ПЕРОКСИДАЦИЯ ЛИПИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦИТОХРОМА C И ЕГО КОМПЛЕКСА С АНИОННЫМИ ЛИПИДАМИ И ЕЕ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА

• ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА

1.1. Актуальность работы

1.2. Цели и задачи

1.3. Положения, выносимые на защиту

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Молекулярно-биологические основы апоптоза

2.1.1. Апоптоз как один из механизмов клеточной смерти

2.1.2. Некроз и апоптоз

2.1.3. Молекулярные механизмы апоптоза

2.2. Цитохром с: строение, свойства и биологические функции

2.2.1. Класс цитохромов

2.2.2. Строение и физико-химические свойства цитохрома с

2.2.3. Цитохром с в клетке

2.3. Взаимодействие цитохрома с с анионными липидами

2.3.1. Липидный состав клетки, анионные липиды и кардиолипин

2.3.2. Образование комплекса цитохрома с с анионными липидами

2.3.3. Комплекс цитохрома с с АЛ как пероксидаза

2.4. Методы исследования процессов липидной пероксидации

2.4.1. Методы обнаружения свободных радикалов

2.4.2. Хромато-масс-спектрометрическое определение продуктов пероксидации липидов

2.4.2. Биофизические модели мембран

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Реагенты

3.2. Культуры клеток и используемый биологический материал

3.3. Аппаратура

64

3.4. Изучение взаимодействия цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с липидными

гидропероксидами

3.4.1. Реакции разложения гидропероксидов липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами

3.4.2. Реакции пероксидации БКЛ пероксидом водорода в присутствие цитохрома c

3.5. Определение гидропероксидов липидов методом активированной хемилюминесценции

3.4.1. Родамин-активированная хемилюминесценция при окислении Fe2+ гидропероксидами липидов

3.4.2. Люминол-активированная хемилюминесценция в реакции восстановления органических и

липидных гидропероксидов под действием микропероксидазы

3.6. Получение комплекса цитохрома с с кардиолипином в гидрофобном растворителе

3.7. Получение малых однослойных липосом методом экструзии

3.8. Получение полиэлектролитных пленок методом послойной адсорбции

3.9. Адсорбция липидов на поверхности полиэлектролитных пленок

3.9.1. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (ЛСКМ)

3.9.2. Выбор условий формирования липидного бислоя на поверхности полиэлектролитных пленок

3.9.3. Транспорт белков через липидный бислой из раствора в полиэлектролитные пленки

3.10. Определение пероксидазной активности комплекса цитохрома с с ТОКЛ липидного монослоя хемилюминесцентным методом

3.11. Методы выделения, разделения и определения липидов клеточных культур и тканей животных

3.11.1. Экстракция липидов и определение содержания фосфолипидов в образце

3.11.2. Определение суммарного содержания белка (для тканей животных)

3.11.3. Разделение липидов методом тонкослойной 2D хроматографии

3.11.4. Обработка липидного экстракта тканей смесью фосфолипаз А1 и А2 с последующим отделением жирных кислот методом твердофазной экстракции

3.11.5. Разделение липидов методом В ЭЖХ

3.11.6. Масс-спектрометрическое определение липидов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Молекулярные механизмы реакций пероксидации, катализируемых цитохромом c и его

комплексом с анионными липидами

4.1.1. Взаимодействие цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с органическими гидропероксидами

4.1.2. Реакции взаимодействия цитохрома c и его комплекса с кардиолипином с анионными липидами и их гидропероксидами

4.1.3. Хемилюминесцентные методики определения гидропероксидов липидов

4.2. Комплекс цитохрома c с кардиолипином в гидрофобном окружении

4.2.1. Получение комплекса цитохрома c с кардиолипином в среде гидрофобного растворителя

4.2.2. Активность комплекса цитохрома c с кардиолипином в липидном монослое

4.2.3. Разработка модели клетки на основе липидного бислоя для изучения мембранно-ассоциированных процессов

4.3. Роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами в развитии апотоза

4.3.1. Механизм биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина митохондрий под действием цитохрома c в процессе апоптоза

4.3.2. Пероксидация кардиолипина и других липидов в процессе апоптоза клеток мозга при церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца

4.3.3. Пероксидация липидов в процессе апоптоза клеток мозга substantia nigra при болезни Паркинсона

4.3.4. Деградационная стадия апоптоза. Роль пероксидации липидов в формировании фагоцитарных сигналов «съешь меня»

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

Цит с - цитохром с; АЛ - анионные липиды; ФЛ - фосфолипиды; КЛ - кардиолипин;

ТОКЛ - 1,1',2,2'-тетраолеилкардиолипин; БКЛ - кардиолипин, выделенный из сердца быка; Цит-АЛ - комплекс цитохрома с с анионными липидами; Цит-КЛ - комплекс цитохрома с с кардиолипином; ФС - фосфатидилсерин;

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты;

ЛК - линолевая кислота; ЛК-ООН - гидропероксид линолевой кислоты;

ПХ - пероксидаза из корней хрена;

МР - микропероксидаза;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

АФК - активные формы кислорода;

ХЛ - хемилюминесценция;

ВЭЖХ-МС - высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

ФБ - фосфатный буферный раствор;

ББ - боратный буферный раствор.

ЛНП - липопротеины низкой плотности

1. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ПЕРОКСИДАЦИЯ ЛИПИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЦИТОХРОМА C И ЕГО КОМПЛЕКСА С АНИОННЫМИ ЛИПИДАМИ И ЕЕ РОЛЬ В АПОПТОЗЕ»

1.1. Актуальность работы

Апоптоз - генетически запрограммированная смерть клетки, один из механизмов ее гибели наряду с некрозом, необходимый для развития многоклеточного организма и участвующий в поддержании тканевого гомеостаза [1]. В то же время, нарушения апоптоза лежат в основе патогенеза многих заболеваний: ингибирование апоптоза приводит развитию раковых опухолей [2], аутоиммунных болезней [3] и нейропрофилеративных заболеваний [4] (шизофрения); с усилением апоптоза связывают развитие СПИДа [5], нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера [6], паркинсонизм [7]), ишемических повреждений [8, 9] (инсульт, инфаркт миокарда) и пр. [10] Современные биофизические и медицинские исследования в области апоптоза направлены, в основном, на изучение его молекулярных механизмов, понимание которых позволит разработать эффективные способы контроля над этим процессом и, в конечном счете, управлять самой клеточной смертью.

На настоящий момент известно, что апоптоз представляет собой многостадийный процесс биологически регулируемых последовательных событий, берущий свое начало в митохондриях, при этом ключевым моментом в развитии апоптоза принято считать образование комплекса между белком цитохромом е и анионным липидом митохондриальной мембраны кардиолипином, приводящее к образованию пор во внешней митохондриальной мембране и последующему высвобождению митохондриального цитохрома е в цитозоль [11, 12]. Было также показано, что комплекс Цит-КЛ обладает пероксидазной активностью и участвует в процессе пероксидации липидов [13, 14]. Точные молекулярные механизмы действия комплекса Цит-КЛ не были установлены, однако известно, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к нарушению целостности митохондриальной мембраны [15-17]. Вопрос о существовании других биологических функций процесса пероксидации липидов под действием

комплекса цитохрома с с кардиолипином, а также другими анионным липидами остается открытым (рис. 1).

Рис. 1. Процесс пероксидации липидов в апоптозе. Пояснения в тексте.

Ответы на эти вопросы позволят уточнить механизм и значимость процесса пероксидации липидных мембран в апоптозе, что, в свою очередь, является важным шагом для понимания и регулирования механизмов клеточной смерти.

1.2. Цели и задачи

Целью данной работы является изучение молекулярных механизмов реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома с с анионными липидами и исследование роли этого процесса в апоптозе.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить молекулярные механизмы реакций липидной пероксидации под действием комплекса Цит-АЛ методом активированной хемилюминесценции в сочетании со спектральными методами исследования.

2. Сравнить пероксидазные свойства комплекса Цит-АЛ в водном окружении, полученного в результате взаимодействия цитохрома с с многослойными липосомами анионного липида или с монослоем липида

методом люминол-активированной хемилюминесценции. Разработать новые системы для изучения комплекса Цит-АЛ в гидрофобном окружении.

3. Выявить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в биосинтезе липидных медиаторов в клетках, подверженных апоптозу, методом хромато-масс-спектрометрии.

4. Установить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в тканях животных с ишемическими повреждениями и с нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Паркинсона) методом ВЭЖХ-МС.

5. Установить роль пероксидации анионного липида фосфатидилсерина на последней (фагоцитарной) стадии апоптоза с использованием хромато-масс-спектрометрии.

6. Разработать методики экспрессного определения первичных продуктов реакций пероксидации липидов, их гидропероксидов, в химических системах и биологических объектах для медицинских исследований.

Научная новизна работы. Для описания процесса пероксидации липидов под действием цитохрома е и его комплекса с АЛ предложено использовать две реакции. Описаны возможные схемы этих реакций. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ в монослое липида. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в гидрофобном растворителе. Показано, что комплекс Цит-КЛ в гидрофобном растворителе обладает пероксидазной активностью. Установлено, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ играют роль не только при инициации апоптоза, но и приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов. Показано, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона и при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией. Установлено, что про-фагоцитарная активность фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше по сравнению с неокисленным.

Практическая ценность работы. Открытие нового механизма биосинтеза окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, важно для клинической практики: понимание механизма биосинтеза медиаторов воспаления для тех или иных заболеваний поможет выбирать оптимальную и наиболее эффективную схему лечения. Был установлен механизм биосинтеза липидных медиаторов при болезни Паркинсона и церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией, в последнем случае показана эффективность действия лекарственного вещества XJB-5-131, ингибитора пероксидации кардиолипина. Разработана и апробирована высокочувствительная методика (10-8 М) определения гидропероксидов липидов крови - маркера многих апоптоз-инициированных патологий.

1.3. Положения, выносимые на защиту

1. Пероксидация липидов под действием цитохрома е и его комплекса с анионными липидами осуществляется путем протекания двух реакций: собственно, пероксидации липидов под действием активных форм кислорода и реакции разложения гидропероксидов липидов с образованием липидных радикалов.

2. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе в хлороформ-метанольной смеси найдено равным 77±11.

3. Реакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома е не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Са2+-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов.

4. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с

последующей реперфузией происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина.

5. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина.

6. Про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше, чем для неокисленного ФС.

Личное участие автора заключалось в проведении всех экспериментов, результаты которых представлены в диссертационной работе, за исключением культивации клеток и описания клеточного ответа, а также операций, проводимых с животными; лично автором были проведены обработка и интерпретация всех полученных данных.

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были также представлены на симпозиуме с международным участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012), всероссийской конференции «Второй съезд аналитиков России» (Москва, 2013) и международной конференции «Ломоносов-2015» (Москва, 2015).

2. Обзор литературы

2.1. Молекулярно-биологические основы апоптоза

2.1.1. Апоптоз как один из механизмов клеточной смерти

Вопрос о гибели клеток, ее причинах, механизмах и возможных путях контроля этого процесса, является, пожалуй, одним из центральных вопросов современной медицинской и биологической науки. Последние десятилетия знания о механизмах клеточной смерти непрерывно расширялись и уточнялись, в результате чего первоначально простая концепция, противопоставляющая два механизма - некроз и апоптоз [1] - была несколько изменена. Были открыты новые формы клеточной смерти, которые, как и апоптоз, заложены (запрограммированы) в генетическом коде клетки. Последние достижения в этой области детально рассмотрены в ряде обзоров [18-20]. Все эти механизмы объединены под общим названием «программируемая клеточная смерть», хотя стоит отметить, что в ранних работах этот термин был синонимичен термину «апоптоз». Некроз при этом стали называть непрограммируемой клеточной смертью.

Классификация механизмов клеточной смерти представлена в таблице 1.

Программируемая клеточная смерть (ПКС)

Непрограммируемая клеточная смерть -некроз Каспазо-зависимый механизм Апоптоз одноядерных клеток (ПКС I типа) Программированный некроз (ПКС III типа)

Митотическая катастрофа Сенессенс (клеточное старение)

Каспазо-независимые механизмы Аутофагия (ПКС II типа)

Параптоз Энтоз

Таблица 1. Механизмы клеточной смерти.

11

Некроз можно описать как неспецифическое набухание клетки и ее мембранных органелл, которое завершается нарушением их целостности. В результате разрывов в плазматической мембране содержимое клетки оказывается во внеклеточном пространстве. Если некроз происходит в организме многоклеточного животного, развивается воспалительный процесс. Принципиальным отличием ПГК является то, что в процессе смерти плазматическая мембрана клетки, как правило, сохраняет свою целостность, и остатки клеток могут быть поглощены макрофагами или соседними клетками. Это означает, что в случае ПГК отсутствует генерализованный ответ организма в виде воспалительной реакции [21].

В составе программируемой клеточной гибели принято выделять три основных типа: апоптоз, аутофагическую гибель и программированный некроз. Митотическая катастрофа, энтоз, параптоз и сенессенс также иногда выделяются в самостоятельные формы клеточной смерти, хотя чаще рассматриваются как варианты апоптоза [18-21].

Поскольку основными видами клеточной смерти по-прежнему считаются некроз и апоптоз, рассмотрим эти механизмы подробнее.

2.1.2. Некроз и апоптоз

Некротическая и апоптотическая формы клеточной гибели одинаковы по своему результату (прекращение биологической активности клетки и ее удаление из организма), но отличаются по молекулярно-биохимическим, морфологическим и клиническим критериям [22].

Рис. 2. Изображения (Л) здоровой, (B) апоптотической и (С) некротической фибросаркомы, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии. На рис. В стрелкой указано клеточное ядро; на рис. С звездочкой отмечен макрофаг (снизу) Шкала: 1 мкм. [23].

Морфологические различия некроза и апоптоза были подробно изучены во многих работах [23-29], рис. 2 иллюстрирует эти различия на примере фибросаркомы - клетки злокачественной опухоли.

В отличие от некроза, апоптоз поражает единичные клетки и делает это избирательно. Апоптотические клетки, в отличие от некротических, не обнаружены в соприкосновении друг с другом, они располагаются по одиночке или небольшими группами и разбросаны по всей ткани, воспалительного процесса при этом не наблюдается [24-26]. Митохондрии при некрозе набухают и разрушаются, при апоптозе большинство митохондрий мало изменено по сравнению с нормой. Ядра при некрозе мало изменены, при апоптозе по периферии, под мембраной ядра, конденсируется хроматин, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров, а ядро может разрываться на два или несколько фрагментов. Клетка при некрозе набухает, а затем может произойти разрыв цитоплазматической мембраны. При апоптозе клетка сжимается, на ее поверхности образуются так называемые «бородавки», что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с фрагментами ядра или без них [27-29] [23].

Помимо морфологических изменений, существует и ряд биохимических показателей апоптоза: фрагментация ДНК; активация специфических сериновых протеиназ, называемых каспазами; появление на поверхности клеток фосфатидилсерина, выход цитохрома с из митохондрий и др [23, 30]. Основными методами определения этих маркеров являются проточная цитофлуориметрия и вестерн-блот анализы.

Отдельного рассмотрения заслуживает получивший широкое распространение метод анализа апоптоза по связыванию флуоресцентно меченного аннексина V-FITC и красителя пропидий иодида (Р!). Аннексин V специфично и с высокой афинностью связывается с фосфатидилсерином, который появляется на поверхности апоптотических и некротических клеток; PI проникает только в клетки с поврежденной мембраной. Таким образом,

апоптотические клетки окрашиваются только аннексином V, поскольку они сохраняют целостность мембраны на ранних стадиях апоптоза, в то время как некротические клетки окрашиваются обоим реагентами (рис. 3).

Рис. 3. Пример анализа апоптотических клеток, окрашенных аннексином V-FITC и пропидий иодидом Р1 методом проточной цитометрии. Клетки линии HL60 инкубировали в отсутствие (слева) и в присутствии хлорноватистой кислоты (справа) в течение суток. Аннексин V/PI'/' - живые клетки; аннексин V/PI+/' - апоптотические клетки; аннексин V/PI+/+ - некротические клетки [30].

Активация защитных антиоксидантных ферментативных систем, таких как глутатионпероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза и др., также может служить косвенным признаком развития апоптоза [31].

ТЛ " V-»

В отличие от некроза, сопровождающегося выраженной клинической симптоматикой, апоптоз не имеет клинических проявлений. Апоптоз распространяется только на отдельные клетки, а некроз развивается на территории ткани и даже целого органа; после апоптоза восстанавливаются клетки, аналогичные погибшим, в то время как на месте некроза обычно разрастается рубцовая соединительная ткань; как уже упоминалось, апоптоз не сопровождается характерными для некроза воспалительными реакциями [4].

2.1.3. Молекулярные механизмы апоптоза

Апоптоз представляет собой каскадный процесс, который реализуется в несколько стадий, называемых сигнальная (индукторная), эффекторная и деградационная фазы. Каждая из них будет подробно рассмотрена ниже.

А. Сигнальная и эффекторная фазы

Инициация апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Соответственно, существует два сигнальных пути индукции апоптоза: внешний, или рецептор-зависимый путь, и внутренний, или митохондриальный путь [32], схематично показанные на рис. 4 [33].

Рис. 4. Схема внутреннего и внешнего путей апоптоза [33]. Объяснение в тексте.

При внешнем пути развития, сигнал апоптоза воспринимается так называемыми рецепторами смерти, расположенными на поверхности клеточной мембраны. Все известные на сегодняшний день рецепторы, принимающие сигналы смерти, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (tumor necrosis factor receptor, или кратко TNFR) и имеют схожее строение. Наиболее изученными рецепторами смерти являются CD95 (также известный как FAS или APO-1), TNFR1 (также называемый p55) и DR3 (death receptor). Они представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти (англ. death domain или кратко DD) и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза [34].

Intrinsic

Cytochromet

Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримеризованными лигандами - гликопротеинами различной природы (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т. п.). Лиганд «сшивает» 3 молекулы рецептора, и активированные таким образом рецепторы передают сигнал внутриклеточным белкам-адаптерам. Для рецептора CD95 (FAS/APO-1) адаптером является белок FADD (FAS-associated DD-protein), а для TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (TNFRl-associated DD-protein) [35].

Адаптеры, ассоциированные с рецепторами смерти, вступают во взаимодействие с эффекторами — пока еще неактивными прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, называемые апоптосомами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть, и активирующими специфические ферменты - инициирующие каспазы (-2; -8 и -10) [36]. Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8 [37]. Активированные инициирующие каспазы далее запускают каспазный каскад во второй, эффекторной фазе апоптоза.

Большинство форм апоптоза у млекопитающих протекает по внутреннему пути, а не через рецепторы клеточной гибели. Такой сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков - цитохрома с; прокаспаз -2, -3 и -9 и флавопротеина AIF (apoptosis inducing factor) - из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки и называется митохондриальным [37, 38].

Данный процесс может индуцироваться рядом факторов, таких как повреждение митохондриальной ДНК, радиационное воздействие, цитотоксичное действие некоторых веществ, укорочение до критического уровня теломеров и пр. Механизм инициированного таким образом выхода апоптогенных белков может заключаться либо в разрыве мембраны митохондрии, либо в результате образования в ней проводящих каналов [16].

Разрыв наружной митохондриальной мембраны, по-видимому, происходит при увеличении объема (набухании) матрикса митохондрий под

действием давления со стороны внутренней мембраны, площадь которой значительно больше, чем площадь мембраны наружной. В первую очередь, это может быть связано с нарушением внутриклеточного гомеостаза ионов Ca2+, высвобождение которых [39, 40] приводит к активации митохондриальной фосфолипазы А2 [41, 42] и последующему увеличению ионной проницаемости внутренней мембраны, которое в свою очередь приводит к активному набуханию митохондрий. Впервые этот процесс наблюдался Ю.А. Владимировым в 1973 году [43], а также был независимо описан Хантером и сотрудниками в 1976-1978 [44-46]. Другой причиной нарушения целостности мембраны и набухания матрикса считают перекисное окисление липидов [4750].

Наиболее вероятным процессом, приводящим пероксидации липидов митохондриальной мембраны, считают взаимодействие цитохрома c с кардиолипином и появление у мембранносвязаннного цитохрома c пероксидазной активности [51-54]. Данное событие имеет решающее значение для выполнения программы апоптоза [55, 56]. Особенности формирования комплекса цитохрома c с кардиолипином и появление у него пероксидазной активности будут подробно рассмотрены в далее.

Не связанное с набуханием матрикса образование пор во внешней мембране обусловлено действием белков семейства Bcl-2 - основных регуляторов митохондриального пути апоптоза [57, 58]. К этому семейству относятся апоптотические белки Bax и Bak - белки цитоплазмы, способные встраиваться в наружную мембрану митохондрий и олигомеризоваться, образуя в мембране каналы [59]. Активация Bax может быть вызвана другим проапоптотическим белком Bid. Впрочем, обрезанная форма Bid (t-Bid), возможно, способна формировать каналы независимо от Bax. Одновременное присутствие Bax и белка внешней мембраны порина, или VDAC (voltage dependent anionic channel) приводит к еще более эффективному раскрытию пор мембраны [60].

Антиапоптотические белки Bcl-2 и Bcl-xL того же семейства Bcl-2 конкурируют с проапоптотическими белками и блокируют процесс открывания пор [61].

Индукторная фаза митохондриального пути апоптоза завершается формированием вышедшим в цитоплазму цитохромом c и белком APAF-1 апоптосомы (apoptosis protease activating factor-1) [60]. Предварительно, APAF-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. В итоге, происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка APAF-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9

[62]. Образовавшаяся апоптосома активирует каспазу-9, которая, в свою очередь, связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3

[63]. При активировании каспаз не имеет значения, находится ли цитохром с в окисленном или в восстановленном состоянии. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз [63].

В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один общий путь апоптоза [34]. Основными эффекторами апоптоза являются ферменты, расщепляющие белки по остаткам аспартата -каспазы. В тканях млекопитающих идентифицировано 14 различных видов каспаз, все они выполняют различные физиологические функции. Часть из них не участвует в апоптозе (-1, -4, -5, -11, -13, -14). Каспазы апоптоза разделяют на инициаторные (-2, -8, -10, -9, -12) и эффекторные (-3, -6, -7). Инициаторные каспазы активируют эффекторные каспазы, которые в свою очередь провоцируют и непосредственно участвуют в трансформации клетки

[64]. Они активируют ферменты эндонуклеазы, гидролизуют белки ядерной ламины, разрушают цитоскелет, и расщепляют белки, регулирующие клеточную адгезию. Другой важной функцией эффекторных каспаз является инактивация белков, блокирующих апоптоз. В частности, расщепляется ингибитор DFF (DNA fragmentation factor), препятствующий активации апоптозной ДНКазы CAD. Разрушению подвергаются и антиапоптозные белки семейства Bcl-2 [34, 63].

Б. Деградационная фаза апоптоза

Вне зависимости от изначального инициирующего воздействия, итогом апоптотической программы является фрагментация клетки на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро, в среднем за 90 минут, фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции [65].

Поскольку часть данной диссертационной работы была посвящена изучению сигнальных механизмов фагоцитоза апоптотических клеток, ниже эта стадия будет рассмотрена подробнее.

Фосфатидилсерин как фагоцитарный «съешь меня» сигнал

Анионный фосфолипид фосфатидилсерин (рис. 5) составляет до 10% от общего количества фосфолипидов в плазматической мембране и мембранах эндоплазматического ретикулума.

Рис. 5. Строение молекулы фосфатидилсерина. Rl и R2 - ацильные остатки жирных кислот.

При нормальном функционировании здоровой клетки фосфатидилсерин находится на внутренней поверхности ее плазматической мембраны и играет важную роль в ряде внутриклеточных реакций [22], однако, при апоптозе молекулы фосфатидилсерина под действием фермента скрамблазы [66] экстернализуются на внешнюю сторону клеточной мембраны. При этом

и и 1 1 и и и /-*

электронейтральный фосфолипидный монослой плазматической мембраны приобретает отрицательный заряд, и поверхность клетки модифицируется, а сам экстернализованный ФС служит сигналом «съешь меня» для макрофагов [67].

о

Аналогично, ФС, экстернализованный на поверхность при активации тромбоцитов, распознается белками свертывания крови [22].

Несмотря на то, что ФС уже давно известен как сигнал «съешь меня», механизм его распознавания фагоцитами изучен не до конца, его исследованию и уточнению посвящено много работ. Основные современные гипотезы и концепции о способах распознавания фосфатидилсерина рецепторами подробно описаны в обзоре [57].

По-видимому, основным механизмом распознавания ФС является его связывание с мостиковыми белками, которые, в свою очередь, связаны с рецепторами. Так, основной из них, ФС-рецептор, который был описан в работе [68], распознает фосфатидилсерин через мостиковый белок аннексин I, который во время апоптоза перемещается из цитозоля клетки к обогащенным фосфатидилсерином участкам внешней стороны плазматической мембраны [69]. Были обнаружены и другие рецепторы, способные распознавать ФС аналогичным образом [57]. Кроме того, существуют также и другие «съешь меня» сигналы для фагоцитов и соответствующие им рецепторы. Например, предполагается, что окисленный по ацильной цепи фосфатидилсерин распознается рецепторами-мусорщиками, CD36 и SR-PSox (рецептор на ФС и рецептор на окисленные липопротеины и цитокин СХСЬ16) [70, 71]. Совсем недавно было обнаружено, что и другой метаболит ФС, лизо-фосфатидилсерин, связывается с G2A рецепторами фагоцитов [72, 73].

Таким образом, фагоциты имеют несколько типов рецепторов для распознавания мертвых клеток, что вызывает вопрос о цели такой очевидной избыточности. Еще одно противоречие концепции о ФС, как об универсальном «съешь меня» сигнале, наблюдается в том, что во время нормальной физиологической активности некоторые типы клеток, включая макрофаги, лимфоциты и эндотелиальные клетки экстернализуют ФС в количествах, достаточных для их обнаружения, но все же не подвергаются удалению [74]. Кроме того, хотя фосфатидилсерин экстернализуется и апоптотическими, и

некротическими клетками (хотя и в разной степени) [75], последствия их захвата фагоцитами кардинально различны [76].

Это поднимает вопрос о том, является ли появление на клеточной поверхности фосфатидилсерина единственным универсальным предвестником фагоцитоза, как полагалось ранее, или есть другие лиганды, также исполняющие роль активаторов фагоцитоза, такие как окисленный и лизо-ФС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА, 2015 год

■ и

1 \

■ \ \ 5

ч

Время, с

I—I—I

О 400

Рис. 44. Кривые хемилюминесценции, полученные введением через шприц 20 мкМ родамина 6ж и различных количеств FeSO4 (1 - 1 мМ, 2 - 2,5 мМ, 3 -5 мМ, 4 - 10 мМ, 5 - 15 мМ) в 20 мМ ФБрН 7,4 к 50 мкл сыворотки крови в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации -10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует началу ХЛ вспышки.

Наконец, аналогичная форма ХЛ кривых и влияние концентрации Fe2+ были получены и для сыворотки крови человека. В отличие от работы [188], липопротеины не выделяли и использовали сыворотку крови без предварительной пробоподготовки. Эти данные представлены на рис. 44. Увеличение концентрации ионов Fe2+ приводило к уширению кинетических ХЛ кривых и исчезновению быстрой вспышки. Поскольку форма ХЛ кривых совпала с полученной в работе [188] для липопротеинов, оценить, необходимо ли выделять ЛНП из образца для ХЛ анализа или сыворотку можно анализировать напрямую, представляло практический интерес. Возможной причиной ошибок, вносимых при использовании сыворотки крови может стать сложность и многокомпонентность сыворотки как объекта, и, как следствие, присутствие мешающих компонентов.

113

12 Время, с

12 Время, с

24

Рис. 45. Влияние прединкубации сыворотки/плазмы крови с родамином 6ж на хемилюминесценцию в системе: 1 - сыворотка и родамин 6ж были смешаны непосредственно в ХЛ эксперименте; 2 - сыворотка и родамин 6ж были смешаны за 5 минут до ХЛ эксперимента; 3 - плазма и родамин 6ж были смешаны непосредственно в ХЛ эксперименте; 4 - плазма и родамин 6ж были смешаны за 3 минуты до ХЛ эксперимента. Рабочие концентрации: 80 мкМ родамин 6ж, 1 мМ FeSO4 и 50 мкл сыворотка или плазма крови в 20 мМ ФБ рН 7,4 в конечном объеме 1000 мкл. Частота регистрации -10 Гц. Момент смешения компонентов ХЛ смеси соответствует 0 минутам.

Действительно, сравнение ХЛ кривых, полученных с предварительной инкубацией сыворотки или плазмы крови с родамином 6ж и без инкубации (смешение в момент эксперимента), показало, что при предварительном взаимодействии сыворотки с родамином 6ж форма ХЛ кривых меняется и интенсивность ХЛ в каждый момент времени падает (рис. 45, кривые 1 и 2 и 3 и 4, соответственно). Вероятно, наблюдаемое явление связано со связыванием родамина с компонентами (белками) объекта. Таким образом, использование описанной методики определения гидропероксидов липидов без предварительного выделения фракции липопротеинов не представляется возможным. Разработка методики определения гидропероксидов липидов на основе ХЛ реакции их восстановления микропероксидазой в присутствие изолюминола

Добавление смеси изолюминола с микропероксидазой к раствору, содержащему небольшие количества гидропероксидов липидов, приводит к

возникновению вспышки ХЛ, интенсивность которой зависит от концентрации гидропероксидов, согласно схеме реакций, прведенной в работе [197] и описанной выше в обзоре литературы. Данная реакция была положена в основу некоторых хемилюминесцентных методик определения гидропероксидов липидов [165, 198], однако ранее применялась для проточных методов в хроматографической детекции и не была адаптирована для стационарных условий. К тому же, в различных вариантах методики использовали различные стандарты - трет-бутилгидропероксид или гидропероксиды различных липидов, что затрудняет сравнение полученных данных.

Оптимизация условий хемилюминесцентных реакций

Значение рН буферного раствора и концентрации реагентов (микропероксидазы-11 и изолюминола) подбирали с использованием ХЛ системы на основе трет-бутилгидропероксида с концентрацией 200 нМ таким образом, чтобы сигнал был максимальным, расход реагентов как можно меньшим, при этом микропероксидаза и изолюминол оставались в необходимом избытке по отношению к предполагаемому содержанию гидропероксидов.

Исследуемая ХЛ система крайне чувствительна к рН реакционной среды. Данные, полученные при проведении реакции с использованием 2 мкМ изолюминола и 200 нМ микропероксидазы, представлены на рис. 46, А. Наблюдаемый эффект усиления хемилюминесцентоного сигнала с ростом рН, по-видимому, связан с увеличением квантового выхода изолюминола, переходящего в щелочной среде в более активную депротонированную форму. Для дальнейших исследований использовали боратный буферный раствор с рН 10.0.

При увеличении концентрации изолюминола до 2 мкМ происходит рост площади под кривой ХЛ, в то время как при концентрациях более 2 мкМ происходит уменьшение хемилюминесцентного сигнала при увеличении концентрации изолюминола (рис. 46, Б). Данный эффект, вероятно, связан с концентрационным тушением. Концентрация микропероксидазы влияет на

хемилюминесценцию в системе аналогичным образом. Максимум аналитического сигнала достигается при 200 нМ, дальнейшее увеличение концентрации микропероксидазы не приводит к росту ХЛ сигнала (рис. 46, Б).

Рис. 46. Зависимости площади под кривой ХЛ от (А) pH буферного раствора (фосфатный для рН<9 или боратный буферный раствор pH 10.0; ХЛ-реагент содержал 200 нМ 1 MP-11 и 2 мкМ изолюминол) и (Б) концентраций изолюминола (черные треугольники) или микропероксидазы (белые ромбы). Концентрация трет-бутилгидропероксида 200 нМ. Общий объем ХЛ смеси 1000 мкл. Стандартные отклонения даны для 2 параллельных измерений.

Два стандарта для определения гидропероксидов липидов

Для определения суммарного содержания гидропероксидов липидов в биологических объектах было предложено использовать два различных стандарта: трет-бутилгидропероксид и гидропероксид линолевой кислоты. ХЛ кривые, полученные для различных концентраций двух этих стандартов, а также для выделенных из крови пациента, больного атеросклерозом, липопротеинов низкой плотности, представлены на рис. 47.

m 1.5 X 1.2 | 0.9

^ 0.6

б

5 03 ix л

A.

6 г Б-

5

4

3

3

о Шш 2

1 V

0

В.

I

60 120 180 240 300 0

Время, с.

60 120 180 240 300

Время, с.

0 60 120 180 240 300 О

Время, с.

Рис. 47. Типичный вид ХЛ кривых в системе, состоящей из 200 нМ MP-11, 2 мкМ изолюминола и различных количеств гидропероксидов: (А) трет-бутилгидропероксида (1 - 25 нМ, 2 - 50 нМ и 3 - 100 нМ) и (Б) гидропероксида линолевой кислоты (1 -75 нМ, 2 -100 нМ и 3 - 200 нМ) в среде боратного буферного раствора pH 10.0. (В) Типичный вид кривых хемилюминесценции ЛНП, выделенных из сыворотки крови в присутствие 200 нМ MP-11 и 2 мкМ изолюминола в среде боратного буферного раствора pH 10.0. Общий объем ХЛ смеси 1000 мкл.

Видно, что реакция с гидропероксидом линолевой кислоты протекает почти на порядок быстрее. Важно отметить тот факт, что за исследуемый период времени (5 минут) реакция восстановления ЛК-ООН полностью заканчивается, что следует из уменьшения ХЛ сигнала до фонового значения. В случае с tBuOOH, ХЛ реакция продолжается значительно дольше (рис. 47, А и Б). Стоит также отметить, что форма ХЛ кривых в случае с ЛК-ООН совпадает с формой кривых, полученных для биологических объектов (рис. 47, В).

Вышесказанное позволяет заключить, что гидропероксид линолевой кислоты представляет собой лучший стандарт для определения гидропероксидов липидов по сравнению с трет-бутилгидропероксидом, в то же время, последний значительно выигрывает по химической устойчивости, доступности, а также по своей стоимости.

Калибровочные зависимости для обоих стандартов линейны в исследуемом концентрационном диапазоне и представлены на рис. 48.

Рис. 48. Градуировчные зависимости площади под кривой ХЛ от концентрации (А) трет-бутилгидропероксида и (Б) гидропероксида линолевой кислоты. Стандартные отклонения даны для 3 параллельных измерений.

Метрологические характеристики, рассчитанные для обоих стандартов:

tBuOOH: у = (0,68±0,07)с(нМ) (Р=0,99; п=10), г=0,99. Предел обнаружения 13 нМ.

ЛК-ООН: у = (0,45±0,05)с(нМ) (Р=0,99; п=12), г =0,99. Предел обнаружения 16 нМ.

Определение гидропероксидов липидов в липопротеинах низкой плотности крови

Были исследованы образцы сыворотки крови 10 пациентов с ранней стадией атеросклероза. Фракцию липопротеинов низкой плотности выделяли согласно методике, описанной в работе [189]. Процедура выделения схематично показана на рис. 4, А. Определяли количество гидропероксидных групп методом градуировочного графика по tBuOOH или ЛК-ООН. Результаты исследования приведены в таблице 5.

№ В единицах tBuOOH, мкмоль/мл сыворотки крови В единицах ЛК-ООН, мкмоль/мл сыворотки крови

1 0,9±0,1 0,6±0,1

2 0,5±0,1 0,3±0,1

3 1,7±0,1 1,1±0,1

4 1,2±0,1 0,8±0,1

5 1,4±0,1 0,9±0,1

6 2,6±0,2 1,7±0,1

7 1,7±0,5 1,1±0,3

8 2,4±0,3 1,6±0,2

9 2,8±0,5 1,9±0,3

10 1,5±0,1 1,0±0,1

Среднее значение: 1,7±0,8 1,1±0,5

Таблица 5. Определение гидропероксидов липидов в липопротеинах низкой плотности крови пациентов, больных атеросклерозом, с использованием двух стандартных соединений: трет-бутилгидропероксида и гидропероксида линолевой кислоты. Стандартные отклонения приведены для 3 измерений.

Рассчитанные значения хорошо коррелируют с содержанием гидропероксидов ЛНП пациентов, больных атеросклерозом, представленным в работе [167].

4.2. Комплекс цитохрома с с кардиолипином в гидрофобном окружении

Подходы, примененные в первом разделе диссертации, позволили изучить основы молекулярных механизмов реакций, однако используемая модель наносфер комплекса в водной среде имеет ряд недостатков, в первую очередь, принципиально отличное от клеточного конформационное состояние как цитохрома с, так и липидов. Поэтому на следующем этапе работы были предприняты попытки разработать новую модель, позволяющую глубже понять механизмы реакций в среде, близкой к биологической.

4.2.1. Получение комплекса цитохрома c с кардиолипином в среде гидрофобного растворителя

Ранее наши многократные попытки перевести комплекс цитохрома с с кардиолипином, выпавший в осадок из водного раствора, в малополярные органические растворители, такие как н-гептан или хлороформ, не увенчались успехом. По-видимому, гидрофобные взаимодействия между сложившимися в кристаллоподобную структуру наносферами (или нанотрубками), имеющими гидрофобную поверхность, настолько велики, а удалить полностью остатки воды из осадка настолько трудно, что растворитель не в состоянии оторвать друг от друга наносферы в составе твердой фазы. Чтобы это произошло, к растворителю надо добавить более полярный растворитель, такой как метанол. Это хорошо видно на рис. 49, где приведены спектры поглощения растворов комплекса цитохрома с с ТОКЛ в гексане, полученные, как описано выше, при разном содержании метанола в смеси перед добавлением хлороформа.

0.15

л

8 0.10

Z

о

с

с

X

4

X

£ 0.05

5

с

о

0.00

Рис. 49. Спектры поглощения комплекса цитохрома c с ТОКЛ в гексане: 1 - при экстракции хлороформом из раствора цитохрома с в смеси вода-метанол 10:11, 2 - из раствора в смеси вода-метанол 10:1.

Видно, что при более высоком содержании метанола в водно-метанольной смеси комплекс цитохрома с с кардиолипином переходит в хлороформ, а затем - в

400 500 600

Длина волны, нм

гексан значительно активнее (рис. 49, 1), чем при низком содержании метанола (рис. 49, 2). Если смесь цитохрома с с кардиолипином была растворена в растворителе с отношением вода/метанол 9:1, количество комплекса, переведенного в гексан, составляло 0,6 нм, а если отношение было 9:11, оно составляло уже 3,2 нмоль (из 20 нмоль цитохрома с в исходной смеси).

Переход комплекса цитохрома с с кардиолипином из водно-метанольной фазы в хлороформ, как показали наши опыты, не зависит от того, добавляли ли мы основное количество метанола перед добавлением хлороформа или же в смеси с хлороформом. В последнем случае процедура перевода комплекса цитохрома с с кардиолипином из водно-буферного раствора в хлороформ весьма напоминает метод выделения липидов по Фолчу, по которому к ткани добавляют 20-кратный избыток смеси хлороформа с метанолом 2:1 [191]. В наших опытах соотношение хлороформ/метанол/вода составляло 100:54:50. Согласно Фолчу, при соотношении 100:50:37 (что близко к нашему) верхняя фаза состояла в основном из смеси воды и метанола (8:48:47), а нижняя - из хлороформа с небольшим количеством метанола и воды (86:14:1). Большинство липидов в такой системе переходят в хлороформ, а в системе, содержащей комплекс цитохрома с с кардиолипином в хлороформ переходят покрытые углеводородной оболочкой шарики, спрятавшие внутри себя цитохром с.

Как уже говорилось, в отсутствие кардиолипина цитохром с в хлороформ не переходит ни в отсутствии метанола, ни при его 50% содержании в водном растворе. Как видно на рис. 50, при отношении кардиолипина к цитохрому в исходной смеси 10:1 и даже 15:1 цитохром с переходит в хлороформ в незначительном количестве (всего 1 и 4% от всего цитохрома в системе), тогда как при соотношении липид/белок 20:1 и 30:1 доля гемопротеина, перешедшего в хлороформ, существенно возрастает (по данным спектрофотометрии, до 24 и 37%, соответственно).

0 20

Й

К

3

о

Рис. 50. Спектры поглощения комплекса цитохрома с с ТОКЛ, экстрагированного в хлороформ, при различных молярных отношениях кардиолипин/цитохром с: 1 -30:1, 2 - 20:1, 3 - 15:1, 4 -10:1 и 5 -0:1. Экстракция производилась путем добавления равного количества хлороформа к водно-метанольной смеси (10:11 по объему) 20 мкМ цитохрома с и кардиолипина в соответствующей концентрации.

То обстоятельство, что в хлороформ во всех приведенных случаях переходила лишь меньшая часть цитохрома, растворенного в водно-метанольной фазе, связано с тем, что он находился в избытке по сравнению с кардиолипином (то есть в соотношении белок:липид большем, чем конечное соотношение Цит:ТОКЛ в хлороформе). В таких условиях в водном растворе формируется стехиометрический комплекс Цит-КЛ, состав которого при постепенном добавлении кардиолипина остается постоянным [176].

С учетом того, что при добавлении реактива Фолча в фазу хлороформ-метанол переходят все фосфолипиды из исходного водного раствора, очевидно, что разделив количество добавленного кардиолипина на количество цитохрома, перешедшего в хлороформ, мы получим молярное отношение липид:белок в комплекса цитохрома с с кардиолипином, который перешел в гидрофобную фазу. При добавлении достаточного количества кардиолипина (соотношение ТОКЛ:Цит в водно-метанольной среде 20:1 и более) это отношение было найдено равным 77±11, что равно или незначительно превышает значения, которые были получены

Длина волны, нм

нами для комплексов в осадке из водно-буферных растворов [195]. Таким образом, комплексы Цит-КЛ могут быть экстрагированы раствором Фолча и переведены в хлороформ, а затем - и в гексан.

Эффект добавления метанола на конформационное состояние цитохрома с оценивали по его поглощению в концентрированном растворе в длинноволновой области спектра (695-700 нм) в водно-метанольных смесях с различным содержанием метанола. Полученные спектры представлены на рис. 51. Видно, что изменение конформации полипептидной цепи происходит при введении 40% метанола и более (спектры не показаны), что согласуется с эмпирически найденными условиями получения комплекса в хлороформ-метанольной смеси, описанными в данном разделе.

Рис. 51. Спектры поглощения 50 мкМ цитохрома с в водно-метанольной смеси с содержанием метанола (по объему): 1 - 0%, 2 - 10%, 3 - 20%, 4 - 30% и 5 - 40%. Экстракция производилась путем добавления равного количества хлороформа к водно-метанольной смеси (10:11 по объему) 20 мкМ цитохрома с и кардиолипина в соответствующей концентрации.

Получение комплекса Цит-КЛ в виде раствора в неполярной среде дает новые возможности в исследованиях строения этого комплекса и механизма его участия в липидной пероксидации в мембранах митохондрий.

4.2.2. Активность комплекса цитохрома c с кардиолипином в липидном монослое

Известно, что цитохром c меняет свою конформацию в завистмости от микроокружения. Предыдущая часть данной работы была посвящена изучению его функций в водных или гидрофобных органических растровах. В данном разделе приведены результаты исследования его пероксидазной активности в монослое ТОКЛ на границе раздела вода-воздух.

Липидный монослой представляет собой модель митохондриальной мембраны, точнее, ее половины. Мембрана митохондрии содержит около 30% кардиолипина и 65% фосфатидилхолина (проценты даны относительно общего содержания липидов). ФХ таким образом представляет собой основной компонент мембраны, однако не играет роли в активации пероксидазной функции цитохрома с, в отличие от кардиолипина. Поэтому образование монослоя из чистого кардиолипина на первом этапе исследования можно считать адекватной моделью. Монослои формировали в ванных Ленгмюра, на базе института кристаллографии РАН. Липиды на поверхности фосфатного буферного раствора сжимали до максимального давления, контролируя образование монослоя премещением барьера до достижения максимального поверхностного давления. После формирования монослоя кардиолипина, в среду под монослоем вводили раствор цитохрома с. Далее, после встраивания белка в монослой кардиолипина, отбирали пробу для ХЛ анализа пероксидазной активности встроенного в монослой цитохрома с (рис. 52, кривая 2). В контрольном эксперименте отбирали раствор цитохрома с без монослоя (рис. 52, кривая 1). Для определения максимальной пероксидазной активности для цитохрома с, до ХЛ анализа к пробе добавляли избыток ТОКЛ, что приводило к формированию наносфер с цитохромом с в максимально активной конформации - рис. 52, кривые 3 и 4.

Рис. 52. ХЛ кривые, полученные в реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствие комплекса цитохрома с с ТОКЛ: 1 - Цит с без монослоя ТОКЛ (контроль), 2 - Цит с в монослое ТОКЛ, 3 - контроль после добавления к нему избытка ТОКЛ (максимальная активность), 4 - Цит с в монослое ТОКЛ после добавления к нему избытка ТОКЛ (максимальная активность). За 0 минут принят момент добавления Н2О2 к смеси люминола и анализируемого образца цитохрома с. Для получения кривых 3 и 4 ТОКЛ добавляли непосредственно перед добавлением Н2О2.

Приведенные выше кривых ХЛ были получены в реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствие пробы - цитохрома с и его комплекса с ТОКЛ. Данная методика была разработана в лаборатории медицинской биофизики МГУ ранее и применялась для водных растворов. В качестве аналитического сигнала для оценки пероксидазной активности рассчитывали площадь под ХЛ кривой за 5 минут ХЛ реакции. Для сравнения данных, пероксидазная активность цитохрома с, встроенного в монослой, после добавления к нему избытка ТОКЛ, была принята за 100%. Данные приведены в таблице 6.

№ Образец Площадь под ХЛ кривой, В Пероксидазная активность, %

1 Цит с без монослоя ТОКЛ (контроль) 1,9±0,3 10±2

2 Цит с в монослое ТОКЛ 5,1±0,6 27±3

3 Цит с без монослоя ТОКЛ: максимальная активность 14,7±3,8 79±21

4 Цит с в монослое: максимальная активность 18,6±0,2 100

Таблица 6. Данные ХЛ анализа пероксидазной активности цитохрома с в монослое ТОКЛ на основе реакции окисления люминола пероксидом водорода в присутствие комплекса. Нумерация образцов соответствует рис. 52. Стандартные отклонения приведены для 2 измерений.

Полученные данные показали принципиальную возможность определения пероксидазной активности цитохрома с в монослое липидов. Тем не менее, значения полученных сиглалов ХЛ незначительно превосходят фоновые значения, и необходимо проводить оптимизацию методики в дальнейшем. Согласно полученным данным, пероксидазная активность цитохрома с, встроенного в монослой кардиолипина, составляет 27% от максимального значения.

4.2.3. Разработка модели клетки на основе липидного бислоя для изучения мембранно-ассоциированных процессов

Наиболее адекватной моделью липидной мембраны принято считать липидный бислой. Недавние исследования взаимодействия цитохрома с с кардиолипином гигантских однослойных липосом [181, 182] показали высокий потенциал перспективность и этого направления. Тем не менее, использование липосом в качестве модельной мембраны имеет ряд ограничений, связанных, в

первую очередь, с динамикой их поведения в растворе, а также с невысокими концентрационными пределами. В данной работе была предложена альтернативная модель липидного бислоя, нанесенного на подложку из биополиэлектролитных мультислоев, состоящих из гиалуроновой кислоты (НА, -) и поли^-лизина (PLL, +). Оба полимера представляют собой компоненты внеклеточного матрикса, что позволяет рассматривать разработанную систему как модель клетки. HA/PLL полимерная пленка была получена методом послойной адсорбции. Пленка, нанесенная на плоскую поверхность покровного стекла и состоящая из 24 бислоев (пар HA/PLL) имеет толщину порядка 1-2 мкм и характеризуется высоким содержанием воды (порядка 80% от объема) [199]. Внутренняя структура мультислоев была изучена ранее в работах [200, 201]. Известно, что гиалуроновая кислота образует жесткий каркас, в то время как полилизин Важно также отметить, что такие полимерные пленки аккумулируют биомолекулы различной природы (АТФ, ДНК, белки и пр.), что позволяет достигнуть высоких концентраций.

Предложенная модель клетки схематично представлена на рис. 53. Липидный бислой образован из липосом, двумя основными компонентами которых были цвиттерионный фосфатидилхолин (ФХ) и анионный липид фосфатидилглицерол (ФГ). Структурно молекула ФГ представляет собой половину молекулы кардиолипина. Липосомы диаметром около 100 нм (как было показано методом динамического светорассеяния) были помечены флуоресцентным липидом NBD-фосфатидилэтаноламином. Их адсорбцию на поверхность планарных HA/PLL мультислоев наблюдали методом конфокальной микроскопии.

■I о

Рис. 53. Модель клеточной мембраны (липидный бислой), на границе раздела между водным раствором (цитозоль, голубым цветом) и биополимерными мультислоями (внеклеточный матрикс, HA/PLL). Масштаб не соблюден. Пояснения в тексте.

На первом этапе исследования необходимо было подобрать условия

1 и и и V/

формирования гомогенной бислоинои липиднои структуры на поверхности полимеров. Было показано, что характер взаимодействия анионных липосом с мультислоями определяется допированием поверхности полимерной пленки поли-L-лизином (рис. 54, А и Б). Для создания пленки использовали два вида поли^-лизина, отличающихся по молекулярной массе: порядка 28 или 280 кДа. PLL28 отличается от PLL280 на несколько порядков большим коэффициентом диффузии (в силу меньшей длины цепи) и, следовательно, быстрее диффундирует к поверхности мультислоев или даже выходит за пределы пленки. Избыточное количество PLL28 приводит к его агрегации с анионными липосомами на поверхности пленки (рис. 54, А). Замена поли^-лизина на PLL280 приводит к формированию гомогенной структуры липидного слоя на поверхности мультислоев (рис. 54, Б).

Рис. 53. Изучение морфологии липидного слоя на полимерных мультислоях методом сканирующей конфокальной лазерной микроскопии. А. Образование агрегатов липидов с PLL на поверхности HA/PLL28 пленки. Б. Образование липидного бислоя на поверхности HA/PLL280 пленки. С. Распределение липидов (слева) и белка лизоцима (справа) на HA/PLL280 пленке, нанескенной на стеклянное волокно. Шкала - 20 мкм.

Флуоресцентные изображения (посередине) соответствуют локализации липидов (флуоресцентно меченных). Приведенные профили флуоресценции (снизу) были взяты вдоль желтых стрелок, указанных на флуоресцентных изображениях. Изображения, полученные при пропускании света (633 нм) приведены сверху. Перед тем началом эксперимента полимерные пленки «царапали» тонкой металлической иглой, полученные царапины (в виде креста для рис. 53, А) и вертикальной линии (рис. 53, Б) использовали для (1) фокусирования на поверхности пленки и (2) в качестве контроля для адсорбции липосом на стекло. Попытка уменьшить силу взаимодействия липосом и полилизина за счет исключения из состава липосом ФГ не привела к улучшению качества липидного бислоя (данные не показаны).

Распределение липосом на поверхности пленок, а не внутри мультислоев, было показано с использованием HA/PLL280 пленки, нанесенной на длинное и узкое стеклянное волокно цилиндрической формы (рис. 53, В). В качестве контрольного эксперимента, в пленку загрузили белок лизоцим, для которого известно гомогенное распределение по всей глубине пленки (рис. 53, В, справа). В отличие от лизоцима, липосомы (рис. 53, В, слева) локализуются только на поверхности мультислоев и не проникают внутрь.

Чтобы подтвердить формирование бислойной структуры, а не мультислойное строение липидного покрытия, количество адсобрированных липидов определяли по уменьшению флуоресценции супернатанта (суспензии липосом, содавленной к пленке полимеров). Найденное значение составило 0,4±0,1 нмоль, в то время как количество липидов, необходимое для образования липидного бислоя (оцененное теоретически) равно 0,6 нмоль. Очевидно, что адсорбированное количество недостаточно для образования нескольких бислоев и, учитывая гомогенное распределение липидов по поверхности (рис 53, Б), можно предположить, что липосомы разворачиваются и образуют липидный бислой на поверхности мультислоев.

Наконец, транспорт модельного белка, лизоцима, по свойствам и размерам аналогичного цитохрому c, через полученную мембрану и в ее отсутствие был изучен методом конфокальной микроскопии (рис. 54).

Рис 54. Транспорт лизоцима через липидный бислой (А - черные ромбы, Б -изображения снизу) и в отсутствие липидного бислоя (А - красные круги, Б -изобрадения сверху). А. Кинетика транспорта лизоцима. Стандартные отклонения приведены для 2 измерений. Б. Изображения, полученные для 30 мин. Шкала - 20 мкм.

В присутствие мембраны было показано уменьшение количества белка, прошедшего в пленку по сравнению с непокрытыми липидами мультислоями, примерно в 2-3 раза.

Были найдены условия получения гомогенной и непрерывной структуры бислоя липидов, его структура была подтверждена методами флуоресцентного анализа и лазерной конфокальной микроскопии, барьерные свойства против транспорта белков были изучены. Разработанная система может быть использована в дальнейшем для изучения процессов, происходящих на мембране или в околомембранном пространстве клетки.

4.3. Роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома с с анионными липидами в развитии апотоза

Завершающий этап работы был посвящен изучению роли процесса липидной пероксидации в апоптозе непосредственно в культурах клеткок при внутреннем пути инициации апоптоза и тканях животных при различных патологиях. Данное исследование стало возможным благодаря использованию мощного инструмента

для тотального скрининга липидного состава клеток и тканей - хромато-масс-спектрометрического анализа.

4.3.1. Механизм биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина митохондрий под действием цитохрома c в процессе апоптоза

Последняя часть данной диссертационной работы была посвящена изучению роли реакций пероксидации анионных липидов в процессе апоптоза. Известно, что катализируемая цитохромом c пероксидация мембраны митохондрий приводит к образованию в ней пор и дальнейшему выходу апоптогенных белков в цитозоль. В этом разделе будет показана еще одно важное значение реакций пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c - биосинтез липидных медиаторов. Было также показано, что этот механизм реализуется при церебральной ишемии-реперфузии и болезни Паркинсона (следующие два раздела).

Известно, что стадия инициации апоптоза происходит в митохондриях, после чего каскад каспаз развивается в цитозоле и на финальной стадии достигает клеточной мембраны. Очевидно, что в клетке должна существовать система сигнальных молекул для реализации программы апоптоза: в роли таких молекул выступают липидные медиаторы, продукты окисления полиненасыщенных жирных кислот. В ранних работах был изучен путь биосинтеза липидных медиаторов из фосфатидилсерина, находящегося на клеточной мембране (подробно результаты этих работ были описаны в обзоре [202]). Известно, что этот механизм осуществляется ферментными системами, находящимися в цитозоле. Тем не менее, в ряде исследований было показано, что фосфатидилсерин является не единственным липидом, подвергающимся окислению в процессе апоптоза. Так, кардиолипин, содержащийся в митохондриях, источниках апоптоза, также может подвергаться окислению.

Данная работа была проведена в Питтсбургском университете (США) с использованием ряда химических, клеточных и животных моделей [184]. Вклад

автора заключался в интерпретации данных хромато-масс-спектрометрического анализа. Основные результаты будут рассмотрены ниже.

Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа липидов мутантных клеток, не содержащих цитохром (Цит с " ") и контрольных клеток той же линии (Цит с ++), подвергнутых апоптозу, инициированному актиномицином Д (не являющимся окислителем) или окислителем tBuOOH приведены на рис. 55.

Рис. 55. А. Уровень апоптоза, оцененный по связыванию клеток с аннексином V. Б. ВЭЖХ-МС свободных окисленных жирных кислот и В. ВЭЖХ-МС лизо-кардиолипинов в Цит с +/+ и Цит с клетках без обработки и после обработки актиномицином Д или tBuOOH. ФЛ - фосфолипиды, КЛ - кардиолипин. Стандартные отклонения даны для п=3. (*) - значения, статистически (р>0,99) отличающиеся от соответствующих контрольных.

Для Цит с " - клеток уровень апоптоза (согласно флуоресценции аннексина V) после обработки актиномицином или tBuOOH не отличался от контрольного значения, в то время как для Цит с + + количество клеток, вступивших в апоптоз, возросло в несколько раз после обработки актиномицином или tBuOOH (рис. 55, А). Согласно данным ВЭЖХ-МС анализа, этот процесс сопровождался накоплением продуктов окисления (рис. 55, Б) и гидролиза (рис. 55, В).

Использование ингибиторов различных фосфолипаз в сочетаниии с последующим ВЭЖХ-МС анализом фосфолипидов позволило установить, что гидролиз окисленного кардиолипина происходит под действием кальций-независимой фосфолипазы А2 (данные не показаны).

Окисленные и затем гидролизованные из кардиолипина митохондриальной мембраны жирные кислоты могут затем быть экстернализованы во внеклеточный матрикс и выполнять сигнальные функции.

Далее было проведено ВЭЖХ-МС исследование продуктов окисления кардиолипина митохондрий, выделенных из тканей мозга. Кардиолипин мозга крысы и других млекопитающих отличается большим разнообразием молекулярных видов (рис. 56, А). Основные полиненасыщенные компоненты кардиолипина мозга - линолевая, арахидоновая и докозагексаеновая жирные кислоты, легко подвергающиеся окислению.

Рис. 56. Масс-спектры (А) кардиолипина, выделенного из митохондрий мозга крысы и (Б) тетралинолеоилкардиолипина, выделенного из сердца. Каждая линия в спектре соответствует молекулярному виду с определенным m/z. Над спектрами приведены молекулярные формулы и соответствующие им m/z для максимальных пиков в каждом из кластеров кардиолипина.

Выделенный из митохондрий природный кардиолипин окисляли смесью цитохрома с с пероксидом водорода. Полученные продукты окисления анализировали методом ВЭЖХ-МС. Найденные в липидном экстракте окисленные жирные кислоты (и ЖК, из которых они были образованы) приведены в таблице 7 ниже. В таблице также приведены литературные данные, указывающие на функции липидных медиаторов найденных окисленных ЖК при различных патологиях.

ш/г [М-Н]- Окисленная ЖК Количество присоединенных атомов кислорода Образована из ЖК Функции липидного медиатора

293 9-оксо-октадекадиеновая кислота + 1 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2 Воспалительная гиперлагезия; лиганд для ванилоидных рецепторов [203]

293 13-оксо-октадекадиеновая кислота + 1 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2 Воспалительная гиперлагезия; лиганд для ванилоидных рецепторов, блокирует интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARт-рецепторы [203, 204]

295 9-гидрокси-октадекадиеновая кислота + 1 [О] ЛК 18:2 Лиганд для ванилоидных и G2A рецепторов, блокирует интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARт-рецепторы [205-207]

Лиганд для ванилоидных и G2A

295 13 -гидрокси-октадекадиеновая кислота + 1 [О] ЛК 18:2 рецепторов, блокирует интерлейкиновые рецепторы и активирует PPARт-рецепторы [205, 206]

295 9,10-эпокси-октадекамоноеновая кислота + 1 [О] ЛК 18:2 Не установлено

295 12,13-эпокси-октадекамоноеновая кислота + 1 [О] ЛК 18:2 Не установлено

309 309 9-гидрокси-14-оксо-октадекадиеновая кислота 13-гидрокси-8-оксо-октадекадиеновая кислота + 2 [О] - 2 [Н] + 2 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2 ЛК 18:2 Не установлено

309 309 309 9,10-эпокси-13 -оксо-октадекамоноеновая кислота 12,13-эпокси-9-оксо-октадекамоноеновая кислота 9,10-эпокси-13 -гидрокси-откадекадиеновая кислота + 2 [О] - 2 [Н] + 2 [О] - 2 [Н] + 2 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2 ЛК 18:2 ЛК 18:2 Стимулируют выработку альдостерона (минералокортикостероидный гормон коры надпочечников) [208]

309 12,13-эпокси-9-гидрокси-откадекадиеновая кислота + 2 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2

311 311 8,13 -дигидрокси-октадекадиеновая кислота 9,14-дигидрокси-октадекадиеновая кислота + 2 [О] + 2 [О] ЛК 18:2 ЛК 18:2 Не установлено

325 8-оксо-13 -гидроперокси-октадекадиеновая кислота + 3 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2

325 325 13-оксо-8-гидроперокси-октадекадиеновая кислота 9-оксо-14-гидроперокси-октадекадиеновая кислота + 3 [О] - 2 [Н] + 3 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2 ЛК 18:2 Не установлено

325 14-оксо-9-гидроперокси-октадекадиеновая кислота + 3 [О] - 2 [Н] ЛК 18:2

319 15-гидрокси-эйкозатетраеновая кислота + 1 [О] АК 20:4 Блокирует интерлейкиновые рецепторы и активирует PPART-

319 12-гидрокси-эйкозатетраеновая кислота + 1 [О] АК 20:4 рецепторы, стимулирует экспрессию белка CD36 [209-

319 14,15-эпоксиэйкозатетраеновая + 1 [О] АК 20:4 212]

319 319 кислота 11,12-эпоксиэйкозатетраеновая кислота 8,9-эпоксиэйкозатетраеновая кислота + 1 [О] + 1 [О] АК 20:4 АК 20:4

8,9-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [О] АК 20:4

337

кислота + 2 [Н]

5,6-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [О] АК 20:4

337

кислота + 2 [Н]

337 11,12-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [О] АК 20:4 Не установлено

+ 2 [Н]

кислота

337 14,15-дигидрокси-эйкозатриеновая + 2 [О] АК 20:4

кислота + 2 [Н]

265 Транкированная 14,15-дигидрокси- + 2 [О] АК 20:4

эйкозатетраеновая кислота транкированная

293 Транкированная 4,10,16-тригидрокси-докозагексаеновая кислота + 3 [О] транкированная ДГК 22:6 Не установлено

Таблица 7. Найденные в составе кардиолипина мозга крысы после его обработки смесью цитохрома с и Н2О2

окисленные жирные кислоты и их биологические функции липидных медиаторов. ЛК- линолевая кислота, АК -арахидоновая кислота, ДГК - докозагексаеновая кислота.

Важно отметить тот факт, что для цитохрома c основным субстратом окисления в кардиолипине служит линолевая кислота, в результате окисления которой образуется огромное число различных молекулярных видов окисленной ЛК. Арахидоновая кислота окисляется только в определенных положениях: продуктов ее окисления в конце углеводородной цепи (в положениях 17-, 18-, 19- и 20-) не обнаружили, в то время как основные компоненты - арахидоновая и докозагексаеновая кислота - практически не подвергаются окислению, при том, что обе указанные кислоты - арахидоновая и докозагексаеновая - содержат большие, чем линолевая кислота, системы двойных связей и должны легче подвергаться окислению. Аналогичные закономерности будут показаны для двух частных случаев реализции механизма биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина под действием цитохрома c и далее кальций-независимого гидролиза фосфолипазами, рассмотренных в двух следующих главах.

Рис. 57. МС спектры исходного кардиолипина ^^ 1448) и продуктов его окисления смесью цитохрома c и H2O2 (количество присоединенных атомов кислорода указано стрелками).

Поскольку основным субстратом окисления была найдена линолевая кислота, с целью количественной оценки каждого из молекулярных видов продуктов ее окисления, аналогичный эксперимент был проведен для окисления тетралинолеоилкардиолипина вместо кардиолипина мозга крысы (МС спектр приведен на рис. 56, Б) под действием цитохрома c в присутствие пероксида водорода. МС спектры исходного кардиолипина (т^ 1448) и продуктов его окисления приведены на рис. 57.

Количественная оценка полученных продуктов окисления была также проведена масс-спектрометрически, с использованием соответствующих стандартов для каждого из индивидуальных молекулярных видов. Эти данные приведены в таблице 8.

ш/г [М-Н]- Количество присоединенных атомов кислорода % от суммарного количества продуктов окисления

1448 0 0,9±0,1

1462 1 2,2±0,1

1464 1 5,7±0,1

1478 2 4,8±0,2

1480 2 13,9±0,1

1494 3 6,2±0,2

1496 3 10,3±0,4

1510 4 7,2±0,3

1512 4 11,2±0,4

1523 5 5,5±0,1

1528 5 7,7±0,1

1542 6 5,8±0,7

1544 6 6,5±0,9

1558 7 3,1±0,6

1560 7 3,4±0,1

1574 8 2,1±0,5

1576 8 2,4±0,1

1590 9 0,6±0,1

1592 9 0,5±0,1

Таблица 8. Количественная оценка тетралинолеоилкардиолипина и продуктов его окисления после обработки смесью цитохрома с и Н2О2. Стандартные отклонения приведены для 3 измерений.

Полученные данные свидетельствуют о роли реакций пероксидации кардиолипина в биосинтезе липидные медиаторов апоптоза. Основным субстратом окисления в этих реакциях является линолевая кислота.

4.3.2. Пероксидация кардиолипина и других липидов в процессе апоптоза клеток мозга при церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца

Считается, что патогенез церебральной ишемии связан со снижением

энергопродукции и нарушением активного транспорта различных ионов через

141

мембраны с раскрытием Са2+-каналов. Избыточное внутриклеточное накопление ионов кальция и их переход в активную форму вызывает активацию внутриклеточных ферментов, фосфолипаз, что приводит к образованию липидных медиаторов из жирных кислот фосфолипидов, окисленных циклооксигеназой и липоксигеназой, и, в конечном счете, реализации механизмов смерти нейрона. В недавних исследованиях было выявлено, что липидные медиаторы могут быть также синтезированы кальций-независимой фосфолипазой из окисленного под действием цитохрома c кардиолипина. Вклад каждого из этих механизмов в гибель нейронов при церебральной ишемии-реперфузии не был оценен до сих пор.

В данной работе использовали следующую модель церебральной ишемии-реперфузии у крыс: после 9 минут асфиксии и исчезновения биоэлектрической активности сердца проводили сердечно-легочную реанимацию. Анализы участка мозга cortex у крыс после восстановления спонтанного кровообрапщения показали 10-кратную активацию каспаз 3/7. У выживших крыс наблюдались двигательные и когнитивные нарушения. В исследовании крыс разделили на 3 группы: (1) контрольная группа, (2) крысы, подвергнутые остановке сердца и реанимированные и (3) крысы, реанимированных после остановки сердца и получившие через сутки после восстановления спонтанного кровообращения селективный ингибитор окисления в митохондриях, искусственно синтезированный антиоксидант вещество XJB-5-131 [213]. При этом для крыс, получивших через сутки после восстановления спонтанного кровообращения XJB наблюдалось снижение активности каспаз 3/7 и ускоренное восстановление двигательных функций. Полный анализ липидного состава cortex у крыс был проведен методом хромато-масс-спектрометрии непосредственно автором данной диссертационной работы, поэтому далее эти результаты будут рассмотрены более детально.

На первом этапе был определен кортикальный липидный состав для всех трех исследуемых групп животных. Для этого липидный экстракт разделяли по классам фосфолипидов на нормально-фазовой силикагельной колонке и

определяли их суммарное содержание с использованием стандартных веществ для каждого фосфолипидного класса (таблица 3). Полученные данные выражали в единицах нмоль фосфолипидов/мг белка, результаты представлены в

таблице 9.

Фосфолипиды СоПех Контроль (здоровые крысы) Церебральная ишемия-реперфузия Церебральная ишемия-реперфузия // XJB-5-131

нмоль/мг белка ± станд.откл (п=4)

Фосфатидилхолин 229±12 237±36 236±33

Фосфатидилэтаноламин 73±8 78±7 74±10

Фосфатидилсерин 31±5 32±5 31±7

Фосфатидилинозитол 8±2 10±2 8±2

Фосфатидилглицерол 14±2 15±2 13±1

Кардиолипин 9±1 9±1 8±1

Таблица 9. Кортикальный фосфолипидный состав. Статичтически значимых различий для исследуемых групп не обнаружено.

Статистически значимых различий в фосфолипидном составе для исследуемых групп не было обнаружено. Было выдвинуто предположение, что изменения в липидном составе, связанные с окислением липидов во время церебральной ишемии-реперфузии, к моменту выделения липидного экстракта могли быть уже нивелированы внутренними системами клеток. Один из основных механизмов удаления окисленных фосфолипидов связан с действием фосфолипаз, ферментов, гидролизующих фосфолипиды с образованием лизо-фосфолипида и свободной ЖК. С целью проверить это предположение, был проведен ВЭЖХ-МС-анализ лизо-фосфолипидов по отдельным

фосфолипидным классам. В контрольных образцах были обнаружены лизо-фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилэтпноламин, лизо-фосфатидилинозитол и

монолизо-кардиолипин. Лизо-фосфатидилсерин и лизо-фосфатидилглицерол не

были найдены (рис. 58).

800

¡6 о

ISO IS I

* 600

52:3 54:' 56:9 58:10

v VD

54:6 56:$ 58:9 54:5 56: ~ 58:8 54:4 56:6

Д 400

16:0 18:0 18:1

&

c;

о

54:3 56:5

| 200

18:0 1S:1

0

ЕП

ЛФИ

ЛФЭ ЛФХ Монолизо-КЛ

Рис. 58. Лизо-фосфолипиды и их молекулярные виды, обнаруженные в участке cortex крыс контрольной группы: ЛФИ - лизофосфатидилинозитол, ЛФЭ -лизофосфатидилэтаноламин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, монолизо-КЛ -монолизокардиолипин. Погрешности представляют собой стандартные отклонения для n=4.

В образцах кортекса крыс, подвергнутых остановке сердца, уровень всех обнаруженных продуктов гидролиза повысился, однако только для монолизо-кардиолипина эти изменения были статистически достоверными. Для крыс, получивших XJB, уровни лизо-фосфолипидов упали вновь до контрольного значения или ниже, причем эти изменения были найдены статистически достоверными для всех лизо-фосфолипидов, кроме фосфатидилэтаноламина. Полученные данные для каждого из обнаруженных лизо-фосфолипидов приведены на рис. 59.

о

я

£ 150

2 200

| 100

2

с 0

ЛФХ

ЛФИ ЛФЭ Монолизо-КЛ

Рис. 59. ВЭЖХ-МС анализ кортикальных лизо-фосфолипидов по классам. ЛФИ -лизофосфатидилинозитол, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ЛФХ -лизофосфатидилхолин, монолизо-КЛ - монолизокардиолипин. Стандартные отклонения даны для п=4. (*) - значения для лизо-фосфолипидов, статистически (р>0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, (#) - значения для лизо-фосфолипидов, статистически (р>0,99) отличающихся от найденных для ишемия-реперфузионных крыс.

При гидролизе фосфолипидов в клетке окисленные ЖК высвобождаются из всех фосфолипидных классов, так что, в конечном счете, определить, из каких фосфолипидов были гидролизованы те или иные ЖК, невозможно. Тем не менее, можно оценить суммарное содержание свободных ЖК в образце. Для этого фракция ЖК была выделена методом 2D-тонкослойной хроматографии (прочие фракции фосфолипидов также были сохранены для дальнейших анализов) и разделена по индивидуальным окисленным и неокисленным видам на обращенно-фазовой хроматографической колонке с последующим МС определением. Для неокисленных ЖК не было найдено статистически значимых различий для трех исследуемых групп, однако содержание окисленных жирных кислот оказалось различным (рис. 60, А). Были обнаружены продукты окисления линолевой кислоты: гидрокси-, эпокси- и гидроперокси-производные. Более того, найденные изменения суммарного содержания окисленных ЖК и лизо-фосфолипидов, практически совпадают (А на рис. 60, Б).

Рис. 60. А. ВЭЖХ-МС анализ свободных окисленных ЖК: гидрокси-, эпокси- и гидроперокси-производных ЛК. Б. Сопоставление уровня суммарных свободных продуктов окисления линолевой кислоты (ЛКокисл) и суммарного содержания лизо-фосфолипидов (лизо-ФЛ). Стандартные отклонения даны для п=4. (*) -значения, статистически (р>0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, (#) - значения, статистически (р>0,99) отличающиеся от найденных для ишемия-реперфузионных крыс.

При проведении МС анализа липидов, важно иметь в виду, что для биологических тканей во время апоптоза характерно окисление липидов на уровне всего 0.1 % и менее - даже такой уровень окисления приводит к драматическим изменениям в метаболизме клетки. К тому же, что эта незначительная доля продуктов окисления липидов рассредоточена между различными классами фосфолипидов, таким образом, что определяемые содержания лежат в диапазоне 0.01 % от общего числа липидов и менее, что приводит к необходимости обнаружения следовых количеств окисленных липидов на фоне спектра неокисленных липидов и представляет собой сложную задачу.

Молекулярные виды неокисленных липидов насчитывают более 1000 соединений. При этом в их состав входят одни и те же жирнокислотные остатки, насчитывающие не более 30 неокисленных молекулярных видов, и, разумеется, определение их и продуктов их окисления представляет собой более простую задачу. В данной работе был предложен подход к выделению жирнокислотных остатков из фосфолипидов путем их количественной обработки фосфолипазами

с последующей твердофазной экстракцией гидролизованных жирных кислот. Принцип этого подхода схематично показан на рис. 61.

I. Обработка липидного экстракта фосфолилазами

II. Твердофазная экстракция жирных кислот

Р1А1 -

I

Р1Аг

+ Лизо-ФС-\г^\_5П2 Лизо-ФС <

Р1А

Картридж для I твердофазной Экстракции ЖК

ЖК

III. ВЭЖХ-МС анализ жирных кислот, гидролизованных их фосфолипидов

Рис. 61. Схема выделения жирнокислотных остатков из фосфолипидов путем (I) их обработки фосфолипазами с (II) последующей твердофазной экстракцией гидролизованных жирных кислот для (III) ВЭЖХ-МС анализа. ФЛ -фосфолипид, лизо-ФЛ - лизо-фосфолипид, ЖК - жирная кислота, PLA -фосфолипаза. Пояснения в тексте.

Экстракт липидов переводится в водную среду, где фосфолипиды самоорганизуются с образованием липосом, после чего их обрабатывают либо смесью фосфолипаз А1 и А2, гидролизующих жирные кислоты из sn1 и sn2-положения, соответственно. Полученные таким образом жирные кислоты отделяют от оставшихся в результате гидролиза полярных головок фосфолипидов, негидролизованных или частично гидролизованных липидов, а также фосфолипаз методом обращенно-фазовой твердофазной экстракции. Спектр свободных жирных кислот (тех, которые не входили в состав фосфолипидов в образце) вычитается впоследствии из соответствующего спектра гидролизованных ЖК.

В результате обработки липидного экстракта смесью фосфолипаз А1 и А2 и ВЭЖХ-МС анализа окисленных ЖК, были обнаружены моноокси-продукты окисления линолевой кислоты (кето-, гидрокси- и эпокси-производные) и диокси-соединения (кето-гидрокси или эпокси-гидрокси-производные - точная химическая структура не была установлена, а также дигидрокси-производные ЛК). Продукты окисления других полиненасыщенных ЖК не были найдены.

147

Повышение уровня окисления фосфолипидов для каждого из молекулярных видов окисленных ЖК (рис. 62, А) и для их суммарного содержания (рис. 62, Б) за вычетом свободных окисленных ЖК (представленных на рис. 60) свидетельствует о роли пероксидации липидов в патогенезе церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца. Митохондриальный антиоксидант XJB-5-131 показал эффективность ингибирования окисления липидов.

Рис. 62. ВЭЖХ-МС анализ негидролизованных окисленных ЖК (в составе фосфолипидов): (А) кето-, гидрокси-, эпокси-, кето-гидрокси (или эпокси-гидрокси)-и дигидрокси-производных ЛК и (Б) суммарное содержание вышеперечисленных продуктов окисления линолевой кислоты (ЛКокисл). Стандартные отклонения даны для п=4. (*) - значения, статистически (р>0,99) отличающихся от найденных для контрольных крыс, (#) - значения, статистически (р>0,99) отличающиеся от найденных для ишемия-реперфузионных крыс.

Наконец, более детальный анализ выделенной ранее фракции кардиолипина позволил обнаружить его окисленные молекулярные виды, они были найдены только в образцах мозга крыс после остановки сердца (рис. 63).

Рис. 63. ВЭЖХ-МС анализ окисленного кортикального кардиолипина. А. Хроматографический пик окисленного кардиолипина был обнаружен только в образцах мозга крыс после ишемии-реперфузии. Б. МС2 спектры окисленного кардиолипина с [M-H] 1464 и 1480, полученные для хроматографического пика слева. Пики с m/z 293, 295, 309 и 311 (отмеченные красным) соответствуют окисленной линолевой кислоте в составе кардиолипина, m/z 255, 279 и 303 (синим) - неокисленные ЖК. m/z 153 характерен для фосфолипидов (фосфатно-глицериновый остаток).

Пероксидация всех основных классов фосфолипидов в патогенезе церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца была обнаружена. Тем не менее, наиболее значимые изменения произошли с кардиолипином, подвергнутому окислению и последующему гидролизу в большей степени по сравнению с остальными фосфолипидами. К тому же, лечение селективного митохондриального ингибитора окисления, XJB, оказалось эффективным. Полученные данные служат индикатором того, что при реперфузионном окислении фосфолипидов митохондриальный путь окисления кардиолипина под действием цитохрома с, по-видимому, преобладает над путем окисления фосфолипидов клеточной мембраны под действием цитозольных ферментов -циклооксигеназы, липоксигеназы, цитохрома P450 и других пероксидаз [214].

Была показана роль кальций-независимого пути биосинтеза липидных медиаторов из кардиолипина, окисленного под действием цитохрома c, и эффективность применения селективного ингибитора пероксидации

кардиолипина, вещества XJB, для лечения церебральной ишемии-реперфузии после остановки сердца.

4.3.3. Пероксидация липидов в процессе апоптоза клеток мозга substantia nigra при болезни Паркинсона

Болезнь Паркинсона - медленно прогрессирующее хроническое нейродегенеративное заболевание, вызванное разрушением и гибелью нейронов, вырабатывающих нейромедиатор дофамин в черной субстанции мозга -substantia nigra [215]. Одной из основных причин, приводящих к развитию паркинсонизма, считают нарушение работы митохондрий, митохондриальный стресс, тесно связанный с усилением процесса апоптоза, а основными поражающими факторами - снижение активности комплекса I [216], понижение уровня глутатиона [217], модификации белка [218], повреждения ДНК [219] и, наконец, окисление липидов [220]. Основным продуктом окисления липидов при болезни Паркинсона был найден 4-гидрокси-2-ноненаль, транкированная жирная кислота, однако ее источники, липиды, продуктом окисления которых является ноненаль [221] [222], до сих пор не были установлены. Между тем, определение мишеней окисления представляет собой важный шаг как для понимания механизмов апоптоза и пероксидации липидов, так и для возможной защиты липидов от окисления в медицинских целях для лечения паркинсонизма. Современные методы исследования, в первую очередь, масс-спектрометрия липидов, позволили идентифицировать эти липиды-мишени. Данная работа была проведена в Питтсбургском университете (США) на ротенон-индуцированной модели болезни Паркинсона, модель и общая схема эксперимента описаны в разделе атериалы и методы (рис. 21). Вклад автора данной диссертационной работы заключался в получении и интерпретации данных хромато-масс-спектрометрического анализа. Основные результаты будут рассмотрены ниже.

С целью оценить общий жирнокислотный состав фосфолипидов и

определить, какие из них потенциально могут быть мишенями для окисления,

был применен подход, аналогичный описанному в предыдущем разделе (рис. 61)

150

и заключающийся в обработке липидного экстракта фосфолипазами с последующей твердофазной экстракцией гидролизованных ЖК. В отличие от предыдущего исследования, липидный экстакт обрабатывали отдельно фосфолипазами А1 и А2. Найденный жирнокислотный состав фосфолипидов отдельно для sn1 и sn2-положений представлен на диаграммах ниже (рис. 64). Содержание свободных жирных кислот, найденное в образцах (те же молекулярные виды, что и для sn1 и sn2-положений были обнаружены), вычиталось. Из трех представленных групп ЖК, только полиненасыщенные ЖК могут служить субстратом окисления. Доминирующими видами ПНЖК в обоих положениях были найдены докозагексаеновая кислота, содержащая систему 6 двойных связей (22:6) и арахидоновая кислота (20:4), содержащая систему 4 двойных связей.

Рис. 64. Жирнокислотный состав фосфолипидов в (А) sn1 и (Б) sn2-положениях для substantia nigra крыс. ЖК разделены на три группы: насыщенные (14:0, 16:0, 18:0, 20:0 и 22:0), мононенасыщенные (16:1, 18:1 и 20:1) и полиненасыщенные жирные кислоты (молекулярные виды указаны на рис.).

Ввиду большей доли докозагексаеновой и арахидоновой кислот среди обнаруженных ПНЖК, а также наличию в них длинной системы двойных связей, предполагалось обнаружить большее количество продуктов их окисления по сравнению с прочими жирными кислотами. Анализ окисленных ЖК, напротив, не выявил ни одного продукта их окисления, и единственным субстратом, подвергнутым окислению была линолевая кислота. Были обнаружены моноокси-(гидрокси- и эпокси-) производные ЛК. Их содержание статистически достоверно увеличилось на 5 и на последний день (10-14, в зависимости от индивидуальной

реакции крысы) введения ротенона (рис. 65). Участок мозга cortex использовали в качестве контроля, там повышения уровня окисления не было обнаружено.

о . Эпопеи-производные ЛК оQ Гидрокси-производные ЛК

1день 5 день последний с 1день S день последний

де«ь День

Рис. 65. Количество эпокси- и гидрокси-соединений, найденных в substantia nigra здоровых крыс (белые столбики) иротенон-обработанных крыс (черным) на 1, 5 или последний (10-14) день введения ротенона (ротенон вводили до начала развития у крыс физиологических признаков паркинсонизма). Звездочками отмечены статистически отличные от соответствующего контрольного значения (p>0.99, n=5). Погрешности - стандартные отклонения.

Дальнейший анализ липидов был проведен другими авторами опубликованной по теме этого исследования статьи [183] и выявил, что основной мишенью окисления и источником окисленной линолевой кислоты служил кардиолипин.

4.3.4. Деградационная стадия апоптоза. Роль пероксидации липидов в формировании фагоцитарных сигналов «съешь меня»

Для изучения роли пероксидации и окисления фосфатидилсерина при внутреннем и внешнем путях развития апоптотоза проводили хромато-масс-спектрометрический анализ липидных экстрактов из контрольных и апоптотических клеток линий HL60 и Jurkat. Следует подчеркнуть, что все эксперименты по работе с клетками были проведены сотрудниками лаборатории В.Е. Кагана. Сам автор данной работы проводил экстракцию и последующий хромато-масс-спектрометрический анализ липидов, поэтому в данном разделе будут, в основном, приведены результаты масс-спектрометрического исследования, в то время как данные, полученные в клеточных экспериментах

будут описаны только в случаях, когда их обсуждение необходимо для понимания картины в целом.

Клетки линии HL60 подобны нейтрофилам [223] и отличаются низким содержанием окисляемых видов фосфатидилсерина (тех видов, которые содержат линолевую кислоту). Это затрудняет их прямое использование для изучения роли окисления ФС для фагоцитоза. С целью повышения содержания таких окисляемых молекулярных видов, в культивационную среду клеток была добавлена линолевая кислота. Результаты интегрирования линолевой кислоты в фосфолипиды клеток были оценены методом ВЭЖХ-МС с разделением фосфолипидов по классам на нормально-фазовой колонке (рис. 66, А, Б).

А.

s см

5 лу .

| 100 г

X

5 t

£ *

Z X

3 S i

О. --)-лЛ-щ t f

I 0 10 20 30 40 50

и Время, мин.

k' _ HL60,обогащенные

■ Контрольные HL60 ■ .

линолевои кислою«

500 „.........................................

£ ir то г

I <00 ' I JL _L.

1 1 Я 80 Г

В 300 II. . ч «ч «о,

§ 1 1 260 W М М 00

i 200 I ЯШ 5 с С СС

О И Ш §40 н 9 -J «

ä ■■ ^И Т 5 00 00 00 00

: ь_JML-*mIüu2: гРп Д I

<ь4 л4 л4 А* л> л0 Naive-HL60 LA-HL60

rf4 ^ <1> s4 # # оГ »ф* t^b" ^b i^b »^b к

Молекулярные виды, sn7sn:

N»-

Рис. 66. ВЭЖХ-МС анализ липидного состава клеток HL60, контрольных и обогащенных линолевой кислотой. A. Нормально-фазовая хроматограмма разделения фосфолипидов по классам. Б. Распределение фосфатидилсерина в контрольных и обогащенных ЛК HL60 клетках по молекулярным видам и перераспределение одного из основных молекулярных видов с m/z 786,5 (пояснение в тексте). В. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в HL60 клетках. Г. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в HL60 клетках, обогащенных ЛК. Стандартные отклонения даны для n=3. (*) - значения для LA-HL60, статистически (p>0,99) отличающиеся от найденных для контрольных HL60 клеток.

В обычных HL60 клетках, без добавления линолевой кислоты, основным молекулярным видом фосфатидилсерина является вид Q8:0/C18:1 (snVsn2), соответствующий на масс-спектре пику с m/z 788,5. Второй по интенсивности пик с m/z 786,5, согласно данным MS2-спектра соответствует молекулярным видам С 18:1 /С 18:1 и ^8:0^18:2, причем обнаружено лишь следовое количество линолеат-содержащего вида ^8:0/^8:2 по сравнению с доминирующим ^8:1/^8:1 (рис. 67). После обогащения клеток линолевой кислотой общее содержание фосфатидилсерина (как и других фосфолипидов) не изменилось, однако произошло перераспределение молекулярных видов в сторону линолеат-содержащих молекул. С^ю^^^-ФС стал основным молекулярным видом фосфатидилсерина (рис. 66, Б и 67), при этом количество неокисляемых С16:0^18:1 и С^Ю^^^-ФС уменьшилось.

Рис. 67. А. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в НL60 клетках. Б. МС1 и МС2 спектры для m/z 786,5 в НL60 клетках, обогащенных ЛК.

ЛК-обогащенные клетки использовали далее для изучения влияния окисленного ФС на фагоцитарный ответ макрофагов при апоптозе. Обычные HL60 клетки при этом выступали в качестве контроля. Важно отметить, что для клеток HL60 характерно наличие окисляемых ЖК в sn2-положении. Эта особенность строения использовалась нами в дальнейших экспериментах с обработкой клеток различными фосфолипазами.

Н2О2 представляет собой классический инструмент для инициации апоптоза в ИЬ60 клетках [224] [225]. На рис. 68, А показано увеличение уровня фагоцарного захвата апоптических ИЬ60 клеток RAW264.7 макрофагами после обработки их пероксидом водорода. При этом для LA-HL60 клеток наблюдалось

значительно большее (в 7.2 раз по фагоцитарному индексу) увеличение уровня фагоцитоза (рис 68, А). О том, что более эффективный фагоцитоз апоптотических LA-HL60 по сравнению с обычными HL60 клетками достигается не за счет увеличения экстернализации ФС, свидетельствуют аналогичные уровни ФИТС-аннексин-связывания в обоих типах клеток (данные не показаны).

Рис. 68. Н2О2-индуцированный апоптоз в HL60 клетках. А. Фагоцитарные индексы, посчитанные для контрольных (naïve) и обогащенных ЛК (LA-HL60) клеток без и после обработки Н2О2. Соответствующие изображения макрофагов (красным) и захвачекнных ими клеток (зеленым) представлены на врезке. Б. Количество основных окисляемых молекулярных видов ФС в LA-HL60 и в LA-HL60, обработанных Н2О2. Стандартные отклонения даны для n=3.

МС анализ фосфолипидов клеток, разделенных по классам на нормально-фазоговой ВЭЖХ колонке, показал существенное уменьшение содержания окисляемого ФС (рис 68, Б) и примерно четырехкратное увеличение количества окисленного ФС (суммарное количество ФСокисл. В ШО2-обработанных LA-HL60 клетках составило 130 ±9 пмоль/106 клеток). Доминирующими продуктами окисления при этом были молекулярные виды, содержащие два атома кислорода (гидроперокси-, дигидрокси- и гидокси-эпокси) в линолеате ацильной цепи ^ю^^-ФС (рис 69). Чтобы убедиться, что наблюдаемый эффект усиления фагоцитоза окисленным фосфатидилсерином не является специфическим для конкретной линии макрофагов, использовали макрофаги ТНР-1, стимулированные ФМА. В этом случае также обнаружили, что апоптотические

LA-HL60 клетки являются гораздо более привлекательными мишенями для фагоцитоза ТНР-1 макрофагами по сравнению с обычными HL60 клетками (данные не показаны).

т/г 786,5 MC2

200 400

| | | г

600 800 200 400 600 800

m/z

; т/г 802,5 МО т/г + О [1 б/

т/г 818,5 MC2

200 400 600 800

m/z

+ 00/327

Рис. 69. МС2 спектры для m/z 786,5 802, 5 и 818, 5, соответствующих молекулярному виду ФС С18:0/18:2, Сl8:0/18:2+[O] и Сl8:0/18:2+[2O].

С целью оценить распределение образованного под действием Н2О2 окисленный фосфатидилсерина между внутренней и внешней поверхностями плазматической мембраны, был проведен дополнительный ВЭЖХ-ИЭР-МС анализ апоптотических LA-HL60 клеток с использованием двух независимых подходов: (1) обработка клеток фосфолипазой А1 в присутствии БСА, очищенного от жирных кислот, и анализ образованных при этом окисленных sn2-ацил-лизо-фосфатидилсеринов и (2) обработка липопротеиновой Lp-PLA2, фосфолипазой, обладающей высокой селективностью по отношению к окисленным липидам (по отношению к неокисленным) [226] с последующим анализом накопленных sn1-ацил-лизофосфолипидов. Оба подхода схематично представлены на рис. 70. Идеологически, эксперимент напоминает представленный ранее на рис. 61, однако, если в предыдущих случаях фосфолипазами обрабатывали липидные экстракты, в настоящем исследовании обработке фосфолипазами подвергали сами клетки.

# г-

в. :

9

к

Рис. 70. Схема определения фосфатидилсеринов, экстернализованных на поверхность клетки в процессе апоптоза. А. Экстернализация ФС и ФСокисл на внешнюю сторону клеточной мембраны в результате апоптоза. Б. Обработка клетки фосфолипазой А1 приводит к гидролизу ФС с образованием лизо-ФС и окисленного лизо-ФС. Количество окисленного лизо-ФС эквивалентно количеству окисленного по sn2-положению ФС. В. Обработка клетки липопротеиновой фосфолипазой А2 приводит к гидролизу окисленного ФС с образованием лизо-ФС и окисленных свободных жирных кислот. Количество лизо-ФС эквивалентно количеству окисленного по sn2-положению ФС. Количество окисленных ЖК заведомо больше количества окисленного ФС, поскольку под действием Lp-PLA2 происходит гидролиз не только ФСокисл, но и других окисленных фосфолипидов.

Количество экстернализованных на поверхность молекул окисленных ФС (эквивалентное количеству окисленных sn2-ацил-лизо-ФС производных) было таким образом оценено с использованием первого подхода и составило 24±8 пмоль/106 клеток. Общее количество sn2-ацил-лизо-ФС производных (окисленных и неокисленных), гидролизованных PLAl, а значит, и суммарное количество экстернализованного фосфатидилсерина, составило 173 пмоль/106 клеток. Исходя из этих данных, было подсчитано, что доля окисленного фосфатидилсерина составляет ~ 14±4 мольных % от общего количества экстернализованного на клеточную поверхность фосфатидилсерина, или ~ 19 мольных % от общего окисленного ФС клеток.

ВЭЖХ-МС анализ фосфолипидов клеток, обработанных Lp-PLA2, показал накопление sn1-ацил-лизо-ФС. Обнаруженное количество sn1-ацил-лизо-ФС

после обработки Lp-PLA2 составило 13±2 пмоль/106 клеток, или 8 мольных % от общего количества клеточного ФС. В силу специфичности Lp-PLA2 к окисленному ФС, это эквивалентно количеству окисленного ФС, экстернализованного на поверхность. Полученные данные хорошо согласуются с результатами экспериментов с PLAt-обработанными клетками, описанными выше. Одновременно с лизофосфолипидами были также обнаружены различные виды гидролизованной окисленной линолевой кислоты: с одним атомом кислорода (оксо- и гидрокси-), двумя (гидроперокси-, дигидрокси- и гидрокси-эпокси-) или тремя (оксо- гидроперокси-) - виды с m/z 293, 295, 311 и 325, соответственно. Полученные хроматографические пики и соответствующие им МС2 спектры для этих окисленных жирных кислот представлены на рис. 71. Обработка клеток Lp-PLA2 привела к существенному увеличению содержания этих окисленных кислот, в то время как изменений в содержании неокисленные свободных жирных кислот при этом не наблюдалось.

Рис. 71. ВЭЖХ-МС анализ окисленных свободных жирных кислот. Хроматографические пики,соответствующие им МС2 спектры и предполагаемые на основании этих данных структурные формулы для m/z 295, 311 и 325.

Для получения более полного представления о взаимосвязи между обогащением фосфатидилсерина окисляемой линолевой кислотой, апоптозом и фагоцитарным ответом, использовали два индуктора гибели клеток, не являющихся окислителями - стауроспорин (СТС) и FAS антитела - для запуска апоптоза по внутреннему и внешнему механизму воздействия соответственно. С помощью одного из этих индукторов в Jurkat клетках был вызван апоптоз, после чего проведен ВЭЖХ-МС анализ и оценка фагоцитоза. Результаты, полученные для СТС-индуцированного пути, согласуются с данными для Н2О2-индуцированного пути апоптоза в HL60 клетках. Напротив, активация FAS-пути апоптоза в Jurkat клетках не привела к значительному увеличению содержания окисленных ФС, несмотря на обогащение этих клеток линолевой кислотой (данные не показаны, [183]).

Полученные данные говорят о том, что накопление окисленного фосфатидилсерина в апоптотических клетках приводит к усилению фагоцитоза. Липиды клеток, обогащенных линолевой кислотой, способны подвергаться окислению в процессе апотоза, в результате чего на их поверхности накапливается ФСокисл. Было показано, что фагоцитарный индекс для таких клеток на порядок больше по сравнению с контрольными (необогащенными ЛК) клетками. При этом, согласно результатам проведенного ВЭЖХ-МС анализа липидов, среди экстернализованного на поверхность клеток в процессе апоптоза фосфатидилсерина, окисленный ФСокисл представляет лишь незначительную долю от общего количества экстернализованного ФС. Таким образом, про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно на два порядка величины выше, чем для неокисленного ФС.

5. Заключение

На сегодняшний день исследования в области апоптоза представляют собой актуальное направление развития науки. Несмотря на большой объем знаний, накопленных за последние 40 лет, в этой области до сих пор многие вопросы остаются открытыми.

В данной работе была предпринята попытка глубже понять механизмы и биологичесое значение важного звена в развитии апоптоза - пероксидации липидов мембран под действием цитохрома с и его комплекса с анионными липидами.

Несмотря на то, что в литературе предложено и описано большое число реакций, приводящих к пероксидации липидов мембран, единой концепции на настоящий момент не существут. Литературные данные зачастую разнятся или противоречат друг другу. Особенностью данной диссертационной работы является то, что для изучения реакций пероксидации был применен метод активированной хемилюминесценции, позволяющий регистрировать кинетику образования липидных радикалов. В результате проведенного исследования было установлено, что в основе процесса пероксидации липидов лежат две химических реакции: разложение гидропероксидов липидов и липопероксидация под действием пероксида водорода.

Важным аспектом исследования представляется то, что реакции пероксидации липидов были изучены в различных средах. Отдельно стоит отметить, что комплекс цитохрома с с кардиолипином удалось получить в виде раствора в неполярном органическом растворителе. Это может дать начало новому подходу в исследовании структуры и функций комплекса цитохрома с с анионными липидами.

Изучение роли процесса пероксидации в апоптозе также позволило

сделать ряд важных наблюдений и выводов. Основным из них стоит считать

участие реакций пероксидации кардиолипина митохондриальных мембран под

действием цитохрома с в биосинтезе окисленных жирных кислот, способных

160

исполнять роль липидных медиаторов воспаления. Удалось также показать, что такой путь биосинтеза реализуется при развитии церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией, и при паркинсонизме. Другим важным результатом исследования стоит назвать установление роли пероксидации фосфатидилсерина цитоплазматических мембран: было показано, что окисленный фосфатидилсерин представляет собой гораздо более эффективный сигнал «съешь меня» для фагоцитов по сравнению с неокисленным.

Таким образом, данная диссертационная работа раскрывает механизм пероксидации липидов мембран под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами и уточняет роль этого процесса в апоптозе.

6. Выводы

1. Методом активированной хемилюминесценции было показано, что пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами реализуется в результате протекания двух реакций: реакции разложения гидропероксидов липидов и липопероксидации под действием пероксида водорода. Предложены воможные схемы этих двух реакций.

2. Впервые был получен комплекс цитохрома c с кардиолипином в виде раствора в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе было найдено равным 77±11.

3. Методом хроматографического разделения липидов и их масс-спектрометрического определения было показано, что реакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Са2+-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления.

4. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией; показана эффективность применения селективного ингибитора пероксидации кардиолипина, вещества XJB.

5. Методом ВЭЖХ-МС было показано, что реакции пероксидации кардиолипина, катализируемые комплексом Цит-КЛ, приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, исполняющих роль липидных медиаторов воспаления, при болезни Паркинсона.

6. Установлено, что про-фагоцитарная активность окисленного