Johnson-Tidey, 1996], кроме того, именно моноциты/макрофаги составляют основную популяцию лейкоцитов, обнаруженных в интиме пораженных атеросклерозом артерий у человека и экспериментальных животных [Tsukada et al., 1990]. Такое избирательное привлечение моноцитов в атеросклеротическую бляшку обеспечивается формированием специфических адгезивных контактов между эндотелиальными клетками и моноцитами, а также спектром хемотаксических факторов, синтезируемых клетками сосудистой стенки.

На сегодняшний день идентифицирован и охарактеризован ряд молекул, которые могут стимулировать миграцию моноцитов в область атеросклеротической бляшки. Полагают, что привлечению моноцитов способствует локальное увеличение экспрессии эндотелием молекул адгезии, в частности Р и Е селектинов [van der Wal et al., 1992; Bevilacqua et al., 1994; Johnson-Tidey et al., 1994] и иммуноглобулин-подобных молекул ICAM-1 и VCAM-1 [Cybulsky, Gimbrone, 1991; Johnson-Tidey et al., 1994; Nakashima et al., 1998]. Участие этих молекул в атерогенезе убедительно продемонстрировано в экспериментальных моделях - показано, что мутации в генах Р селектина и ICAM-1 существенно подавляют атерогенез у апоЕ-дефицитных мышей [Collins et al., 2000]. Введение дополнительной мутации в ген VCAM-1 приводило к существенному уменьшению размеров атеросклеротических поражений артерий у мышей, дефицитных по рецепторам липопротеидов низкой плотности [Cybulsky et al., 2001]. Среди моноцитарных хемоаттрактантов, образующихся в атеросклеротической бляшке, следует выделить тромбин [Bar-Shavit et al., 1983], продукты деградации матриксных белков [Postlethwaite, Kang, 1976; Norris et al., 1982], окисленные липопротеины низкой плотности [Quinn et al., 1987], а также хемокин MCP-1, который, по-видимому, играет основную роль в накоплении моноцитов в интиме на ранних этапах атерогенеза [Valente et al., 1992; Boring et al., 1998].

Молекулы адгезии моноцитов и их участие в миграции клеток в стенку сосуда.

Взаимодействие моноцитов с компонентами сосудистой стенки, клетками и матриксными белками, обеспечивают мембранные рецепторы -молекулы адгезии. Основные семейства моноцитарных молекул адгезии представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Молекулы адгезии моноцитов и их известные лиганды (по данным Pardi et al., 1992 и Patarroyo, 1994 с дополнениями).

Молекулы адгезии Лиганды

Интегрины

LFA-1 (CD 11 a/CD 18) ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3

Мас-1 (CD lib/CD 18) ICAM-1, СЗЬ, Фибриноген,

PI50,95 (CDllc/CD18) gplba

VLA-4 (CD49d/CD29) Фибриноген, C3bi, ICAM-1

VLA-5 (CD49e/CD29) VCAM-1, Фибронектин

VLA-6 (CD49f/CD29) Фибронектин

Семейство иммуноглобулинов Ламинин

ICAM-1

ICAM-2, ICAM-3 LFA-1, Мас-1, Фибриноген

PEC AM-1 (CD31) LFA-1

Селектины РЕСАМ-1 (CD31)

L селектин

Другие Гепарансульфат

Антигены Lex, sLex (CD 15, CD 15s) протеогликаны

PSGL-1 Е селектин

CD44 Р селектин

Гиалуроновая кислота

Таким образом, моноциты характеризуются широким спектром молекул адгезии, которые способны связываться с соответствующими лигандами на эндотелиальных, гладкомышечных клетках и тромбоцитах, а также с белками межклеточного матрикса. Современные исследования направлены на идентификацию молекул, необходимых для миграции моноцитов в поврежденную стенку сосуда. Предполагают, что «роллинг» моноцитов на активированном эндотелии опосредован главным образом L селектинами [Luscinskas et al., 1994], а их прохождение через эндотелий -РЕСАМ-1 (platelet-endothelial cell adhesion molecule-1, CD31) [Muller et al., 1993]. Однако не вызывает сомнения, что основную роль в экстравазации моноцитов играют интегрины.

Интегрины представляют семейство а(3 гетеродимерных трансмембранных рецепторов. Моноцитарные интегрины представлены главным образом семейством -интегринов, имеющих общую Р субъединицу CD29, и семейством лейкоцит-специфичных (32-интегринов (CD1 la,b,c/CD18). Особенностью лейкоцитарных интегринов является их взаимодействие как с матриксными белками, так и с лигандами на поверхности других клеток [Hynes, 1992]. Показано, что (Зринтегрин VLA-4 (CD49d/CD29) и [32-интегрины LFA-1 (CDlla/CD18) и Мас-1 (CDllb/CD18) участвуют в адгезии моноцитов на активированном эндотелии путем связывания соответственно с VCAM-1 и ICAM-1 [Meerschaert, Furie, 1995; Patel et al., 1998]. Ингибирование этих взаимодействий с помощью моноклональных антител приводило к уменьшению количества моноцитов/макрофагов в атеросклеротических бляшках у экспериментальных животных [Kling et al., 1995; Patel et al., 1998; Huo et al., 2000].

Интегрины играют первостепенную роль в инвазии моноцитов в сосудистую стенку при ее повреждении, например, при изъязвлении атеросклеротической бляшки или ее разрыве в ходе ангиопластики. При моделировании условий острого повреждения сосудистой стенки in vitro показана Мас-1-опосредованная адгезия лейкоцитов в местах отложения фибрина и скопления тромбоцитов [Kirchhofer et al., 1997; Kuijper et al., 1997]. Считают, что эти свойства Мас-1 обусловлены его связыванием с фибриногеном [Altieri et al., 1988] и тромбоцитарным гликопротеином ipa [Simon et al., 2000]. У линии мышей, не имеющих Мас-1, обнаружено подавление миграции лейкоцитов через слой тромбоцитов и последующее уменьшение толщины неоинтимы при механическом повреждении артерии [Simon et al., 2000b],

Известными лигандами интегрина VLA-4 являются белок внеклеточного матрикса фибронектин и молекулы адгезии VCAM-1, экспрессируемые, как упоминалось выше, активированными эндотелиальными и гладкомышечными клетками [Li et al., 1993; Meerschaert, Furie, 1995; Huo et al., 2000]. Высокая экспрессия VCAM-1 гладкомышечными клетками наблюдается в атеросклеротической бляшке [O'Brien et al., 1993; Libby, Li, 1993]. Таким образом, интегрины VLA-4 могут быть задействованы как на начальных этапах миграции моноцитов в стенку сосуда, обеспечивая контакт с эндотелием, так и в дальнейшей инвазии этих клеток в очаг воспаления благодаря взаимодействию с фибронектином и молекулами адгезии гладкомышечных клеток.

Эти данные послужили основанием для разработки экспериментальных методов предупреждения рестеноза после ангиопластики. Так, у кроликов образование неоинтимы после баллонирования и стентирования артерий значительно уменьшалось при введении животным антител, блокирующих Мас-1 [Rogers et al., 1996]. В модели экспериментальной эндатерэктомии у обезьян введение антител, блокирующих VLA-4, приводило к существенному уменьшению количества моноцитов/макрофагов в неоинтиме и подавляло ее утолщение [Lumsden et al., 1997].

Авидность лейкоцитарных интегринов - соотношение «количества» и «качества».

В циркулирующих лейкоцитах интегрины находятся в неактивном состоянии и поэтому не могут связываться с соответствующими лигандами. Активация лейкоцитов под действием воспалительных стимулов, в частности цитокинов и бактериальных продуктов, является необходимым условием для стимуляции интегрин-зависимой адгезии [Hmama et al., 1999; Weber et al., 1996, 1999]. Показано, что в основе этого феномена могут лежать несколько механизмов: увеличение количества экспонированных интегринов за счет слияния внутриклеточных везикул с наружной мембраной, изменение конформации молекул, сопровождающееся повышением сродства связывания с лигандами, и перераспределение интегринов на клеточной мембране - их кластеризация [Calafat et al., 1993; Buckley et al., 1998]. Поэтому для характеристики способности интегринов вызывать адгезию клеток используют термин «авидность». Таким образом, авидность интегринов зависит от их количества на поверхности клетки в месте ее адгезионного контакта и от аффинности связывания индивидуальных интегринов с лигандами.

Изучение механизмов регуляции авидности интегринов, вовлеченных в процесс миграции моноцитов в сосудистую стенку, представляется на сегодняшний день весьма актуальным. Мембранную мобилизацию (Зг-интегрина Мас-1 в моноцитах стимулируют бактериальные продукты -формилпептид FMLP [Lundahl et al., 1996] и липополисахарид (ЛПС) [Nakstad et al., 1998]. Потенциальными активаторами моноцитарной экспрессии Мас-1 также являются хемокины, среди которых наибольшей активностью обладает МСР-1 [Vaddi, Newton, 1994]. Эти факторы, действуя через различные мембранные рецепторы, вызывают мобилизацию внутриклеточного кальция и быструю перестройку цитокелета, что приводит к транспорту внутриклеточного пула интегринов Мас-1 на поверхность моноцитов. Данные об участии МСР-1 в регуляции экспрессии Мас-1 моноцитами представляют наибольший интерес в связи с обнаружением этого хемокина в атеросклеротической бляшке [Takeya et al., 1993]. Кроме того, увеличенное содержание МСР-1 в крови [Nishiyama et al.,

1998] и повышенная экспрессия этого хемокина в моноцитах [Lee et al.,

1999] были отмечены у больных с нестабильной стенокардией. Не исключено, что увеличенная экспрессия Мас-1 циркулирующими моноцитами, также обнаруженная у больных с нестабильной стенокардией [deServi et al., 1996], может быть связана с действием МСР-1.

МСР-1 не только вызывает экспозицию Мас-1 на поверхности клеток, но и увеличивает аффинность связывания Мас-1 с молекулами адгезии ICAM-1, т.о. вызывая адгезию моноцитов на эндотелии в системе сокультивирования in vitro [Weber et al., 1999]. Известными активаторами высокоаффинного связывания Мас-1 с другим лигандом, фибриногеном, являются двухвалентные катионы Mg и Mn [Altieri, 1991] и нуклеотиды АТФ и АДФ [Altieri et al., 1990]. Возможно, что эти пути активации Мас-1 могут быть задействованы в адгезии моноцитов в месте острого повреждения сосудистой стенки, которое сопровождается локальным увеличением концентрации катионов и нуклеотидов, а также отложением фибриногена/фибрина.

Регуляция авидности интегрина YLA-4 изучена в меньшей степени. Однако имеющиеся на сегодняшний день сведения позволяют предположить общие для Мас-1 и VLA-4 пути активации. Предполагают, что авидность связывания VLA-4 моноцитов также контролируется хемокинами и зависит от концентрации двухвалентных катионов. Моноцитарные хемокины МСР-1, MIP-ip (monocyte inflammatory protein -1(3) и RANTES (regulated on activation normal T cells expressed and secreted) вызывают быструю и преходящую активацию связывания VLA-4 с фибронектином и VCAM-1, а катионы, в частности Мп , могут стабилизировать высокоаффинную конформацию VLA-4 [Weber et al., 1996; Weber, Springer, 1998].

Адгезия и миграция моноцитов в очаге воспаления - это многоступенчатый процесс, требующий каскадной активации различных типов молекул адгезии. В связи с этим актуальным является поиск механизмов, обеспечивающих согласованное функционирование этих рецепторов на разных этапах миграции лейкоцитов в стенку сосуда. Существуют данные о том, что лигирование и кластеризация с помощью антител против L селектинов увеличивает экспрессию Мас-1 и аффинность его связывания с фибриногеном в нейтрофилах [Simon et al., 1995]. Кроме того, на клетках миеломоноцитарных линий показано, что лигирование VLA-4 вызывает (Зг-интегрин-зависимую адгезию путем изменения конформации интегринов Мас-1 и LFA-1 [May et al., 2000]. Эти данные свидетельствуют о существовании "crosstalk" между различными молекулами адгезии - дополнительного и очень важного с биологической точки зрения механизма регуляции авидности интегринов.

Интегрины Мас-1 и VLA-4 в регуляции эффекторных функций моноцитов.

Интегрины не только обеспечивают механическое «сцепление» клеток друг с другом и матриксными белками. Они представляют собой мембранные рецепторы, связывание которых вызывает активацию каскада внутриклеточной сигнализации и, как следствие, изменение физиологии клетки [Clark, Brugge, 1995].

В настоящее время имеются некоторые сведения об интегрин-зависимой регуляции эффекторных функций лейкоцитов - продукции цитокинов, тканевого фактора, активных соединений кислорода. Так, в условиях in vitro установлено, что лигирование интегринов VLA-4 с помощью антител приводит к продукции фактора некроза опухоли - а и экпрессии тканевого фактора [Dackiw et al., 1996]. Лигирование р2-интегринов или контакт с фибрин(оген)ом вызывает экспрессию в моноцитах тканевого фактора, интерлейкина-1, фактора некроза опухоли-а, активных соединений кислорода [Trezzini et al., 1991; Fan, Edgington, 1991, 1993; Pakianathan, 1995; Perez, Roman, 1995]. Механизм интегрин-зависимой стимуляции моноцитов могут объяснять следующие данные. Цитокины, упомянутые выше, принадлежат к т.н. семейству генов раннего ответа, которые экспрессируются в клетке при активации ядерного фактора транскрипции NF-кВ (nuclear factor-кВ) [Yurochko et al., 1992; Sitrin et al., 1998]. Известными стимуляторами экпрессии генов раннего ответа в моноцитах являются продукты бактериального и вирусного происхождения, некоторые митогены и цитокины [Siebenlist et al., 1994]. Литература располагает доказательствами того, что адгезия, опосредованная интегринами Мас-1 и VLA-4, также может вызывать в моноцитах активацию фактора транскрипции NF-кВ [Yurochko et al., 1992; Lin et al., 1995; Sitrin et al., 1998].

Известно, что NF-кВ является ключевым регулятором воспалительных реакций, т.к. контролирует транскрипцию цитокинов, в том числе факторов некроза опухоли-а и -(3, интерлейкинов-1,-2,-6,-8,-12, МСР-1, MIP-1, RANTES, интерферона-у, а также гранулоцитарного и гранулоцит-макрофагального колониестимулирующих факторов [Blackwell, Christman, 1997], тканевого фактора [Hall et al., 1999] и молекул адгезии ICAM-1 [Poston et al., 1992]. Показано, что NF-кВ-опосредованная внутриклеточная сигнализация сопровождается образованием свободных радикалов кислорода [Schreck et al., 1992]. Активация NF-кВ-зависимого синтеза макромолекул характерна для моноцитов/макрофагов, находящихся в очаге воспаления, в частности, в атеросклеротической бляшке [Brand et al., 1996]. Возможно, что это является следствием Мас-1- и VLA-4-опосредованного взаимодействия моноцитов с матриксными белками и клетками сосудистой стенки.

Таким образом, изучение экспрессии интегриновых рецепторов и анализ их взаимодействия с лигандами имеют большое значение для понимания механизмов адгезии, миграции и последующей активации моноцитов в поврежденной стенке сосуда.

Система активации плазминогена е адгезии и миграции моноцитов.

Способность клеток в ходе миграции в тканях преодолевать барьеры из белков внеклеточного матрикса, т.е. их внедрение-инвазивность, зависит от активности протеолитических ферментов на поверхности клеток. Система активации плазминогена, которая включает плазминоген, активаторы и ингибиторы плазминогена, а также связывающие их поверхностные белки и рецепторы, играет центральную роль в клеточной инвазии [Andreasen et al., 2000]. Более того, обнаруженное недавно взаимодействие этих компонентов с молекулами адгезии, белками матрикса и сигнальными молекулами определяет их уникальную функцию как координаторов клеточной адгезии и миграции [Chapman, 1997].

Активаторы плазминогена тканевого типа и урокиназного типа (урокиназа) генерируют образование соответственно в крови и тканях плазмина, ключевой протеазы системы фибринолиза. Наряду с этим плазмин, образующийся в тканях под действием урокиназы, активирует матриксные металлопротеиназы - ферменты, составляющие протеолитическую основу клеточной миграции и тканевого ремоделирования [Murphy, Gavrilovic, 1999]. Как плазмин, так и матриксные металлопротеиназы участвуют в деградации различных белков внеклеточного матрикса. Они могут также активировать ряд факторов роста и цитокинов (фактор роста гепатоцитов, трансформирующий фактор роста-Р, интерлейкин-1) путем перевода их из латентного состояния в активное [Molineaux et al., 1993; Odekon et al., 1994; Mullberg et al., 1995; Naldini et al., 1995] или высвобождения из комплексов с матриксными белками [Falcone et al., 1993]. Все эти процессы увеличивают инвазивный потенциал клеток.

Активность урокиназы и тканевого активатора плазминогена контролируется несколькими ингибиторами, среди которых основную физиологическую роль играет ингибитор активаторов плазминогена 1-го типа (ПАИ-1) [Andreasen et al., 2000]. ПАИ-1 относится к семейству ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), но в отличие от других членов этого семейства, активная конформация ПАИ-1 стабилизируется путем его высокоаффинного связывания с витронектином. Витронектин -сывороточный гликопротеин, который накапливается в тканях при их механическом повреждении, а также маркер дегенеративных изменений [Preissner, Seiffert, 1998]. Компоненты системы фибринолиза локализуются на поверхности клеток с помощью специфических молекул: рецепторов урокиназы [Behrendt et al., 1995]), белков, содержащих С-концевые лизиновые остатки (сайты связывания плазминогена [Plow et al., 1995]), рецепторов липопротеинов низкой плотности (комплекс урокиназа-ПАИ-1 связывается с ЬКР/а2-макроглобулиновым рецептором [Nykjaer et al., 1997]). Взаимодействие с ПАИ-1 приводит к интернализации комплексов урокиназа/рецептор урокиназы, последующей деградации урокиназы в лизосомах и возвращению свободного рецептора урокиназы на поверхность клетки [Conese et al., 1995; Nykjaer et al., 1997]. Динамическая экспрессия компонентов урокиназного пути активации плазминогена на поверхности мигрирующей клетки определяет их участие в различных физиологических и патофизиологических процессах (Рисунок 3).

Получение линии трансгенных мышей, дефицитных по урокиназе и ее рецепторам, позволило оценить роль этих компонентов в ремоделировании сосудистой стенки in vivo. Оказалось, что по сравнению с мышами «дикого типа» у мышей, лишенных урокиназы, повреждение сосудистой стенки сопровождается более интенсивным отложением фибрина [Carmeliet et al., 1994], подавлением образования неоинтимы и уменьшением вероятности образования атеросклеротических аневризм [Carmeliet, Collen, 1998]. Отсутствие гена ПАИ-1, напротив, стимулировало рост неоинтимы после внутрисосудистого повреждения [Carmeliet et al., 1997; Loskutoff et al., 1997].

У мышей, дефицитных по рецептору урокиназы, было отмечено снижение миграции лейкоцитов в очаг воспаления [May et al., 1998]. Отсутствие гена плазминогена у трансгенных животных приводило к подавлению формирования неоинтимы после повреждения, однако, значительно менее выраженному, чем при отсутствии гена урокиназы, что может указывать на существование не связанных с генерацией плазмина свойств урокиназы [Carmeliet et al., 1997b],

Экспрессия компонентов фибринолитической системы моноцитами/макрофагами.

Экспрессия компонентов активации плазминогена характерна для клеток, способных к миграции и инвазии, в частности, для моноцитов. Моноциты синтезируют урокиназу и тканевой активатор плазминогена, их ингибиторы ПАИ-1 и ПАИ-2, экспрессируют рецептор урокиназы (CD87) и мембранные сайты связывания плазминогена [Saksela et al., 1985; Blasi et al., 1986; Felez et al.,1990]. Экспрессию моноцитами рецепторов урокиназы, урокиназы и ее ингибиторов регулируют про-воспалительные цитокины и факторы роста. Известными индукторами синтеза урокиназы моноцитами являются интерферон-у, фактор некроза опухоли-а [Guetko et al., 1992; Sitrin et al., 1994], трансформирующий фактор роста-(3, тромбин [Lundgren et al., 1994], интерлейкины -1,-2,-4,-13 [Guetko et al., 1993; Paysant et al., 1998]. Трансформирующий фактор роста-Р стимулирует синтез ПАИ-1, но не ПАИ-2 [Hamilton et al., 1993; Lundgren et al., 1994], в свою очередь уровень синтеза ПАИ-2 повышается в присутствии интерлейкинов-1 и -2 и фактора некроза опухоли-а [Gyetko et al., 1992; 1993]. Ряд цитокинов, в том числе факторы некроза опухоли-а и (3, интерлейкины-1 и -6 и интерферон-у, увеличивают экспрессию рецепторов урокиназы в промоноцитарных линейных клетках [Sitrin et al., 1994; Yoshida et al., 1996].

В зрелых моноцитах стимулирующий эффект на экспрессию рецепторов урокиназы был продемонстрирован только для интерферона-у и фактора некроза опухоли-а [Kirchheimer et al., 1988; Gyetko et al., 1994]. Ингибирующее действие на экспрессию рецепторов урокиназы в моноцитах показано для интерлейкина-10 - известного моноцитарного «инактиватора» [Paysant et al., 1998]. Помимо воспалительных цитокинов, синтез урокиназы и ее рецепторов в моноцитах увеличивают некоторые про-атерогенные факторы, в частности окисленные липопротеины низкой плотности [Hsu et al., 1998; Ganne et al., 1999] и лизофосфатидилхолин [Oka et al., 2000].

Перечисленные выше пути стимуляции экспрессии урокиназы, ее рецепторов и ингибиторов подтверждают данные о повышении содержания этих молекул в очаге воспаления и в атеросклеротической бляшке [Lupu et al., 1993, 1995; Raghunath et al., 1995; Falkenberg et al., 1996, 1998]. С помощью иммуногистохимического анализа и метода гибридизации in situ показано, что в зрелых фиброатероматозных бляшках урокиназу, тканевой активатор плазминогена и ПАИ-1 синтезируют главным образом макрофаги, локализованные вокруг зоны некроза [Padro et al., 1997; Kienst et al., 1998; Steins et al., 1999]. По мере прогрессирования атеросклеротического процесса в стенке артерии продемонстрировано увеличение в несколько раз содержания тканевого активатора плазминогена и урокиназы, однако большая их часть находилась в комплексе с ПАИ-1, т.е. являлась функционально неактивной [Kienast et al., 1998; Steins et al., 1999]. Кроме того, культивирование макрофагов, выделенных из полученных при эндатерэктомии у человека образцов, сопровождалось в 3-4 раза большей секрецией ПАИ-1, по сравнению с аутологичными моноцитами крови [Tipping et al., 1993]. При этом количество урокиназы и тканевого активатора плазминогена, синтезируемых макрофагами атеросклеротической бляшки и моноцитами крови больных атеросклерозом, согласно результатам данного исследования, существенно не отличалось.

Следует отметить, что, по крайней мере in vitro, урокиназа и плазмин обладают выраженным про-воспалительным эффектом, например, плазмин активирует интерлейкин-1 в моноцитах [Matsushima et al., 1986; Falcone et al., 1993], а эндогенная урокиназа увеличивает секрецию фактора некроза опухоли-ос моноцитарными клетками, стимулированными эндотоксином [Sitrin et al., 1996]. Известно, что интерлейкин-1 и фактор некроза опухоли-а являются основными стимуляторами синтеза хемокинов, в частности МСР-1, моноцитами и эндотелиальными клетками [Libby et al., 1995]. Описаны также и другие, не зависимые от активации цитокинов, клеточные эффекты урокиназы и плазмина. Так, в культуре моноцитов насыщение рецепторов урокиназы экзогенной урокиназой активирует фосфоинозитидный обмен и мобилизацию внутриклеточного кальция [Sitrin et al., 1999]. Ингибирование связывания эндогенной урокиназы с рецептором подавляет синтез катепсина В и матриксной металлопротеиназы 9 моноцитарными линейными клетками [Rao et al., 1995]. Плазмин стимулирует метаболизм арахидоновой кислоты в моноцитах [Weide et al., 1996] и является специфическим моноцитарным хемоаттрактантом [Syrovets et al., 1997].

В пораженной атеросклерозом стенке сосуда увеличение содержания урокиназы и плазмина, по всей вероятности, может способствовать деградации внеклеточного матрикса, привлечению лейкоцитов и их активации, что в конечном итоге может привести к дестабилизации атеросклеротической бляшки. Повышенная активность ПАИ может быть причиной сниженного фибринолиза и персистирующего тромбообразования. Следовательно, как активация, так и подавление плазмин-зависимого протеолиза могут быть задействованы на разных этапах развития атеросклероза и его осложнений. Таким образом, анализ экспрессии моноцитами/макрофагами компонентов системы активации плазминогена является весьма актуальным для изучения патогенеза атеросклероза и его осложнений.

Система рецептор урокиназы-урокиназа в адгезии и миграции моноцитов.

Связывание урокиназы с ее мембранным рецептором обеспечивает локализацию протеолитической активности урокиназы и образующегося под ее действием плазмина на поверхности клетки. Рецептор урокиназы, будучи гликозилфосфатидилинозитол-заякоренным белком [Behrendt, Stephens, 1998], может свободно перемещаться в мембране. В мигрирующих моноцитах комплексы урокиназа-рецептор локализуются на лидирующем полюсе клетки [Estreicher et al., 1990], а ингибирование урокиназы с помощью моноклональных антител существенно уменьшает инвазивность моноцитов, подавляя их миграцию через слой матриксных белков in vitro [Kirchheimer, 1989].

Участие компонентов системы фибринолиза в адгезии и миграции клеток не сводится только к механическому «удалению преград» на пути мигрирующей клетки. Обнаруженное недавно высокоаффинное связывание рецептора урокиназы с витронектином, а также его взаимодействие с интегриновыми молекулами адгезии предполагает существование уникального механизма регуляции клеточной адгезии.

Wei et al. [1994] впервые показали, что рецептор урокиназы является одновременно и высокоаффинным (Kd < 30 нМ) рецептором витронектина. Урокиназа или ее связывающийся с рецептором домен (т.н. «ростовой» домен) увеличивали количество комплексов рецептор урокиназы/витронектин, из чего был сделан вывод о том, что взаимодействие с урокиназой приводит к стабилизации «витронектин-связывающей» конформации рецептора урокиназы. Эти данные объясняют феномен стимуляции урокиназой витронектин-зависимой адгезии миеломоноцитарных линейных клеток, не имеющих «классических» интегриновых рецепторов для этого матриксного белка [Waltz et al., 1994].

Известно, что ПАИ-1 также может связываться с витронектином [Seiffert, Loskutoff, 1991], а плазминовый протеолиз витронектина препятствует этому взаимодействию [Chain et al., 1991]. ПАИ-1 ингибирует адгезию миеломоноцитарных клеток на витронектине, т.к. имеет общий с рецептором урокиназы сайт связывания на этом матриксном белке [Deng et al., 1996; Waltz et al., 1997]. Эти данные послужили основой гипотезы о механизме регуляции адгезии и миграции клеток на витронектине. Предполагают, что урокиназа вызывает сначала прикрепление, а затем открепление клеток от витронектинового матрикса в связи с активацией плазмина, расщепляющего витронектин. Локальный избыток ПАИ-1 способствует клеточной миграции, т.к. препятсявует адгезии клеток, конкурируя с рецептором урокиназы за связывание с витронектином.

В атеросклеротической бляшке отложения витронектина локализуются по краю липидно-некротической зоны [Sato et al., 1994; Mori et al., 1996; van Aken et al., 1997] - в местах преимущественного накопления моноцитов/макро фагов. In vitro обнаружена стимуляция экспрессии моноцитами урокиназы и ее рецепторов и, как следствие, увеличение адгезии клеток на витронектине под действием атерогенных липопротеинов [Ganne et al., 1999]. Не исключено, что взаимодействие между компонентами урокиназного пути активации плазминогена и витронектином определяют в некоторой степени адгезию и миграцию моноцитов in vivo в атеросклеротической бляшке.

На сегодняшний день не вызывает сомнения тот факт, что рецептор урокиназы принадлежит к семейству мембранных молекул, контролирующих авидность интегринов, в том числе лейкоцитарных Р2-интегринов. С помощью гистохимического анализа мембранных антигенов прикрепленных к матриксу моноцитов и гранулоцитов и метода иммунопреципитации обнаружено формирование комплексов урокиназы, рецепторов урокиназы и интегринов Мас-1 [Pollanen et al., 1988; Xue et al.,

1994; Bohuslav et al., 1995]. Показано, что рецептор урокиназы регулирует Mac-1-зависимую адгезию моноцитов на фибриногене и эндотелии [Simon et al., 1996; Sitrin et al., 1996b; May et al., 1998]. Так, блокирование рецепторов урокиназы с помощью антител или «анти-смысловых» олигонуклеотидов подавляло адгезию моноцитов на фибриногене [Sitrin et al., 1996]. Взаимодействие рецепторов урокиназы с витронектином или со стимулирующими антителами повышало сродство Мас-1 к фибриногену и эндотелиальным лигандам. Напротив, удаление рецепторов урокиназы с поверхности клеток с помощью гликозилфосфатидилинозитол-специфичной липазы С ингибировало адгезию лейкоцитов на эндотелии. Кроме того, показано, что рецептор урокиназы участвует в упомянутом выше пути активации р2-интегринов при связывании р!-интегринов VLA-4 с VCAM-1 [May et al., 2000]. В свою очередь связывание Мас-1 с ингибирующими антителами подавляет адгезию моноцитарных клеток на витронектине [Simon et al., 1996], т.о. функциональная связь рецепторов урокиназы с молекулами адгезии является двусторонней. Участие рецепторов урокиназы в адгезии и миграции клеток, не зависящее от генерации плазмина, было продемонстрировано in vivo [Waltz et al., 2000]. Введение химерного белка, состоящего из рецептор-связывающего домена урокиназы и Fc фрагмента человеческого иммуноглобулина G, препятствовало накоплению лейкоцитов в очаге воспаления у мышей «дикого типа» и у мышей, дефицитных по урокиназе, но не у животных, лишенных рецепторов урокиназы. Следует отметить, что роль урокиназы в интегрин-зависимой адгезии лейкоцитов исследована в меньшей степени, а имеющиеся сведения носят противоречивый характер. Так, обнаружена тенденция к уменьшению Мас-1 зависимой адгезии при добавлении урокиназы в культуру моноцитарных клеток или при ингибировании синтеза урокиназы с помощью «антисмысловых» олигонуклеотидов в моноцитах [Simon et al., 1996; Sitrin et al., 1996;]. С другой стороны, согласно более поздней публикации, насыщение рецепторов урокиназой увеличивает экспозицию Мас-1 в нейтрофилах и т.о. может способствовать клеточной адгезии [Sitrin et., 2000].

Вышеизложенные литературные данные свидетельствуют о важной роли компонентов урокиназного пути активации плазминогена в адгезии, миграции, активации и дифференцировке моноцитов (Рисунок 4). Эта роль определяется клеточными эффектами, которые зависят от активации латентных факторов роста и цитокинов или связаны с непосредственным действием урокиназы и плазмина на клетку, а также комплексной регуляцией клеточной адгезии и миграции, включающей участие в протеолизе матриксных белков, регуляции активности интегринов и адгезии на витронектине. Таким образом, анализ экспрессии моноцитами урокиназы и ее рецепторов может способствовать получению дополнительных сведений о механизмах развития патологических состояний, связанных с адгезией и миграцией моноцитов, в частности, атеросклероза и рестеноза.

Заключение.

Рядом исследований показано, что моноцитарная инфильтрация играет существенную роль в ремоделировании стенки артерии при атеросклерозе и рестенозе. Миграция моноцитов в поврежденную стенку сосуда зависит от состояния молекул агезии на клеточной мембране, а также от уровня синтеза этими клетками ферментов, расщепляющих белки внеклеточного матрикса. Моноцитарные интегрины Мас-1 и VLA-4 необходимы для взаимодействия моноцитов с элементами сосудистой стенки, а компоненты урокиназного пути активации плазминогена создают протеолитическую основу клеточной миграции. Данные об экспрессии урокиназы, рецепторов урокиназы, интегринов Mac-1 и VLA-4 моноцитами больных с коронарным атеросклерозом и рестенозом к началу данной работы отсутствовали. Не было определено участие урокиназы в Мас-1-и VLA-4 - зависимой адгезии

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ MA ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика пациентов и контрольной группы доноров.

В исследование было включено 29 пациентов, 23 мужчины и 6 женщин, средний возраст 49+10 лет. Все пациенты были обследованы в стационаре Российского кардиологического научно-производственного комплекса и имели диагноз ишемическая болезнь сердца (ИБС), стабильная стенокардия

II функционального класса, стенозирующий атеросклероз коронарных артерий, подтвержденный данными коронарной ангиографии. Больные получали стандартную терапию, включающую аспирин, бета-блокатор или антагонист кальция и гиполипидемический препарат ловостатин или симвастатин. Пациенты не имели онкологических заболеваний, иммунных нарушений, инфекционных заболеваний и каких-либо хирургических вмешательств на протяжении месяца, предшествующего проведению исследования. Группу здоровых доноров из 14 человек составили сотрудники Центра, 10 мужчин и 4 женщины, средний возраст 43 + 11 лет. Доноры не имели факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, электрокардиографических признаков поражения коронарных артерий, не получали каких-либо лекарственных препаратов, а также не имели сахарного диабета, онкологических заболеваний, иммунных нарушений, инфекционных заболеваний и каких-либо хирургических вмешательств на протяжении месяца, предшествующего проведению исследования.

В исследование были также включены 24 пациента (мужчины, средний возраст 52+4 года), которым было выполнено успешное стентирование одной коронарной артерии по поводу ИБС, стабильной стенокардии напряжения II

III функционального класса, а также контрольная коронароангиография. Пациенты не имели сопутствующих онкологических или воспалительных заболеваний. Коронарная ангиопластика с установкой металлических стентов Iomed была проведена в соответствии со стандартным протоколом [Самко, Савченко, 1993; Савченко, Самко, 1996]. Ангиографию выполняли в 2 ортогональных проекциях для лучшей визуализации стеноза. Баллонные катетеры и стенты подбирали при помощи компьютерного коронарного анализа (система HICOR) на аппарате Coroscop-33 (Siemens, Германия). Остаточный стеноз после стентирования не превышал 10%. Осложнения в ходе выполнения процедуры отсутствовали у всех пациентов. В ходе ангиопластики каждому пациенту вводили 10000 ЕД гепарина и 250 мкг нитроглицерина интракоронарно после введения проводника в просвет артерии. Все пациенты постоянно получали стандартную терапию, включающую аспирин, 125 мг/сутки, и бета-блокатор, а также тиклопидин, 500 мг/сутки, в течение 1 месяца после ангиопластики. Инфузия гепарина, 500-1000 ЕД/час под контролем показателей свертывания (целевой уровень активированного частичного тромбопластинового времени в 2-3 раза выше исходного) проводилась в течение 12 часов после стентирования. Контрольную коронороангиографию выполняли всем пациентам спустя 6 мес после ангиопластики или ранее при наличии клинических показаний (появление стенокардии напряжения или положительной нагрузочной пробы) с использованием оборудования Quantitative Coronary Analysis system (HICOR, Siemens, Германия) [Foley et al., 1994]. Образцы периферической крови были получены после проведения контрольной ангиографии.

Получение периферической крови.

Пробы венозной крови брали из локтевой вены натощак между 9 и 10 часами утра. В качестве антикоагулянта использовали 130 мМ раствор цитрата натрия в соотношении кровь:антикоагулянт - 9:1.

Активация лейкоцитов в «цельной крови».

УОССЯЙС*** - J V* .-деДООТвШ 4

Для активации лейкоцитов «в цельной крови» в аликвоту периферической крови, добавляли 0.5 мкг/мл липополисахарида (ЛПС, продукт клеточной стенки Грам-отрицательных бактерий) производства фирмы Sigma Chemical СО, США, и инкубировали 0-240 мин при 37° и 5% со2.

Выделение мононуклеарных клеток крови и получение фракции, обогащенной моноцитами.

Мононуклеарные клетки крови были выделены из венозной крови согласно методу Boyum [1968] в градиенте фиколл-верографин, р=1.077 (Flow Laboratories, Великобритания). Клетки, собранные на градиенте плотности, дважды отмывали в фосфатном буфере (ФБ) и очищали от клеточных осколков и тромбоцитов с использованием буфера Бомера-Шормана в соответствии с описанной ранее методикой [Красникова с соавт., 1986]. Количество моноцитов в полученной суспензии определяли по окрашиванию антителами против моноцитарного антигена CD 14.

Обогащенная моноцитами суспензия клеток была получена с помощью центрифугирования мононуклеарных клеток в ступенчатом градиенте Перколла (Sigma Chemical СО, США) согласно протоколу, описанному ранее [Al-Sumidaie et al., 1984]. Клетки, собранные с промежуточного градиента плотности, были отмыты 2 раза в ФБ. В соответствии с данными морфологического анализа и по окрашиванию с антителами против CD 14, полученная суспензия содержала 73+11% моноцитов. Жизнеспособность клеток, определяемая по исключению красителя Трипановый синий, составляла не менее 95%.

Культивирование мононуклеарных клеток.

Мононуклеарные клетки, выделенные из крови, ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина в количестве 3 млн/мл. Клетки культивировали 5 ч при температуре +37°С и 5%-ном содержании С02. Все процедуры проводили в стерильных условиях с использованием силиконированной посуды.

Культивирование линейных клеток.

Промоноцитарные клеточные линии U937 и ТНР-1 были предоставлены соответственно Институтом цитологии РАН и Американской типовой коллекцией клеточных культур (АТСС), клетки В лимфомы Daudi -Институтом вирусологии им. Д.И.Ивановского РАН. Суспензионные клеточные линии U937, ТНР-1 и Daudi культивировали при температуре 37°С и 5%-ном СО2 в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и по 100 U/мл пенициллина и стрептомицина (все реагенты производства Gibco BRL, Life Technologies Ltd., Великобритания). Перед проведением экспериментов клетки U937 инкубировали в присутствии 16 нМ форболмиристатацетата (Sigma Chemical СО, США) 24 ч при +37°С и 5% С02.

Оценка количества антигенов на поверхности лейкоцитов.

Экспозицию поверхностных антигенов на лейкоцитах анализировали методами прямой и непрямой иммунофлюоресценции с использованием следующих мышиных антител против антигенов человека: моноклональные антитела против рецептора урокиназы (клон 3936, American Diagnostica, США) и урокиназы, полученных в лаб. иммунохимии ИЭК РКНПК по раннее описанной методике [Якубов с соавт., 1986], контрольные иммуноглобулины мыши (лаб. иммунохимии ИЭК, РКНПК); меченые флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) или фикоэретрином (ФЭ) моноклональные антитела CDllb, CD14, CD49d, CD54 и контрольные иммуноглобулины соответствующих классов (Becton Dickinson, США). Согласно спецификации производителя, антитела против рецепторов урокиназы связывались как со свободными, так и с оккупированными урокиназой рецепторами. Антитела против урокиназы «узнавали» свободную урокиназу и урокиназу, связанную с рецептором на поверхности клетки.

Для предупреждения дополнительной активации клеток и диссоциации урокиназы из комплексов с мембранными рецепторами все образцы перед иммунологическим окрашиванием фиксировали в 0,4% параформальдегиде в течение 5 мин. При использовании образцов крови проводили лизис эритроцитов в растворе, содержащем 154 мМ NH4C1, 12мМ NaHC03, 1.4 мМ ЭДТА, рН 7.3, 10 мин при комнатной температуре. Лейкоциты отмывали в ФБ, содержащем 0.1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). Суспензии клеток инкубировали при +4°С 30 мин в ФБ-0.1%БСА с насыщающим количеством моноклональных антител (согласно инструкции производителя). При использовании немеченых флюоресцентной меткой антител клетки дополнительно инкубировали при тех же условиях с ФИТЦ-мечеными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши (Ortho, США). Лейкоциты отмывали в ФБ-0.1%БСА и фиксировали 1% параформальдегидом в ФБ.

До проведения цитометрического анализа образцы хранили в темноте при не более 2 суток. Мембранную экспрессию антигенов измеряли методом цитометрии в потоке на приборе Facscan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США), анализируя по 13000 событий для каждого образца. Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений, а их стабильность регулярно проверялась с помощью флюоресцентных бус (Calibrite, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, США). Данные переводили в формат IBM с помощью программы Consort 30 to IBM-PC Data TRANSFER и анализировали, используя программу WinMDI. Мембранную экспрессию антигенов выражали в относительных единицах (О.Е.), представляющих среднюю интенсивность флюоресценции в линейной шкале после вычитания неспецифической флюоресценции. Моноциты выделяли по экспрессии специфического антигена CD 14, гранулоциты - по характеристикам прямого и бокового светорассеяния.

Оценка связывание урокиназы с моноцитами.

Количество свободных насыщаемых рецепторов урокиназы определяли

125 с помощью меченой I рекомбинантной про-урокиназы (лаб. генной инженерии ИЭК РКНПК, [Белогуров с соавт., 1993]). Мечение про-урокиназы проводили по общепринятой методике [Kirchheimer et al., 1988]. Удельная активность препарата составляла 1-2.5x106 распадов/мин на 1 пикомоль урокиназы.

Моноциты получали из фракции мононуклеарных клеток путем адгезии на пластике в среде RPMI 1640, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, при +37°С и 5%-ном С02 в течение 1 ч. Клетки отмывали и проводили связывание с 1251-про-урокиназой при +4°С в течение 16 ч [Kirchheimer et al., 1988;]. Неспецифическое связывание определяли с 100-кратным избытком немеченой про-урокиназы. Радиоактивность проб просчитывали в гамма-счетчике Сотри Gamma (LKB, Швеция). Количество мембранных мест связывания и Kd рассчитывали по методу Скэтчарда.

Анализ содержания урокиназы в плазме крови.

Анализ содержания урокиназы в плазме крови проводили иммуноферментным методом с использованием набора UMUBIND иРА ELISA Kit производства American Diagnostica Inc. (Greenwich, США), позволяющим выявлять низко- и высокомолекулярные формы урокиназы, а также урокиназу, связанную с ингибиторами активаторов плазминогена ПАИ-1 и ПАИ-2.

Приготовление матрикса из фибринонектина.

Для приготовления матрикса из фибронектина 96-луночные планшеты инкубировали с раствором фибронектина в ФБ (5мкг/мл, 100 мкл/лун) ночь при +4°С.

Приготовление матрикса из фибриногена и продуктов его расщепления плазмином.

Для предупреждения ресорбции фибриногена и продуктов его деградации фибриноген был иммобилизован на пластиковой поверхности с использованием «пришивки» глютаральдегидом [Fleury, Angles-Cano, 1991]. 96-луночные планшеты инкубировали 2 ч при комнатной температуре с 2.5% раствором глютаральдегида в 0.1 М натрий-бикарбонатном буфере, рН 9.5. Платы промывали ФБ, затем в лунки вносили фибриноген (очищенный от плазминогена, Sigma Chemical СО, США, 50мкг/лунка) в ФБ, содержащем 1мМ СаС12, рН 7.4, и инкубировали ночь при +4°С. Платы промывали ФБ-1%БСА и инкубировали 0-120 мин с 50 нМ раствором плазмина (30 МЕ/мг, Serva, Германия) в буфере ФБ-1мМ СаС12-0.1%БСА. Затем платы промывали и инкубировали с ингибитором плазмина апротинином, 10 ИЕ/мл, в ФБ, содержащем 0.1%БСА. Полная инактивация плазмина была подтверждена амидолитическим методом с использованием плазмин-специфичного хромогенного субстрата S2254 (Chromogenix АВ, Molndal, Швеция).

В отдельных экспериментах обработанные глютаральдегидом планшеты были покрыты продуктами деградации фибриногена (ПДФ). Для получения ПДФ, фибриноген (500 мкг/мл) инкубировали с 50 нМ плазмина в ФБ-1мМ СаСЬ при комнатной температуре. Через 0-120 мин к смеси добавляли апротинин (10 ИЕ/мл). Для характеристики образовавшихся продуктов проводили электрофорез в 7.5% полиакриамидном геле в присутствии додецилсульфата Na в невосстанавливающих условиях.

Перед внесением клеток планшеты, покрытые фибриногеном или продуктами его деградации, инкубировали 2 ч при комнатной температуре с 1% раствором бычьего альбумина в ФБ для исключения неспецифических мест связывания.

Оценка клеточной адгезии.

Адгезию клеток определяли колориметрическим методом [Wong et al., 1996]. Суспензию линейных клеток (2 млн/мл) в среде RPMI 1640-0.1% БСА вносили в лунки 96-луночной платы (100 мкл суспензии на лунку) и инкубировали 1 ч в С02-инкубаторе.

Платы промывали ФБ для удаления неприкрепившихся клеток. Оставшиеся клетки фиксировали метанолом (5 мин), окрашивали методом Giemsa (30 мин) и измеряли поглощение при 540 нМ на многоканальном спектрофотометре (Labsystems, Multiscan MS). Клеточную адгезию выражали в единицах поглощения при 540 нМ или в относительных единицах, соответствующих % от максимальной адгезии клеток.

Для оценки адгезии обогащенную моноцитами суспензию клеток, 1 млн/мл, в ФБ, содержащем 1 мМ СаС12, 1 mM MgCl2 и 10 мкг/мл полимиксина В (ингибитора липополисахарида), вносили в лунки 96-луночной планшеты и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Согласно данным морфологического анализа, такие условия способствовали преимущественной адгезии моноцитов (более 90% от всех прикрепившихся клеток).

Для ингибиторного анализа были использованы следующие моноклональные антитела: антитела крысы против CD18, клон MAB1388Z, мышиные антитела против CD lib, клон МАВ1380 (Chemicon, Temecula, США); моноклональные антитела мыши против ICAM-1 человека клон TD3D3 (любезно предоставлены доктором А.В.Филатовым, Институт иммунологии РАМН) и клон 84Н10 (Immunotech, Cedex, Франция).

Определение прокоагуляционной активности моноцитов, опосредованной тканевым фактором.

Мононуклеарные клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в Трис-буфере (ТБ, 0.05 М Трис-HCL, 0.2 М NaCl, рН 8.4) в количестве 10 млн/мл. Клеточные лизаты получали методом замораживания-оттаивания. К образцам (50мкл) добавляли 50 мкл объединенной плазмы здоровых доноров, разведенной в 20 раз в ТБ и 50 мкл 0.5 мМ раствора хромогенного субстрата X фактора свертывания крови S2222 (Chromogenix, АВ, Molndal, Швеция) в ТБ, содержащем 50 мМ СаС12 и ингибитор тромбина 12581 (Chromogenix, АВ, Molndal, Швеция). Пробы инкубировали 1.5 ч при и измеряли оптическую плотность при 405 нМ. В контрольных пробах вместо плазмы доноров использовали плазму, дефицитную по VII фактору свертывания крови (Sigma Chemical СО, США). Прокоагуляционную активность моноцитов выражали в относительных единицах, представляющих соотношение (А405 опыт - А405 контроль)/количество моноцитов в пробе.

Статистический анализ.

Данные представлены как среднее + стандартная ошибка среднего (SE) при п>10 и как среднее + стандартное отклонение (SD) при п<10. Для определения достоверности различий использовали /-критерий Стьюдента для непарных измерений.

Формы рекомбинантной урокиназы и антитела.

В работе использовали следующие формы урокиназы: высокомолекулярная гликозилированная урокиназа человека (Medac, Munich, Германия), рекомбинантная про-урокиназа, рекомбинантная про-урокиназа с заменой гистидина на глутамин в активном центре и рекомбинантная про-урокиназа, не содержащая домен, ответственный за связывание с рецептором (лаб. генной инженерии ИЭК РКНПК, [Белогуров с соавт., 1993]). Протеолитическая активность форм урокиназы анализировалась расщеплением хромогенного субстрата S2444 (Chromogenix, АВ, Molndal, Швеция). Про-урокиназа с модифицированным активным центром не обладала протеолитической активностью. Соответствие конформаций рекомбинантных форм структуре нативного белка доказано связыванием с моноклональными антителами к различным эпитопам нативной урокиназы, чистота препаратов проверена методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия [Mukhina et al., 2000].

В работе также использовались поликлональные антитела козы против урокиназы человека (лаб. иммунохимии ИЭК РКНПК), s-аминокапроновая кислота, полимиксин В, а2-антиплазмин и липополисахарид E.Coli (Sigma Chemical СО, США). Все биохимические реактивы общего назначения были аналитической чистоты и следующих фирм: Sigma (США), Serva (Германия), Fluka (Швейцария), РеаХим (Россия), Bio-Rad (США). Пластиковая посуда для работы с клетками -фирмы Corning-Costar (Нидерланды).

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Динамика экспозиции моноцитарных антигенов при активации клеток «в цельной крови».

Для определения динамики экспозиции поверхностных антигенов моноцитами при активации in vitro, аликвоты периферической крови, полученной от 3-х доноров, инкубировали с 0.5 мкг/мл ЛПС при +37°С в течение различных временных интервалов (0, 30, 120 и 240 мин). Образцы фиксировали и окрашивали антителами против а-субъединиц интегринов Мас-1 и VLA-4 (CDlib и CD49d соответственно), урокиназы, рецепторов урокиназы и ЛПС-связывающей молекулы CD 14. Мембранную экспрессию антигенов анализировали методом цитофлюориметрии и выражали в % от максимальной флюоресценции. Как показано на Рисунке 5, экспозиция интегрина Мас-1 и рецепторов урокиназы моноцитами существенно возрастала, ~ в 8 и в 5 раз соответственно, и достигала максимальных значений при 2-х-часовом инкубировании крови с ЛПС. Экспозиция CD 14 также увеличивалась, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными, свидетельствующими о 2-кратном повышении количества CD 14 на мембране моноцитов при аналогичном способе активации [Marchant et al., 1992]. В отличие от других антигенов, мембранная экспозиция интегрина YLA-4 оставалась на постоянном уровне (Рисунок 5). Мы также не обнаружили существенных изменений в связывании с моноцитами антител против урокиназы (данные не представлены). В соответствии с полученными результатами последующие измерения максимальной экспозиции поверхностных антигенов активированными моноцитами проводились после инкубирования крови с 1 мкг/мл ЛПС в течение 2 ч.

Индивидуальные значения максимальной экспозиции поверхностных антигенов моноцитами, полученные для трех доноров, сохранялись на постоянном уровне (CV<10%) в течение 3 мес.

Характеристика больных стабильной стенокардией и контрольной группы доноров.

Характеристики здоровых доноров и больных стабильной стенокардией представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Клинические характеристики больных стабильной стенокардией и здоровых доноров.

Здоровые доноры, п=Т4 Пациенты со стабильной стенокардией, п=29

Возраст,г (среднее+SE) 43+11 49+10

Пол (% мужчин) 72 79

Диабет (%) - 10

Гиперлипидемия (%) - 41

Курение (%) 50 41

Коронароангиография:

• Однососудистое - 79 поражение (%)

• Двусосудистое - 21 поражение (%)

Клинические и ангиографические характеристики больных, перенесших коронарную ангиопластику.

Клинические и ангиографические характеристики пациентов, полученные перед ангиопластикой, приведены в Таблице 3. Каждому пациенту была выполнена успешная ангиопластика с установкой стента. По данным контрольной ангиографии, проведенной спустя 6 мес после ангиопластики, рестеноз (уменьшение просвета сосуда на 50% и более) был выявлен у 10 пациентов.

У большинства (90%) пациентов с ангиографически подтвержденным рестенозом была выявлена стенокардия напряжения во время проведения велоэргометрической пробы. Никто из обследованных пациентов не имел признаков сердечной недостаточности и de novo сформированных атеросклеротических повреждений коронарных артерий (с диаметром стеноза >50%).

Таблица 3. Исходные клинические и ангиографические характеристики пациентов (в соответствии с данными контрольной коронароангиографии пациенты разделены на 2 группы).

Пациенты с Пациенты без рестенозом, п=10 рестеноза, п=14

Возраст, г (среднее + SE) 53+2 52+4

Диабет - 1 пациент

Артериальная гипертония 20% 29%

Курение 10% 14%

Артерия: ПНА/ГЖА/ОА 10%/50%/40% 29%/42%29%

Диаметр артерии, мм (среднее + SE) 2.8+0.2 2.9+0.3

Диаметр стеноза, % 75+5 77+7 среднее + SE)

ПНА - передняя нисходящая артерия, ПКА - правая коронарная артерия, OA - огибающая артерия.

Урокиназа в плазме крови больных стабильной стенокардией и здоровых доноров.

Содержание урокиназы в плазме крови (среднее + SE) больных стабильной стенокардией составляло 10.40+0.69 пМ (п=24) и достоверно (р<0.05) превышало соответствующий показатель у здоровых доноров (8.25+0.53, п=14). Концентрация урокиназы варьировала от 3.64 до 17.64 у пациентов и от 5.18 до 10.82 у доноров. Распределение урокиназы в плазме крови больных стабильной стенокардией и здоровых доноров представлено на Рисунке 6.

Рецепторы урокиназы и урокиназа на моноцитах больных со стабильной стенокардией и здоровых доноров.

Мы проанализировали общий пул рецепторов урокиназы и относительное количество мембраносвязанной урокиназы на моноцитах крови методами иммунофлюоресценции и цитофлюориметрии в потоке. Число свободных рецепторов на моноцитах было определено с помощью

125 связывания с меченой I рекомбинантной про-урокиназой. Мы не обнаружили достоверных различий в экспрессии рецепторов урокиназы на моноцитах доноров и больных с коронарным атеросклерозом ни до, ни после активации «в цельной крови». Тем не менее, у больных наблюдалась тенденция к увеличению этого показателя. Нами показано достоверное (р<0.05) увеличение количества мембраносвязанной урокиназы на моноцитах пациентов по сравнению со здоровыми донорами. Об этом также свидетельствуют результаты рецепторного связывания про-урокиназы. Так, количество свободных рецепторов урокиназы на поверхности моноцитов больных стабильной стенокардией было примерно в 2 раза ниже (р<0.05) по сравнению с донорами (Таблица 4).

Таблица 4. Мембранная экспозиция рецепторов урокиназы и урокиназа на моноцитах здоровых доноров и пациентов со стабильной стенокардией. Данные представлены как среднее + SD.

Анализируемые Параметры Здоровые доноры Больные

До активации После активации, До активаци и После активаци и п=10 п=13

Рецепторы урокиназы, О.Е. 22+7 92+23 28+10 109+9

Урокиназа, О.Е. 10+9, п=6 33+17, п=5

Количество свободных рецепторов урокиназы на клетку 10770+5570, п=5 4810+3450, п=8

Рецепторы урокиназы и мембраносвязанная урокиназа на моноцитах при коронарном рестенозе.

Мы оценили рецепторы урокиназы на моноцитах после активации клеток «в цельной крови», а также количество мембраносвязанной урокиназы на моноцитах у больных, перенесших ангиопластику коронарных артерий (Таблица 5).

Таблица 5. Рецепторы урокиназы и мембрано с вязанная урокиназа на моноцитах (среднее + SE) больных, перенесших ангиопластику.

Пациенты без рестеноза Пациенты с рестенозом

Рецепторы урокиназы, О.Е. 111+14 117+10

Урокиназа, О.Е. 28+9 40+13#

07

Мы не обнаружили различий в экспрессии рецепторов урокиназы на моноцитах пациентов с рестенозом и без такового. Нами отмечена тенденция к увеличению количества мембраносвязанной урокиназы на моноцитах крови больных с рестенозом по сравнению с пациентами без рестеноза.

Экспрессия интегрииов Мас-1 у больных со стабильной стенокардией и здоровых доноров.

Относительное количество молекул адгезии Мас-1 на моноцитах крови больных стабильной стенокардией и здоровых доноров измеряли по связыванию с антителами против а субъединицы этих интегринов (CDlib) до и после активации клеток «в цельной крови». Полученные результаты представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Мембранная экспозиция Мас-1 моноцитами здоровых доноров и больных стабильной стенокардией.

Здоровые доноры, п=6 Больные, п=5

До активации После активации До активации После активации

Мас-1, О.Е. (среднее + SD) 260+81 1284+128 295+99 1400+114

Нами не обнаружено достоверных различий в экспрессии интегринов Мас-1 моноцитами здоровых доноров и больных стабильной стенокардией.

Моноцитарные интегрины Мас-1 и VLA-4 при коронарном рестенозе.

Индивидуальные показатели экспозиции Мас-1, VLA-4 и CD 14 представлены на Рисунке 7.

Результаты измерения относительного количества поверхностных моноцитарных антигенов Мас-1 и VLA-4 после активации клеток «в цельной крови» представлены в Таблице 7. Полученные данные свидетельствуют о статистически достоверном увеличении мембранной экспозиции активированными моноцитами интегринов Мас-1 на 20%) и VLA-4 (-30%) у больных с рестенозом по сравнению с пациентами без рестеноза. Существенных различий в экспрессии другого моноцитарного антигена - ЛПС-связывающей молекулы CD 14 - не обнаружено.

Таблица 7. Мембранная экспрессия интегринов Мас-1 и VLA-4 и молекул CD 14 после активации «в цельной крови» у больных с рестенозом и без рестеноза.

Интенсивность флюоресценции, О.Е. (среднее ±SE)

Мас-1 VLA-4 CD14

Пациенты без 1184+76 66+7 460+31 рестеноза

Пациенты с 1425+82* 86+6* 475+34 рестенозом

-р<0.05

Повышенное содержание урокиназы на мембране моноцитов, обнаруженное нами у больных с коронарным атеросклерозом и рестенозом, можно рассматривать как фактор, способствующий инвазии моноцитов в стенку сосуда и ее последующему ремоделированию. Помимо этого, урокиназа и образующийся под ее действием плазмин могут усиливать «воспалительный ответ» моноцитов, участвуя в активации некоторых цитокинов и факторов роста, а также обладая прямым стимулирующим действием на клетку (см. Обзор литературы). На основании этих данных в экспериментальной части работы мы поставили перед собой цель выяснить, не принимает ли урокиназа участия в регуляции такой важной с точки зрения патогенеза атеросклероза и рестеноза «эффекторной» функции моноцитов, как экспрессия тканевого фактора. Учитывая данные об увеличенной экпрессии моноцитами интегринов Мас-1 и VLA-4 при рестенозе, мы исследовали влияние урокиназы на адгезию клеток на фибриногене и фибронектине - белках, являющихся лигандами для этих молекул адгезии.

Урокиназа не влияет на прокоагуляционную активность моноцитов, опосредованную тканевым фактором.

На основании данных о наличии незанятых урокиназой рецепторов на мембране моноцитов мы проверили, не влияет ли насыщение экзогенной урокиназой на экспрессию тканевого фактора этими клетками. Суспензии мононуклеарных клеток культивировали 5 ч в присутствии 1-10 нМ урокиназы (высокомолекулярной гликозилированной формы) и затем оценивали прокоагуляционную активность клеточных лизатов. Оказалось, что такие условия культивирования не приводят к индукции тканевого фактора в моноцитах. В то же время инкубирование клеток в присутствии ЛПС - известного стимулятора синтеза тканевого фактора [van der Logt et al., 1994] - вызывало 4-5-кратное увеличение прокоагуляционной активности по сравнению со спонтанным уровнем независимо от присутствия экзогенной урокиназы (Рисунок 8).

Известно, что ЛПС стимулирует синтез урокиназы в моноцитах [Manchanda, Schwartz, 1990]. Урокиназав свою очередь может регулировать индуцированную ЛПС продукцию некоторых био-медиаторов, в частности фактора некроза опухоли-а [Sitrin et al., 1996 Ь]. Мы исследовали участие эндогенной урокиназы в индуцированной ЛПС экспрессии тканевого фактора. С этой целью мы использовали козьи поликлональные антитела против урокиназы человека для ингибирования эндогенной урокиназы и е-аминокапроновую кислоту для вытеснения плазминогена с клеточных сайтов связывания. Оказалось, что ни один из этих агентов не влиял на стимулированную ЛПС прокоагуляционную активность моноцитов (Рисунок 9).

Урокиназа стимулирует адгезию промоноцитариых клеток U937 на фибриногене, но не на фибронектине.

На основании данных об участии рецептора урокиназы в Мас-1-опосредованной адгезии моноцитов на фибриногене [Sitrin et al., 1996], мы исследовали роль урокиназы в этом процессе. В качестве модели мы использовали клетки промоноцитарной линии U937, «примированные» форболмиристатацетатом - индуктором моноцитарной дифференцировки этих клеток [Hass et al., 1989; Liu, Wu, 1992; Pucillo et al., 1993]. Мы обнаружили, что добавление экзогенной про-урокиназы к суспензии клеток вызывало их прикрепление к фибриногеновому матриксу. Как показано на Рисунке 10, максимальный эффект наблюдался при концентрации про-урокиназы 10 нМ спустя 3 ч после ее внесения. Высокомолекулярная гликозилированная урокиназа оказывала аналогичное действие на адгезию клеток. Исследование адгезии клеток U937 на фибронектине показало, что количество прикрепившихся клеток на этом матриксном белке не зависело от присутствия в среде экзогенной урокиназы (Рисунок 10).

Мы изучили влияние различных рекомбинантных форм про-урокиназы на фибриноген-зависимую адгезию клеток U937. Оказалось, что формы с неизмененным каталитическим доменом, независимо или отсутствия связывающегося с рецептором домена, обладали одинаковой способностью стимулировать адгезию, в то время как урокиназа, лишенная протеолитической активности, не вызывала адгезию клеток (Рисунок 11).

Стимулирующее действие урокиназы на фибриноген-зависимую адгезию клеток U937 связано с образованием плазмина.

Поскольку оказалось, что адгезию клеток U937 на фибриногене стимулируют протеолитически активные формы урокиназы, мы исследовали участие плазмина в этом процессе. Анализ стимулированной урокиназой адгезии клеток проводили в присутствии ингибитора плазмина - а2-антиплазмина. В равном молярном соотношении про-урокиназы и а2-антиплазмина наблюдалось 50%-ное подавление адгезии, в соотношении 1:10 адгезия практически отсутствовала (Рисунок 12).

Адгезия моноцитарных клеток зависит от расщепления фибриногенового матрикса плазмином.

Так как обнаруженная нами стимуляция урокиназой адгезии клеток U937 на фибриногене была связана в конечном итоге с образованием плазмина, мы предположили, что этот эффект мог быть опосредован расщеплением фибриногенового матрикса под действием плазмина. Для подтверждения этой гипотезы мы проанализировали адгезию клеток U937, а также другой промоноцитарной линии ТНР-1 [Auwerx, 1991] в зависимости от степени деградации фибриногенового матрикса плазмином. Оказалось, что плазминовая модификация иммобилизованного фибриногена (см. Материалы и Методы) приводила к существенному увеличению адгезии клеток U937 и снижению адгезии клеток ТНР-1 (Рисунки 13 и 14).

Адгезия,А540 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

0 20 40 60 80 100

Пре-инкубирование фибриногена с плазмином, мин

Рисунок 13. Зависимость клеточной адгезии от степени деградации фибриногена.

Клетки ТНР-1 и U937 вносили в лунки, покрытые фибриногеном и пре-инкубированные с плазмином (50нМ) в течение различных временных интервалов. * # -р<0.05. Количество прикрепившихся клеток выражено в единщих поглощения при 540 нМ. Приведены данные 5 независимых экспериментов (среднее + SD).

Максимальное (3-4-кратное) возрастание адгезии U937 и почти 2-кратное уменьшение адгезии ТНР-1 наблюдалось в лунках, где фибриногеновый матрикс был пре-инкубирован с 50нМ плазмина в течение 30 мин. Более длительная обработка фибриногена плазмином приводила к постепенному снижению адгезии обоих типов клеток. Мы не наблюдали изменений адгезии клеток на фибриногене, пре-инкубированном с плазминогеном. Ни U937, ни ТНР-1 клетки не прикреплялись к альбумину, иммобилизованному на платах с помощью глютаральдегида (данные не приведены). Моноциты, выделенные из периферической крови, прикреплялись как к интактному фибриногену, так и фибриногену, обработанному плазмином, причем в последнем случае адгезия была немного снижена (Рисунок 14).

Молекулы Мас-1 и ICAM-1 в адгезии моноцитарных клеток на фибриногене и продуктах его плазминового протеолиза.

Различное «адгезивное» поведение клеток, зависящее от степени деградации фибриногена, предполагает вовлечение разных классов молекул адгезии. Для того чтобы выяснить, какие именно молекулы участвуют в клеточной адгезии на фибриногене и продуктах его деградации, мы проанализировали мембранную экспрессию известных рецепторов фибриногена Р 2-интегринов Мас-1 и молекул адгезии ICAM-1 [Altieri et al., 1988, 1995] на линейных клетках и моноцитах крови, а также провели ингибиторный анализ с антителами, блокирующими эти молекулы.

Как показало связывание антител против CD lib и ICAM-1 (CD54), клетки ТНР-1 экспрессировали большое количество интегринов Мас-1, и практически не имели ICAM-1 (Таблица 8). Напротив, для клеток U937 характерным оказалось более выраженная мембранная экспозиция ICAM-1 по сравнению с Мас-1. Моноциты, выделенные из периферической крови, имели наибольшее количество Мас-1 и умеренное количество ICAM-1 на клеточной поверхности.

Таблица 8. Мембранная экспозиция Мас-1 uICAM-1 различными типами клеток.

U937 ТНР-1 Daudi Моноциты, выделенные из крови

Мас-1 151+10 443+39 25+5 1060+210

ICAM-1 742+44 44+6 752+30 323+46

Примечание . Клетки инкубировали с ФЭ-мечеными моноклоналъными антителами против а-субъединицы Мас-1 (CDllb) и против ICAM-1(CD54). Относительную экспрессию антигенов измеряли методом цитометрии в потоке и выражали в относительных единицах флюоресценции. Приведены результаты трех измерений (среднее+ SD).

Ингибиторный анализ показал, что адгезия клеток ТНР-1 на фибриногене более чем на 60% снижена в присутствии антител против |32-интегринов (25мкг/мл), в то же время антитела против ICAM-1 (клон TD3D3) не подавляли адгезию этих клеток. Напротив, прикрепление клеток U937 к плазмин-модифицированному фибриногену ингибировалось на 60%) антителами против ICAM-1 (25 мкг/мл), но не антителами против р2-интегринов (Рисунок 15 А).

Ингибиторный анализ адгезии моноцитов крови в целом подтвердил участие молекул Мас-1 и ICAM-1 в клеточной адгезии на фибриногене и его производных (Рисунок 15 Б). Так, блокирующие антитела против Мас-1 существенно (~ на 40%) ингибировали адгезию моноцитов на фибриногене, но не на фибриногене, обработанном плазмином. Антитела против ICAM-1 (клон 84Н10) подавляли адгезию моноцитов только на модифицированном плазмином фибриногене, хотя в сравнении с клетками U937 степень ингибирования адгезии моноцитов была низкой (-25%) и статистически недостоверной в связи с высокой вариабельностью результатов отдельных экспериментов.

Мы также провели дополнительные эксперименты с использованием клеток В лимфомы Daudi. С помощью цитофлюориметрии в потоке мы обнаружили высокую мембранную экспрессию ICAM-1 и практически

1 2 3 4 5

Рисунок 16. Адгезия клеток на фибриногене и иммобилизованных продуктах деградации фибриногена.

Клетки U937 и ТНР-1 вносили в лунки, покрытые фибриногеном (ФГ, 1) и различными продуктами деградации фибриногена (2-5), охарактеризованными методом электрофореза. Стрелками указаны полосы на электрофореграмме, соответствующие фибриногену и различным продуктам его деградации -фрагментам X, Y, D и Е. -р<0.05. Адгезия клеток выражена в единицах поглощения при 540 нМ (среднее + SD, по данным 5 независимых экспериментов). полное отсутствие Мас-1 в этих клетках (Таблица 8). Как мы ожидали, клетки Daudi прикреплялись только к плазмин-модифицированному фибриногену (Рисунок 14).

Зависимость адгезии моноцитарных клеток от степени деградации фибриногена.

Для того чтобы выяснить, с образованием каких продуктов деградации фибриногена связаны изменения в клеточной адгезии, клетки ТНР-1 и U937 помещали в лунки, покрытые охарактеризованными электрофоретически продуктами деградации фибриногена. Как показано на Рисунке 16, клетки ТНР-1 прикреплялись более эффективно к негидролизованному фибриногеновому матриксу и матриксу, частично гидролизованному до X и Y фрагментов. Максимальная адгезия клеток U937 была связана с образованием X и Y фрагментов, а ФГ и конечные продукты его деградации - фрагменты D и Е - не стимулировали адгезию этих клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе были проанализированы некоторые компоненты систем адгезии и фибринолиза моноцитов при коронарном атеросклерозе и рестенозе, а также изучено участие урокиназы и плазмина в регуляции прокоагуляционной активности моноцитов и адгезии этих клеток на фибриногене.

У больных со стабильной стенокардией нами обнаружено достоверное повышение содержания урокиназы в плазме, а также урокиназы, ассоциированной с моноцитами крови. Эти изменения сопровождались двукратным увеличением количества связанных с урокиназой рецепторов на поверхности моноцитов. Полученные данные могут свидетельствовать о повышенном синтезе урокиназы моноцитами крови при коронарном атеросклерозе. Возможно, что стимуляция экспрессии урокиназы моноцитами является одним из системных проявлений хронического воспалительного процесса в стенке сосуда. Подтверждением данной гипотезы служат ранее опубликованные сведения об активации синтеза цитокинов лейкоцитами больных стабильной стенокардией, в частности фактора некроза опухоли-а, интерферона-у [Vaddi et al., 1994], интерлейкинов-1 и -2, хемокина МСР-1 [Lee et al., 1999; Mazzone et al., 1999]. Известно, что фактор некроза опухоли-а, интерферон-у и интерлейкин-1, являются индукторами синтеза урокиназы в моноцитах [Gyetko et al., 1992; 1993].

Во время выполнения данного исследования в литературе появились сведения о повышении содержания урокиназы в крови больных с рестенозом после коронарной ангиопластики. Проспективный анализ содержания урокиназы в плазме у пациентов, перенесших ангиопластику коронарных артерий, показал стабильное увеличение этого показателя у пациентов с ангиографически верифицированным рестенозом как до ангиопластики, так и в течение всего восстановительного периода (6 мес после процедуры) [Strauss et al., 1999]. Мы проанализировали количество урокиназы, ассоциированной с моноцитами крови больных после стентирования коронарных артерий, и отметили тенденцию к увеличению этого показателя у больных с рестенозом по сравнению с пациентами без рестеноза.

Увеличенная экспрессия урокиназы моноцитами создает основу для более эффективной инвазии этих клеток в пораженную стенку сосуда. Помимо этого, урокиназа и образующийся под ее действием плазмин могут усиливать «воспалительный ответ» моноцитов, участвуя в активации цитокинов и факторов роста [Falcone et al., 1993; Sitrin et al., 1996 b], а также обладая прямым стимулирующим действием на клетку, которое включает увеличение продукции метаболитов арахидоновой кислоты и стимуляцию клеточной миграции [Weide et al., 1996; Syrovets et al., 1997]. Таким образом, повышенный синтез урокиназы моноцитами можно рассматривать как фактор, способствующий воспалительному процессу в поврежденной стенке сосуда и ее последующему ремоделированию.

Активация моноцитов сопровождается дегрануляцией и девезикуляризацией клеток, что приводит к определенным количественным изменениям молекулярного состава цитоплазматической мембраны. Так, при кратковременной стимуляции моноцитов «в цельной крови» мы наблюдали существенное увеличение мембранного пула интегринов Мас-1 и рецепторов урокиназы - установленных «маркеров» активации моноцитов [Min et al., 1992; Calafat et al., 1993]. Интересно, что количество интегринов VLA-4 на мембране моноцитов не изменялось при активации клеток. Следовательно, в отличие от Mac-1 эти молекулы адгезии не накапливаются в цитоплазме, а экспонируются на наружной мембране клетки. Наше наблюдение находится в соответствии с ранее опубликованными данными о том, что VLA-4-зависимая адгезия лимфоцитов не требует активации клеток, а связана с конформационными изменениями мембранных молекул [Yednock et al., 1995].

Появление в периферической крови активированных моноцитов и гранулоцитов, характеризующихся увеличенной экспозицией лейкоцитарных {32-интегринов - установленный показатель воспалительного процесса. Увеличение базального уровня этих молекул на поверхности моноцитов крови было отмечено во время приступа нестабильной стенокардии [Mazzone et al.„ 1993; deServi et al., 1996], в остром периоде инфаркта миокарда [Meisel et al., 1998], а также в первые часы и дни после коронарной ангиопластики [Mickelson et al., 1996; Serrano et al., 1997]. Существуют также сведения о наличии этого «воспалительного маркера» у больных стабильной стенокардией [Mazzone et al., 1997; Kassirer et al., 1999; Berliner et al., 2000], однако, эти исследования были выполнены в основном на больных с многососудистыми поражениями и/или имеющих одновременно несколько факторов риска развития атеросклероза. Увеличение мембранной экспрессии интегринов VLA-4 моноцитами было отмечено у больных в острой фазе инфаркта миокарда [Meisel et al., 1998]. Мы не нашли в литературе сведений об экспрессии моноцитами рецепторов урокиназы при коронарном атеросклерозе. Следует отметить, что в упомянутых выше работах охарактеризована базальная экспозиция интегринов моноцитами крови, иными словами, определен «адгезивный фенотип» циркулирующих в крови клеток. Мы проанализировали как базальный уровень молекул адгезии и рецепторов урокиназы на моноцитах, так и максимальную экспозицию этих молекул, которая может иметь место in vivo при контакте моноцитов с поврежденной сосудистой стенкой. Оказалось, что базальный уровень экспозиции интегринов Мас-1 и рецепторов урокиназы моноцитами крови больных стабильной стенокардией существенно не отличается от соответствующих параметров моноцитов здоровых доноров. По-видимому, это связано с тем, что включенные в наше исследование больные, по данным ангиографии, в основном имели однососудистые поражения коронарных артерий. Можно сделать вывод о том, что системная активация моноцитов, определяемая по увеличению мембранной экспозиции соответствующих антигенов, не характерна для больных со стабильным течением стенокардии и не имеющих распространенного атеросклеротического поражения артерий. Мы также не обнаружили достоверных различий в максимальном количестве интегринов Мас-1 и рецепторов урокиназы, экспонированных моноцитами больных стабильной стенокардией и здоровых доноров после активации in vitro. Следовательно, уровень синтеза этих молекул в моноцитах у пациентов с коронарным атеросклерозом, по-видимому, не изменен. Наряду с этим, анализ количества интегринов Мас-1 и VLA-4 на поверхности моноцитов у пациентов, имевших стабильную стенокардию и перенесших по этому поводу ангиопластику коронарных артерий, показал достоверное увеличение экспозиции этих молекул адгезии активированными моноцитами у больных с рестенозом.

Проникновение моноцитов в поврежденную стенку сосуда является ключевым моментом, инициирующим воспаление и приводящим в конечном итоге к гиперплазии неонтимы и рестенозу. В экспериментах in vitro и in vivo доказано, что молекулы адгезии Мас-1 и VLA-4 необходимы для эффективной инвазии моноцитов в очаг воспаления и повреждения тканей. Мас-1 участвует в адгезии и миграции клеток в местах отложения фибрина и тромбоцитов [Kuijper et al., 1997]. У кроликов образование неоинтимы после баллонирования и стентирования значительно уменьшалось при введении животным антител, блокирующих Мас-1 [Rogers et al., 1996]. У линии мышей, не имеющих Мас-1, показана нарушенная миграция лейкоцитов через слой тромбоцитов и последующее подавление роста неоинтимы при механическом повреждении артерии [Simon et al., 2000]. Согласно клиническим исследованиям, экспозиция Мас-1 на моноцитах и гранулоцитах крови существенно возрастает в первые часы после ангиопластики, причем в большей степени у тех больных, у которых впоследствии наблюдались клинические признаки рестеноза [Mickelson et al., 1996; Inoue et al., 1998].

Известными лигандами интегрина VLA-4 являются белок внеклеточного матрикса фибронектин и молекулы адгезиии VCAM-1, экспрессируемые активированными эндотелиальными и гладкомышечными клетками [Li et al., 1993; Meerschaert et al., 1995; Huo et al., 2000]. Таким образом, VLA-4 может участвовать в дальнейшей инвазии моноцитов в стенку сосуда при ее повреждении. В модели экспериментальной эндатереэктомии у обезьян показано, что введение блокирующих VLA-4 антител приводит к уменьшению количества моноцитов/макрофагов в неоинтиме и подавляет ее утолщение [Lumsden et al., 1997]. Нами впервые обнаружено увеличение экспрессии VLA-4 моноцитами у пациентов с рестенозом. На основании этого мы предполагаем, что взаимодействие моноцитов с компонентами сосудистой стенки, опосредованное интегринами VLA-4, могут иметь большое значение в патогенезе рестеноза у человека.

Согласно нашим наблюдениям, индивидуальные показатели максимальной экспозиции поверхностных антигенов моноцитами в нашей модели активации, сохраняются на одном и том же уровне (CV<10%), по крайней мере, в течение 2-3 мес и отражают «индивидуальную реактивность» каждого пациента. В наше исследование мы включили больных с аналогичными базальными клиническими и ангиографическими характеристиками, не имеющих известных факторов, увеличивающих вероятность развития рестеноза (нестабильная стенокардия, небольшой диаметр пораженной артерии, диабет). Поэтому мы предполагаем, что рестеноз, по крайней мере, частично, может быть связан с увеличенной моноцитарной экспрессией молекул адгезии, наблюдаемой нами в соответствующей группе больных.

В литературе имеются данные, свидетельствующие о наличии взаимосвязи между увеличенной экспозицией молекул адгезии лейкоцитами крови и рестенозом после баллонной ангиопластики [Mickelson et al., 1996; Inoue et al., 1998]. Как правило, анализ маркеров проводился в пробах, взятых перед ангиопластикой и спустя несколько минут после нее, т.е. оценивалось влияние самой процедуры на указанные показатели. Обнаруженные изменения оказались более выраженными в образцах, полученных из коронарного синуса, и практически отсутствовали в периферической крови. Наше исследование было основано на предположении, что изменения в экспозиции поверхностных антигенов лейкоцитов у больных с рестенозом может быть выявлено и при активации in vitro, т.е. независимо от процедуры ангиопластики. Для того, чтобы оценить возможность использования обнаруженных маркеров в качестве предикторов рестеноза необходимы дальнейшие исследования на группе пациентов до ангиопластики с последующим анализом данных при получении результатов контрольной ангиографии.

Обнаружение ключевой роли тканевого фактора в патогенезе ряда заболеваний, в частности коронарного атеросклероза и его тромботических осложнений [Taubman et al., 1997], послужило поводом для активного изучения регуляции активности этого белка. Моноциты в атеросклеротической бляшке контактируют с рядом факторов, включая матриксные белки, Т лимфоциты и гладкомышечные клетки, липопротеиды, цитокины и факторы роста. Как отмечалось выше, некоторые из них стимулируют синтез тканевого факторы моноцитами [Camerer et al., 1996], другие, такие как, холестерин и триглицериды, не оказывают такого воздействия [van der Fijnden et al., 1999]. Для атеросклеротической бляшки отмечено локальное накопление фибринолитических компонентов, в том числе урокиназы [Raghunath et al., 1995]. Учитывая эти данные, а также собственные наблюдения об увеличении количества моноцит-ассоциированной урокиназы при коронарном атеросклерозе, мы проанализировали участие системы урокиназа-плазмин в регуляции активности тканевого фактора в моноцитах. Оказалось, что по крайней мере в нашей модельной системе, экспрессия тканевого фактора не зависела от этих компонентов. Так, экзогенная урокиназа не стимулировала экспрессию тканевого фактора в моноцитах, выделенных из периферической крови. Кроме того, ингибирование эндогенных урокиназы и плазмина не влияло на активность тканевого фактора в липополисахарид-активированных моноцитах.

Секреция моноцитами активаторов плазминогена и их способность прикрепляться к фибрин/фибриногену определяют адгезию и миграцию этих клеток в поврежденной стенке артерии. В настоящей работе мы показали, что взаимодействие моноцитов с фибриногеном может зависеть от фибринолитической активности этих клеток.

Фибриноген как основной компонент системы гемостаза при повреждении тканей образует нерастворимый фибриновый сгусток, препятствуя таким образом кровопотере. Впоследствии фибриновый матрикс расщепляется плазмином с образованием ранних, X и Y, и конечных, D и Б, продуктов деградации фибрин(оген)а (ПДФ) [Marder, Budzynski, 1974]. Помимо участия в гемостазе, фибриноген и его производные обладают рядом других биологических свойств, в частности, в поврежденной сосудистой стенке эти молекулы регулируют адгезию клеток, обладают вазоконстрикторной, хемотаксической и митогенной активностью [Smith, Thompson, 1994; Herrick et al., 1999]. По мнению ряда исследователей [Bini et al., 1989; Valenzuela et al., 1992], развитие атеросклеротического процесса в стенке артерии сопровождается повышением образования и последующей деградацией фибрина [Kienast et al., 1998; Steins et al., 1999]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что протеолиз фибриногенового матрикса под действием плазмина может приводить к существенным изменениям в адгезионном ответе клеток - иметь стимулирующее или ингибирующее влияние в зависимости от вовлеченных молекул адгезии. Мы предполагаем, что р2-интегрины Мас-1 опосредуют прикрепление клеток к негидролизованному фибриногену и ранним продуктам его деградации, в то время как иммуноглобулин-подобные молекулы адгезии ICAM-1 эффективно связываются только с ранними ПДФ, фрагментами X и Y, но не с фибриногеном или конечными продуктами его деградации, фрагментами D и Е.

Согласно общепринятому мнению, адгезия лейкоцитов крови на фибриногене опосредована главным образом интегринами Мас-1, и во взаимодействии с Мас-1 участвует аминокислотная последовательность 190-202 у цепи фибриногена, входящая в состав D фрагмента [Altieri et al., 1988]. Однако, имеются данные, что по крайней мере еще одна последовательность, у (377-395), необходима для более эффективного взаимодействия фибриногена с Mac-1 [Ugarova et al., 1998]. Предполагается, что эти 2 модуля образуют в трехмерной структуре так называемый «карман связывания» для Мас-1, который присутствует в фибриногене и ранних продуктах его деградации. Под действием плазмина может произойти расщепление С-концевой последовательности и, как следствие, уменьшение сродства при связывании Mac-1 с гидролизованным фибриногеном. Обнаруженное нами уменьшение адгезии клеток ТНР-1 по мере деградации фибриногена может служить подтверждением этой гипотезы.

Считается, что физиологическая роль лейкоцитарных молекул адгезии 1С AM-1 состоит в образовании межклеточных контактов в ходе иммунного ответа [Maio, Del Vecchio, 1992]. Наши данные свидетельствуют о том, что ICAM-1 также может участвовать в клеточной адгезии на иммобилизованных ПДФ. Так, клетки U937 и Daudi, характеризующиеся высокой экспрессией ICAM-1 на фоне очень низкой экспрессии Мас-1, эффективно прикреплялись к фибриногену только после его обработки плазмином.

Алтиери с соавторами [Altieri et al., 1995] недавно показали, что ICAM-1 э ндотелиальных клеток связывается с фибриногеном, и что последовательность (117-133) у цепи ФГ важна для взаимодействия с ICAM-1. Значения Kd для связывания ICAM-1 с фибриногеном и различными ПДФ неизвестны. Возможно, что некоторый протеолиз фибриногена необходим для полного экспонирования ICAM-1-связывающей последовательности. Такая гипотеза подтверждается как ранними данными об индуцированных протеолизом конформационных изменениях, затрагивающих центральный сегмент у цепи фибриногена (последовательность 95-265) [Plow, Edgington 1979; Fair et al., 1981], так и более поздним сообщением о том, что последовательность 112-119, находящаяся в непосредственной близости от участка связывания 1С AM-1, «скрыта» в молекуле фибриногена, но экспонируется в X фрагменте [Ugarova etal., 1993].

По сравнению с линейными клетками моноциты крови характеризуются высокой мембранной экспозицией Мас-1 и умеренной экспозицией ICAM-1. Координированное функционирование обоих рецепторов, по-видимому, лежит в основе эффективной адгезии этих клеток как на фибриногене, так и на ранних ПДФ. Увеличенная плотность молекул Мас-1 и ICAM-1 обнаружена на моноцитах больных с острыми коронарными синдромами [Mazzone, et al, 1993; Meisel, et al, 1998]. Считается, что экспрессия ICAM-1 моноцитами существенно возрастает по мере миграции клеток из крови в очаг воспаления (Maio, Del Vecchio, 1992; Most et al., 1992). Напротив, количество интегринов Мас-1 на мембране макрофагов атеросклеротической бляшки снижается [Gray, Shankar, 1995]. культуре лимфоидных клеток и гемопоэтических предшественников [Levesque, et al, 1986; Zhou, et al, 1993]. Таким образом, наши данные могут иметь существенное значение для дальнейшего выяснения механизмов воспалительных и иммунных процессов в поврежденной стенке сосуда. выводы

1. У больных стабильной стенокардией выявлено повышенное содержание урокиназы в плазме и урокиназы, ассоциированной с моноцитами крови, по сравнению со здоровыми донорами. Отмечена тенденция к увеличению количества урокиназы, ассоциированной с моноцитами крови, у больных с коронарным рестенозом по сравнению с пациентами без рестеноза.

2. Экспрессия интегринов Мас-1 и рецепторов урокиназы моноцитами пациентов стабильной стенокардией не отличается от соответствующих показателей здоровых доноров. Экспозиция интегринов Мас-1 и VLA-4 активированными in vitro моноцитами крови увеличена у больных с коронарным рестенозом по сравнению с пациентами без рестеноза.

3. Урокиназа и плазмин не оказывают влияния на спонтанную и эндотоксин-стимулированную прокоагуляционную активность моноцитов, опосредованную тканевым фактором.

4. Урокиназа изменяет адгезию клеток на фибриногеновом матриксе, при этом действие урокиназы определяется ее протеолитическими свойствами.

5. Протеолиз фибриногена под действием плазмина ингибирует адгезию клеток, зависимую от р2-интегринов Мас-1.

6. Частичный плазминовый протеолиз фибриногена с образованием ранних продуктов деградации, фрагментов X и Y, стимулирует адгезию клеток, опосредованную иммуноглобулинподобными молекулами 1С AM-1.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Красникова Т.Л., Радюхин В.А., Парфенова Е.В. Действвие |3-блокатора на адренергические рецепторы лимфоцитов при гипертонической болезни. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1986. 102(7): 46-48.

2. Белогуров А.А., Бибилашвили Р.Ш., Горюнова Л.Е., Дельвер Е.П., Домкин В.В., Шевелев А .Я., Южаков А.А. Патент SUN 1692151 Al. 1993.

3. Савченко А.П., Самко А.Н. Применения интракоронарных стентов для лечения ишемической болезни сердца. Визуализация в клинике. 1996; N8:17-21.

4. Савченко А.П., Матчин Ю.Г., Смирнов М.А., Лякишев А.А., и соавт. -Сравнительная оценка клинических показателей больных ИБС в отдаленном периоде после баллонной ангиопластики и баллонной ангиопластики со стентированием. Вестн. рентгенол. радиол. 2000;2:4-8.

5. Самко А.Н., Савченко А.П. Некоторые современные направления чреспросветной коронарной ангиопластики. Кардиология. 1993; N 9: 6267.

6. Самко А.Н. Применение интракоронарных стентов для лечения больных ишемической болезнью сердца. Русский медицинский журнал, 1998;6 (14):923- 927.

7. Якубов Л.З., Крацик Г.А., Синицин В.В., Домогатский С.П., Рохлин О.В., Смирнов В.Н. Патент No. 1384614 Al, 1986.

8. van Aken BE, Seiffert D, Thinnes T, Loskutoff DJ. Localization of vitronectin in the normal and atherosclerotic human vessel wall. Histochem Cell Biol. 1997;107(4):313-20.

9. Al-Sumidaie AM, Jones DL, Young HL. Characterization of the under-agarose method for quantifying migration of highly purified human monocytes. J Immunol Methods. 1984; 75(1): 129-140.

10.Altieri DC. Occupancy of CDllb/CD18 (Mac-1) divalent ion binding site(s) induces leukocyte adhesion. J Immunol. 1991;147(6): 1891-1898.

11.Altieri DC, Bader R, Mannucci PM, Edgington TS. Oligospecificity of the cellular adhesion receptor Mac-1 encompasses an inducible recognition specificity for fibrinogen. J Cell Biol. 1988; 107(5): 1893-1900.

12.Altieri DC, Duperray A, Plescia J, Thornton GB, Languino LR. Structural recognition of a novel fibrinogen gamma chain sequence (117-133) by intercellular adhesion molecule-1 mediates leukocyte-endothelium interaction. J Biol Chem. 1995;270(2):696-699.

13.Altieri DC, Wiltse WL, Edgington TS. Signal transduction initiated by extracellular nucleotides regulates the high affinity ligand recognition of the adhesive receptor CDllb/CD18. J Immunol. 1990;145(2):662-670.

14.Andreasen PA, Egelund R, Petersen HH. The plasminogen activation system in tumor growth, invasion, and metastasis. Cell Mol Life Sci. 2000;57(1):25-40.

15.Assoian RK, Fleurdelys BE, Stevenson HC, Miller PJ, Madtes DK, Raines EW, Ross R, Sporn MB. Expression and secretion of type beta transforming growth factor by activated human macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84(17):6020-6024.

16.Auwerx J. The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia. 1991;47(1):22-31.

17.Behrendt N, Ronne E, Dano K. The structure and function of the urokinase receptor, a membrane protein governing plasminogen activation on the cell surface. Biol ChemHoppe Seyler. 1995;376(5):269-279.

18.Behrendt N, Stephens RW. The urokinase receptor. Fibrinol Proteol. 1998; 12:191-204.

19.Berliner S, Rogowski O, Rotstein R, Fusman R, Shapira I, Bomstein NM, Prochorov V, Roth A, Keren G, Eldor A, Zeltser D. Activated polymorphonuclear leukocytes and monocytes in the peripheral blood of patients with ischemic heart and brain conditions correspond to the presence of multiple risk factors for atherothrombosis. Cardiology. 2000;94(l):19-25.

20.Bevilacqua MP, Nelson RM, Mannori G, Cecconi O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annu Rev Med. 1994;45:361-378.

21.Biasucci LM, Liuzzo G, Buffon A, Maseri A. The variable role of inflammation in acute coronary syndromes and in restenosis. Semin Interv Cardiol. 1999;4(3): 105-110.

22.Bini A, Fenoglio JJJr, Mesa-Tejada R, Kudryk B, Kaplan KL. Identification and distribution of fibrinogen, fibrin, and fibrin(ogen) degradation products in atherosclerosis. Use of monoclonal antibodies. Arteriosclerosis. 1989;9(1): 109-121.

23.Bjorkerud S. Effects of transforming growth factor-beta 1 on human arterial smooth muscle cells in vitro. Arterioscler Thromb. 1991 ;11(4):892-902.

24.Blackwell TS, Christman JW. The role of nuclear factor-kappa В in cytokine gene regulation. Am J Respir Cell Mol Biol. 1997; 17( 1 ):3-9.

25.Blasi F. uPA, uPAR, PAI-1: key intersection of proteolytic, adhesive and chemotactic highways? Immunol Today. 1997;18(9):415-417.

26.Blasi F, Stoppelli MP, Cubellis MY. The receptor for urokinase-plasminogen activator. J Cell Biochem. 1986;32(3):179-186.

27.Bohuslav J, Horejsi V, Hansmann C, Stockl J, Weidle UH, Majdic O, Bartke I, Knapp W, Stockinger H. Urokinase plasminogen activator receptor, beta 2-integrins, and Src-kinases within a single receptor complex of human monocytes. J Exp Med. 1995;181(4):1381-1390.

28.Boring L, Gosling J, Cleary M, Charo IF. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature. 1998;394(6696):894-897.

29.Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968;97:77-89.

30.Brand K, Page S, Rogler G, Bartsch A, Brandl R, Knuechel R, Page M, Kaltschmidt C, Baeuerle PA, Neumeier D. Activated transcription factor nuclear factor-kappa В is present in the atherosclerotic lesion. J Clin Invest. 1996;97(7):1715-1722.

31.Buckley CD, Rainger GE, Bradfield PF, Nash GB, Simmons DL. Cell adhesion: more than just glue (review). Mol Membr Biol. 1998; 15(4): 167-176.

32.Calafat J, Kuijpers TW, Janssen H, Borregaard N, Verhoeven AJ, Roos D. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD1 lb/CD18. Blood. 1993;81(11):3122-3129.

33.Сатегег E, Kolsto AB, Prydz H. Cell biology of tissue factor, the principal initiator of blood coagulation. Thromb Res. 1996; 81(1): 1-41.

34.Carmeliet P, Collen D. Development and disease in proteinase-deficient mice: role of the plasminogen, matrix metalloproteinase and coagulation system. Thromb Res. 1998;91(6):255-285.

35.Carmeliet P, Moons L, Lijnen R, Janssens S, Lupu F, Collen D, Gerard RD. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 1997;96(9):3180-3191.

36.Carmeliet P, Moons L, Ploplis У, Plow E, Collen D. Impaired arterial neointima formation in mice with disruption of the plasminogen gene. J Clin Invest. 1997b;99(2):200-208.

37.Carmeliet P, Schoonjans L, Kieckens L, Ream B, Degen J, Bronson R, De Vos R, van den Oord J J, Collen D, Mulligan RC. Physiological consequences of loss of plasminogen activator gene function in mice. Nature. 1994;368(6470):419-424.

38.Celi A., Pellegrini G., Lorenzet R., De Blasi A, Ready N, Furie ВС, Furie B. et al. P-selectin induces the expression of tissue factor on monocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91(19): 8767-8771.

39.Chapman HA. Plasminogen activators, integrins, and the coordinated regulation of cell adhesion and migration. Curr Opin Cell Biol. 1997;9(5):714-724.

40.Cipollone F, Marini M, Fazia M, Pini B, Iezzi A, Reale M, Paloscia L, Materazzo G, D'Annunzio E, Conti P, Chiarelli F, Cuccurullo F, Mezzetti A. Elevated circulating levels of monocyte chemoattractant protein-1 in patients with restenosis after coronary angioplasty. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2001 ;21 (3):327-334.

41.Clark EA, Brugge JS. Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science. 1995;268(5208):233-239.

42.Collins RG, Velji R, Guevara NV, Hicks MJ, Chan L, Beaudet AL. P-Selectin or intercellular adhesion molecule (ICAM)-l deficiency substantially protects against atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. J Exp Med. 2000;191(1):189-194.

43.Conese M, Nykjaer A, Petersen CM, Cremona O, Pardi R, Andreasen PA, Gliemann J, Christensen EI, Blasi F. alpha-2 Macroglobulin receptor/Ldl receptor-related protein(Lrp)-dependent internalization of the urokinase receptor. J Cell Biol. 1995; 131(6 Pt 1): 1609-1622.

44.Cybulsky MI, Gimbrone MA. Endothelial expression of a mononuclear leukocyte adhesion molecule during atherogenesis. Science. 1991 ;251 (4995): 788-791.

45.Cybulsky MI, Iiyama K, Li H, Zhu S, Chen M, Iiyama M, Davis V, Gutierrez-Ramos JC, Connelly PW, Milstone DS. A major role for VCAM-1, but not 1С AM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 2001; 107(10): 1255-1262.

46.Dackiw АР, Nathens AB, Marshall JC, Rotstein OD. Integrin engagement induces monocyte procoagulant activity and tumor necrosis factor production via induction of tyrosine phosphorylation. J Surg Res. 1996;64(2):210-215.

47.Deng G, Curriden SA, Wang S, Rosenberg S, Loskutoff DJ. Is plasminogen activator inhibitor-1 the molecular switch that governs urokinasereceptor-mediated cell adhesion and release? J Cell Biol. 1996; 134(6): 1563-1571.

48.Edgington TS, Mackman N, Brand K, Ruf W. The structural biology of expression and function of tissue factor. Thromb Haemost. 1991;66:67-79.

49.van den Eijnden MM, van Noort JT, Hollaar L, van der Laarse A, Bertina RM. Cholesterol or triglyceride loading of human monocyte-derived macrophages by incubation with modified lipoproteins does not induce tissue factor expression. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999;19(2):384-392.

50.Estreicher A, Muhlhauser J, Carpentier JL, Orci L, Vassalli JD. The receptor for urokinase type plasminogen activator polarizes expression of the protease to the leading edge of migrating monocytes and promotes degradation of enzyme inhibitor complexes. J Cell Biol. 1990;111(2):783-792.

51.Fabbri M, Bianchi E, Fumagalli L, Pardi R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm Res. 1999;48(5):239-246.

52.Fair DS, Edgington TS, Plow EF. 1981. Immunochemical mapping of the conformation of human fibrinogen. The gamma 95-264 segment in inaccessible to antibody in native fibrinogen but progressively exposed by plasmic cleavage. J Biol Chem. 10:8018-8023.

53.Falcone DJ, McCaffrey ТА, Haimovitz-Friedman A, Vergilio JA, Nicholson AC. Macrophage and foam cell release of matrix-bound growth factors. Role of plasminogen activation. J Biol Chem. 1993;268(16):11951-11958.

54.Fan ST, Edgington TS. Coupling of the adhesive receptor CDllb/CD18 to functional enhancement of effector macrophage tissue factor response. J Clin Invest. 1991; 87(1): 50-57.

55.Fan ST, Edgington TS. Integrin regulation of leukocyte inflammatory functions. CD1 lb/CD 18 enhancement of the tumor necrosis factor-alpha responses of monocytes. J Immunol. 1993;150(7):2972-80.

56.Fan ST, Mackman N, Cui MZ, Edgington TS. Integrin regulation of an inflammatory effector gene. Direct induction of the tissue factor promoter by engagement of p 1 and a4 chains. J Immunol. 1995; 154(7): 3266-3274.

57.Farb A, Sangiorgi G, Carter AJ, Walley VM, Edwards WD, Schwartz RS, Virmani R. Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans. Circulation. 1999;99(l):44-52.

58.Feldman LJ, Aguirre L, Ziol M, Bridou JP, Nevo N, Michel JB, Steg PG. Interleukin-10 inhibits intimal hyperplasia after angioplasty or stent implantation in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 2000; 101 (8):908-916.

59.Felez J, Miles LA, Plescia J, Plow EF. Regulation of plasminogen receptor expression on human monocytes and monocytoid cell lines. J Cell Biol. 1990; 111 (4): 1673-1683.

60.Fleury V, Angles-Cano E. Characterization of the binding of plasminogen to fibrin surfaces: the role of carboxy-terminal lysines. Biochemistry. 1991; 30(30):7630-7638.

61.Foley DP, Escaned J, Strauss BH, di Mario C, Haase J, Keane D, Hermans WR, Rensing BJ, de Feyter PJ, Serruys PW. Quantitative coronary angiography (QCA) in interventional cardiology: clinical application of QCA measurements. Prog Cardiovasc Dis. 1994;36(5):363-384.

62.Furukawa Y, Matsumori A, Ohashi N, Shioi T, Ono K, Harada A, Matsushima K, Sasayama S. Anti-monocyte chemoattractant protein-1/monocyte chemotactic and activating factor antibody inhibits neointimal hyperplasia in injured rat carotid arteries. CircRes. 1999;84(3):306-314.

63.Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and acute coronary syndromes. N Engl J Med. 1992; 326(4):242-250.

64.Garcia-Moll X, Coccolo F, Cole D, Kaski JC. Serum neopterin and complex stenosis morphology in patients with unstable angina. J Am Coll Cardiol. 2000;35(4):956-962.

65.Chain D, Kreizman T, Shapira H, Shaltiel S. Plasmin cleavage of vitronectin. Identification of the site and consequent attenuation in bindingplasminogen activator inhibitor-1. FEBS Lett. 1991 ;285(2):251 -256.

66.Ganne F, Vasse M, Beaudeux JL, Peynet J, Francois A, Paysant J, Lenormand B, Collet JP, Vannier JP, Soria J, Soria C. Increased expression of u-PA and u-PAR on monocytes by LDL and Lp(a) lipoproteins—consequences for plasmin generation and monocyte adhesion. Thromb Haemost. 1999;81(4):594-600.

67.Gosling J, Slaymaker S, Gu L, Tseng S, Zlot CH, Young SG, Rollins BJ, Charo IF. MCP-1 deficiency reduces susceptibility to atherosclerosis in mice that overexpress human apolipoprotein B. J Clin Invest. 1999;103(6):773-778.

68.Gray JL, Shankar R. Down regulation of CDllb and CD18 expression in atherosclerotic lesion-derived macrophages. Am Surg. 1995;61(8):674-679; discussion 679-680.

69.Gyetko MR, Shollenberger SB, Sitrin RG. Urokinase expression in mononuclear phagocytes: cytokine-specific modulation by interferon-gamma and tumor necrosis facto r-alpha. J Leukoc Biol. 1992;51(3):256-263.

70.Gyetko MR, Todd RF 3rd, Wilkinson CC, Sitrin RG. The urokinase receptor is required for human monocyte chemotaxis in vitro. J Clin Invest. 1994;93(4): 1380-1387.

71.Gyetko MR, Wilkinson CC, Sitrin RG. Monocyte urokinase expression: modulation by interleukins. J Leukoc Biol. 1993;53(5):598-601.

72.Hall AJ, Vos HL, Bertina RM. Lipopolysaccharide induction of tissue factor in THP-1 cells involves Jun protein phosphorylation and nuclear factor kappaB nuclear translocation. JBiolChem. 1999;274(l):376-383.

73.Hamerlinck FF. Neopterin: a review. Exp Dermatol. 1999;8(3):167-176.

74.Hamilton JA, Whitty GA, Wojta J, Gallichio M, McGrath K, Ianches G. Regulation of plasminogen activator inhibitor-1 levels in human monocytes. Cell Immunol. 1993;152(1):7-17.

75.Hass R, Bartels H, Topley N, Hadam M, Kohler L, Goppelt-Strube M, Resch K. TPA-induced differentiation and adhesion of U937 cells: changes in ultrastructure, cytoskeletal organization and expression of cell surface antigens. Eur J Cell Biol. 1989;48(2):282-293.

76.Herrick S., Blanc-Brude O., Gray A., Laurent G. Fibrinogen. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999; 31(7):741-746.

77.Hmama Z, Knutson KL, Herrera-Velit P, Nandan D, Reiner NE. Monocyte adherence induced by lipopolysaccharide involves CD 14, LFA-1, and cytohesin-1. Regulation by Rho and phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem. 1999;274(2): 1050-1057.

78.Hoffmann R, Mintz GS, Dussaillant GR, Popma JJ, Pichard AD, Satler LF, Kent KM, Griffin J, Leon MB. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 1996;94(6): 1247-1254.

79.Hojo Y, Ikeda U, Katsuki T, Mizuno O, Fukazawa H, Kurosaki K, Fujikawa H, Shimada K. Interleukin 6 expression in coronary circulation after coronary angioplasty as a risk factor for restenosis. Heart. 2000;84(l):83-87.

80.Hojo Y, Ikeda U, Katsuki T, Mizuno O, Fukazawa H, Fujikawa H, Shimada K. Chemokine expression in coronary circulation after coronary angioplasty as a prognostic factor for restenosis. Atherosclerosis. 2001;156(l):165-70.

81.Hsu HY, Hajjar DP, Khan KM, Falcone DJ. Ligand binding to macrophage scavenger receptor-A induces urokinase-type plasminogen activator expression by a protein kinase-dependent signaling pathway. J Biol Chem. 1998;273(2): 1240-1246.

82.Huo Y, Hafezi-Moghadam A, Ley K. Role of vascular cell adhesion molecule-1 and fibronectin connecting segment-1 in monocyte rolling and adhesion on early atherosclerotic lesions. Circ Res. 2000;87(2):153-159.

83.Hynes RO. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell. 1992;69(1):11-25. Review.

84.Inoue T, Sakai Y, Fujito T, Hoshi K, Hayashi T, Takayanagi K, Morooka S. Clinical significance of neutrophil adhesion molecules expression after coronary angioplasty on the development of restenosis. Thromb Haemost. 1998;79(l):54-58.

85 Jander S, Sitzer M, Wendt A, Schroeter M, Buchkremer M, Siebler M, Muller W, Sandmann W, Stoll G. Expression of Tissue Factor in High-Grade Carotid Artery Stenosis : Association With Plaque Destabilization. Stroke. 2001;32(4):850-854.

86.Johnson-Tidey RR, McGregor JL, Taylor PR, Poston RN. Increase in the adhesion molecule P-selectin in endothelium overlying atherosclerotic plaques. Coexpression with intercellular adhesion molecule-1. Am J Pathol. 1994;144(5):952-961.

87.Jude B, Agraou B, McFadden EP, Susen S, Bauters C, Lepelley P, Vanhaesbroucke C, Devos P, Cosson A, Asseman P. Evidence for time-dependent activation of monocytes in the systemic circulation in unstable angina but not in acute myocardial infarction or in stable angina. Circulation. 1994;90(4): 1662-1668.

88.Kassirer M, Zeltser D, Prochorov V, Schoenman G, Frimerman A, Keren G, Shapira I, Miller H, Roth A, Arber N, Eldor A, Berliner S. Increased expression of the CD lib/CD 18 antigen on the surface of peripheral white blood cells in patients with ischemic heart disease: further evidence for smoldering inflammation in patients with atherosclerosis. Am Heart J. 1999; 138(3 Pt l):555-559.

89.Kienast J, Padro T, Steins M, Li CX, Schmid KW, Hammel D, Scheld HH, van de Loo JC. Relation of urokinase-type plasminogen activator expression to presence and severity of atherosclerotic lesions in human coronary arteries. Thromb Haemost. 1998;79(3):579-586.

90.Kirchheimer JC, Nong YH, Remold HG. IFN-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and urokinase regulate the expression of urokinase receptors on human monocytes. J Immunol. 1988; 141(12):4229-4234.

91.Kirchheimer JC, Remold HG. Endogenous receptor-bound urokinase mediates tissue invasion of human monocytes. J Immunol. 1989;143(8):2634-2639.

92.Kirchhofer D, Riederer MA, Baumgartner HR. Specific accumulation of circulating monocytes and polymorphonuclear leukocytes on platelet thrombi in a vascular injury model. Blood. 1997;89(4):1270-1278.

93.Kishikawa H, Shimokama T, Watanabe T. Localization of T lymphocytes and macrophages expressing IL-1, IL-2 receptor, IL-6 and in human aortic intima. Role of cell-mediated immunity in human atherogenesis. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 1993;423(6):433-442.

94.Kling D, Fingerle J, Harlan JM, Lobb RR, Lang F. Mononuclear leukocytes invade rabbit arterial intima during thickening formation via CD18-and VLA-4-dependent mechanisms and stimulate smooth muscle migration. Circ Res. 1995;77(6):1121-1128.

95.Koenig W. Atherosclerosis involves more than just lipids: focus on inflammation. Eur Heart J Supplements. 1999; l(Suppl T): T19-T26.

96.Komatsu R, Ueda M, Naruko T, Kojima A, Becker AE. Neointimal tissue response at sites of coronary stenting in humans: macroscopic, histological, and immunohistochemical analyses. Circulation. 1998;98(3):224-233.

97.Kornowski R, Hong MK, Tio FO, Bramwell 0, Wu H, Leon MB. In-stent restenosis: contributions of inflammatory responses and arterial injury to neointimal hyperplasia. J Am Coll Cardiol. 1998;31(l):224-230.

98.Kuijper PH, Gallardo Torres HI, Lammers JW, Sixma JJ, Koenderman L, Zwaginga J J. Platelet and fibrin deposition at the damaged vessel wall: cooperative substrates for neutrophil adhesion under flow conditions. Blood. 1997;89(1): 166-175.

99.Lee WH, Lee Y, Kim JR, Chu JA, Lee SY, Jung JO, Kim JS, Kim S, Seo JD, Rhee SS, Park JE. Activation of monocytes, T-lymphocytes and plasma inflammatory markers in angina patients. Exp Mol Med. 1999;31(3): 159-164.

100. Levesque JP, Hatzfeld A, Hatzfeld J. Fibrinogen mitogenic effect on hemopoietic cell lines: control via receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(17):6494-6498.

101. Li H, Cybulsky MI, Gimbrone MAJr, Libby P. Inducible expression of vascular cell adhesion molecule-1 by vascular smooth muscle cells in vitro and within rabbit atheroma. Am J Pathol. 1993;143(6):1551-1559.

102. Libby P, Li H. Vascular cell adhesion molecule and smooth muscle cell activation during atherogenesis. J Clin Invest. 1993;92(2): 538-9.

103. Libby P. Changing concepts of atherogenesis. J Intern Med. 2000;247(3):349-58.

104. Libby P, Ganz P. Restenosis revisited—new targets, new therapies. N Engl J Med. 1997;337(6):418-419.

105. Libby P, Geng YJ, Aikawa M, Schoenbeck U, Mach F, Clinton SK, Sukhova GK, Lee RT. Macrophages and atherosclerotic plaque stability. Сип-Орт Lipidol. 1996;7(5):330-335.

106. Libby P, Sukhova G, Lee RT, Galis ZS. Cytokines regulate vascular functions related to stability of the atherosclerotic plaque. J Cardiovasc Pharmacol. 1995;25 Suppl 2:S9-12.

107. Lin TH, Rosales С, Mondal К, Bolen JB, Haskill S, Juliano RL. Integrin-mediated tyrosine phosphorylation and cytokine message induction in monocytic cells. A possible signaling role for the Syk tyrosine kinase. J Biol Chem. 1995;270(27): 16189-16197.

108. Liu MY, Wu MC. Induction of human monocyte cell line U937 differentiation and CSF-1 production by phorbol ester. Exp Hematol. 1992;20(8):974-979.

109. van der Logt CP, Dirven RJ, Reitsma PH, Bertina RM. Expression of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor in monocytes in response to bacterial lipopolysaccharide and phorbolester. Blood Coagul Fibrinolysis. 1994;5(2):211-220.

110. Loskutoff D.J. PAI-1 inhibits neointimal formation after arterial injury in mice: a new target for controlling restenosis? Circulation. 1997;96(9):2772-2774.

111. Lundahl J, Hallden G, Skold CM. Human blood monocytes, but not alveolar macrophages, reveal increased CDllb/CD18 expression and adhesion properties upon receptor-dependent activation. Eur Respir J. 1996;9(6): 1188-1194.

112. Lundgren CH, Sawa H, Sobel BE, Fujii S. Modulation of expression of monocyte/macrophage plasminogen activator activity and its implications for attenuation of vasculopathy. Circulation. 1994;90(4):1927-1934.

113. Lumsden AB, Chen C, Hughes JD, Kelly AB, Hanson SR, Harker LA. Anti-VLA-4 antibody reduces intimal hyperplasia in the endarterectomized carotid artery in nonhuman primates. J Vase Surg. 1997;26(l):87-93.

114. Luscinskas FW, Kansas GS, Ding H, Pizcueta P, Schleiffenbaum BE, Tedder TF, Gimbrone MA. Monocyte rolling, arrest and spreading on IL-4-activated vascular endothelium under flow is mediated via sequential action of

L-selectin, beta 1-integrins, and beta 2-integrins. J Cell Biol. 1994; 125(6): 1417-1427.

115. Mach F, Schonbeck U, Bonnefoy JY, Pober JS, Libby P. Activation of monocyte/macrophage functions related to acute atheroma complication by ligation of CD40. Circulation. 1997; 96(2): 396-399.

116. Maio M, Del Vecchio L. Expression and functional role of CD54/Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) on human blood cells. Leuk Lymphoma. 1992;8(l-2):23-33.

117. Manchanda N, Schwartz BS. Lipopolysaccharide-induced modulation of human monocyte urokinase production and activity. J Immunol. 1990;145(12):4174-4180.

118. Marchant A, Duchow J, Delville JP, Goldman M. Lipopolysaccharide induces up-regulation of CD 14 molecule on monocytes in human whole blood. Eur J Immunol. 1992;22(6):1663-1665.

119. Marder V, Budzynski A. The structure of the fibrinogen degradation products. Progress in Hemostasis and Thrombosis. In: Spaet T, editor. Grune and Stratton, New York. 1974. P141.

120. Matsushima K, Taguchi M, Kovacs EJ, Young HA, Oppenheim JJ. Intracellular localization of human monocyte associated interleukin 1 (IL 1) activity and release of biologically active IL 1 from monocytes by trypsin and plasmin. J Immunol. 1986;136(8):2883-2891.

121. May AE, Kanse SM, Lund LR, Gisler RH, Imhof В A, Preissner KT. Urokinase receptor (CD87) regulates leukocyte recruitment via beta 2 integrins in vivo. J Exp Med. 1998;188(6):1029-1037.

122. May AE, Neumann FJ, Schomig A, Preissner KT. VLA-4 (alpha(4)beta(l)) engagement defines a novel activation pathway for beta(2) integrin-dependent leukocyte adhesion involving the urokinase receptor. Blood. 2000 Jul 15;96(2):506-13.

123. Mazzone A, De Servi S, Mazzucchelli I, Fossati G, Gritti D, Canale C, Cusa C, Ricevuti G. Increased expression of CDllb/CD18 on phagocytes in ischaemic disease: a bridge between inflammation and coagulation. Eur J Clin Invest. 1997;27(8):648-652.

124. Mazzone A, de Servi S, Ricevuti G, Mazzucchelli I, Fossati G, Pasotti D, Bramucci E, Angoli L, Marsico F, Specchia G, et al. Increased expression of neutrophil and monocyte adhesion molecules in unstable coronary artery disease. Circulation. 1993;88(2):358-363.

125. Mazzone A, De Servi S, Vezzoli M, Fossati G, Mazzucchelli I, Gritti D, Ottini E, Mussini A, Specchia G. Plasma levels of interleukin 2, 6, 10 and phenotypic characterization of circulating T lymphocytes in ischemic heart disease. Atherosclerosis. 1999;145(2):369-374.

126. Meerschaert J, Furie MB. The adhesion molecules used by monocytes for migration across endothelium include CD1 la/CD 18, CD1 lb/CD 18, and VLA-4 on monocytes and ICAM-1, VCAM-1, and otherligands on endothelium. J Immunol. 1995;154(8):4099-4112.

127. Meisel SR, Shapiro H, Radnay J, Neuman Y, Khaskia AR, Gruener N, Pauzner H, David D. Increased expression of neutrophil and monocyte adhesion molecules LFA-1 and Mac-1 and their ligand ICAM-1 and VLA-4 throughout the acute phase of myocardial infarction: possible implications for leukocyte aggregation and microvascular plugging. J Am Coll Cardiol. 1998;31(1):120-125.

128. Mickelson JK, Lakkis NM, Villarreal-Levy G, Hughes BJ, Smith CW. Leukocyte activation with platelet adhesion after coronary angioplasty: a mechanism for recurrent disease? J Am Coll Cardiol. 1996;28(2):345-353.

129. Min HY, Semnani R, Mizukami IF, Watt K, Todd RF 3rd, Liu DY. cDNA for Mo3, a monocyte activation antigen, encodes the human receptor for urokinase plasminogen activator. J Immunol. 1992;148(11):3636-3642.

130. Molineaux SM, Casano FJ, Rolando AM, Peterson EP, Limjuco G, Chin J, Griffin PR, Calaycay JR, Ding GJ, Yamin TT, et Interleukin 1 beta (IL-1 beta) processing in murine macrophages requires a structurally conserved homologue of human IL-1 beta converting enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 ;90(5):1809-1813.

131. Moreno PR, Bernardi YH, Lopez-Cuellar J, Murcia AM, Palacios IF, Gold HK, Mehran R, Sharma SK, Nemerson Y, Fuster Y, Fallon JT. Macrophages, smooth muscle cells, and tissue factor in unstable angina. Circulation. 1996; 94(12): 3090-3097.

132. Moreno PR, Bernardi VH, Lopez-Cuellar J, Newell JB, McMellon C, Gold HK, Palacios IF, Fuster V, Fallon JT. Macrophage infiltration predicts restenosis after coronary intervention in patients with unstable angina. Circulation. 1996b;94( 12) :3 098-3102.

133. Moreno PR, Falk E, Palacios IF, Newell JB, Fuster V, Fallon JT. Macrophage infiltration in acute coronary syndromes. Implications for plaque rapture. Circulation. 1994; 90(2): 775-778.

134. Mori M, Iwasaki K, Sato R, Komine Y, Itabe H, Imanaka T, Takano T. Characterization of vitronectins in atherosclerotic lesions. J Atheroscler Thromb. 1996;3(1):25-31.

135. Mullberg J, Durie FH, Otten-Evans C, Alderson MR, Rose-John S, Cosman D, Black RA, Mohler KM. A metalloprotease inhibitor blocks shedding of the IL-6 receptor and the p60 TNF receptor. J Immunol. 1995; 155(11):5198-5205.

136. Muller WA, Weigl SA, Deng X, Phillips DM. PECAM-1 is required for transendothelial migration of leukocytes. J Exp Med. 1993;178(2):449-460.

137. Munro JM, van der Walt JD, Munro CS, Chalmers JA, Cox EL. An immunohistochemical analysis of human aortic fatty streaks. Hum Pathol. 1987;18(4):375-380.

138. Murakami T, Yamada N. Modification of macrophage function and effects on atherosclerosis. Curr Opin Lipidol. 1996;7(5):320-323.

139. Murphy G, Gavrilovic J. Proteolysis and cell migration: creating a path? Curr Opin Cell Biol. 1999; 11 (5):614-621.

140. Murphy G, Gavrilovic J. Proteolysis Bar-Shavit R, Kahn A, Fenton JW, Wilner GD. Chemotactic response of monocytes to thrombin. J Cell Biol. 1983;96(l):282-285.

141. Nakashima Y, Raines EW, Plump AS, Breslow JL, Ross R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in theApoE-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998;18(5):842-851.

142. Nakstad B, Haugen T, Skjonsberg OH, Lyberg T. Expression of leukocyte integrins and tissue factor in mononuclear phagocytes. Eur Respir J. 1998;12(3):601-606.

143. Naldini L, Vigna E, Bardelli A, Follenzi A, Galimi F, Comoglio PM. Biological activation of pro-HGF (hepatocyte growth factor) by urokinase is controlled by a stoichiometric reaction. J Biol Chem. 1995;270(2):603-611.

144. Napoleone E, Di Santo A, Lorenzet R. Monocytes upregulate endothelial cell expression of tissue factor: a role for cell-cell contact and cross-talk. Blood. 1997; 89(2): 541-549.

145. Nerem RM, Levesque MJ. Fluid dynamics as a factor in the localization of atherogenesis. AnnN Y Acad Sci. 1983;416:709-719.

146. Nielken NA, Coughlin SR, Gordon D, Wilcox JN. Monocyte chemoattractant protein-1 in human atheromatous plaques. J Clin Invest. 1991 ;88(4):1121-1127.

147. Nishiyama K, Ogawa H, Yasue H, Soejima H, Misumi K, Takazoe K, Yoshimura M, Kugiyama K, Tsuji I, Kumeda K. Simultaneous elevation of the levels of circulating monocyte chemoattractant protein-1 and tissue factor in acute coronary syndromes. Jpn Circ J. 1998;62(9):710-712.

148. Norris DA, Clark RA, Swigart LM, Huff JC, Weston WL, Howell SE. Fibronectin fragment(s) are chemotactic for human peripheral blood monocytes. J Immunol. 1982;129(4): 1612-1618.

149. Nykjaer A, Conese M, Christensen EI, Olson D, Cremona O, Gliemann J, Blasi F. Recycling of the urokinase receptor upon internalization of the uPA:serpin complexes. EMBO J. 1997;16(10):2610-2620.

150. O'Brien KD, Allen MD, McDonald TO, Chait A, Harlan JM, Fishbein D, McCarty J, Ferguson M, Hudkins K, Benjamin CD, et al. Vascular cell adhesion molecule-1 is expressed in human coronary atherosclerotic plaques. Implications for the mode of progression of advanced coronary atherosclerosis. J Clin Invest. 1993;92(2):945-951.

151. Odekon LE, Blasi F, Rifkin DB. Requirement for receptor-bound urokinase in plasmin-dependent cellular conversion of latent TGF-beta to TGF-beta. J Cell Physiol. 1994;158(3):398-407.

152. Ogawa H. Pathophysiology of acute coronary syndromes. J Cardiol. 1999;33 Suppl 1:9-16.

153. Oka H, Kugiyama K, Doi H, Matsumura T, Shibata H, Miles LA, Sugiyama S, Yasue H. Lysophosphatidylcholine induces urokinase-type plasminogen activator and its receptor in human macrophages partly through redox-sensitive pathway. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000;20(l):244-250.

154. Orford JL, Selwyn AP, Ganz P, Popma JJ, Rogers C. The comparative pathobiology of atherosclerosis and restenosis. Am J Cardiol. 2000;86(4B):6H-11H.

155. Padro T, Steins M, Li CX, Mesters RM, Hammel D, Scheld HH, Kienast J. Comparative analysis of plasminogen activator inhibitor-1 expression in different types of atherosclerotic lesions in coronary arteries from human heart explants. Cardiovasc Res. 1997;36(l):28-36.

156. Pakianathan DR. Extracellular matrix proteins and leukocyte function. J Leukoc Biol. 1995;57(5):699-702.

157. Pardi R, Inverardi L, Bender JR. Regulatory mechanisms in leukocyte adhesion: flexible receptors for sophisticated travelers. Immunol Today. 1992;13(6):224-230.

158. Patel SS, Thiagarajan R, Willerson JT, Yeh ET. Inhibition of alpha4 integrin and ICAM-1 markedly attenuate macrophage homing to atherosclerotic plaques in ApoE-deficient mice. Circulation. 1998;97(1):75-81.

159. Paysant J, Vasse M, Soria J, Lenormand B, Pourtau J, Vannier JP, Soria C. Regulation of the uPAR/uPA system expressed on monocytes by the deactivating cytokines, IL-4, IL-10 and IL-13: consequences on cell adhesion to vitronectin and fibrinogen. Br J Haematol. 1998; 100( 1 ):45-51.

160. Perez RL, Roman J. Fibrin enhances the expression of IL-1 beta by human peripheral blood mononuclear cells. Implications in pulmonary inflammation. J Immunol. 1995 Feb;154(4):1879-1887.

161. Plow E., Edgington T. Localization and characterization of the cleavage-associated neoantigen locus in the E domain of fibrinogen. J Biol Chem. 1979; 254:672-678.

162. Plow EF, Herren T, Redlitz A, Miles LA, Hoover-Plow JL. The cell biology of the plasminogen system. FASEB J. 1995;9(10):939-945.

163. Pollanen J, Hedman K, Nielsen LS, Dano K, Vaheri A. Ultrastructural localization of plasma membrane-associated urokinase-type plasminogen activator at focal contacts. J Cell Biol. 1988;106(l):87-95.

164. Polterauer P, Nanobachvili J, Fuegl A, Huk I. Vascular surgery between the millenniums. Vasa. 2000;29(1): 17-27.

165. Postlethwaite AE, Kang AH. Collagen-and collagen peptide-induced chemotaxis of human blood monocytes. J Exp Med. 1976; 143(6): 1299-1307.

166. Poston RN, Haskard DO, Coucher JR, Gall NP, Johnson-Tidey RR. Expression of intercellular adhesion molecule-1 in atherosclerotic plaques. Am J Pathol. 1992;140(3):665-673.

167. Poston RN, Johnson-Tidey RR. Localized adhesion of monocytes to human atherosclerotic plaques demonstrated in vitro: implications for atherogenesis. Am J Pathol. 1996;149(l):73-80.

168. Preissner KT, Seiffert D. Role of vitronectin and its receptors in haemostasis and vascular remodeling. Thromb Res. 1998;89(1): 1-21.

169. Pucillo CE, Colombatti A, Vitale M, Salzano S, Rossi G, Formisano S. Interactions of promonocytic U937 cells with proteins of the extracellular matrix. Immunology. 1993;80(2):248-252.

170. Quinn MT, Parthasarathy S, Fong LG, Steinberg D. Oxidatively modified low density lipoproteins: a potential role in recruitment and retention ofmonocyte/macrophages during atherogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1987;84(9):2995-2998.

171. Raghunath PN, Tomaszewski JE, Brady ST, Caron RJ, Okada SS, Barnathan ES. Plasminogen activator system in human coronary atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1995;15(9): 1432-1443.

172. Rao NK, Shi GP, Chapman HA. Urokinase receptor is a multifunctional protein: influence of receptor occupancy on macrophage gene expression. J Clin Invest. 1995;96(l):465-474.

173. Rickles FR, Hair GA, Zeff RA, Lee E, Bona RD. Tissue factor expression in human leukocytes and tumor cells. Thromb Haemost. 1995;74(l):391-395.

174. Rollins В J. Monocyte chemoattractant protein 1: a potential regulator of monocyte recruitment in inflammatory disease. Mol Med Today. 1996;2(5):198-204.

175. Rogers C, Edelman ER, Simon DI. A mAb to the beta2-leukocyte integrin Mac-1 (CDllb/CD18) reduces intimal thickening after angioplasty or stent implantation in rabbits. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95(17):10134-10139.

176. Rogers C, Welt FG, Karnovsky MJ, Edelman ER. Monocyte recruitment and neointimal hyperplasia in rabbits. Coupled inhibitory effects of heparin. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1996; 16(10): 1312-1318.

177. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 1993;362(6423):801-809.

178. Ross R. Atherosclerosis—an inflammatory disease. N Engl J Med. 1999;340(2):115-126.

179. Ryden L, Hamsten A. The way ahead in the management of unstable coronary artery disease. Am J Cardiol. 1997;80(5A):64E-67E.

180. Saksela O, Hovi T, Vaheri A. Urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor secreted by cultured human monocyte-macrophages. J Cell Physiol. 1985;122(1):125-132.

181. Sato R, Mori M, Imanaka T, Takano T. Accumulation of vitronectin in atherosclerotic lesions where lipids deposited. J Atheroscler Thromb. 1994; 1 Suppl l:S50-4.

182. Schreck R, Albermann K, Baeuerle PA. Nuclear factor kappa B: an oxidative stress-responsive transcription factor of eukaryotic cells (a review). Free Radic Res Commun. 1992; 17(4):221-37.

183. Schwartz RS, Topol EJ, Serruys PW, Sangiorgi G, Holmes DR Jr. Artery size, neointima, and remodeling: time for some standards. J Am Coll Cardiol. 1998;32(7):2087-2094.

184. Seiffert D, Loskutoff DJ. Evidence that type 1 plasminogen activator inhibitor binds to the somatomedin В domain of vitronectin. J Biol Chem. 1991;266(5):2824-2830.

185. Serrano CV Jr, Ramires JA, Venturinelli M, Arie S, D'Amico E, Zweier JL, Pileggi F, da Luz PL. Coronary angioplasty results in leukocyte and platelet activation with adhesion molecule expression. Evidence of inflammatory responses in coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 1997;29(6): 1276-1283.

186. de Servi S, Mazzone A, Ricevuti G, Mazzucchelli I, Fossati G, Angoli L, Valentini P, Boschetti E, Specchia G. Expression of neutrophil and monocyte CD11B/CD18 adhesion molecules at different sites of the coronary tree in unstable angina pectoris. Am J Cardiol. 1996;78(5):564-568.

187. Siebenlist U, Franzoso G, Brown K. Structure, regulation and function of NF-kappaB. AnnuRev Cell Biol. 1994;10:405-55.

188. Simon SI, Burns AR, Taylor AD, Gopalan PK, Lynam EB, Sklar LA, Smith CW. L-selectin (CD62L) cross-linking signals neutrophil adhesive functions via the Mac-1 (CDllb/CD18) beta 2-integrin. J Immunol. 1995; 155(3): 1502-1514.

189. Simon DI, Chen Z, Xu H, Li CQ, Dong Jf, Mclntire LV, Ballantyne CM, Zhang L, Furman MI, Berndt MC, Lopez JA. Platelet glycoprotein ibalpha is a counterreceptor for the leukocyte integrin Mac-1 (CDllb/CD18). J Exp Med. 2000; 192(2): 193-204.

190. Simon DI, Dhen Z, Seifert P, Edelman ER, Ballantyne CM, Rogers C. Decreased neointimal formation in Mac-1(-/-) mice reveals a role for inflammation in vascular repair after angioplasty. J Clin Invest. 2000b; 105(3):293-300.

191. Simon DI, Rao NK, Xu H, Wei Y, Majdic O, Ronne E, Kobzik L, Chapman HA. Mac-1 (CD1 lb/CD 18) and the urokinase receptor (CD87) form a functional unit on monocytic cells. Blood. 1996;88(8):3185-3194.

192. Sitrin RG, Pan PM, Harper HA, Blackwood RA, Todd RF 3rd. Urokinase receptor (CD87) aggregation triggers phosphoinositide hydrolysis and intracellular calcium mobilization in mononuclear phagocytes. J Immunol. 1999; 163(11):6193-6200.

193. Sitrin RG, Pan PM, Harper HA, Todd RF 3rd, Harsh DM, Blackwood RA. Clustering of urokinase receptors (uPAR; CD87) induces proinflammatory signaling in human polymorphonuclear neutrophils. J Immunol. 2000; 165(6):3341-3349.

194. Sitrin RG, Pan PM, Srikanth S, Todd RF 3rd. Fibrinogen activates NF-kappa В tran scription factors in mononuclear phagocytes. J Immunol. 1998; 161(3): 1462-1470.

195. Sitrin RG, Shollenberger SB, Strieter RM, Gyetko MR. Endogenously produced urokinase amplifies tumor necrosis factor-alpha secretion by THP-1 mononuclear phagocytes. JLeukocBiol. 1996 Feb;59(2):302-311.

196. Sitrin RG, Todd RF 3rd, Albrecht E, Gyetko MR. The urokinase receptor (CD87) facilitates CD1 lb/CD 18-mediated adhesion of human monocytes. J Clin Invest. 1996b;97(8): 1942-1951.

197. Sitrin RG, Todd RF 3rd, Mizukami IF, Gross TJ, Shollenberger SB, Gyetko MR. Cytokine-speciflc regulation of urokinase receptor (CD87) expression by U937 mononuclear phagocytes. Blood. 1994;84(4):1268-1275.

198. Smith E., Thompson W. Fibrin as a factor in atherogenesis. Thromb Res. 1994;73:1-19.

199. Steins MB, Padro T, Li CX, Mesters RM, Ostermann H, Hammel D, Scheld HH, Berdel WE, Kienast J. Overexpression of tissue-type plasminogen activator in atherosclerotic human coronary arteries. Atherosclerosis. 1999;145(1):173-180.

200. Strauss BH, Lau UK, Bowman KA, Sparkes J, Chisholm RJ, Garvey MB, Fenkell LL, Natarajan MK, Singh I, Teitel JM. Plasma urokinase antigen and plasminogen activator inhibitor-1 antigen levels predict angiographic coronary restenosis. Circulation. 1999; 100(15): 1616-1622.

201. Syrovets T, Tippler B, Rieks M, Simmet T. Plasmin is a potent and specific chemoattractant for human peripheral monocytes acting via a cyclic guanosine monophosphate-dependent pathway. Blood. 1997;89(12):4574-4583.

202. Takeya M, Yoshimura T, Leonard EJ, Takahashi K. Detection of monocyte chemoattractant protein-1 in human atherosclerotic lesions by an anti-monocyte chemoattractant protein-1 monoclonal antibody. Hum Pathol. 1993;24(5):534-539.

203. Taubman MB, Fallon JT, Schecter AD, Giesen P, Mendlowitz M, Fyfe BS, Marmur JD, Nemerson Y. Tissue factor in the pathogenesis of atherosclerosis. Thromb Haemost. 1997;78(l):200-204.

204. Tipping PG, Davenport P, Gallicchio M, Filonzi EL, Apostolopoulos J, Wojta J. Atheromatous plaque macrophages produce plasminogen activator inhibitor type-1 and stimulate its production by endothelial cells and vascular smooth muscle cells. Am J Pathol. 1993;143(3):875-885.

205. Trezzini C, Schuepp B, Maly FE, Jungi TW. Evidence that exposure to fibrinogen or to antibodies directed against Mac-1 (CD1 lb/CD 18; CR3) modulates human monocyte effector functions. Br J Haematol. 1991; 77( 1): 16-24.

206. Tsukada T, Rosenfeld ME, Gown AM, Ross R. Immunocytochemical analysis of the cellular composition of atherosclerotic lesions in the human aorta. In Pathobiology of the human atherosclerotic plaque, Glasgow s., Newman W.P. Schaffer S.A.(eds). New York, Springer-Verlag, 1990. Pp 349357.

207. Ugarova TP, Budzynski AZ, Shattil SJ, Ruggeri ZM, Ginsberg MH, Plow EF. 1993. Conformational changes in fibrinogen elicited by its interaction with platelet membrane glycoprotein GPIIb-IIIa. J Biol Chem. 268(28):21080-21087.

208. Ugarova TP, Solovjov DA, Zhang L, Loukinov DI, Yee VC, Medved LV, Plow EF. 1998. Identification of a novel recognition sequence for integrin alphaM beta2 within the gamma-chain of fibrinogen. J Biol Chem. 273(35):22519-22527.

209. Vaddi K, Newton RC. Regulation of monocyte integrin expression by beta-family chemokines. J Immunol. 1994;153(10):4721-4732.

210. Vaddi K, Nicolini FA, Mehta P, Mehta JL. Increased secretion of tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma by mononuclear leukocytes in patients with ischemic heart disease. Relevance in superoxide anion generation. Circulation. 1994;90(2):694-699.

211. Valente AJ, Rozek MM, Sprague EA, Schwartz CJ. Mechanisms in intimal monocyte-macrophage recruitment. A special role for monocyte chemotactic protein-1. Circulation. 1992;86(6 Suppl):III20-25.

212. Valenzuela R, Shainoff JR, DiBello PM, Urbanic DA, Anderson JM, Matsueda GR, Kudryk BJ. Immunoelectrophoretic and immunohistochemical characterizations of fibrinogen derivatives in atherosclerotic aortic intimas and vascular prosthesis pseudo-intimas. Am J Pathol. 1992; 141(4):861-880.

213. van der Wal AC, Das PK, Tigges AJ, Becker AE. Adhesion molecules on the endothelium and mononuclear cells in human atherosclerotic lesions. Am J Pathol. 1992; 141(6): 1427-1433.

214. Waltz DA, Chapman HA. Reversible cellular adhesion to vitronectin linked to urokinase receptor occupancy. J Biol Chem. 1994;269(20): 14746-14750.

215. Waltz DA, Fujita RM, Yang X, Natkin L, Zhuo S, Gerard CJ, Rosenberg S, Chapman HA. Nonproteolytic role for the urokinase receptor in cellular migration in vivo. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000;22(3):316-322.

216. Waltz DA, Natkin LR, Fujita RM, Wei Y, Chapman HA. Plasmin and plasminogen activator inhibitor type 1 promote cellular motility by regulating the interaction between the urokinase receptor and vitronectin. J Clin Invest. 1997;100(l):58-67.

217. Weber C, Alon R, Moser B, Springer ТА. Sequential regulation of alpha 4 beta 1 and alpha 5 beta 1 integrin avidity by CC chemokines in monocytes: implications for transendothelial chemotaxis. J Cell Biol. 1996; 134(4): 10631073.

218. Weber KS, Klickstein LB, Weber C. Specific activation of leukocyte beta2 integrins lymphocyte function-associated antigen-1 and Mac-1 by chemokines mediated by distinct pathways via the alpha subunit cytoplasmic domains. Mol Biol Cell. 1999;10(4):861-873.

219. Weber С, Springer ТА. Interaction of very late antigen-4 with VCAM-1 supports transendothelial chemotaxis of monocytes by facilitating lateral migration. J Immunol. 1998;161(12):6825-6834.

220. Wei Y, Waltz DA, Rao N, Drummond RJ, Rosenberg S, Chapman HA. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin. J Biol Chem. 1994;269(51):32380-3238.

221. Weide I, Tippler B, Syrovets T, Simmet T. Plasmin is a specific stimulus of the 5-lipoxygenase pathway of human peripheral monocytes. Thromb Haemost. 1996;76(4):561-568.

222. Wong WSF, Simon DI, Rosoff PM, Rao NK, Chapman HA. 1996. Mechanisms of pertussis toxin-induced myelomonocytic cell adhesion: role of Mac-1 (CDllb/CD18) and urokinase receptor (CD87). Immunology. 88(1):90-97.

223. Xue W, Kindzelskii AL, Todd RF 3rd, Petty HR. Physical association of complement receptor type 3 and urokinase-type plasminogen activator receptor in neutrophil membranes. J Immunol. 1994;152(9):4630-4640.

224. Yednock ТА, Cannon C, Vandevert C, Goldbach EG, Shaw G, Ellis DK, Liaw C, Fritz LC, Tanner LI. Alpha 4 beta 1 integrin-dependent cell adhesion is regulated by a low affinity receptor pool that is conformationally responsive to ligand. J Biol Chem. 1995;270:28740-28750.

225. Yoshida E, Tsuchiya K, Sugiki M, Sumi H, Mihara H, Maruyama M. Modulation of the receptor for urokinase-type plasminogen activator in macrophage-like U937 cells by inflammatory mediators. Inflammation. 1996;20(3):319-326.

226. Yurochko AD, Liu DY, Eierman D, Haskill S. Integrins as a primary signal transduction molecule regulating monocyte immediate-early gene induction. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89(19):9034-9048.

227. Zhou YQ, Levesque JP, Hatzfeld A, Cardoso AA, Li ML, Sansilvestri P, Hatzfeld J. Fibrinogen potentiates the effect of interleukin-3 on early human hematopoietic progenitors. Blood. 1993; 82(3):800-806.

Благодарности

В заключение выражаю глубокую благодарность своим руководителям: Татьяне Леонидовне Красниковой за научное и практическое руководство, а также за очень доброе и внимательное отношение ко мне лично, Парфеновой Елене Викторовне за помощь в выполнении исследований и за советы при оформлении диссертации, Всеволоду Арсеньевичу Ткачуку и Виктории Викторовне Степановой, без участия которых эта работа была бы невозможна. Благодарю всех сотрудников лабораторий молекулярной эндокринологии, клеточной подвижности и клеточной адгезии ИЭК РК НГЖ за помощь, дружеское отношение и поддержку.