Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Судницына, Мария Викторовна

• Судницына, Мария Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2012

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3»

В дальнейших исследованиях на клеточных культурах кардиомиоцитов, а также на трансгенных животных с повышенной экспрессией HspB6 в сердечной мышце было продемонстрировано защитное действие HspBó при различных патологических состояниях. Так, например, у трансгенных животных с повышенным уровнем экспрессии HspBó ишемия/реперфузия сопровождалась существенным уменьшением некроза и апоптоза кардиомиоцитов и более быстрым восстановлением сердечной функции, чем у контрольных животных [87]. Повышенная экспрессия HspBó защищала кардиомиоциты от действия токсичного цитостатика доксорубицина [88] и липополисахаридов, внутрибрюшинное введение которых моделирует состояние сепсиса у животных [89]. При выявлении механизмов антиапоптотического действия HspBó на кардиомиоциты оказалось, что он может взаимодействовать с различными белками, вовлеченными в процесс регуляции апоптоза. Так, например, HspBó предотвращает транслокацию проапоптотического белка ВАХ в митохондрии [87], инактивируетссовую киназу ASK1 [90], а также способствует сохранению активности протеинкиназы Akt, предотвращая активацию проапоптотического белка BAD [88]. При развитии сепсиса HspBó снижает активность транскрипционного фактора NF-кВ, уменьшая продукцию кардиомиоцитами провоспалительных цитокинов [89]. Помимо этого было установлено, что уменьшение степени фосфорилирования HspBó (достигаемое путем экспрессии в клетках нефосфорилируемого мутанта S16A) сопровождается увеличением гибели клеток вследствие ишемии. Этот эффект, по всей видимости, связан с ингибированием процесса аутофагии в кардиомиоцитах [91].

В последнее время появились данные о том, что HspBó может стимулировать ангиогенез в сердечной мышце [92]. Это интересный пример внеклеточного действия HspBó,

4 4 < > А который активно секретируется кардиомиоцитами и взаимодействует с рецептором фактора роста сосудов (VEGFR2), запуская сигнальный каскад в клетках эндотелия, приводящий к ангиогенезу.

Весьма вероятно, что протекторное действие HspB6 не ограничивается только сердечной мышцей. Существуют данные, свидетельствующие о корреляции между уровнем экспрессии HspB6 и такими патологическими состояниями, как рак и болезнь Альцгеймера [84].

2.2.2 Влияние HspBó на процесс агрегации тромбоцитов.

Повреждение стенки сосуда вызывает активацию тромбоцитов, которые, взаимодействуя между собой и с межклеточным коллагеновым матриксом, образуют агрегаты, препятствующие кровотечению. Этот процесс строго регулируется и находится под контролем различных факторов, таких как тромбин, коллаген, ADP. Оказалось, что HspB6 способен специфически связываться с тромбоцитами и ингибировать их агрегацию под действием тромбина, но не ADP [93]. Дальнейшие исследования показали, что HspB6 предотвращает вход Са2+ через клеточную мембрану тромбоцитов, индуцированный тромбином и коллагеном, однако не влияет на выход Са из внутриклеточных депо [94]. Высказывается предположение, что действие HspB6 связано с ингибированием активности фосфолипазы С тромбоцитов [95]. Любопытно отметить, что сходным эффектом на агрегацию тромбоцитов обладает не только интактный полноразмерный HspB6, но и короткие пептиды HspB6 и а-В-кристаллина [96]. При этом активный девятичленный пептид HspB6 содержит в своем составе Serió - остаток, подвергающийся фосфорилированию протеинкиназой А.

Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что HspB6 может выступать в роли ингибитора агрегации тромбоцитов. Этот факт представляется особенно интересным, потому что сердечно-сосудистые заболевания могут сопровождаться повышением уровня HspB6 в плазме крови [94, 95].

2.2.3 Участие HspBó в регуляции сократительной активности гладкой мускулатуры.

Спустя несколько лет после идентификации HspBó как представителя семейства малых белков теплового шока интерес к этому белку резко возрос. Это было связано с обнаружением того факта, что фосфорилирование HspBó коррелировало с расслаблением гладкой мускулатуры сосудов [78]. В настоящее время рассматриваются два основных участие в регуляции сократительной активности гладких мышц. Дальнейшее продолжение исследований в этом направлении позволило установить, что обработка гладкой мускулатуры сосудов и воздухоносных путей фосфорилированным пептидом HspB6, слитым с последовательностью, обеспечивающей его проникновение в клетку, эффективно обеспечивает расслабление гладкой мускулатуры [99, 100]. При этом нефосфорилированный пептид и пептид с заменой Ser 16—*Ala были неэффективны.

В ходе дальнейшего изучения механизма действия HspB6 оказалось, что активация в клетке циклонуклеотид-зависимого сигнального каскада не только приводит к расслаблению, но также препятствует последующему сокращению мышечных клеток под действием серотонина [101]. При этом степень фосфорилирования легких цепей миозина и потребление кислорода мышечными клетками оставалось на высоком уровне. Учитывая этот факт, К. Брофи и соавт. предложили следующую гипотезу, объясняющую механизм расслабления гладких мышц под действием фосфорилированного HspB6. Согласно этой гипотезе, нефосфорилированный HspB6 взаимодействует с элементами цитоскелета, поддерживая его целостность. Фосфорилирование вызывает диссоциацию HspB6 от актинового цитоскелета и нарушение фиксации актиновых филаментов в области фокальных контактов [101]. Частичная разборка актинового цитоскелета приводит к расслаблению, при этом сам процесс образования актомиозинового комплекса не ингибируется, о чем свидетельствует активное потребление мышцей кислорода. В пользу этой гипотезы свидетельствуют полученные в лаборатории К. Брофи данные о том, что HspB6 может связываться как с актином [70], так и с а-актинином, одним из компонентов фокальных контактов [71]. При этом по данным К. Брофи и соавт. нефосфорилированный HspB6 преимущественно взаимодействует с F-актином, а фосфорилированный - с G-актином, что также может способствовать разборке актиновых филаментов.

Прямо противоположные результаты были получены в лаборатории К. Рембольда. В экспериментах, проведенных этой группой, было установлено, что фосфорилированный HspB6 соосаждался с фибриллярным актином, а нефосфорилированный HspB6 оставался в супернатанте. По данным этих исследователей при расслаблении сонной артерии, вызванном действием активаторов гуанилатциклазы, происходило снижение потребления мышцей кислорода, что могло свидетельствовать об ингибировании взаимодействия головок миозина с актином [97]. Более того, в структуре HspB6 был обнаружен пептид (остатки 110-121), в определенной степени гомологичный ингибиторному участку тропонина I, регулирующему взаимодействие актина и миозина в скелетных и сердечных мышцах [97]. Таким образом, была сформирована альтернативная гипотеза, предполагающая, что фосфорилирование гладкомышечного HspB6 циклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами вызывает его транслокацию на актиновые филаменты, где он, подобно тропонину I в скелетных и сердечных мышцах, препятствует взаимодействию головок миозина с тонкими филаментами и, как следствие, ингибирует мышечное сокращение [102, 103].

Несмотря на очевидное противоречие двух гипотез, обе они базировались на предположении о том, что HspB6 является истинным актин-связывающим белком. Тем не менее, в серии биохимических экспериментов, выполненных in vitro, не удалось установить прямого взаимодействия HspB6 (или его мутанта, имитирующего фосфорилирование) с интактным актином [73].

Продолжая свои исследования на клеточных культурах, К. Брофи и соавт. обнаружили, что повышенная экспрессия HspB6 ингибировала сократительную активность немышечных клеток [100], а добавление к культуре клеток фосфорилированного пептида HspB6, слитого с последовательностью, обеспечивающей его проникновение в клетку, вызывало разборку актиновых стресс-фибрилл [49, 99]. При изучении белков-партнеров фосфопептида HspB6 в клеточных лизатах оказалось, что он взаимодействует с универсальным белком-адаптером 14-3-3 [49] (см. раздел 3). Чуть позднее было установлено, что не только фосфорилированный пептид, но и фосфорилированный интактный HspB6 способен взаимодействовать с 14-3-3 [50]. Кроме того, оказалось, что появление в клетке фосфорилированного HspB6 или его фосфопептида коррелировало с уменьшением степени фосфорилирования актин-связывающего белка кофилина [49, 99], также считающегося партнером 14-3-3 [104, 105].

На основе описанных экспериментальных фактов была сформулирована новая гипотеза, постулирующая непрямое влияние фосфорилированного HspB6 на актиновый цитоскелет (рис.4). Согласно этой гипотезе, образующийся при активации циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ фосфорилированный HspB6 вытесняет фосфорилированный неактивный кофилин из комплекса с 14-3-3. Фосфорилированный кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, становится активным и обеспечивает деполимеризацию и фрагментацию актиновых филаментов, что в конечном итоге приводит к расслаблению гладких мышц и реорганизации цитоскелета немышечных клеток [49, 51]. эти процессы могут играть важную роль в формировании примембранного актинового цитоскелета и обеспечении направленного движения клеток.

Фосфорилирование кофилина по остатку Ser3 предотвращает его взаимодействие с актином. Две изоформы LIM-киназы, экспрессирующиеся повсеместно [114, 115], а также менее изученные TES-киназы, обнаруженные в различных тканях, но преимущественно экспрессирующиеся в семенниках [116, 117], участвуют в фосфорилировании кофилина. В регуляцию активности LIM-киназ вовлечены сигнальные пути, связанные с Rho-GTP-азами. РАК- и Rho-киназы, активируемые под действием Rho-GTP-аз, фосфорилируют и активируют LIM-киназы [115, 118]. Активация TES-киназ происходит при запуске сигнальных путей, связанных с интегриновыми рецепторами [116]. Данные литературы свидетельствуют о том, что фосфорилированная TES-киназа! может взаимодействовать с белком-адаптером 14-3-3 [119], что вызывает ингибирование киназной активности фермента и влияет на его внутриклеточную локализацию. Данные литературы о взаимодействии LIM-киназы1 и 14-3-3 достаточно противоречивы [105, 120]. Процесс дефосфорилирования кофилина находится под контролем двух фосфатаз, так называемых Slingshot и Chronophin [121, 122]. Как уже отмечалось, дефосфорилирование приводит к активации кофилина. Механизм регуляции фосфатазы Chronophin остается пока практически не изученным. Механизмы регуляции фосфатазы Slingshot изучены полнее. Считается, что этот фермент может связываться с фибриллярным актином и это приводит к повышению ферментативной активности [120]. Фосфорилирование Slingshot приводит к образованию комплекса с белком 14-3-3 [123, 124], что вызывает диссоциацию фосфатазы от актиновых филаментов и ингибированию ее активности. Судя по всему, описываемая система регуляции имеет много обратных связей. Например, Slingshot способна дефосфорилировать не только кофилин, но и LIM-киназу [123], регулируя ее активность. Таким образом, в клетке существует сложная система регуляции кофилина, важную роль в которой играет универсальный адаптерный белок 14-3-3. изоформ, причем у е изоформы отсутствует также третий солевой мостик, что, возможно, связано с уменьшением стабильности гомодимера и повышенной склонностью е изоформы образовывать гетеродимеры [136].

На внутренней стороне каждого мономера располагается субстрат-связывающий участок - так называемая амфипатическая бороздка, образованная спиралями аЗ, а5, а7 и а9. С одной стороны в бороздке находятся гидрофобные остатки L172, L216, L220 и L227, принадлежащие спиралям а7 и а9. С другой стороны бороздки преимущественно располагаются заряженные остатки К49, R56, R60, К120, D124, R127, а также Y128, принадлежащие аЗ и а5 спиралям [135]. Таким образом, наиболее консервативные аминокислотные остатки расположены в области межсубъединичных контактов, а также на внутренней поверхности мономеров, в то время как наружная поверхность димера образована сравнительно вариабельными аминокислотными остатками.

Дальнейшие исследования показали, что кристаллические структуры всех изоформ 14-3-3 млекопитающих очень похожи. Кроме того, они представляют собой довольно жесткие структуры и не изменяют свою конформацию при связывании фосфопептидов и даже полноразмерных белков-партнеров [136-138].

3.3 Взаимодействие 14-3-3 с белками-партнерами.

В настоящее время известно более 300 белков-партнеров 14-3-3, к которым относятся различные протеинкиназы, белки-рецепторы, ферменты, белки цитоскелета, транскрипционные факторы, белки-регуляторы апоптоза и др. [139]. Несмотря на большое разнообразие белков-партнеров, большинство белков, взаимодействующих с 14-3-3, имеют в своей структуре фосфорилированные остатки Ser/Thr, расположенные в достаточно консервативном окружении, так называемых консенсусных последовательностях [140]. В литературе описано несколько таких консенсусных последовательностей. Так первичная структура мотива I, узнаваемого 14-3-3, имеет вид RSX(pS/pT)X(P/G), а мотив II, также узнаваемый 14-3-3, имеет несколько иную первичную структуру - RX(Y/F)X(pS/pT)XP [137]. Был обнаружен также и мотив III, располагающийся на С-конце белка-партнера и имеющий структуру pSXi.2-COOH [141]. Участки, узнаваемые 14-3-3, могут несколько отличаться от упомянутых выше консенсусных последовательностей. Например, в случае HspB6 последовательность, узнаваемая 14-3-3, имеет вид RRApSAP. Тем не менее высказывается предположение, что чем ближе последовательность к консенсусной, тем прочнее белок-партнер взаимодействует с 14-3-3 [137].

Данные, полученные при анализе кристаллических структур комплексов 14-3-3 с фосфопептидами, свидетельствуют о том, что фосфопептид располагается в амфипатической бороздке 14-3-3, вытягиваясь вдоль нее, и взаимодействует с аминокислотными остатками спиралей а5, а7 и а9. При этом фосфатная группа координируется консервативными остатками К49, 1156, Ш27 и У128 [136, 137]. Пролин в положении +2 относительно фосфосерина обеспечивает изгиб полипептидной цепи, необходимый для правильного расположения узнаваемой последовательности в амфипатической бороздке.

Помимо консенсусного мотива, узнаваемого 14-3-3, большинство белков-партнеров объединяет еще одна структурная особенность. Оказалось, что более 90% этих белков имеют в своей структуре неупорядоченные участки, причем консенсусные последовательности для связывания 14-3-3, как правило, располагаются именно в этих участках [142]. Существует точка зрения, что при связывании с 14-3-3 эти неупорядоченные участки начинают приобретать определенную структуру. Такой способ взаимодействия может объяснить наличие чрезвычайно широкого круга белков-партнеров 14-3-3, обладающих существенными структурными и функциональными различиями.

Наличие димерной структуры и размер внутреннего центрального канала 14-3-3 предполагают возможность одновременного связывания двух белков-лигандов или одного белка-лиганда, имеющего в своей структуре два центра связывания (два фосфорилируемых мотива). Кроме того оказалось, что наличие в структуре белка-партнера второго участка связывания увеличивает его сродство к 14-3-3 более чем в 30 раз [137, 143], что может иметь важное физиологическое и функциональное значение [144]. Высказывается предположение, что участок в структуре белка-партнера, обладающий высоким сродством, может выступать в качестве своеобразного «привратника». Связывание этого участка с 14-3-3 позволяет должным образом ориентировать белок-партнер и обеспечивает связывание второго участка, обладающего более низким сродством. Замыкание второго контакта обеспечивает образование чрезвычайно прочного комплекса, что может приводить к очень существенным изменениям структуры и свойств белка-партнера [145].

Несмотря на то, что 14-3-3 преимущественно взаимодействует с фосфорилированными белками-партнерами, существует много примеров, когда 14-3-3 образует комплексы и с нефосфорилированными лигандами. Так, например, связывание 143-3 бактериального токсина экзоэнзима 8 не зависит от фосфорилирования [146]. Интересно отметить, что и в этом случае участок связывания 14-3-3 располагается в амфипатической бороздке, а остаток аспарагиновой кислоты полипептидной цепи экзоэнзима Б имитирует фосфат и взаимодействует с консервативным остатком У128 14-3-3 [136].

Существует несколько механизмов, с помощью которых 14-3-3 может влиять на функционирование белков-партнеров в клетке. Во-первых, связывание белка с 14-3-3 может препятствовать его взаимодействию с другими белками-партнерами. Так, например, образование комплекса фосфатазы Slingshot с 14-3-3 препятствует ее связыванию с актиновыми филаментами, что может приводить к ингибированию ее активности [120, 123]. Прочное взаимодействие 14-3-3 с транскрипционным фактором F0X04, осуществляемое сразу по двум участкам, не позволяет последнему связываться с регуляторными областями на молекуле ДНК [144]. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что 143-3 может защищать белки-партнеры от действия фосфатаз и/или протеаз.

Во-вторых, взаимодействие с 14-3-3 может влиять на активность фермента, изменять его кинетические параметры и сродство к субстратам, как это происходит в случае арилалкиламин-М-ацетилтрансферазы [138], а также триптофан- и тирозин- гидроксилаз и некоторых других ферментов. По-видимому, это происходит вследствие того, что жесткая структура 14-3-3 может изменять конформацию белка-партнера, благоприятствуя образованию фермент-субстратного комплекса или стабилизируя переходное состояние при образовании продукта [145].

В третьих, 14-3-3 может влиять на внутриклеточную локализацию белка-партнера, маскируя или экспонируя определенные последовательности в его структуре [147].

В-четвертых, 14-3-3 может играть роль своеобразного адаптера, сближая два белка-партнера и способствуя их взаимодействию. Примером такого взаимодействия может служить тройной комплекс, состоящий из 14-3-3, протеинкиназы С-С, и протеинкиназы Raf-1. Образование такого комплекса благоприятствует фосфорилированию Raf-1 протеинкиназой С-С, и ее последующей активации [129].

Очевидно, что некоторые из этих механизмов функционирования (например, выполнение роли адаптера) подразумевают обязательное наличие димерной структуры у 143-3. Тем не менее, вопрос о необходимости димерной структуры 14-3-3 для его эффективного функционирования, также как и вопрос о существовании и возможной функциональной роли мономеров 14-3-3 остаются до сих пор открытыми. Установлено, что мутантная форма 14-3-3, с делецией N-концевого участка и не способная к димеризации, тем не менее эффективно связывает фосфорилированную триптофан-гидроксилазу [148]. В то же время точечные мутации в области межсубъединичных контактов, приводящие к диссоциации димеров 14-3-3, не влияли на взаимодействие 14-3-3 с протеинкиназой Raf, но полностью предотвращали способность 14-3-3 поддерживать Raf в активном состоянии [149]. О важной функциональной роли димерной структуры говорят также данные о том, что мутантные формы 14-3-3, не способные к димеризации, обладают пониженной способностью связывать фосфорилированные белки-партнеры [150]. Кроме того, такие мутанты крайне нестабильны in vivo, а их экспрессия в клетке сопровождается быстрой протеолитической деградацией [151]. С другой стороны, при экспрессии в культуре клеток недимеризующиеся мутантные формы 14-3-3 были способны модулировать активность Са2+-зависимого К+-канала [152], а обнаруженная недавно сплайс-форма 14-З-Зе, не способная к димеризации, эффективно защищала клетки от апоптоза, вызванного ультрафиолетовым излучением [153]. Таким образом, вполне вероятно, что мономерная форма 14-3-3 может играть определенную функциональную роль, особенно если учесть, что стабильность димеров может регулироваться путем фосфорилирования 14-3-3.

3.4 Регуляция 14-3-3 путем фосфорилирования.

Взаимодействие белков семейства 14-3-3 с партнерами может регулироваться не только путем фосфорилирования белков-партнеров, но также путем фосфорилирования самого 14-3-3. В составе 14-3-3 известно три остатка, подвергающихся фосфорилированию под действием различных протеинкиназ как in vivo, так и in vitro - Ser58, Serl84 и Thr232. Необходимо отметить, что эти остатки не всегда консервативны, они могут отсутствовать у некоторых изоформ. Кроме того, некоторые протеинкиназы могут фосфорилировать одни изоформы и не фосфорилировать другие, что может быть связано с различиями в первичной структуре вблизи участков фосфорилирования. Единственной изоформой, фосфорилирование которой по всем трем участкам было показано in vivo, является Ç изоформа 14-3-3 [154]. Рассмотрим фосфорилирование Ç изоформы 14-3-3 более подробно.

Ser58 расположен в области межсубъединичных контактов димера 14-3-3, что может существенно затруднять его фосфорилирование. Тем не менее, известно, что он подвергается фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, таких как PKB/Akt [155], МАРКАРК2 [156], РКА [157], SOK-1 [158], сфингозин-зависимая протеинкиназа (каталитический домен РКС5) [159, 160]. По мнению большинства авторов фосфорилирование Ser58 приводит к нарушению димерной структуры 14-3-3 [156, 157, 159, 160] и частичной или полной диссоциации димеров, что может быть следствием появления объемной фосфатной группы в области плотного контакта между двумя мономерами. Высказывается предположение, что мономеры, образующиеся вследствие фосфорилирования Ser58, крайне нестабильны. По этой причине фосфорилирование Ser58 может приводить к регулируемой деградации 14-3-3 [151]. Помимо этого фосфорилирование Ser58 сопровождается ослаблением прочности взаимодействия 14-3-3 с некоторыми белками-партнерами, такими как Raf-1 [156], р53 [157], ASK1 [158], ВАХ [160]. Такой эффект фосфорилирования Ser58 может быть связан как с нарушением димерной структуры i '

14-3-3, так и со стерическими затруднениями при связывании фосфорилированного участка белка-партнера в амфипатической бороздке, поскольку Ser58 расположен в непосредственной близости к Arg56 и Arg60, взаимодействующих с фосфатной группой. Интересный способ регуляции фосфорилирования Ser58 был обнаружен Дж. Вудкок и соавт. Оказалось, что доступность Ser58 для различных протеинкиназ резко возрастает при взаимодействии 14-3-3 со сфингозином, который образуется при расщеплении сфинголипидов [161]. Таким образом, фосфорилирование Ser58 14-3-3 в клетке находится под строгим контролем и может влиять как на время жизни 14-3-3, так и на способность 143-3 взаимодействовать с белками-партнерами.

Фосфорилирование Serl84 связывают с регуляцией антиапоптотической активности 14-3-3. Serl84 подвергается фосфорилированию под действием протеинкиназы JNK, которая активируется при различных стрессах. Следствием фосфорилирования является высвобождение из комплекса с 14-3-3 и активация таких проапоптотических белков, как ВАХ [162], F0X03a, BAD [163], c-Abl [164]. Ослабление взаимодействия 14-3-3 с белками-партнерами может быть связано с тем, что Serl84 расположен поблизости от субстрат-связывающей бороздки 14-3-3.

Thr232 находится в подвижном С-концевом участке 14-3-3, который может располагаться в амфипатической бороздке и препятствовать связыванию белков-партнеров [165, 166]. Фосфорилирование Thr232 казеинкиназой 1а заметно уменьшает сродство 14-3-3 к c-Raf [167], а также препятствует активации арилалкиламин-Ы-ацетилтрансферазы под действием 14-3-3 [168]. По-видимому, фосфорилированный С-концевой участок 14-3-3 активно конкурирует с белками-партнерами 14-3-3 за связывание с амфипатической бороздкой [168].

Таким образом, по всей видимости, фосфорилирование является эффективным способом регуляции функционирования 14-3-3. * *

Завершая обзор литературы, можно заключить, что малый белок теплового шока HspB6 способен влиять на многочисленные и разнообразные процессы в клетке. Нет сомнений в том, что фосфорилирование HspB6 по остатку Serl6 каким-то образом оказывает влияние на процесс расслабления гладкой мускулатуры. Опираясь на данные литературы, можно предположить, что в основе этого эффекта лежит взаимодействие HspB6 с универсальным белком-адаптером 14-3-3, который также вовлечен в регуляцию большого количества внутриклеточных процессов. Следует, однако, констатировать, что, несмотря на f,1 привлекательность этой гипотезы и многочисленные исследования, детальный механизм, с помощью которого HspB6 влияет на процесс расслабления гладких мышц, остается малопонятным. Выяснение этого механизма и способов его регуляции может быть важным не только с теоретической точки зрения, но может оказаться полезным при решении некоторых практических задач, таких как разработка методов борьбы с астмой и спазмами сосудов головного мозга, а также при трансплантации сосудов в сердечно-сосудистой хирургии [51, 169].

В связи с этим целью данной работы был подробный анализ взаимодействия HspB6 с 14-3-3^ дикого типа, его мутантами, имитирующими фосфорилирование, а также мутантами, не способными к димеризации. Помимо этого целью работы была проверка гипотезы о том, что HspB6 регулирует расслабление гладких мышц, вытесняя фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Используя различные методы, исследовать взаимодействие HspB6 с 14-3-3^ дикого типа in vitro.

2. Проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3^, на его способность связывать HspB6.

3. Исследовать взаимодействие HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры.

4. Изучить влияние фосфорилированного HspB6 на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным кофилином.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препаративные методы

1. Получение рекомбинантных белков. 1.1. Получение рекомбинантного HspB6 человека.

1.1.1. Экспрессия рекомбинантного HspB6.

Для получения рекомбинантного HspB6 использовали плазмиду рЕТ23(Ь), содержащую полноразмерную копию мРНК HspB6 человека. Плазмида была любезно предоставлена к.б.н. A.C. Сейт-Неби. Для экспрессии HspB6 использовали штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS. К 100 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 2 мкл плазмиды, инкубировали клетки на льду 30 мин, после чего проводили тепловой шок при 42°С в течение 50 с. К охлажденным во льду клеткам добавляли 900 мкл среды LB и растили при 37°С в течение 60 мин при постоянном перемешивании. Полученные клетки высевали на твердую среду LB-arap, содержащую 0,1 мг/мл ампициллина, и растили при 37°С в течение ночи. Чашки Петри с колониями клеток хранили в холодильнике.

Клетки с одной колонии переносили в 50 мл среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С в течение ночи. Полученную «ночную» культуру переносили в 1 л среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С до достижения оптической плотности, равной 0,5-0,6 при 600 нм. После этого добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ и растили клетки при 30°С в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2000 g) и суспендировали осадок в 20 мл лизис-буфера, содержащего 50 мМ трис/НС1, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 14 мМ ß-МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Суспензию клеток хранили на -20°С.

1.1.2. Выделение рекомбинантного HspB6.

Суспензию клеток Е. coli, в которых была проведена препаративная экспрессия HspB6, размораживали и обрабатывали лизоцимом в концентрации 0,06 мг/мл в течение 30 мин на льду. Для разрушения бактериальной ДНК добавляли ДНКазу I до конечной концентрации 3 мкг/мл и MgCb до конечной концентрации 2 мМ и инкубировали суспензию 15 мин при комнатной температуре. Клетки бактерий разрушали обработкой на ультразвуковом дезинтеграторе Branson S250D (выходная мощность 20%) три раза по 1 мин во льду. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 g. Супернатант отделяли, а осадок ресуспендировали в 20 мл лизис-буфера. Процедуру экстракции, начиная с обработки ультразвуком, повторяли еще два раза. Полученные супернатанты объединяли, добавляли сульфат аммония до степени насыщения 30% и инкубировали 1 ч на льду при постоянном перемешивании. По окончании периода инкубации суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 g, осадок растворяли в 15 мл буфера Б (20 мМ трис/ацетат, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 14 мМ 0-МЭ, ОД мМ ФМСФ) и диализовали против 2 л буфера Б в течение ночи.

На следующем этапе частично очищенный препарат HspB6 подвергали дальнейшей очистке с помощью хроматографических методов. Препарат HspB6 после диализа центрифугировали (30 мин при 105000 g), разводили в 4 раза и наносили порциями на колонку HiTrapQ (Amersham-Pharmacia) объемом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 4 объемами буфера Б, затем проводили элюцию линейным градиентом NaCl от 10 до 360 мМ в 12 объемах колонки. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 1 мл, состав которых анализировали при помощи SDS-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество HspB6 объединяли и подвергали дополнительной очистке с помощью метода гидрофобной хроматографии. К полученному препарату HspB6 добавляли сульфат аммония до концентрации 0,3 М и наносили его порциями на колонку PhenylHP HiTrap (Amersham Pharmacia) объемом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером Б, содержащим 0,3 М сульфата аммония. Колонку промывали 4 объемами буфера уравновешивания, затем проводили элюцию в два этапа линейным градиентом (NH^SCU. На первой стадии (7 объемов колонки) концентрация сульфата аммония уменьшалась с 300 до 15 мМ, а на второй стадии (10 объемов колонки) концентрация сульфат аммония уменьшалась с 15 до 0 мМ. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 1 мл, состав которых анализировали при помощи SDS-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество целевого белка, объединяли, концентрировали при помощи ультрафильтрации и диализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, содержащего 1 мМ ДТТ вместо Р-МЭ. Концентрацию белка в конечном препарате определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции HspB6 при 280 нм равным 0,582 (мг/мл)"' - см"'. Выход белка сіл бактериальной культуры составил ~80 мг. Полученный препарат делили на аликвоты и хранили при -20°С.

1.2 Получение рекомбинантного 14-3-3£ человека и его мутантных форм.

Рекомбинантный 14-3-3^ и его мутантные формы были любезно предоставлены к.б.н. H.H. Случанко.

1.3. Получение рекомбинантных кофилина-1 и кофилина-2 человека и их мутантных форм, имитирующих фосфорилирование.

1.3.1. Получение молекулярных конструкций для экспрессии мутантных форм S3D кофилина-1 и кофилина-2.

Для получения рекомбинантного кофилина-1 и кофилина-2 использовали плазмиду рЕТ23(Ь), содержащую полноразмерные копии мРНК кофилинов человека. Плазмида была любезно предоставлена к.б.н. A.C. Сейт-Неби. Для того чтобы получить молекулярные конструкции для экспрессии мутантных форм кофилинов, несущих замену Ser3 на Asp, использовали мутагенные (мутантный триплет показан жирным шрифтом) «прямые» ген-специфичные праймеры с сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Ndel (показано курсивом): ААТТАС4 ТА rGGCCGACGGTGTGGCTGTC ДЛЯ кофилина-1 И

АТАТАС4 ТАrGGCTGACGGAGTTACAGTG для кофилина-2. В качестве «обратных» праймеров использовали ген-специфичные праймеры с сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Xhol (показано курсивом): AT AT ACTCG^ GTC AC AAAGGCTTGCCCTCC AG для кофилина-1 и ATATACrCG^íGTTATAATGGTTTTCCTTCAAGTG для кофилина-2. Праймеры синтезировали в компании «Евроген». Проба для полимеразной цепной реакции содержала по 0,2 цМ прямых и обратных праймеров, 0,2 ц,М каждого из четырех dNTP, 2,5 ед. Pfu-ДНК-полимеразы (Fermentas), 1-кратный буфер для Pfu-ДНК-полимеразы (Fermentas) и следовые количества матрицы. В качестве матрицы использовали плазмиду, содержащую копию мРНК кофилина дикого типа. Амплифицированную таким образом вставку переосаждали из раствора в присутствии 65%-ного спирта и 0,2 М NaCl. Для клонирования полученной вставки ее и предварительно выделенный вектор рЕТ23(Ь) обрабатывали одновременно двумя эндонуклеазами рестрикции Ndel и Xhol (Fermentas) в буфере «О» (Fermentas). По окончании периода инкубации вектор дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой (Fermentas) для минимизации лигирования пустого вектора. После очистки рестрикционных фрагментов через 1%-ный агарозный гель с использованием набора «Silica Bead DNA Gel Extraction Kit» (Fermentas) осуществляли лигирование вектора и вставки Т4-ДНК-лигазой (Fermentas) в однократном лигазном буфере. Молярное соотношение вектор:вставка составляло 1:3. Полученной лигазной смесью трансформировали бактерии штамма DH5a и высевали на твердую среду ЬВ-агар. Выросшие колонии скринировали на наличие вставки нужной длины при помощи полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных области Т7-промотора и Т7-терминатора вектора рЕТ23(Ь). «Положительные» клоны наращивали в жидкой среде ЬВ и выделяли плазмиды методом щелочного лизиса. Полученные конструкции секвенировали в компании «Евроген».

1.3.2. Экспрессия рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм, имитирующих фосфорилироеание.

Для экспрессии кофилинов компетентные клетки Е. соН ВЬ21(БЕЗ)рЬуз8 трансформировали плазмидами, несущими нужные вставки, и растили «ночные» культуры. Последовательность действий была аналогична той, которая описана в разделе 1.1.1, посвященном экспрессии НзрВб. Экспрессию кофилинов проводили методом самоиндукции [170]. 50 мл «ночной» культуры переносили в 1 л трехкратной среды ЬВ, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С до достижения суспензией оптической плотности, равной 0,5-0,6 при 600 нм. После этого снижали температуру инкубации до 25°С и растили культуру в течение 18-22 ч. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2000 §) и суспендировали осадок в 20 мл лизис-буфера. Суспензию клеток хранили на -20°С.

1.3.3 Выделение рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм, имитирующих фосфорилироеание.

Процедуру разрушения бактериальных клеток и экстракцию цитоплазматических белков проводили так же, как это описано в разделе 1.1.2, посвященном выделению НврВб. К полученному экстракту добавляли сульфат аммония до степени насыщения 60% и инкубировали 30 мин во льду при постоянном перемешивании. По окончании инкубации суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 ¡*, осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли сульфат аммония до степени насыщения 80%. Суспензию инкубировали 30 мин во льду при постоянном перемешивании, после чего центрифугировали 15 мин при 23700 Осадок растворяли в 8 мл буфера М, содержащего 20 мМ МЕБЛЧаОН, рН 6,0, 150 мМ №С1, 0,2 мМ ЭГТА, 14 мМ р-МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Для дальнейшей очистки препарата использовали метод гель-фильтрации. Частично очищенный белок наносили порциями на колонку 8ирегёех200 Н1126/60 (АгпегзЬат-РЬагтаст), уравновешенную буфером М. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 3 мл, состав которых анализировали при помощи ЗБЗ-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество кофилина, объединяли, концентрировали при помощи ультрафильтрации и диализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, содержащего 1 мМ ДТТ вместо ß-МЭ. В полученных препаратах определяли концентрацию белка спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции кофилина-1 при 280 нм равным 0,786 (мг/мл)"1-см"1, а кофилина-2 - 0,992 (мг/мл)"' -см"1. Выход белка с 1 л бактериальной культуры составил 100-150 мг. Полученные препараты делили на аликвоты и хранили при -20°С.

1.4. Получение рекомбинантного каталитического домена LIM-киназы.

1.4.1. Получение молекулярной конструкции для экспрессии каталитического домена ЫМ-киназы.

Плазмида pcDNA3 для экспрессии в эукариотических клетках, содержащая копию участка мРНК, кодирующего каталитический домен LIM-киназы (302-647 аминокислотные остатки), была любезно предоставлена доктором Г. Бокочем (Исследовательский институт Скриппс, Ла-Йолла, Калифорния, США). Для экспрессии каталитического домена в бактериальной системе последовательность переклонировали в вектор рЕТ23(Ь). Для этого ее амплифицировали с использованием «прямого»

А ААТ АС4 ТА rGTCTCCGGGCGCTGGCTCACTG) И «обратного»

ААТТACTCGAGGTCGGGGACCTCAGGGTG) ген-специфичных праймеров, содержащих сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Ndel и Xhol, соответственно (показано курсивом). Состав пробы для полимеразной цепной реакции и последовательность действий при переклонировании аналогичны таковым, описанным в разделе 1.2.1. Необходимо отметить, что «обратный» праймер не содержал стоп-кодон перед сайтом узнавания Xhol. Это позволяло при клонировании вставки в вектор и экспрессии целевого белка получить белок, содержащий последовательность из 8 остатков гистидинов на С-конце.

1.4.2. Экспрессия каталитического домена LIM-киназы.

Компетентные клетки Е. coli BL21(DE3)pLysS трансформировали плазмидой, содержащей последовательность каталитического домена LIM-киназы, и растили «ночную» культуру в объеме 50 мл. «Ночную» культуру вносили в 1 л среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С до достижения суспензией оптической плотности при 600 нм значения 0,5-0,6. После этого суспензию охлаждали до 20°С, добавляли IPTG до концентрации 0,4 мМ и растили при 20°С в течение 18-22 ч. По

38 окончании периода инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2000 g) и суспендировали осадок в 20 мл лизис-буфера, не содержащего ЭДТА. Суспензию клеток хранили на -20°С.

1.4.3. Выделение рекомбинантного каталитического домена ЫМ-киназы.

Процедуру разрушения бактериальных клеток и экстракцию цитоплазматических белков проводили так же, как это описано в разделе 1.1.2, посвященном выделению HspB6. В полученный экстракт добавляли NaCl до концентрации 500 мМ, имидазол и КН2РО4 до концентрации 20 мМ и доводили рН до 7,5. Экстракт наносили на колонку HisTrapHP (Amersham-Pharmacia), предварительно уравновешенную буфером Н, содержащим 20 мМ имидазол, 200 мМ КН2Р04, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Элюцию проводили линейным градиентом (7 объемов колонки) имидазола от 20 до 500 мМ. При проведении хроматографии собирали фракции объемом 1 мл и анализировали их состав методом SDS-электрофореза (см. раздел 11.1), а также проверяли на наличие протеинкиназной активности. Для этого по 5 мкл фракции вносили в 22 мкл инкубационной среды, содержащей 0,9 мг/мл кофилина-1, 0,12 мМ АТР и следовые количества [у- Р]-АТР в буфере Ф (20 мМ трис/НС1, 15 мМ КН2Р04, рН 7,5, 3,5 мМ MgCl2, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ). Включение радиоактивного фосфата определяли так, как это описано в разделе 4.2. Фракции, обладающие наибольшей активностью, объединяли и диализовали в течение ночи против 2 л буфера JI, содержащего 40 мМ трис/HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ. Полученный препарат концентрировали при помощи ультрафильтрации, добавляли равный объем глицерина и хранили при -20°С.

2. Получение компетентных клеток.

Для получения компетентных клеток использовали методику, предложенную Чангом и соавт. с изменениями [171]. Клетки Е.соН с одной колонии переносили в 20 мл среды ЬВ и растили «ночную» культуру в термостате-качалке при 37°С в течение ночи. 2 мл «ночной» культуры переносили в 200 мл среды ЬВ и растили при 37°С до оптической плотности при 600 нм 0,3-0,4. Охлаждали колбу на льду и центрифугировали суспензию клеток 15 мин при 2000 Супернатант стерильно убирали, а осадок ресуспендировали в 7 мл среды ЬВ, содержащей 10% полиэтиленгликоль (Мг 6000), 5% ДМСО, 50 мМ MgCl2, предварительно стерилизованной пропусканием через фильтр с диаметром пор 0,2 цш. Полученную суспензию клеток инкубировали на льду в течение 10 мин, после чего расфасовывали по 300 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

3. Выделение актина из ацетонового порошка.

Актин скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порошка по методу Парди и Спудича [172]. Препарат ацетонового порошка был любезно предоставлен проф. Д.И. Левицким (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН). Навеску порошка ~1 г заливали 20-кратным объемом буфера А (2 мМ трис/HCl, рН 8,0, 0,2 мМ СаС12, 0,2 мМ АТР, 0,5 мМ МЭ, 0,005% азида натрия), экстрагировали на льду при постоянном перемешивании в течение 30 мин и центрифугировали 15 мин при 23700 g. Осадок повторно экстрагировали 10-кратным объемом буфера А и центрифугировали. Супернатанты объединяли и фильтровали через складчатый фильтр. В полученном экстракте инициировали полимеризацию актина добавлением 1 М КС1 и 40 мМ MgCl2 до конечных концентраций 50 мМ и 2 мМ, соответственно. Раствор инкубировали на льду в течение 75 мин без перемешивания для того, чтобы предотвратить фрагментацию образующихся актиновых филаментов. К полученному вязкому раствору добавляли сухой КС1 до конечной концентрации 0,6 М для диссоциации актин-связывающих белков. После добавления соли актиновые филаменты осаждали ультрацентрифугированием в течение 2 ч при 80000 g. К осадку F-актина добавляли 2 мл буфера А и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера. Для деполимеризации раствор F-актина диализовали против 2 л буфера А в течение 2 суток, после чего оставшийся недеполимеризованным F-актин удаляли ультрацентрифугированием при 80000 g в течение 1 ч. В полученном препарате определяли концентрацию актина спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции актина при 290 нм равным 0,66 (мг/млУ'-см"1. Выход белка с 1 г ацетонового порошка составил -10 мг. Полученный препарат актина хранили при +4°С в течение недели.

4. Фосфорилирование белков.

4.1. Фосфорилирование №рВ6 протеинкиназой А.

Для фосфорилирования ШрВб использовали рекомбинантную каталитическую субъединицу сАМР-зависимой протеинкиназы (протеинкиназы А), любезно предоставленную Е.В. Мымриковым. НэрВб (1 мг/мл) фосфорилировали в буфере Ф,

Ч '

1' содержащем 20 мМ трис/НС1, 15 мМ КН2Р04, рН 7,5, 3,5 мМ MgCl2, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ и 0,15 мМ АТР, содержащем следовые количества [у-32Р]-АТР. Перед добавлением препарата протеинкиназы А из реакционной среды отбирали две пробы по 2 мкл, являющиеся контролем на общее содержание радиоактивности в реакционной среде, и пробу в 10 мкл, позволяющую определить неспецифическое связывание радиоактивной АТР с белком в отсутствие фермента. Пробы наносили на фильтры Whatman ЗММ, после чего в реакционную смесь вносили препарат протеинкиназы А и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Каждые 20 мин для контроля включения фосфата в белок из реакционной смеси отбирали пробы по 10 мкл и наносили их на фильтры. Фильтры высушивали и отмывали от низкомолекулярных радиоактивных веществ 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 10 мМ фосфата натрия и 10 мМ пирофосфата натрия. Фильтры, содержащие пробы для определения общего содержание радиоактивности в реакционной среде, оставляли неотмытыми. Высушенные фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость ЖС-106, и считали радиоактивность проб на сцинтилляционном счетчике Rackbeta 1214 (LKB). Зная общее содержание радиоактивности в пробе и включение радиоактивного фосфата в белок по окончании инкубации, рассчитывали степень фосфорилирования HspB6, которая составляла 0,7-0,8 моль фосфата на моль белка. Помимо этого, подбор количества протеинкиназы А и контроль за включением фосфата в HspB6 осуществляли также с помощью метода электрофореза в присутствии мочевины (см. раздел 11.2).

4.2. Фосфорилирование кофилина рекомбинантным каталитическим доменом LIM-киназы.

Для повышения эффективности фосфорилирования кофилина каталитический домен

LIM-киназы предварительно активировали путем фосфорилирования под действием рекомбинантного каталитического фрагмента РАК-киназы, любезно предоставленного к.б.н.

А. Ю. Хапчаевым. Для этого каталитический домен LEM-киназы инкубировали с каталитическим фрагментом РАК-киназы в буфере Ф, содержащем 0,25 мМ АТР, в течение 1 ч при 37°С. После этого реакционную среду разводили буфером Ф таким образом, чтобы концентрация АТР стала равной 0,1 мМ, и вносили кофилин до концентрации 0,5 мг/мл и следовые количества [у-32Р]-АТР. Как и в случае с HspB6, из реакционной смеси отбирали две контрольные пробы и пробу до внесения кофилина и инкубировали смесь в течение 2 ч при 37°С. Каждые 20 мин из реакционной смеси отбирали пробы для контроля включения радиоактивного фосфата в кофилин и наносили их на фильтры. Измерение радиоактивности проб и расчет степени фосфорилирования проводили так же, как это описано в разделе 4.1. В

41

8.2 Иммунопреципитация Н$рВ6.

Для изучения взаимодействия ШрВб с 14-3-3 методом иммунопреципитации пробы готовили следующим образом. Отдельно в пробе объемом 40 мкл смешивали НврВб (0,2 мг/мл) и 14-3-3 (0,3 мг/мл) в буфере И (20 мМ трис/ацетат, рН 7,6, 100 мМ ЫаС1, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ, 2 мг/мл БСА) и переносили инкубационную смесь в пластиковую пробирку, содержащую 30 мкл сефарозы с иммобилизованными антителами на ШрВб. В качестве контроля на неспецифическую сорбцию белков на сефарозе использовали пробу, содержащую сефарозу без иммобилизованных антител. Пробы инкубировали на шейкере в течение 45 мин при комнатной температуре, после чего сефарозу осаждали, супернатант отбрасывали, а сефарозу промывали 750 мкл буфера И, не содержащего БСА. Процесс промывки сефарозы повторяли трижды. После последней промывки супернатант отбирали особенно тщательно, а к сефарозе добавляли 30 мкл 1-кратного БОЭ-буфера для образцов (см. раздел 11.1), который не содержал Р-МЭ, чтобы минимизировать попадание в элюат тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Для более полной элюции связавшихся с сефарозой белков пробы инкубировали 5 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая, после чего сефарозу осаждали, а супернатант отбирали и добавляли к нему 1% Р-МЭ. После предварительного прогрева при 95°С в течение 5 мин белковый состав проб анализировали методом БОБ-электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле. Полученные гели окрашивали красителем Кумасси 11-250, отмывали и сканировали. Интенсивность пятен обсчитывали с помощью программы 1ша§е1.

9. Метод наслаивания (overlay).

Метод наслаивания использовали для исследования связывания HspB6 и кофилина с 14-3-3, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране.

9.1. Метод наслаивания с последующей авторадиографией.

1, 2 и 4 мкг 14-3-3 в объеме 1 мкл наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану высушивали и отмывали от несвязавшегося белка буфером TBST (10 мМ трис/HCl, рН 7,5, 15 мМ NaCl, 0,1% TWEEN20) 3 раза по 5 мин. Мембрану инкубировали в буфере Т (20 мМ трис/HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% TWEEN20), содержащем 3% БСА и либо кофилин, либо HspB6 в концентрации 0,4 мг/мл. При этом образцы кофилина были предварительно фосфорилированы LIM-киназой, а препараты HspB6 были фосфорилированы протеинкиназой А в присутствии радиоактивной АТР. Полученные препараты фосфорилированных белков инкубировали с нитроцеллюлозной мембраной в

45 течение ночи при 4°С. По окончании инкубации мембраны отмывали буфером TBST 4 раза по 5 мин. Мембраны высушивали и подвергали авторадиографии (см. раздел 13). Время экспозиции составляло 2 суток.

9.2. Метод наслаивания с последующей окраской антителами.

1, 2 и 4 мкг 14-3-3 в объеме 1 мкл наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану высушивали и отмывали от несвязавшегося белка буфером TBST 3 раза по 5 мин. После этого мембрану инкубировали в течение 15 мин в буфере TBST, содержащем 5% сухое молоко, для блокировки свободных мест на мембране. После блокирования мембрану инкубировали в буфере Т, содержащем 0,4 мг/мл фосфорилированного или нефосфорилированного кофилина, в течение ночи при 4°С. По окончании инкубации мембраны отмывали буфером TBST 4 раза по 5 мин. Далее мембрану инкубировали 30 минут на шейкере с первичными моноклональными антителами на кофилин (Cell Signalling), разведенными в 1000 раз буфером TBST. Мембрану отмывали и помещали в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Конъюгат был любезно предоставлен д.б.н. А.Г. Катрухой. Мембрану отмывали от вторичных антител и обрабатывали рабочим раствором из набора Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific). После этого мембрану помещали между двумя слоями полиэтиленовой пленки, и закладывали в кассету для авторадиографии Amersham Hypercassete™ (GE Healthcare) с фотопленкой Amersham Hyperfilm™ MP (GE Healthcare). Время экспозиции составляло 1-5 мин. По окончании экспозиции пленку проявляли и фиксировали (см. раздел 13).

10. Коседиментация.

Метод коседиментации использовали для изучения влияния 14-3-3 на взаимодействие кофилина с F-актином. Для полимеризации актина к препарату G-актина в буфере А добавляли 10-кратный полимеризующий раствор, содержащий 0,5 М KCl, 20 мМ MgCb и 10 мМ АТР, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворы кофилина и 14-3-3 предварительно центрифугировали в течение 1 ч при 130000 g. В пробы объемом 50 мкл, содержащие 20 мМ трис/HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl, вносили 20 (iM полимеризованного актина, 20 (iM 14-3-3 и различные количества кофилина (2,5-10 цМ). Пробы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 130000 g 1 ч. Супернатант отбирали, а осадок растворяли в

46

11.2. Электрофорез в присутствии мочевины.

Электрофорез в присутствии мочевины по методу Перри и соавт. [176] позволял разделять нефосфорилированную и фосфорилированные формы НзрВб. Электродный буфер и 15% полиакриламидный гель содержали 20 мМ трис/глицин, рН 8,6. Кроме того, гель содержал мочевину в концентрации 6 М. Для приготовления образцов к белковому раствору добавляли 4-кратный буфер для образцов, содержащий 10 мМ трис/глицин, рН 8,6, 8 М мочевину, 4 % МЭ и 0,004% бромфеноловый синий. Электрофорез проводили при силе тока 15 мА на пластину геля и напряжении 300 В в течение 2,5 ч. Гели окрашивали красителем Кумасси 11-250, отмывали и сканировали.

12. Окрашивание гелей серебром.

Окрашивание гелей серебром применяли в том случае, если было необходимо детектировать на геле очень небольшие количества белка (менее 1 мкг). Последовательность действий при окрашивании гелей серебром была следующей:

1. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 40% этилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 30-60 мин.

2. Промывали 2 раза (по 10 мин) в 10% этиловом спирте.

3. Промывали 5 раз (по 5 мин) водой МПИС?.

4. Инкубировали в ослабителе Фармера (0,15% К3Ре(СМ)6, 0,03% Ш28204, 0,05% ЫагСОз) в течение 2 мин.

5. Промывали 4 раза (по 5 мин) водой МПИС).

6. Инкубировали в 0,1% водном растворе AgNOз в течение 30 мин.

7. Инкубировали в 2,5% растворе Ка2С03 в течение 5 мин.

8. Проявляли в 2,5% растворе ШгСОз, содержащем 0,008% формальдегида.

Время проявления зависело от природы и количества белка, нанесенного на гель. Фиксирование окраски и последующее хранение гелей проводили в 1%-ном растворе уксусной кислоты.

13. Авторадиография.

Полиакриламидные гели, в которых проводили анализ проб, содержащих белок, фосфорилированный в присутствии анализировали при помощи метода авторадиографии. Для этого гели высушивали между двумя слоями целлофановой пленки и закладывали в кассету для авторадиографии Amersham Hypercassete™ (GE Healthcare) с фотопленкой Amersham Hyperfilm™ MP (GE Healthcare). Время экспозиции зависело от уровня радиоактивности исследуемых образцов. По окончании экспозиции пленку помещали в проявитель, содержащий 0,22% метол, 7,2% сульфит натрия, 0,88% гидрохинон, 4,8% углекислый натрий и 0,4% бромистый калий. После этого пленку промывали водой и помещали в фиксирующий раствор, содержащий 26% тиосульфат натрия, 5% хлористый аммоний и 1,7% пиросернистокислый натрий, промывали водой и высушивали.

14. Сиектрофотометрическое определение концентрации белка.

Концентрацию белка в гомогенных препаратах, полученных после выделения и очистки, определяли спектрофотометрическим методом. Для этого измеряли оптическую плотность образцов при 280 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100 pro (Amersham Biosciences) против соответствующего буфера. Исключение составлял препарат актина, концентрацию которого измеряли при 290 нм из-за наличия в буфере А 0,2 мМ АТР. При расчете концентрации белка использовали коэффициенты экстинкции, приведенные в таблице 1.

Таблица 1. Весовые коэффициенты экстинкции (е), используемые для спектрофотометрического определения концентраций некоторых белков.

Белок £,-(мг/мл)"1'СМ"1 Длина волны, нм Источник

HspB6 0,582 280 UniProtKB 014558

14-З-ЗС 0,987 280 UniProtKB Р63104

Кофилин-1 0,786 280 UniProtKB Р23528

Кофилин-2 0,992 280 UniProtKB Q9Y281

Актин 0,660 290 [177]

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Получение рекомбинантного HspB6 человека.

Для получения больших количеств целевого белка часто используется метод препаративной экспрессии рекомбинантного белка в клетках Е. coli. Благодаря повышенной экспрессии этот метод позволяет получать большие количества белка и существенно упростить процедуру очистки. Кроме того, этот метод позволяет получать белки таких организмов, выделение из которых затруднительно, например, белки из тканей человека.

Для того, чтобы экспрессировать целевой белок, необходимо сначала трансформировать клетки Е. coli плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую этот белок. Для успешной трасформации бактериальные клетки подвергаются либо химической обработке, либо электропорации. В нашей работе мы получали компетентные клетки химическим методом, после чего смешивали их с плазмидой, содержащей полноразмерную копию мРНК HspB6 человека, и подвергали кратковременному тепловому шоку, чтобы обеспечить эффективное проникновение ДНК в клетку бактерии.

Методика экспрессии HspB6 была разработана в нашей лаборатории О.В. Букач и соавт. [34]. Согласно этой методике, клетки растили в жидкой среде LB при постоянном перемешивании при 37°С. После достижения бактериальной культурой логарифмической стадии роста (оптическая плотность суспензии при 600 нм составляла 0,5-0,6) синтез HspB6 инициировали добавлением 0,5 мМ EPTG и продолжали инкубацию в течение 4 ч. На каждой стадии из суспензии отбирали пробы и анализировали экспрессию HspB6 методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Как видно на рис.6, добавление в среду IPTG вызывает накопление в клетках бактерий белка с кажущейся молекулярной массой 20 кДа, соответствующей кажущейся молекулярной массе HspB6, при этом указанный белок находился преимущественно в растворимой фракции. выводы

1. Установлено, что фосфорилированный сАМР-зависимой протеинкиназой НэрВб прочно взаимодействует с 14-3-3^; образующиеся комплексы НзрВб/14-3-3 имеют стехиометрию 1:2 или 2:2.

2. Мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, влияют на связывание 14-3-3 с НврВб, при этом мутация 858Е ослабляет, а мутация Б184Е увеличивает прочность образующегося комплекса.

3. Мутации, предотвращающие димеризацию, не влияют на способность 14-3-3 избирательно и с высоким сродством взаимодействовать с фосфорилированным НБрВб; стехиометрия образующихся комплексов составляет 1:1.

4. 14-3-3^ не образует прочных комплексов с кофилином, фосфорилированным ЫМ-киназой, и не влияет на связывание кофилина с Б- и в-актином.

5. Опровергнута гипотеза о том, что фосфорилированный НэрВб вызывает расслабление гладких мышц, вытесняя кофилин из его комплекса с 14-3-3. Высказано предположение, что фосфорилированный НврВб может вытеснять из комплексов с 14-3-3 протеинкиназы и/или протеинфосфатазы кофилина и, таким образом, регулировать реорганизацию актинового цитоскелета. chaperone alphaB-crystallin elucidated by a triple hybrid approach. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011.108(51): p. 20491-6.

25. Lambert, H., S.J. Charette, A.F. Beraier, A. Guimond, and J. Landry, HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J Biol Chem, 1999. 274(14): p. 9378-85.

26. Theriault, J.R., H. Lambert, A.T. Chavez-Zobel, G. Charest, P. Lavigne, and J. Landry, Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J Biol Chem, 2004. 279(22): p. 23463-71.

27. Yang, C., J.C. Salerno, and J.F. Koretz, NH2-terminal stabilization of small heat shock protein structure: a comparison of two NH2-terminal deletion mutants of alphaA-crystallin. Mol Vis, 2005.11: p. 641-7.

28. Hayes, D., V. Napoli, A. Mazurkie, W.F. Stafford, and P. Graceffa, Phosphorylation dependence ofhsp27 multimeric size and molecular chaperone function. J Biol Chem, 2009. 284(28): p. 18801-7.

29. Aquilina, J.A., J.L. Benesch, L.L. Ding, O. Yaron, J. Horwitz, and C.V. Robinson, Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Chem, 2004. 279(27): p. 28675-80.

30. McHaourab, H.S., J.A. Godar, and P.L. Stewart, Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins. Biochemistry, 2009. 48(18): p. 3828-37.

31. Haslbeck, M., S. Walke, T. Stromer, M. Ehrnsperger, H.E. White, S. Chen, H.R. Saibil, and J. Buchner, Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J, 1999.18(23): p. 6744-51.

32. Horwitz, J., Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(21): p. 10449-53.

33. Ehrnsperger, M., S. Graber, M. Gaestel, and J. Buchner, Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J, 1997.16(2): p. 221-9.

34. Bukach, O.V., A.S. Seit-Nebi, S.B. Marston, and N.B. Gusev, Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur J Biochem, 2004. 271(2): p. 291-302.

35. Khanova, H.A., K.A. Markossian, S.Y. Kleimenov, D.l. Levitsky, N.A. Chebotareva, N.V. Golub, R.A. Asryants, V.I. Muronetz, L. Saso, I.K. Yudin, K.O. Muranov, M.A. Ostrovsky, and B.I. Kurganov, Effect of alpha-crystallin on thermal denaturation and aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biophys Chem, 2007. 125(2-3): p. 521-31.

47. van de Klundert, F.A., R.H. Smulders, M.L. Gijsen, R.A. Lindner, R. Jaenicke, J.A. Carver, and W.W. de Jong, The mammalian small heat-shock protein Hsp20 forms dimers and is a poor chaperone. Eur J Biochem, 1998. 258(3): p. 1014-21.

48. Arrigo, A.P., The cellular "networking" of mammalian Hsp27 and its functions in the control of protein folding, redox state and apoptosis. Adv Exp Med Biol, 2007. 594: p. 1426.

49. Dreiza, C.M., C.M. Brophy, P. Komalavilas, E.J. Furnish, L. Joshi, M.A. Pallero, J.E. Murphy-Ullrich, M. von Rechenberg, Y.S. Ho, B. Richardson, N. Xu, Y. Zhen, J.M. Peltier, and A. Panitch, Transducible heat shock protein 20 (HSP20) phosphopeptide alters cytoskeletal dynamics. FASEB J, 2005. 19(2): p. 261-3.

50. Chernik, I.S., A.S. Seit-Nebi, S.B. Marston, and N.B. Gusev, Small heat shock protein Hsp20 (HspB6) as a partner of 14-3-3gamma. Mol Cell Biochem, 2007. 295(1-2): p. 9-17.

51. Dreiza, C.M., P. Komalavilas, E.J. Furnish, C.R. Flynn, M.R. Sheller, C.C. Smoke, L.B. Lopes, and C.M. Brophy, The small heat shock protein, HSPB6, in muscle function and disease. Cell Stress Chaperones, 2010.15(1): p. 1-11.

52. Carra, S., S.J. Seguin, H. Lambert, and J. Landry, HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem, 2008. 283(3): p. 1437-44.

53. Shemetov, A. A. and N.B. Gusev, Biochemical characterization of small heat shock protein HspB8 (Hsp22)-Bag3 interaction. Arch Biochem Biophys, 2011. 513(1): p. 1-9.

54. Sun, Y. and T.H. MacRae, The small heat shock proteins and their role in human disease. FEBS J, 2005. 272(11): p. 2613-27.

55. Boncoraglio, A., M. Minoia, and S. Carra, The family of mammalian small heat shock proteins (HSPBs): Implications in protein deposit diseases and motor neuropathies. Int J Biochem Cell Biol, 2012.

56. Kato, K., S. Goto, Y. Inaguma, K. Hasegawa, R. Morishita, and T. Asano, Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha B crystallin. J Biol Chem, 1994. 269(21): p. 15302-9.

57. Kappe, G., E. Franck, P. Verschuure, W.C. Boelens, J.A. Leunissen, and W.W. de Jong, The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones, 2003. 8(1): p. 53-61.

58. Taylor, R.P. and I.J. Benjamin, Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J Mol Cell Cardiol, 2005. 38(3): p. 433-44.

71. Tessier, D.J., P. Komalavilas, A. Panitch, L. Joshi, and C.M. Brophy, The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. J Surg Res, 2003.111(1): p. 152-7.

72. Golenhofen, N., M.D. Perng, R.A. Quinlan, and D. Drenckhahn, Comparison of the small heat shock proteins alphaB-crystallin, MKBP, HSP25, HSP20, and cvHSP in heart and skeletal muscle. Histochem Cell Biol, 2004.122(5): p. 415-25.

73. Bukach, O.V., S.B. Marston, and N.B. Gusev, Small heat shock protein with apparent molecular mass 20 kDa (Hsp20, HspB6) is not a genuine actin-hinding protein. J Muscle Res Cell Motil, 2005. 26(4-5): p. 175-81.

74. Bukach, O.V., A.E. Glukhova, A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins HspBl (Hsp27) and HspB6 (Hsp20). Biochim Biophys Acta, 2009.1794(3): p. 486-95.

75. Mymrikov, E.V., A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones, 2012.17(2): p. 157-69.

76. Fontaine, J.M., X. Sun, R. Benndorf, and M.J. Welsh, Interactions ofHSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 337(3): p. 1006-11.

77. Takuwa, Y., G. Kelley, N. Takuwa, and H. Rasmussen, Protein phosphorylation changes in bovine carotid artery smooth muscle during contraction and relaxation. Mol Cell Endocrinol, 1988. 60(1): p. 71-86.

78. Beall, A.C., K. Kato, J.R. Goldenring, H. Rasmussen, and C.M. Brophy, Cyclic nucleotide-dependent vasorelaxation is associated with the phosphorylation of a small heat shock-related protein. J Biol Chem, 1997. 272(17): p. 11283-7.

79. Beall, A., D. Bagwell, D. Woodrum, T.A. Stoming, K. Kato, A. Suzuki, H. Rasmussen, and C.M. Brophy, The small heat shock-related protein, HSP20, is phosphorylated on serine 16 during cyclic nucleotide-dependent relaxation. J Biol Chem, 1999. 274(16): p. 11344-51.

80. Edwards, H.V., J.D. Scott, and G.S. Baillie, PKA phosphorylation of the small heat-shock protein Hsp20 enhances its cardioprotective effects. Biochem Soc Trans, 2012. 40(1): p. 210-4.

81. Wang, Y., A. Xu, R.B. Pearson, and G.J. Cooper, Insulin and insulin antagonists evoke phosphorylation of P20 at serine 157 and serine 16 respectively in rat skeletal muscle. FEBS Lett, 1999. 462(1-2): p. 25-30.

82. Wang, Y., A. Xu, J. Ye, E.W. Kraegen, C.A. Tse, and G.J. Cooper, Alteration in phosphorylation ofP20 is associated with insulin resistance. Diabetes, 2001. 50(8): p. 18217.

83. van de Klundert, F., I.P. van den, GJ. Stege, and W.W. de Jong, Rat Hsp20 confers thermoresistance in a clonal survival assay, but fails to protect coexpressed luciferase in Chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 254(1): p. 164-8.

84. Edwards, H.V., R.T. Cameron, and G.S. Baillie, The emerging role of HSP20 as a multifunctional protective agent. Cell Signal, 2011. 23(9): p. 1447-54.

85. Chu, G., G.F. Egnaczyk, W. Zhao, S.H. Jo, G.C. Fan, J.E. Maggio, R.P. Xiao, and E.G. Kranias, Phosphoproteome analysis of cardiomyocytes subjected to beta-adrenergic stimulation: identification and characterization of a cardiac heat shock protein p20. Circ Res, 2004. 94(2): p. 184-93.

86. Nicolaou, P., R. Knoll, K. Haghighi, G.C. Fan, G.W. Dorn, 2nd, G. Hasenfub, and E.G. Kranias, Human mutation in the anti-apoptotic heat shock protein 20 abrogates its cardioprotective effects. J Biol Chem, 2008. 283(48): p. 33465-71.

87. Fan, G.C., X. Ren, J. Qian, Q. Yuan, P. Nicolaou, Y. Wang, W.K. Jones, G. Chu, and E.G. Kranias, Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusion injury. Circulation, 2005.111(14): p. 1792-9.

88. Fan, G.C., X. Zhou, X. Wang, G. Song, J. Qian, P. Nicolaou, G. Chen, X. Ren, and E.G. Kranias, Heat shock protein 20 interacting with phosphorylated Akt reduces doxorubicin-triggered oxidative stress and cardiotoxicity. Circ Res, 2008.103(11): p. 1270-9.

89. Wang, X., B. Zingarelli, M. O'Connor, P. Zhang, A. Adeyemo, E.G. Kranias, Y. Wang, and G.C. Fan, Overexpression of Hsp20 prevents endotoxin-induced myocardial dysfunction and apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation. J Mol Cell Cardiol, 2009. 47(3): p. 38290.

90. Fan, G.C., Q. Yuan, G. Song, Y. Wang, G. Chen, J. Qian, X. Zhou, Y.J. Lee, M. Ashraf, and E.G. Kranias, Small heat-shock protein Hsp20 attenuates beta-agonist-mediated cardiac remodeling through apoptosis signal-regulating kinase 1. Circ Res, 2006. 99(11): p. 123342.

91. Qian, J., X. Ren, X. Wang, P. Zhang, W.K. Jones, J.D. Molkentin, G.C. Fan, and E.G. Kranias, Blockade of Hsp20 phosphorylation exacerbates cardiac ischemia/reperfusion injury by suppressed autophagy and increased cell death. Circ Res, 2009.105(12): p. 122331.

92. Zhang, X., X. Wang, H. Zhu, E.G. Kranias, Y. Tang, T. Peng, J. Chang, and G.C. Fan, Hsp20 functions as a novel cardiokine in promoting angiogenesis via activation of VEGFR2. PLoS One, 2012. 7(3): p. e32765.

105. Birkenfeld, J., H. Betz, and D. Roth, Identification of cofilin and LIM-domain-containing protein kinase 1 as novel interaction partners of 14-3-3 zeta. Biochem J, 2003. 369(Pt 1): p. 45-54.

106. Bamburg, J.R. and B.W. Bernstein, Roles of ADF/cofilin in actin polymerization and beyond. F1000 Biol Rep, 2010. 2: p. 62.

107. Oser, M. and J. Condeelis, The cofilin activity cycle in lamellipodia and invadopodia. J Cell Biochem, 2009.108(6): p. 1252-62.

108. Carlier, M.F., V. Laurent, J. Santolini, R. Melki, D. Didry, G.X. Xia, Y. Hong, N.H. Chua, and D. Pantaloni, Actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) enhances the rate of filament turnover: implication in actin-based motility. J Cell Biol, 1997.136(6): p. 1307-22.

109. Ichetovkin, I., W. Grant, and J. Condeelis, Cofilin produces newly polymerized actin filaments that are preferred for dendritic nucleation by the Arp2/3 complex. Curr Biol, 2002.12(1): p. 79-84.

110. Andrianantoandro, E. and T.D. Pollard, Mechanism of actin filament turnover by severing and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol Cell, 2006. 24(1): p. 13-23.

111. Yonezawa, N., E. Nishida, K. Iida, I. Yahara, and H. Sakai, Inhibition of the interactions of cofilin, destrin, and deoxyribonuclease I with actin by phosphoinositides. J Biol Chem, 1990. 265(15): p. 8382-6.

112. van Rheenen, J., X. Song, W. van Roosmalen, M. Cammer, X. Chen, V. Desmarais, S.C. Yip, J.M. Backer, R.J. Eddy, and J.S. Condeelis, EGF-inducedPIP2 hydrolysis releases and activates cofilin locally in carcinoma cells. J Cell Biol, 2007. 179(6): p. 1247-59.

113. Frantz, C., G. Barreiro, L. Dominguez, X. Chen, R. Eddy, J. Condeelis, M.J. Kelly, M.P. Jacobson, and D.L. Barber, Cofilin is a pH sensor for actin free barbed end formation: role ofphosphoinositide binding. J Cell Biol, 2008.183(5): p. 865-79.

114. Arber, S., F.A. Barbayannis, H. Hanser, C. Schneider, C.A. Stanyon, O. Bernard, and P. Caroni, Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. Nature, 1998. 393(6687): p. 805-9.

115. Scott, R.W. and M.F. Olson, LIMkinases: function, regulation and association with human disease. J Mol Med (Berl), 2007. 85(6): p. 555-68.

116. Toshima, J., J.Y. Toshima, T. Amano, N. Yang, S. Narumiya, and K. Mizuno, Cofilin phosphorylation by protein kinase testicular protein kinase 1 and its role in integrin-mediated actin reorganization and focal adhesion formation. Mol Biol Cell, 2001. 12(4): p. 1131-45.

117.

118.

119.

120.

121.

122.

123.

124.

125,

126.

127

128

129,

Toshima, J., J.Y. Toshima, K. Takeuchi, R. Mori, and K. Mizuno, Cofilin phosphorylation and actin reorganization activities of testicular protein kinase 2 and its predominant expression in testicular Sertoli cells. J Biol Chem, 2001. 276(33): p. 31449-58. Edwards, D.C., L.C. Sanders, G.M. Bokoch, and G.N. Gill, Activation of LIM-kinase by Pakl couples Rac/Cdc42 GTPase signalling to actin cytoskeletal dynamics. Nat Cell Biol, 1999.1(5): p. 253-9.

Toshima, J.Y., J. Toshima, T. Watanabe, and K. Mizuno, Binding of 14-3-3beta regulates the kinase activity and subcellular localization of testicular protein kinase 1. J Biol Chem, 2001. 276(46): p. 43471-81.

Nagata-Ohashi, K., Y. Ohta, K. Goto, S. Chiba, R. Mori, M. Nishita, K. Ohashi, K. Kousaka, A. Iwamatsu, R. Niwa, T. Uemura, and K. Mizuno, A pathway of neuregulin-induced activation of cofilin-phosphatase Slingshot and cofilin in lamellipodia. J Cell Biol, 2004.165(4): p. 465-71.

Niwa, R., K. Nagata-Ohashi, M. Takeichi, K. Mizuno, and T. Uemura, Control of actin reorganization by Slingshot, a family of phosphatases that dephosphorylate ADF/cofilin. Cell, 2002.108(2): p. 233-46.

Gohla, A., J. Birkenfeld, and G.M. Bokoch, Chronophin, a novel HAD-type serine protein phosphatase, regulates cofilin-dependent actin dynamics. Nat Cell Biol, 2005. 7(1): p. 21-9. Soosairajah, J., S. Maiti, O. Wiggan, P. Sarmiere, N. Moussi, B. Sarcevic, R. Sampath, J.R. Bamburg, and O. Bernard, Interplay between components of a novel LIM kinase-slingshot phosphatase complex regulates cofilin. EMBO J, 2005. 24(3): p. 473-86. Eiseler, T., H. Doppler, I.K. Yan, K. Kitatani, K. Mizuno, and P. Storz, Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nat Cell Biol, 2009.11(5): p. 545-56.

Aitken, A., 14-3-3 proteins: a historic overview. Semin Cancer Biol, 2006.16(3): p. 162-72. Sluchanko, N.N. and N.B. Gusev, 14-3-3 proteins and regulation of cytoskeleton. Biochemistry (Mosc), 2010. 75(13): p. 1528-46.

Boston, P.F., P. Jackson, and R.J. Thompson, Human 14-3-3 protein: radioimmunoassay, tissue distribution, and cerebrospinal fluid levels in patients with neurological disorders. J Neurochem, 1982. 38(5): p. 1475-82.

Subramanian, R.R., S.C. Masters, H. Zhang, and H. Fu, Functional conservation of 14-3-3 isoforms in inhibiting bad-induced apoptosis. Exp Cell Res, 2001. 271(1): p. 142-51. Van Der Hoeven, P.C., J.C. Van Der Wal, P. Ruurs, M.C. Van Dijk, and J. Van Blitterswijk, 14-3-3 isotypes facilitate coupling of protein kinase C-zeta to Raf-1: negative regulation by 14-3-3 phosphorylation. Biochem J, 2000. 345 Pt 2: p. 297-306.

130. Jones, D.H., S. Ley, and A. Aitken, Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. FEBS Lett, 1995.368(1): p. 55-8.

131. Liang, X., M.B. Butterworth, K.W. Peters, W.H. Walker, and R.A. Frizzell, An obligatory heterodimer of 14-3-3beta and 14-3-3epsilon is required for aldosterone regulation of the epithelial sodium channel. J Biol Chem, 2008. 283(41): p. 27418-25.

132. Verdoodt, B., A. Benzinger, G.M. Popowicz, T.A. Holak, and H. Hermeking, Characterization of 14-3-3sigma dimerization determinants: requirement of homodimerization for inhibition of cell proliferation. Cell Cycle, 2006. 5(24): p. 2920-6.

133. Freeman, A.K. and D.K. Morrison, 14-3-3 Proteins: diverse functions in cell proliferation and cancer progression. Semin Cell Dev Biol, 2011. 22(7): p. 681-7.

134. Xiao, B., S.J. Smerdon, D.H. Jones, G.G. Dodson, Y. Soneji, A. Aitken, and S.J. Gamblin, Structure of a 14-3-3 protein and implications for coordination of multiple signalling pathways. Nature, 1995. 376(6536): p. 188-91.

135. Liu, D., J. Bienkowska, C. Petosa, R.J. Collier, H. Fu, and R. Liddington, Crystal structure of thezeta isoform of the 14-3-3 protein. Nature, 1995. 376(6536): p. 191-4.

136. Gardino, A.K., S.J. Smerdon, and M.B. Yaffe, Structural determinants of 14-3-3 binding specificities and regulation of subcellular localization of 14-3-3-ligand complexes: a comparison of the X-ray crystal structures of all human 14-3-3 isoforms. Semin Cancer Biol, 2006.16(3): p. 173-82.

137. Yaffe, M.B., K. Rittinger, S. Volinia, P.R. Caron, A. Aitken, H. Leffers, S.J. Gamblin, S.J. Smerdon, and L.C. Cantley, The structural basis for 14-3-3:phosphopeptide binding specificity. Cell, 1997. 91(7): p. 961-71.

138. Obsil, T., R. Ghirlando, D.C. Klein, S. Ganguly, and F. Dyda, Crystal structure of the 14-3-3zeta:serotonin N-acetyltransferase complex, a role for scaffolding in enzyme regulation. Cell, 2001.105(2): p. 257-67.

139. Mackintosh, C., Dynamic interactions between 14-3-3 proteins and phosphoproteins regulate diverse cellular processes. Biochem J, 2004. 381(Pt 2): p. 329-42.

140. Muslin, A.J., J.W. Tanner, P.M. Allen, and A.S. Shaw, Interaction of 14-3-3 with signaling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine. Cell, 1996. 84(6): p. 889-97.

141. Coblitz, B., M. Wu, S. Shikano, and M. Li, C-terminal binding: an expanded repertoire and function of 14-3-3proteins. FEBS Lett, 2006. 580(6): p. 1531-5.

142. Bustos, D.M. and A.A. Iglesias, Intrinsic disorder is a key characteristic in partners that bind 14-3-3 proteins. Proteins, 2006. 63(1): p. 35-42.

143. Kostelecky, B., A.T. Saurin, A. Purkiss, P.J. Parker, and N.Q. McDonald, Recognition of an intra-chain tandem 14-3-3 binding site within PKCepsilon. EMBO Rep, 2009. 10(9): p. 983-9.

144. Obsil, T., R. Ghirlando, D.E. Anderson, A.B. Hickman, and F. Dyda, Two 14-3-3 binding motifs are required for stable association of Forkhead transcription factor F0X04 with 143-3 proteins and inhibition ofDNA binding. Biochemistry, 2003. 42(51): p. 15264-72.

145. Yaffe, M.B., How do 14-3-3 proteins work?— Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Lett, 2002. 513(1): p. 53-7.

146. Yasmin, L., A.L. Jansson, T. Panahandeh, R.H. Palmer, M.S. Francis, and B. Hallberg, Delineation of exoenzyme S residues that mediate the interaction with 14-3-3 and its biological activity. FEBS J, 2006. 273(3): p. 638-46.

147. Muslin, A.J. and H. Xing, 14-3-3 proteins: regulation of subcellular localization by molecular interference. Cell Signal, 2000.12(11-12): p. 703-9.

148. Ichimura, T., J. Uchiyama, O. Kunihiro, M. Ito, T. Horigome, S. Omata, F. Shinkai, H. Kaji, and T. Isobe, Identification of the site of interaction of the 14-3-3 protein with phosphorylated tryptophan hydroxylase. J Biol Chem, 1995. 270(48): p. 28515-8.

149. Tzivion, G., Z. Luo, and J. Avruch, A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature, 1998. 394(6688): p. 88-92.

150. Shen, Y.H., J. Godlewski, A. Bronisz, J. Zhu, M.J. Comb, J. Avruch, and G. Tzivion, Significance of 14-3-3 self-dimerization for phosphorylation-dependent target binding. Mol Biol Cell, 2003.14(11): p. 4721-33.

151. Messaritou, G., S. Grammenoudi, and E.M. Skoulakis, Dimerization is essential for 14-3-3zeta stability andfunction in vivo. J Biol Chem, 2010. 285(3): p. 1692-700.

152. Zhou, Y., S. Reddy, H. Murrey, H. Fei, and I.B. Levitan, Monomeric 14-3-3 protein is sufficient to modulate the activity of the Drosophila slowpoke calcium-dependent potassium channel. J Biol Chem, 2003. 278(12): p. 10073-80.

153. Han, D., G. Ye, T. Liu, C. Chen, X. Yang, B. Wan, Y. Pan, and L. Yu, Functional identification of a novel 14-3-3 epsilon splicing variant suggests dimerization is not necessary for 14-3-3 epsilon to inhibit UV-induced apoptosis. Biochem Biophys Res Commun, 2010. 396(2): p. 401-6.

154. Aitken, A., Post-translational modification of 14-3-3 isoforms and regulation of cellular function. Semin Cell Dev Biol, 2011. 22(7): p. 673-80.

155. Powell, D.W., M.J. Rane, Q. Chen, S. Singh, and K.R. McLeish, Identification of 14-3-3zeta as a protein kinase B/Akt substrate. J Biol Chem, 2002. 277(24): p. 21639-42.

156. Powell, D.W., M.J. Rane, B.A. Joughin, R. Kalmukova, J.H. Hong, B. Tidor, W.L. Dean, W.M. Pierce, J.B. Klein, M.B. Yaffe, and K.R. McLeish, Proteomic identification of 14-3-3zeta as a mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 substrate: role in dimerformation and ligand binding. Mol Cell Biol, 2003. 23(15): p. 5376-87.

157. Gu, Y.M., Y.H. Jin, J.K. Choi, K.H. Baek, C.Y. Yeo, and K.Y. Lee, Protein kinase A phosphorylates and regulates dimerization of 14-3-3 epsilon. FEBS Lett, 2006. 580(1): p. 305-10.

158. Zhou, J., Z. Shao, R. Kerkela, H. Ichijo, A.J. Muslin, C. Pombo, and T. Force, Serine 58 of 14-3-3zeta is a molecular switch regulating ASK1 and oxidant stress-induced cell death. Mol Cell Biol, 2009. 29(15): p. 4167-76.

159. Woodcock, J.M., J. Murphy, F.C. Stomski, M.C. Berndt, and A.F. Lopez, The dimeric versus monomeric status of 14-3-3zeta is controlled by phosphorylation of Ser58 at the dimer interface. J Biol Chem, 2003. 278(38): p. 36323-7.

160. Kanno, T. and T. Nishizaki, Sphingosine induces apoptosis in hippocampal neurons and astrocytes by activating caspase-3/-9 via a mitochondrial pathway linked to SDK/14-3-3 protein/Bax/cytochrome c. J Cell Physiol, 2011. 226(9): p. 2329-37.

161. Woodcock, J.M., Y. Ma, C. Coolen, D. Pham, C. Jones, A.F. Lopez, and S.M. Pitson, Sphingosine and FTY720 directly bind pro-survival 14-3-3 proteins to regulate their function. Cell Signal, 2010. 22(9): p. 1291-9.

162. Tsuruta, F., J. Sunayama, Y. Mori, S. Hattori, S. Shimizu, Y. Tsujimoto, K. Yoshioka, N. Masuyama, and Y. Gotoh, JNK promotes Box translocation to mitochondria through phosphorylation of 14-3-3 proteins. EMBO J, 2004. 23(8): p. 1889-99.

163. Sunayama, J., F. Tsuruta, N. Masuyama, and Y. Gotoh, JNK antagonizes Akt-mediated survival signals by phosphorylating 14-3-3. J Cell Biol, 2005.170(2): p. 295-304.

164. Yoshida, K., T. Yamaguchi, T. Natsume, D. Kufe, and Y. Miki, JNK phosphorylation of 143-3 proteins regulates nuclear targeting of c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nat Cell Biol, 2005. 7(3): p. 278-85.

165. Truong, A.B., S.C. Masters, H. Yang, and H. Fu, Role of the 14-3-3 C-terminal loop in ligand interaction. Proteins, 2002. 49(3): p. 321-5.

166. Silhan, J., V. Obsilova, J. Vecer, P. Herman, M. Sulc, J. Teisinger, and T. Obsil, 14-3-3 protein C-terminal stretch occupies ligand binding groove and is displaced by phosphopeptide binding. J Biol Chem, 2004. 279(47): p. 49113-9.

167. Dubois, T., C. Rommel, S. Howell, U. Steinhussen, Y. Soneji, N. Morrice, K. Moelling, and A. Aitken, 14-3-3 is phosphorylated by casein kinase I on residue 233. Phosphorylation at this site in vivo regulates Raf/14-3-3 interaction. J Biol Chem, 1997. 272(46): p. 28882-8.

168. Obsilova, V., P. Herman, J. Vecer, M. Sulc, J. Teisinger, and T. Obsil, 14-3-3zeta C-terminal stretch changes its conformation upon ligand binding and phosphorylation at Thr232. J Biol Chem, 2004. 279(6): p. 4531-40.

169. An, S.S., P.S. Askovich, T.I. Zarembinski, K. Ahn, J.M. Peltier, M. von Rechenberg, S. Sahasrabudhe, and J.J. Fredberg, A novel small molecule target in human airway smooth muscle for potential treatment of obstructive lung diseases: a staged high-throughput biophysical screening. Respir Res, 2011.12: p. 8.

170. Studier, F.W., Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 207-34.

171. Chung, C.T., S.L. Niemela, and R.H. Miller, One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86(7): p. 2172-5.

172. Pardee, J.D. and J. A. Spudich, Purification of muscle actin. Methods Enzymol, 1982. 85 Pt B: p. 164-81.

173. Schaub, M.C. and S.V. Perry, The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. Biochem J, 1969.115(5): p. 993-1004.

174. Nosworthy, N.J., M. Kekic, and C.G. dos Remedios, The affinity of chick cofilin for actin increases when actin is complexed with DNase I: formation of a cofilin-actin-DNase I ternary complex. Proteomics, 2001.1(12): p. 1513-8.

175. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

176. Perrie, W.T. and S.V. Perry, An electrophoretic study of the low-molecular-weight components of myosin. Biochem J, 1970.119(1): p. 31-8.

177. Houk, T.W., Jr. and K. Ue, The measurement of actin concentration in solution: a comparison of methods. Anal Biochem, 1974. 62(1): p. 66-74.

178. Sluchanko, N.N., I.S. Chernik, A.S. Seit-Nebi, A.V. Pivovarova, D.I. Levitsky, and N.B. Gusev, Effect of mutations mimicking phosphorylation on the structure and properties of human 14-3-3zeta. Arch Biochem Biophys, 2008. 477(2): p. 305-12.

179. Yang, X., W.H. Lee, F. Sobott, E. Papagrigoriou, C.V. Robinson, J.G. Grossmann, M. Sundstrom, D.A. Doyle, and J.M. Elkins, Structural basis for protein-protein interactions in the 14-3-3 protein family. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(46): p. 17237-42.

180. Moriyama, K., K. Iida, and I. Yahara, Phosphorylation of Ser-3 of cofilin regulates its essential function on actin. Genes Cells, 1996.1(1): p. 73-86.

181. Datskevich, P.N., E.V. Mymrikov, N.N. Sluchanko, A.A. Shemetov, M.V. Sudnitsyna, and N.B. Gusev, Expression, purification and some properties offluorescent chimeras of human small heat shock proteins. Protein Expr Purif, 2012. 82(1): p. 45-54.

182. Sarmiere, P.D. and J.R. Bamburg, Regulation of the neuronal actin cytoskeleton by ADF/cofilin. J Neurobiol, 2004. 58(1): p. 103-17.

183. Agnew, B.J., L.S. Minamide, and J.R. Bamburg, Reactivation of phosphorylated actin depolymerizing factor and identification of the regulatory site. J Biol Chem, 1995. 270(29): p. 17582-7.

184. Chen, H., B.W. Bernstein, and J.R. Bamburg, Regulating actin-filament dynamics in vivo. Trends Biochem Sci, 2000. 25(1): p. 19-23.