Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гладилина, Юлия Алексеевна

• Гладилина, Юлия Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гладилина, Юлия Алексеевна

Список сокращений

Введение

1. Аспарагиназа как противолейкозный препарат (обзор литературы)

1.1. Бактериальные аспарагиназы и история их изучения

1.2. Структурно-функциональные особенности аспарагиназы

1.3. Физико-химические свойства

1.4. Гидролиз аспарагина определяет противоопухолевое действие аспарагиназы

1.5. Глутаминазная активность - основная причина токсичности аспарагиназы

1.6. Современные терапевтические аспарагиназы

1.7. Актуальность разработки лекарственного препарата на основе аспарагиназы без глутаминазной активности

2. Материалы и методы

2.1. Генно-инженерные методы клонирования и экспрессии

2.2. Выделение рекомбинантного фермента методом 42 колоночной хроматографии

2.3. Физико-химическая характеристика аспарагиназы

2.3.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле

2.3.2. Изоэлектрофокусирование

2.3.3. Определение аспарагиназной активности 44 2.3.4.Определение концентрации белка. 45 2.3.5.0пределение температуры денатурации фермента 46 2.3.6.Определение стабильности фермента в растворе мочевины 46 2.3.7.Определение стабильности фермента при многократных циклах замораживания — оттаивания

2.4. Определение равновесных кинетических констант

2.5. Определение цитотоксической активности аспарагиназы

2.6. Определение перекрестной иммуноспецифичности аспарагиназ

2.6.1. Получение специфических поликлональных антител

2.6.2. Определение уровня выработки антител методом прямого иммуноферментного анализа (ИФА)

3. Результаты и обсуждение

3.1 Получение рекомбинантного штамма-продуцента НрА

3.1.1. Клонирование гена НрА

3.1.2. Оптимизация генетической конструкции для экспрессии НрА в клетках E.coli

3.1.3. Характеристика рекомбинантного штамма продуцента

3.1.4. Экспрессия рекомбинантной НрА

3.2. Выделение аспарагиназы НрА

3.3. Характеристика рекомбинантной НрА

3.3.1. Физико-химические свойства

3.3.2. Каталитические свойства

3.3.3. Цитотоксическая активность

3.3.4. Перектестная антигенность НрА и ЕсА 85 3.4. Возможности практического применения НрА

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование, экспрессия и характеристика L-аспарагиназы Helicobacter pylori с противоопухолевой активностью»

Данная работа посвящена одной из актуальнейших проблем современной биохимии, онкологии и медицины - созданию эффективных препаратов, подавляющих рост опухолевой клетки в результате целенаправленного воздействия на ее метаболизм. На сегодня единственным примером практического использования ферментов в онкотерапии является применение бактериальной аспарагиназы в схемах комбинированной химиотерапии острых лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулобластом (Narta U.K., 2007). В последнее время появились сообщения о попытках использования аспарагиназы для лечения острой миелобластной лейкемии (Perel Y., et al, 2002), болезни Ходжкина^ и не-Ходжкинской лимфомы (Kobrinsky N.L., et al, 2001), меланосаркомы и множественной миеломы (Wriston J.C., et al, 1985).

Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза; КФ 3.5.1.1.) катализирует гидролиз аспарагина с образованием аспарагиновой кислоты и иона аммония. Именно это свойство аспарагиназы и определяет ее противоопухолевое действие. При введении аспарагиназы в организм человека происходит снижение концентрации аспарагина в крови и тканевой жидкости. В лейкозных клетках, в отличие от нормальных тканей, активность аспарагинсинтазы снижена или полностью отсутствует. При снижении концентрации экзогенного аспарагина лейкозные клетки испытывают дефицит этой аминокислоты, происходит ингибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот, и, в конечном счете, гибель раковой клетки. Таким образом, достигается избирательная регрессия опухолевой ткани при аспарагиназной терапии.

Несмотря на большое число бактериальных аспарагиназ с установленным противоопухолевым действием, только два препарата аспарагиназы Escherihia coli (ЕсА) и Erwinia chrysanthemi (ErA) используются в клинической практике (Wriston J.C., et al, 1985). Широкий спектр функциональных нарушений, индуцированных применением аспарагиназы, включает в себя поражения печени и поджелудочной железы, панкреатит, тромбозы и эмболии, нейротоксичность и подавление иммунной системы. (Narta U.K., 2007). Осложнения аспарагиназной терапии снижают эффективность лечения, особенно в развивающихся странах, где обеспечение адекватной сопроводительной терапии является невозможным (Moola Z.B., et al, 1994).

Основной причиной токсичности аспарагиназы принято считать исчерпание внеклеточного глутамина вследствие частичной глутаминазной активности фермента. Kafkewitz и соавт. суммировали в своем обзоре результаты экспериментальных работ, которые показывают, что дефицит глутамина в организме заметно подавляет функцию иммунной системы, в то время как дефицит аспарагина такого действия не оказывает (Kafkewitz D., et al, 1983). Поэтому поиск новых аспарагиназ с низкой глутаминазной активностью является актуальной задачей медицинской биологии.

Получение низкотоксичной аспарагиназы является особенно необходимым у нас' в стране. В целях уменьшения потребности в сопроводительной терапии и трансфузиях компонентов крови современные отечественные протоколы лечения лейкозов предполагают отказ от высокодозной интенсивной химиотерапии. Напротив, разработанные оригинальные протоколы, как например "Москва - Берлин 91" (ОЛЛ-МБ 91), используют длительное, в течение нескольких месяцев, применение аспарагиназы в малых дозах (von Stackelberg A., et al, 1999). В связи с этим возникают новые требования к препарату аспарагиназы, главным из которых является его низкая токсичность. Применяемые в настоящее время терапевтические аспарагиназы, которые были введены в клиническую практику более 40 лет назад, не' удовлетворяют современным требованиям к этим препаратам.

Попытки сделать аспарагиназу менее токсичной традиционно предпринимаются двумя путями. Первый из них предполагает снижение глутаминазной активности направленным мутагенезом аминокислотных остатков, определяющих субстратную специфичность фермента. Глутаминазная активность наиболее удачного мутанта ЕсА N248A была снижена в 2 раза по сравнению с ферментом дикого штамма. (Derst С., et al, 2000). Однако аспарагиназная активность этого производного ЕсА также была снижена и при физиологических условиях составляла не более 12% от первоначальной. Кроме того, была нарушена термодинамическая стабильность каталитически активной конформации. В целом, довольно сложно прогнозировать терапевтический эффект этого производного, а исследование биологического действия ЕсА N248A так и не было проведено.

Второй подход, состоящий в поиске новых аспарагиназ с ^низкой глутаминазной активностью, и был реализован в данной работе.

Цель данного исследования состояла в разработке метода получения рекомбинантной аспарагиназы Helicobacter pylori и характеристике ее терапевтически значимых свойств.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Клонирование и экспрессия гена НрА в клетках E.coli. Получение рекомбинантного штамма-продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрессию НрА.

2. Разработка лабораторного способа выделения гомогенного препарата НрА, пригодного для создания на его основе крупномасштабного метода получения фермента.

3. Характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА.

4. Определение цитотоксической активности НрА по отношению к клеткам лейкозов человека.

5. Сравнение антигенности НрА и основной терапевтической аспарагиназы ЕсА.

Научная новизна работы, прежде всего, состоит в выделении и характеристике новой бактериальной аспарагиназы. Впервые клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма Helicobacter pylori, получен рекомбинантный штамм E.coli, продуцирующий НрА. Разработаны оптимальные условия экспрессии, разработан простой и эффективный способ очистки, что позволило впервые получить гомогенный препарат НрА. Проведена детальная характеристика физико-химических и каталитических свойств НрА. Определены кинетические константы гидролиза основных физиологических субстратов НрА - аспарагина и глутамина. Показано, что глутаминазная активность фермента не превышает 0,01% от аспарагиназной активности. Установлено, что НрА обладает высокой цитотоксической активностью в отношении клеток острого лимфобластного лейкоза MOLT-4, лимфомы Беркитта Raji, а также хронического миелоидного лейкоза К-562. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апопотоза. Установлено, что НрА иммунохимически отлична от аспарагиназы E.coli.

Практическая ценность результатов данной работы главным образом состоит в их применении для разработки нового противолейкозного препарата. Острый лимфобластный лейкоз является самым частым онкологическим заболеванием в педиатрии. На его долю приходится более 30% всех опухолей у детей (Павлова М.П., 1996). Ежегодно в России регистрируют до 3000 новых случаев этого заболевания (Кривошеина E.JL, 2005). Установленные в данной работе свойства НрА обеспечат лекарственному препарату на его основе ряд существенных преимуществ перед современными терапевтическими аспарагиназами: (а) низкая токсичность позволит избежать развития множества побочных эффектов, типичных для аспарагиназной терапии; (б) низкая себестоимость его производства как рекомбинантного фермента уменьшит стоимость лечения; (в) отличная от ЕсА антигенность НрА указывает на возможность использования фермента для заместительной аспарагиназной терапии. Учитывая, что в нашей стране аспарагиназа никогда не производилась, результаты данной работы представляют интерес в качестве основы для создания первого отечественного препарата для лечения различных форм лейкозов.

Диссертационная работа построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», раздела «Результаты исследования и их обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы, включающего 147 источников. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гладилина, Юлия Алексеевна

Выводы

1. Клонирован ген периплазматической аспарагиназы из штамма Н. pylori. Получен рекомбинантный штамм E.coli, устойчиво продуцирующий каталитически активную НрА.

2. Разработана лабораторная процедура очистки НрА, которая является пригодной для промышленного крупномасштабного получения рекомбинантной аспарагиназы и обеспечивает выход активного фермента более 60%.

3. Проведена характеристика терапевтически значимых физико-химических и каталитических свойств НрА. Фермент имеет широкий оптимум рН и характеризуется высокой стабильностью при денатурирующих условиях. Удельная аспарагиназная активность при физиологических условиях составляет 94 МЕ/мг, что значительно превышает глутаминазную активность 0,0083 МЕ/мг.

4. Установлено, что НрА эффективно подавляет рост клеток острой лимфобластной лейкемии MOLT-4, лимфомы Беркита Raji и хронического миелоидного лейкоза К562. Определены соответствующие значения LC50. Показано, что НрА вызывает гибель лейкозной клетки по механизму апоптоза.

5. Показано, что антигенность НрА отличается от антигенности основной терапевтической аспарагиназы из штамма Е. coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гладилина, Юлия Алексеевна, 2008 год

1. Aghaiypour K., Wlodawer A, Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-Asparaginase Biochemistry, 2001, vol. 40, pp. 5655-5664.

2. Apostolidou E., Swords R., Alvarado Y., Giles F.J., Treatment of acute lymphoblastic leukaemia: a new era. (2007) Drugs, 67, 2153-2171.

3. Arens A., Rauenbusch E., Irion E., Wagner O., Bauer K., Kaufmann W. Isolation and properties of L-asparaginases from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1970 Feb; 351(2): 197-212.

4. Aslanian A.M., Fletcher B.S., Kilberg M.S. Asparagine synthetase expression alone is sufficient to induce 1-asparaginase resistance in MOLT-4 human leukaemia cells. Biochem J. 2001 Jul 1; 357(Pt l):321-8.

5. Aung, H. P., Bocola, M., Schleper, S., and Ro"hm, K.-H. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1481, 349-359.

6. Azuma Т., Kato S., Zhou W., Yamazaki S., Yamakawa A., Ohtani M., Fujiwara S., Minoura Т., Iinuma K., Kato T. Diversity of vacA and cagA genes of Helicobacter pylori in Japanese children. Aliment Pharmacol Ther. 2004 Jul;20 Suppl 1:7-12.

7. Bendtsen J. D., Nielsen H., von Heijne G. and Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol., 340:783-795, 2004.

8. Bonekamp F. and Jensen K. F. (1988) The AGG codon is translated slowly in E.coli even at very low expression levels. Nucleic Acids Res. 16, 3013-3024.

9. Callow D.S., Capell B.J., Evans C.G. Experimental continuous culture production of the enzyme L-asparaginase by Erwinia carotovora. J Gen Microbiol. 1971 Mar; 65(3).

10. Cammack K.A., Marlborough D.I., Miller D.S. Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora // Biochem J., 1972, vol. 126(2), pp. 361-79.

11. H.Carstens C.P., Waesche A. "Codon Bias-Adjusted BL21 Derivatives for Protein Expression" Strategies Newsletters (Stratagene) May 1999; vol. 12 #2 pg. 49-51

12. Cedar H. & Schwartz J.H., (1967). Localization of the two L-asparaginases in anaerobically grown Escherichia coli. J. Biol. Chem. 242, 3753-3755.

13. Cedar H. & Schwartz J.H., (1968) Production of L-asparaginase II by Escherichia coli. J Bacteriol 96, 2043-2048.

14. Chabner B.A. Cancer Chemotherapy: Principles and practice. Chabner B.A. and Collins J.M. eds., Philadelphia, Lippincote, 1990, p. 545.

15. Clavell L.A., Gelber R.D., Cohen H.J., et al. Four-agent induction and intensive asparaginase therapy for treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. N. Engl. J. Med., 1986, vol. 315(11), pp. 657-663.

16. Derst C., Henseling J., Rohm K.H. Probing the role of threonine and serine residues of E. coli asparaginase II by site-specific mutagenesis. // Protein Eng., 1992, vol. 5, pp. 785-789.

17. Derst С., Wehner A., Specht V., Rohm K.H. States and functions of tyrosine residues in Escherichia coli asparaginase II. Eur J Biochem. 1994 Sep 1; 224(2):533-40.

18. Derst C., Henseling J., Rohm KH. Engeneering the substrate specificity of Escherichia coli asparaginase II. Selective reduction of glutamiase activity by amino acid replacements at position 248. Protein Science, 2000, vol. 9(10), pp. 2009-2017.

19. Distasio J.A., Niederman R.A., Kafkewitz D., and Goodman D., (1976) J. Biol. Chem. 251,6929-6933.

20. Distasio J.A., Salazar A.M., Nadji M., Durden D.L. Glutaminase-free asparaginase from vibrio succinogenes: an antilymphoma enzyme lacking hepatotoxicity. Int J Cancer. 1982 Sep 15;30(3):343-7. No abstract available. (1982) Int. J. Cancer 30, 343-347.

21. Dhar S.K., Soni R.K., Das B.K., Mukhopadhyay G. Molecular mechanism of action of major Helicobacter pylori virulence factors. Mol Cell Biochem. 2003 Nov;253(l-2):207-15.

22. Dunlop P.C., Meyer G.M., Ban R.J. Characterization of two forms of asparaginase in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem., 1978, vol. 253(4), p. 1297-1304.

23. Dunlop P.C., Meyer G.M., Roon R.J. Nitrogen catabolite repression of asparaginase II in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacterid., 1980, vol. 143(1), p. 422-426

24. Elitsur Y., Yahav J. Helicobacter pylori infection in pediatrics. Helicobacter. 2005; 10 Suppl 1:47-53.

25. Feinberg W.M., Swenson M.R., Cerebrovascular complications of L-asparaginase therapy. Neurology, 1988, vol. 38, pp. 127-133.

26. Filpula D., Nagle J.W., Pulford S., Anderson D.M. Sequence of L-asparaginase gene from Erwinia chrysanthemi NCPPB 1125. Nucleic Acids Res. 1988 Nov 11; 16(21): 10385.

27. Fine B.M., Kaspers G.J., Ho M., Loonen A.H., Boxer L.M. A genome-wide view of the in vitro response to 1-asparaginase in acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res. 2005 Jan l;65(l):291-9.

28. Gouet P., Courcelle E., Stuart D.I. & Metoz F., (1999) ESPript: analysis of multiple sequence alignments in PostScript. Bioinformatics 15, 305-308.

29. Guo Q.L., Wu M.S., Chen Z. Comparison of antitumor effect of recombinant L-asparaginase with wild type one in vitro and in vivo. Acta Pharmacol Sin. 2002 Oct; 23(10):946-51.

30. Goward C.R., Tattersall R., Atkinson T. Bioseparation, 1992, vol. 2(6), pp. 335341.

31. Hartree E.F. Anal. Biochem. 1991, vol. 192, pp. 215-218.

32. Haskell C.M. ed. Cancer Treatment 3 rd ed. Philadelphia: W.B Saunders Co. 1980, 130 p.

33. Herrmann V., Rohm K.H., Schneider F. On the substrate specificity of L-asparaginase from E. coli. FEBS Lett. 1974 Feb 15; 39(2):214-7.

34. Ho D.H., Whitecar J.P. Jr, Luce J.K., Frei E. L-asparagine requirement and the effect of L-asparaginase on the normal and leukemic human bone marrow. Cancer Res. 1970 Feb;30(2):466-72.

35. Jameel F., Bogner R., Mauri F., Kalonia D. Investigation of physicochemical changes to L-asparaginase during freeze-thaw cycling. J Pharm Pharmacol., 1997, vol. 49 (5), pp. 472-477.

36. Jennings M.P., Beacham I.R. Analysis of the Escherichia coli gene encoding L-asparaginase II, ansB, and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins. J Bacteriol. 1990 Mar;172(3):1491-8.

37. Kafkewitz'D, Bendich A. Enzyme-induced asparagine and glutamine depletion and immune system function. (1983) Am J Clin Nutr. 37,1025-30.

38. Kane J.F., (1995) Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 494-500

39. Keefer J.F., Moraga D.A., Schuster S.M. Comparison of glycine metabolism in mouse lymphoma cells either sensitive or resistant to L-asparaginase. Biochem. Pharmacol. 1985. 34, 559-565.

40. Kitto G.B., Smith G., Theit Т.О. et al. Tumor inhibitory and non-inhibitory L-asparaginase from Ps. Geniculata. J. Bacteriol., 1979, vol. 137(1), pp. 204-212.

41. Kobs G., (1997) Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM®-T Vector Systems. Promega Notes 62, 15.

42. Rohm K.H., Schneider F. Kinetic studies on the mechanism of asparaginase from E. coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1971 Dec; 352(12):1739-43

43. Kozak M, Borek D, Janowski R, Jaskolski M. Crystallization and preliminary crystallographic studies of five crystal forms of Escherichia coli L-asparaginase II (Asp90Glu mutant).Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2002 Jan;58(Pt 1): 130-2

44. Kozak M, Jaskolski M, Rohm KH. Preliminary crystallographic studies of Y25F mutant of periplasmic Escherichia coli L-asparaginase.Acta Biochim Pol. 2000;47(3):807-l 4

45. Krasotkina J., Borisova A., Gervaziev Y., Sokolov N. One step purification and kinetic properties of the recombinant L-asparaginase from Erwinia carotovora.Biotechnol. Appl. Biochem., 2004, vol. 39(2), pp.215-221.

46. Kristiansen Т., Einarson M., Sundberg L., Porath J. Purification of L-asparaginase from E. coli by specific adsorption and desorbtion // FEBS Lett., 1970, vol. 7, p. 294-298.

47. Laboureur P., Langlois C., Labrousse M. et al. L-asparaginases d' Escherichia coli. 1. Proprietes des formes natives. Biochimie, 1971, vol. 53(11/12), pp. 11471156.

48. Law A.S., Wriston J. Purification and properties of Bacillus coagulans L-asparaginase // Arch. Biochem. Blophys., 1971, vol. 147(2), p. 744-752.

49. Lee S.M., Wroble M.H., Ross J.T. Large-scale recovery and purification of L-asparaginase from Erwinia carotovora. Appl. Biochem. Biotechnol., 1986, vol. 12, pp. 229-246.

50. Lee S.M., Wroble M.H., Ross J.T. L-asparaginase from Erwinia carotovora. An improved recovery and purification process using affinity chromatography. Appl. Biochem. Biotechnol. 1989, vol. l,pp. 1-11.

51. Lubkowski J., Palm G.J., Gilliland G.L., Derst C., Ro"hm K.H., Wlodawer A., (1996) Eur. J. Biochem. 241, 201-207.

52. Lubkowski J., Wlodawer A., Ammon H.L., Copeland T.D., Swain A.L. Structural characterization of Pseudomonas 7A glutaminase-asparaginase // Biochemistry, 1994, vol. 33, pp. 10257-10265, (a).

53. Magalhaes Queiroz D.M., Luzza F. Epidemiology of Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 2006 Oct; 11 Suppl 1:1-5.

54. Maita Т., Matsuda G. The primary structure of L-asparaginase from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1980;361(2):105-17

55. Manson S.D., Mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma. Semin Oncol Nurs. 2006 May; 22(2):73-9

56. Marais A., Mendz G.L., Hazell S.L., Megraud F. Metabolism and genetics of Helicobacter pylori: the genome era. Microbiol Mol Biol Rev. 1999 Sep; 63(3):642-74.

57. Mashburn L.T., Wriston J.C., Jr. Change in ribonuclease concentrations in L~ asparaginase-treated lymphosarcomata. Nature. 1966 Sep 24; 211(5056): 1403-4.

58. Mashburn L.T., Wriston J.C., Jr. Tumor inhibitory effect of L-asparaginase from Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 1964 May; 105: 450-2.

59. Meister A., Levintow L., Greenfield R.E., Abendschein P.A. Hidrolysis and transfer reaction catalyzed by omega-amidase preparation // J. Biol. Chem., 1955, vol. 215, pp. 441-447.

60. Meister, A. (1955) Methods in Enzymology II, pp. 380-385, Academic Press, New York

61. Miller M, Rao J.K.M., Wlodawer A. and Gribskov M.R., (1993) FEBS Lett. 328, 275-279.

62. Moayyedi P, Soo S, Deeks J, Delaney B, Harris A, Innes M, Oakes R, Wilson S, Roalfe A, Bennett C, Forman D. Eradication of Helicobacter pylori for non-ulcer dyspepsia. Cochrane Database Syst Rev. 2006 Apr 19;(2):CD002096.

63. Moayyedi P, Forman D, Duffett S, Mason S, Brown J, Crocombe W, Feltbower R, Axon A; Leeds HELP Study Group. Association between Helicobacter pylori infection and adult height. Eur J Epidemiol. 2005; 20(5):455-65.

64. Moola Z.B., Scawen M.D., Atkinson T. and Nicholls D.J. (1994) Erwinia chrysanthemi L-asparaginase: epitope mapping and production of antigenically modified enzymes. Biochem. J., 302, 921-927

65. Muller H.J., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 1998, vol. 28, pp. 97-113.

66. Nakamura N., Fujio Т., Tanaka M. On the productivity and properties of L-asparaginase from Escherichia coli A-1-3 // Agr. Biol. Chem., 1972, vol. 36(12), p. 2251-2253

67. Nalepka E.R., McCue B.A., Norton S.J. Regulation of L-asparaginase in Lactobacillus plantarum // Texas J. Sci., 1981, vol. 33(2/4), p. 87-101.

68. Narta U.K., Kanwar S.S., Azmi W. Pharmacological and clinical evaluation of l-asparaginase in the treatment of leukemia. (2007) Crit Rev Oncol Hematol. 61, 208-221

69. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., Gvon Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10:1-6, 1997.

70. North A.C., Wade H.E., Cammack K.A. Physicochemical studies of L-asparaginase from Erwinia carotovora. Nature. 1969 Nov 8; 224(5219):594-5.

71. Palm G.J., Lubkowski J., Derst C., Schleper S., Rohm K.H., Wlodawer A. A covalently bound catalytic intermediate in Escherichia coli asparaginase: crystal structure of a Thr-89-Val mutant // FEBS Lett., 1996, vol. 390, pp. 211-216.

72. Pastan I., Perlman R. Cyclic adenosine monophosphate in bacteria. Science. 1970 Jul 24; 169(943):339-44.

73. Peek R.M. Jr. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection. Springer Semin Immunopathol. 2005 Sep; 27(2): 197-215.

74. Peterkofsky A., Gazdar C. Glucose inhibition of adenylate cyclase in intact cells of Escherichia coli B. Proc Natl Acad Sci USA. 1974 Jun; 71(6):2324-8.

75. Pritsa A.A., Papazisis K.T., Kortsaris A.H., Geromichalos G.D., Kyriakidis. Antitumor activity of L-asparaginase from Thermus thermophilus. Anticancer Drugs. 2001 Feb; 12(2): 137-42.

76. Rieder G, Fischer W, Haas R. Interaction of Helicobacter pylori with host cells: function of secreted and translocated molecules. Curr Opin Microbiol. 2005 Feb; 8(l):67-73.

77. Roberts J., Schmid F.A., Rosenfeld H.J. Biologic and antineoplastic effects of enzyme-mediated in vivo depletion of L-glutamine, L-tryptophan, and L-histidine. Cancer Treat Rep. 1979 Jun;63(6):l 045

78. Roberts J., Holcenberg J.S., and Dolowy W.C., (1972) J. Biol. Chem. 247, 8490.

79. Rohm K.H., and Van Etten, R. L. (1986) Arch. Biochem. Biophys. 244, 128136.

80. Schmid F.A., Roberts J. Antineoplastic and toxic effects of Acinetobacter and Pseudomonas glutaminase-asparaginases. Cancer Chemother. Repp., 1974, vol. 58, pp. 829-840.

81. Schwartz J.H., Reeves J.Y., Broome J.D. Two L-asparaginases from E. coli and their action against tumors. Proc Natl Acad Sci USA. 1966 Nov; 56(5): 15169.

82. Schwartz J.H. Asparaginase II of Escherichia coli: Bacterial physiology and enzymatic mechanism of action // In: Intern, symp. L-asparaginase. Paris, 1970, N 197, p. 79-85.

83. Shifrin S., Parrott C.L., Luborsky S.W. Substrate binding and intersubunit interactions in L-asparaginase. J Biol Chem. 1974 Mar 10; 249(5): 1335-40.

84. Spring K.J., Jerlstrom P.G., Burns D.M. & Beacham I.R. (1986). L-Asparaginase genes in Escherichia coli: isolation of mutants and characterization of the ansA gene and its protein product. J. Bacteriol. 166, 135-142

85. Stingl K., De Reuse H. Staying alive overdosed: how does Helicobacter pylori control urease activity? Int J Med Microbiol. 2005 Sep; 295(5):307-l 5.

86. Story M.D., Voehringer D.W., Stephens L.C., Meyn R.E. L-asparaginase kills lymphoma cells by apoptosis. Cancer Chemother. Pharmacol., 1993, vol. 32, pp. 129-133.

87. Swain A.L., Jaskolski M., Housset D., Rao J.K.M., Wlodawer A. Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, pp. 1474-1478.

88. Taguchi T. Recent advances in L-asparaginase studies. Gan To Kagaku Ryoho., 1988, vol. 15, pp. 1815-1825.

89. Taylor C.W., Dorr R.T., Fanta P., Hersh E.M., Salmon S.E. A phase I and pharmacodynamic evaluation of polyethylene glycol-conjugated L-asparaginase in patients with advanced solid tumors. Cancer Chemother. Pharmacol., 2001. vol. 47(1), pp. 83-88.

90. Tytgat G.N., Rauws E.A., De Koster E. Campylobacter pylori. Scand J Gastroenterol Suppl. 1988; 155:68-81.

91. Ueno Т., Ohtawa K., Mitsui K., Kodera Y., Hiroto M., Matsushima A., Inada Y., Nishimura H. Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. Leukemia, 1997, vol. 11, pp. 1858-1861.

92. Wade H.E. Synthesis and functions of microbial asparaginases and glutaminases. // In Payne, J.W. (Ed.), Microorganisms and Nitrogen Sources, Wiley, Chichester, 1980, p. 563-575.

93. Warrell R.P. Jr, Arlin Z.A., Gee T.S., Chou T.C., Roberts J., Young C.W., Clinical evaluation of succinylated Acinetobacter glutaminase-asparaginase in adult leukemia.Cancer Treat Rep. 1982 Jul;66(7): 1479-85.

94. Willis R.C. & Woolfolk C.A. (1974) Asparagine utilization in Escherichia coli. J Bacteriol 118, 231-241.

95. Wriston J.C. Asparaginase. Methods Enzymol., 1985. 113, 608-618.

96. Yun M.K., Nourse A., White S.W., Rock C.O. & Heath R.J. (2007) Crystal structure and allosteric regulation of the cytoplasmic Escherichia coli L-asparaginase I. J Mol Biol 369, 794-811

97. Zhou M.-Y., Clark S.E. and Gomez-Sanchez C.E., (1995) Universal cloning method by ТА strategy. BioTechniques 19, 34.

98. Борисова A.A. Рекомбинантная L-аспарагиназа Erwinia carotovora: разработка способа выделения гомогенного препарата фермента и его свойства. Дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. М., 2003, 127с.

99. Гершанович В.Н. Репрессия катаболитами в бактериальной клетке // Успехи совр. Биологии, 1970, т. 69(1), с. 49-71.

100. Гершанович В.Н. Роль циклического аденозин-3',5'-монофосфата в регуляции транкрибирования бактериальных генов // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1977, № 3, с. 429-439.

101. Доман Н.Г., Феденко Е.П. Биологическая роль АМФ // Успехи биол. химии., 1976, т. 17, с. 63-101.

102. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. // Справочник биохимика, с. 465-466. Пер. с англ. М.: Мир, 1991.

103. Красоткина Ю.В., Соколов Н.Н. Структура и функции бактериальной аспарагиназы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. В печати. 2008

104. Кривошеина Е.Л., Бельченко Д.И. Особенности некоторых клинико-лабораторных показателей в зависимости от течения и исходов острого лимфобластного лейкоза у детей. // Педиатрия, 2005, №3 С.40-43.

105. Ленинджер А. Основы биохимии. М., Мир, 1985, с. 233-235.

106. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Соколов Н.Н., Козлов Е.А., Куцман М.Е Выделение и свойства гомогенного препарата L-аспарагиназы из Pseudomonas fluorescens АГ // Биохимия, 1975, т. 40(5), с. 984-989.

107. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. //Экспериментальная биология. Пер. с англ. М.: Мир, 1967.

108. Озолинь Р.К., Гривиня П.П., Савенкова Л.Ф. и др. Аспарагиназа и сериндегидратаза микроорганизмов: Продуценты, регуляция и свойства // Рига, Зинатне, 1985, 150 с.

109. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами, М. «Наука», 1983. с. 304

110. Павлова М.П. Гематологические болезни у детей, п/ред. М.П. Павловой. (1996), Учебн. Пособие, Минск, 440с.

111. Свежова Н.В., Шаркова В.Е., Громов Д.Б., Головаченко В.А., Полынцев Д.Г. Методы математической обработки данных в иммуноферментном анализе. // Клиническая лабораторная диагностика, 2008, №1, С.3-17.

112. Соколов Н.Н., Занин В.А., Александрова С.С. Бактериальные L-аспарагиназы и глутамин(аспарагин)азы: некоторые свойства, строение и противоопухолевая активность // Вопр. мед. химии., 2000, т. 46(6), с. 531-548.

113. Соколов Н.Н., Эльдаров М.А., Сидорук К.В., Жгун А.А., Борисова А.А., Александрова С.С., Омельянюк Н.М., Богуш В.Г., Красоткина Ю.В., Гервазиев Ю. В., Покровская М.В., Соков Б.Н., Березов Т.Т., Скрябин К.Г.,

114. Арчаков А.И. Разработка противоопухолевого препарата рекомбинантной L-аспарагиназы Erwinia carotovora. // Молекулярная медицина №1 2005 С. 4553.

115. Тимаков A.M., Кондратчик K.JL, Тиганова О.А. Пегилированная форма аспарагиназы альтернатива нативной Е. coli аспарагиназы? // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии, 2003, т.2, №4, с. 9296.

116. Тимаков A.M., Кондратчик K.JL, Хондкарян Г.Ш., Муторова О.Ю., Ковалева O.JI. Препараты L-аспарагиназы в лечении острого лимфобластного лейкоза у детей. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопаталогии в педиатрии, 2003,т.2, №3, с. 90-93.