Причины и механизмы поддержания высокого уровня транскрипционного фактора NF-kB в линиях аденокарцином мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Смирнов, Анатолий Сергеевич

• Смирнов, Анатолий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смирнов, Анатолий Сергеевич

Используемые сокращения.

Ключевые слова.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Структура транскрипционного фактора ОТ-кВ и его субдъединиц.

1.1.1 Полипептиды р50 и р52.

1.1.2 Полипептиды р65 (11е1А), р68 (ИеШ) и с-ге1.

1.2 Последовательности ДНК, связывающие 1*е1-белки комплексы.

1.3 Ингибиторы ОТ-кВ: семейство 1-кВ белков.

1.4 Механизмы деградации 1-кВ.

1.5 ОТ-кВ и коактиваторы транскрипции.

1.6 Роль №-кВ в блокировке и активации апоптоза.

1.7 ОТ-кВ и окислительный стресс.

1.8 ОТ-кВ и рак.

1.9 Клетки с высоким конституитивным уровнем ядерного ОТ-кВ.

1.10 Опухолевый супрессор р53.

1.10.1 Регуляция р53.

1.10.2 р53 и арест клеточного цикла.

1.10.3 р53 и индукция апоптоза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Причины и механизмы поддержания высокого уровня транскрипционного фактора NF-kB в линиях аденокарцином мыши»

Целью настоящей работы является изучение причин и механизмов поддержания высокого конституитивного уровня транскрипционного фактора №-кВ в ядрах клеток аденокарцином мыши КСМЛ-0 и КСМЛ-100. Также в данной работе затрагиваются вопросы взаимосвязи КБ-кВ и опухолевого супрессора р53. №-кВ является одним из наиболее изученных транскрипционных регуляторов. Его активность может быть индуцирована широким спектром сигналов, от бактериальных и вирусных патогенов до цитокинов, цитотоксических агентов и ультрофиолетового излучения. Транскрипционные мишени №-кВ также весьма разнообразны и вовлечены в регуляцию множества биологических процессов, таких как имунный ответ, трансформация, пролиферация или программируемая клеточная смерть (апоптоз). В связи с этим особенный интерес вызывают ткани и клеточные линии, имеющие повышеный базальный уровень ядерного №-кВ. Несмотря на то, что регулялция активации №-кВ в ответ на индуцирующий сигнал интенсивно исследуется в последние годы и ее общие закономерности достаточно изучены, механизм поддержания высокого конституитивного уровня яденого №-кВ в тех тканях и типах клеток, в которых он высок еще слабо изучено. Именно этим двум вопросам и посвящена насиоящая работа.

1. Обзор Литературы

1.2 Структура транскрипционного фактора NF-кВ и его субдъединиц.

Транскрипционный фактор NF-кВ (nuclear factor kappa В - ядерный фактор каппа Б) был впервые описан как белок, специфически связывающийся с последовательностью ДНК 5'-GGGACTTTCC-3' [5], [6]. Эта последовательность была определена как присущий В-лимфоцитам элемент положительного регулятора гена легкой цепи к иммуноглобулинов [7]. В дальнейшем было показано, что в большинстве типах клеток NF-кВ может быть индуцирован в ядре воздействием одного из индукторов: TNFa (фактора некроза опухолей), РМА (форболовых эфиров), LPS (липополисахаридов) и многих других. Было также показано, что воздействие детергентами на цитоплазматические фракции приводит к активации NF-кВ в бесклеточной системе [8]. Кроме того, активация NF-кВ in vivo не зависит от синтеза белка de novo [5]. На основании этих данных была выдвинута гипотеза о том, что активация NF-кВ идет путем не зависящей от транскрипции мобилизации в ядро неактивной цитоплазматической формы [5]. Согласно современным взглядам, NF-кВ является убиквитин-зависимым транскрипционным фактором, который, за исключением некоторых типов клеток, активируется под действием стрессовых сигналов, после чего попадает в ядро в форме, способной связывать ДНК.

При выделении NF-кВ на афинной колонке из клеточных линий человека [9], [10] и кролика [11] были получены два полипептида с молекулярной массой 50 и 65 кДа, названных, соответственно, р50 и р65 (Reí А). Это дало возможность сделать предположение, что молекула NF-кВ состоит из двух субъединиц, одна иди обе из которых обладают ДНК-связывающей активностью.

После клонирования кДНК генов, кодирующих полипептиды р50 и р65, было выяснено [12], что оба белка принадлежат к так называемому "ге1-семейству" белков, гомологичных онкогену v-rel [13]. В этому семейству впоследствие были отнесены полипептиды c-rel, р52, р68 (RelB), plOO и р105, белок dorsal, обнаруженный у Drosophila [14]. Показателем принадлежности белков к NF-кВ/Rel семейству служит наличие у них участков, гомологичных ДНК-связывающему домену Reí (около 300 аминокислот).

1.2.1 Полипептиды р50 и р52. кДНК р50 кодирует белок с молекулярной массой 105кДа (рЮ5), на N-конце которого обнаруживается участок, протяженностью 360 аминокислот, гомологичный Rel-домену. Полноразмерный белок р105 не обладает ДНК-связывающей активностью, но после протеолитического расщепления убиквитин-зависимым протеосомным комплексом [15] из р105 образуются два полипептида. Один из них, N-концевой (р50), способен связываться с ДНК, а другой, С-концевой (р55 или I-kBy), имеющий в своем составе характерные для 1-кВ семейства (см. ниже) "анкириновые повторы", обычно подвергаетсяся протеолизу. Методами иммунофлоуресценции и преципитации было показано, [16] что р105 строго локализован в цитоплазме. Помимо связывания с ДНК, Rel-домен участвует в образовании димеров, вследствие чего р50 может образовывать гомодимер или гетеродимеры с другими представителями Rel/NF-кВ семейства (р65, c-rel, р-68).

Гомо- и гетеродимеры NF-кВ, включающие в себя р50 способны связываться с ДНК, хотя специфичность к последовательности зависит от субъединичного состава NF-kB [17]. В то ?ке время, р50 не может вызывать активацию транскрипции, связываясь с последовательностями типа кВ, в силу отсутствия у него соответствующего трансактивационного домена [18]. Лишь входя в состав гетеродимера с молекулами, способными активировть транскрипцию (р65, р68, с-rel) [22], [23], [24], р50 учавствует в образовании комплексов с транс-активационными свойствами. Более того, гомодимеры р50 способны даже подавлять транскрипцию за счет конкуренции с активными молекулами за связывание последовательностей типа кВ [19].

Позднее была клонированна кДНК гена, кодирующего р52, другую субъединицу NF-кВ, сходную с р50 [23]. Белок-предшественник р52 имеет молекулярный вес 100 кДа и, как и р105, содержит на N-конце Reí домен, а на С-конце "анкириновые повторы". В самом Rel-домене гомология по аминокислотному составу между рЮО и р105 достигает 60%, но общая гомология этих белков не превышает 40%. рЮО также подвергается протеолизу с образованием полипептида р52, способного связывться с ДНК. При этом в клетках опухоли молочный железы MDA-MB-435 полноразмерный рЮО способен сам связываться с другими NF-кВ-белками и удерживать их в цитоплазме, беря на себя функцию других ингибиторов NF-кВ, белков I-кВа и I-кВр (см. ниже) [143].

Зрелая форма р52 может гетеродимеризоваться с р65 и другими белками NF-icB/Rel семейства обладая при этом высоким сродством к кВ-подобным последовательностям. Подобно р50, р52 не обладает трансактивационным доменом. Эффект, оказываемый гетеродимерами с участием р52 на транскрипцию может быть различным и зависит от последовательности связываемого кВ сайта [23], [25].

1.2.2 Полипептиды р65 (RelA), р68 (RelB) и c-rel. мРНК еще одного белка Rd-семейства, р65 имеет размер 2,6 т.п.н. и кодирует белок в 549 аминокислот [22]. Эта мРНК была обнаружена во всех исследованных клеточных линиях и тканях. Полноразмерный белок, полученый трансляцией in vitro, может образовывать гетеродимер с р50 и р52 и в таком виде связывать кВ последовательности. Сходными свойствами обладают и два белка Rel-семейства, имеющие наибольшую гомологию с р65 - р68 и c-rel. Как уже говорилось выше, р65, р68 и v-rel обладают трансактивационными доменами [22], [23], [24]. Как было показано на примере р65, для транскрипционной функции этого белка наиболее важным является район 435-459 аминокислот. Отличительной особенностью этого района явлются высокое содержание отрицательно заряженных аминокислот и структура, отчасти напоминающая "лейциновую молнию" [22]. р65, c-rel и р68 не претерпевают протеолизной обработки для образования зрелого белка.

Несмотря на высокую гомологию белков р65, р68 и c-rel, существуют и важные отличия между их свойсвами. р68 не обладает ДНК-связывающей активностью и для создания транскрипционно-активного комплекса должен связываться с р50 или р52. р68 также не образует димеры с р65 и c-rel, которые, в свою очередь, могут образовывать димеры друг с другом.

1.3 Последовательности ДНК, связывающие Яе1-белки комплексы.

Последовательности типа кВ могут существенно отличаться от "классического" ^-кВ-сайта, первоначально определенного как 10-членник 5'-ОООАСТТТСС-З'. Эти различия отражаются на сродстве отдельных представителей ОТ-кВ семейства к различным последовательностям ДНК. Как уже отмечалось выше, ДНК-связывающей активностью обладают белки р50, р52, р65 и с-ге1. В работе [17] был проведен анализ специфичности связывания р50, р65 и с-ге1 с ДНК и определены консенсусные последовательности для их связывания. Консенсусы выводились из 18 последовательностей, имеющих набольшее сродство к соответствующему белку. Проведенные исследования показали, что р50 связывается с большей вероятностью с 5' концевым фрагментом участка связывания, а р65 с 3' концевым. Последовательности для с-ге1 дивергированы в большей степени, но, как и для р65 понаправлению к 3' концу увеличивается консервативность. В связывании ДНК субъединиц р50 и р65 наблюдается большая специфичность, чем в случае с-ге1. Консенсусные последовательность для р50 5'-СОООАТУССС-З', для р65 5'-ОООКЫТТТСС-3' и для с-ге1 5'-НОО№4А/ТТТСС-3'. Консенсусная последовательность типа кВ в составе известных генов определена как ССОЛЫКУУСС, где Я - произвольный пиримидин, У - произвольный пурин, а N - произвольное основание. Специфичность функции различных №-кВ комплексов в регуляции отдельных генов может достигаеться за счет различного сродства разных №-кВ комплексов к разным кВ-подобным последовательностям.

Участки связывания транскрипционного фактора №-кВ присутствуют в регуляторных областях большого количества различный генов. В основном, это гены имунного ответа и воспалительных реакций. NF-kB регулирует транскрипцию генов к-цепи Ig, интерлейкинов 2, 6 и 8 [26] [27] [28] [29] [30], TCR (рецептора Т-клеток) [31], МНС (главного комплекса гистосовместимости) I и II [32] [33] [34], факторов роста GM-CSF [35], G-CSF[36], цитокинов TNF а и ß [37] [38] [39] [40] [41], ß-интерферона [42] [43],'С4 белка системы комплемента [44], онкогена с-шус [45], вирусов HIV [46], SV-40 [47], CMV [48], аденовирусов [49] и других. NF-kB принимает участие в регуляции таких процессов, как активация Т-лимфоцитов [50] и терминальная дифференцировка В-лимфоцитов [51], а NF-kB - подобный белок Dorsal регулирует становление дорзовентральной оси у Drosophila [52]. Например, мыши с двойной негативно-доминантной мутацией р50 и р52 не способны генерировать зрелые остеокласты и В-лимфоциты [53], вообще, доминантно-негативная мутация какой-либо субъединицы NF-kB приводит к расстройствам имунной системы [214] [115] [116]. Кроме того, NF-kB принимает участие в регуляции (как положительной, так и отрицательной) апоптоза. Эта роль NF-kB рассмотрна в отдельной главе.

1.4 Ингибиторы NF-kB: семейство I-кВ белков.

Перейдем к регуляции активации самого NF-kB. Во время,предшествующее активации, большая часть NF-kB находится в цитоплазме, в форме, не способной связывать ДНК [8]. В цитоплазме NF-kB связан с белками класса I-кВ (I-кВа, I-KBß , 1-кВу - С-концевой домен р105, I-kBs, bcl-3, р105, plOO, Cactus). Отличительной особенностью этого класса белков является наличие в них доменов анкириновых повторов", ранее описаний для белков, вовлеченных в регуляцию роста и дифференцировки [20], обеспечивающих взаимодействие с белками семейства ОТ-кВЛ1е1. Первыми были обнаружены, очищены и клонированы гены I-кВа и 1-кВр [54]. Недавно был клонирован новый член 1-кВ-семейства - 1-кВе [55]. Белки 1-кВ отличаются друг от друга по специфичности связывания молекул ОТ-кВ. Например, 1-кВа, 1-кВр и 1-кВв ингибируют комплексы, содержащие р65 и с-ге1, а 1-кВу и Ьс1-3 связывают гомодимеры р50 и р52 [56][55]. По-особому обстоит дело с комплексами, в состав которых входит Яе1В. Они либо не ингибируются вовсе, либо ингибируются с низким сродством. Вследствие этого, Ке1В-р50 и Яе1В-р52 играют роль конститутивных транскрипционных факторов [57]. 1-кВа [58] и Ьс1-3 были обнаружены не только в цитоплазме, но и в ядре. Ьс1-3 выполняет сложную регуляторную функцию: с одной стороны, связываясь с гомодимерами р50 он предотвращает их конкуренцию с р50-р65 за последовательности типа кВ [59] и активирует транскрипцию, с другой стороны, он может связывать р50-р65 и выступать как репрессор [60]. Недавно было показано [144], что Ьс1-3 способен взаимодействовать с кофакторами транскрипции, играя роль "посредника" или промежуточного звена между ними и ОТ-кВ белками. Ядерный 1-кВа блокирует ДНК-связывание ОТ-кВ и "вытягивает" свободный Ж-кВ из ядра [63].

Система №-кВ/1-кВ является авторегуляторной: в промоторе 1-кВа находится последовательность 5'-ОСОААТТТСС-3', аналогичная последовательности типа кВ в промоторе гена ЮТа [39], вследствие чего активация экспресии 1-кВа зависит от присутствия в ядре активного №-кВ; в то же время, транслокация NF-кВ в ядро связана с диссоциацией комплекса NF-kB/I-кВа [61].

Важной особенностью I-KBß и 1-кВе является то, что они деградируют за большее время, чем I-кВа и, как следствие, вовлечены в регуляцию более медленных процессов [62] [63] и, видимо, не регулируются NF-кВ. При этом I-кВа более сильный ингибитор NF-кВ чем I-icBß и 1-кВе.

При связывании белков I-кВ с NF-кВ, "анкириновые повторы" взаимодействуют с доменом NLS (nuclear localization signal - сигнал ядерной локализации), что делает невозможным транспорт NF-кВ в ядро. Кроме того, в районе С-конца белки I-кВ-семейства был обнаружен консервативный район, при удалении которого I-кВ продолжает связываться с NF-кВ in vitro, но перестает блокировать его ДНК-связывающую активность [64]. В последствие было обнаружено, что в этом рацоне находится так называемый PEST домен, который необходим I-кВ для блокировки ДНК-связывающей активности NF-кВ [145]. В молекулах I-кВр конститутивное фосфорилирование PEST домена может быть необходимым для ассоциации с комплексами, содержащими c-rel [146]. Как правило, PEST домен регулирует время жизни белка й его демаскирование приводит к быстрой деградации содержащего PEST домен полипептида. Тем не менее, делеция PEST домена в I-кВа не влияет на индуцируемую деградацию I-кВа, хотя и стабилизирует этот полипептид в интактных клетках [147].

Как уже было сказано, активация NF-кВ происходит под действием разнообразных индукторов, таких как TNFa [65] [38], LPS[5][7], РМА[5], IL-1 [66]

67] и 2 [68] (интерлейкины 1 и 2), двухцепочечная РНК [42], вирусы гепатита В, цитамегаловирус[69], герпеса типа I [70] и IV[71], Сендай [72],, аденовирусы [73], перекись водорода [74], ионизирующее излучение [75] и других. При этом вначале происходит фосфорилирование I-кВ IKK киназным комплексом, что на данном этапе не приводит к деградации NF-kB [2] [110], а затем фосфорилированный белок убиквитинируется и гидролизуется убиквитин-зависимым протеосомным комплексом [4]. Время активации NF-кВ варьирует от 10 минут для TNFa [5], до 6 часов для РМА [79] и сильно зависит от типа клеток. Для повторной инактивации NF-кВ необходим синтез I-кВ de novo, что занимает некоторое время, так что остаточное действие активированного NF-кВ может продолжаться до 8 часов [5].

1.5 Механизмы деградации 1-кВ.

Как уже говорилось выше, сигналы, индуцирующие NF-кВ приводят к активации IKK киназного комплекса, который фосфорилирует молекулу I-кВ по двум серинам на N-конце (это серины 32 и 36 для 1-кВа, 19 и 23 1-кВр, 157 и 1611-kBs) [148] [149]. IKK киназный комплекс включает в себя как минимум три полипептида: IKKa, IKKß и IKKy (NEMO). IKKa и IKKß являются каталитическими субъединицами киназного комплекса [1] [112] [113] [121], в то время как IKKy играет регуляторную роль [122] [123]. Долгое время оставалось неясным, почему спустя некоторое время после поступления индуцирующего сигнала новосинтезированный I-кВ может накапливаться в клетках, не деградирует. Недавно было показано [121], что IKK-киназный комплекс имеет большее сродство к молекулам I-кВ, связаным с NF-кВ комплексами, чем к свободному I-кВ. Эти данные объясняют, каким образом I-кВ может накапливаться в клетке с актиным IKK-комплексом, снижая уровень ядерного NF-кВ спустя некоторое время после активации.

Следующим за фосфорилированием I-кВ шагом является его убиквитинирование, включающее в себя три последовательные стадии, первая из которых АТФ-зависима [124]. Эти стадии регулируются тремя ферментами (El, Е2 и ЕЗ), лишь один из которых (ЕЗ лигаза) специфичен для I-кВ. В отличие от ферментов, вызывающих фосфорилирование I-кВ, эти белки конститутивно активны, что делает фосфорилирование лимитирующей стадией деградации 1-кВ. Фосфорилированный и убиквитинированный I-кВ расщепляется 26S протеосомой [4] [125] [126], что приводит к высвобождению и ядерной транслокации NF-kB комплексов.

Примечательно, что другой белок, ß-катенин, имеет два серина, симметричных серинам 32 и 36 I-кВа, которые также фосфорилируются в ответ на поступление индуцирующего сигнала, что приводит к убиквитинированию ß-катенина и расщеплению его 26S протеасомой [127]. Таким образом, механизмы деградации ß-катенина и I-кВа идентичны; более того, ЕЗ-лигаза, вовлеченная в убиквитинирование ß-катенина вовлечена и в убиквитинирование 1-кВа.

Описаный выше деградации I-кВ не является единственным. Например, в клетках WEHI-231 помимо классического был обнаружен и исследован альтернативный путь деградации I-кВа, не зависящий от 26S протеосомы [135].

Этот путь обсуждается ниже в связи с поддержанием высокого конституитивного уровня NF-кВ в этих клетках.

1.6 NF-кВ и коактиваторы транскрипции.

После попадания в ядро NF-кВ-комплексы связываются с ДНК и активируют транскрипцию. При этом NF-кВ взаимодействует с большим количестврм так называемых транскрипционных коакгиваторов, белков, связаных с полимеразными или транскрипционными комплексами, или могущих изменять структуру хроматина. К примеру, р65 связывается с ацетилтрансферазой СВР и ее структурным гомологом рЗОО [151] [152]. Фосфорилирование р65 протеинкиназой А (РКА) приводит к увеличению NF-кВ-зависимой транскрипции за счет усиления сродства р65 к СВР/рЗОО [153]. Кроме NF-кВ, СВР может взаимодействовать со многими другими индуцибильными транскрипционными факторами, что обеспечивает координацию различных сигналов на транскрипционном уровне [154] [76] [78]. Эта координация возможна благодаря тому, что уровень СВР/рЗОО в клетке достаточно невысок и конкуренция за него влияет на уровень NF-kB-зависимой транскрипции.

К другому классу коактиваторов, взаимодействующих с NF-кВ относится белок SRC-1 (steroid receptor-coactivator-1, который способен взаимодействовать с полипептидом р50 и усиливать NF-кВ-зависимую транскрипцию [155] Этот белок принадлежит к так называемому р160 семейству трансрипционных коактиваторов, куда, кроме него, входят белки NcoA-2 (nuclear receptor-coactivator-1), RAC-3 (receptor-associated coactivator-3, AIB-1 (amplified in breast carcinoma-1), ACTR activator of the thyroid and retinoic ) и TRAM-1 (thyroid hormone activator molecule) (см. обзор [156] ). Многие из этих полипептидов были первоначально описаны как лиганд-зависимые белки, взаимодействующие с ядерными рецепторами и вместе с СВР участвуют в формировании комплексов, вовлеченных в транскрипцию, обусловленную ядерными рецепторами [157] [158] [159]. Недавно было показано, что транскрипционные коакгиваторы абсолютно необходимы для NF-kB-зависимой транскрипции [160].

1.7 Роль NF-kB в блокировке и активации апоптоза.

Классическим индуктором активации NF-kB является фактор некроза опухоли (TNFa). TNFa принадлежит к семейству цитокинов TNF/NGF (nerve growth factor), регулирующих многие клеточные процессы, в частности, дифференцировку и программируемую клеточную смерть (апоптоз) [80]. Сам TNFa (как, впрочем, и большинство других активаторы NF-kB: ионизирующее излучение, даунорубицин и т.д.) может оказывать на клетку два противоположных действия [81]: с одной стороны, он запускает механизмы цитотоксичности (не зависящие от синтеза белка), с другой стороны, опосредованно активирует транскрипцию генов, продукты которых могут блокировать апоптоз (путь, зависящий от белкового синтеза) - по всей видимости, к ним относятся супероксиддисмутаза, белок А20, белки семейства IAP (ингибиторы апоптоза), bcl-2 [82], [83], [84]. Недавно было показано [161], что NF-kB активирует транскрипцю генов TRAF1 и TRAF2, что приводит к подавлению активности каспазы-8 и блокировке апоптоза.

Активация NF-кВ играет ключевую роль в предотвращении TNF-индуцированного апоптоза [85]. Это вытекает из трех основных соображений. Во-первых, нечувствительные к TNF-зависимому апоптозу клетки приобретают эту чувствительность при обработке ингибиторами белкового синтеза [86]. Во-вторых, клетки из relA-нокаутной мыши не способны активировать NF-кВ и экспрессировать TNF-индуцируемые гены, блокирующие апоптоз [85]. И, наконец, в третьих, клетки, экспрессирующие мутантный I-кВа, способный связывать NF-кВ, но не деградирующий под действием активаторов, также становятся чувствительны к TNF-индуцированному апоптозу [87]. Таким образом, именно баланс про- и анти- апоптотическими процессов и обеспечивает селективность воздействия TNFa и прочих индукторов апоптоза на клетки-мишени.Рассмотрим более подробно механизм индукции апоптоза и активации NF-kB.

При воздействии TNFa на клетку этот цитокин связывается с рецепторами двух типов (CD120a - р55 TNF рецептор, CD120b - р75 TNF рецептор), причем для запуска TNF-зависимых механизмов ему достаточно связаться с 5-20% рецепторов [79]. CD 120а активирует как цитотоксический, так и защитный механизмы, в то время как CD120b активирует лишь защитный. Во внутриклеточной части CD 120а имеется консервативный домен DD (death domen - "домен смерти") размером около 90 аминокислот, наличие которого необходимо и достаточно для индукции апоптоза этим рецептором. DD рецептора TNF способен взаимодействовать с аналогичными DD-доменами так называемых TRAF-белков (TNF-рецептор ассоциированных факторов: MORT1/FADD [88], TRADD [89] и RIP [90] ) по принципу "рецептор-лиганд" [91]. CD 120а связывается с TRADD, который, в свою очередь, связывается с MORT1/FADD, RIP может ассоциировать как с TRADD, так и с MORT 1/FADD. В то же время, MORT 1/FADD связывается с так называемой каспазой-8 [92] и запускает каскад активации так называемых ICE-протеаз (каспаз), что приводит к необратимым изменениям в клетке и апоптозу. В то же время, TRADD, RIP, а также внутриклеточная часть CD120b могут взаимодействовать с адапторным белком TRAF2. В свою очередь, TRAF2 способен активировать NIK киназу (NF-кВ индуцирующая киназа), которая фосфорилирует 1КК-киназный комплекс, в свою очередь фосфорилирующий I-кВа по 32 и 26 серинам [1] [2] [3]. После фосфорилирования специфическая ЕЗ лигаза убиквитинирует I-кВа, после чего I-кВа расщепляется 26S протеосомой [4] [125] [126]. Выше этот путь был уже рассмотрен подробно. Свободный NF-кВ транслоцируется в ядро и активирует транскрипцию генов, способных блокировать апоптоз.

Недавно было показано [162], что еще один важнейший антиапоптотический путь - PI-3 киназа - Akt/PKB может приводить к активации NF-кВ. Более того, активность Akt необходима для активации NF-кВ фактором некроза опухоли (TNFa) наравне с активностью NIK - киназы и мутантные формы как Akt, так и NIK блокируют эту активацию [163]. В этой работе сообщалось, что Akt фосфорилирует одну из субъединиц IKK киназного комплекса - IKKa. В другой недавней работе [164] было продемонстрированно, что антиапоптотический сигнал PDGF, способный блокировать с-тус - индуцированный апоптоз и вызывающий активацию PI-3 киназы И Akt/PKB, ведет к активации NF-кВ через * Akt. При этом Akt фосфорилирует другую субъединицу IKK киназного комплекса -IKKß.

TNFa - отнюдь не единственный агент, могущий индуцироваь апоптоз и/или активацию NF-кВ. Сходные процессы могут индуцироваться большинством вышеописанных активаторов NF-кВ (например, ультрофиолетовым излученим, LPS, PMA). Но в силу наибольшей изученности и характерности, модель индукции апоптоза и NF-кВ фактором некроза опухоли представляется наиболее удобной для описания.

Роль NF-кВ в блокировке апоптоза была также активно исследуется на модели клеточных линий с конституитивно высоким уровнем ядерного NF-кВ (см. ниже).

В некоторых случаях активация NF-кВ приводит к индукции апоптоза -например, для индукции апоптоза клеток карциномы, вызываемого вирусом Синдбис необходима активация NF-кВ [93] [94]. Другой характерный пример - NF-кВ регулирует трансакрипцию полипептидов проапоптатической Fas-FasL системы [165]. Таким образом, NF-кВ регулирует экспрессию генов, разнообразные продукты которых как блокируют (см. выше)[107], так и стимулируют апоптоз (Fas, c-myc [45], р53 [95]).

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что влияние, оказываемое NF-кВ на процесс апоптоза,сильно зависит от множества факторов, таких как тип индуктора, тип клеток, состояние клетки в данный момент времени, наличие различных внешних воздействий на клетку и многих других [101].

1.8 NF-kB и окислительный стресс.

Молекулярный кислород необходим аэробным организмам для их жизнедеятельности; в то же время он черезвычаяно токсичен. Несмотря на то, что в основном состоянии кислород неактивен, во время метаболических процессов он восстанавливается, что приводит к образованию активных форм кислорода (ROI -reactive oxygen intermediates), таких как супероксид радикал (Ог"), перекись водорода (Н2О2) и гидроксид-ион (ОН*). Активные формы кислорода способны окислять различные биологические макромолекулы, вызывать повреждения ДНК, разрыв цепей ДНК, сшивку или повреждение белков и многое другое.

Активные формы кислорода продуцируются не только в ходе нормальных метаболтческих процессов в клетке. Хронические воспалительные реакции, ультрофиолетовое облучение, гербициды и кислотные дожди также вызывают образование ROI (см. обзор [166]). Накопление активных форм кислорода в клетке приводит к окислительному стрессу. Защитные функции против окислительного стресса осуществляются в клетке небольшими низкомолекулярными антиоксидантами и белками-антиоксидантами. Белки антиоксиданты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза) могут катализировать реакции расщепления активных форм кислорода, низкомолекулярные антиоксиданты хилатируют ионы металов (ферритин), блокируя образование ROI.

Активные формы кислорода могут служить компонентами сигнальных каскадов. Баланс между оксидантами и антиоксидантами, такими как глутатион и тиоредоксин, может регулировать активацию многих транскрипционных факторов. Несколько лет назад было показано, что обработка клеток перекисью водорода может приводить к активации NF-кВ (см. обзор [167]). Тот факт, что различные индукторы NF-кВ, такие как TNFa, IL-1, LPS, ультрофиолетовое излучение и другие одновременно вызывли накопление активных форм кислорода в клетке позволило сделать предположение о том, что ROI являются универсальными активаторами NF-кВ. Эта теория подтверждается также данными о том, что многие низкомолекулярные антиоксиданты (например пирролидинэдитиокарбомат -PDTC) и белки-антиоксиданты могут блокировать активацию NF-kB [166]. Тем не менее, точный механизм взаимодействия NF-кВ и активных форм кислорода неизвестен. Недавно было показано [168], что гидроксид-ион отвечает за активацию NF-кВ в клетках Jurkat (Т-лимфома) и макрофагах. С использованием системы продукции гидроксид-ионов, не использующей экзогенную перекись водорода было показано, что антиоксиданты, понижающие концентрацию ОН* или его предшественников способны блокировать активацию NF-кВ. Кроме того, было показано, что хилаты, блокирующие образование гидроксил-иона из перекиси водорода также предотвращали активацию NF-кВ. Таким образом именно способность клеток синтезировать ОН* из перекиси водорода влияет на активацию NF-кВ. Интересно, что, поскольку ОН* крайне активен и имеет короткое время жизни, активация NF-кВ может сильно зависеть от внутриклеточной локализации этого ROI. Недавно было показано, что восстановительная реакция на плазматической мембране макрофагов сама по себе может инициировать процесс активации NF-kB [169].

Регуляция метаболизма активных форм кислорода весьма сложна и механизмы, с помощью которых они активируют NF-кВ, также могут быть весьма разнообразны. В работе [170] были исследованы три различных тканеспецифических пути приводящих к активации NF-кВ интерлейкином-1 (IL-1). В лимфоидных клетках активация NF-кВ зависела от продукции активных форм кислорода, опосредованной 5-липоксигеназой, в моноцитах от продукции ROI, опосредованной НАДФН и в эпителиальных клетках активация NF-кВ не зависела ни от продукции активных форм кислорода, ни от 5-липоксйгеназы.

Как уже отмечалось выше, точный молекулярный механизм взаимодействия NF-кВ и активных форм кислорода неизвестен. Обработка некоторых типов клеток перекисью водорода приводило к появлению гиперфосфорилированной формы I-кВа, которая быстро деградировала в отсутствие протеосомных ингибиторов. [171] [172]. Исходя из этих данных можно было бы предположить, что активные формы кислорода воздействуют на IKK киназный комплекс непосредственно или на какой-либо вышестоящий в каскаде белок. Тем не менее, обработка клеток HeLa антиоксидантом PDTC, способным ингибировать NF-кВ, приводила к сильнейшей активации IKK-киназного комплекса, но не приводила к фосфорилированию или деградации 1-кВа [166]. Одновременная обработка клеток TNFa и PDTC приводила к накоплению фосфорилированной формы I-кВа, которая не подвергалась деградации. Все эти данные говорят о том, что PDTC не блокирует активность IKK, а в некоторых случаях, напротив, усиливает и что активность эта недостаточна для фосфорилирования I-кВа. Таким образом, по прежнему остается неясным, как PDTC и вообще антиоксиданты блокируют активацию NF-kB. Возможно, окислительно-восстановительные реакции могут регулировать активацию NF-кВ на нескольких уровнях, одним из которых может являться блокировка убиквитинирования или деградации NF-kB.

1.9 NF-kB и рак.

NF-кВ -белки вовлечены в процессы опухолевого роста и метастазирования. Гены c-rel, р105, р52, RelA/p65 и bcl-3 расположены в областях, часто подвергающихся транслокациям при перестройках генома, сопутствующих процессам опухолеобразования [99] [173] [174] У многих злокачественно трансформированных клеточных линий [96] [97] (например опухоли молочной железы у крысы и человека, линия NIH3T3) повышен конститутивный уровень NF-кВ, в то же время, искусственное нарушение регуляции NF-кВ (антисмысловыми РНК к 1-кВ) может приводить исходно нормальные клетки к злокачественной трансформации [98]. Для пролиферации клеток лимфомы Ходжкина необходима конститутивная активность NF-kB [99]. Вирусный белок Tax (вирус HTLV-1, вызывающий лейкемию) является активатором NF-kB [175]. Онкогенная форма полипептида ras, наиболее широко распостраненная в опухолях, способна активировать NF-кВ и ингибирование NF-кВ может блокировать клеточную трансформацию, опосредованную ras [176] [177].

Эти и другие данные указывают на чрезвычайно важную роль, которую играет NF-кВ в пролиферации и поддержании жизнеспособности опухолей. Роль эта имеет как минимум два важных аспекта. Первый из них сводится к тому, что некоторые онкогены (с-шус), белки, вовлеченные в процесс опухлеобразования (р53) и вирусы, способные вызывать трансформацию (ретровирусы, аденовирусы, SV-40) находятся под контролем NF-кВ, или сами его с необходимостью активируют при трансформации (как, например, протоонкоген ras) [100], следовательно, изменения в регуляции NF-кВ могут влиять на злокачественное перерождение клеток. Второй, не менее важный, аспект - влияние уровня NF-кВ на чувствительность клеток к иммунным реакциям организма и антираковой терапии [87]. Многие противоопухлевые препараты и терапевтическиее воздействия (даунорубицин, ионизирующее излучение), равно как и большинствое защитных реакции организма сводятся к индукции апоптоза в трансформированных клетках [108]. Между тем, активация NF-кВ этими индукторами апоптоза (например, TNFa, ионизирующее излучение, химеотерапевтические агенты) может защищать клетки от гибели [85] [107]. Таким образом, возможность независимо регулировать активность NF-кВ (например, с использованием мутантного 1-кВ [107]) открыла бы новые возможности в антираковой терапии [87].

1.10 Клетки с высоким конституитивным уровнем ядерного NF-kB.

В большинстве тканей и клеточных линий конституитивный уровень активного NF-кВ сравнителбно невысок. Тем не менее, в некоторых типах клеток, таких как незрелые В-лимфоциты, В-лимфомы, нейроны, клетки, специфичные для болезни Ходжкина, мышиные гкпатоциты, многие опухолевые клетки, был зафиксирован неожиданно-высокий базальный уровень NF-kB [128] [99] [130-134]. В разных системах этот высокий уровень поддерживался различными механизмами. Например, в клетках WEHI-231 высокий конституитивный уровень NF-кВ обусловлен коротким временем жизни молекул 1-кВа. В этих клетках I-кВа расщепляется с помощью Са++ -зависимой протеиназы, ингибируемой EGTA и другими хилатами [135]. При исследований клеток специфичных для болезни

Ходжкина было обнаружено, что молекулы I-кВа в этих клетках неполноразмерны и не способны связывать NF-кВа [133][136]. Lernbecher et al также показали, что в исследованых ими лимфоидных клетках I-кВа не способен связывать комплексы, содержащие белок RelB, хотя эти комплексы и связывались с I-кВа дикого типа [137]. Обработка клеток Т-лимфомы НиТ-78 антителами к ФНО приводила к понижению высокого базального уровня NF-кВ, что говорит о том, что в этих клетках экспрессируется TNFa (или его гомолог), постоянно поддерживающий в активном состоянии путь деградации I- кВ [134].

Эксперименты по искусственному понижению уровня ядерного NF-кВ в клетках, где этот уровень был конституитивно высок показали, что высокий уровень NF-кВ необходим большинству подобных клеток для жизнедеятельности или пролиферации. В клетках с низким конституитивным уровнем NF-кВ его искусственное понижение обычно не вызывает гибели или ареста клеток. В клетках WEHI-231 понижение базального уровня NF-кВ приводило к резкому падению уровня онкогена с-тус (как уже говорилось, транскрипционной мишени NF-кВ) и апоптозу [139-141]. Было также показано, что апоптоз индуцируется именно падением уровня с-тус; оверэкспрессия экзогенного с-тус полностью блокировала гибель клеток, вызванную падением уровня NF-кВ. С другой стороны, активация транскрипции онкогена с-тус и опухолевого супрессора р53 NF-кВ может вызывать апоптоз в некоторых клетках [142] [129]. На системе крысиных фибробластов Rat 1а было показано, что оверэкспрессия с-тус может приводить к блокировке активации NF-кВ (повидимому, это один из механизмов обратной связи) и делать клетки чувствительными к апоптотическому действию TNFa [109]. Вообще, взаимодействия NF-кВ с-шус и р53 крайне сложны и разнообразны, они могут приводить к противоположным эффектам в разных системах. Кроме того, эти белки взаимодействуют на нескольких уровнях. В дополнение к вышеописанной активации транскрипции р53, обусловленной NF-кВ, недавно было показано [76] [78], что эти два транскрипционных фактора конкурируют за кофактор транскрипции рЗОО/СВР, негативно влияя на транскрипционную активность друг друга.

1.11 Опухолевый супрессор р53.

Опухолевый супрессор р53 играет важнейшую роль в регуляции внутриклеточных процессов. Мутации в р53 или его инактивация являются отличительной чертой большинства опухолевых клеток [178]. Одна из важнейших функций р53 - индукция ростового ареста или апоптоза в ответ на некоторые стимулы, такие как вирусная инфекция или повреждение ДНК [179] [180]. Благодаря этим свойствам р53 и является опухолевым супрессором - любые геномные перестройки приводят к стабилизации р53 и апоптозу; связь между апоптотической функцией р53 и супрессией опухолей была неоднократно показана на различных моделях (см. обзоры [181] [178]). р53 не только участвует во многих внутриклеточных процессах, таких как регуляция клеточного цикла, апоптоз, репарация ДНК, ростовой арест, дифференцировка и ангиогенез, но и обладает различными биохимическими активностями - активация и репрессия транскрипции, отжиг ДНК, 3-5' экзонуклеазная активность (см обзоры [182] [183]).

1.11.1 Регуляция р53.

В интактных клетках р53 присутствует в небольших количествах и имеет достаточно короткое время жизни (около 20 мин.) [178]. Деградация р53 может осуществлятся двумя путями: калпаиновым протеалитическим путем [184] и убиквитин-зависимым пртеолитическим путем [185]. После того как с помощью ферментов убиквитиновой системы (El, Е2 и ЕЗ) к р53 ковалентно присоеденются несколько молекул убиквитина, белок расщепляется 26S протеосомой. Выше убиквитин-268 протеосомная система уже была рассмотрена в связи с деградацией I-кВа. В отличие от факторов, принимающих участие в убиквитинировании 1-кВа, подобные факторы для р53 еще слабо изучены.

В настоящее время принято считать, что стабильность р53 может регулироваться полипептидом MDM2. р53 и MDM2 связаны системой отрицательной обратной связи - р53 активирует транскрипцию MDM2, в то время как MDM2 может связываться с р53 и блокировать его транскрипционную активность. [186] [187]. ДНК-повреждающие агенты, способные стабилизировать р53, могут вызывать фосфорилирование р53 по серинам 15 и 37 [188], после чего MDM2 перестает ингибировать его транскрипционную активность. Возможно, MDM2 не способен связывать фосфорилированную форму р53. Согласно другим данным, MDM2 способен вызывать деградацию р53 [189]. Также было показано, что MDM2 может активировать убиквитинирование р53 in vitro. Согласно последним данным, р53 с делегированным димеризационным доменом (олигомеризация р53 необходима для его трансактивационной активности) имеет низкое сродство к МОМ2 и слабо подвержен убиквитинированю [191]. Все эти данные позволяют предположить следующую модель регуляции р53 [191]. В интактных клетках р53 связывается с МГОМ2, что приводит к его убиквитинированию и деградации 26Б протеосомой. В ответ на индуцирующий сигнал происходит фосфорилирование р53 по серинам 15 и 37, что предотвращает его взаимодействие с МОМ2 и привоит к стабилизации р53.

1.11.2 р53 и арест клеточного цикла.

При поступлении индуцирующего сигнала (сигналом может быть, например, двунитевой разрыв в ДНК) происходит стабилизация р53 и активация его транскрипционной активности. После активации р53 может вызывать либо арест клеточного цикла, либо апоптоз. Какой из этих двух механизмов будет запущен зависит от многих факторов, таких как тип клеток, внешние стимулы, интенсивность стрессового воздействия, эффективность ДНК-репарации и многих других [192]. Например, в Т-лимфоцитак стабилизация р53 обычно приводит к апоптозу, в то время как в фибробластах р53 вызывает арест клеточного цикла [193].

Под контролем р53 находятся важнейшие контрольные точки 01 и СИ фаз клеточного цикла. Активация транскрипционным фактором р53 транскрипции р21 шр1/аР' приводит к -аресту (см. обзор [194]), в то время как индукция транскрипции 14-З-Зст и 0АБ045 приводит к 02 аресту [195]. р21 индуцирует 01 арест, ингибируя так называемые cdk (циклин-зависимые киназы), которые в активном состоянии способны фосфорилировать белок ретинобластомы (pRb). В гипофосфорилированном состоянии pRb инактивирует сайты связывания транскрипционного фактора E2F, что и приводит к блокировке перехода из G1 в S фазу клеточного цикла. Кроме того, pRB активирует гистондеацетилазу HDAC1, которая блокирует транскрипцию, вызывая компакгизацию нуклеосом [196]. Еще один механизм действия р21 - блокировка взаимодействия PCNA (proliferating cell nuclear antigen - белок, необходимый для процессивности ДНК-полимеразы ô) и ДНК полимеразы ô, необходимого для репликации [197]. Кроме этого, р53 может вызывать и р21-независимый G1 арест [198].

G2 арест может индуцироваться по крайней мере двумя транскрипционными мишенями р53. Продукт гена 14-З-За инактивирует фосфорилированную форму cdc25C, фосфатазу, взаимодейсвующую с комплексом циклин B/cdc2, важным для перехода из G2 в M фазу клеточного цикла [199]. Продукт же гена GADD45 может блокировать образование комплекса циклин B/cdc2, вероятнее всего напрямую взаимодействуя с cdc2 [200].

1.11.3 р53 и индукция апоптоза.

В то время как опосредованный р53 арест клеточного цикла связан исключительно с его транскрипционной активностью, индуцированный р53 апоптоз может быть как транскрипционно зависимым, так и транскрипционно независимым [193] [182].

Проапоптотические продукты геныов-мишени р53 могут быть разделены на две группы: к первой группе относятся сигнальные белки, вовлеченные в передачу про- или антиапоптотического сигнала (например, репрессия IGF-IR приводит к блокировке антиапоптотического сигнала IGF-1 [201], ко второй группе относятся полипептиды, взаимодействующие с эффекторными проапоптотическими молекулами (например, трансактивация Ьах приводит к высвобождению цитохрома С и активации каспаз [202]).

Один из наиболее примечательных механизмов активации р53-зависимого апоптоза - взаимодействие р53 и проапоптотической системы Fas-FasL. р53 положительно регулирует экспрессию Fas-рецептора [203]; кроме того, р53 регулирует транспорт Fas-рецептора из аппарата Гольджи на цитоплазматическую мембрану. Напомним, что выше уже говорилось о том, что экспрессия FasL положительно регулируется NF-кВ; таким образом, система Fas-FasL представляет собой дополнительный пример взаимодействия NF-кВ и р53 в процессе апоптоза. Еще одна возможность для взаимодействия этих двух транскрипционных факторов - через активные формы кислорода (ROI). Выше подробно обсуждалась роль ROI как возможных универсальных индукторов активности NF-кВ. р53 способен индуцировать увеличение уровня активных форм кислорода [204] и регулирует транскрипцию группы генов (PIG), могущих вызвать окислительный стресс [205].

Еще в 1994 году было показано [206], что р53 может запускать в клетках механизм апоптоза в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка. Тем не менее, механизмы транскрипционно-независмого р53-индуцированного апоптоза до сих пор неясны. Один из возможных механизмов этого явления может быть связан с

E2F-1 [207], который, впрочем, может индуцировать и р53-независимый апоптоз. Недавно было показано, что р53 может вызывать активацию каспаз во внеклеточных эктрактах вне зависимости от присутствия цитохрома с или Ьах. Возможно, и р53-зависимый и р53-независмый апоптоз проходят в одних и тех же системах одновременно, но с различной кинетикой и вступают в сложные синергические взаимодействия. [192]. В пользу этого предположения и говорят данные о том, что дикий тип р53 вызывает апоптоз быстрее и эффективней, чем мутантная форма, не обладающая транскрипционной активностью [208].

Несмотря на то, что наиболее изучена проапоптотическая р53, Lassus et al продемонстрировали, что небольшие дозы р53 дикого типа могут предотвращать апоптоз, индуцированный уменьшением концентрации сыворотки в среде [209]. Позднее было показано, что антиапоптотическая функция р53 не зависит от его транскрипционной активности [210].

1.12 Заключение.

Мы рассмотрели в общих чертах механизмы функционированния и регуляции NF-кВ и отчасти р53, а также их влияние на такие процессы, как трансформация, арест клеточного цикла и апоптоз. В разных условия эти белки могут оказывать на клетку прямо противоположное влияния - вызывать как гибель клетки, так и блокировку апоптоза. В этих процессах весьма важную роль играет взаимодействие NF-кВ с другими белками, вовлеченными в регуляцию этих процессов - в первую очередь с р53 и с-тус. Именно баланс между различными активностями этих и некоторых других белков и определяет судьбу клетки после различных воздействий.

Разумеется, мы рассмотрели лишь наиболее важные для понимания настоящей работы аспекты регуляции и функционирования №-кВ. Большой интерес предсьавляет собой связь между путями активацией №-кВ и деградацией Р-катенина, многие другие механизмы и явления,не рассмотренный здесь подробно.

Одной из наиболее интересных и быстроразвивающихся аспектов в области, связаной с КБ-кВ является изучение систем с конституитивно высоким уровнем ЫБ-кВ. Важность подобных исследований связана в первую очередь с тем, что конституитивный уровень №-кВ это как правило высок в агрессивных и высокожизнестойких клетках. Понимание роли высокого уровня ОТ-кВ в этих клетках, механизмов поддержания, путей и последствий понижения этого уровня могло бы иметь огромное научное и медицинское значение, причем в лечении не только онкологических заболеваний, а таких болезней как скажем ревматоидный артрит и хронические воспалительные реакции [102]. Хотелось бы еще раз подчеркнуть, что только комплексное исследование взаимодействий различных каскадов и белков в клетке могло бы дать ключ к пониманию сложных внутриклеточных процессов и межклеточных взаимодействий.

2. Материалы и методы.

2.1. Клеточные линии и трансфекции.

Линии аденокарциномы молочной железы мыши с низким и высоким метастатическим потенциалом КСМЛ-0 и КСМЛ-100, соответственно, ВМР-печень (в 100% случаев дает метастазы в печень), полученные из опухоли молочной железы мыши, индуцированной MMTV [104], HeLa - человеческую клеточную линию эпителиальной карциномы и К562 - клетки хронической эритролейкемии человека [211] вели на средах DMEM (Sigma,St Louis, МО), суспензионные клетки WEHI-231 - мышиную В - клеточная лимфому, человеческую лимфому Jurcat вели на среде RPMI (Sigma,St Louis, МО), с добавлением 10% бычьей фетальной сыворотки (Gibco, Grand Island, NY) и по 50 мкг/мл стрептомицина и пенициллина при 5% содержании С02 в инкубаторе при ЪТС, как описано в [212].

Трансфекция проводилась при помощи реагента LIPOFECTIN производства фирмы Gibco BRL, согласно рекомендациям изготовителя. Использовалось 5-15 мкл реагента на одну лунку шестилуночного планшета. Перед трансфекцией клеткам заменялась среда на бессывороточную. Репортерные плазмиды, сконструированные на основе вектора pCAT3Basic, трансфецировались совместно с вектором pCMVß-gal, экспрессирующим ß-галактозидазу, под контролем цитомегаловирусного промотора. Эффективность каждой трансфекции определялась по активности ß-галактозидазы полученного белкового экстракта с помощью ONPG-окрашивания [213]. Все эксперименты по трансфекции повторялись не менее 3-х раз.

Клетки окрашивали X-gal для определения активности ß-gal in situ. Окрашивание проводили следующим образом. Клетки промывали буфером PBS, фиксировали 5 мин при 4°С в PBS, содержащем 2% формальдегида, 0.2% (v/v) глютаральдегида , промывали в PBS 3 раза и окрашивали PBS, содержащем 20 мМ ферроцианида калия, 20 мМ феррицианида, 2мМ MgCl2,1мг/мл X-Gal (в 1Ч,Ы-диметилформамиде) и инкубировали при 37°С в течение 12 ч. В отдельных экспериментах клетки лизировали и измеряли активность ß-gal с помощью ONPG-окрашивания как описано в [103].

2.3. Плазмиды.

NF-кВ-зависимая репортерная плазмида pN5 содержала 5 копий консенсусного кВ сайта 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3' в регуляторной области гена хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в плазмиде pCAT-Promoter ("Promega"). Ген GSE-22 [107], кодирующий С-концевой фрагмент р53 крысы (аминокислоты 319-390) и ген Е6 [105] были клонированы в вектор pBabePuro. р53-зависимая репортерная плазмида содержала сайт связывания р53 из регуляторной области гена p21/Waf, клонированный в вектор CatTKO [38, 40]. кДНК человеческого 1-кВ (MAD3) дикого типа и мутантная по Ser-32 и Ser-36 (с заменой на аланин) были клонированы в вектор pRc-CMV ("Invitrogen"). Оба вектора были любезно предоставлены Нэнси Райе (Frederick Cancer Centre, США).

Все плазмиды были дважды очищены в градиенте хлорида цезия. 2.3. Измерение САТ-активности.

Через два дня с момента трансфекции клетки лизировались и активность хлорамфениколацетилтрансферазы определялась стандартным методом [214] с разделением ацетилированных и неацетилированной форм хлорамфеникола при помощи тонкослойной хроматографии. Тотальные белковые экстракты, полученные лизисом клеток в 0.25 мМ Трис-HCl pH 7.8 трехкратным замараживанием в жидком азоте и оттаиванием, инкубировались 10 мин на 65оС для инактивации эндогенной деацетилазы. На 50 мкл белковых экстрактов добавлялось 80 мкл раствора для САТ реакции ( 50 мкл 1М Трис-HCl pH 7.8, 10 мкл 0.1 мК/мл 14С-меченного хлорамфеникола, 20 мкл 3.5 мг/мл ацетил кофермента А) и смесь инкубировалась ночь на 37С. Далее к реакции добавлялся 1 мл этилацетата, смесь встряхивалась на вортексе и центрифугировалась 5 мин (12 000 об/мин) при комнатной температуре. Верхняя фаза переносилась в новую пробирку и выпаривалась 1 час. Осадок растворялся в 25 мкл этил ацетата и наносился на пластину для тонкослойной хроматографии (Sybron SIL G/ UV 254, Brinkmann). Хроматография проходила в присутствии в камере раствора (95: 5 хлороформ: метанол). После высушивания пластина экспонировалась с радиоавтографической пленки. Уровень САТ активности оценивался с помощью фосфоимеджера (в данном случае использовался стандартный пакет программ) или дэнситометра.

2.4. Анализ апоптоза.

Для флуоресцентного анализа на апоптоз клетки были открепляли раствором трипсина ("Sigma"), промывали PBS и инкубировали 15 мин на льду вместе с окрашивающей смесью анексина V-FLUOS и пропидиум иодида согласно рекомендациям производителя ("Boehringer Mannheim"). Затем клетки анализировали методом проточной цитофлуометрии на цитофлуориметре Becton/Dickenson Vantage с длинной возбуждающей волны 488 нм, фильтрами 515 нм для анексин V-FLUOS и 560 нм для пропидиум иодида.

2.5. Выделение ядерных белковых экстрактов.

Ядерные экстракты из клеток ES были любезно предоставлены доктором Бердом (Edinburg University, Шотландия). Из клеток KCMJÏ-0, KCMJ1-100, ВМР-0, ВМР-печень, WEHI-231, HeLa, К562 ядерные белковые экстракты выделяли по методу Дигнама [138]. Клетки суспендировались в буфере А (2М сахароза, 15 мМ Трис-НС1 pH 7.9, 140 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 0.5 мМ EGTA, 0.15 мМ спермин, 0.5 мМ спермидин, 1 мМ DTT, 25 мМ KCl, 0.4 мМ PMSP, 2 мМ MgC12) и разрушались в гомогенизаторе Даунса В до разрушения 90% клеток. Ядра осаждались центрифугированием 40 мин при 4оС в бакетном роторе SW28 на 24.000 об/мин. Ядра промывались буфером В 1мл на 1г клеток (75 мМ KCl, 0.25 мМ MgC12, 1мМ EDTA, 0.5 мМ EGTA, 20 мМ HEPES- КОН pH 7.9, 0.23 M сахароза, 0.15 мМ спермин, 0.5 мМ спермидин, 1 мМ DTT, 25 мМ KCl, 0.4 мМ PMSF) и переосаждались центрифугированием 20 мин при ОС на 1500 об/мин. Ядра суспендировались в одном объеме осадка ядер буфера С ( 0.35 M NaCl, 20 мМ HEPES-KOH рН 7.9, 5 мМ EDTA, 10 % глицерин, 1 мМ DTT, 0.4 мМ PMSF ) и инкубировались при 4 С в течение 1-2 часов. Ядерные оболочки осаждались центрифугированием в роторе SS34 30 мин на 16.000 об/мин. Концентрацию белка в ядерных экстрактах определяли по методу Бредфорда [150].

2.6. Анализ ядерных белковых экстрактов с помощью экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле.

Реакцию связывания ядерных белковых экстрактов с фрагментами ДНК, меченными с 5'-конца по одной из цепей ферментативным фосфорилированием в присутствии [у-32Р]АТФ (Обнинск) проводили по методике описанной в [103]. Реакцию связывания ставили следующим образом: Змкл 5х буфера (150 мМ КС1, 30 мМ HEPES-KOH ( рН 7.9 ), 20 мМ Tris-HCl ( рН 7.9 ), 5 мМ DTT, 25% глицерина, 1.5 мг/мл BSA ), 3 мкл ядерного экстракта (примерно 15 мкг тотального белка ), 1 мкл меченого фрагмента ДНК (3x104 имп/мин ), 2 мкл поли (dl-dC) ("Pharmacia") (1мкг/мкл) в 100 кратном избытке к количеству меченой пробы, инкубировали 15 мин при 30С. Эксперименты по конкуренции с немечеными фрагментами осуществлялись путем добавления 50-ти кратного (по количеству вещества) избытка немеченого олигонуклеотида. После электрофореза в 3,5-4% неденатурирующем ПААГ (соотношение акриламида к бис-акриламиду 1:59) в 0.3 кратном Трис-боратном буфере (рН 8.0), гель переносили на ватман

-с

ЗММ, сушили и экспонировали на ренгеновскую пленку Kodak-B ioMАХ MS в течение 12 часов.

Для экспериментов по торможению в геле с использованием олигонуклеотидов, удовлетворяющих условиям консенсусов связывания факторов NF-кВ, Oct-1, c-myc и р53 были синтезированы, соответственно, следующие олигонуклеотиды: 5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3', и комплементарный ему 5' -GCCTGGGA А AGTCCCCTC А АС А-3'; 5 '-TGTCGA ATGCA А АТС ACTAGAA-3', и комплементарный ему 5 '-TTCTAGTGATTTGCATTCGACA-3';

5-GGAAGCAGACCACGTGTCTGCTTCC-3', и комплиментарный ему 5-GGAAGCAGACACGTGGTCTGCTTCC -3';

5-TACAGAACATGTCTAAGCATGCTGGGG-3', и комплиментарный ему 5'- CCCCAGCATGCTTAGACATGTTCTGTA-3';

Один из каждой пары олигонуклеотидов метился 5'- ферментативным фосфорилированием в присутствии у-32Р] АТФ, а затем производился температурный отжиг с комплементарным ему немеченым олигонуклеотидом. Реакционная смесь разделялась в 12% неденатурирующем ПААГ. Полоса, соответствующая двухцепочечному олигонуклеотиду, вырезалась из геля. После этого полученные двухцепочечные молекулы элюировались из ПААГ и использовались для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле.

2.7. Иммуноблот со специфичными антителами.

Блот-гибридизация проводилась в соответствии с рекомендациями фирмы Santa Cruz Biotechnology. Белки, фракционированные в денатурирующем SDS-ПААГ переносились методом полусухого переноса в буфере ( 0.286 г Трис-base, 1.42 г глицин, 20 мл метанол / на 100мл раствора) при 150мА в течение 1 часа на мембрану Hybond-P (Amersham ). После этого мембрана инкубировалась в течение ночи в блокирующем буфере (5% обезжиренное сухое молоко, 0.05% Tween-20 в буфере TBS ( 10 мМ Трис-HCl pH 8.0, 150 мМ NaCl )). Далее мембрана инкубировалась в течение 1 часа в блокирующем буфере с добавленными в него специфичными антителами в количестве 1:2000 по объему. Затем мембрана отмывалась три раза по 10 мин в TBS-буфере и, после этого, инкубировалась в течение 1 часа в блокирующем буфере, содержащем соответствующие вторичные антитела в разведении 1: 10000. После трех отмывок в TBS-буфере мембрана помещалась в проявляющий раствор ECL фирмы (Amersham) на 1 мин. Мембрана немедленно экспонировалась на радиоавтографическую пленку в течение различных промежутков времени.

Использовались следующие антитела фирмы "SantaCruz Inc.": anti-p50 (Hl 19) sc7178, anti-p65 (C20) sc372, anti-RelB (C19) sc226, anti-myc (N-262) sc-764. Антитела к p53 (421) были любезно предоставлены П.М. Чумаковым (ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН).

2.8. Иммунопреципитация и разделение белков в денатурирующем SDS-ПААГ.

Для иммуноиреципитации клетки промывали PB S и снимали при помощи раствора Версена. Затем клетки осаждались центрифугированием, и, после этого, растворялись в 100-200 мкл раствора ИРА (50 мМ Tris pH 7,8, 150 mM NaCl, 1% Triton Х-100, 0,1% SDS, 0,1% дезоксихолат натрия) и лизировались в нем приблизительно 1-1,5 часа при покачивании на качалке. После инкубации, полученные лизаты центрифугировались 10 минут при 12000 g на центрифуге Eppendorf, и супернатанты, представляющие собой тотальные белковые экстракты, освобожденные от клеточного дебриса, переносились в новую пробирку. В каждую пробирку с белковым экстрактом, полученным так, как описано выше, а также в пробирки с культуральной жидкостью соответствующих клеток, добавлялись соответствующие антитела в соотношении 1:500 по объему. Белковые экстракты и культуральная жидкость инкубировались с антителами в течение ночи при 4 С. Затем в пробирки с белковыми экстрактами и культуральной жидкостью добавлялось 5-15 мкл суспензии протеин-A сефарозы (производства фирмы Sigma) в растворе RIPA. Экстракты и культуральная жидкость инкубировались с протеинА сефарозой 4-6 часов. После этого протеин-A сефароза осаждалась центрифугированием, супернатант удалялся, осадок ресуспендировался в буфере для нанесения, и полученные образцы анализировались в денатурирующем SDS-ПААГ: разделяющий гель ( 8% акриламидный-бис-акриламидный микс (сшивка 1 : 29), 400 мМ Трис-HCl pH 8.8, 0,1% SDS, 0,1% аммоний персульфат, TEMED), концентрирующий гель (5% акриламидный-бис-акриламидный микс ( сшивка 1: 29), 126 мМ Трис-HCl рН 6.8, 0,1 % SDS, 0,1 % аммоний персульфат, TEMED), электрофорезный буфер (24мМ Трис-base, 190мМ глицин, 0,1% SDS). Параллельно на гель наносился окрашенный белковый маркер (High Range, Sigma).

2.9. Реактивы.

В работе использовались реактивы ТРСК, PDTC, PMSF, ФНО, ONPG и X-gal фирмы ("Sigma").

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Клетки КСМЛ-100 и КСМЛ-0 обладают высоким конститутивным уровнем транскрипционного фактора ОТ-кВ.

Конститутивный уровень ядерного №-кВ был определен в ядерных экстрактах из различных клеточных линий методом связывания с консенсусным кВ олигонуклеотидом (Рис.1). Количество белка уравнивалось по уровню связывания транскрипционного фактора ОсЫ с его консенсусным сайтом связывания. Мы показали, что в клетках КСМЛ-100 конститутивный уровень №-кВ аномально высок, в клетках КСМЛ-0 он несколько ниже (сравним с уровнем в клетках \УЕН1-231 или в клетках К562, индуцированных ФНО), но значительно выше, НеЬа, К562 и ЕБ. В клетках аденокарциномы мыши ВМР-Печень и ВМР-0 конститутивный уровень №-кВ был также высоким. Как было показано ранее, в клетках КСМЛ-100 и КСМЛ-0 спектр №-кВ состоит из гомодимеров р50-р50 и гетеродимеров р50-р65 и р50-Яе1В.

3.2. ТРСК и РБТС уменьшают уровень активного ОТ-кВ в клетках КСМЛ-100 и КСМЛ-0.

Ингибитор протеаз ТРСК и антиоксидант РЭТС понижают уровень активного №-кВ в клетках \VEHI-231. Мы исследовали влияние ТРСК и РБТС на уровень активного №-кВ в клетках КСМЛ-100 и КСМЛ-0. Клетки КСМЛ-100 обрабатывали 25мкМ и 50мкМ ТРСК и 15 мкМ РБТС в течение 1, 3 и 7 часов и определяли уровень активного №-кВ в полученных из этих клеток ядерных экстрактах методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле (Рис 2, 3).

Рисунок1. Задержка ДНК-белковых комплексов в геле. Ядерные экстракты из различных типов клеток (указаны сверху) использовали в реакции связывания с консенсусными олиго-нуклеотидами для №-кВ и ОсЫ. Стрелки указывают на ДНК-белковые комплексы

Нормировка проводилась по уровню связывания с консенсусным сайтом связывания Ой-1. Обработка клеток ТРСК в обеих концентрациях (25 и 50 мкМ) приводила к падению уровня ядерного №-кВ после 1 часа обработки. После 3 и 7 часов обработки уровень ядерного ИБ-кВ незначительно возрастал (Рис. 2,Б). Этот эффект сильно зависел от концентрации ТРСК. Более значительный эффект наблюдался после обработки клеток КСМЛ-0 и КСМЛ-100 50 мкМ ТРСК: 8% от исходного уровня ядерного ИР-кВ спустя 1 час после добавления ТРСК, 10% спустя 3 часа и 15% спустя 7 часов. При обработке клеток 25 мкМ ТРСК наблюдались значения 20% исходного уровня через 1 час, 35% через 3 и 45% через 7 часов. Как и ожидалось, уровень ядерного Ос1>1 не изменялся под воздействием ТРСК, что позволило сделать вывод о специфичности понижения №-кВ при помощи ТРСК. Аналогичные эксперименты с использованием РБТС также привели к изменениям в уровне ИБ-кВ, но с другой кинетикой. Обработка клеток КСМЛ-100 15мкМ РБТС приводили к медленному, но стабильному падению ЫБ-кВ (Рис 3) - уровень ядерного ЫБ-кВ состовлял 100% от исходного спустя 1 час, 75% спустя 3 часа, 50% спустя 7 часов и 25% спустя 11 часов. Аналогичные результаты получены и на клетках КСМЛ-0.

Методом иммуноблота с тотальными экстрактами мы показали, что обработка ТРСК и РБТС в течение 1, 3 и 7 часов не приводит к изменению общего уровня белков р65/Яе1 А, р68/Яе1 В и р50 (данные не показаны) в клетке. Таким образом, ни ТРСК, ни РЭТС не изменяли общий уровень ОТ-кВ белков в этих клетках, что говорит о том, что изменение уровня активного ЫБ-кВ происходило за

ТРСК. 25жМ ТРСК, 50мкМ

0 13 7 1

I ? 5 4 5 6 ?

ОсГ-1 ют 1

0—«ЗОикВ

Рисунок 2. Задержка ДНК-белковых комплексов в геле, а- Ядерные экстракты из клеток КСМЛ-ЮО пос-ле обработки 25 мкМ (дорожки 1-4) и 50 мкМ (дорожки 5-8) ТРСК использовали в реакции связывания с консенсусными олигонуклеотидами для №-кВ и ОсЫ. Стрелки указыва-ют на ДНК-белковые комплексы. Цифры над авторадиограммой - время обраб отки. б- Кинетика понижения ядерного ИР-кВ под действием различных доз ТРСК. По оси абсцисс отложено время, по оси ординат -проценты от начально-го уровня. клеток КСМЛ-100 после обработки 15 мкМ РБТС использовали в реакции связывания с консенсусными олигонклео-тидами для №-кВ и ОсЫ. Стрелки указывают на ДНК-белковые комплексы. Цифры над авторадиограммой - время обработки в часах, б- Кинетика понижения ядерного №-кВ под действием 15 мкМ РБТС. По оси абсцисс отложено время, по оси ординат - проценты от начального уровня. счет транслокации NF-кВ комплексов из ядра в цитоплазму. Соответствующие эксперименты на клетках KCMJI-0 дали аналогичные результаты.

3.3. ТРСК и PDTC вызывают апоптоз в клетках КСМЛ-100 и КСМЛ-0.

Апоптоз в клетках КСМЛ-100 и КСМЛ-0 определялся методом двойного окрашивания аннексином V-FLUOS и пропидиум иодидом с последующим исследованим клеток на проточном цитофлуориметре. Аннексии V является Са44"-зависимым фосфолипид-связывающим белком, имеющим высокое сродство к фосфатидилсерину (PS), одному из известных маркеров апоптоза. Окрашивание пропидиум иодидом применялось для отличия апоптотических клеток от некротических.

Низкие дозы ТРСК (25 мкМ и ниже) не вызывали сдвигов в связывании аннексина V в клетках КСМЛ-100. Спустя 20 часов после обработки 25 мкМ ТРСК клетки были по-прежнему жизнеспособны (Рис 4, А). Тем не менее, 50 мкМ ТРСК вызывал повышенное связывание аннексина V. Кинетика связывания была следующей: (Рис 4 Б-Е): 1 час- (5±2)%, 3 часа - (8+3)%, 5 часов - (14±5)% и 8 часов-(45±14)%. На основании этих результатов нами был сделан вывод о том, что ТРСК вызывает или не вызывает в клетках КСМЛ-100 апоптоз в зависимости от концентрации (25 мкМ ТРСК не вызывал апоптоза, а 50 мкМ вызывал). Поскольку ТРСК - ингибитор протеаз, мы обработали клетки другим ингибитором протеаз, PMSF, дабы определить насколько специфично воздействие ТРСК. PMSF не влиял на связывание аннексина V клетками (Рис 4, Ж).

Таким образом, падение уровня ядерного №-кВ в клетках КСМЛ-100 индуцировала в этих клетках апоптоз. Для того, чтобы определить, не является ли ТРСК неспецифически токсичным для клеток, мы обрабатывали клетки НеЬа различными концентрациями ТРСК. Клетки НеЬа оказались устойчивыми к обработке ТРСК в концентрациях до 75 мкМ в течение по крайней мере 20 часов (Рис 4, 3). В клетках НеЬа уровень ядерного №-кВ сравнительно невысок (Рис 1), поэтому обработка ТРСК не могла приводить к его существенному понижению.

Вступление клеток КСМЛ-100 в апоптоз под действием ТРСК также сопровождалось изменением их формы. Нормальные клетки линии КСМЛ-100 выглядят как прикрепляющиеся фибробласты нерегулярной формы; через 1 час обработки 50мкМ ТРСК клетки приобретают сферическую форму.Тем не менее, клетки остаются прикрепленными и открепляются лишь после 6-8 часов обработки.

Уровень активного №-кВ в клетках КСМЛ-0 ниже чем в клетках КСМЛ-100, но существенно выше, чем в большинстве типов клеток. Эксперименты показали, что ТРСК в обеих концентрациях (25 мкМ и 50 мкМ) вызывал апоптоз в клетках КСМЛ-0 за 10 часов (данные не показаны).

Также клетки КСМЛ-100 и КСМЛ-0 обрабатывались 15 мкМ РЭТС, что вызывало апоптоз в 50% клеток за 16 часов в клетках КСМЛ-0 (данные не показаны) и за 24 часа в клетках КСМЛ-100 (Рис . 4, К).

3.4. Низкие дозы ТРСК делают клетки КСМЛ-100 чувствительными к ФНО.

По нашим данным обработка клеток КСМЛ-100 1нМ ФНО вызывала в этих клетках 50% активацию активного №-кВ за 15 минут [26] и не вызывает гибели клеток за 24 часа (Рис 5 А). Обработка клеток КСМЛ-100 15 мкМ ТРСК также не вызывает гибели клеток (Рис 5 Б). Тем не менее, совместная обработка клеток КСМЛ-100 15мкМ ТРСК и 1нМ ФНО вызывала апоптоз в 75% клеток (измерение проводилось, как и в предыдущих экспериментах, методом проточной цитофлуометрии) за 24 часа (Рис 5 В). Таким образом, ТРСК в низких дозах делает клетки КСМЛ-100 чувствительными к апоптотическому действию ФНО, что, возможно, достигается блокировкой активации ИР-кВ, ответственной за предотвращение ФНО-индуцированного апоптоза.

Рис 5.

ТМРарЬа 1пМ, 24 Ь

10° 1С1 " 1С? ' 1Г

ТРСК 15 тюгоМ. 24 П

•У 41'

Г 1ЭЯ П4

ТМ-а1рГ,а 1пМ.

Анашв методом проточной щггофлуорометрин, Закрашенные области соответствуют необработанным клеткам КСМЛ-100 Незп^кшетойв? области представляют «летки КСМЛ-100. обработанные (А)-1 кМ ФНО 24 ч; (Б> 15 мкМ ТРСК. ?,4 ч; (В)- 1 иМ ФИО к 15даМТРСК.2Ьг.

3.5. Трансфекция клеток KCMJI-100 вектором, экспрессирующим 1-кВа суперрепрессор приводит к их гибели.

Для того, чтобы определить, является ли апоптотическое действие ТРСК опосредованно специфическим понижением NF-кВ клетки KCMJI-100 транзиторно котрансфецировали вектором, экспрессирующим ген lacZ под CMV-промотором и вектором, экспрессирующим дикий тип I-кВа под CMV промотором, или вектором, экспрессирующим супер-репрессор I-кВа под CMV промотором. Спустя 2 дня после трансфекции клетки окрашивали in situ для определения экспрессии p-gal. По количеству lacZ -позитивных клеток судили о влиянии котрансфецирующей плазмиды на жизнеспособность клеток (Рис 6). В ходе этих экспериментов мы установили, что и дикий тип I-кВа, и супер-репрессор 1-кВа вызывает 4-5 кратное уменьшение lacZ-позитивных клеток (32±7 на поле для дикого типа, 29±4 для суперрепрессора при 153±17 для пустого вектора в контроле). Параллельно измерялся уровень NF-кВ в исследуемых клетках методом измерения САТ-активности после котрансфекции NF-кВ-зависимым САТ-репортерным вектором и вектором, экспрессирующим дикий тип I-кВа под CMV промотором, или вектором, экспрессирующим супер-репрессор I-кВа. В качестве САТ-репортера использовался вектор pN5, содержащий 5 консенсусных сайтов связывания NF-кВ в регуляторной области гена CAT под минимальным S Y40

Рисунок 6. Влияние ингибиторов р53 и NF-кВ на жизнеспособность клеток KCMJ1-100. Клет-ки KCMJI-100 котрансфецировали вектором, экспрессирую-щим lacZ и векторами, экспрессирующими ген дикого типа (д.т.) I-кВа, ген супер-репрессора I-кВа, гены, кодирующие GSE-22 и Е6. Через 48 часов клетки окрашивали in situ P-gal. По количеству lacZ-позитивных клеток судили о жизнеспособности клеток.

Рисунок 7. Влияние 1-кВа дикого типа (д.т.) и суперрепрессора (с.р.) на транскрипционную актив-ность №-кВ КСМЛ-100. Клетки ко-трансфецировались М^-кВ -зависимой САТ-репортерной плазмидой и векторами, экспре-ссирующими гены, ко-дирующие 1-кВа д.т и с.р. Через 12, 24 и 36 ч измеряли САТ-актив-ность в экстрактах. промотором и вектор рН6. Плазмида рН6 имела структуру, аналогичную pN5, но сайты NF-кВ были мутированы так, что не связывали NF-кВ комплексы. САТ-активность измерялась через различные промежутки времени: 12, 24 и 36 ч после трансфекции. При трансфекции плазмидой рН6 наблюдалось уменьшение САТ-сигнала в случае котрансфекции как с plkB-mut, так и с plkB-wt: в 10 раз за 12 ч, в 6 раз за 24 ч, в 6 раз за 36 ч. Поскольку эта кинетика совпадает с кинетикой гибели клеток, мы использовали ее для нормализации данных, полученных с помощью pN5. Мы обнаружили, что котрансфекция pN5 с р\кВ-тШ вызывала эффективную блокировку NF-кВ-зависимой транскрипции. Понижение САТ-сигнала зависело от времени и варьировало (после нормализации по рН6) от 40 раз за 12 ч до 25 раз за 24 ч и 15 раз за 36 ч. (Рис 7). plKB-w/ оказывало меньшее негативное влияние на NF-кВ-зависимую транскрипцию: 7 раз за 12 , 5 за 24, 3 за 36 ч.

3.6. Микроинъекция вектора, экспрессирующего суперрепрессор IkB-a в клетки KCMJI-100 приводила к фрагментации ядер.

Чтобы удостоверится в том, что падение уровня ядерного NF-кВ, вызванное обработкой ТРСК, было причиной апоптоза в клетках KCMJI-100, мы микроинъецировали в эти клетки вектора р1кВ-тм/ и pRc-CMV. Эффективность трансфекции оценивали с помощью микроинъекции вектором, экспрессирующим (З-gal. В каждом эксперименте микроинъецировались примерно 200 клеток. Экспрессию {З-gal оценивали спустя 24 ч in situ окрашиванием X-Gal. После микроинъекций выживало примерно 70% клеток. Мы обнаружили, что примерно в

30% клеток введение конструкции, экспрессирующей 1кВ-тШ (с.р.) вызывало фрагментацию ядер (Рис 8).

Введение же рЫс-СМУ не вызывало увеличение количества клеток с фрагментированными ядрами по сравнению с неинъецированными клетками. Параллельно клетки окрашивались Х-Оа1 и пропидиум иодидом. Окрашенные пропидиум иодидом клетки анализировались с помощью флуоресцентного контроль ж V • - Г ,, Явив Ж- j AL.1 * щ* г* * I ^

Рисунок 8. Клетки KCMJI-100 были микро-инъецированны векто-рами pRc-CMV (контроль) или plkB-mut (I-kB с.р.) вместе с вектором, экспрессирующим P-gal Клетки окрашивались in situ с помощью X-Gal. микроскопа. Было обнаружено, что примерно в 20% клеток, окрашенных Х-Оа1 хроматин был конденсирован. Таким образом, специфическое ингибирование конститутивного ЫБ-кВ приводило к апоптозу в клетках КСМЛ-100.

3.7. Понижение уровня активного №-кВ с помощью ТРСК и 1-кВа не влияет на уровень с-тус, но вызывает резкое падение уровня р53 в клетках КСМЛ-100.

Методом задержки ДНК-белковых комплексов в геле было показано, что обработка клеток 50мкМ ТРСК вызывает небольшое увеличение уровня активного с-тус в течении 1 часа, после чего уровень с-тус возвращается к исходному (Рис 9 А). Уровень же активного ядерного р53 существенно падает в течение 1 часа после обработки и продолжает падать через 3 и 7 часов. Определение общего уровня с-тус и р53 в этих клетках методом Вестерн-блот анализа дало следующий результат: уровень с-тус остается неизменным (данные не показаны), в то время как уровень и ядерного, и тотального р53 катастрофически падает в течении первых 7 часов после обработки ТРСК (Рис 9 Б). Клетки также котрансфецировали р53-зависимым САТ-репортерным вектором и векторм, экспрессирующим суперрепрессор 1-кВа. Было обнаружено, что экспрессия суперрепрессора 1-кВа вызывает 4-5-кратное падение р53-зависимой транскрипционной активности за 24 часа (Рис 9 В). Таким образом, падение уровня ОТ-кВ вызывает падение общего уровня белка р53, ДНК связывания р53 и р53-зависимой транскрипции. л \ ТРСК, !г ' ттш 50мкМ 7 ' часы ¡щ* Щ ОеИ

1 с-тус р53 Б

ТРСК. ЗОмкМ .

О 1 2 3 чаш

Рисунок 9. А- Влияние ТРСК на уровень ядерных белков с-шус и р53. Ядерные экстракты из клеток КСМЛ-100 после обработки 50 мкМ ТРСК исполь-зовали в реакции связывания с кон-сенсусными олиго-нуклеотидами для р53, с-тус и Ос1;-1. Стрелки указывают на ДНК-белковые комп-лексы. Цифры над авторадиограммой обознача-ют время обработ-ки в часах. Б- Вли-яние ТСРК на уро-вень белка р53 в ядерных и тоталь-ных экстрактах из клеток КСМЛ-100. Клетки обрабатывали 50 мкМ ТРСК в течение 1, 2 и 3 ч, выделенные из них ядерные и тотальные белки разделяли в 15%-ном денатурирующем ПААГ и гибридизовали с антителами к р53. В- Влияние С8Е-22, Е6 и суперрепрессора 1-кВа на транскрипционную активность р53 в клетках КСМЛ-100. Клетки котрансфецировались р53-зависимой САТ-репортерной плазмидой и векторами, экспрессирующими гены, кодирующие 08Е-22, Е6 и суперрепрессор 1-кВа. Через 24 часа измеряли САТ-активность в экстрактах.

3.8. р53 функционально активен в клетках KCMJI-100.

Методом полимеразной цепной реакции была амплифицирована кДНК гена р53 из клеток KCMJI-100. Продукт амплификации изолировался из продуктов амплификации для определения первичной структуры ДНК методом автоматического сиквенса. Таким образом достигалось представление всех аллельных вариантов. Была обнаружена одна замена в положении 93 от ATG кодона, не изменяющая кодируемой аминокислоты. В наших экспериментах р53 связывается с сайтом из регуляторной области р21 и трансактивирует р53-зависимый промотор, регулирующий активность гена хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT); эта транскрипционная активация может быть понижена экспрессией GSE-22, белка, способного связываться с эндогенным р53 и блокировать его трансактивационную активность (Рис 9 В). Все эти данные говорят о том, что р53 функционально активен в клетках KCMJI-100.

3.9. Для выживания клеток KCMJI- 100 необходим высокий уровень белка р53, а не его трансактивационная активность.

GSE-22 является укороченной формой р53, которая связывается с эндогенным р53, блокируя его способность к трансактивации. Обычно это приводит к стабилизации белка р53. Е6 - вирусный белок, связывающий р53 и вызывающий его транслокацию в цитоплазму и быструю деградацию. Клетки KCMJT-100 котрансфецировали вектором, экспрессирующим GSE-22 и или р53-зависимым САТ-репортерным вектором, или вектором, экспрессирующим lacZ. Как и ожидалось, GSE-22 понижал уровень р53-зависимой трансактивации (Рис 9

В). При этом в случае 1асг 08Е-22 не влиял на количество 1ас2-позитивных клеток, а значит, на жизнеспособность клеток (Рис 6). Аналогичные эксперименты с использованием вектора, экспрессирующего Е6 вместо вектора, экспрессирующего С8Е-22, показали, что Е6 понижает и количество ¡acZ -позитивных клеток(Рис 6), и р53-зависимый САТ-сигнал (Рис 9 В) примерно в 5 раз. Таким образом, именно понижение уровня белка р53, но не уровня р53-зависимой трансактивации приводит к гибели клеток.1

3.10 Белок 1-кВа стабилен в клетках КСМЛ-100 и короткоживущ в клетках КСМЛ-0.

Эксперименты по определению времени жизни 1-кВа в клетках КСМЛ-0 и КСМЛ-100 привели к неожиданным на первый взгляд результатам: в клетках КСМЛ-100, в которых уровень ядерного №-кВ значительно выше, чем в клетках КСМЛ-0 1-кВа значительно стабильнее, чем в клетках КСМЛ-0 (время полужизни 5 ч в КСМЛ-100 против 15 мин в КСМЛ-0) (Рис 10). Эти данные показали необходимость более детального изучения регуляции 1-кВа в клетках КСМЛ-0 и КСМЛ-100. и 1 1

1 йрем (ч)

КСМЛ-100 шйошгексимид

КСМЛ-0 цгаелогекшмвд

КСМЛ-100

ФНО

Рисунок 10. Время жизни белка 1-кВа в клетках КСМЛ-0 и КСМЛ-100. Клетки КСМЛ-100 и КСМЛ-0 обрабатывали циклогексимидом или 1нМ ФНО, экстракты из этих клеток анализировали методом иммуноблоттинга. Видно, что в клетках КСМЛ-100 1-кВа долго- а в клетках КСМЛ-0 короткоживущий. При этом и в клетках КСМЛ-0 (данные не показаны), и в клетках КСМЛ-100 1-кВа быстро деградирует под действием ФНО

3.11. Доминантно-негативный ТКАР-2 подавляет активность ОТ-кВ в клетках КСМЛ-0, но не в клетках КСМЛ-100.

Клетки КСМЛ-0 и КСМЛ-100 котрансфецировали ОТ-кВ-зависимой САТ-репортерной конструкцией и векторами, экспрессирующими ТИАР-2 дикого типа и Т11АР-2 с доминантно-негативной мутацией, позволяющей мутантной форме белка ингибировать функцию дикого типа Т11АР-2 за счет способности связываться с вышестоящими в данном регуляторном каскаде белками и неспособности передавать сигнал нижестоящим белкам. В клетках КСМЛ-0 дикий тип Т11АР-2 вызывал увеличение, в то время как мутантный Т11АР-2 вызывал резкое падение уровня ОТ-кВ-зависимой транскрипции. Данные, что в клетках КСМЛ-0 ингибирование эндогенного ТЯАР-2 приводит к блокировке конститутивной активации ИР-кВ говорят о том, что в интактных клетках Т11АР-2 постоянно активирует транслокацию МР-кВ в ядро путем активации деградации 1-кВа.

Напротив, в клетках КСМЛ-100 ни дикий тип ТКАР-2, ни мутантный ТИАР-2 не приводили к существенным изменениям ОТ-кВ-зависимого САТ-сигнала (Рис 11).

Таким образом, в клетках КСМЛ-0, в отличие от клеток, КСМЛ-100 путь фосфорилирования и деградации 1-кВа конститутивно активен, что и приводит к повышенному уровню №-кВ.

3.12. ОТ-кВ комплексы не связаны с 1-кВа в клетках КСМЛ-100.

Данные о том, что дикий тип ТКАР-2 не влияет на уровень ИР-кВ-зависимой транскрипции в клетках КСМЛ-100 позволили нам сделать предположение, что повышение уровня фосфорилирования и, как следствие, деградации 1-кВа не влияет на уровень ядерного ЫБ-кВ в этих клетках. Эксперименты по иммунопрецепитации показали, что в клетках КСМЛ-100 комплексы ЫР-кВ не связаны с 1-кВа и связаны с 1-кВр с низкой афинностью. В клетках КСМЛ-0 комплексы №-кВ связаны с 1-кВа с высокой, а с 1-кВр с низкой афинностью (Рис 12). При этом общий уровень ОТ-кВ и 1-кВ белков в этих клетках не отличаются. я о и

I— 2

Iе™

КСМЛ4 4 5 г d к

CSl 2

КСМЛ-100

Рисунок 11. NF-кВ-зависимая САТ-активность. Клетки KCMJI-0 и KCMJI-lOO котрансфецировались NF-кВ -зависимой CAT репор-терной плазмидой pSVCATN5 и векторами, экспрессирующими дикий тип TRAF-2 или TRAF-2 с доминтно-негативной му-тацией. Спустя 48 часов из этих клеток получали экстракты, в которых затем методом тонко-слойной хромотографии измерялась CAT активность (активность хлорамфеник-олацетилтрансферазы). Для каждого типа клеток за 100% принималась CAT активность в соответ-ствующем контроле.

Таким образом, нами исследованы два новых механизма поддержания высокого уровня №-кВ в клетках КСМЛ-0 и КСМЛ-100. В клетках КСМЛ-0 конститутивно активен путь фосфорилирования и деградации 1-кВа, что приводит к короткому времени жизни этого белка и повышенному уровню ядерного ОТ-кВ. В клетках КСМЛ-100 молекулы 1-кВа не связаны с ОТ-кВ, что также приводит к повышенному уровню транскрипционного фактора №-кВ в ядре.

3.13. ТРСК индуцирует в клетках КСМЛ-100 неизвестный полипептид с молекулярной массой около 58 кДа (р58), который связывается с №-кВ.

Оставалось неясным, каковы точные механизмы понижения ядерного уровня №-кВ в клетках КСМЛ-100 в ответ на обработку ТРСК. Эксперименты показали, что ТРСК не вызывает понижения общего уровня ТЧР-кВ. Это говорит о том, что понижение уровня №-кВ под действием ТРСК происходит путем транслокации №-кВ из ядра в цитоплазму. Тем не менее, ни один из описанных в литературе 1-кВ белков не вовлечен в этот процесс. 1-кВа не связан с ИР-кВ в клетках КСМЛ-100. Белки 1-кВв и I- кВу в этих клетках не детектируются, что было показано методом иммуноблота. Уровень белков 1-кВр, Ьс1-3 и 1-кВа не претерпевает изменений под действием ТРСК. Для определения того, какой белок вовлечен в быстрое падение уровня №-кВ в клетках КСМЛ-100 под действием

1С

ТРСК клетки обрабатывали радиоактивно меченым [Б ]- метионином и затем

Рисунок 12.

Иммунопреципитация. А. Тотальные экстракты из клеток Ш КСМЛ-0 (дор. 1-3) и КСМЛ-100 (дор. 4-6) преципитировали с антителами к 1-кВа (Santa Cruz, sc203) (дор. 1 и 4), полученый супернатант повторно преципитировали с антителами к I-кВа (дор. 2 и 5), полученый супернатант преципитировали с антителами к р65 (RelA) (sc372), (дор. 3 и 6). После этого все преципитаты разделяли в денатурирующем полиакриломидном геле и окрашивали антителами к р65 (Reí А). Таким образом, 1 и 2 ^ дор. (4 и 5 для КСМЛ-100) дорожки представляют собой р65, связаный с 1-кВа; 3 дорожка (6 для КСМЛ-100) представляет собой не связаный с 1-кВа р65. Стрелка указывают на положение специфических полос. Б. Тотальные экстракты из клеток КСМЛ-0 (дор. 1-3) и КСМЛ-100 (дор. 4-6) преципитировали с антителами к 1-кВр (sc945) (дор. 1 и 4), полученый супернатант повторно преципитировали с антителами к I-KBß (дор. 2 и 5), полученый супернатант преципитировали с антителами к р65 (RelA) (дор. 3 и 6). После этого все преципитаты разделяли в денатурирующем ПААГ и окрашивали антителами к р65 (Reí А). Таким образом, 1 и 2 дор. (4 и 5 для КСМЛ-100) дорожки представляют собой р65, связаный с 1-KBß; 3 дорожка (6 для КСМЛ-100) представляет собой не связаный с 1-KBß р65. Стрелка указывают на положение специфических полос. Во всех случаях гибридизация детектировалась с помощью вторичных антител, ковалентно сшитых с пероксидазой хрена. обрабатывали ТРСК в течение 20 мин. Тотальные экстракты из этих клеток преципитировали с антителами к №-кВ белкам р50, 11е1А/р65 и 11е1В/р68. Преципитат разделяли в 10% ПААГ. Была детектирована одна полоса, соответствующая белку с молекулярной массой около 58 кДа, которая существенно увеличивалась после обработки ТРСК (Рис 13). Все остальные полосы оставались неизменными. Таким образом можно сделать вывод о том, что обработка клеток КСМЛ-100 ТРСК в течение 20 минут приводит к быстрой аккумуляции неизвестного полипептида с молекулярной массой около 58 кДа, который связывается с ИР-кВ-белками и предположительно относится к семейству 1-кВ.

КСМЛ-0 КСМЛ-100 а I о. й 33 и Ц о зй V о Р

Рисунок 13. Авто-радиограмма преципитата с ОТ-кВ белками экстрактов из [835]- метионин-меченых клеток КСМЛ-100 и КСМЛ-0 после разделения в 10% ПААГ. Указаны полосы, соответствующие белкам р65/Яе1А, р50 и неизвестного белка "р58". р65(Ие! А) выводы.

1.Высокий уровень Ж-кВ необходим клеткам КСМЛ-0 и КСМЛ-100 для их жизнедеятельности. Понижение этого уровня вводит клетки КСМЛ-0 и КСМЛ-100 в апоптоз.

2.Низкие дозы ТРСК, незначительно понижающие уровень ОТ-кВ в клетках КСМЛ-100 не вводят эти клетки в апоптоз, но делают их чувствительными к цитототоксическому действию ФНО.

3. Понижение уровня активного ОТ-кВ с помощью ТРСК и 1-кВа не влияет на уровень с-шус, но вызывает резкое падение уровня р53 в клетках КСМЛ-100.

4. Для выживания клеток КСМЛ-100 необходим высокий уровень белка р53, а не его трансактивационная активность.

5. Высокий конститутивный уровень ядерного ИР-кВ в клетках КСМЛ-0 обусловлен тем, что Т11АР-2 постоянно активирует транслокацию №-кВ в ядро путем активации деградации 1-кВа .

6. Высокий конститутивный уровень ядерного КБ-кВ в клетках КСМЛ-100 обусловлен тем, что ОТ-кВ комплексы не связаны с 1-кВа в этих клетках .

7. ТРСК индуцирует в клетках КСМЛ-100 неизвестный полипептид с молекулярной массой около 58 кДа (р58), который связывается с ОТ-кВ.

Список литературы.

1. DiDonato J.A., Hayakawa M., Rothwarf D.M., Zandi E. and Karin M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. // Nature. 1997. V. 388. P. 548-554. l.Traenckner E.B., Pähl H.L., Henkel T., Schmidt K.N., WilkS., Baeuerle P.A. Phosphorylation of human I kappa B-alpha on serines 32 and 36 controls I kappa B-alpha proteolysis and NF-kappa B activation in response to diverse stimuli. //EMBO J. 1995. V.14. P. 2876-2883. 3. Regnier C.H., SongH.Y., GaoX., GoeddelD. V., Cao Z, Rothe M. Identification and characterization of an IkappaB kinase.// Cell. 1997. V. 90. P. 373-383.

4. Chen Z., HaglerJ., Palombella V.J., Melandri F., Scherer D., Ballard D., Maniatis T. Signal-induced site-specific phosphorylation targets I kappa B alpha to the ubiquitin-proteasome pathway // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 1586-1597.

5. Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences.// Cell. 1986. V. 46. P. 705-716.

6. Sen R, Baltimore D. Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein

Nf-kappa B by a posttranslational mechanism.// Cell 1986, V. 47. P. 921-928.

7. Lenardo M, Pierce JW, Baltimore D, Protein-binding sites in Ig gene enhancers determine transcriptional activity and inducibility.// Science, 1987, V. 236. P. 1537-1577.

8. Baeuerle PA, Baltimore D Activation of DNA-binding activity in an apparently cytoplasmic precursor of the NF-kappa B transcription factor.//

Cell. 1988. V. 53. P.211-217.

9. Kawakami K, Scheidereit C, Roeder RG Identification and purification of a human immunoglobulin-enhancer-binding protein (NF-kappa B) that activates transcription from a human immunodeficiency virus type 1 promoter in vitro.// Proc Natl Acad Sei USA. 1988. V. 85. P. 4700-4704.

10. Zabel U, Schreck R, Baeuerle PA. DNA binding of purified transcription factor NFkappa B. Affinity, specificity, Zn2+ dependence, and differential half-site recognition.// J Biol Chem. 1991. V. 266. P. 252-260.

11. Ghosh S, Gifford AM, Riviere LR, Tempst P, Nolan GP, Baltimore D. Cloning of the p50 DNA binding subunit of NF-kappa B: homology to rel and dorsal.// Cell. 1990. V. 62. P. 1019-1029.

12. Gilmore TD. NF-kappa B, KBF1, dorsal, and related matters.//

Cell. 1990. V. 62. P. 692-694.

13. Stephens RM, Rice NR, Hiebsch RR, Bose HR Jr, Gilden RVNucleotide sequence of v-rel: the oncogene of reticuloendotheliosis virus.// Proc Natl Acad Sei U S A. 1983. V. 80. P. 6229-6232.

14. Steward R. Dorsal, an embryonic polarity gene in Drosophila, is homologous to the vertebrate proto-oncogene, c-rel.// Science. 1987. V. 238. P. 692-694.

15. Palombella VJ, Rondo OJ, Goldberg AL, Maniatis T. The ubiquitin-proteasome pathway is required for processing the NF-kappa B1 precursor protein and the activation of NF-kappa B.// Cell. 1994. V. 78. P. 773-785.

16. Bours V, Burd PR, Brown K, Villalobos J, ParkS, RyseckRP, Bravo R, Kelly K,

Siebenlist U. A novel mitogen-inducible gene product related to p50/pl05-NF-kappa B participates in transactivation through a kappa B site.// Mol Cell Biol.

1992. V. 12. P. 685-695.

17. Kunsch C, Ruben SM, Rosen CA. Selection of optimal kappa B/Rel DNA-binding motifs: interaction of both subunits of NF-kappa B with DNA is required for transcriptional activation.//Mol Cell Biol. 1992. V. 12. P. 4412-4421.

18 .Kieran M, Blank V, Logeat F, Vandekerckhove J, Lottspeich F, Le Bail O, Urban MB, Kourilsky P, Baeuerle PA, Israel A. The DNA binding subunit of NF-kappa B is identical to factor KBF1 and homologous to the rel oncogene product. Cell. 1990. V. 62. P.1007-1018.

19. Plaksin D, Baeuerle PA, Eisenbach L. KBF1 (p50 NF-kappa B homodimer) acts as a repressor of H-2Kb gene expression in metastatic tumor cells.// J. Exp. Med.

1993. V. 177. P. 1651-1662.

20. Haskill S, BegAA, Tompkins SM, Morris JS, Yurochko AD, Sampson-Johannes A,

Mondal K, Ralph P, Baldwin AS Jr. Characterization of an immediate-early gene induced in adherent monocytes that encodes I kappa B-like activity.// Cell. 1991. V.28;V. 65. P. 1281-1289.

21. Hatada EN, Nieters A, Wulczyn FG, Naumann M, Meyer R, Nucifora G, McKeithan

TW, Scheidereit C. The ankyrin repeat domains of the NF-kappa B precursor pi 05 and the protooncogene bcl-3 act as specific inhibitors of NF-kappa B DNA binding.// Proc Natl Acad Sei U S A 1992. V. 89. P.2489-93.

22. Nolan GP, Ghosh S, Liou HC, Tempst P, Baltimore D. DNA binding and I kappa B inhibition of the cloned p65 subunit of NF-kappa B, a rel-related polypeptide.// Cell. 1991. V. 64. P. 961-969.

23. Schmid RM, Perkins ND, Duckett CS, Andrews PC, Nabel GJ. Cloning of an NFkappa B subunit which stimulates HIV transcription in synergy with p65. //Nature. 1991. V. 352. P. 733-736.

24. Ruben SM, Narayanan R, KlementJF, Chen CH, Rosen CA Functional characterization of the NF-kappa B p65 transcriptional activator and an alternatively spliced derivative.// Mol Cell Biol. 1993. V. 12. P. 444-454.

25. Perkins ND, Schmid RM, Duckett CS, Leung K, Rice NR, Nabel GJ

Distinct combinations of NF-kappa B subunits determine the specificity of transcriptional activation.// Proc Natl Acad Sei USA. 1992. V. 89. P. 1529-1533.

26. Lenardo MJ, Kuang A, Gifford A, Baltimore D NF-kappa B protein purification from bovine spleen: nucleotide stimulation and binding site specificity. //Proc Natl Acad Sei U S A. 1988. V. 85. P. 8825-8829.

27. Shimizu H, Mitomo K, Watanabe T, Okamoto S, Yamamoto K Involvement of a NFkappa B-like transcription factor in the activation of the interleukin-6 gene by inflammatory lymphokines.// Mol Cell Biol. 1990. V. 10,P. 561-568.

28. Libermann TA, Baltimore D Activation of interleukin-6 gene expression through the

NF-kappa B transcription factor.//Mol Cell Biol. 1990 V. 10. P. 2327-2334.

29. Mukaida N, Make Y, Matsushima K Cooperative interaction of nuclear factor-kappa

B- and cis-regulatory enhancer binding protein-like factor binding elements in activating the interleukin-8 gene by pro-inflammatory cytokines.// J Biol Chem. 1990. V. 265. P. 21128-21133."

30. Make Y, Mukaida N, Kuno K, Akiyama M, Ikeda N, Matsushima K, Murakami S

Hepatitis B virus X protein transactivates human interleukin-8 gene through acting on nuclear factor kB and CCAAT/enhancer-binding protein-like cis-elements.// J Biol Chem 1991. V. 266. P. 13759-13736.

31. Jamieson C, Mauxion F, Sen R Identification of a functional NF-kappa B binding site in the murine T cell receptor beta 2 locus.// 1989. J. Exp. Med. V. 170. P. 17371743.

32. Baldwin GC, Gasson JC, Quan SG, Fleischmann J, Weisbart R, Oette D, Mitsuyasu

RT, Golde DW Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances neutrophil function in acquired immunodeficiency syndrome patients.// Proc Natl Acad Sci USA. 1988 V. 85. P. 723-727.

33. Israel A, Le Bail O, Hatat D, Piette J, Kieran M, LogeatF, Wallach D, Fellous M,

Kourilsky P TNF stimulates expression of mouse MHC class I genes by inducing an NF kappa B-like enhancer binding activity which displaces constitutive factors.// 1989. EMBO J. V. 8. P. 3793-3800.

34. Blanar MA, BurJkly LC, Flavell RA NF-kappa B binds within a region required for Bcell-specific expression of major histocompatibility complex class II gene E alpha d. Mol Cell Biol 1989. V. 9. P. 844-846.

35. Schreck R, Zorbas H, Winnacker EL, Baeuerle PA The NF-kappa B transcription factor induces DNA bending which is modulated by its 65-kD subunit. Nucleic Acids Res 1990. V. 18. P. 6497.

36. Nishizawa M, Tsuchiya M, Watanabe-Fukunaga R, Nagata S Multiple elements in the promoter of granulocyte colony-stimulating factor gene regulate its constitutive expression in human carcinoma cells. J Biol Chem 1990 V. 265. P. 5897-5902.

37. Shakhov AN, Collart MA, Vassalli P, Nedospasov SA, Jongeneel CVKappa B-type enhancers are involved in lipopolysaccharide-mediated transcriptional activation of the tumor necrosis factor alpha gene in primary macrophages.// J Exp Med 1990. V. 171. P. 35-47.

38. Collart MA, Baeuerle P, Vassalli P Regulation of tumor necrosis factor alpha transcription in macrophages: involvement of four kappa B-like motifs and of constitutive and inducible forms of NF-kappa B.// Mol Cell Biol 1990. V. 10. P. 1498-1506.

39. Kuprash DV, Nedospasov SA Interaction of transcription factors of the NF-kappa

B/rel family with DNA leads to significant bending of it at binding segments.//Dokl Akad Nauk SSSR. 1992. V. 322. P. 421-426.

40. Paul NL, Lenardo MJ, Novak KD, Sarr T, Tang WL, Ruddle M/Lymphotoxin activation by human T-cell leukemia virus type I-infected cell lines: role for NF-kappa B.// J. Virol. 1990. V. 64. P. 5412-5419.

41. Messer G, Weiss EH, Baeuerle PA Tumor necrosis factor beta (TNF-beta) induces binding of the NF-kappa B transcription factor to a high-affinity kappa B element in the TNF-beta promoter.// Cytokine. 1990. V. 2. P. 389-397.

42. Visvanathan KV, Goodbourn S Double-stranded RNA activates binding of NF-kappa

B to an inducible element in the human beta-interferon promoter. // EMBO J. 1989. V. 8. P. 1129-1138.

43. Fujita T, Miyamoto M, Kimura Y, Hammer J, Taniguchi T Involvement of a ciselement that binds an H2TF-1/NF kappa B like factor(s) in the virus-induced interferon-beta gene expression .//Nucleic Acids Res. 1989. V. 17. P.3335-3346.

44. Yu DY, Huang ZM, Murakami S, Takahashi M, Nonaka M Specific binding of a hepatoma nuclear factor to the NF.kappa B/H2TF1 recognition motif found in the C4 promoter, but not in the Sip promoter.// J Immunol. 1989. V. 143. P. 23952400

45. La Rosa F.A., Pierce J. W., Sonenshein G.E. Differential regulation of the c-myc oncogene promoter by the NF-kappa B rel family of transcription factors.// Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 1039-1044.

46. Nabel G, Baltimore D An inducible transcription factor activates expression of human immunodeficiency virus in T cells.// Nature. 1987. V. 326. P. 711-713.

47. Kanno M, Fromental C, Staub A, Ruffenach F, Davidson I, Chambon P. The SV40

TC-II(kappa B) and the related H-2Kb enhansons exhibit different cell type specific and inducible proto-enhancer activities, but the SV40 core sequence and the AP-2 binding site have no enhanson properties.// EMBO J. 1989. V. 8. P. 4205-14.

48. Sambucetti LC, Cherrington JM, Wilkinson GW, Mocarski ES NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.// EMBO J. 1989. V. 8. P. 4251-4258.

49. Williams JL, Garcia J, Harrich D, Pearson L, Wu F, Gaynor R Lymphoid specific gene expression of the adenovirus early region 3 promoter is mediated by NF-kappa B binding motifs.// EMBO J. 1990. V. 9. P. 4435-4442.

50. Jamieson C, McCaffrey PG, Rao A, Sen R Physiologic activation of T cells via the T cell receptor induces NF-kappa B.// J Immunol. 1991. V. 147. P.416-420.

51. Liou EC, Sha WC, Scott ML, Baltimore D Sequential induction of NF-kappa B/Rel family proteins during B-cell terminal differentiation.// Mol Cell Biol. 1994. V. 14. P. 5349-5359.

52. Liu ZP, Galindo RL, Wasserman SA A role for CKII phosphorylation of the cactus

PEST domain in dorsoventral patterning of the Drosophila embryo.// Genes Dev. 1997. V. 11. P. 3413-3422.

53. Franzoso G, Carlson L, XingL, PoljakL, Shores EW, Brown KD, LeonardiA, Tran

T, Boyce BF, Siebenlist U. Requirement for NF-kappaB in. osteoclast and B-cell development.// Genes Dev. 1997 V. 11. P. 3482-3496.

54. Zabel U, Baeuerle PA Purified human I kappa B can rapidly dissociate the complex of the NF-kappa B transcription factor with its cognate DNA.// Cell. 1990. V. 61. P. 255-265.

55. Whiteside ST, EpinatJC, Rice NR, Israel A I kappa B epsilon, a novel member of the

I kappa B family, controls RelA and cRel NF-kappa B activity.// EMBO J. 1997. V. 16. P.1413-1426.

56. Miyamoto S, Verma /MRel/NF-kappa B/I kappa B story.// Adv Cancer Res. 1995. V.

66. P. 255-92.

57. Lernbecher T, Kistler B, Wirth TTwo distinct mechanisms contribute to the constitutive activation of RelB in lymphoid cells.// EMBO J. 1994. V. 13. P. 4060-4069.

58. Tran K, Merika M, Thanos D Distinct functional properties of IkappaB alpha and

IkappaB beta.// Mol Cell Biol. 1997. V. 17. P. 5386-5399.

59. Bours V, Franzoso G, Azarenko V, ParkS, Kanno T, Brown K, Siebenlist t/The oncoprotein Bcl-3 directly transactivates through kappa B motifs via association with DNA-binding p50B homodimers.// Cell. 1993. V. 72. P. 729-739.

60. Wulczyn FG, Naumann M, Scheidereit C Candidate proto-oncogene bcl-3 encodes a subunit-specific inhibitor of transcription factor NF-kappa B.// Nature. 1992. V. 358. P. 597-599.

61. Cheng Q, CantCA, MollT, Hofer-Warbinek R, Wagner E, Birnstiel ML, Bach FH, de Martin R NK-kappa B subunit-specific regulation of the I kappa B alpha promoter.// J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 13551-13557.

62. Molitor J A, Walker WH, Doerre S, Ballard DW, Greene WC NF-kappa B: a family of inducible and differentially expressed enhancer-binding proteins in human T cells.// Proc Natl Acad Sci U S A 1990. V. 87. P. 10028-10032.

63. Tran K, Merika M, Thanos D Distinct functional properties of IkappaB alpha and

IkappaB beta.//Mol Cell Biol. 1997. V. 17. P. 5386-5399.

64. Naumann M, Wulczyn FG, Scheidereit C The NF-kappa B precursor pi05 and the proto-oncogene product Bcl-3 are I kappa B molecules and control nuclear translocation of NF-kappa B. EMBO J. 1993. V. 12. P. 213-222.

65. Gromkowski SH, Mama K, Yagi J, Sen R, Rath S Double-stranded RNA and bacterial lipopolysaccharide enhance sensitivity to TNF-alpha-mediated cell death. // Int Immunol. 1990. V. 2. P. 903-908.

66. Freimuth WW, DepperJM, Nabel GJ Regulation of the IL-2 receptor alpha-gene.

Interaction of a kappa B binding protein with cell-specific transcription factors.// J Immunol. 1989. V. 143. P. 3064-3068.

67. Osborn L, KunkelS, Nabel GJ Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1 stimulate the human immunodeficiency virus enhancer by activation of the nuclear factor kappa B.// Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. P. 2336-2340.

68. Hazan U, Thomas D, AlcamiJ, Bachelerie F, Israel N, Yssel H, Virelizier JL,

Arenzana-Seisdedos F Stimulation of a human T-cell clone with anti-CD3 or tumor necrosis factor induces NF-kappa B translocation but not human immunodeficiency virus 1 enhancer-dependent transcription. // Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87. P. 7861-7865.

69. Shurman L, Sen R, Bergman Y Adenovirus El A products activate the Ig k-chain enhancer in fibroblasts. A possible involvement of the NF-kB binding site.//J Immunol. 1989. V. 143. P. 3806-3812.

70. Gimble JM, Duh E, Ostrove JM, Gendelman HE, Max EE, Rabson AB Activation of the human immunodeficiency virus long terminal repeat by herpes simplex virus type 1 is associated with induction of a nuclear factor that binds to the NF-kappa B/core enhancer sequence.// J Virol. 1988. V. 62. P. 4104-4112.

71. Ensoli B, Lusso P, Schachter F, Josephs SF, Rappaport J, Negro F, Gallo RC, Wong-Staal F Human herpes virus-6 increases HIV-1 expression in co-infected T cells via nuclear factors binding to the fflV-1 enhancer.//EMBO J. 1989. V. 8. P. 3019-3027.

72. Lenardo MJ, Fan CM, Maniatis T, Baltimore D The involvement of NF-kappa B in beta-interferon gene regulation reveals its role as widely inducible mediator of signal transduction.// Cell. 1989. V. 57. P. 287-294.

73. Sambucetti LC, Cherrington JM, Wilkinson GW, Mocarski ES NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.// EMBO J 1989. V. 8. P. 4251-4258.

74. Schreck R, Rieber P, Baeuerle PA Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1.// EMBO J. 1991. V. 10. P. 2247-2258.

75. Stein B, Kramer M, RahmsdorfHJ, PontaH, Herrlich P UV-induced transcription from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) long terminal repeat and

UV-induced secretion of an extracellular factor that induces HIV-1 transcription in nonirradiated cells,// J Virol. 1989. V. 63. P. 4540-4544.

76. Webster G.A., Perkins N.D. Transcriptional cross talk between NF-kappaB and p53. Mol. Cel. Biol. 1999 May. V. 19. P. 3485-3495.

77. Chen ZJ, Parent L, Maniatis T Site-specific phosphorylation of IkappaBalpha by a novel ubiquitination-dependent protein kinase activity. // Cell. 1996. V. 84. P.

853-862.

78. Ravi R., Mookerjee B., van Hensbergen Y., Berdi G.C., Giordano A., El-Deiry W.S., Fuchs E.J., Berdi A. p53-mediated repression of nuclear factor-kappaB RelA via the transcriptional integrator p300. // Cancer Res. 1998 . V. 58. P. 4531-4536.

79. Hohmann HP, Kolbeck R, Remy R, van Loon AP Cyclic AMP-independent activation of transcription factor NF-kappa B in HL60 cells by tumor necrosis factors alpha and beta.//Mol Cell Biol. 1991. V. 11. P. 2315-2318.

80. Pennica D, Nedwin GE, HayflickJS, Seeburg PH, DerynckR, Palladino MA, Kohr WJ, Aggarwal BB, Goeddel DVHuman tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin.// Nature. 1984. V. 312. P. 724-729.

81. Hahn T, Toker L, Budilovsky S, Aderka D, Eshhar Z, Wallach D Use of monoclonal antibodies to a human cytotoxin for its isolation and for examining the self-induction of resistance to this protein.// Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. P. 3814-3818.

82. Opipari AW Jr, Hu HM, Yabkowitz R, Dixit VMThe A20 zinc finger protein protects cells from tumor necrosis factor cytotoxicity.//! Biol Chem. 1992. V. 267. P. 1242412427.

83. Wong GH, ElwellJH, Oberley LW, Goeddel DVManganous superoxide dismutase is essential for cellular resistance to cytotoxicity of tumor necrosis factor.// Cell. 1989. V. 58. P. 923-931.

84. Chu ZL, McKinsey TA, Liu L, Gentry JJ, Malim MH, Ballard DW Suppression of tumor necrosis factor-induced cell death by inhibitor of apoptosis c-IAP2 is under NF-kappaB control.// Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. P. 10057-10062.

85. Beg AA, Baltimore D An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alphainduced cell death.// Science. 1996. V. 274. P. 782-784.

86. Nophar Y, Holtmann H, Ber R, Wallach D Dominance of resistance to the cytocidal effect of tumor necrosis factor in heterokaryons formed by fusion of resistant and sensitive cells.// J Immunol V. 140. P. 3456-3460.

87. Wang CY, Mayo MW, Baldwin AS Jr TNF- and cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition ofNF-kappaB.//Science. 1996. V. 274. P. 784-787.

88.BoldinMP, Varfolomeev EE, PancerZ, MettIL, CamonisJH, Wallach D. A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APOl contains a sequence motif related to the death domain.// J Biol Chem. 1995. V. 270. P. 7795-7798.

89. Hsu H, XiongJ, Goeddel DV The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell death and NF-kappa B activation.// Cell. 1995. V. 81. P. 495-504.

90. Stanger BZ, Leder P, Lee TH, Kim E, Seed B RIP: a novel protein containing a death domain that interacts with Fas/APO-1 (CD95) in yeast and causes cell death.// Cell. 1995. V. 81. P. 513-523.

91. KischkelFC, Hellbardt S, BehrmannI, Germer M, PawlitaM, Krammer PH, Peter

ME Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.// EMBO J. 1995. V. 14. P. 5579-5588.

92. Feinstein E, Kimchi A, Wallach D, Boldin M, Varfolomeev E The death domain: a module shared by proteins with diverse cellular functions.// Trends Biochem Sci.

1995. V. 20. P. 342-324.

93. Lin KI, Lee SH, Narayanan R, Baraban JM, HardwickJM, Ratan RR Thiol agents and Bcl-2 identify an alphavirus-induced apoptotic pathway that requires activation of the transcription factor NF-kappa B.// J Cell Biol. 1995. V. 131. P. 1149-1161.

94. Grimm S, Bauer MK, Baeuerle PA, Schulze-Osthoff K Bcl-2 down-regulates the activity of transcription factor NF-kappaB induced upon apoptosis.// J Cell Biol.

1996. V. 134. P. 13-23.

95. Wu H, Lozano G NF-kappa B activation of p53. A potential mechanism for suppressing cell growth in response to stress.// J Biol Chem. 1994. V. 269. P. 20067-20074.

96. Sovak MA, Bellas RE, Kim DW, Zanieski GJ, Rogers AE, Traish AM, Sonenshein GE Aberrant nuclear factor-kappaB/Rel expression and the pathogenesis of breast cancer.// J Clin Invest. 1997. V. 100. P. 2952-2960.

97. Nakshatri H, Bhat-Nakshatri P, Martin DA, Goulet RJJr, Sledge GWJr Constitutive activation of NF-kappaB during progression of breast cancer to hormone-independent growth.// Mol Cell Biol. 1997. V.17. P. 3629-3639.

98. Beauparlant P, KwanI, Bitar R, ChouP, Koromilas AE, SonenbergN, HiscottJ

Disruption of I kappa В alpha regulation by antisense RNA expression leads to malignant transformation.// Oncogene. 1994. V. 9. P. 3189-3197.

99. Bargou R.C., Emmerich F., Krappmann D., BommertK., Marara M.Y., Arnold W.,

Royer H.D., Grinstein E., GreinerA., Scheidereit C., DorkenB. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin's disease tumor cells.// J. Clin. Invest. 1997. V. 100. P. 2961-2969.

100. Mayo MW, Wang CY, Cogswell PC, Rogers-Graham KS, Lowe SW, Der CJ,

Baldwin AS Jr Requirement ofNF-kappaB activation to suppress p53-independent apoptosis induced by oncogenic Ras.// Science. 1997. V. 278. P. 1812-1815.

101. Baichwal VR, Baeuerle PA Activate NF-kappa В or die?// Curr Biol. 1997. V. 7. P.

94-96.

102. MakarovSS, Johnston WN, OlsenJC, Watson JM, MondalK, RinehartC, Has kill JS

NF-kappa В as a target for anti-inflammatory gene therapy: suppression of inflammatory responses in monocytic and stromal cells by stable gene transfer of I kappa В alpha cDNA.// Gene Ther. 1997. V. 4. P. 846-852.

103.Mdniatis T, Fritsch EE, Sambrook J Molecular Cloning, 2-nd ed., New York: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1982.

104. Сенин B.M., Бунцевич A.M., Афанасьева A.B., Киселева M.C., Новый штамм метастазирующей карциносаркомы мышей. // Экспериментальная онкология. 1983. Т. 5. С. 35-39.

105. Scheffner M., Werness B.A., Huibregtse J.M., Levine A.J., Howley P.M. The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promotes the degradation of p53//Cell. 1990. V. 63. P. 1129-36.

106. Ossovskaya V.S., Mazo I.A., Chernov M.V., Chernova O.B., Strezoska Z, Kondratov

R.V., Stark G.R., Chumakov P.M., Gudkov A.V. Use of genetic suppressor elements to dissect distinct biological effects of separate p53 domains.// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 10309-14.

107. Van Antwerp D.J., Martin S.J., Kafri T., Green D.R. Suppression of TNF-alphainduced apoptosis by NF-kB. // Science. 1996. V. 274. P. 787-789.

108. Arced RJTumor cell survival and resistance to therapy.// Curr Opin Hematol.

1996. V.3. P. 279-287.

109. Kiefstrom J., Arighi E., Littlewood T., Jaattela M., Saksela E., Evan G., Alitalo K.

Induction of TNF-sensitive cellular phenotype by c-Myc involves p53 and impaired NF-kappaB activation.//EMBO J. 1997. V. 16. P. 7382-7392.

110. Traenckner EB, Wilk S, Baeuerle PA A proteasome inhibitor prevents activation of

NF-kappa B and stabilizes a newly phosphorylated form of I kappa B-alpha that is still bound to NF-kappa B. // EMBO J. 1994. V. 13. P. 5433-5441.

111. Brown K, Gerstberger S, Carlson L, Franzoso G, Siebenlist U Control of I kappa Balpha proteolysis by site-specific, signal-induced phosphorylation.// Science. 1995. V. 267. P. 1485-1488.

112. Mercurio F, Zhu H, Murray BW, Shevchenko A, Bennett BL, Li J, Young DB,

BarbosaM, Mann M, Manning A, Rao A IKK-1 and IKK-2: cytokine-activated

IkappaB kinases essential for NF-kappaB activation.//Science. 1997. V. 278. P. 860-866.

113. Zandi E, Rothwarf DM, Delhase M, Hayakawa M, Karin MThe IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation.//Cell. 1997. V. 91. P. 243-252.

114. Beg AA, Sha WC, Bronson RT, GhoshS, Baltimore D Embryonic lethality and liver degeneration in mice lacking the RelA component of NF-kappa B.// Nature. 1995. V. 376. P. 167-170.

115. Sha WC, Liou HC, Tuomanen EI, Baltimore D Targeted disruption of the p50 subunit of NF-kappa B leads to multifocal defects in immune responses.// Cell. 1995. V. 80. P. 321-330.

116. Weih F, Carrasco D, Durham SK, Barton DS, Rizzo CA, RyseckRP, Lira SA, Bravo

R Multiorgan inflammation and hematopoietic abnormalities in mice with a targeted disruption of RelB, a member of the NF-kappa B/Rel family.//Cell. 1995. V. 80. P. 331-340.

117. Korobko E. V., Saschenko L.P., Prockhorchouk E.B., Korobko I. V., Gnuchev N. V.,

Kiselev S.L. Resistance to tumor necrosis factor induced apoptosis in vitro correlates with high metastatic capacity of cells in vivo. // Immunol. Lett. 1999. V. 67.P. 71-76.

118. Angel P, Karin MThe role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation.//Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1072. P. 129-157.

119. Yamit-Hezi A, Plaksin D, Eisenbach L c-fos and c-jun overexpression in malignant cells reduces their tumorigenic and metastatic potential, and affects their MHC class I gene expression.Oncogene 1994 Apr;9(4): 1065-79

120. ChongAS Stimulation of IvN-gamma, TNF-alpha, and TNF-betc secretion in IL-2activated T sells: costimulatory roles for Lu,A-l, LFA-2, CD44, and CD45 molecules.// Cell Immunol. 1992. V. 144. P. 69-79.

121 Zandi E, Chen Y, Karin M Direct phosphorylation of IkappaB by IKKalpha and

IKKbeta: discrimination between free and NF-kappaB-bound substrate.// Science. 1998. V. 281. P. 1360-1363.

122. RothwarfDM, Zandi E, Natoli G, Karin MIKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex.//Nature. 1998. V. 395. P. 297-300.

123 Yamaoka S, Courtois G, Bessia C, Whiteside ST, Weil R, Agou F, Kirk HE, Kay RJ, Israel A Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation.//Cell. 1998. V. 93. P. 1231-1240.

124. Hershko A, CiechanoverA The ubiquitin system.// Annu Rev Biochem. 1998. V. 67. P.425-479.

125 AlkalayT, YaronA, Hatzubai A, JungS, AvrahamA, Gerlitz O, Pashut-Lavon I, Ben-Neriah Y In vivo stimulation of I kappa B phosphorylation is not sufficient to activate NF-kappa B.//Mol Cell Biol. 1995. V. 15. P. 1294-1301.

126 . DiDonato J A, Mercurio F, Karin M Phosphorylation of I kappa B alpha precedes but is not sufficient for its dissociation from NF-kappa B.// Mol Cell Biol. 1995. V. 15. P.1302-1311.

127. Aberle H, Bauer A, Stappert J, Kispert A, Kemler R beta-catenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway.// EMBO J. 1997. V. 16. P. 3797-3804.

128. WuM., Lee H., Bellas R.E., Schauer S.L., ArsuraM., Katz D., FitzGeraldM.J., Rothstein L., SherrD., Sonenshein G.E. Inhibition ofNF-kappaB/Rel induces apoptosis of murine B cells. // EMBO J. 1996. V. 15. P. 4682-4690.

129. Qin Z.H., Chen R. W, Wang Y., Nakai M., Chuang D.M., Chase T.N. Nuclear factor kappaB nuclear translocation upregulates c-Myc and p53 expression during NMDA receptor-mediated apoptosis in rat striatum. // J. Neurosci. 1999. V. 19. P. 4023-33.

130. Bargou RC, Leng C, Krappmann D, Emmerich F, Mapara MY, Bommert K, Royer

HD, Scheidereit C, Dorken B High-level nuclear NF-kappa B and Oct-2 is a common feature of cultured Hodgkin/Reed-Sternberg cells.// Blood. 1996. V. 87. P. 4340-4347.

131. Bellas R.E., FitzGerald M.J., Fausto N., Sonnenshein G.E. Inhibition of NF-kappa

B activity induces apoptosis in murine hepatocytes. // Am J Pathol. 1997. V. 151. P. 891-896.

132. SovakM.A., Bellas R.E., Kim D. W, Zanieski G.J., Rogers A.E., TraishA.M.,

Sonenshein G.E. . Aberrant nuclear factor-kappaB/Rel expression and the pathogenesis of breast cancer. // J. Clin. Invest. 1997. V. 100. P. 2952-2960

133. Wood KM., RoffM. and Hay R.T. Defective IkBoc in Hodgkin cell lines with constitutively active NF-kappaB. // Oncogene. 1998. V. 16. P. 2131 -2139.

134. Giri DK, Aggarwal BB Constitutive activation of NF-kappaB causes resistance to apoptosis in human cutaneous T cell lymphoma HuT-78 cells. Autocrine role of tumor necrosis factor and reactive oxygen intermediates.//.! Biol Chem. 1998. V. 273. P. 14008-14014.

135. Miyamoto S, Seufzer BJ, Shumway SD. .Novel IkappaB alpha proteolytic pathway in WEHI231 immature B cells.// Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 19-29.

136. Emmerich F, Meiser M, Hummel M, Demel G, Foss HD, Jundt F, Mathas S,

Krappmann D, Scheidereit C, Stein H, Dorken B Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappa B alpha gene in Reed-Sternberg cells.// Blood. 1999. V. 94. P. 3129-3134.

137. Lernbecher T, Kistler B, Wirth J7Two distinct mechanisms contribute to the constitutive activation of RelB in lymphoid cells.// EMBO J. 1994. V. 13. P. 4060-4069.

138. Dignam J.D., Martin P.L., Shastry B.S., Roeder R.G.: Eukaryotic gene transcription with purified components. Methods Enzymol. 1983, V. 101, P. 582-598.

139. Lee H, Arsura M,WuM, Duyao M, Buckler AJ, Sonenshein GE Role of Rel-related factors in control of c-myc gene transcription in receptor-mediated apoptosis of the murine B cell WEHI231 line.// J Exp Med. 1995. V. 181. P. 1169-1177.

140. Wu M, Arsura M, Bellas RE, FitzGerald MJ, Lee H, Schauer SL, Sherr DH,

Sonenshein GE Inhibition of c-myc expression induces apoptosis of WEHI 231 murine B cells.// Mol Cell Biol. 1996. V. 16. P. 5015-5025.

141. Wu M, Lee H, Bellas RE, Schauer SL, Arsura M, Katz D, FitzGerald MJ, Rothstein TL, Sherr DH1 Sonenshein GE Inhibition of NF-kappaB/Rel induces apoptosis of murine B cells.// EMBO J. 1996. V. 15. P. 4682-4690.

143. Dejardin E, Bonizzi G, Bellahcene A, Castronovo V, Merville MP, Bours V Highlyexpressed pl00/p52 (NFKB2) sequesters other NF-kappa B-related proteins in the cytoplasm of human breast cancer cells.// Oncogene. 1995. V. 11. P. 1835-1841.

144. Dechend R, Hirano F, Lehmann K, Heissmeyer V, Ansieau S, Wulczyn FG,

Scheidereit C, Leutz A The Bcl-3 oncoprotein acts as a bridging factor between NF-kappaB/Rel and nuclear co-regulators.// Oncogene. 1999. V. 18. P. 33163323.

145 Ernst MK, Dunn LL, Rice NR The PEST-like sequence of I kappa B alpha is responsible for inhibition of DNA binding but not for cytoplasmic retention of c-Rel or RelA homodimers.// Mol Cell Biol. 1995. V. 15. P. 872-882.

146. Chu ZL, McKinsey TA, Liu L, QiX, Ballard DW Basal phosphorylation of the PEST domain in the

I(kappa)B(beta) regulates its functional interaction with the c-rel proto-oncogene product.// Mol Cell Biol. 1996. V. 16. P. 5974-5984.

147. Van Antwerp DJ, Verma /M Signal-induced degradation of I(kappa)B(alpha): association with NFkappaB and the PEST sequence in I(kappa)B(alpha) are not required.// Mol Cell Biol. 1996. V. 16. P. 6037-6045.

148. McKinsey TA, Brockman J A, Scherer DC, Al-Murrani SW, Green PL, Ballard DW

Inactivation of IkappaBbeta by the tax protein of human T-cell leukemia virus type 1: a potential mechanism for constitutive induction of NF-kappaB.// Mol Cell Biol. 1996. V. 16. P. 2083-2090.

149. Whiteside ST, Epinat JC, Rice NR, Israel A I kappa B epsilon, a novel member of the I kappa B family, controls RelA and cRel NF-kappa B activity.// EMBO J. 1997.V. 16. P. 1413-1426.

150. Bradford MM A repid and sensitive method for the quentitation of microgram quantités of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, V. 72, P. 248-254.

151. GerritsenME, Williams AJ, NeishAS, Moore S, Shi Y, Collins TCREB-binding protein/p300 are transcriptional coactivators of p65. // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. V. 94. P. 2927-2932.

152. Perkins ND, Felzien LK, Betts JC, Leung K, Beach DH, Nabel GJ Regulation of NFkappaB by cyclin-dependent kinases associated with the p300 coactivator.// Science. 1997. V. 278. P. 1231-1234.

153. ZhongH, Voll RE, Ghosh S Phosphorylation of NF-kappa B p65 by PKA stimulates transcriptional activity by promoting a novel bivalent interaction with the coactivator CBP/p300.// Cell. 1996. V. 85. P. 403-414

154. Kamei Y, Xu L, Heinzel T, Torchia J, Kurokawa R, Gloss B, Lin SC, Heyman RA,

Rose DW, Glass CK, Rosenfeld MG A CBP integrator complex mediates transcriptional activation and AP-1 inhibition by nuclear receptors.// Cell. 1996. V. 85. P. 403-414.

155. Na SY, Lee SK, Han SJ, Choi HS, Im SY, Lee JW Steroid receptor coactivator-1 interacts with the p50 subunit and coactivates nuclear factor kappaB-mediated transactivations.// J Biol Chem. 1998. V. 273. P. 10831-10834.

156. Torchia J, Glass C, Rosenfeld MG Co-activators and co-repressors in the integration of transcriptional responses.// Curr Opin Cell Biol. 1998. V. 10. P. 373-383.

157. Chen H, Lin RJ, Schiltz RL, Chakravarti D, Nash A, Nagy L, Privalsky ML,

Nakatani Y, Evans i?MNuclear receptor coactivator ACTR is a novel histone acetyltransferase and forms a multimeric activation complex with P/CAF and CBP/p300.// Cell. 1997. V. 90. P. 569-580.

158. Smith CL, Onate SA, Tsai MI, O'Malley 5JFCREB binding protein acts synergistically with steroid receptor coactivator-1 to enhance steroid receptor-dependent transcription.// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. V. 93. P. 8884-8888.

159. Torchia J, Rose DW, Inostroza J, Kamei Y, Westin S,pGlass CK, Rosenfeld MG The transcriptional co-activator p/CIP binds CBP and mediates nuclear-receptor function.//Nature. 1997. V. 387. P. 677-684.

160. Sheppard KA, Rose DW, Haque ZK, Kurokawa R, Mclnerney E, Westin S, Thanos

D, Rosenfeld MG, Glass CK, Collins J Transcriptional activation by NF-kappaB requires multiple coactivators.//Mol Cell Biol. 1999. V. 19. P. 6367-6378.

161. WangCY, CusackJCJr, Liu R, Baldwin AS Jr Control of inducible chemoresistance: enhanced anti-tumor therapy through increased apoptosis by inhibition of NF-kappaB.// Nat Med. 1999. V. 5. P. 412-417.

162. Kane LP, Shapiro VS, Stokoe D, Weiss A Induction of NF-kappaB by the Akt/PKB kinase.// Curr Biol. 1999. V. 9. P. 601-604.

163. Ozes ON, Mayo LD, GustinJA, PfefferSR, Pfejfer LM, Donner DB NF-kappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase.// Nature. 1999. V. 401. P. 82-85.

164. Romashkova J A, Makarov SS NF-kappaB is a target of AKT in anti-apoptotic PDGF signalling.// Nature. 1999. V. 401. P. 86-90.

165. Chan H, Bartos DP, Owen-Schaub LB Activation-dependent transcriptional regulation of the human Fas promoter requires NF-kappaB p50-p65 recruitment.// Mol Cell Biol. 1999. V. 19. P. 2098-2108.

166. Mercurio F, Manning ^4MNF-kappaB as a primary regulator of the stress response.//

Oncogene. 1999. V. 18. P. 6163-6171.

167. Baeuerle PA, Henkel T Function and activation of NF-kappa B in the immune system.// Annu Rev Immunol. 1994. V. 12. P.141-179.

168. Shi X, Dong Z, Huang C, Ma W, Liu K, Ye J, Chen F, Leonard SS, Ding M,

Castranova V, Vallyathan FThe role of hydroxyl radical as a messenger in the activation of nuclear transcription factor NF-kappaB.// Mol Cell Biochem. 1999. V. 194. P. 63-70.

169. KaulN, Choi J, Forman HJ Transmembrane redox signaling activates NF-kappaB in macrophages.// Free Radic Biol Med. 1998. V. 24. P. 202-207.

170. Bonizzi G, Piette J, Schoonbroodt S, Greimers R, Havard L, Merville MP, Bours V

Reactive oxygen intermediate-dependent NF-kappaB activation by interleukin-lbeta requires 5-lipoxygenase or NADPH oxidase activity .//Mol Cell Biol. 1999. V. 19. P. 1950-1960.

171. Mercurio F, Zhu H, Murray BW, Shevchenko A, Bennett BL, Li J, Young DB,

Barbosa M, Mann M, Manning A, Rao A IKK-1 and IKK-2: cytokine-activated IkappaB kinases essential forNF-kappaB activation.// Science. 1997. V. 278. P. 860-866.

172. Yaron A, Gonen H, Alkalay I, Hatzubai A, Jung S, Beyth S, Mercurio F, Manning AM, Ciechanover A, Ben-Neriah Y Inhibition ofNF-kappa-B cellular function via specific targeting of the I-kappa-B-ubiquitin ligase.// EMBO J. 1997. V. 16. P. 6486-6494.

173. Mathew S, Murty W, Dalla-Favera R, Chaganti RS Chromosomal localization of genes encoding the transcription factors, c-rel, NF-kappa Bp50, NF-kappa Bp65, and lyt-10 by fluorescence in situ hybridization.// Oncogene. 1993. V. 8. P. 191193.

174. Gilmore TD, Morin PJThe I kappa B proteins: members of a multifunctional family.// Trends Genet. 1993. V. 9. P. 427-433.

175. Finco TS, Westwick JK, Norris JL, BegAA, DerCJ, Baldwin AS Jr Oncogenic Ha

Ras-induced signaling activates NF-kappaB transcriptional activity, which is required for cellular transformation.//! Biol Chem. 1997. V. 272. P. 24113-24116.

176. Fisher DE Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold.//

Cell .1994. V. 78. P. 539-542.

177. Mayo MW, Wang CY, Cogswell PC, Rogers-Graham KS, Lowe SW, Der CJ,

Baldwin AS Jr Requirement of NF-kappaB activation to suppress p53-independent apoptosis induced by oncogenic Ras.// Science. 1997. V. 278. P. 1812-1815.

178. Levine AJ. p53, the cellular gatekeeper for growth and division.// Cell. 1997. V. 88.

P. 323-331.

179. Maltzman W, CzyzykL UV irradiation stimulates levels of p53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells.// Mol Cell Biol. 1984. V. 4. P. 1689-1694.

180. Maki CG, Howley PMUbiquitination of p53 and p21 is differentially affected by ionizing and UV radiation.// Mol Cell Biol. 1997. V. 17. P. 355-363.

181. Attardi LD, Jacks 7The role of p53 in tumour suppression: lessons from mouse models.// Cell Mol Life Sci. 1999. V. 55. P. 48-63.

182. Amundson SA, Zhan Q, Penn LZ, Fornace AJJr Myc suppresses induction of the growth arrest genes gadd34, gadd45, and gaddl53 by DNA-damaging agents.// Oncogene. 1998. V. 17. P. 2149-2154.

183. Janus F, Albrechtsen N, Dornreiter I, Wiesmuller L, Grosse F, Deppert WThe dual role model for p53 in maintaining genomic integrity.// Cell Mol Life Sci. 1999. V. 55. P. 12-27.

184. Kubbutat MH, Vousden KH Proteolytic cleavage of human p53 by calpain: a potential regulator of protein stability.// Mol Cell Biol. 1997. V. 17. P. 460-468.

185. Maki CG, Huibregtse JM, Howley PMin vivo ubiquitination and proteasomemediated degradation of p53(l).// Cancer Res. 1996. V. 56. P. 2649-2654.

186. MomandJ, Zambetti GP, Olson DC, George D, Levine A J The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation.//Cell. 1992. V. 69. P. 1237-1245.

187. Oliner JD, Kinzler KW, Meitzer PS, George DL, Vogelstein B Amplification of a gene encoding a p53-associated protein in human sarcomas.// Nature. 1992. V. 358. P. 80-83.

188. Shieh SY, Ikeda M, Taya Y, Prives C DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.// Cell. 1997. V.91. P. 325-334.

189. Haupt Y, Maya R, KazazA, Oren MMdm2 promotes the rapid degradation of p53.// Nature. 1997. V. 387. P. 296-269.

190. Honda R, Tanaka H, Yasuda //Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53.// FEBS Lett. 1997. V. 420. P. 25-27.

191. Maki CG. Oligomerization is required for p53 to be efficiently ubiquitinated by

MDM2.// J Biol Chem. 1999. V. 274. P. 16531-16535.

192. SionovRV, Haupt FThe cellular response to p53: the decision between life and death.// Oncogene. 1999. V. 18. P. 6145-6157.

193. Bates S, Vousden KH Mechanisms of p53-mediated apoptosis.// Cell Mol Life Sci.

1999. V. 55. P. 28-37.

194. Wu GS, El-Diery WS. p53 and chemosensitivity// Nat Med. 1996. V. 2. P. 255-256.

195. Hermeking H, Lengauer C, PolyakK, He TC, Zhang L, Thiagalingam S, Kinzler

KW, Vogelstein B\ 4-3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression.// Mol Cell. 1997. V. 1. P. 3-11.

196. BrehmA, MiskaEA, McCance DJ, ReidJL, Bannister AJ, Kouzarides T

Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.// Nature. 1998. V. 391. P. 597-601.

197. Waga S, Hannon GJ, Beach D, Stillman B The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA.//Nature. 1994. V. 369. P. 574-578.

198. Schneider E, Montenarh M, Wagner P Regulation of CAK kinase activity by p53.//

Oncogene. 1998. V. 17. P. 2733-2741.

199. Peng CY, Graves PR, Thoma RS, Wu Z, Shaw AS, Piwnica-Worms //Mitotic and G2 checkpoint control: regulation of 14-3-3 protein binding by phosphorylation of Cdc25C on serine-216. // Science. 1997. V. 277. P. 1501-1505.

200. Wang XW, Zhan Q, Coursen JD, Khan MA, Kontny HU, Yu L, Hollander MC,

O'Connor PM, Fornace AJJr, Harris CC GADD45 induction of a G2/M cell cycle checkpoint.// Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96. P. 3706-3711.

201. Prisco M, Hongo A, Rizzo MG, SacchiA, Baserga R The insulin-like growth factor I receptor as a physiologically relevant target of p53 in apoptosis caused by interleukin-3 withdrawal.// Mol Cell Biol. 1997. V. 17. P. 1084-1092.

202. Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Snow BE, Brothers GM, Mangion J,

Jacotot E, Costantini P, Loeffler M, Larochette N, Goodlett DR, Aebersold R, Siderovski DP, Penninger JM, Kroemer G Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor.// Nature. 1999. V. 397. P. 441-446

203. Owen-Schaub LB, Zhang W, CusackJC, Angelo LS, Santee SM, Fujiwar a T, Roth

JA, Deisseroth AB, Zhang WW, Kruzel E Wild-type human p53 and a temperature-sensitive mutant induce Fas/APO-1 expression.// Mol Cell Biol. 1995. V. 15. P. 3032-3040.

204. Johnson TM, Yu ZX, Ferrans VJ, Lowenstein RA, Finkel rReactive oxygen species are downstream mediators of p53-dependent apoptosis.// Proc Natl Acad Sei U S A. 1996. V. 93. P. 11848-11852.

205. PolyakK, Xia Y, Zweier JL, KinzlerKW, Vogelstein B A model for p53-induced apoptosis.// Nature. 1997. V. 389. P. 300-305.

206. Caelles C, Helmberg A, Karin Mp53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation of p53-target genes.// Nature. 1994. V. 370. P. 220-223.

207. Dyson N The regulation of E2F by pRB-family proteins.// Genes Dev. 1998. V. 12.

P. 2245-2262.

208. Haupt Y, Rowan S, Shaulian E, Vousden KH, Oren MInduction of apoptosis in

HeLa cells by trans-activation-deficient p53.// Genes Dev. 1995. V. 9. P. 21702183.

209. Lassus P, Ferlin M, Piette J, Hibner U Anti-apoptotic activity of low levels of wild-type p53.// EMBO J. 1996. V. 15. P. 4566-4573.

210. Lassus P, Bertrand C, Zugasti O, ChambonJP, Soussi T, Mathieu-Mahul D, Hibner

U Anti-apoptotic activity of p53 maps to the COOH-terminal domain and is retained in a highly oncogenic natural mutant.// Oncogene. 1999. V. 18. P. 46994709.

211. ATCC: Catalog of CELL LINES & HYBRIDOMAS, 6 th edition, 1988.

212. Doppler W., Groner B., BallR.K.: Prolaction and glucocorticoid hormones synergistically induce expression of transfected rat beta-casein gene promoter constractions in a mammary epithelial cell line. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980, V. 86, P. 104-108.

213. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1998.

214. Short protocols in molecular biology. Second edition. 1992.