Индукция апоптоза в анеуплоидных клетках тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Александрова, Екатерина Анатольевна

• Александрова, Екатерина Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Александрова, Екатерина Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Апоптоз

Понятие апоптоза

Функции апоптоза

Модели изучения апоптоза

Морфология, биохимия и генетика апоптоза

Индукция апоптоза

Внутриклеточное развитие программы апоптоза Завершение апоптоза Защита от ПКС Некроз и апоптоз Циклогексимид Анеуплоидия

Получение анеуплоидных клеток Многополюсные митозы и анеуплоидные клетки Распространенность в природе Анеуплоидия и апоптоз МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток Индукция апоптоза Выявление апоптотических клеток Получение патологических митозов Электронная микроскопия Иммунофлуоресцентные исследования Постановка экспериментов Статистика

РЕЗУЛЬТАТЫ

ЦГИ индуцирует апоптоз и блокирует пролиферацию

FAF28 СПЭВ

Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ

FAF28 СПЭВ

Ультраструктура апоптотических клеток FAF28 СПЭВ

Изменения митохондрий в культуре СПЭВ Действие колцемида

Накопление К-митозов FAF28 СПЭВ

Получение многополюсных митозов FAF28 СПЭВ

Прижизненные наблюдения за клетками, возникшими путем многополюсного митоза Контроль 1 Контроль 2 Опыт ОБСУЖДЕНИЕ

ЦГИ индуцирует апоптоз и блокирует пролиферацию Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ Ультраструктура апоптотических клеток СПЭВ FAF

Действие колцемида

Накопление К-митозов

Получение многополюсных митозов 65 Прижизненные наблюдения за клетками, возникшими путем многополюсного митоза

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукция апоптоза в анеуплоидных клетках»

В ходе эволюции у клеток многоклеточных организмов возникли механизмы самоуничтожения - программированной клеточной смерти (ПКС) (Hale et al., 1996; Jacobson et al., 1997). Эти механизмы координируются на генетическом уровне и контролируются как внешними, так и внутренними факторами. Одним из видов ПКС является апоптоз. Апоптоз сопровождает организм в течение всей его жизни, наряду с пролиферацией и дифференцировкой. Исследования апоптоза имеют важное прикладное значение. Они могут помочь в разработке методов лечения опухолевых, аутоиммунных, дистрофических, нейродегенеративных заболеваний.

Любые нарушения в процессе апоптоза, его избыток или недостаток приводят к возникновению различных заболеваний (Thompson et al., 1995). В частности, сбой программы апоптоза в генетически дефектных клетках становится причиной развития злокачественных опухолей (Wright, McMaster, 2002). Многие способы лечения опухолей направлены на то, чтобы запустить в раковых клетках сбившуюся программу самоуничтожения (Kim et al., 2002). Однако эффективность такого лечения оказывается неодинаковой для различных видов рака. И очень часто повышенной устойчивостью к противоопухолевым агентам обладают вторичные опухоли, развивающиеся после лечения первичных новообразований.

Мы высказываем предположение, что такая устойчивость вторичных опухолей к ранее действенным препаратам может быть связана с изменившейся структурой генома их клеток. Известно, что клетки опухолевой ткани активно пролиферируют. А поскольку контроль над целостностью генома в этих клетках нарушен, то делящиеся клетки нередко демонстрируют аномалии митоза, количество которых прогрессирует со временем (Алов, 1972; Онищенко, 1993). В результате подобных патологических митозов могутвозникнуть клетки с таким хромосомным составом, что они оказываются неспособными вступить в апоптоз (например, в силу утраты каких-то генов, ответственных за развитие программы гибели). Поэтому, в то время как основная масса клеток первичной опухоли успешно элиминируется в ходе химиотерапии, данные клетки, устойчивые к индукции апоптоза, выживают. Клон такой клетки впоследствии дает новую опухоль, мало чувствительную к ранее действенным препаратам.

Целью данной работы было проверить, возможно ли действительно в ходе аномального митоза получить клетку, устойчивую к индукции апоптоза.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫАПОПТОЗПонятие апоптозаГибель клеток во время эмбриогенеза, метаморфоза, эндокрин-зависимой атрофии тканей и при удалении стареющих клеток называется программированной клеточной гибелью (ПКС) или апоптозом. Слово "апоптоз" пришло из греческого языка, где обозначало процесс опадания листьев с деревьев или лепестков с цветов (аро — отделение от, ptosis — падение с) (Kerr et al., 1972; Martin et al., 1994). В биологии апоптозом первоначально называли клеточную гибель, происходящую при развитии животного в строго определенном месте в строго определенное время, подчеркивая запрограммированность смерти. Но хотя многие авторы использовали термины "апоптоз" и "ПКС" как взаимозаменяемые понятия, в последнее время многие исследователи различают их. Например, Martin с соавторами (1994) считают, что апоптоз — описательный термин, введенный Керром с коллегами для описания клеточной смерти с определенным набором морфологических признаков. И апоптоз может быть лишь одним из видовПКС. В дополнение к этому, в настоящее время уже выделяют такие варианты ПКС, как аутофагическая гибель (Bursch et al., 2000) и параптоз (Sperandio et al, 2000), отличающиеся от классической картины апоптоза не только биохимически, но отчасти и морфологическими признаками.

Функции апоптозаАпоптоз выполняет несколько важных функций в онтогенезе многоклеточных организмов. Jacobson с соавторами (1997) пишут о пяти таких функциях:•формообразование частей тела (например, формирование конечности у большинства высших позвоночных, когда клетки эмбриона, расположенные между зачатками пальцев, отмирают путем апоптоза; или образование полостей тела; или ксилогенез и флоэмогенез у растений)•ликвидация ненужных органов в эмбриогенезе (структуры, которые были нужны предкам, но не нужны потомкам; структуры, нужные для одного пола и не нужные для другого; структуры, необходимые только на определенных стадиях онтогенеза)•контроль численности клеток (нервная система позвоночных изначально имеет почти двукратный избыток клеток, а затем остаются только нейроны, соответствующие иннервируемым клеткам-мишеням)(8ЬаЬат, Horvitz, 1996; Ashkenazi, Dixit, 1998)•устранение дефектных клеток (элиминируются клетки атипичные, нефункционирующие, находящиеся не на месте, потенциально опасные, например, клетки с сильно поврежденной ДНК (Ziegler et al., 1994) или Т-клетки, распознающие антигены тканей собственного организма (Галактионов, 1998))•особый путь дифференцировки клеток (эпителий хрусталика, кератиноциты кожи, дифференцируясь, проявляют признаки апоптоза (Maruoka et al., 1997),)Помимо перечисленных случаев, есть и такие варианты клеточной смерти, функции которых не известны.

Очевидно, что подавление ПКС может привести к нарушениям эмбриогенеза, к развитию рака и устойчивости опухолевых клеток к цитотоксической терапии (Kerr et al., 1994; Reed, 1999), развитию болезней иммунной системы (Williams, 1991). В то же время, избыточная ПКС вызывает не менее катастрофические последствия — болезни Альцгеймера и Паркинсона, склероз, СПИД, ишемию (Thompson, 1995).

Модели изучения апоптозаПуть развития апоптоза эволюционно довольно консервативен и, хотя у разных групп организмов могут быть некоторые особенности, в целом для изучения базовых элементов апоптоза возможно использование разных моделей.

Одним из первых объектов, на которых исследовались генетика и биохимия апоптоза, была нематода Caenorhabditis elegans. Это очень удачная модель, так как эмбриональное развитие этого червя точно картировано. Известно, что у взрослого гермафродита формируется 1090 клеток, и из них 131 клетка подвергается апоптозу (Ellis et al., 1991 a; Sulston et al., 1983). При этом точно известно, когда в эмбриогенезе происходит апоптоз и какие клетки на какой стадии развития животного гибнут. Это имеет большое значение, так как ПКС у С.elegans происходит очень быстро (в течение часа) (Ellis, Horvitz, 1986; Ellis et al., 1991 b), и, не зная места и времени ПКС, ее трудно изучать (по крайней мере, на ранних стадиях, до появления явных морфологических признаков). C.elegans и сейчас остается активно изучаемым объектом, хотяидеальной данную модель тоже нельзя назвать, так как, например, у C.elegans в процессе апоптоза не участвуют некоторые белки, вовлеченные в апоптоз у других организмов. И наоборот — для некоторых генов апоптоза C.elegans еще не найдено гомологов ни у кого другого. Тем не менее, полагают, что такие гомологи существуют, но пока не обнаружены, так как нет еще полного картирования генов-регуляторов ПКС у млекопитающих.

Помимо Caenorhabditis elegans, существуют и другие модели для изучения ПКС. Например, очень привлекательным объектом для исследования этого процесса считается плодовая мушка дрозофила (Rowan, Fisher, 1997). Отличительной особенностью апоптоза дрозофилы является наличие белка Reaper (White et al., 1994), эквивалента которому больше не найдено ни у одного организма. У позвоночных более или менее подробно ПКС изучается на нейронах (85% нейронов при эмбриональном развитии подвергается апоптозу), на тимоцитах (при созревании в тимусе около 95% тимоцитов гибнут) (Golstein, 1991), на клетках предстательной железы (после кастрации крысы 85% клеток простаты гибнут в течение двух недель) (Ellis et al., 1991 b).

В последние годы большой популярностью в исследовании генетики апоптоза пользуются клеточные культуры. Искусственно вызванные мутации по определенным генам апоптоза, получение клонов клеток, гипо- или гиперэкспрессирующих те или иные белки, вовлеченные в апоптоз, — все это позволяет исследователям четче выявлять молекулы, участвующие в апоптозе, лучше понимать его механизмы.

Морфология, биохимия и генетика апоптозаИзменения, происходящие с клетками во время апоптоза, сходны в большинстве типов клеток (некоторые отличия присутствуют в апоптозе нейронов, дрожжей). В апоптотической клетке на той или иной стадии можно зарегистрировать следующие явления:• Разобщение с соседними клетками и субстратом.• Изменение липидного состава плазматической мембраны. Фосфатидилсерин в норме присутствует в основном на цитоплазм атической стороне бислоя, а при апоптозе перемещается на наружную сторону.• Повышение экспрессии некоторых генов. Однако это происходит не во всех случаях ПКС.• Увеличение уровня кальция в цитоплазме.• Каскад каспаз, активация ими друг друга и прочих разрушающих клетку ферментов.• Конденсация цитоплазмы за счет возникновения большого количества поперечных сшивок между белками.• Конденсация хроматина.• Расщепление ядерной ДНК на олигомеры из (180*п) пар нуклеотидов.• Нарушение электронно-транспортной цепи в митохондриях и прекращение синтеза АТР.• Разрушение ядерной ламины.• Сжатие и фрагментация ядра.• Появление специфических маркёров на поверхности клетки.• Реорганизация цитоскелета.• Фрагментация клетки на апоптотические тельца.• Поглощение апоптотических телец макрофагами или соседними клетками.

Специфичность апоптоза нейронов — в отсутствии конденсации хроматина и повышенного уровня кальция в цитоплазме (Ellis et al., 1991 b). Кроме того, у нейронов отмечают заметные поломки в структуре митохондрий, тогда как у остальных клеток и митохондрии, и другие органеллы не разрушаются до самого конца.

Такое единообразие картины апоптоза позволяет выделить общие для всех типов клеток фазы апоптоза:1. Индукция2. Инициация3. Эффекторная фаза4. Образование и поглощение апоптотических телецИндукция апоптозаПобудить клетку вступить в апоптоз могут как внешние стимулы, так и внутриклеточные сигналы. Кроме того, стимулом к смерти могут быть не только прямые сигналы к началу апоптоза, но также и отсутствие сигналов выживания.

Доказано, что большинство клеток высших животных нуждается в сигналах других клеток, чтобы избежать ПКС (Raff et al., 1993; Elshamy et al., 1998). Исключение — бластомеры, которые выживают и в отсутствие сигналов выживания от других клеток. Некоторые клетки способны вырабатывать сигналы выживания сами для себя. Это характерно для тканей, образованных одним типом клеток — хрусталик, хрящ (Jacobson et al., 1997). Возможно, что гибель клеток может быть связана с неспособностью улавливать эти сигналы. Например, так происходит при развитии нервной системы (Raff et al., 1993): первоначально образуется избыток нейронов, каждый из которых стремится иннервировать свою мишень; сигналы выживания дают клетки-мишени (иннервируемые), и выживают только те нейроны, которым удалось достигнуть клетки-мишени.

Помимо отсутствия сигналов выживания, ПКС может вызыватьсяналичием собственно апоптотических сигналов. Сейчас известно множествохимических соединений, обработка которыми побуждает клетку вступить вапоптоз. Это: 2-хлораденозин (Rufini et al., 1997), фарнезол (Miquel et al.,1996), геранилгераниол (Miquel et al., 1996), циклогексимид (Alessenko etlial.,1994, 1997), этопозид (Song et al., 1997) и многие другие. Однако все эти вещества являются чужеродными для живого организма. А в естественных условиях такими сигналами могут быть TNFa, Fas (Wallach et al., 1997), изменение уровня гормонов (Ellis et al., 1991b), а также вещества, которые в иных ситуациях являются индукторами дифференцировки и пролиферации (Hale et al., 1996; Ellis et al., 1991b, Kroemer et al., 1995), например, протеинкиназа с, церамид, р53, c-myc.

Механизм действия всех этих химических соединений изучался и изучается многими группами ученых. Для некоторых веществ (TNFa, Fas) механизм уже детально установлен (Ashkenazi, Dixit, 1998), для других — еще недостаточно изучен.

Помимо внеклеточных сигналов, есть еще внутриклеточная индукция, например, при значительных повреждениях ядерной ДНК Искусственным индуктором в этом случае может быть у-облучение или ультрафиолет (Thompson, 1995), а естественным — вирусная инфекция.

Итак, с одной стороны, ПКС может быть запущена путем рецептор-опосредованных физиологических стимулов (таких как принятие сигнала гибели, отсутствие сигналов выживания, комбинация противоречивых сигналов). С другой стороны, апоптоз может быть результатом генетических нарушений и других изменений, произошедших в самой клетке. Так, апоптоз может вызываться вирусной инфекцией, тепловым шоком, повышением уровня свободных радикалов (Thompson, 1995).

Внутриклеточное развитие программы апоптозаВ зависимости от индуктора возможны два способа инициации программы гибели - рецепторный и митохондриальный.

Рецепторный апоптоз осуществляется через рецепторы на плазматической мембране, специально предназначенные для включенияпрограммы апоптоза. Этот путь хорошо изучен на примере белков TNF-семейства. Одним из белков этого семейства, индуцирующих ПКС, является Fas-лигэнд. Fas-лиганд (FasL) соединяется с Fas-рецептором (CD95) на поверхности клетки. Структура FasL такова, что одновременно он связывает и сближает три рецептора. Fas-рецептор — трансмембранный белок, который на цитоплазматической стороне имеет участок DD (death domain). Цитоплазматический белок FADD (Fas-Associated Death Domain Protein) состоит из такого же участка DD и участка DED (death effector domain). В прокаспазе-8 тоже есть DED. Все эти белки способны ассоциировать посредством одноимённых доменов, т.е. Fas взаимодействует с FADD через DD, a FADD взаимодействует с прокаспазой-8 через DED. Таким образом, на мембране оказывается целый комплекс белков: Fas/ FADD/ прокаспаза-8. А поскольку FasL сближает сразу три рецептора Fas, то сближенными оказываются три прокаспазы. Такое тесное соседство вызывает автокатализ и образование активной формы каспазы-8. Активная каспаза-8 запускает последующий каскад каспаз, ведущий к гибели клетки.Fas принадлежит семейству TNF-рецепторов. Помимо Fas и TNFR, сюда входят DR3, DR4, DR5 (Ashkenazi, Dixit, 1998). Механизм запуска апоптоза через эти рецепторы в целом схож, отличаются только детали. Например, TNFR ассоциирует не напрямую с FADD, а через посредника — TRADD.

Если апоптоз не связан с рецепторами смерти, то пути инициации могут начинаться по-разному, но все в итоге приводят к митохондриальному запуску программы гибели. Митохондрия приводит клетку к апоптозу по крайней мере тремя способами, возможно — взаимосвязанными. Это: нарушения в электронно-транспортной цепи и прекращение синтеза АТФ; изменение окислительно-восстановительного потенциала клетки; выход в цитоплазму молекул, активирующих каспазы (Green, Reed, 1998).

Через нарушение энергетического метаболизма (прекращение синтеза АТФ) действует такой индуктор, как церамид (Garcia-Ruiz et al., 1997).

Нарушения в окислительно-восстановительном потенциале клетки связаны с чрезмерной продукцией при некоторых видах ПКС (Bredesen, 1995).

Однако, возможно, эти два события являются лишь поздними следствиями развивающегося апоптоза. А истинная индукция ПКС с участием митохондрий связана с высвобождением из межмембранного пространства митохондрий цитохрома С. Цитохром С взаимодействует с цитоплазматическим фактором Apaf-1 (Apoptosis protease activating factor-1), играющем роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг прокаспазы-9 (Li et al., 1997). Весь процесс требует присутствия АТФ. Предполагается, что в результате АТФ-зависимого конформационного изменения Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром С. Связав цитохром С, Apaf-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ для прокаспазы-9. Подобная конструкция, содержащая АТФ, цитохром С, Apaf-1 и прокаспазу-9 (не менее 8 молекул) называется апоптосомой. Затем активная каспаза-9 запускает каскад каспаз, ведущий к гибели клетки.

Несмотря на огромное разнообразие сигналов ПКС и то, что апоптоз начинается по-разному в разных случаях, вполне возможно, что механизм эффекторной фазы апоптоза (то есть, собственно гибели) в клетке один или их очень немного (Ellis et al., 1991а), и главную роль в этом/этих механизмах играют одни и те же (или близкородственные) виды молекул-эффекторов. Это прежде всего каспазы.

Каспазы (Cystein Aspartase Protease) — семейство цистеиновых протеаз, расщепляющих субстрат на участке после остатка аспарагиновой кислоты (схожей специфичностью отличается только гранзим В у14цитотоксических Т-лимфоцитов). Кроме того, специфичность действия каспаз обусловлена узнаванием ещё по крайней мере четырех аминокислотных остатков в сайте расщепления. Каспазы сходны по структуре, последовательности аминокислот, но различаются по функциям. Все они экспрессируются в виде неактивного предшественника, который содержит три домена: N-концевой домен (высоковариабельный, участвует в регуляции активации), большая субчастица (20кДа), малая субчастица (10кДа). Активация проэнзима — протеолитический процессинг, сопровождающийся ассоциацией большой и малой субчастиц в гетеродимер. Показано (по крайней мере на двух каспазах — каспазе-1 и каспазе-3), что гетеродимеры образуют тетрамер с двумя каталитическими центрами, действующими независимо (Walker et al., 1994; Wilson et al., 1994). Функционально каспазы бывают эффекторными (каспазы-3,-6,-7,-11,-14) и инициаторными (каспазы-1,-2,-4,-5,-8,-9,-10). Инициаторные каспазы являются передатчиками апоптотического сигнала и активаторами эффекторных каспаз. Причем различные инициаторные каспазы участвуют в различных сигнальных путях. Например, каспаза-8 связана с запуском апоптоза через рецепторы смерти (Ashkenazi, Dixit, 1998). А каспаза-9 вовлечена в митохондриальный путь. Эффекторные каспазы, по-видимому, одни и те же во всех случаях.

Для активации инициаторных каспаз необходимо их связывание со специфическими кофакторами (FADD для каспазы-8, Apaf-1 и АТФ для каспазы-9). Активация каспаз в этом случае происходит либо из-за олигомеризации каспаз (кофакторы способствуют их сближению и межмолекулярному протеолизу), либо кофакторы так меняют конформацию предшественника, что становится возможен автокатализ (Thornbery, Lazebnik, 1998).

После того, как проапогттотический сигнал активирует инициаторную каспазу, она в свою очередь активирует эффекторную каспазу, что завершается в итоге разрушением клетки. В гибнущей клетке происходит15фрагментация ДНК, конденсация хроматина, распад цитоплазматических компонентов, блеббинг клеточной мембраны (Laster, Mackenzie, 1996). Полагают, что во всех этих изменениях прямо или косвенно участвуют каспазы. Мишенями каспаз являются -92 белка: структурные белки, сигнальные белки, белки-регуляторы транскрипции, трансляции, репарации и др. (Liu et al., 1997; Enari et al., 1998; Xue, Horvitz, 1997; Orth et al., 1996).

Завершение апоптозаГибнущая путем апоптоза клетка в итоге распадается на апоптотические тельца, содержащие остатки органе л л и окруженные плазматической мембраной, так что цитоплазматический материал не попадает в межклеточное пространство и не вызывает повреждений соседних структур. Апоптотические тельца впоследствии поглощаются другими клетками организма (Dini et al., 1995). Большую роль при этом играют поверхностные изменения, происходящие с апоптотической клеткой, ведущие в итоге к узнаванию и уничтожению гибнущих клеток макрофагами.

Уже на начальных этапах ПКС клетка отделяется от субстрата и соседних клеток, округляется, утрачивает специализированные поверхностные структуры и начинает производить специальные наружные маркёры. Один из них — avP3 витронектиновый рецептор — способен взаимодействовать с СБЗб-лигандом на макрофаге (Martin et al., 1994; Hale et al., 1996). Еще один способ сигнализирования для макрофага: карбогидрат-лектиновые взаимодействия (Martin et al., 1994; Dini et al., 1995). Кроме того, фагоцитирующие клетки могут узнавать апоптотические клетки по изменившемуся липидному составу на наружной стороне плазматической мембраны. В норме плазматическая мембрана характеризуется асимметричностью: фосфатидилхолин и сфингомиелин располагаются в основном в наружной части бислоя, а фосфатидилсерин ифосфатидилэтаноламин — на внутренней (Албертс и др., 1994). Такая асимметрия поддерживается АТФ-зависимыми ферментами, которые связывают фосфатид ил серии с цитоскелетными белками клетки и исправляют неверную встройку липидов. Апоптоз сопровождается потерей этой асимметрии. Фосфатидилсерин начинает встраиваться в наружную часть бислоя (Fadok et al., 1992; Martin et al., 1996).

В утилизации апоптотических клеток могут участвовать не только "профессиональные" макрофаги (Fadok et al., 1992), но и нефагоцитирующие обычно соседние клетки (Jacobson et al., 1997).

Защита от ПКСВ лабораторных условиях остановить программу гибели можно, используя ингибиторы каспаз (zVAD.fmk и др.) (Gottron et al., 1997; Takahashi et al., 1997) и других эффекторов апоптоза. В некоторых случаях блокаторы транскрипции и белкового синтеза также останавливают ПКС, подтверждая, что в определённых видах апоптоза необходим синтез de novo белка и РНК (Kroemer et al., 1995). Но помимо этих искусственных агентов, известны и физиологические блокаторы ПКС. Иначе бесконтрольный апоптоз в различных органах мог бы нанести серьёзный вред организму.

У C.elegans таким защитником от ПКС является белок CED-9 (Hengartner et al., 1992). Механизм действия CED-9 установлен (Vaux, 1997). Он ингибирует белок CED-4, который, хотя и не принимает активного участия в апоптозе, но является активатором другого CED-белка: CED-3, а это уже основной эффектор в ПКС у C.elegans (Ellis, Horvitz, 1986).

У млекопитающих известен гомолог CED-9 — белок Вс1-2 (Hengartner et al., 1992; Hengartner, Horvitz, 1994). Более того, существует целое семейство Вс1-2-родственных белков: Bcl-w, Bcl-x Вах, Вак и другие (Boise et al., 1993; Gibson et al., 1996). Однако в отличие от CED-9, который однозначно блокирует апоптоз, члены Вс1-2-семейства могут быть как17ингибиторами, так и индукторами ПКС. Сам Вс1-2, а также Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Bag-1, A-l/Bfl-1, BRAG-1, NR-13, Boo/Diva предотвращают апоптоз. Индукторами являются Bcl-XS, Вах, Bad, Bak, Bar, Bid, Bim/Bod. Существует несколько моделей возможного механизма действия Вс1-2 и других белков семейства. Наиболее популярная модель связана с нахождением Вс1-2 и Вах на наружной митохондриальной мембране (Zhivotovsky et al., 1998), их способностью образовывать гетеродимеры (Oltvai et al., 1993) и зависимостью апоптоза от соотношения количества Вс1-2 и Вах (Lewis, 1995). Полагают, что Вах образует поры, встраиваясь в мембрану митохондрий (Green, Reed, 1998; Tsujimoto, Shimizu, 2000). Через эти поры из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль выходят цитохром С, AIF, каспазы-2,-3,-9, запускающие ПКС. Вс1-2 предотвращает образование этих пор и выход агентов (Rosse et al., 1998).

Наряду с CED-9 и Вс1-2-семейсгвом, защитным свойством обладают некоторые вирусные белки. Существование и размножение вируса возможно только в живой, нормально функционирующей клетке-хозяине. Поэтому, чтобы предотвратить гибель клетки в ответ на инфекцию, некоторые вирусы экспрессируют гены-супрессоры ПКС, например, белок Tax вируса HTLV-1 или вирусные белки МС159, Е6/7 (Siegel et al., 1998; Finzer et al., 2002). Два последних действуют на начальных этапах рецептор-опосредованного апоптоза. Для активации инициаторной каспазы-8 необходима ассоциация прокаспазы с рецепторным комплексом CD95/FADD (в случае FasL опосредованного апоптоза) или TNFR/TRADD/FADD (в случае TNFa опосредованного апоптоза). Ассоциация происходит через участок DED (death effector domain), имеющийся и в прокаспазе-8 и в молекуле FADD. Вирусные белки МС159 и Е8 также имеют DED. Соединяясь с рецепторным комплексом, эти белки занимают место прокаспазы-8. В результате активации каспазы не происходит и ПКС останавливается.

Таким образом, в природе в дополнение к механизму запуска клеточной гибели существуют ещё и механизмы по её предотвращению.

Некроз и апоптозВажно отличать апоптоз от другой формы клеточной гибели —некроза. В отличие от апоптоза, некроз является незапрограммированной,генетически не контролируемой, "случайной", формой гибели клетки.

Известно, что причиной некроза в большинстве случаев является нарушениецелостности плазматической мембраны. К этому могут вести разныевоздействия: прямое механическое повреждение мембраны или же нарушениеработы трансмембранных насосов и каналов (косвенно к этому могут вести инарушения электроннотранспортной цепи митохондрий, в результате чегомембранным насосам не поставляется АТФ). В итоге клетка начинает терятьОкалий, внутрь нее прийикает натрий, трансмембранный потенциал утрачивается. Морфологически некротическая клетка выглядит набухшей, с нечеткими границами, хроматин в ядре в начале плотно сжат (пикноз), но со временем глыбки теряют четкие очертания и растворяются (кариолизис). Все мембранные структуры из-за нарушения гомеостаза сильно набухают и затем разрушаются, а клеточное содержимое выбрасывается в межклеточное пространство, вызывая воспалительную реакцию. Обычно некрозу подвергаются сразу много соседних клеток, и воспаление развивается в пограничной живой ткани (Wyllie et al., 1980)В отличие от некроза, апоптоз — событие, которое затрагивает одиночные клетки. При этом происходит активация внутриклеточных протеаз и аутодеградация основных компонентов клетки. Нарушения целостности плазматической мембраны, таким образом, не происходит и воспалительная реакция в окружающей ткани не наступает. Изменения плазматической мембраны, сопутствующие гибели, активируют фагоцитирующие клетки (Ellis et al., 1991а; Fadok et al., 1992).

ЦИКЛОГЕКСИМИДЦиклогексимид (актидион, 3-[2-(3,5-диметш1-2-оксициклогексил)-2-гидроксиэтил]глутаримид), Mr = 281,3 г/моль, известен как ингибитор белкового синтеза в клетках эукариотов, но не прокариотов ("Справочник биохимика", 1991). Полагают, что он оказывает воздействие на все этапы трансляции: инициацию, элонгацию, терминацию (Rajalakshmi et al., 1971). Причём влияние на тот или иной этап зависит от дозы циклогексимида (ЦГИ): при низких концентрациях он сильнее блокирует элонгацию, а при высоких — инициацию (Лейтин, Лерман, 1975).

Как и другие ингибиторы белкового синтеза, ЦГИ способен предотвращать те формы ПКС, в которых необходимо новообразование белка (Jacobson et al., 1997), например в тимоцитах (Alessenko, 1997), в нейронах (Kim et al., 2000). Однако в последние годы появились данные о противоположном эффекте ЦГИ: Gong, Darzynkiewicz (1993), Alesenko (1994), Bloom (1999), Fujita (1999) показали, что в некоторых типах клеток (в промиелоцитах, гепатоцитах, клетках эндотелия) ЦГИ индуцирует ПКС. Точный механизм действия ЦГИ в этом случае не ясен.

Возможно, развитие апоптоза в присутствии агента-ингибиторамакромолекулярного синтеза говорит о существовании короткоживущихзащитных белков. Это наглядно демонстрируется в работах, где ЦГИиспользуется совместно с другими агентами, которые в отсутствиетрансляционного блока теряют способность индуцировать апоптоз (Karahashi,Amano, 1998). В этих случаях ЦГИ используется лишь как вспомогательныйагент. Но нужно отметить также и то, что помимо трансляционного блокаЦГИ вызывает кратковременную (в течение 3 часов) экспрессию генов с-тус,c-fos, c-jun, и более длительную экспрессию гена р53 (Alessenko, 1994, 1997).

Участие данных протоонкогенов в ПКС показано многими исследователями20(Shi et al., 1992; Eizenberg et al., 1995; Evan, Littlewood, 1998; Deschesnes et al., 2001). Еще один возможный механизм индукции ПКС циклогексимидом может быть связан с митохондриальными повреждениями, которые отмечены в некоторых типах клеток, обработанных ЦГИ (Струве, Ченцов, 1977; Blom et al., 1999).

Некоторыми авторами показано, что эффект ЦГИ (предотвращать или запускать апоптоз) может быть дозозависимым: Tessitore (1999) повышал уровень ПКС в гепатоцитах крыс малыми дозами ЦГИ, но блокировал ПКС повышенными дозами. А вот в работе Alessenko (1997) высокие, сублетальные дозы ЦГИ не вызывали снижения уровня ПКС в гепатоцитах. Lemaire (1999), в противоположность Tessitore, утверждает, что именно низкие дозы ЦГИ защищают от ПКС (предположительно, через ингибирование каспазы-3).

В тех случаях, когда для ЦГИ показана проапоптотическая активность, программа гибели развивается по классическому каспазному пути (Bloom et al., 1999; Lemaire et al., 1999), хотя отмечается, что ЦГИ может оказывать противоположный эффект на разные каспазы. Так, ЦГИ дозозависимо активирует каспазаЗ-подобные протеазы, но блокирует каспаза1-подобные (Bloom et al., 1999). Показано также, что клетки, находящиеся на разных стадиях клеточного цикла, вступают в апоптоз в равной степени (Gong, Darzynkiewicz, 1993).

Таким образом, ЦГИ может использоваться и в качестве индуктора, и в качестве блокатора ПКС, в зависимости от дозы агента и типа клеток. При этом если механизм защиты от ПКС связан напрямую с остановкой синтеза белков-участников апоптоза, то механизм индукции апоптоза циклогексимидом не изучен до конца.

АНЕУПЛОИДИЯПолучение анеуплоидных клетокОсновной способ развития анеуплоидии — нарушение нормального течения митоза и неправильное распределение хромосом между дочерними клетками. Это приводит к возникновению клеток с несбалансированными кариотипами. При этом к анеуплоидии (то есть, к недостатку или избытку нескольких хромосом) могут вести как патологии митоза, связанные с повреждением хромосом, так и патологии, связанные с повреждением митотического аппарата (Алов, 1972). Например, фрагментация хромосом и образование ацентрических фрагментов приводит к хаотичному распределению этих фрагментов по дочерним клеткам. Впоследствии фрагменты обладают способностью воссоединяться своими концами (Леван, Бизеле, 1961). Снижение функциональной активности кинетохора или утрата некоторыми хромосомами кинетохоров также ведет к беспорядочному перемещению хромосом в митозе и непредсказуемому распределению их по дочерним ядрам. Аномальная репродукция центриолей или их преждевременное созревание и последующий многополюсный митоз приводит к неравномерному распределению хромосом между несколькими дочерними клетками (Онищенко, 1993; Fukasawa et al., 1997; Sato et al., 2000). Асимметричный митоз характеризуется неравномерным развитием противоположных полюсов, в результате чего к полюсам отходит разное количество хромосом. Часто многополюсные митозы возникают спонтанно в полиплоидных клетках, так как здесь многократно умножено число центриолей (Онищенко, 1993)Помимо митотических аномалий анеуплоидию вызывают и нарушения мейоза. Например, при нарушении конъюгации гомологичных хромосом возможно отхождение в анафазе I обеих хромосом к одномуполюсу. В результате возникнут гаметы, а затем и соматические клетки, с лишними или недостающими хромосомами.

Многополюсные митозы и анеуплоидные клеткиМногополюсные митозы возникают спонтанно или в результате различных физических и химических воздействий (Кегуег, 1984; Hotchkiss, Sisken, 1980). Как правило, источником многополюсного митоза служат либо полиплоидные клетки, в которых число центриолей увеличено, либо клетки, в которых в результате разобщения хромосомного и центросомного циклов сформировались дополнительные центросомы, организующие полюса веретена. Так, например, К-митотическая задержка приводит к блокированию или удлинению хромосомного цикла. Центриолярный цикл при этом продолжается. Проявлением этого является разъединение центриолей и отхождение их друг от друга на значительное расстояние (Оншценко, 1993). Такие одиночные центриоли могут формировать самостоятельные полюса веретена деления. Кроме того, из-за нарушения фибриллярного материала с центриолями возможно появление и бесцентриолярных полюсов (Ходяков и др., 1986). Показано, что в трехполюсном митозе бесцентриолярными могут быть один или два полюса (Кегуег et al., 1984; Ходяков и др., 1986). Механизм возникновения многополюсных митозов с бесцентриолярными полюсами остается неясным.

В диплоидных клетках многополюсные, и в частности — трехполюсные, митозы могут завершаться эуплоидным или анеуплоидным распределением хромосом по дочерним клеткам. Эуплоидное распределение возможно в том случае, когда форма метафазной хромосомной пластинки является V-образной. Тогда в случае образования трех дочерних ядер в них может содержаться In, 2n, In (Ходяков и др., 1986). При Y-образной форме метафазной пластинки всегда идет образование анеуплоидных дочерних ядер.

Распространенность в природеМногополюсные митозы (а, следовательно, и появление анеуплоидных клеток) описаны в кишечном эпителии аскариды (Анисимов и др., 1974), в печени мышей (Бродский, Урываева, 1981), в эндометрии крысы (Зыбина, Грищенко, 1970). Однако у человека, в нормальных тканях и в физиологических условиях, патологические мигозы встречаются очень редко, поэтому и анеуплоидных клеток в норме в организме человека нет. В случае же их возникновения такие клетки с аномальным хромосомным набором быстро элиминируются. Однако различные патологические процессы, такие как реакция воспаления, вирусная инфекция, опухолевый рост способны значительно повысить вероятность повреждения миготического аппарата и образование аномальных по хромосомному составу клеток (Алов, 1972; Онищенко, 1993). Кроме того, некоторое количество анеуплоидных клеток может возникать при гаметогенезе, причем вероятность этого события увеличивается с возрастом.

Отсутствие в гамете человека одной из 23 хромосом или же избыток одной или нескольких хромосом, как правило, не сказывается на жизнеспособности самой гаметы, но приводит к образованию зиготы, которая не может развиться в полноценный организм и погибает (Qumsiyeh et al., 2000). Но в некоторых случаях анеуплоидный зародыш оказывается жизнеспособным и тогда развивается организм с различными аномалиями. Например, трисомия по 21 хромосоме вызывает болезнь Дауна, моносомия по Х-хромосоме - синдром Шерешевского-Тернера, избыток Х-хромосом — синдром Клейнфельтера, трисомии по 13, 14, 15 хромосомам приводят к развитию "волчьей пасти", "заячьей губы", полидактилии.

Еще один часто встречаемый вариант, при котором можно встретить анеуплоидные клетки, это опухоли. В опухолях, которые всегда отличаются ослабленным контролем за целостностью клеточного генома, аномальные митозы возникают значительно чаще, чем в нормальной ткани. Однако24остается неясным, является ли патология митоза результатом озлакачествления клеток или патологические митозы являются одной из причин этого явления. Во всяком случае известно, что образующиеся в результате полиплоидные клетки, анеуплоидные клетки, клетки с хромосомными аномалиями не устраняются и, в свою очередь, демонстрируют патологии в последующих митозах, так что количество аномалий увеличивается прогрессивно (Алов, 1972).

Анеуплоидия и апоптозУ анеуплоидных организмов уровень апоптоза в отдельных органах в несколько раз выше, чем у диплоидных. Так, моносомия по Х-хромосоме у человека приводит к 70%-ной гибели ооцитов, с чем и связывают бесплодие у женщин с синдромом Тернера (Modi et al., 2003), а трисомия по 8 хромосоме повышает уровень апоптоза в стволовых клетках крови (Sloand et al., 2002).

Даже в опухолях, где апоптоз в поврежденных клетках запускается далеко не всегда (Kerr et al., 1994; Reed, 1999), все же отмечено, что если эта опухоль является анеуплоидной, то это сопровождается повышенным уровнем апоптоза (Lipponen, 1999; Abdel-Moneim et al., 2000). С другой стороны известны также и случаи, когда анеуплоидная опухоль оказывается более устойчива к противоопухолевым агентам, вызывающим апоптоз, чем подобные же диплоидные опухоли (Bobkova et al., 2000). Вообще, есть гипотеза, что повышение уровня анеуплоидии (путем увеличения числа центросом и появления многополюсных митозов) в опухоли служит своего рода способом повысить жизнеспособность опухоли (Онищенко, 1993; Brinkley, 2001) в ответ на противоопухолевую терапию. Однако в анеуплоидной опухоли неизбежно повышается уровень спонтанного апоптоза и чтобы поддержать ее жизнеспособность и снизить уровень апоптоза в клетках затем должны восстановиться биполярные митозы (Brinkley, 2001)Таким образом, к настоящему времени известно, что хромосомный состав играет важную роль в жизнедеятельности клеток. Отсутствие одной или нескольких хромосом в диплоидном наборе или избыток хромосом, как правило, приводит со временем к клеточной смерти. Однако, поскольку апоптоз является генетически обусловленной программой, возникает вопрос о том, может ли отсутствие некоторых генов не позволить клетке запускать данную программу? Ответ на этот вопрос может иметь большое значение в терапии опухолей, однако исследования в этом направлении не проводились. В связи с этим в настоящей работе были поставлены следующие задачи:1. Отработать метод индукции апоптоза с помощью такого агента, действие которого напрямую связано с активацией генов апоптоза в клетке.

2. Индуцировать в клеточной популяции патологические митозы, вызывающие появление клеток с аномальным хромосомным составом.

3. Исследовать возможность индукции апоптоза в полученных анеуплоидных клетках выбранным агентом.

Индукция апоптозаВ качестве индуктора апоптоза использовался водный раствор циклогексимида (Sigma, С 7698) в конечной концентрации 10*2 М.

Выявление апоптотических клетокНа разных этапах работы применялись различные методы выявления клеток, подвергшихся апоптозу:а) На препаратах, фиксированных для световой микроскопии и окрашенных гематоксилином и эозином, апоптотические клетки выявлялись по наличию ядерных изменений: конденсированный хроматин, формирующий "полулуния" в ядре, или полная фрагментация ядер на плотные, ярко окрашенные глыбки (Рис. 1).б) На нефиксированных препаратах апоптоз выявлялся с использованием фазово-контрастной оптики по характерному для апоптотической клетки блеббингу (пузырению) поверхности клетки: по всей поверхности появляются достаточно крупные выпячивания цитоплазмы, хорошо заметные на фазовом контрасте (Рис. 2).в) На нефиксированных препаратах также использовалась прижизненная окраска аннексином V, конъюгированным с флюоресцентным красителем Су3.18 (Sigma, А 4963) или с FITC (Sigma, А 9210). Дополнительным красителем для выявления ядерного компонента в составе апоптотической клетки служил йодид пропидия (Sigma Р 4170). Аннексии V в присутствии кальция специфически связывается с фосфатидилсерином на наружной поверхности мембраны апоптотической клетки. Нефиксированные клетки на 5мин помещались в аннексин-связывающий буфер (10 мМ HEPES, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСЬ, рН 7,5), затем окрашивались 10 мин смесью раствора йодида пропидия (конечная концентрация = 5 мкг/мл) с раствором аннексина V на аннексии- связ ывающем буфере в конечной концентрации 127мкг/мл. Клетки отмывали 5 мин в аннексин-связывающем буфере и помещались в камеру для прижизненных наблюдений. Наблюдения и фотосъемка проводились на микроскопе Opton Photo III; объектив 25х.г) На ультраструктурном уровне апоптотические клетки определялись по характерному уплотнению цитоплазмы и конденсации хроматина.

Получение патологических митозовАнтитубулиновый агент колцемид (Sigma, D 7385) в концентрации 0,05 мкг/мл вводился в культуру на срок 18-22 ч для накопления колхицино-подобных митозов. После отмывания от колцемида средой без сыворотки клетки помещались в среду с сывороткой. Через 30-60 мин наблюдалось большое число трехполюсных метафазных пластинок.

Постановка экспериментов

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Александрова, Екатерина Анатольевна

выводы

1. Циклогексимид (ЦГИ) индуцирует апоптоз и подавляет митотическую активность в клетках СПЭВ и FAF28.

2. При сочетании действия ЦГИ с нарушением условий культивирования (изменение рН и содержания О2/СО2) в культуре FAF28 регистрируется большее число апоптотических клеток, чем при действии ЦГИ в отдельности.

3. ЦГИ вызывает изменения морфологии митохондрий: появляются митохондрии с уплотненным матриксом, с расширенным межмембранным пространством или нарушенной внешней мембраной, увеличивается длина митохондрий.

4. Среди апоптотических клеток, индуцированных ЦГИ, встречаются варианты как с интактными цитоплазматическими органеллами, так и с полностью разрушенной системой мембранных и немембранных органелл.

5. Присутствие колцемида вызывает в культурах СПЭВ и FAF28 накопление К-митозов, а в дальнейшем - многоядерных и апоптотических клеток. После снятия воздействия колцемидом в клетках культуры СПЭВ наблюдается более высокий уровень многополюсных митозов, чем в культуре FAF28.

6. Клетки СПЭВ, не способные выйти из К-митоза, в присутствии ЦГИ вступают в апоптоз.

7. Анеуплоидные клетки СПЭВ, возникшие путем многополюсного митоза, способны асинхронно вступать в апоптоз, индуцированный циклогексимидом. 1П\А

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Александрова, Екатерина Анатольевна, 2004 год

1. Abdel-Moneim I., Melamed M.R., Darzynkiewicz Z., Corczyca W. Proliferation and apoptosis in solid tumors. Analisis by laser scanning cytometry Anal. Quant. Cytol. Histol., Vol. 22, #5, pp. 393-397,2000

2. Alessenko A.V., Boikov P.Ia., Drobot L.B., Rusakov S.A., Filippova G.N. Change in the level of sphingosine in rat liver nuclei and cells during oncogene superexpression induced by cycloheximide Biokhimia, Vol. 59, #7, pp. 10761087,1994

3. Alessenko A.V., Boikov P.Ya., Filippova G.N., Khrenov A.V., Loginov A.S., Makarieva E.D. Mechanisms of cycloheximide-inducsd apoptosis in liver cells FEBS Letters, Vol. 416, pp. 113-116,1997

4. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation Science, Vol. 281, pp. 1305-1308, 1998

5. Bereiter-Hahn J., Voth M. Dynamics of mitochondria in living cells: shape changes, dislocations, fusion, and fission of mitochondria. Microsc. Res. Tech 27:198-219,1994

6. Bernal S.D., Lampidis T.J., Summerhayes I.C., Chen L.B. Rhodamine-123 selectively reduces clonal growth of carcinoma cells in vitro Science, Vol. 218, pp. 1117-1119,1982

7. Blom W.M., de Bont H.J., Meijerman I., Mulder G.J., Nagelkerke J.F. Prevention of cycloheximide-induced apoptosis in hepatocytes by adenosine and by caspase inhibitors Biochem. Pharmacol., 58 (12), pp. 1891-1898, 1999

8. Bobkova K., Otova В., Marinov I., Mandys V. et al. Anticancer effect of PMEDAP-monitoring of apoptosis Anticancer Res., Vol. 20 (2A), pp. 1041-1047, 2000

9. Boise L.H., Gonzalez-Garcia M., Postema C.E., Ding L., Lindsten Т., Turka L.A., Мао X., Nunez G., Thompson C.B. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death Cell, Vol. 74, pp. 597608, 1993

10. Bossy-Wetzelz E., Barsoum M.J., Godzik A., Schwarzenbacher R., Lipton S.A. Mitochondrial fission in apoptosis, neurodegeneration and aging Current Opinion in Cell Biology, 15:1-11,2003

11. Bredesen DE. Neural apoptosis Ann Neurol., Vol. 38, pp. 839-51, 1995

12. Brinkley B.R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division Trends Cell Biol., 11(1), pp. 18-21,2001

13. Bursch W., Hochegger K., Torok L., Marian В., Ellinger A., Hermann R.S. Autophagic and apoptotic types of programmed cell death exhibit different fates of cytoskeletal filaments J. Cell Sci., Vol. 113, pp. 1189-1198,2000

14. Deschesnes R.G., Huot J., Valerie K., Landry J. Involvement of p38 in Apoptosis-associated Membrane Blebbing and Nuclear Condensation Mol. Biol. Cell, Vol. 12, pp. 1569-1582,2001

15. Dini L., Lentini A., Diez G.D., Rocha M., Falasca L., Serafino L., Vidal-Vanaclocha F. Phagocytosis of apoptotic bodies by liver endothelial cells J Cell Sci., Vol. 108, pp. 967-973,1995

16. Eizenberg O., Faber-Elman A., Gottlieb E., Oren M., Rotter V., Schwartz M. Direct involvement of p53 in programmed cell death of oligodendrocytes The EMBO Journal, Vol. 14, #6, pp. 1136-1144,1995

17. Ellis H.M., Horvitz H.R. Genetic control of programmed cell death in the nematode Celegans Cell, Vol. 44, pp.817-829, 1986

18. Ellis R.E., Jacobson D.M., Horvitz H.R. Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans Genetics, Vol. 129, pp. 79-94,1991

19. Ellis R.E., Yuan J.Y., Horvitz H.R. Mechanisms and functions of cell death Annu. Rev. Cell Biol., Vol. 7, pp. 663-698,1991

20. Elshamy W.M., Fridvall L.K., Ernfors P. Growth arrest failure, G1 restriction point override, and S phase death of sensory precursor cells in the absence of neurotrophin-3 Neuron, Vol.21, pp. 1003-1015,1998

21. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD Nature, Vol. 301, pp. 43-50,1998

22. Erenpreisa Je., Cragg M.S. Mitotic death: a mechanism of survival? Cancer Cell International, Vol. 1, pp. 1-7,2001

23. Evan G., Littlewood T. A matter of life and cell death Science, Vol. 281, pp. 1317-1322,1998

24. Finzer P., Aguilar-Lemarroy A., Rosl F. The role of human papillomavirus oncoproteins E6 and E7 in apoptosis Cancer Lett., Vol. 188, pp. 15-24,2002

25. Fujita H., Morita I., Murota S. A possible involvement of ion transporter in tumor necrosis factor alpha and cycloheximide-induced apoptosis of endothelial cells Mediators Inflamm, Vol. 8, # 4-5, pp. 211-218, 1999

26. Fukasawa K., Wiener F., Vande Woude G.F., Mai S. Genomic instability and apoptosis are frequent in p53 deficient young mice Oncogene, Vol. 15, #11, pp. 1295-1302, 1997

27. Garcia-Ruiz C., Colell A., Man M., Morales A., Fernandez-Checa J.C. Direct effect of ceramide on the mitochondrial electron transport chain leads to generation of reactive oxygen species. Role of mitochondrial glutathione J Biol. Chem.,272, 11369,1997

28. Gibson L., Holmgreen S.P., Huang D.C., Bernard O., Copeland N.G., Jenkins N.A., Sutherland G.R., Baker E., Adams J.M., Cory S. bcl-w, a novel member of the bcl-2 family, promotes cell survival Oncogene, Vol. 13, pp. 665-675,1996

29. Golstain P., Ojcius D.M., Young J.D. Cell death mechanisms and the immune system Immunol.Rev., Vol. 121, pp.29-65,1991

30. Gong J., Li X., Darzynkiewicz Z. Different patterns of apoptosis of HL-60 cells induced by cycloheximide and camptothecin J. Cell Physiol., Vol. 157, #2, pp. 263-270, 1993

31. Gottron F.J., Ying H.S., Choi D.W. Caspase inhibition selectively reduces the apoptotic component of oxygen-glucose deprivation-induced cortical neuronal cell death Mol.Cell Neurosci., Vol. 9, # 3, pp. 159-169, 1997

32. Green D.R., Reed J.C. Mitochondria and apoptosis Science, Vol. 281, pp. 1309-1312,1998

33. Gulbins E., Dreschers S., Bock I. Role of mitochondria in apoptosis J Exp. Physiol., Vol. 88, pp. 85-90, 2003

34. Hale A.J., Smith C.A., Sutherland L.C., Stoneman V.E., Longthorne V.L., Culhane A.C., Williams G.T. Apoptosis: molecular regulation of cell death Eur. J. Biochem., Vol. 236, pp. 1-26,1996

35. Harris C., Grady H,. Svoboda D. Alterations in pancreatic and hepatic ultrastructure following acute cycloheximide intoxication J Ultrastructure Res., Vol. 22, pp. 240-251, 1968

36. Hengartner M.O., Ellis R.E., Horvitz H.R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death Nature, Vol. 356, pp. 494-499, 1992

37. Hengartner M.O., Horvitz R. C.elegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene bcl-2 Cell, Vol. 76, pp. 665-676,1994

38. Hotchkiss S.K., Sisken J.E. Differences among human cell lines in the incidence of multipolar spindles during recovery from mitotic arrest J Cell Biol., Vol. 87, p. 238, 1980

39. Hwang K.M., Yang L.C., Carrico C.K., Schulz R.A., Schenkman J.B., Sartorelli A.C. Production of membrane whoris in rat liver by some inhibiters of protein synthesis J Cell Biol., Vol. 62, # 1, pp. 20-31,1974

40. Ianzini F., Mackey M.A. Spontaneous premature chromosome condensation and mitotic catastrophe following irradiation of HeLa S3 cells Int. J Radiat. Biol., Vol. 72, pp. 409-421, 1997

41. Jacobson M.D., Weil M., Raff M.C. Programmed cell death in animal development Cell, Vol. 88, pp. 347-354, 1997

42. Jordan M.A., Wendell K., Gardiner S., Derry W.B., Copp H., Wilson L. Mitotic block induced in HeLa cells by low concentrations of paclitaxel (Taxol) results in abnormal mitotic exit and apoptotic cell death Cancer Res., Vol. 56, pp. 816-825, 1996

43. Kalt A., Schiwa M., Trends Cell Biol., Vol. 3, pp. 118-128, 1993

44. Karahashi H., Amano F. Apoptotic changes preceding necrosis in lipopolysaccharide-treated macrophages in the presence of cycloheximide

45. Exp.Cell Res., Vol. 241, # 2, pp. 373-383, 1998

46. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics Br. J. Cancer, Vol. 26, pp. 239-257, 1972

47. Kerr, J.F.R., Winterford, C.M., Harmon, B.V. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy Cancer, Vol. 73, pp. 2013-2026,1994

48. Keryer G., Ris H., Borisy G.G. Centriole distribution during tripolar mitosis in Chinese hamster ovary cells J Cell Biol., Vol. 98, pp. 2222-2229, 1984

49. Kim D.H., Hong H.N., Lee J.H., Park H.S. Okadaic acid induces cycloheximide and caspase sensitive apoptosis in immature neurons Mol. Cells, Vol. 10, #1, pp. 83-89, 2000

50. Kroemer G., Petit P., Zamzami N., Vayssiere J.L., Mignotte B. The biochemistry of programmed cell death The FASEB journal, Vol. 9, pp. 12771287,1995

51. Kung A.L., Sherwood S.W., Schimke R.T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 87, pp. 9553-9557, 1990

52. Laster S.M., Mackenzie J.M.J. Bleb formation and F-actin distribution during mitosis and tumor necrosis factor-induced apoptosis Microsc. Res. Tech., Vol. 34, #3, pp. 272-280, 1996

53. Lee Y.J., Cho H.N., Soh J.W., Jhon G.J., Cho C.K., Chung H.Y., Bae S., Lee S.J., Lee Y.S. Oxidative stress-induced apoptosis is mediated by ERK1/2 phosphorylation Exp. Cell Res., Vol. 291, pp. 251-66, 2003

54. Lemaire C., Andreau K., Souvannavong V., Adam A. Specific dual effect of cycloheximide on В lymphocyte apoptosis: involvement of CPP 32/caspase-3 Biochem. Pharmacol., Vol. 58, # 1, pp. 85-93, 1999

55. Lewis R. Apoptosis activity: cell death establishes itself as a lively research field Scientist, Vol. 9, # 3, p. 15, 1995

56. Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S.M., Ahmad M., Alnemri E.S., Wang X. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade Cell, Vol. 91, pp. 479-489,1997

57. Lipponen P. Apoptosis in breast cancer: relationship with other pathological parameters Endocr. Relat. Cancer, Vol. 6, # l,pp. 13-16,1999

58. Liu X., Zou H., Slaughter C., Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis Cell, Vol. 89, pp.175-184,1997

59. Martin S.J., Green D.R., Cotter T.G. Dicing with death: dissecting the components of the apoptosis machinestry Elsevier Science Publishers, pp. 26-30, 1994

60. Maruoka Y., Harada H., Mitsuyasu Т., Seta Y., Kurokawa H., Kajiyama M., Toyoshima K. Keratinocytes become terminally differentiated in a process involving programmed cell death Biochem. and Biophys. Res. Commun., Vol. 238, pp. 886-890, 1997

61. McGill M., Brinkley B.R. Mitosis in human leucocytes during colcemid inhibition and recovery Cancer Res., Vol. 32, pp. 746-755, 1972

62. Miquel К., Pradines A., Favre G. Farnesol and geranylgeraniol induce actin cytoskeleton disorganization and apoptosis in A549 lung adenocarcinoma cells Biochem. and Biophys. Res. Commun., Vol. 225, pp. 869-876, 1996

63. Modi D.N., Sane S., Bhartiya D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads Mol. Hum. Reprod., Vol. 9, pp. 219225, 2003

64. Mozdy A.D., McCafifery J.M., Shaw J.M. Dnmlp GTPase-mediated mitochondrial fission is a multi-step process requiring the novel integral membrane component Fislp J Cell Biol 151:367-380. 2000

65. Oltvai Z.N., Milliman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death Cell, Vol. 74, pp. 609-619,1993

66. Orth K., Chinnaiyan A.M., Garg M., Froelich C.J., Dixit V.M. The CED-3/ICE-like protease Mch-2 is activated during apoptosis and cleaves the death substrate Lamin A The Journal of Biological Chemistry, Vol. 271, ?28, pp. 1644316446,1996

67. Qumsiyeh M.B., Kim K.R., Ahmed M.N., Bradford W. Cytogenetics and mechanisms of spontaneous abortions: increased apoptosis and decreased cell proliferation in chromosomally abnormal villi Cytogenet. Cell Genet., Vol. 88, pp. 230-25,2000

68. Raff M.C., Barres B.A., Burne J.F., Coles H.S., Ishizaki Y., Jacobson M.D. Programmed cell death and the control of cell survival: lessons from the nervous system Science, Vol. 262, pp. 695-700,1993

69. Rajalakshmi S., Liang H., Sarma D.S., Kisilevsky R., Farber E. Cycloheximide, an inhibitor of peptide chain termination or release in liver in vivo and in vitro Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 42, pp. 259-265, 1971

70. Reed J.C. Mechanisms of apoptosis avoidance in cancer Curr. Opin. Oncol., Vol. 1 l,pp. 68-75, 1999

71. Rieder C., Palazzo R.E. Colcemid and the mitotic cycle J. Cell Sci., Vol. 102, pp. 387-392, 1992

72. Roninson I.B., Broude E.V., Chang B-D If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells Drug Resistance Updates, Vol. 4, pp. 303-313,2001

73. Rosse Т., Olivier R., Monney L., Rager M., Conus S., Fellay I., Jansen В., Borner C. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome с Nature, Vol. 391, pp. 496-499,1998

74. Rowan S., Fisher D.E. Mechanisms of apoptotic cell death Leukemia, Vol. 11, pp. 457-465, 1997

75. Sato N., Mizumoto K., Nakamura M., Ueno H., Minamishima Y.A., Farber J.L., Tanaka M. A possible role for centrosome overduplication in radiation-indused cell death Oncogene, Vol. 19, pp. 5281-5290,2000

76. Seale R.L., Simpson R.T. Effects of cycloheximide on chromatin biosynthesis J Mol. Biol., Vol. 94, # 3, pp. 479-501, 1972

77. Shaham S., Horvitz H.R. Developing Caenorhabditis elegans neurons may contain both cell-death protective and killer activities Genes and Development, Vol. 10, pp. 578-591, 1996

78. Shaw J.M., Nunnari J. Mitochondrial dynamics and division in budding yeast Trends Cell Biol., Vol. 12, pp. 178-184,2002

79. Sherwood S.W., Sheridan J.P., Schimke R.T. Induction of apoptosis by the anti-tubulin drug colcemid: relationship of mitotic checkpoint control to the induction of apoptosis in HeLa S3 cells Exp. Cell Res., Vol. 215, pp. 373-379, 1994

80. Shi Y., Glynn J.M., Guilbert L.J., Cotter T.G., Bissonnette R.P., Green D.R. Role for c-myc in activation-induced apoptotic cell death in T cell hybridomas Science, Vol. 257, pp. 212-214, 1992

81. Siegel R.M., Martin D.A., Zheng L., Ng S.Y., Bertin J., Cohen J., Lenardo M.J. Death-effector filaments: novel cytoplasmic structures that recruit caspases and trigger apoptosis The Journal of Cell Biology, Vol. 141, pp. 12431253,1998

82. Smirnova E., Griparic L., Shurland D.L., van der Bliek A.M. Dynamin-related protein Drpl is required for mitochondrial division in mammalian cells Mol. Biol. Cell, 12:2245-2256,2001

83. Smirnova E., Shurland D.L., Ryazantsev S.N., van der Bliek A.M. A human dynamin-related protein controls the distribution of mitochondria J Cell Biol. 143:351-358, 1998

84. Song Q., Wei Т., Lees-Miller S., Alnemri E., Watters D., Lavin M.F. Resistance of actin to cleavage during apoptosis Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, pp. 157-162,1997

85. Sperandio S., de Bell I., Bredesen D.E. An alternative, nonapoptptic form of programmed cell death Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol.97, pp. 14376-14381, 2000

86. Sulston J.E., Schierenberg E., White J.G., Thomson J.N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans Dev Biol., Vol. 100, # 1, pp. 64119,1983

87. Taylor E.W. The mechanism of colchicines inhibition of mitosis J. Cell Biol., Vol. 25, pp. 145-160,1965

88. Tessitore L., Tomasi C., Greco M. Fasting-induced apoptosis in rat liver is blocked by cycloheximide Eur. J. Cell Biol., 78(8), pp. 573-579, 1999

89. Thompson C.B. Apoptosis in pathogenesis and treatment of disease Science, Vol. 267, pp. 1456-1462,1995

90. Thornbery N.A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within Science, Vol. 281, pp. 1312-1316, 1998

91. Tsujimoto Y., Shimizu S. Bcl-2 family: Life-or-death switch FEBS Letters, Vol. 466, pp. 6-10,2000

92. Vaux D.L. CED-4 — the third horseman of apoptosis Cell, Vol. 90, pp. 389-390,1997

93. Wallach D., Boldin M., Varfolomeev E., Beyaert R., Vandenabeele P., Fiers W. Cell death induction by receptors of the TNF family: towards a molecular understanding FEBS Letters, Vol. 410, pp. 96-106,1997

94. White K., Grether M.E., Abrams J.M., Young L., Farrell K., Steller H. Genetic control of programmed cell death in Drosophila Science, Vol. 264, pp. 677-683,1994

95. Williams G.T. Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis Cell, Vol. 65, pp. 1097-1098,1991

96. Wilson K.P., Black J.A., Thomson J.A., Kim E.E., Griffith J.P., Navia M.A., Murcko M.A., Chambers S.P., Aldape R.A., Raybuck S.A., et al. Structure and mechanism of interleukin-ip-converting enzyme Nature, Vol. 370, pp. 270-275, 1994

97. Wright M.M., McMaster C.R. Phospholipid synthesis, diacylglycerol compartmentation, and apoptosis Biol. Res., Vol. 35, pp. 223-229,2002

98. Wyllie A.H., Kerr J.F.R., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis International Review of Cytology, Vol. 68, pp. 251-300,1980

99. Xue D., Horvitz H.R. Caenorhabditis elegans CED-9 protein is a bifunctional cell-death inhibitor Nature, Vol. 390, pp. 305-308, 1997

100. Zhivotovsky В., Orrenius S., Brustugun O.T., Doskeland S.O. Injected cytochrome с induces apoptosis Nature, Vol. 391, pp. 449-450, 1998

101. Ziegler A., Jonason A.S., Leffell D.J., Simon J.A., Sharma H.W., Kimmelman J., Remington L., Jacks Т., Brash D.E. Sunburn and p53 in the onset of skin cancer Nature, Vol. 372, pp. 773-776, 1994

102. Албертс Б. и др. "Молекулярная биология клетки" Том 1, стр. 256, Москва, "Мир", 1994

103. Алов И.А. "Цитофизиология и патология митоза", М.: Медицина, 1972

104. Анисимов А.П., Токмакова Н.И., Ушева JI.H. Пролиферация и рост кишечного эпителия в постнатальном онтогенезе. Сообщение 3. Аномалии митозов, изменение плоидности и размеров ядер Онтогенез, Том 5, стр. 43-52,1974

105. Бродский В.Я., Урываева И.В. "Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка", М: Наука, стр. 259,1981

106. Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Ультраструктура митотического аппарата метафазных клеток в ткани СПЭВ после прекращения действия 2-меркаптоэтанола Цитология, Том 26, стр. 10951102,1984

107. Галактионов В.Г. "Иммунология" Москва, "Мир" стр. 179-181,1998

108. Зиновкина JI.A., Надеждина Е.С. Белки центросомы Биохимия, Том 61, стр. 1347-1361, 1996

109. Зыбина Е.В., Грищенко В.А. Полиплоидные клетки трофобласта в различных отделах плаценты белой крысы Цитология, Том 12, стр. 585595, 1970120. "Культура животных клеток. Методы" стр. 19, Москва, "Мир", 1989

110. Леван А., Бизеле Дж. Изучение роли хромосом в канцерогенезе. В кн.: Генетика рака. М., стр. 273,1961

111. Лейтин В.Л., Лерман М.И. Кинетика синтеза полипептидной цепи in vitro: эффект ингибирования трансляции Биохимия, том 40, №5, стр. 10601069,1975

112. Новичкова Е.А., Онищенко Г.Е., Штиль А.А. Деполимеризация микротрубочек винкристином вызывает гибель клеток при переходе из К-митоза в интерфазу ДАН, Том 12,2003

113. Онищенко Г.Е. "Центриолярный и центросомный циклы при дифференцировки и патологии" М: Наука, 1993125. "Справочник биохимика", стр. 232, Москва, "Мир", 1991

114. Струве М. Е., Ченцов Ю. С. Действие циклогексимида на ультраструктуру и некоторые метаболические процессы клеток92культуры СПЭВ. Сообщение 1 Цитология и генетика, том 11, №5, стр. 409418, 1977

115. Филиппова Г.Н., Спитковский Д.Д., Бойков П.Я., Алесенко А.В. Экспрессия онкогенов в печени крыс в условиях разобщения матричных биосинтезов сублетальными дозами циклогексимида Молекулярная биология, том 23, Вып. 3, стр. 843-850, 1989

116. Ходяков A.J1., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Распределение хромосом и центриолей в трехполюсных метафазах, индуцированных 2-меркаптоэтанолом в культуре клеток китайского хомячка ДАН СССР, Том 290, № 1, стр. 225-227, 1986

117. Ходяков А.Л., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Спонтанное слияние бесцентриолярных клеток, образующихся в результате трехполюсного митоза в культуре клеток Цитология, Том 12, стр. 1242-1245,19881. ИЛЛЮСТРАЦИИ«

118. Рис. 1 Культура FAF28. Обработка циклогексимидом 7 ч. Окраска гематоксилином и эозином. Стрелками указаны апоптотические клетки