Роль мембранной матриксной металлопротеиназы-1 в протеолитической модификации и функциональной активации α v β3 интегрина в раковых клетках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ратников, Борис Игоревич

• Ратников, Борис Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ратников, Борис Игоревич

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Материалы и методы.

Результаты. —

Обсуждение.

ВЫВОДЫ.>-л

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль мембранной матриксной металлопротеиназы-1 в протеолитической модификации и функциональной активации α v β3 интегрина в раковых клетках»

Взаимодействие клеток с внеклеточным матр иксом (ВКМ) критически необходимо для нормального развития и функционирования организма. Регуляция этого взаимодействия осуществляется посредством уникальной протеолитической системы, ответственной за гидролиз разнообразных компонентов ВКМ [1]. Ферментативные системы регулируют целостность и состав ВКМ и играют ключевую роль в контролировании сигналов, вызываемых в клетках различными молекулами ВКМ. В свою очередь, эти сигналы регулируют клеточную пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Круговорот и перестройка ВКМ должны эффективно регулироваться, так как неконтролируемый протеолиз его компонентов приводит к аномальному развитию организма и появлению целого ряда патологических состояний, связанных или с чрезмерной, или с недостаточной деградацией компонентов ВКМ.

Матриксные металлопр отеиназы (ММП) - это цинк-зависимые эндопептидазы, способные гидролизовать один или более компонентов ВКМ, а также нематриксные белки. ММП включают в себя большое семейство ферментов, которые имеют общие структурные и функциональные элементы и являются продуктами разных генов. В настоящее время известно около 28 металлопротеиназ и этот список постоянно пополняется. Существует множество свидетельств в пользу роли ММП в нормальных и патологических процессах, включая эмбриогенез, заживление ран, воспаление, артрит и рак.

Взаимосвязь между ММП и раковым метастазированием является предметом повышенного интереса. ММП служат объектом терапевтического вмешательства с использованием новых лекарственных средств, направленных на ингибирование их активности. В связи с этим понимание структуры и функции ММП имеет важное значение для терапии рака [2-6]. Большие усилия затрачиваются на разработку и клинические испытания ингибиторов ММП общего действия [7, 8]. Тем не менее, к настоящему времени не удалось создать клинически эффективных препаратов на их основе. Очевидно, что для создания противоопухолевых лекарственных средств необходимы фундаментальные знания о процессах, в которых ММП играют ключевую роль.

В последнее время все больше исследований посвящается ММП мембранного типа (МТ-ММП). В настоящий момент известно 6 различных МТ-ММП. Характерной особенностью этих ферментов является наличие трансмембранного домена, который удерживает МТ-ММП в составе цитоплазматической мембраны. Причиной повышенного интереса к ММП этой группы и к наиболее распространенной из них, МТ1-ММП, является четко выраженная связь между опухолевым метастазированием и уровнем экспрессии этих ферментов в раковых клетках [9, 10]. Одной из причин наблюдаемой корреляции могут быть особенности субстратной специфичности МТ-ММП. Кроме того, локализация МТ-ММП на клеточной мембране создает предпосылки для направленной модификации как белков ВКМ, так и поверхностных рецепторов [11, 12], в частности, ингегринов [13].

Интегрины - это широко распространенное семейство гетеродимерных рецепторов клеточной поверхности. Взаимодействуя с белками ВКМ, интегрины осуществляют регуляцию адгезии, подвижности и инвазии клеток, а также принимают участие в межклеточных взаимодействиях [14, 15]. Интегрины играют важную роль в эбриогенезе и во многих процессах во взрослом организме [16-18].

Интегрины состоят из нековалентно сязанных аир субъединиц, которые, соединяясь в разных, но не случайных комбинациях, образуют 25 различных гетеродимерных рецепторов. Среди известных интегринов, оофЗ интегрин играет уникальную функциональную роль в опухолевом ангиогенезе и метастазировании [18].

Показано, что большинство а субъединиц интегринов, включая аЗ, а4, а5, аб, а7, а8, а9, ау, аПЬ и аЕ, подвергаются созреванию в результате эндопротеолитического расщепления соответствующих предшественников. Разрыв полипептидных цепей по высоко консервативным шрам основных аминокислотных остатков осуществляется конвертазами пробелков (КП) семейства субтилизина/кексина. КП протеолитически превращают одноцепочечные предшественники а субъединиц в зрелые белки, состоящие из ТЧ-концевой тяжелой и С-концевой легкой цепей, соединенных дисульфидным мостиком [19, 20]. Недавно было показано, что один из членов семейства КП, фурин, принимает участие в специфичном расщеплении предшественников а5, а6 и ау субъединиц интегринов [20].

Значение расщепления а субъединиц на тяжелую и легкую цепь в функции интегринов окончательно не выяснено. Из имеющихся данных следует, что созревание а цепи интегринов не влияет на связывание лигандов, но является ключевым для передачи биохимических сигналов «снаружи внутрь» через инте грины [21, 22]. В подтверждение, ингибирование протеолитического созревания предшественника ау субъединицы в результате суперэкспрессии ингибитора фурина а-1 антитрипсина существенно снижает эффективность сигналинга через ау05 интегрин и распластывание клеток аденокарциномы НТ29-Б4 [21].

Синтез ММП в инвазирующих клетках часто ассоциирован с экспрессией интегринов [23-26]. Все больше данных свидетельствует о взаимодействии ММП с интегринами на поверхности нормальных и опухолевых клеток [27]. Brooks с соавторами показали связывание активированной ММП-2 с avß3 интегрином, экспрессированным на поверхности клеток инвазирующей меланомы [28]. В подтверждение этого наблюдения неоднократно было показано, что экспрессия avß3 интегрина коррелирует со способностью к активации ММП-2 в различных опухолевых клеточных линиях [13, 29-33]. Кроме того, для клеток человеческой глиомы U251 и меланомы BML было продемонстрировано, что avß3 интегрин непосредственно взаимодействует с МТ1-ММП [13, 33].

Несмотря на то, что взаимодействие между ММП и интегринами и, в частности, между МТ1-ММП и avß3 интегрином было показано достаточно давно, не ясно, каким образом оно осуществляется. Приводит ли это взаимодействие к протеолигической модификации ингегринов? Если МТ1-ММП гидролизует avß3 интегрин на поверхности опухолевых клеток, то какие структурные изменения претерпевает интегрин в результате гидролиза и как эти изменения отражаются на его функции? Нет ответа также на вопрос о функциональной значимости такого взаимодействия для опухолевого развития. Важность ответов на эти вопросы трудно переоценить, так как они могут расширить представления о процессах, ответственных за метастазирование опухолевых клеток. Полученная информация может быть использована при разработке новых противоопухолевых лекарственных средств.

В настоящей работе впервые было показано, что помимо гидролиза белков ВКМ и активации растворимых ММП, МТ1-ММП обладает функцией, подобной КП. Так, для клеток карциномы груди MCF7, которые одновременно экспрессируют avß3 интегрин и МТ1-ММП, было продемонстрировано, что МТ1-ММП непосредственно осуществляет предшественника ау субъединицы. эндопр отео лигическое расщепление

Альтернативный, МТ1 -ММП-зависимый процессинг ау предшественника, продемонстрированный в этой работе, приводит к появлению уникального ау|33 интегрина. Процессированный МТ1-ММП схуРЗ интегрин, обусловливает повышенную способность клеток к прикреплению, рапластыванию и миграции на витронектине, а также к активации киназы фокальной адгезии (КФА). Аналогичная модификация посредством МТ1-ММП была показана и для двух других а субъединиц интегринов аЗ и а5, обычно созревающих с участием КП. Данные, приведенные в этой работе, позволяют предположить, что процессинг а субъединиц интегринов МТ1-ММП является общим механизмом, с помощью которого клетки способны селективно регулировать активность интегринов на клеточной поверхности. Этот новый механизм регуляции функции интегринов отражает важность и сложность взаимодействий между МТ1-ММП и рецепторами клеточной адгезии в раковых клетках. Полученная информация может найти применение при разработке противоопухолевых лекарственных средств.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Выявление механизмов метастазирования является одной из важнейших проблем современной биологии рака. Существующие в настоящее время представления отводят ключевую роль в этом процессе двум классм молекул: интегринам и матриксным металлопротеиназам (ММП). Данный обзор посвящен анализу литературных данных об участии интегринов и ММП в процессах опухолевого роста и метастазирования.

Интегрины: классификация и структура

Интегрины изначально были охарактеризованы как семейство рецепторов, экспрессированных на плазматической мембране и ответственных за прикрепление клеток к внеклеточному матриксу (ВКМ) [34]. Осознание важности роли интегринов в раке произошло в середине 90-х годов, когда было показано участие ау(33 интегрина в неоваскуляризации опухолей и сохранении их метастатического потенциала [18]. К настоящему времени продемонстрировано, что интегрины способны влиять на такие динамические процессы в нормальных и раковых клетках, как передача биохимических сигналов внутрь клетки и экспрессия генов, ответственных за миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживание клеток.

Семейство интегринов представлено семнадцатью а и восемью |3 субъединицами, нековалентно ассоциированными на поверхности клеток в более чем двадцать а|3 гетер о димер ных комбинаций [35]. Альтернативный сплайсинг мРНК, кодирующих некоторые интегрины, увеличивает многообразие рецепторов этого семейства. Каждая субъединица интегринов содержит большой внеклеточный

Участок связьтания лиганда

12-15 ми

Цнтоплазмаишеский домен

Рисунок 1. Структура интегринов млекопитающих. домен (около 1000 аминокислотных остатков у а и приблизительно 700 у ß субъединиц), трансмембранный район и короткий цитоплазматический домен (Рис. 1).

Большинство а субъединиц интегринов, включая аЗ, а4, а5, аб, а7, а8, а9, av, «IIb и аЕ, подвергаются посттрансляционной модификации в результате протеолигического процессинга КП по парам основных аминокислот. Эндопротеолитическое расщепление по участкам, содержащим основные аминокислоты, необходимо для созревания многих белков, полипепгидных гормонов, факторов роста и нейропептидов. Этот процесс также критичен для функциональной активации некоторых рецепторов на клеточной поверхности, адгезионных молекул и белков ВКМ [36, 37]. Недавние результаты дают возможность предполагать, что в результате созревания а субъединиц интегрины приобретают способность к более эффективному сигналингу, приводящему к усилению клеточной адгезии [21].

Сайг расщепления а субъединиц состоит из последовательности двух основных аминокислот Lys/Arg-Arg с дополнительным основным аминокислотным остатком в положении Р4 (Arg в аЗ, аб, а7, аПЬ и аЕ субъединицах) или Р6 (His в а4, а5, а8 и av субъединицах). В а субъединицах интегринов участок расщепления находится недалеко от начала трансмембранного домена. Исключение представляет а4 субъединица, в которой расщепление происходит посередине молекулы. После расщепления созревшая молекула состоит из соединенных дисульфидным мостиком мембранносвязанной С-концевой легкой цепи с молекулярной массой 25-30 кДа и N-концевой тяжелой цепи с молекулярной массой 120 - 125 кДа (Рис. 1).

Одной из КП, осуществляющих расщепление а субъединиц, является фурин. Способность фурина модифицировать а субъединицы интегринов была доказана отсутствием их процессинга в клетках LoVo, экспрессирующих функционально неактивный фермент [38]. Модификация а субъединиц интегринов может быть осуществлена рекомбинантным фурином in vitro [19]. Ввиду того, что KII обладают широкой субстратной специфичностью и перекрывающейся экспрессией в различных тканях [36, 37], представляется возможным, что более чем одна КП осуществляет эндопротеолиз одного и того же белка. Подобно фурину, процессинг а субъединиц интегринов могут осуществлять многие КП [20].

Взаимодействие интегринов с лигандами

Интегрины ответственны за прикрепление клеток к В КМ посредством связывания с его индивидуальными компонентами. Интегрины узнают короткие пептидные последовательности в белках ВКМ и белках клеточной поверхности, принадлежащих к семейству иммуноглобулинов. Несмотря на то, что некоторые интегрины селективно связывают только один лиганд ВКМ (например, ингегрин a.5pl узнает только фибронектин), многие интегрины связываются с двумя или более белками [16] (Таблица 1).

Аминокислотные последовательности белков ВКМ, принимающие участие во взаимодействии с интегринами, были успешно определены для различных лигандов [39]. Классическим примером служит последовательность RGD. Эта последовательность, узнаваемая фибронектиновым рецептором - а5(31 интегрином, была впервые найдена в фибронектине.

Таблица 1. Лиганды интегринов.

Лиганд Интегрин

Аденовирусный пентонный белок avß3, avß5

Сиалобелок кости avß3, avß5

Borrelia burgdorferi aübß3

Candida albicans «Mß2

Коллагены alßl, a2ßl, allßl, allbß3

Денатурирование коллагены a5ßl, avß3, allbß3

Цитотактин, Тенасцин-С a8ßl, a9ßl, avß3, avß6

Декорсин аГГЬЗ

Дезинтегрины avß3, aübß3

Е кадхерин aEß7

Эпилигрин a3ßl

Фактор X aMß2

Фибронектин a2ßl, a3ßl, a4ßl, a4ß7, a5ßl, a8ßl, avßl, avß3, avß5, avß6, avß8, allbß3

Фибриноген a5ßl, aMß2, avß3, axß2, aübß3

Tat белок вируса иммунодефицита человека avß3, avß5

ЮЗЪ aMß2, axß2

ICAM-1 aLß2, aMß2

ICAM-2,3,4,5 aLß2

Инвазии a3ßl, a4ßl, a5ßl, a6ßl

Ламинин alßl, a2ßl, a6ßl, a7ßl, a6ß4, avß3

MAdCAM-1 a4ß7

ММП-2 avß3

Фактор ингибирования нейтрофилов aMß2

Остеопонтин avß3

Плазминоген aübß3

Протромбин avß3, aübß3

Фертшшн сперматозоида a6ßl

Тр омбоспондин a3ßl, avß3, allbß3

VCAM-1 a4ßl, a4ß7

Витронектин avßl, avß3, avß5, aübß3

Фактор фон Виллебрандта avß3, allbß

В настоящее время ШЗО последовательность известна как мотив узнавания различных лигандов многими интегринами (Таблица 2). Несмотря на то, что КШ)-содержащие пептиды ингибируют связывание лигандов интегринами, узнающими этот мотив, специфичность взаимодействия с 1ШО-содержащими белками ВКМ не определяется только наличием этой последовательности в лиганде.

Контекст, в котором представлена ЯбО последовательность в лигандах интегринов (фланкирующие остатки, трехмерная структура и индивидуальные особенности ингегрин-связывающего участка), определяет способность белков ВКМ к образованию прочного комплекса с интегринами [40]. Хорошим примером влияния множества факторов на узнавание интегринами лиганд-связывающих участков является взаимодействие (33 интегринов с фибриногеном. В то время как и аПЬрЗ и ау(33 интегрины узнают фибриноген, содержащий множественные ЛОВ последовательности, а КОБ пептиды ингибируют связывание фибриногена с этими интегринами, оба рецептора узнают в фибриногене также и другие последовательности [41, 42]. Комбинации интегринов на клеточной поверхности позволяют клеткам узнавать множество разнообразных белков ВКМ (Таблица 2). Предпочтение, отдаваемое интегринами определенным лигандам, определяется соотношением аффинностей интегринов, относительным содержанием белков ВКМ в специфическом микроокружении и конформационным состоянием, контролирующим доступность ингегрин-узнаваемой последовательности лиганда [43].

HHLGGAKQAGDV у- цепь фибриногена а.НЪрЗ

GPR а-цепь фибриногена ахр2

PI peptide у- цепь фибриногена аМ(32

Р2 peptide у- цепь фибриногена аМ(32

AEIDGIEL Тенасцин a9pl

QIDS VCAM-1 а4р1

LDT MAdCAM-1 а4р7

CS-1 peptide Фибронектин а4р1, а4(37

CS-5 peptide Фибронектин а4р1 ffiAPS Фибронектин a4pi

ICAM peptides ICAM-1, -2, -3 aLp2, aMp2

DLXXL Тенасцин avp6

GFOGER Тенасцин alpl, a2pl

Влияние двухвалентных катионов металлов на интегрины

Регуляция функциональной активности интегринов осуществляется посредством множества механизмов, в том числе взаимодействием с двухвалентными катионами металлов.

Интегрины - это металлосодержащие белки. Каждый гетеродимер содержит 3-5 участков связывания двухвалентных катионов с относительно низкой аффинностью (от мкМ до мМ). Двухвалентные катионы оказывают существенное влияние на функции интегринов, являясь агонистами или антагонистами связывания лигандов.

Связывание двухвалентных катионов может изменять специфичность интегринов и, таким образом, селективно влиять на их взаимодействие с определенным лигандом [43]. Одно из возможных объяснений влияния двухвалентных катионов металлов на функции интегринов состоит в том, что лиганд и металл находятся рядом в лиганд-связывающем кармане интегринов. Эта гипотеза получила экспериментальное подтверждение, когда было показано, что лиганды могут вытеснять два двухвалентных катиона из а11Ь{33 интегрина при связывании ЙХЮ, и что двухвалентные катионы и 1ШО пептиды могут взаимоисключающе связываться с пептидом из лигандсвязывающего участка (33 интегриновой субъединицы [44]. Недавно справедливость этой модели была подтверждена и для других интегринов [45].

Интегрины передают биохимические сигналы «снаружи внутрь» клетки

Опосредуемое интегринами прикрепление к субстрату является необходимым условием нормальной жизнедеятельности клеток. Лигирование интегринов, т.е. связывание интегринами лигандов, регулирует такие биологические процессы как выживание, подвижность и пролиферацию нормальных и раковых клеток. Центральной функцией интегринов является передача биохимических сигналов (сигналинг). Интегрины передают сигналы через клеточную мембрану вследствие лигирования субстратами или противоивтегрненовыми антителами [46-48].

Цито плазматические домены интегринов в основном представлены короткими полипептидными последовательностями, лишенными ферментативной активности. Вследствие этого, ингегрины передают сигналы внутрь клетки при помощи адапторных белков, соединяющих ингегрины с цитоскелетом, цито плазматическими киназами и трансмембранными рецепторами факторов роста. Способность интегринов связывать лиганды регулируется изнутри клетки (сигналинг «изнутри наружу»). Связывание лигаццов вызывает сигналы, передаваемые внутрь клетки (сигналинг «снаружи внутрь») [49-54]. В результате передачи в клетку сигналов, индуцируемых интегринами, может повышаться внутриклеточный рН [47, 48, 55, 56] и концентрация внутриклеточного кальция [5759]. Кроме того, могут усиливаться синтез инозитольных липидов, фосфорилирование КФА [60, 61] и активация р34/сс1с2 [62] и циклина А [63]. Была также показана интегрин-зависимая активация многих киназ, в том числе протеин китазы С [64], киназ семейств 8гс и АЫ, серин-треонин киназы, интегрин-связанной киназы [61, 65-69], мигоген-активируемой протеин киназы [70-72], фосфатидилинозитол 3-киназы [73, 74], р21Яа8 [75] и ОТ-кВ [76]. Многие из указаных эффектов могут быть непосредственно индуцированы кластеризацией интегринов на поверхности клетки с помощью моноклональных антител. Последнее позволяет предположить, что ингегрины сами по себе, без помощи дополнительных молекул, являются ответственными за инициацию передачи сигнала.

Сигнальные каскады, активируемые интегринами, были детально изучены в культурах прикрепляющихся клеток. Условием нормального функционирования прикрепляющихся клеток, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки, является их «заякоривание» на подходящем В КМ. В зависимости от сигналов, полученных от В КМ, эти клетки либо пролиферируют, либо выходят из клеточного цикла и дифференцируются. Эта способность адекватно отвечать на прикрепление к субстрату утеряна раковыми клетками [77].

Какие изменения в поведении клеток происходят при дотировании интегринов белками ВКМ? Интегриновый сигналинг и сборка цигоскелета тесно взаимосвязаны. В процессе связывания с ВКМ интегрины кластеризуются в плоскости клеточной мембраны и ассоциируются с цитоскелетными и сигнальными комплексами, которые запускают сборку актиновых филаментов. Реорганизация актиновых филаментов в более крупные стрессовые волокна вызывает в свою очередь усиление кластеризации интегринов, образуя, таким образом, систему положительной обратной связи. В результате белки ВКМ, интегрины и белки цигоскелета собираются в агрегаты по обе стороны клеточной мембраны. Хорошо развитые агрегаты - контакты фокальной адгезии, могут быть идентифицированы при помощи флуоресцентной микроскопии [78].

Таким образом, интегрины служат интеграторами ВКМ и цигоскелета, за что они и получили свое название. Обычно, в ответ на контакт с ВКМ клетки выпускают филоподии и «обследуют» подложку. Интегрины на концах филоподий связываются с ВКМ и инициируют образование контактов фокальной адгезии. В процессе прикрепления клеток происходит образование богатых актином ламеллоподий, часто между филоподиями. Позже происходит образование полностью развитых контактов фокальной адгезии и актиновых стрессовых волокон. Так как интегрины запускают сборку крупных сигнальных комплексов и активируют множественные сигнальные каскады, они могут служить общими регуляторами клеточных функций.

Механизмы передачи ингегринами сигналов «снаружи внутрь» являются предметом многих исследований, и интегрин-зависимые сигнальные каскады с участием КФА и киназ семейства Src достаточно детально изучены. Большинство интегринов активирует сигнальную цепь с участием КФА. Как происходит активация самой КФА до сих пор не ясно, однако известно, что она связана со сборкой контактов фокальной адгезии. В новообразовавшихся фокальных контактах КФА непосредственно или через цигоскелетные белки талин и паксиллин взаимодействует с цитоплазматическими доменами (В субъединиц интегринов [79]. В активированной КФА Тугз97 аутофосфорилируется, создавая участок связывания для Src киназы [71, 80]. Src киназа затем фосфорилирует целый набор компонентов, принимающих участие в фокальной адгезии. Кроме КФА, некоторые (31 и ctv интегрины активируют тирозиновую киназу Fyn, и через нее - адапгерный белок She [65, 66]. Предполагают, что в качестве мембранного адаптера в этом каскаде участвует кавеолин-1, который соединяет интегрин с а субъединицей Fyn.

Роль интегринов в раке

Интегрины принимают активное участие в клеточном движении и опухолевом метастаз ировании. Показано, что a2pl интегрин - рецептор коллагена и ламинина - повышает способность к метастазированию некоторых опухолевых клеточных линий [81]. Интегрин <xv[33, обладающий одной из самых широких лигандных специфичностей, осуществляет прикрепление клеток к большому числу лигандов (Таблицы 1 и 2). Экспрессия этого интегрина позволяет клетке прикрепляться, мигрировать и реагировать практически с любым белком В КМ. Способность к миграции аурЗ-положительных клеток зависит от наличия последовательности NPXY в цитоплазматической части рЗ субъединицы [82]. В отличие от клеток, трансфецированных рЗ субъединицей дикого типа, опухолевые клетки, трансфецированные кДНК РЗ субъединицы с мутацией в NPXY последовательности, не способны метастазировать [82]. Интегрин avp3 экспрессируется активно мигрирующими клетками, такими как метастазирующие меланомные клетки [83], причем уровень экспрессии этого интегрина коррелирует с уровнем метастазирования [82-84]. Интегрин avP5 принимает также участие в клеточном движении, но, в отличие от сафЗ интегрина, клеточная подвижность с участием avP5 интегрина зависит от активности рецепгорной тирозин киназы [85] и экспрессии генов, инициируемой №кВ [76].

В процессе опухолевого развития интегриновый репертуар клеток может меняться [77, 86, 87]. Изменения в экспрессии некоторых av интегринов были отмечены в разных опухолях. Показано, что уровень экспрессии av интегринов повышается в инфильтрирующих карциномах груди, в то время как в ангиокарциномах экспрессия интегрина avP3 теряется [88]. Изменения в экспрессии av интегринов в глиобластомах, а также в клетках меланомы кожи и сосудистой оболочки глазного яблока коррелируют со степенью развития опухолей. Gladston и

Cheresh [89] показали, что avp3 экспрессировался в астроцитомах Ш и IV стадий, тогда как в опухолях более низких I и П стадий и в нормальном мозге этот интегрин не обнаруживался. Было также отмечено, что распределение витронектина и avP3 в тканях совпадало, причем наблюдалась ассоциация витронектина с клетками в астроцитомах IV стадии, но не с клетками глии и опухолевыми клетками на более низких стадиях или с нормальными клетками мозга. Albelda с коллегами [83] были первыми, кто отметили, что экспрессия av[33 ингегрина в меланоме кожи происходила на более поздних стадиях развития болезни, а именно во время фазы вертикального роста и мета стаз ир ования. Сходные наблюдения, свидетельствующие в пользу ассоциации между экспрессией avp3 интегрина и поздней стадией меланомы, были сделаны и другими авторами [90-94].

Тот факт, что уровень экспрессии того или иного интегрина зависит от клинической стадии развития опухоли, ничего не говорит о функции интегринов in situ. Иммуногистологические исследования и экспериментальные наблюдения in vitro позволили идентифицировать несколько ау|33-зависимых процессов, приводящих к изменениям в поведении опухолевых клеток. Успешное использование моноклональных антител [95] и пептидов [96, 97] для блокирования связывания лигандов avP3 интегрином и подавления опухолевого роста и метастазирования у мышей дало основания полагать, что интегрины принимают активное участие в метастатическом процессе.

Одним из наиболее важных процессов, в которых принимают участие интергины, является ангиогенез, т.е. развитие новых кровеносных сосудов из пред существующей кровеносной сети. Этот чрезвычайно тонко регулируемый процесс играет важную роль в целом ряде нормальных физиологических процессов, таких как имплантация трофобласта, заживление ран и эмбриональное развитие. Однако, неконтролируемое образование новых кровеносных сосудов может способствовать развитию таких патологий, как ревматоидный артрит, ретинопатия на почве диабета и опухолевый рост и метастазирование [28, 98-101]. Интегрин avp3 минимально экспрессирован в нормальных, не развивающихся кровеносных сосудах. Однако, его экспрессия значительно увеличивается в клетках сосудов опухолей [102, 103] в ответ на факторы роста in vitro [104, 105] и in vivo [103, 106].

Строго контролируемая экспрессия ауЗЗ ингегрина и увеличение его экспрессии при ангиогенезе указывают на центральную роль этого рецептора в неоваскуляргоации опухолей. Антагонисты ау(33, но не (31 интегринов, с высокой эффективностью ингибируют ангиогенез в животных моделях [103].

Таким образом, ингегрины играют ключевую роль в онкогенезе и опухолевом метастазировании, оказывая влияние на множество клеточных процессов как в самой раковой клетке, так и в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов опухоли.

В последнее время стали накапливаться данные, свидетельствующие о взимодействии интегринов с металлопротеиназами при опухолевом развитии и метастазировании Например, непосредственно связываясь с интегрином оо/(33, протеолитически активная форма ММП-2 локализуется на поверхности раковых и эндотелиальных клеток [107]. Вероятно, эта способность позволяет клеткам координировать клеточную миграцию и способность деградировать ВКМ, что, в свою очередь, способствует клеточной инвазии [107]. Сходно, была показана связь между а2Р1 интегрином и позитивной регуляцией экспрессии ММП-1 [108]. Понимание того, как происходит взаимодействие ММП с интегринами и какие последствия оно вызывает, может предоставить ценную информацию для создания новых лекарственных средств для борьбы с раком.

Роль протеолитических ферментов в опулевом развитии

В настоящее время роль в опухолевой инвазии и метастазировании протеолитических ферментов в целом и ММП, в частности, не вызывает сомнения [109]. Однако, классическое представление о том, что эти ферменты служат в основном для разрушения тканевых барьеров, находится в процессе пересмотра.

Развитие злокачественной опухоли зависит от ряда важных особенностей раковых клеток, таких как безостановочный рост опухоли (автономный рост), способность избегать запрограмированную клеточную смерть (апопгоз), блокировать сигналы ингибирования роста, поддерживать постоянный рост кровеносных сосудов, локально инвазировать и проникать в отдаленные органы и ткани, т.е. метастаз ир о в ать [110]. Инвазия и метастазирование являются важными аспектами развития опухолей и главной причиной смертности при раке.

Опухолевый ангиогенез имеет ряд общих черт с клеточной инвазией. Интересно, что оба процесса являются следствием локального баланса позитивных и негативных регуляторных сигналов. Во многих исследованиях было показано, что в инвазирующей опухолевой или эндотелиальной клетке осуществляется тесная пространственная и временная кооперация между молекулами клеточной адгезии, элементами цито скелета, регулятор ными молекулами и протеазами, деградирующими ВКМ [111].

Протеазы, принимающие участие в круговороте ВКМ, были идентифицированы во всех четырех классах протеолигических ферментов (серил-, цистил-, аспартил- и металлопротеазы) [112]. До недавнего времени считалось, что металлопротеазы принимают участие на самых первых этапах деградации ВКМ. Однако последние данные свидетельствуют о более многообразной роли ММП, чем представлялось ранее. Роль ММП в развитии рака глубоко изучается, однако многие вопросы, имеющие отношение к разработке новых лекарственных средств и использованию ингибиторов ММП в клинической практике, остаются неразрешенными. Необходимо понимание роли отдельных ММП в таких ключевых процессах как опухолевый рост, инвазия и клеточные миграция и ангиогенез.

Протеолиз ВКМ является критическим этапом в начале опухолевой инвазии. Считается, что для того, чтобы опухолевая клетка могла метастазировать, она должна преодолеть соединительнотканные барьеры - базальные мембраны или интерстициальную строму, окружающие опухоль и кровеносные сосуды. Несмотря на то, что несколько семейств протеаз потенциально способны принимать участие в этих процессах, ММП и члены семейства сериновых протеаз, такие как плазмин и активатор плазминогена урокиназного типа, в последнее время находятся в центре внимания. Относительный вклад этих протеаз в инвазивное поведение опухолевых и эндотелиальных клеток оценить сложно, однако эксперименты с использованием трансгенных и нокаутных мышей постепенно проясняют картину [109].

Каким же образом происходит разрушение ВКМ и инвазия клетками опухоли соединительнотканных барьеров? ВКМ состоит из плотно переплетенной сети коллагеновых волокон, ламининов, гликопротеинов и протеогликанов с включениями минорных компонентов. Базальные мембраны, состоящие, главным образом, из слоев коллагена IV типа и ламинина, разделяют ткани на отдельные компартаменгы. Во время перерождения опухоли из доброкачественной в злокачественную происходят глубокие изменения в субэпителиальной базальной мембране. В частности, для инвазирующей карциномы характерна потеря целостности базальной мембраны вокруг инвазирующих опухолевых клеток [113, 114]. На основании результатов исследований взаимодействия опухолевых клеток с ВКМ и с субэпителиальными базальными мембранами, в частности, было постулировано, что процесс клеточной инвазии состоит из трех основных стадий: 1) прикрепления опухолевых клеток к базальной мембране; 2) образования в базальной мембране протеолитических дефектов и 3) миграции раковых клеток через эти дефекты [113, 114]. В настоящее время принято считать, что все три стадии клеточной инвазии справедливы в отношении всех видов ВКМ, а не только базальной мембраны.

Матриксные металлопротеиназы: классификация и структура

Как уже упоминалось, процесс опухолевого метастазирования тесно связан с экспрессией ММП в раковых клетках. Структные и функциональные особенности этих ферментов хорошо изучены. Матриксные металлопротеиназы (матриксины) -это семейство цинк-содержащих эндопептидаз, для которых показана способность протеолизовать большинство, если не все белки ВКМ [109]. Субстратная специфичность многих ММП весьма широка и схожа для большинства матриксинов. Для человека и других видов описано 28 членов ММП семейства, а также 4 специфических тканевых ингибитора ММП (ТИМП) [10, 111].

На основе субстратной специфичности и структурной гомологии, семейство ММП может быть классифицировано в 5 групп: 1) интерстициальные коллагеназы, 2) желатиназы (коллагеназы IV типа), 3) стромелизины, 4) металлопротеиназы мембранного типа (МТ-ММП) и 5) неклассифицированные ММП [109] (Таблица 3). Все ММП имеют схожую доменную структурную организацию [10, 109], хотя не все домены имеются у каждого члена семейства (Рис. 2). Для всех ММП общим является наличие сигнального пептида, пропептида, каталитического домена с высоко консервативным цинк-связывающим участком и, за исключением ММП-7, гемопексинового домена. Два члена семейства, ММП-2 и ММП-9, имеют желатин-связывающий домен, содержащий три фибронектиновых повтора второго типа, которые встроены в каталитический домен и определяют субстратную специфичность этих протеаз. Пять членов семейства, известных под названием

А В С о

Е Р О н

Рисунок 2. Доменная организация ММП.

27

ИИСИ11111Э ммп-7 —I-1ИГ— 1 ШМП-ПЯ1ППП1«10 9П99

-■ ■ » "-»■— ММП-2

II II I II II 1—1 ММП-9

Д1' 1Т— IММП-11

ШШШЪСШШШШШШ^ШШШШЗ ММП-14,15,16,17,24,25 ■—III |—— ММП-21 осизаш ммп-23

МТ-ММП, имеют также трансмембранный домен, с помощью которого они заякорены в цитоплазматической мембране, и короткий цитоплазматический домен, чья функция не совсем ясна [115].

Все матриксины синтезируются в виде препроферментов и, за исключением стромелизнна-3 и МТ-ММП, секретируются в неактивной проформе. Пропептидный домен (приблизительно 80 аминокислотных остатков) имеет высоко консервативную последовательность PRCG(V/N)PD. Боковая цепь остатка цистеина (цистеиновый переключатель) связывает атом цинка в каталитическом домене, таким образом поддерживая латентное состояние про-ММП [116, 117]. Стромелизин-3 (ММП-11), МТ-ММП, ММП Xenopus и ММП-23 имеют RX(K/R)R последовательность, процессируемую КП в С-концевой части пропепгида. Для ММП-11 [118] и МТ1-ММП (ММП-14) [119] была показана внутриклеточная активация фурином. После активации протео логические функции ММП регулируются ТИМП во внеклеточной среде или а2-макроглобулином в плазме.

Связь экспрессии ММП с опухолевым развитием

Обширный исследовательский материал свидетельствует об увеличенной экспрессии ММП в опухолевых тканях по сравнению с соответствующими нормальными и окружающими тканями. Одни из самых первых наблюдений, подтверждающих важность ММП в раке, были получены в 1980 году в исследовании, посвященном ММП, секретируемой клетками меланомной линии и способной деградировать коллаген базальной мембраны [120]. За этой работой последовало множество других, в которых было показано, что инвазивность и метастатический потенциал опухолевых клеток коррелировал и с экспрессией матриксинов. Увеличенная экспрессия ММП, включая ММП-1, ММП-2, ММП-9, стромелюины-2 и -3, матрилизин и МТ1-ММП, была показана для многих опухолей разного тканевого происхождения [113, 121].

Особую роль следует отвести МТ-ММП, для которых была показана способность активировать растворимые ММП: ММП-2 и ММП-13 [10, 122, 123]. Помимо активации ММП-2 и ММП-13, субстратная специфичность МТ-ММП мало чем отличается от таковой большинства ММП. Несмотря на то, что МТ1-ММП экспрессируется нормальными клетками, ее количество резко возрастает на поверхности раковых клеток [9, 10]. В некоторых случаях уровни экспрессии той или иной ММП коррелировали с клинической стадией развития опухоли. Тем не менее, картина экспрессии ММП, которая была бы универсальна для различных типов рака у человека, не выявлена [109].

Постепенно стало очевидным, что ММП участвуют в гораздо более широком спектре процессов, чем постулированные ранее протеолиз и разрушение соединительнотканных барьеров, необходимые для опухолевого метастазирования и формирования новых кровеносных сосудов. Все больше данных свидетельствует в пользу того, что многие функции клеток схожи в процессах ангиогенеза и опухолевой инвазии. В частности, эндотелиальные клетки, как и раковые клетки, экспрессируют ММП и их ингибиторы. Для ММП была показана способность влиять на морфологию эндотелиальных структур, а также на миграцию эндотелиальных клеток in vitro и in vivo [124-127]. Однако, роль ММП в опухолевом ангиогенезе и инвазии раковых клеток остается плохо охарактеризованной.

ММП оказывают влияние на опухолевое развитие и ангиогенез, регулируя адгезию, пролиферацию и миграцию клеток. В одном из недавних исследований было показано, что, модифицируя ко-рецепгор (31 интегринов - тканевую трансглютаминазу, МТ1-ММП влиет на способность клеток взаимодействовать с ВКМ[11].

Локалюация МТ1-ММП на клеточной поверхности обусловливает ее эффективное взаимодействие с другими мембранными белками, в том числе с интегринами. В подтверждение этого предположения была показана ко-локализация МТ1-ММП и avß3 интегрина в клетках глиомы U251 и меланомы BML [13,33]. Было также продемонстрировано влияние МТ1-ММП на функциональную активацию avß3 интегрина [32]. Так, ко-трансфекция клеток карциномы груди MCF7 ß3 субъединицей интегринов и МТ1-ММП привела к значительному увеличению миграции и адгезии клеток на вюронектине. Трансфекция MCF7 клеток только МТ1-ММП или только ß3 субъединицей ингегринов не индуцировала, что указывает на взаимодействие между avß3 и МТ1-ММП. Не ясным, однако, остается вопрос, каким образом МТ1-ММП вызывает изменения функциональной активности интегрина. Важность ответа на этот вопрос трудно переоценить, так как он может пролить свет на нешвестные до сих пор механизмы клеточной инвазии и метастазирования. Полученная информация может быть использована при разработке противоопухолевых лекарственных средств. Для ответов на эти вопросы были поставлены следующие задачи:

1. Показать, что МТ1-ММП способна осуществлять протеолитическую модификацию avß3 интегрина в клетках карциномы груди человека MCF7.

2. Изучить структурные особенности avß3 интегрина, процессированного МТ1-ММР.

3. Исследовать функциональное значение протеолигической модификации avß3 интегрина МТ1-ММР в клетках карциномы груди MCF7.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Антитела и реагенты

Мышиные моноклояальные антитела LM609, ВНА2.1, M-KD102, против avß3, a2ßl и a5ßl интегринов, соответственно, а также поликлональные кроличьи антитела AB 1949 против а5 субъединицы интегринов были приобретены у компании Chemicon International (Temecula, USA). Моноклональные антитела против av субъединицы интегринов были выделены на колонке с иммобилизованным Белком А из среды, кондиционированной клетками гибридомы L230, полученной из American Type Culture Collection (АТСС Rockville, USA). Кроличьи антитела АВ815 против шарнирного района МТ1-ММП (остатки аминокислот 285-318) были приобретены у Chemicon Intemational. Fab-9, БаЬ-фрагмент IgG человека, содержащий последовательность RGD в CDR3 районе гипервариабельного участка, был получен как описано в [128]. Каталитический домен МТ1-ММП (рМТ-кат) был получен как описано ранее [129]. Na125I был приобретен у Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). Гидроксаматные ингибиторы ММП широкого спектра действия GM6001 [130] и AG3340 [131] были приобретены у Chemicon International и Allergan (Irvine, USA), соответственно. Сток-растворы этих ингибиторов с концентрацией 25 и 30 мМ, соответственно, были приготовлены в ДМСО. Сток-раствор ингибитора фурина decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketone (dec-RVKR-cmk) (Bachem, King of Prussia, USA) с концентрацией 33,6 мМ был приготовлен в метаноле. Про-ММП-2 была выделена ш культуральной среды, кондиционированной клетками р2АНТ2А72 (клетки фибросаркомы человека НТ-1080, ко-трансфецированных генами Е1А и про-ММП-2) [123]. Ингибиторы протеаз, включая ФМСФ, леупепгин, пепстатин и апротинин, а также фторид натрия, пирофосфат натрия и ортованадат натрия, были куплены у компании Sigma

St. Louis, USA). avß3 ингегрин, выделенный из человеческой плаценты, был получен от А. Белкина (Москва, Россия).

Получение плазмид кДНК полноразмерной ß3 субъединицы интегринов человека (GenBank™ Accession # Р05106) и человеческой МТ1-ММП дикого типа (МТ-ДТ, GenBank™ Accession # U41078) были клонированы в экспрессионные векторы млекопитающих pcDNA.3-neo и pcDNA.3-zeo (Invitrogen, San Diego, USA), соответственно [13]. Каталитически неактивная мутантная МТ1-ММП (МТ-Е240А) была получена заменой Glu-240 в каталитическом центре фермента на Ala [132] с использованием QuickChange System (Stratagene, San Diego, USA) и следующих мутагенных праймеров: прямого 5'- GGTGGCTGTGCACGCGCTGGGCCATGCCC-3 ' и обратного 5'- GGGCATGGCCCAGCGCGTGCACAGCCACC-3 ' (нуклеотиды, отмеченные жирным шрифтом, обозначают замену кодона). кДНК мутантной МТ1-ММП бьша переклониро вана в плазмиду pcDNA.3-zeo и правильность последовательности и рамки считывания была подтверждена секвенированием.

Клеточные культуры и трансфекция клеток

Клетки карциномы груди человека MCF7, полученные из АТСС, культивировались при 37°С и 5% С02 в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (DMEM/ФБС) и 10 мкг/мл гентамицина. Клетки MCF7 не экспрессируют avß3 ингегрин, МТ1-ММП и ММП-2 [13], что делает эту клеточную линию идеальной для анализа воздействия МТ1-ММП на avß3 ингегрин. Трансфекция клеток осуществлялась с использованием Липофектамина (Life Technologies, Gaithersburg, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Для получения стабильных трансфектантов, родительские MCF7 клетки сначала трансфецировались полноразмерной (33 субъединицей интегринов человека в плазмиде pcDNA.3-neo. Популяция стабильно трансфецированных клеток была отобрана в среде DMEM/ФБС в присутствии 0.2-0.8 мг/мл антибиотика G418 (Life Technologies, Gaithersburg, USA). После 30-минутной инкубации с антителами LM609 (10 мкг/мл) клетки были подвергнуты сортингу на клеточном сортере FACStar (Becton Dickinson, Mountain View, USA). Полученные (33 клетки были затем трансфецированы плазмидой pcDNA.3-zeo, несущей полноразмерную человеческую МТ1-ММП дикого типа (МТ-ДТ) или МТ1-ММП с мутацией в активном центре (MT-E240A). Стабильные двойные трансфектанты были отобраны в среде DMEM/ФБС в присутствии 0,6-0,8 мг/мл зеоцина (Invitrogen, San Diego, USA) и 0,2 мг/мл G418. Клеточные линии (33/МТ1-ДТ и РЗ/МТ1-Е240А, ко-экспрессирующие av(33 интегрин и МТ1-ММП дикого типа или мутантную форму, соответственно, были получены с помощью сортировки клеток, о крашеных антителами против МТ1-ММП. Контрольные, несортированные клетки (ЗЗ/zeo были получены после трансфекции (33 клеток исходной плазмидой pcDNA.3-zeo. Клеточные культуры поддерживались в среде DMEM/ФБС в присутствии 0,2 мг/мл зеоцина и G418. Экспрессия av(33 ингегрина и МТ1-ММП клеточными линиями периодически проверялась проточной цитофлуорометрией с антителами LM609 и АВ815, соответственно. Трансфекция второй плазмидой не повлияла на уровень экспрессии av(33 ингегрина в двойных трансфектантах. Для экспериментов по ко-культивации, (ЗЗ/zeo клетки культивировались в течение 48 часов с MCF7 клетками, трансфещрованнымиМТ1-ДТ илиМТ1-Е240А [132] или исходным zeo вектором.

Проточная цитофлуорометрия

Клетки инкубировались на льду с мышиными антителами LM609 против avß3 интегрина или кроличьими антителами АВ815 против МТ1-ММП в концентрации 5 мкг/мл в фосфатном буфере Дюльбекко (ДФБ, Life Technologies), содержащем 1 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2, 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,02% азида натрия (все реактивы приобретены у компании Sigma). После получасовой инкубации с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с ФИТЦ (бараньи антитела против иммуноглобулинов G мыши и козьи F(ab')2 фрагменты против иммуноглобулинов кролика) (Sigma), клетки были подвергнуты анализу на проточном цитофлуорометре FACStar с помощью программы CellQuest. В качестве отрицательных контролей использовались клетки, инкубированные с неспецифическими мышиными или кроличьими иммуноглобулинами с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антителами.

Иммунопреципитация и Вестерн блотинг

Для анализа avß3 интегрина и МТ1-ММП, клетки были посеяны в среде DMEM/ФБС в присутствии или отсутствии ингибиторов ММП, GM6001 или AG3340, в указанных концентрациях. При необходимости, среда была заменена через указанные временные интервалы на свежую, содержащую или не содержащую ингибиторы ММП. После инкубации, клетки были отмыты ДФБ и белки клеточной поверхности были биотиншшрованы sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce, Rockford, USA). Для этого, клетки были отмьггы ДФБ и проинкубированы в течение часа при комнатной температуре в присутствии 0,2 мг/мл sulfo-NHS-LC-biotin в ДФБ, содержащем 1 мМ СаС1г, 1 мМ MgCl2. После интенсивных отмывок ДФБ, клетки были сняты с поверхности пластика с помощью скребка, осаждены центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут и лизированы в течение часа на холоду с перемешиванием в присутствии 50 мМ N-OKTici-ß-D-глюкопиранозида (Amresco, Solon, USA) в 50 мМ трис буфере, pH 7,5, содержащем 150 мМ NaCl, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgCl2 и смесь ингибиторов протеаз, 1 мМ ФМСФ, 2 мкг/мл апротинина, пепстатина и леупептина (лидирующий буфер, ЛБ). Клеточные лизаты были осветлены инкубацией с фиксированными клетками Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem, San Diego, USA) в течение часа на холоду с перемешиванием. Аликвоты клеточных лшатов, содержащих 1 мг тотального белка, были смешаны с 3 мкг анти-интегриновых или анти-МТ 1 -ММП антител и Белок А агарозой. После 14-часовой инкубации при 4°С, Белок А агароза была отмыта лидирующим буфером, ДФБ, содержащим 0,05% Твина 20 (ДФБ/Тв) и 0,5 M NaCl, и, наконец, ДФБ/Тв. Связавшиеся иммунные комплексы были элюированы кипячением образцов в течение 5 минут в двукратном буфере для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (20 мкл). В некоторых случаях образцы были восстановлены в присутствии 50 мМ ДТТ. После центрифугирования, солюбилизированные белки были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Разделенные на геле белки были перенесены на мембрану Immobilon Р (МШроге, Beverlly, USA). После блокирования 1% казеином в ДФБ/Тв, мембрана была обработана конъюгатом Ехй-а\ас1ш™-пероксидаза хрена (Sigma), и полосы, содержащие пероксидазную активность были проявлены при помощи цветного субстрата ТМВ/М™ (Chemicon).

Для идентификации форм интегриновых субъединиц аЗ и а5, протеолизованных МТ1-ММП, лизаты поверхностно биотиншшрованных клеток были проинкубированы в течение 12 часов на холоду в присутствии авидин-агарозы

Pierce). После интенсивных отмывок, описанных выше, адсорбированные белки были элюированы кипячением образцов в течение 5 минут в двукратном буфере для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (20 мкл) и подвергнуты электрофорезу в 8% полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Разделенные на геле белки были перенесены на мембрану Tmmobilon Р. После блокирования 1% казеином в ДФБ/Тв, интегриновые а субъединицы были проявлены специфическими антителами.

Фосфорилирование киназы фокальной адгезии (КФА)

Клетки были культивированы в DMEM/ФБС в течение 48 часов в присутствии или в отсутствии ингибитора фурина dec-RVKR-cmk. Затем среда в культурах была заменена на бессывороточную среду, содержащую или не содержащую ингибитор фурина. Через 24 часа клетки были сняты с поверхности пластика минимальной трипсинизацией, интенсивно отмыты в холодной среде DMEM, содержащей 1% БСА (DMEM/БСА) и ресуспендированы в теплой среде DMEM, в присутствии 20 мМ HEPES, рН 7,2. Культур а льные чашки (150 мм в диаметре) были покрыты в течение ночи указанными концентрациями витронектина при 4°С, затем отмыты ДФБ и блокированы 1% БСА. Клетки были добавлены к покрытым витронектином чашкам и оставлены для прикрепления. Через 1 час, прикрепленные клетки были отмыты холодным ДФБ, содержащим 1 мМ СаСЬ и 1 мМ MgCl2, и лизированы 1% Тритоном Х-100 в 50 мМ трис буфере, содержащем 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ фторида натрия, 10 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ ортованадата натрия и ингибиторов протеаз (1 мМ ФМСФ, и 2 мкг/мл апротинина, пепстатина и леупептина). После инкубации на льду в течение 1 ч, клеточные лизаты были отцешрифугированы на холоду при 14000 об/мин в течение

20 минут. Образцы лизатов, содерджащие 1 мг тотального белка, были смешаны с 2 мкг кроличьих антител sc-557 против КФА (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) и Белок G агарозой. После инкубации в течение ночи на холоду с перемешиванием, образцы были отмыты как описано выше. После ДСН электрофореза, разделенные белки были перенесены на мембрану Immobilon Р. После блокирования 5% БСА в ДФБ/Тв, мембрана была проинкубирована в присутствии 2 мкг/мл антител против КФА или фосфотирозина (pTyr) (mAb 4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, USA). После интенсивной отмывки ДФБ/Тв, мембрана была проинкубирована с соответствующими вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой хрена. После отмывки коньюгата ДФБ/Тв, зоны пероксидазной активности были проявлены с помощью ТМВ/М субстрата. Для определения соотношения рТуг/КФА, была определена интенсивность окраски полос с помощью камеры AlphaEase и программы Alphalmager (Alpha Inotech).

Очистка и определение МН^концевой последовательности интегрина avfi3

Интегрин av(33 был выделен из рз/zeo, (ЗЗ/МТ-ДТ и J33/MT-E240A клеток с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными антителами LM609 как описано [133]. Полученный из 1.6 х 109 клеток лизат был нанесен на колонку, содержащую 1 мл сорбента, на холоду при скорости протока 0.5 мл/мин в режиме рециркуляции. После отмывки, связавшийся материал был элюирован 0,05% ТФА, рН 2,5 в 50 мМ N- октил- [3-D- глю копир а нозид е. Элюат был немедленно нейтрализован 10% аммиаком и далее отдиализован против 5 мМ трис буфера, рН 7,5, содержащего 0,1% ДСН. После концентрирования при помощи лиофильной сушки, элюат был подвергнут электрофорезу в полиакриламдном геле (ПААГ) в присутствии ДСН с последующим переносом разделенных белков на мембрану

Immobilem Р. После отмывки мембраны водой и окраски раствором Кумасси R250, белковые полосы, соответствующие интегрину avß3, были вырезаны т мембраны и подвергнуты N-концевому микросеквенированию.

Для анализа взаимодействия МТ1-ММП с ингегрином avß3, образцы очищенного ингегрина были подвергнуты электрофорезу в полиакриламдном геле в присутствии ДСН с последующим переносом разделенных белков на мембрану Immobilon Р и Вестерн блоттингом с антителами AB 1932 против ß3 субъединицы интегринов и АВ815 против МТ1-ММП. После инкубации со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, блоты были проявлены с помощью ТМВ/М субстрата.

Связывание Fab-9 тетками экспрессирующими интегрин avß3

Эксперименты по связыванию Fab-9 были выполнены как описано ранее [134]. Клетки в концентрации 3 х 106/мл были смешаны с увеличивающимися концентрациями Fab-9, меченного 1251, и проинкубированы в течение 70 минут при 14°С. Неспецифическое связывание Fab-9 было измерено в присутствии 5 мМ ЭДТА. По окончании инкубации, не связавшийся 125I Fab-9 был отделен от клеток с помощью центрифугирования в 20% сахарозе при 14000 об/мин в течение 3-х минут. Радиоактивность осадка была определена с помощью гамма-счетчика. Величины констант диссоциации (Кд) комплекса avß3*Fab-9 были получены при помощи графика Скетчарда и нелинейной регрессии данных с использованием модели связывания с одним типом независимых участков. " • • ' •• -.А«» i"'К V * 1 ' Ч "Vi? tu-. * ■"

Гидролиз интегрина av/33 рекомбинантным каталитическим доменом МТ1ммп

Интегрин av^3, полученный из плаценты (2 мкг; 8 пикомолей), был проинкубирован в течение 16 часов при 37 °С в присутствии рМТ-кат (0,1 мкг; 5 пикомолей) в буфере, содержащем 20 мМ трис буфера, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 50 мкМ ZnCl2, 5 мМ СаС12. Затем образцы были смешаны с двукратным буфером для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, проинкубированы при 100°С в течение 5 минут и подвергнуты элетрофорезу в ПААГ в присутствии ДСН. Белковые полосы были проявлены Кумасси R250.

Для получения интегринов, содержащих предшественник av субъединицы (npo-av), были использованы клетки LoVo, экспрессирующие неактивный фурин, [38]. av интегрины были выделены на колонке с иммобилизованными антителами L230. Препарат интегринов (0,2 мкг) был смешан с рМТ-кат (0,1 мкг) в буфере, содержащем 20 мМ триса, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 50 мкМ ZnCl2, 5 мМ СаС12, и проинкубирован в течение 16 часов при 37°С. По окончании инкубации, препарат был подвергнут элетрофорезу в ПААГ в присутствии ДСН. Разделенные белковые полосы были подвергнуты Вестерн блоттингу в присутствии 2 мкг/мл АВ1930, узнающих цитоплазматический домен av субъединицы интегринов.

Иммунофлуоресцентная конфокальная микроскопия

Клетки были посеяны в DMEM/ФБС в плотности 1-1,5 х 104/лунку 8-и луночной стеклянной камеры (LabTek П, Nalge Nunc, Denmark). После 48-часовой инкубации, клетки были отмыты ДФБ и зафиксированы в течение 20 минут холодной 1:1 смесью метанол: ацетон. Неспецифическое связывание антител было блокировано с помощью 30-минутной инкубации при комнатной температуре в юссийс fbcvjM »r.n

4БЛМ0Т присутствии ДФБ, содержащем 10% козьей сыворотки и 5% БСА. Клетки были окрашены антителами LM609 (10 мкг/мл) или L230 с последующей инкубацией в присутствии 20 мкг/мл козьих антител против мышиных IgCi. конъюгированных с Alexa-568 (Molecular Probes, Eugene, USA). Далее, клетки были проинкубированы в присутствии 10 мкг/мл кроличьих антител против МТ1-ММП АВ815 и затем в гфисутствии 20 мкг/мл козьих антител против кроличьих IgG, конъюгированных с Alexa-488 (Molecular Probes). После отмывки ДФБ, клетки были обработаны Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, USA) и исследованы с помощью сканирующего конфокального микроскопа (MRC-1024; Bio-Rad). Регистрация и обработка визуальной информации были осуществлены с помощью программных шкетов Lasersharp и LaserPix (Bio-Rad MicroScience Division, UK) и Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, USA).

Зимография в желатиновых гелях

Клетки высевались в DMEM/ФБС в присутствии или в отсутствии увеличивающихся концентраций ММП ингибитора GM6001. После 24-часовой инкубации клетки были отмыты и инкубация была продолжена в течение 24 часов в бессывороточной среде в присутствии 50 нг/мл ММП-2 с теми же концентрациями GM6001. Клеточный супер натанг был смешан с эквивалентным объемом двукратного буфера для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Аликвоты по 10 мкл были подвергнуты электрофорезу в ПААГ в присутствии ДСН на гелях с кополимеризованным свиным желатином (Novex, San Diego, USA). Для проявления зон с желатинолигической активностью гели отмывались 2 раза по 15 мин в 2.5 % Triton Х-100 с последующей инкубацией при 37°С в буфере следующего состава: 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 5 мМ СаС12. Через 16 часов гели были окрашены КумассиЯ250 [13].

Клеточная адгезия

Эксперименты по клеточной адгезии проводились с использованем 96-луночных планшетов с высокой сорбционной способностью пластика (Corning, Corning, USA), покрытых в течение ночи на холоду витронектином или Fab-9 в концентрациях, указанных в тексте. Планшеты были заблокированы DMEM/БСА, содержащей 10 мМ HEPES, pH 7.2 (DMEM/BCA/HEPES).

Клетки, культивированные в DMEM/ФБС, были сняты с подложки с помощью неэнзиматического буфера (Specialty Media, Lavalette, USA) и ресуспендированы в DMEM/BCA/HEPES. Клетки были посажены при плотности 5 х 105/мл в DMEM/BCA/HEPES и оставлены для прикрепления к подложке в течение 1 часа при 37°С. Где указано, увеличивающиеся концентрации cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) пептида (cRGD; Peptide Institute, Osaka, Japan) были использованы для ингибирования клеточной адгезии. Прикрепившиеся клетки были фиксированы, окрашены Кристалл фиолетовым (Sigma), и включившийся краситель был экстрагирован. Оптическая плотность экстрактов измерялась колориметрически при 540 нм [32].

Клеточная миграция

Направленная миграция клеток была проведена в модифицированных камерах Бойдена (Transwell™, Costar, Cambridge, USA) в бессывороточной среде как описано [13]. Обратная сторона мембраны с размером пор 8 мкм вкладыша с диаметром 6.5 мм, была покрыта витронектином в концентрации 2 мкг/мл в течение ночи при 4°С и заблокирована 1% БСА. Клетки, культивированные в течение ночи в DMEM/ФБС, были сняты с подложки с помощью неэнзиматического буфера (Specialty Media). Клетки (7,5 х 104) были посажены в 0,15 мл бессывороточной среды AIM-V (Life Technologies) во внутреннюю камеру. Наружная камера была заполнена 0,6 мл среды AIM-V. После 48-часовой инкубации, промигрировавшие на наружнуюю поверхность мембраны клетки были сняты раствором трипсина/ЭДТА и подсчитаны. Где указано, клетки были сначала проинкубированы в присутствии 10 мкМ AG3340 и/или 100 мкМ ингибитора фурина dec-RVKR-cmk в течение 24-72 ч, а затем пересажены в камеры Бойдена в присутствии одного или обоих ингибиторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия интегрина avfiS и МТ1-ММП в клетках карциномы груди MCF7

Клетки карциномы груди MCF7, стабильно трансфецированные кДНК (33 субъединицы ингегринов (рЗ клетки), были описаны ранее [32]. Для них характерна de novo экспрессия av|33 интегрина, так как клетки родительской линии не экспрессируют [33 субъединицу ингегринов, но продуцируют av интегрины, чья a субъединица способна образовывать гетеродимеры с трансфецированной (33 субъединицей [134]. Ко-трансфекция (33 клеток кДНК МТ1-ММП дикого типа (МТ-ДТ) привела к значительному увеличению миграции клеток (33/МТ-ДТ на вигронектине, одном из наиболее эффективных лигандов av(33 интегрина [135]. Наблюдаемое изменение в клеточной миграции сопровождалось увеличением электрофоретической подвижности рЗ субъединицы ингегринов, что дало основание предполагать существование специфической модификации алфЗ интегрина МТ1-ММП [13]. Так как трансфекция клеток MCF7 только МТ1-ММП не индуцировала их миграцию на вигронектине, все последующие исследования были сконцентрированы на клетках MCF7, экспрессирующих avP3 ингегрин совместно или в отсутствии МТ1-ММП. Детальный анализ оафЗ интегрина в клетках РЗ/МТ-ДТ показал, что МТ1-ММП специфически влияет на процесс созревания av субъединицы ингегринов.

Для подтверждения участия МТ1-ММП в процессинге avP3 интегрина и, как следствие, модуляции avP3 интегрин-зависимых клеточные функций, в дополнение к РЗ/МТ-ДТ клеткам были получены клетки MCF7, ко-экспрессирующие avP3 ингегрин и каталитически неактивную МТ1-ММП. Для инактивации МТ1-ММД остаток глутаминовой кислоты (Е24о), принимающий участие в акте катализа , был заменен на остаток аланина (А24о) при помощи сайг-специфического мутагенеза. Полученная к ДНК (МТ-Е240А) была переклонирована в вектор pcDNA-zeo и использована для стабильной трансфекции ß3 клеток. После отбора на клеточном сортере ß3/MT-E240A трансфектантов, ко-экспрессирующих avß3 ингегрин и мутантную МТ1-ММП, клетки были детально охарактеризованы в сравнении с РЗ/МТ-ДТ клетками и контрольными ß3/zeo клетками, трансфецированными исходным вектор ом pcDNA-zeo без МТ1-ММП-вставки.

Окрашивание антителами против avß3 интегрина LM609 с последующей проточной цитофлуорометрией подтвердило сходные уровни экспрессии avß3 интегрина в ß3/zeo, РЗ/МТ-ДТ и ß3/MT-E240A клетках (Рис. 3, левая панель). В отличие от ß3/zeo клеток, лишенных МТ1-ММП, РЗ/МТ-ДТ и ß3/MT-E240A клетки экспрессировали высокие уровни МТ1-ММП, сравнимые в обеих клеточных линиях (Рис. 3, правая панель).

В соответствии с данными проточной цитофлуорометрии, анализ с использованием иммунопрецшштации и Вестерн блоттинга показал, что МТ1-ММП отсутствовала в ß3/zeo клетках (Рис. 4А, дорожка 1), тогда как РЗ/МТ-ДТ и рз/МТ-Е240А клетки экспрессировали значительные количества МТ1-ММП (Рис. 4А, линии 2 и 3, соответственно).

МТ1-ММП в РЗ/МТ-ДТ клетках была в основном представлена аутолигическими формами с молекулярными массами 42 и 39 кДа, тогда как в ß3/MT-E240A клетках MT1-MMQ бьша представлена полноразмерной формой с молекулярной массой 60 кДа. Недавно было показано, что низкомолекулярные формы МТ1-ММП накапливаются на поверхности трансфецированных MCF7 клеток

Рисунок 3. Анализ экспрессии аурЗ интегрина и МТ1-ММП в МСК7 клетках.

Экспрессия аурЗ интегрина и МТ1-ММП МСБ7 клетками была проанализирована при помощи проточной цитофлуорометрии рз/гео, рЗ/МТ-ДТ и РЗ/МТ-Е240А клеток, окрашенных антителами ЬМ609 против аурз интегрина (левая панель) или АВ815 против МТ1-ММП (правая панель). В качестве отрицательных контролен (открытые гистограммы) для специфических антител (закрытые гистограммы) были использованы нормальная мышиная или кроличья сыворотки. Детекция антител, связавшихся с клеточной поверхностью, осуществлялась при помощи вторичных бараньих и козьих антител против иммуноглобулинов мыши и кролика, соответственно, конъюгированных с ФИТЦ. Ось абсцисс - относительная интенсивность флуоресценции; ось ординат - количество клеток. вследствие аутолиза активного фермента [132]. В согласии с полученными данными, 48-часовая инкубация клеток рЗ/МТ-ДТ в присутствии синтетического гидроксаматного ингибитора ММП А03340 привела к появлению полноразмерной МТ1-ММП с молекулярной массой 60 кДа и одновременному исчезновению форм с молекулярными массами 42 и 39 кДа (Рис. 4А, дорожка 4).

Для подтверждения отсутствия протеолитической активности у мутантной МТ1-ММП, мы сравнили способность трансфецированных клеток активировать про-ММП-2. Так как родительские МСБ7 клетки не экспрессируют ММП-2, экзогенная про-ММП-2 (Рис. 4Б, дорожка 5) была добавлена к контрольным клеткам и клеткам, трансфецированным МТ1-ММП. После 8 часовой инкубации, кондиционированная среда была подвергнута анализу на наличие активированных форм ММП-2 с помощью желатиновой зимографии. В соответствии с отсутствием экспрессии МТ1-ММП, рз/гео клетки не обладали способностью активировать профермент ММП-2 (Рис. 4Б, дорожка 1), тогда как клетки, экспрессирующие МТ1-ММП дикого типа, активировали про-ММП-2 с молекулярной массой 68 кДа через 64-кДа интермедиат до 62-кДа зрелой формы (Рис. 4Б, дорожка 2).

Клетки 33/МТ-Е240А не обладали способностью активировать про-ММП-2 (Рис. 4Б, дорожка 3), подтверждая, что мутация в активном центре МТ1-ММП привела к экспрессии каталитически неактивного фермента. Как и ожидалось, А03340 полностью блокировал активацию про-ММП-2 (33/МТ-ДТ клетками (Рис. 4Б, дорожка 4).

МТ1-ММП-зависимый процессинг интегрина avf}3 в клетках MCF7

Созревание av субъединицы в результате протеолигического процессинга КП является необходимым для полной функциональной активности av интегринов [21]. Для изучения механизма индукции миграции рЗ клеток в результате трансфекции МТ1-ММП мы сравнили процессинг а субъединицы av(33 интегрина в контрольных (ЗЗ/zeo клетках и (33 клетках, трансфецированных МТ1-ММП дикого типа или МТ1-ММП с мутацией в активном центре.

Иммунопреципитация av|33 интегрина антителами LM609 из лизатов (ЗЗ/zeo клеток, биотинилированных по клеточной поверхности, с последующим электрофорезом в ПААГ в присутствии ДСН в невосстанавливающих условиях и Вестерн блоттингом подтвердила наличие в интегрине av субъединицы с молекулярной массой 150 кДа и (33 субъединицы с молекулярной массой 90 кДа (Рис. 4В, -ДГТ, дорожка 1; av и (33, соответственно). Восстановление иммунопреципитированных белков показало, что в (ЗЗ/zeo клетках av субъединица представлена двумя формами: предшественником с молекулярной массой 150 кДа и тяжелой субъединицей с молекулярной массой 125 кДа (Рис. 4В, + ДТТ, дорожка 1; предшественник av и зрелая av, соответственно). В отличие от контрольных клеток, в рз/МТ-ДТ клетках avP3 интегрин в невосстанавливающих условиях был представлен av субъединицей с молекулярной массой 150 кДа, рз субъединицей с молекулярной массой 90 кДа и дополнительной полосой с молекулярной массой 140 кДа (Рис. 2В, -ДТТ, дорожка 2; av, РЗ, и процессированная av, соответственно). Анализ иммунопреципитатов в восстанавливающих условиях показал, что в РЗ/МТ-ДТ клетках практически полностью отсутвовал предшественник av субъединицы в составе avP3 интегрина (Рис. 4В, +ДТТ, дорожки 1 и 2, соответственно). В этих условиях, помимо зрелой формы с молекулярной массой 125 кДа, была выявлена дополнительная форма av субъединицы с молекулярной массой 115 кДа (Рис. 2В, +ДТТ, дорожка 2; процессированная av). Как следует из анализа иммунопреципигатов в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, avß3 интегрин, иммунопреципитированный из ß3/MT-E240A клеток, был неотличим от avß3 интегрина, экспрессированного в контрольных ß3/zeo клетках (Рис. 4В, дорожка 3). Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что присутствие дополнительной формы av субъединицы интегринов в РЗ/МТ-ДТ клетках связано с экспрессией в них каталитически активной МТ1-ММП.

Для подтверждения предположения о том, что каталитически активная МТ1

ММП ответственна за появление низкомолекулярной формы а субъединицы avß3 интегрина в РЗ/МТ-ДТ клетках, мы исследовали влияние синтетических ингибиторов ММП на процессинг av субъединицы интегринов. Для этого сначала

3/zeo и РЗ/МТ-ДТ клетки были проинкубированы в течение 48 часов в присутствии возрастающих концентраций гидроксаматного ингибитора ММП

GM6001. После биотинилированш клеточной поверхности, avß3 интегрин был иммунопреципитирован из клеточных лизатов с использованием антител LM609 с последующим электрофорезом и Вестерн блоттингом иммунопреципигатов.

Ингибирование МТ1-ММП-зависимого процессинга а субъединицы avß3 интегрина в рЗ/МТ-ДТ клетках хорошо коррелировало с исчезновением аутолитической активности МТ1-ММП (Рис. 5Б, средняя панель) и способностью клеток активировать про-ММП-2 (Рис. 5Б, нижняя панель). Инкубация ßS/МТ-ДТ клеток в присутствии смеси ингибиторов протеиназ широкого спектра действия, специфичных к сериновым, цистеиновым и астрагиновым протеазам и аминопептидазам, не повлияла на процессинг а субъединицы avß3 интегрина или аутолиз МТ1-ММП (данные не приводятся). Таким образом, участие этих классов протеиназ в протео литической модификации аурЗ интегрина может быть исключено. Вместе взятые, полученные данные позволяют предположить, что процессинг а субъединицы тфЗ интегрина, наблюдаемый в [33/МТ-ДТ клетках, с высокой степенью вероятности происходит за счет протеолиза, опосредуемого МТ1-ММП.

Для интерпретации данных, полученных в экспериментах с применением ингибиторов ММП, необходима информация о скорости обмена аурЗ интегрина и МТ1-ММП на клеточной поверхности. Для определения периода полужизни интегрина ау(33, модифицированного МТ1-ММП, РЗ/МТ-ДТ клетки культивщювались в течение разных промежутков времени в присутствии 10 ¡дМ гидроксаматного ингибитора ММП А03340. Клетки были пробиотинилированы по клеточной поверхности, лизированы и со/рЗ интегрин и МТ1-ММП были иммунопреципигированы из клеточных лизатов. После электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН и Вестерн блотгинга, было показано ингибирование образования низкомолекулярной формы и одновременное появление предшественника (xv субъединицы. Соответственно, потеря аутолигических форм МТ1-ММП сопровождалась накоплением МТ1-ММП с молекулярной массой 60 кДа (Рис. 5В, нижняя панель). В результате 72-часовой обработки РЗ/МТ-ДТ клеток ингибитором ММП, алфЗ интегрин был неотличим от такового в рЗ/гео клетках.

Вместе взятые полученные данные говорят о том, что экспрессия МТ1-ММП в рз клетках приводит к необычному процессингу а субъединицы аурз интегрина, а именно, к полному созреванию предшественника и появлению ншкомолекулярной формы ау субъединицы. В свою очередь, этот уникальный процессинг аурз интегрина может обусловливать увеличение миграции рЗ/МТ-ДТ клеток на витронектине по сравнению с контролем [32]. Так как исчезновение низкомолекулярной формы av субъединицы сопровождалось реципрокным появлением ее предшественника, результаты экспериментов с использованием ингибиторов ММП указывают на то, что именно предшественник av субъединицы является специфическим субстратом МТ1-ММП в РЗ/МТ-ДТ клетках.

МТ1-ММПпроцессирует предшественник а субъединицы avß3 интегрина

Для проверки данных о том, что предшественник av субъединицы (npo-av) подвергается специфическому протеолизу МТ1-ММП с образованием двух форм тяжелых цепей с молекулярными массами 125 и 115 кДа, активность конвертазы пробелков фурина была заингибирована. Для этого контрольные клетки ß3/zeo и клетки ЗЗ/МТ-ДТ были проинкубированы в присутствии или в отсутствии dec-RVKR-cmk в концентрации 100 |дМ. После инкубации в течение 48 часов, проверхность клеток была биотинилирована и avß3 интегрин был иммунопреципитирован из клеточных лизатов антителами LM609. Анализ интегрина показал, что ингибирование фурина привело к накоплению npo-av субъединицы в контрольных клетках (Рис. 5Г, дорожка 5). Напротив, в рз/МТ-ДТ клетках, независимо от присутствия ингибитора, предшественник av субъединицы был процессирован с образованием тяжелых цепей с молекулярными массами 125 и 115 кДа (Рис. 5Г, дорожки 7 и 8). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что МТ1-ММП непосредственно осуществляет процессинг предшественника а субъединицы avß3 интегрина. Таким образом, помимо созревания а субъединицы avß3 интегрина с участием КП, существует ее альтернативный процессинг с участием МТ1-ММП.

Предшественник av субъединицы интегрина avp3 является субстратом МТ1ммп

Способность МТ1-ММП специфически протеолизовать предшественник, но не зрелую форму av субъединицы была подтверждена в экспериментах по протеолизу av интегринов in vitro рекомбинангным каталитическим доменом МТ1-ММП (рМТ-кат) (Рис. 6).

В качестве субстратов были использованы выделенный из человеческой плаценты av(33 интегрин, в котором а субъединица представлена исключительно зрелой формой, и выделений из клеток карциномы прямой кишки LoVo пул av интегринов, содержащих только предшественник а субъединицы. Как видно из Рис. 6А, зрелая av субъединица была устойчива к протеолизу рМТ-кат. Следовательно, после протеолиза КП av субъединица теряет способность расщепляться МТ1-ММП. Вследствие двух независимых мутаций в фуриновом гене [38] клетки LoVo не способны осуществлять эндопротеолигичекий процессинг пробелков, включая предшественники а субъединиц интегринов [19]. Таким образом, эта клеточная линия является удобным источником npo-av субъединицы. Лизат клеток LoVo был подвергнут аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованными антителами L230 и очищенные av интегрины были проинкубированы с рМТ-кат в присутствии или отсутствии ингибитора ММП AG3340. После 8-часовой инкубации при 37°С был осуществлен электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН в восстанавливающих условиях и Вестерн блоттинг с антителами АВ1930 против цитоплазматического домена av субъединицы (Рис. 6Б).

Анализ подтвердил, что выделенные av ингегрины содержали только предшественник av субъединицы (Рис. 6Б, дорожка 1). Инкубация av интегринов в присутствии рМТ-кат привела к исчезновению формы с молекулярной массой 150 кДа (Рис 6Б, дорожка 2) и одновременному появлению фрагмента с молекулярной массой 16 кДа, реагирующего с антителами АВ1930. Исчезновение низкомолекулярного фрагмента, сопровождающееся появлением исходной полосы npo-av субъединицы в присутствии AG3340, позволяет заключить, что МТ1-ММП способна осуществлять специфический протеолиз предшественника av субъединицы, но не зрелого белка (Рис. 6Б, дорожка 3).

Определение аминокислотной последовательности участка расщепления npo-av субъединицы

Для подтверждения того, что МТ1-ММП способна осуществлять процессинг про-a субъединицы av(33 ингегрина с образованием альтернативной формы тяжелой цепи, мы определили N-концевые аминокислотные последовательности субъединиц avP3 ингегрина, экспрессированного в рз/zeo и РЗ/МТ-ДТ клетках. Для этого avp3 ингегрин был выделен из клеточных лизатов на колонке с иммобилизованными антителами LM609 и подвергнут анализу N-концевой аминокислотной последовательности. Обе клеточные линии экспрессировали РЗ субъединицу интегринов с N-концевой аминокислотной последовательностью, идентичной ранее описанной в литературе (G27PNIXTT). В рз/zeo клетках N-концы предшественника и тяжелой цепи зрелой av субъединицы были представлены последовательностью F3tNLDVD, тогда как легкая цепь на N-конце имела последовательность D89iLAL. Полученные результаты полностью соответствуют опубликованным данным [136] и подтверждают нормальный процессинг про-ау субъединицы в рз/гео клетках.

В отличие от контрольных клеток, легкая цепь ау субъединицы из рЗ/МТ-ДТ клеток начиналась с последовательности Ь892АЬ8ЕО, а обе формы тяжелой цепи начинались с последовательности Р31МЛ)УО, соответствующей нормальной 14-концевой последовательности предшественника и тяжелой цепи ау субъединицы ингегринов (Рис. 6В).

Таким образом, в РЗ/МТ-ДТ клетках была обнаружена необычная форма легкой цепи ау субъединицы ингегринов, представляющая собой продукт специфического протеолиза предшественника ау субъединицы МТ1-ММП. МТ1-ММП-опосредованный протеолиз осуществляется между А&р-891 и Ьеи-892, а не Аг§-890 и Азр-891, как в контрольных клетках. В результате, в клетках, экспрессирующих МТ1-ММП, образуется легкая цепь, начинающаяся с остатка Ь892 (Рис. 6В). Очевидно, что молекулярная масса такой легкой цепи незначительно отличается от молекулярной массы легкой цепи ау субъединицы, процессированной КП. Это заключение подтверждается присутствием одной формы легкой цепи ау субъединицы, электрофоретическая подвижность которой была идентична в аурЗ ингегрине, выделенном как из рЗ/МТ-ДТ, так и рЗ/гео клеток (данные не приводятся). Таким образом, наблюдаемая разница в молекулярной массе между 150-кДа и 140-кДа формами ау субъединицы в невосстанавливающих условиях определяется разницей в молекулярной массе между двумя формами тяжелой цепи ау субъединицы, образующимися в клетках РЗ/МТ-ДТ. Так как И-концевые последовательности обеих форм тяжелой цепи идентичны, наблюдаемая разница в молекулярной массе должна быть обусловлена разницей в их С-концевых последовательностях.

Результаты определения N-концевых аминокислотных последовательностей avp3 ингегрина из P3/zeo и РЗ/МТ-ДТ клеток позволяют предположить, что в клетках, экспрессирующих МТ1-ММП, предшественник av субъединицы интегринов подвергается специфическому и уникальному процессингу МТ1-ММП. В результате этого процессинга образуется легкая цепь, отличающаяся на один аминокислотный остаток от легкой цепи av субъединицы, процессированной КП, и тяжелая цепь, N-концевая последовательность которой идентична тяжелой цепи av субъединицы, процессированной КП, а С-конец на 10 кДа легче, по сравнению с С-концом тяжелой цепи av субъединицы, процессированной КП (Рис. 6В).

МТ1-ММПпротеолизует аЗ и а5 субъединицы интегринов

Так как протеолиз av субъединицы, осуществляемый КП, происходит в районе, гомологичном у многих а субъединиц интегринов (Таблица 4), было предположено, что МТ1-ММП может процессировать не только avP3, но и другие интегрины. Для проверки этой гипотезы поверхность рз/zeo и рз/МТ-ДТ клеток была пробиотинилирована и меченные биотином белки клеточной поверхности были подвергнуты аффинной хроматографии на агарозном носителе с пришитым авидином. После электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН выделенные белки были проанализированы Вестерн блоттингом с использованием антител против а2, аЗ и а5 субъединиц интегринов (Рис. 6Г).

В контрольных рз/zeo клетках полосы, соответствующие аЗ и а5 субъединицам, были представлены формами с молекулярными массами 150 и 160 кДа, соответственно (Рис. 6Г, дорожки 3 и 5). Сходно с av субъединицей (Рис. 6Г, дорожка 2), аЗ и а5 субъединицы интегринов в клетках РЗ/МТ-ДТ были представлены двумя формами. Электрофоретически более подвижные полосы

Таблица 4. Анализ последовательностей предполагаемых участков расщепления а субъединиц интегринов.

Субъединица Последовательность

Р1 Р1'

Процессируемая КП: (XV ШП ЬАЪ аЗ ЬБР а5 КИЕ АРБ аб КИЕ 1ТЕ а7 ИЛЕ ЬЕР а8 КИБ УНУ а9 ЫК V ЬБС аПЬ Р5Я ЬОВ

Не процессируемая КП: а2 КИЕ ООУ предположительно соответствуют МТ1-ММП-процессированным формам этих субъединиц интегринов (Рис. 6Г, дорожки 4 и 6, соответственно). Напротив, как в РЗ/МТ-ДТ, так и рЗ/zeo клетках а2 субъединица была представлена только одной формой с молекулярной массой 150 кДа (Рис. 6Г, дорожки 7 и 8, соответственно). Таким образом, процессинг с участием МТ1-ММП, по-видимому, характерен не только для (XV субъединицы, но и для аЗ и а5 субъединиц интегринов.

Анализ предполагаемых участков расщепления МТ1-ММП был проведен для а субъединиц интегринов, процессируемых КП (av, аЗ, а5, аб, а7, а8, а9 и аПЬ), в сравнении с не процессируемой а2 субъединицей (Таблица 4). Для этого сайты расщепления КП были выравнены по первому из двух остатков основных аминокислот (Lys или Arg). Вследствие отсутствия классического мотива узнавания КП, allb был выравнен по РГ положению гфедполагаемого участка расщепления МТ1-ММП. Как показало сравнение, подобно av субъединице, a субъединицы, процессируемые КП, имели остаток гидрофобной аминокислоты в РГ положении предполагаемого участка расщепления МТ1-ММП. Напротив, в а2 субъединице в положении, соответствующем РГ положению сайта расщепления МТ1-ММП в a субъединицах, процессируемых КП, находится остаток полярной аминокислоты Gin. Разница в аминокислотном составе гфедполагаемого участка расщепления МТ1-ММП может объяснить отсутствие МТ1-ММП-зависимого процессинга а2 субъединицы интегринов в (33/МТ-ДТ клетках. С другой стороны, несмотря на наличие специфичной для узнавания КП последовательности Lys-Arg, отсутствие КП-зависимого созревания а2 субъединицы может говорить о недоступности этого района для протеолитической атаки как КП, так и МТ1-ММП.

Образование комплекса между (XV(33 интегрином и МТ1-ММП необходимо для процессинга ау субъединицы

Очевидно, что для непосредственного протеолиза ом субъединицы МТ1-ММП должна входить в непосредственный контакт с интегрином. Для подтверждения этого предположения была исследована ко-локализация ау(33 интегрита и МТ1-ММП на плазматической мембране (33/МТ-ДТ клеток с помощью конфокальной микроскопии.

Клетки были окрашены мышиными антителами ЬМ609 против ингегрина ау(33 или Ь230 против ау субъединицы интегринов с последующей окраской кроличьими антителами против шарнирного района МТ1-ММП. При контрольном окрашивании с использованием нормальных мыши и кролика специфическая иммунофлуоресценция отсутствовала (данные не приводятся). При окраске специфическими антителами на плазматической мембране клеток и на концах клеточных выростов наблюдалась частичная ко-локализация МТ1-ММП с ау|33 интегрином (Рис. 7, верхняя панель) или ау интегринами (Рис. 7, нижняя панель). По-видимому, пространственная близость ау(33 ингегрина с МТ1-ММП является необходимым условием процессинга предшественника ау субъединицы интегринов МТ1-ММП.

Существование предполагаемых комплексов между оу$3 интегрином и МТ1-ММП было подтверждено присутствием биотинилированной полосы в районе 42 кДа при анализе иммунопреципигатов биотинилированного ингегрина из (33/МТ-ДТ клеток (Рис. 8А, дорожка 2). Положение белка, ко-преципигирующегося с ау(33 интегрином из лизатов (33/МТ-ДТ клеток, было неотличимо от положения МТ1

ММП из этих же клеток (Рис. 8А, дорожка 4). В случае рз/гео клеток ко-преципитация белка с молекулярной массой 42 кДа с аурЗ интегрином не наблюдалась (Рис. 8А, дорожка 1). Отсутствие биотинилированного материала в районе 42 кДа, ко-преципитируюгцегося антителами ЬМ609, хорошо согласуется с полным отсутствием МТ1-ММП в этих клетках и свидетельствует в пользу того, что МТ1-ММП ко-прецидитируется с ау)33 интегрином (Рис. 8А, дорожка 3).

Для подтверждения данных ко-преципитации МТ1-ММП с сафЗ интегрином бьша проведена аффинная хроматография лизатов рз/гео и РЗ/МТ-ДТ клеток на колонке с иммобилизованными антителами ЬМ609. Элю ир о ванные белки были подвергнуты электрофорезу в ПААГ в присутствии ДСН с последующим Вестерн блоттингом. Верхняя часть мембраны с перенесенными белками бьша проанализирована на присутствие РЗ субъединицы интегринов (Рис. 8Б, верхняя панель), а нижняя часть - на присутствие МТ1-ММП (Рис. 8Б, нижняя панель). Лизаты клеток глиомы 17251, трансфецированных МТ1-ММП дикого типа и содержащих формы МТ1-ММП с молекулярными массами 63, 60 и 42 кДа [132], были использованы в качестве положительного контроля (Рис 8Б, дорожка 4).

Как видно из Рис. 8Б, в случае контрольных клеток комплекс алфЗ интегрита с МТ1-ММП обнаружен не был (дорожка 1). Напротив, МТ1-ММП с молекулярной массой 42 кДа выделялась вместе с аурз интегрином из РЗ/МТ-ДТ и РЗ/МТ-Е240А клеток (Рис.8Б, дорожки 2 и 3, соответственно). В соответствии с результатами иммуно пр еципитации биотиншшрованной МТ1-ММП, 42-кДа форма бьша основной формой МТ1-ММП, выделенной в комплексе с аурз интегрином из лизатов РЗ/МТ-ДТ клеток (Рис. 4А и 8А). Соответственно, в лизатах РЗ/МТ-Е240А клеток в комплексе с аурз интегрином присутствовала МТ1-ММП с молекулярной массой 60 кДа.

Приведенные данные убедительно свидетельствуют в пользу комплексообразования между «урЗ интегрином и МТ1-ММП и позволяют предположить, что МТ1-ММП непосредственно осуществляет процессинг а\ субьединиды интегринов в рЗ/МТ-ДТ клетках. Для дополнительного подтверждения этого предположения было проанализировано, окажет ли МТ1-ММП, экспрессированная на плазматической мембране одной клетки, протеолигическое воздействие на алфЗ интегрин, находящийся на поверхности соседней клетки. Для этой цели рз/гео клетки ко-культивировались с МСБ7 клетками, трансфецированными МТ1-ММП дикого типа или мутантной МТ1-Е240А. После двухдневной ко-культивации клетки были биотинилированы и аурЗ интегрин был иммунопреципитирован из клеточных лизатов с использованием антител ЬМ609 (Рис. 8В). Для контроля влияния плотности клеток в культуре, рЗ/МТ-ДТ и рз/гео клетки культивировались при удвоенной плотности (Рис. 8В, дорожка 1 и 2, соответственно). Несмотря на то, что в момент посадки клеточная плотность в культуре превышала конфлюэнтную в два раза, процессинг осу субъединицы аурз интегрина в рз/гео клетках в результате их ко-культивации с клетками МТ1-ДГ и МТ1-Е240А изменен не был (Рис. 8В, дорожки 4 и 5, соответственно). В отличие от рз/гео клеток, в РЗ/МТ-ДТ клетках, как и ожидалось, наблюдался альтернативный процессинг а субъединицы аурЗ интегрина (Рис. 8В, дорожка 1). Следовательно, для протеолитического процессинга ау субъединицы необходима экспрессия интегрина и МТ1-ММП в одной и той же клетке. Эти данные говорят о необходимости определенной ориентации аурз интегрина и МТ1-ММП для образования прочного комплекса. По-видимому, такая ориентация эффективно достигается, когда аурз интегрин и МТ1-ММП находятся на мембране одной и той же клетки.

Процессинг av субъединицы МТ1-ММП не влияет на связывание RGD лигандов avß3 интегрином

Для исследования функциональной значимости протеолигической модификации avß3 интегрина МТ1-ММП была изучена способность интегрина связывать лиганды, содержащие RGD последовательность.

Для этой цели был использован Fab-9 - рекомбинантный Fab фрагмент IgG человека, содержащий RGD последовательность в CDR3 районе гипервариабельного участка и специфически связывающийся с ß3 интегринами [128, 137]. Сначала было проанализировано, способны ли avß3 гетеродимеры, содержащие низкомолекулярную форму av субъединицы, обнаруженную в клетках ß3/MT^T, связывать RGD-лиганды. Для этого avß3 ингегрин был иммунопреципитирован из ß3/zeo и ßS/МТ-ДТ клеток с помощью антител LM609, узнающих гетеродимер avß3 независимо от его функционального статуса, или RGD-лигандом Fab-9, узнающим только функционально полноценный avß3 ингегрин (Рис. 9А). Анализ Вестерн блоттингом показал, что формы av субъединицы, преципитированные Fab-9, были неотличимы от таковых, пр еципитир о в анных LM609 (Рис. 9А, дорожки 1-3 и 4-6, соответственно). Из этих результатов следует, что характерная для клеток ß3/MT^T низкомолекулярная форма, равно как про-форма и зрелая форма av субъединицы, образует с ß3 субъединицей гетеродимеры, способные связывать RGD-лиганд Fab-9.

Затем было проанализировано влияние процессинга av субъединицы МТ1-ММП на аффинность связывания RGD лигандов avß3 интегрином. Константа диссоциации комплекса, образованного между ау(33 интегрином и ш1-РаЪ-9, была определена в равновесных условиях связывания лиганда с интегрином, экспрессированным на поверхности (ЗЗ/гео, (33/МТ-ДТ и (33/МТ-Е240А клеток. Сходные величины констант диссоциации комплексов были получены для всех трех клеточных линий (Таблица 5), что свидетельствует об отсутствии влияния процессинга алфЗ интегрита МТ1-ММП на способность этого интегрина связываться с лигандами.

Для проверки предположения о том, что сходные аффинности связывания РаЪ-9 обусловливают сходную эффективность адгезии к этому 1ШО-лиганду, (33/гео, РЗ/МТ-ДТ и рЗ/МТ-Е240А клетки были посажены на пластик, покрытый РаЬ-9. Независимо от экспрессии МТ1-ММП или ее энзиматической активности, не наблюдалось существенной разницы в краткосрочной адгезии всех трех клеточных линий к пластику, покрытому БаЪ-9 при возрастающих концертрациях (Рис. 9Б). Эти наблюдения позволяют предположить, что процессинг а субъединицы осуРЗ интегрина МТ1-ММП не оказывает влияния на адгезию клеток МСБ7 к мономерному КХЮ-лиганду РаЬ-9. Это предположение было подтверждено сходной эффективностью циклического 1ШР пептида (с!ШО) ингибировать адгезию всех трех клеточных линий к РаЬ-9 (Рис. 9В). В совокупности эти данные означают, что процессинг а субъединицы аурЗ интегрина МТ1-ММП не влияет на лиганд-связывающие характеристики аурЗ интегрина.

Таблица 5. Аффинность интегрина ос\рЗ экспрессированного клетками 1\КТ7 по связыванию 1251-РаЬ-9.

Клеточная линия Кд* (нМ) Число рецепторов на клетку х 1(Г3

ЗЗ/гео 3.13 ±0.41 (п**=2) 70.9 рз/мт-дт 6.01 ±0.76 (п=3,р=0.06) 70.5

РЗ/МТ-Е240А 3.27 (п=1) 59.0

Данные представлены как средние величины ± стандартные ошибки измерений. Кд — константа диссоциации комплекса лиганд-рецептор. п - число независимых экспериментов.

Клетки, ко-экспрессирующие а\фЗ интегрин и МТ1-ММП, обладают повышенной адгезией и миграцией на витронектине

Далее мы исследовали эффекты процессинга ау субъединицы МТ1-ММП на взаимодействие клеток с витронектином - природным лигандом ссу|33 интегрина. Сначала сравнивалась адгезия рз/гео, рЗ/МТ-ДГ и |33/МТ-Е240А клеток на пластике, покрытом витронектином в возрастающих концентрациях. По сравнению с |33/гео клетками (Рис. 10А), клетки рЗ/МТ-ДТ обладали повышенной адгезией к витронектину, что подтверждает ранее опубликованные данные [32].

В противоположность (33/МТ-ДТ клеткам, РЗ/МТ-Е240А клетки обладали адгезией к витронектину, схожей с контрольными клетками (Рис. 10А). сЯОБ пептид обладал приблизительно одинаковой способностью ингибировать адгезию всех трех клеточных линий к витронектину (Рис. 10Б). Следовательно, хотя краткосрочная адгезия клеток к витронектину - мультимерному белку ВКМ [138], в значительной степени зависела от экспрессии каталитически активной МТ1-ММП, аффинность ау(33 интегрина к мономерным 1ШО лигандам не была затронута. Вместе с данными о сходной способности сху(33 интегрина связывать 1ШО-лиганды независимо от процессинга КП или МТ1-ММП, полученные результаты свидетельствуют о том, что в (33/МТ-ДТ клетках вигронектин индуцирует сигналинг «снаружи внутрь», обусловливающий не только усиление клеточной адгезии, но и увеличение эффективности клеточной миграции.

Для иследования того, каким образом трансфекция МТ1-ММП обусловливает повышение способности клеток, экспрессирующих ссу(33 интегрин, мигрировать на витронектине, была исследована миграция рз/гео, рЗ/МТ-ДТ и РЗ/МТ-Е240А клеток в модифицированной камере Бойдена с мембраной, покрытой витронектином (Рис. 11).

Эффективность миграции рЗ/МТ-ДТ клеток была примерно в три раза больше, по сравнению с рз/гео клетками. Напротив, миграционная способность рЗ/МТ-Е240А клеток, экспрессирующих каталитически неактивную МТ1-ММП, не отличалась от контроля (Рис. 11А). Таким образом, каталитически активная МТ1-ММП ответственна за повышенную миграцию клеток РЗ/МТ-ДТ на витронектине. Более того, так как клетки РЗ/МТ-Е240А экспрессируют аурЗ интегрин, не отличимый от контрольного, результаты экспериментов по клеточной миграции свидетельствуют о том, что увеличенная миграционная способность РЗ/МТ-ДТ клеток обусловлена процессингом а субъединицы аурЗ интегрина.

Справедливость этого заключения была продемонстрирована модуляцией миграции РЗ/МТ-ДТ клеток ингибиторами ММП и фурина АС3340 и ¿ес-Ю/КВ.-стк, соответственно. Принимая во внимание относительно долгий период полужизни аурз интегрина на клеточной поверхности (Рис. 5В), клетки были прединкубированы в присутствии одного или обоих ингибиторов, а затем использованы в экспериментах по миграции. Для контрольных рз/гео клеток, обработанных А03340 или с1ес-ЯУКЛ-сшк, а также смесью этих ингибиторов, не наблюдалось значительных изменений в миграционной способности по сравнению с необработанными клетками (Рис. 11В). Напротив, миграция РЗ/МТ-ДТ клеток, прединкубированных с А03340 в течение 48 или 72 часов, снизилась до уровня контрольной (Рис. 11Б). В клетках РЗ/МТ-ДТ, наблюдаемый через 48-72 часа инкубации с ингибитором возврат а субъединицы аурз интегрина из формы, процессированной МТ1-ММП, в состояние, характерное для контрольных клеток рЗ/гео (Рис. 5В), совпадает по времени с исчезновением повышенной миграционной способности клеток. Более того, обработка ингибитором фурина, не влияющим на

73 способность МТ1-ММП процессировать av субъединицу (Рис. 5Г), привела к дополнительному увеличению миграции клеток РЗ/МТ-ДТ более, чем в два раза (Рис. 11В). Существенно, что в присутствии AG3340 стимулирующий эффект ингибитора фурина на миграцию ЭЗ/МТ-ДТ клеток полностью исчезал (Рис. 11В). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что увеличенная миграция клеток на вигронектине обусловлена уникальным процессингом avß3 интегрина МТ1-ММП.

Процессинг avß3 интегрина МТ1-ММП в клетках MCF7 стимулирует сигналит «снаружи внутрь»

Для объяснения миграционных особенностей ß3/zeo и рЗ/МТ-ДТ клеток, мы исследовали влияние процессинга av субъединицы на avß3 - оно ср едо в анный сигналинг «снаружи внутрь» с участием тирозин киназ. Для этого были сравнены скорости миграции трансфектангов MCF7 клеток на вигронектине в присутствии ингибиторов тирозин киназ: дженестеина и гербимицина А. В концентрациях ниже токсических дженестеин не оказывал значительного влияния на миграцию ß3/MT-ДТ клеток (данные не приводятся). Напротив, гербимицин А ингибировал миграцию ß3/zeo и рЗ/МТ-ДТ клеток на 74% (п=1) и на 67.5 ± 12.9% (п=3), соответственно. Сравнимые уровни уменьшения миграции в обеих клеточных линиях позволяют предположить, что увеличенная за счет МТ1-ММП миграция ßS/МТ-ДТ клеток может быть обусловлена сигналингом «снаружи внутрь». Такой сигналинг может бьггь опосредован фосфорилированием белков, находящихся в сигналинговой цепи после ингегрин-лигандного комплекса. Так, было показано, что фосфорилирование киназы фокальной адгезии (КФА) зависит от созревания av интегринов в результате протеолиза КП [21].

В связи с этим, мы проанализировали, изменен ли сигналинг с участием КФА в клетках, ко-экспрессирующих функционально активную МТ1-ММП и avß3 интегрин. Для этого ß3/zeo и ЗЗ/МТ-ДТ клетки были прединкубированы в присутствии или отсутствии ингибитора фурина dec-RVKR-cmk, культивированы в бессывороточной среде с теми же добавками и затем посажены на пластик, покрытый витронектином. После инкубации в течение 1 часа прикрепившиеся клетки были лизированы и КФА была иммунопреципитирована с помощью специфических антител с последующим Вестерн блоттингом с антителами против фосфотирозина и КФА (Рис. 12). В отсутствие обработки ингибитором фурина, ко-экспрессия каталитически активной МТ1-ММП и avß3 ингегрина сопровождалась повышенным уровнем фосфоршшрования КФА по сравнению с контролем (Рис 12А, дорожка 3). Напротив, в ß3/zeo клетках, не экспрессирующих МТ1-ММП, или ß3/MT-E240A клетках, экспрессирующих каталитически неактивную МТ1-ММП, наблюдался одинаково низкий уровень фософорилирования КФА (Рис. 12А, дорожки 1 и 5, соответственно), идентичный таковому в клетках, экспрессирующих только МТ1-ММП (данные не приводятся). Как и ожидалось, ингибирование КП-опосредованного процессинга а субъединицы avß3 интегрина в ß3/zeo клетках ингибитором фурина (Рис. 5В, дорожка 5) сопровождалось снижением уровня фосфорилирования КФА (Рис. 12А, дорожка 2). Напротив, уровень фосфорилирования КФА в клетках ß3/MT^T существенно возрастал после обработки ингибитором фурина (Рис. 12А, дорожка 4). Эти результаты указывают на изменение сигналинга через ccvß3 интегрин, процессированный МТ1-ММП (Рис. 5Г, дорожка 7).

Для подтверждения предположения о том, что процессинг avß3 интегрина МТ1-ММП приводит к гомененнию сигналинга через КФА, мы также проанализировали фосфор ил ирование КФА в зависимости от плотности вигронектина на пластике. Клетки (ЗЗ/гео и РЗ/МТ-ДТ были посажены на пластик, покрытый витронектином при возрастающих концентрациях, и уровень фосфоршшрования КФА был определен при помощи денситометрического анализа результатов Вестерн блоттинга с антителами против рТуг и КФА. Из Рис. 12Б видно, что уровень фосфорилирования КФА по остаткам тирозина зависел от ко-экспрессии МТ1-ММП и шфЗ ингегрина МСР7 клетками. Несмотря на то, что в обеих клеточных линиях максимальное фосфоршшрования КФА было получено при одинаковой плотности вигронектина на пластике, уровень фосфорштирования в [33/МТ-ДТ клетках был в 2-4 раза выше, чем в контроле. Полученные результаты доказывают, что изменение сигналинга через КФА в РЗ/МТ-ДТ клетках обусловлено альтернативным процессингом аурз интегрина МТ1-ММП. Таким образом, модуляция сигналинга МТ1-ММП может приводить к изменению адгезивных и миграционных стимулов в раковых клетках.

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время все большее внимание уделяется гфедставлению о том, что помимо деградации компонентов ВКМ, ММП осуществляют протеолитическую модификацию клеточных рецепторов, экспрессированных на плазматической мембране [11-13,32]. Этот аспект функционирования ММП очень важен, так как он отражает способность клеток приспосабливаться к постоянно изменяющемуся ВКМ.

Экспрессия МТ-ММП на поверхности клеток позволяет им осуществлять модификацию рецепторов, интегрированных в плазматическую мембрану. В зависимости от состава ВКМ, МТ-ММП могут осуществлять положительную или отрицательную регуляцию клеточной миграции. Так, протеолитическая модификация тканевой трансглютаминазы на переднем крае клеток глиомы 11251 и фибросаркомы НТ1080 подавляет клеточную адгезию и миграцию на фибронектине [11]. Экспрессия МТ1-ММП в МСБ7 клетках приводит к функциональной активации аурЗ интегрина, придавая, таким образом, клеткам, ко-экспрессирующим оофЗ интегрин и МТ1-ММП, способность к повышенной адгезии и миграции [32].

Целью данной работы было детальное изучение того, как МТ1-ММП модифицирует аурЗ интегрин, опосредуя повышенную адгезию и миграцию клеток на вигронектине - эффективном лиганде аурз интегрина. В данном исследовании впервые был показан уникальный и специфический процессинг предшественника а субъединицы аурз интегрина МТ1-ММП в клетках карциномы груди МСБ7. В клетках, экспрессирующих аурз интегрин, ау субъединица была представлена, в основном, зрелой формой, которая состоит из тяжелой и легкой цепей, соединенных дисульфидной связью. В клетках, ко-экспрессирующих аурз интегрин и МТ1-ММП, была выявлена дополнительная тяжелая ау цепь с меньшей молекулярной массой, чем у обычной тяжелой цепи. Ингибирование МТ1-ММП двумя разными гидроксаматными ингибиторами ММП с широким спектром действия - вМ6001 [130] и А03340 [131], предотвращало процессинг «у субъединицы МТ1-ММП в клетках рЗ/МТ-ДТ, указывая на ММП-зависимую природу модификации аурз интегрина. Для доказательства того, что МТ1-ММП принимает участие в протеолизе ау субъединицы, мы использовали каталитически неактивную форму МТ1-ММП, МТ-Е240А [132]. Клетки, ко-экспрессирующие аурЗ интегрин и МТ-Е240А, содержали а субъединицу аурз интегрина, не отличимую от таковой в контрольных рз/гео клетках.

Так как, а-субъединицы многих интегринов подвергаются эндопротеолитическому процессингу КП с образованием дисульфидно связанных легкой и тяжелой цепей [21], уникальный процессинг ау субъединицы МТ1-ММП является примером до сих пор неизвестной конвертазоподобной функции этой ММП. Недавно фурин - представитель семейства субтилизиновых/кексиновых конвертаз пробелков - был идентифицирован как один из центральных ферментов, участвующих в эндопротеолигическом процессинге ау, а5 и аб субъединиц интегринов [19, 20]. Для доказательства существования альтернативного процессинга ау субъединицы МТ1-ММП фурин-зависимый процессинг аурз интегрина был блокирован специфическим ингибитором фурина [139]. Как и ожидалось, обработка ингибитором привела к накоплению предшественника ау субъединицы в контрольных клетках. Неполное ингибирование процессинга аурз интегрина может быть объяснено участием в этом процессе помимо фурина других конвертаз [19, 20]. В противоположность рз/гео клеткам, обработка ингибитором фурина не оказала существенного влияния на процессинг ау субъединицы в рз/МТ-ДТ клетках. Эти данные убедительно подтверждают, что МТ1-ММП способна осуществлять альтернативный процессинг av субъединицы, приводящий к образованию уникального по составу алфЗ ингегрина.

Отсутствие протеолиза каталитическим доменом МТ1-ММП avf$3 интегрина, содержащего только зрелую a субъединицу, и эффективный гидролиз npo-av субъединицы убедительно показывают, что предшественник, но не зрелая форма av субъединицы, является субстратом МТ1-ММП. Следовательно, av субъединица не может быть процессирована МТ1-ММП после процессинга КП. С другой стороны, разница в молекулярной массе между легкой цепью av субъединицы, процессированной МТ1-ММП in vivo (25 кДа), и продуктом расщепления in vitro, содержащим С-концевую часть av субъединицы (16 кДа), означает, что условия протеолиза npo-av субъединицы могут влиять на конечный состав продуктов гидролиза.

Фурин и некоторые другие представители семейства КП, осуществляющие протеолиз по парам основных аминокислот, являются мембранно-связанными КП первого типа. Они находятся в основном в сети транс-Гольджи, но обнаруживаются также и в эндосомах, на плазматической мембране как интегральные мембранные белки, и во внеклеточной среде как растворимые ферменты [140]. Подсемейство КП, находящихся в транс-Гольджи/эндосомальной сети, считают ответственным за эндопротеолитический процессинг белков, экспортирующихся по экзоцитозному пути, включая субъединицы интегринов [20, 140]. Эксперименты с применением пульс-чейса показали, что расщепление субъединиц интегринов происходит или на уровне сети транс-Гольджи, или в процессе экзоцигоза [19].

Тот факт, что МТ1-ММП может проходить активацию фурин-зависимым [141] или фурин-независимым [132] путем внутри клетки, позволяет предположить, что, по крайней мере частично, процессинг av субъединицы может происходить внутриклеточно. Однако, в на стояще время однозначного ответа на этот вопрос не получено.

Пост-трансляционный эндопротеолигический процессинг а\ субъединицы КI I, включая фурин, осуществляется по парам основных аминокислотных остатков. Расщепление происходит по С-концу последовательностей основных аминокислотных остатков, таких как ЮЖ/Кв, ИХXII и (11/К)К [140]. КП протеолизуют последовательность Т888К1ШЬ в предшественнике ал/ субъединицы интегринов с появлением К889 на С-конце тяжелой цепи и Окэ^АЬ на Оконце легкой цепи. По сравнению с КП, для МТ1-ММП, подобно другим ММП, характерна более широкая субстратная специфичность. МТ1-ММП гидролизует такие белки В КМ, как интер стициа льные коллагены, фибронектин, тенасцин-С, вигронектин, ламинин-1, аггрекан и другие белки, включая про-ММП-2 [11, 119, 123, 142, 143]. Секвенирование продуктов гидролиза пептидов, полученных в результате анализа библиотеки бактериофагового дисплея, подтвердило большое разнообразие последовательностей, гидролшуемых МТ1-ММП, таких как РХО/РЬ, РЕИГ, ТУОТ, РУРУ, БТКА и А№1Ь (РГ положения обозначены жирным шрифтом) [11, 144, 145].

Выступая в качестве конвертазоподобного фермента, МТ1-ММП в клетках карциномы груди МСБ7 расщепляет предшественник ау субъединицы интегринов по крайней мере в двух местах. Первый разрыв происходит в районе известного участка расщепления КП с Т888КЯО последовательности, на один аминокислотный остаток дальше к С-концу. Это МТ1-ММП-зависимое расщепление приводит к появлению последовательности Ь89оАЬ вместо БвспЬАЬ на М-конце легкой цепи ау субъединицы. Один из предсказанных участков МТ1-ММП-специфичного расщепления имеет последовательность БЕБЬ [145]. Второй участок расщепления

МТ1-ММП в предшественнике av субъединицы интегринов приводит к появлению тяжелой цепи с молекулярной массой на 10 кДа меньшей, чем у обычной тяжелой цепи. Этот еще не идентифицированный участок, скорее всего, находится внутри дисульфидно-связанной петли, ограниченной Cys852 и Cys904 и включающей также потенциальный участок гликозилирования в позиции Asn874. Одновременное укорочение полипептидной цепи и потеря сахарного компонента может объяснить разницу в молекулярной массе между двумя формами тяжелой цепи av субъединицы интегринов, наблюдаемыми в клетках (33/МТ-ДТ.

Сходно с фур ином и другими КП, процессирующими а субъединицы различных интегринов, МТ1-ММП помимо процессинга av субъединицы способна модифицировать по меньшей мере еще две других а субъединицы интегринов - аЗ и а5. В соответствии с отсутствием процессинга КП, МТ1-ММП не расщепляет а2 субъединицы интегринов. Независимо от экспрессии МТ1-ММП эта субъединица состоит из одной цепи В отличие от av, аЗ и а5 субъединиц интегринов, процессируемых КП, в не процессируемой КП а2 субъединице на месте остатка гидрофобной аминокислоты, следующего за последовательностью KRX в позиции РГ предполагаемых сайтов расщепления МТ1-ММП, находится Gin.

Наличие тяжелой и легкой цепей у интегринов, процессируемых КП, характерно для зрелых, полностью функциональных рецепторов. Посттрансляционная протеолитическая модификация а субъединиц интегринов считается необходимой для их функциональной активации [22]. Несмотря на то, что для некоторых интегринов функциональная значимость созревания не была подтверждена [22, 146, 147], было показано, что процессинг av субъединицы интегринов ассоциирован с компетентным узнаванием и связыванием лигадов с последующим сигналингом. Однако, аффинность связывния avp3 ингегрина с лигандами не меняется в зависимости от процессинга а субъединицы [21]. Наши результаты, демонстрирующие, что альтернативный процессинг avp3 интегрина МТ1-ММП в клетках MCF7 не повлиял на аффинность связывания лигандов, но привел к более эффективной адгезии и миграции клеток на витронектине, полностью согласуются с данными, указывающими на физиологическую значимость процессинга av субъединицы интегринов [21].

Адгезивная функция интегринов непосредственно связана с передачей биохимических сигналов в клетку [61, 148-151]. Клеточная адгезия, опосредованная инте гринами, индуцирует фосфорилирование белков по остаткам тирозина -явление, наблюдаемое одним ив первых сразу же после лигирования интегринов [152]. Специфическим аспектом сигналинга «снаружи внутрь» является активация цитоплазматических тирозин киназ, в частности, (КФА) [61, 153]. КФА - хорошо охарактеризованный медиатор взаимодействий между клетками и ВКМ, специфично модулирует клеточную миграцию, опосредованную интегринами [154]. Локализованная в контактах фокальной адгезии, КФА становится фосфорилированной по остаткам тирозина и активируется вследствие прикрепления клеток к белкам ВКМ. По-видимому, активация КФА является необходимым условием для клеточной миграции, так как КФА фосфорилирована по остаткам тирозина почти во всех мигрирующих клетках [155].

Фосфорилирование КФА в ответ на лигирование avp3 интегрина в результате клеточной адгезии к витронектину было показано в нескольких типах опухолевых клеток, включая высоко инвазивные карциномы простаты [155]. Активация КФА коррелирует с модулированием клеточной миграции, причем опосредованный КФА сигналинг зависит от зрелости av интегринов. В соответствии, отсутствие эндопротеолитического расщепления av субъединицы интегринов нарушало сигналинг с участием КФА и подавляло адгезию клеток, опосредованную интегринами [21]. В настоящем исследовании для клеток МСБ7, ко-экспрессирующих МТ1-ММП и ау(33 интегрин, бьшо продемонстрировано повышение уровня фосфорилирования КФА после лигирования интегрина витронектином. Характерно, что в этих клетках алфЗ интегрин полностью процессирован. Существенным является также тот факт, что в присутствии ингибитора фурина, когда процессинг ау(33 интегрина осуществляется главным образом посредством МТ1-ММП, клетки МСБ7 достигали максимальной миграционной способности. Таким образом, не исключено, что процессинг осу субъединицы интегринов МТ1-ММП приводит к повышенному сигналингу «снаружи внутрь», тем самым способствуя повышению клеточной миграции.

В целом, приведенные данные впервые показывают наличие новой функции МТ1-ММП в опухолевых клетках, а именно процессинга предшественников некоторых а субъединиц интегринов, включая ау, аЗ и а5. Детальное изучение этой новой функции МТ1-ММП позволит понять, каким образом ММП способствуют миграции опухолевых клеток не только за счет деградации ВКМ, но и посредством модуляции рецепторов на клеточной поверхности, ответственных за такие важные функции как клеточные адгезия и миграция. выводы

1. МТ1-ММП способна к протеолитической модификации предшественников ау, аЗ и а5 субъединиц интегринов, обычно процессируемых КН. Выявлена гомология потенциальных участков расщепления МТ1-ММП, которая позволяет предположить, что предшественники всех а субъединиц интегринов, созревающих с участием КП, могут быть субстратами МТ1-ММП.

2. В клетках карциномы груди МСБ7 МТ1-ММП может выступать в качестве конвертазы предшественника сху[33 интегрина, осуществляя альтернативный процессинг а субъединицы алфЗ интегрина в отсутствие активности КП.

3. Впервые описана уникальная структура а\ субъединицы интегринов, процессированной МТ1-ММП. Протеолиз предшественника а\ субъединицы МТ1-ММП происходит по крайней мере в двух сайтах в петле, дисульфидно связанной Су5-852 и Су8-904. В результате МТ1-ММП-зависимого процессинга образуется тяжелая цепь с молекулярной массой на 10 кДа меньше, чем образующаяся в результате созревания с участием КП, и легкая цепь, начинающаяся с остатка лейцина 892, вместо остатка аспарагиновой кислоты 891, характерного для процессинга КП.

4. Протеолигическая модификация алфЗ интегрина МТ1-ММП приводит к усилению адгезии и миграции клеток карциномы груди МСБ7 на вигронекине за счет повышения КФА-опосредованного сигналинга «снаружи внутрь». Следовательно, МТ1-ММП может стимулировать функциональную активность интегринов в раковых клетках, таким образом увеличивая опухолевую инвазию и метастазирование. Соответственно, ингибирование процессинга интегринов МТ1-ММП может служить основой для разработки новых противоопухолевых лекарственных средств.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Massova, I., et al., Matrix metalloproteinases: structures, evolution, and diversification. Faseb J, 1998. 12(12): p. 1075-95.

Woodhouse, E.C., R.F. Chuaqui, and L.A. Liotta, General mechanisms of metastasis. Cancer, 1997. 80(8 Suppl): p. 1529-37.

Chambers, A.F. and L.M. Matrisian, Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis. J Natl Cancer Inst, 1997. 89(17): p. 1260-70. Coussens, L.M. and Z. Werb, Matrix metalloproteinases and the development of cancer. ChemBiol, 1996. 3(11): p. 895-904.

Yu, A.E., et al., Matrix metalloproteinases. Novel targets for directed cancer therapy. Drugs Aging, 1997.11(3): p. 229-44.

Kohn, E.C. and L.A. Liotta, Molecular insights into cancer invasion: strategies for prevention and intervention. Cancer Res, 1995. 55(9): p. 1856-62.

Hidalgo, M. and S.G. Eckhardt, Matrix metalloproteinase inhibitors: how can we optimize their development? Ann Oncol, 2001.12(3): p. 285-7.

Hidalgo, M. and S.G. Eckhardt, Development of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer therapy. JNatl Cancer Inst, 2001. 93(3): p. 178-93.

Hotary, K., et al., Regulation of cell invasion and morphogenesis in a threedimensional type I collagen matrix by membrane-type matrix metalloproteinases 1,

2, and3. J Cell Biol, 2000. 149(6): p. 1309-23.

Nagase, H. and J.F. Woessner, Jr., Matrix metalloproteinases. J Biol Chem, 1999. 274(31): p. 21491-4.

Belkin, A.M., et al., Matrix-dependent proteolysis of surface transglutaminase by membrane- type metalloproteinase regulates cancer cell adhesion and locomotion. J Biol Chem, 2001. 276(21): p. 18415-22.

Kajita, M., et al., Membrane-type 1 matrix metalloproteinase cleaves CD44 and promotes cell migration. J Cell Biol, 2001.153(5): p. 893-904. Deryugina, E.I., et al., MT1-MMP initiates activation of pro-MMP-2 and integrin alphavbeta3 promotes maturation of MMP-2 in breast carcinoma cells. Exp Cell Res, 2001. 263(2): p. 209-23.

Holly, S.P., M.K. Larson, and L.V. Parise, Multiple roles of integrins in cell motility. Exp Cell Res, 2000. 261(1): p. 69-74.

Schoenwaelder, S.M. and K. Burridge, Bidirectional signaling between the cytoskeleton and integrins. Curr Opin Cell Biol, 1999.11(2): p. 274-86. Hynes, R.O., Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell, 1992. 69(1): p. 11-25.

Aldyama, S.K, K. Olden, and K.M. Yamada, Fibronectin and integrins in invasion and metastasis. Cancer Metastasis Rev, 1995. 14(3): p. 173-89. Varner, J. A. and D.A. Cheresh, Integrins and cancer. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(5): p. 724-30.

Lehmann, M., et al., Lack of integrin alpha-chain endoproteolytic cleavage in furin- deficient human colon adenocarcinoma cells LoVo. Biochem J, 1996. 317(Pt 3): p. 803-9.

Lissitzky, J.C., et al., Endoproteolytic processing of integrin pro-alpha subunits involves the redundant function of furin and proprotein convertase (PC) 5A, but not paired basic amino acid converting enzyme (PACE) 4, PC5B or PC7. Biochem J, 2000. 346 Pt 1: p. 133-8.

Berthet, V., et al., Role of endoproteolytic processing in the adhesive and signaling functions of alphavbeta5 integrin. J Biol Chem, 2000. 275(43): p. 33308-13.

Delwel, G.O., F. Hogervorst, and A. Sonnenberg, Cleavage of the alpha6A subunit is essential for activation of the alpha6Abetal integrin by phorbol 12-myristate 13-acetate. J Biol Chem, 1996. 271(13): p. 7293-6.

Agrez, M., et al., The alpha v beta 6 integrin induces gelatinase B secretion in colon cancer cells. Int J Cancer, 1999. 81(1): p. 90-7.

Morini, M., et al., The alpha 3 beta 1 integrin is associated with mammary carcinoma cell metastasis, invasion, and gelatinase B (MMP-9) activity. Int J Cancer, 2000. 87(3): p. 336-42.

Tremble, P., R. Chiquet-Ehrismann, and Z. Werb, The extracellular matrix ligands fibronectin and tenascin collaborate in regulating collagenase gene expression in fibroblasts. MolBiol Cell, 1994. 5(4): p. 439-53.

Yakubenko, V.P., et al., Differential induction of gelatinase B (MMP-9) and gelatinase A (MMP-2) in T lymphocytes upon alpha(4)beta(l)-mediated adhesion to VCAM-1 and the CS-1 peptide of fibronectin. Exp Cell Res, 2000. 260(1): p. 7384.

Madri, J.A. and D. Graesser, Cell migration in the immune system: the evolving inter-related roles of adhesion molecules and proteinases. Dev Immunol, 2000. 7(2-4): p. 103-16.

Brooks, P.C., Role of integrins in angiogenesis. Eur J Cancer, 1996. 32A(14): p. 2423-9.

Bafetti, L.M., et al., Intact vitronectin induces matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinases-2 expression and enhanced cellular invasion by melanoma cells. J Biol Chem, 1998. 273(1): p. 143-9.

Brooks, P.C., et al., Disruption of angiogenesis by PEX, a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity. Cell, 1998. 92(3): p. 391-400.

Deryugina, E.I., et al., Remodeling of collagen matrix by human tumor cells requires activation and cell surface association of matrix metalloproteinase-2. Cancer Res, 1998. 58(16): p. 3743-50.

Deryugina, E.I., et al., Functional activation of integrin alpha V beta 3 in tumor cells expressing membrane-type 1 matrix metalloproteinase. Int J Cancer, 2000. 86(1): p. 15-23.

Hofinann, U.B., et al., Expression of integrin alpha(v)beta(3) correlates with activation of membrane-type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in human melanoma cells in vitro and in vivo. Int J Cancer, 2000. 87(1): p. 12-9.

Hynes, R.O., Integrins: a family of cell surface receptors. Cell, 1987. 48(4): p. 54954. de Melker, A. A. and A. Sonnenberg, Integrins: alternative splicing as a mechanism to regulate ligand binding and integrin signaling events. Bioessays, 1999. 21(6): p. 499-509.

Seidali, N.G. and M. Chretien, Eukaryotic protein processing: endoproteolysis of precursor proteins. Curr Opin Biotechnol, 1997. 8(5): p. 602-7. Seidali, N.G., et al., Precursor convertases: an evolutionary ancient, cell-specific, combinatorial mechanism yielding diverse bioactive peptides and proteins. Ann N Y Acad Sci, 1998. 839: p. 9-24.

Takahashi, S., et al., A second mutant allele offurin in the processing-incompetent cell line, LoVo. Evidence for involvement of the homo B domain in autocatalytic activation. JBiolChem, 1995. 270(44): p. 26565-9.

Ruoslahti, E., RGD and other recognition sequences for integrins. Arum Rev Cell DevBiol, 1996. 12: p. 697-715.

Haas, T.A. and E.F. Plow, Integrin-ligand interactions: a year in review. Curr Opin Cell Biol, 1994. 6(5): p. 656-62.

Yokoyama, K., et al., Specific binding of integrin alpha v beta 3 to the fibrinogen gamma and alpha E chain C-terminal domains. Biochemistry, 1999. 38(18): p. 5872-7.

Farrell, D.H., et al., Role of fibrinogen alpha and gamma chain sites in platelet aggregation. Proc Natl Acad SciU S A, 1992. 89(22): p. 10729-32.

Plow, E.F., et al., Ligand binding to integrins. J Biol Chem, 2000. 275(29): p.

21785-8.

D'Souza, S.E., et al., Ligand and cation binding are dual functions of a discrete segment of the integrin beta 3 subunit: cation displacement is involved in ligand binding. Cell, 1994. 79(4): p. 659-67.

Dickeson, S.K., et al., Ligand binding results in divalent cation displacement from the alpha 2 beta 1 integrin I domain: evidence from terbium luminescence spectroscopy. Biochemistry, 1998. 37(32): p. 11280-8.

Werb, Z., et al., Signal transduction through the fibronectin receptor induces collagenase andstromelysin gene expression. J Cell Biol, 1989. 109(2): p. 877-89. Schwartz, M.A., G. Both, and C. Lechene, Effect of cell spreading on cytoplasmic pH in normal and transformed fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(12): p. 4525-9.

Schwartz, M.A., E.J. Cragoe, Jr., and C.P. Lechene, pH regulation in spread cells and round cells. JBiolChem, 1990. 265(3): p. 1327-32.

Clark, E.A. and J.S. Brugge, Integrins and signal transduction pathways: the road taken. Science, 1995. 268(5208): p. 233-9.

Clark, E.A. and R.O. Hynes, 1997 keystone symposium on signal transduction by cell adhesion receptors. Biochim Biophys Acta, 1997. 1333(3): p. R9-16. Parsons, J.T. and S.J. Parsons, Src family protein tyrosine kinases: cooperating with growth factor and adhesion signaling pathways. Curr Opin Cell Biol, 1997. 9(2): p. 187-92.

Schwartz, M.A., Integrins, oncogenes, and anchorage independence. J Cell Biol,

1997. 139(3): p. 575-8.

Yamada, K.M. and B. Geiger, Molecular interactions in cell adhesion complexes. Curr Opin Cell Biol, 1997. 9(1): p. 76-85.

Howe, A., et al., Integrin signaling and cell growth control. Curr Opin Cell Biol,

1998. 10(2): p. 220-31.

Schwartz, M.A., C. Lechene, and D.E. Ingber, Insoluble fibronectin activates the Na/H antiporter by clustering and immobilizing integrin alpha 5 beta 1, independent of cell shape. Proc Natl Acad SciU S A, 1991. 88(17): p. 7849-53. Schwartz, M.A. and C. Lechene, Adhesion is required for protein kinase C-dependent activation of the Na+/H+ antiporter by platelet-derived growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(13): p. 6138-41.

Schwartz, M.A., Spreading of human endothelial cells on fibronectin or vitronectin triggers elevation of intracellular free calcium. J Cell Biol, 1993. 120(4): p. 100310.

Pelletier, A.J., S.C. Bodary, and A.D. Levinson, Signal transduction by the platelet integrin alpha lib beta 3: induction of calcium oscillations required for protein-tyrosine phosphorylation and ligand-induced spreading of stably transfected cells. Mol Biol Cell, 1992. 3(9): p. 989-98.

Leavesley, D.I., et al., Integrin beta 1- and beta 3-mediated endothelial cell migration is triggered through distinct signaling mechanisms. J Cell Biol, 1993. 121(1): p. 163-70.

Romberg, L.J., et al., Signal transduction by integrins: increased protein tyrosine phosphorylation caused by clustering of beta 1 integrins. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(19): p. 8392-6.

Guan, J.L. and D. Shalloway, Regulation of focal adhesion-associated protein tyrosine kinase by both cellular adhesion and oncogenic transformation. Nature, 1992. 358(6388): p. 690-2.

Symington, B.E., Fibronectin receptor modulates cyclin-dependent kinase activity. J Biol Chem, 1992. 267(36): p. 25744-7.

Guadagno, T.M., et al., A link between cyclin A expression and adhesion-dependent cell cycle progression. Science, 1993. 262(5139): p. 1572-5.

Vuori, K. and E. Ruoslahti, Activation of protein kinase C precedes alpha 5 beta 1 integrin- mediated cell spreading on fibronectin J Biol Chem, 1993. 268(29): p.

21459-62.

Wary, K.K., et al., The adaptor protein She couples a class of integrins to the control of cell cycle progression. Cell, 1996. 87(4): p. 733-43. Wary, K.K., et al., A requirement for caveolin-1 and associated kinase Fyn in integrin signaling and anchorage-dependent cell growth. Cell, 1998. 94(5): p. 62534.

Hannigan, G.E., et al., Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta 1-integrin-linkedprotein kinase. Nature, 1996. 379(6560): p. 91-6.

Lewis, J.M., et al., Integrin regulation of c-Abl tyrosine kinase activity and cytoplasmic- nuclear transport. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(26): p. 151749.

Delcommenne, M., et al., Phosphoinositide-3-OH kinase-dependent regulation of glycogen synthase kinase 3 and protein kinase B/AKT by the integrin-linked kinase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(19): p. 11211-6.

Morino, N., et al., Matrix/integrin interaction activates the mitogen-activated protein kinase, p44erk-l andp42erk-2. J Biol Chem, 1995. 270(1): p. 269-73. Schlaepfer, D.D., et al., Integrin-mediated signal transduction linked to Ras pathway by GRB2 binding to focal adhesion kinase. Nature, 1994. 372(6508): p. 786-91.

Chen, Q., et al., Integrin-mediated cell adhesion activates mitogen-activated protein kinases. J Biol Chem, 1994. 269(43): p. 26602-5.

Chen, H.C. and J.L. Guan, Association of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(21): p. 10148-52.

Guinebault, C., et al., Integrin-dependent translocation of phosphoinositide 3-kinase to the cytoskeleton of thrombin-activated platelets involves specific interactions of p85 alpha with actin filaments and focal adhesion kinase. J Cell Biol, 1995. 129(3): p. 831-42.

Kapron-Bras, C., et al., Stimulation of tyrosine phosphorylation and accumulation of GTP-boundp21ras upon antibody-mediated alpha 2 beta 1 integrin activation in

T- lymphoblastic cells. J Biol Chem, 1993. 268(28): p. 20701-4.

Yebra, M., et al., Induction of carcinoma cell migration on vitronectin by NFkappa B-dependent gene expression. Mol Biol Cell, 1995. 6(7): p. 841-50.

Giancotti, F.G. and F. Mainiero, Integrin-mediated adhesion and signaling in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta, 1994. 1198(1): p. 47-64.

Burridge, K. and M. Chrzanowska-Wodnicka, Focal adhesions, contractility, and signaling. Annu Rev Cell Dev Biol, 1996. 12: p. 463-518.

Chen, H.C., et al., Interaction of focal adhesion kinase with cytoskeletal protein talin. J Biol Chem, 1995. 270(28): p. 16995-9.

Schaller, M.D., et al., Autophosphorylation of the focal adhesion kinase, pp!25FAK, directs SH2- dependent binding ofpp60src. Mol Cell Biol, 1994. 14(3): p. 1680-8.

Chan, B.M., et al., Distinct cellular functions mediated by different VLA integrin alpha subunit cytoplasmic domains. Cell, 1992. 68(6): p. 1051-60. Filardo, E.J., et al., Requirement of the NPXY motif in the integrin beta 3 subunit cytoplasmic tail for melanoma cell migration in vitro and in vivo. J Cell Biol, 1995. 130(2): p. 441-50.

Albelda, S.M., et al., Integrin distribution in malignant melanoma: association of the beta 3 subunit with tumor progression. Cancer Res, 1990. 50(20): p. 6757-64. Kip, J., et al, Human melanoma cells derived from lymphatic metastases use integrin alpha v beta 3 to adhere to lymph node vitronectin. J Clin Invest, 1992. 90(4): p. 1406-13.

Klemke, R.L., et al., Receptor tyrosine kinase signaling requiredfor integrin alpha v beta 5- directed cell motility but not adhesion on vitronectin. J Cell Biol, 1994. 127(3): p. 859-66.

Juliano, R.L. and J. A. Vainer, Adhesion molecules in cancer: the role of integrins. Curr Opin Cell Biol, 1993. 5(5): p. 812-8.

Pignatelli, M. and G. Stamp, Integrins in tumour development and spread. Cancer Surv, 1995. 24: p. 113-27.

Mechtersheimer, G., et al., In situ expression of beta 1, beta 3 and beta 4 integrin subunits in non-neoplastic endothelium and vascular tumours. Virchows Arch, 1994. 425(4): p. 375-84.

Gladson, C.L. and D.A. Cheresh, Glioblastoma expression of vitronectin and the alpha v beta 3 integrin. Adhesion mechanism for transformed glial cells. J Clin Invest, 1991. 88(6): p. 1924-32.

Danen, E.H., et al., Emergence of alpha 5 beta 1 fibronectin- and alpha v beta 3 vitronectin- receptor expression in melanocytic tumour progression. Histopathology, 1994. 24(3): p. 249-56.

McGregor, B.C., et al., Presence of cytoadhesins (Ilb-IIIa-lihe glycoproteins) on human metastatic melanomas but not on benign melanocytes. Am J Clin Pathol, 1989. 92(4): p. 495-9.

Si, Z. and P. Hersey, Immunohistological examination of the relationship between metastatic potential and expression of adhesion molecules and 'selectins' on melanoma cells. Pathology, 1994. 26(1): p. 6-15.

Danen, E.H., et al., Alpha v-integrins in human melanoma: gain of alpha v beta 3 and loss of alpha v beta 5 are related to tumor progression in situ but not to metastatic capacity of cell lines in nude mice. Int J Cancer, 1995. 61(4): p. 491-6.

Natali, P.G., et al., Expression of fibronectin, fibronectin isoforms and integrin receptors in melanocytic lesions. Br J Cancer, 1995. 71(6): p. 1243-7. Boukerche, H., et al., A monoclonal antibody (LYP18) directed against the blood platelet glycoprotein Ilb/IIIa complex inhibits human melanoma growth in vivo. Blood, 1989. 74(3): p. 909-12.

Humphries, M.J., K. Olden, and KM. Yamada, A synthetic peptide from fibronectin inhibits experimental metastasis of murine melanoma cells. Science, 1986. 233(4762): p. 467-70.

Saiki, I., et al., The inhibition of murine lung metastasis by synthetic polypeptides [poly(arg-gly-asp<) and poly(tyr-ile-gly-ser-arg)J with a core sequence of cell adhesion molecules. Br J Cancer, 1989. 59(2): p. 194-7.

Folkman, J. and Y. Shing, Angiogenesis. JBiolChem, 1992. 267(16): p. 10931-4. Blood, C.H. and B.R. Zetter, Tumor interactions with the vasculature: angiogenesis and tumor metastasis. Biochim Biophys Acta, 1990. 1032(1): p. 89118.

Fidler, I.J. and L.M. Ellis, The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell, 1994. 79(2): p. 185-8.

Paku, S. and N. Paweletz, First steps of tumor-related angiogenesis. Lab Invest, 1991. 65(3): p. 334-46.

Brooks, P.C., et al., Integrin alpha v beta 3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels. Cell, 1994. 79(7): p. 1157-64. Brooks, P.C., R.A. Clark, and D.A. Cheresh, Requirement of vascular integrin alpha v beta 3 for angiogenesis. Science, 1994. 264(5158): p. 569-71.

Sepp, N.T., et al., Basic fibroblast growth factor increases expression of the alpha v beta 3 integrin complex on human microvascular endothelial cells. J Invest Dermatol, 1994. 103(3): p. 295-9.

Enenstein, J., N.S. Waleh, and R.H. Kramer, Basic FGF and TGF-beta differentially modulate integrin expression of human microvascular endothelial cells. Exp Cell Res, 1992. 203(2): p. 499-503.

Friedlander, M., et al., Definition of two angiogenic pathways by distinct alpha v integrins. Science, 1995. 270(5241): p. 1500-2.

Brooks, P.C., et al., Localization of matrix metalloproteinase MMP-2 to the surface of invasive cells by interaction with integrin alpha v beta 3. Cell, 1996. 85(5): p. 683-93.

Riikonen, T., et al., Integrin alpha 2 beta 1 is a positive regulator of collagenase (MMP-1) and collagen alpha 1(1) gene expression. J Biol Chem, 1995. 270(22): p. 13548-52.

Stetler-Stevenson, W.G. and A.E. Yu, Proteases in invasion: matrix metalloproteinases. Semin Cancer Biol, 2001. 11(2): p. 143-52.

Hanahan, D. and R.A. Weinberg, The hallmarks of cancer. Cell, 2000. 100(1): p.

57-70.

Kleiner, D.E. and W.G. Stetler-Stevenson, Matrix metalloproteinases and metastasis. Cancer Chemother Pharmacol, 1999. 43(Suppl): p. S42-51. Dano, K., et al., Cancer invasion and tissue remodeling—cooperation of protease systems and cell types. Apmis, 1999. 107(1): p. 120-7.

Stetler-Stevenson, W.G., S. Aznavoorian, and L.A. Liotta, Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis. Annu Rev Cell Biol, 1993. 9: p. 541-73.

Liotta, L.A. and W.G. Stetler-Stevenson, Tumor invasion and metastasis: an imbalance of positive and negative regulation. Cancer Res, 1991. 51(18 Suppl): p. 5054s-5059s.

Seiki, M., Membrane-type matrix metalloproteinases. Apmis, 1999. 107(1): p. 13743.

Van Wart, H.E. and H. Birkedal-Hansen, The cysteine switch: a principle of regulation of metalloproteinase activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990. 87(14): p. 5578-82.

Becker, J.W., et al., Stromelysin-1: three-dimensional structure of the inhibited catalytic domain and of the C-truncated proenzyme. Protein Sci, 1995. 4(10): p. 1966-76.

Pei, D. and S.J. Weiss, Furin-dependent intracellular activation of the human stromelysin-3 zymogen. Nature, 1995. 375(6528): p. 244-7.

Pei, D. and S.J. Weiss, Transmembrane-deletion mutants of the membrane-type matrix metalloproteinase-1 process progelatinase A and express intrinsic matrix-degrading activity. J Biol Chem, 1996. 271(15): p. 9135-40. Liotta, L.A., et al., Preferential digestion of basement membrane collagen by an enzyme derived from a metastatic murine tumor. Proc Natl Acad Sci USA, 1979. 76(5): p. 2268-72.

Nelson, A.R., et al., Matrix metalloproteinases: biologic activity and clinical implications. J Clin Oncol, 2000. 18(5): p. 1135-49.

Sato, H., et al., A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumour cells. Nature, 1994. 370(6484): p. 61-5.

Strongin, A.Y., et al., Mechanism of cell surface activation of 72-kDa type IV collagenase. Isolation of the activated form of the membrane metalloprotease. J BiolChem, 1995. 270(10): p. 5331-8.

Stetler-Stevenson, W.G., Matrix metalloproteinases in angiogenesis: a moving target for therapeutic intervention. J Clin Invest, 1999. 103(9): p. 1237-41. Taraboletti, G., et al., Posttranscriptional stimulation of endothelial cell matrix metalloproteinases 2 and 1 by endothelioma cells. Exp Cell Res, 2000. 258(2): p. 384-94.

Hiraoka, N., et al., Matrix metalloproteinases regulate neovascularization by acting as pericellular fibrinolysins. Cell, 1998. 95(3): p. 365-77.

Schnaper, H.W., et al., Type IV collagenase(s) and TIMPs modulate endothelial cell morphogenesis in vitro. J Cell Physiol, 1993. 156(2): p. 235-46. Smith, J.W., et al., Building synthetic antibodies as adhesive ligands for integrins. J Biol Chem, 1994. 269(52): p. 32788-95.

Ratnikov, B., et al., Determination of matrix metalloproteinase activity using biotinylatedgelatin. Anal Biochem, 2000. 286(1): p. 149-55.

Galardy, RE., et al., Inhibition of angiogenesis by the matrix metalloprotease inhibitor N- [2R-2-(hydroxamidocarbonymethyl)-4-methylpentanoyl)]-Ltryptophan methylamide. Cancer Res, 1994. 54(17): p. 4715-8.

Shalinsky, D.R., et al., Broad antitumor and antiangiogenic activities of AG3340, a potent and selective MMP inhibitor undergoing advanced oncology clinical trials.

Ann N Y Acad Sei, 1999. 878: p. 236-70.

Rozanov, D.V., et al., Mutation analysis of membrane type-1 matrix metalloproteinase (mtl- mmp). the role of the cytoplasmic tail cys574, the active site glu240, and fur in cleavage motifs in oligomerization, processing, and selfproteolysis of mtl-mmp expressed in breast carcinoma cells. J Biol Chem, 2001. 276(28): p. 25705-14.

Smith, J.W. and D. A. Cheresh, The Arg-Gly-Asp binding domain of the vitronectin receptor. Photoafftnity cross-linking implicates amino acid residues 61-203 of the betasubunit. J Biol Chem, 1988. 263(35): p. 18726-31.

Lin, E.C., et al., Identification of a region in the integrin beta3 subunit that confers ligand binding specificity. J Biol Chem, 1997. 272(38): p. 23912-20. Lam, S.C., et al., Isolation and characterization of a platelet membrane protein related to the vitronectin receptor. J Biol Chem, 1989. 264(7): p. 3742-9. Suzuki, S., et al., cDNA and amino acid sequences of the cell adhesion protein receptor recognizing vitronectin reveal a transmembrane domain and homologies with other adhesion protein receptors. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(22): p. 8614-8.

Barbas, C.F., 3rd, L.R. Languino, and J.W. Smith, High-affinity self-reactive human antibodies by design and selection: targeting the integrin ligand binding site. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(21): p. 10003-7.

Seiffert, D. and J.W. Smith, The cell adhesion domain in plasma vitronectin is cryptic. J Biol Chem, 1997. 272(21): p. 13705-10.

Denault, J.B., et al., Inhibition of convertase-relatedprocessing of proendothelin-1. J Cardiovasc Pharmacol, 1995. 26(Suppl 3): p. S47-50.

Schafer, W., et al., Two independent targeting signals in the cytoplasmic domain determine trans-Golgi network localization and endosomal trafficking of the proprotein convertase furin. Embo J, 1995. 14(11): p. 2424-35. Yana, I. and S.J. Weiss, Regulation of membrane type-1 matrix metalloproteinase activation by proprotein convertases. MolBiol Cell, 2000. 11(7): p. 2387-401. d'Ortho, M.P., et al., Membrane-type matrix metalloproteinases 1 and 2 exhibit broad-spectrum proteolytic capacities comparable to many matrix metalloproteinases. Eur J Biochem, 1997. 250(3): p. 751-7.

Ohuchi, E., et al., Membrane type 1 matrix metalloproteinase digests interstitial collagens and other extracellular matrix macromolecules. J Biol Chem, 1997. 272(4): p. 2446-51.

Fosang, A.J., et al., Membrane-type 1 MMP (MMP-14) cleaves at three sites in the aggrecan interglobular domain. FEBS Lett, 1998. 430(3): p. 186-90. Ohkubo, S., et al., Identification of substrate sequences for membrane type-1 matrix metalloproteinase using bacteriophage peptide display library. Biochem BiophysRes Commun, 1999. 266(2): p. 308-13.

Teixido, J., et al., Role of beta 1 and beta 2 integrins in the adhesion of human CD34hi stem cells to bone marrow stroma. J Clin Invest, 1992. 90(2): p. 358-67. Kolodziej, M.A., et al., Study of the endoproteolytic cleavage of platelet glycoprotein lib using oligonucleotide-mediated mutagenesis. J Biol Chem, 1991. 266(34): p. 23499-504.

Humphries, M.J., Integrin activation: the link between ligand binding and signal transduction. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(5): p. 632-40.

Schwartz, M.A., M.D. Schaller, and M.H. Ginsberg, Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annu Rev Cell Dev Biol, 1995. 11: p. 549-99.

Yamada, K.M. and S. Miyamoto, Integrin transmembrane signaling and cytoskeletal control. Curr Opin Cell Biol, 1995. 7(5): p. 681-9.

Miyamoto, S., et al., Integrin function: molecular hierarchies of cytoskeletal and signaling molecules. J Cell Biol, 1995.131(3): p. 791-805.

Parsons, J.T., Integrin-mediated signalling: regulation by protein tyrosine kinases and small GTP-bindingproteins. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(2): p. 146-52. Giancotti, F.G. and E. Ruoslahti, Integrin signaling. Science, 1999. 285(5430): p. 1028-32.

Xu, F. and Z.J. Zhao, Cell density regulates tyrosine phosphorylation and localization of focal adhesion kinase. Exp Cell Res, 2001. 262(1): p. 49-58. Zheng, D.Q., et al., Prostatic carcinoma cell migration via alpha(v)beta3 integrin is modulated by a focal adhesion kinase pathway. Cancer Res, 1999. 59(7): p. 1655-64.