Оценка качества и эффективности биологически активных добавок с коэнзимом Q10 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 15.00.02, доктор фармацевтических наук Каленикова, Елена Игоревна

• Каленикова, Елена Игоревна
• доктор фармацевтических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор фармацевтических наук Каленикова, Елена Игоревна

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История открытия и изучения коэнзима

Биосинтез коэнзимов (}.

Биохимические функции коэнзимов <3.

Физико-химические свойства коэнзимов (2.

Методы определения коэнзимов

Электрохимические методы.

Спектрофотометрические методы.

Хроматографические методы со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием.

Высокоэффективная жидкостная хроматографии с массспектрометрическим детектированием.

Способы пробоподготовки биологических объектов.

Сердечно-сосудистые заболевания и коэнзим С?ю.

Фармакокинетика коэнзима (^ю.

Абсорбция и транспорт.

Эндогенные уровни в тканях.

Захват коэнзима <310 тканями.

Фармакокинетические параметры коэнзима (^ю.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. Качественное и количественное определения коэнзимов <2 и а-токоферола в составе БАД и биоматериале с применением ВЭЖХ-ЭХ.

1.1. Разработка ВЭЖХ-методики определения коэнзима СЬ0 в составе БАД серии «Кудесан»: растворе «Кудесан», таблетках «Кудесан форте» и жевательных таблетках «Кудесан для детей».

1.2. Разработка ВЭЖХ-методики определения коэнзима СЬ0, коэнзима СЬ и а-токоферола в плазме крови, миокарде и головном мозге крыс.

1.3. Выводы.

ГЛАВА 2. Фармакокинетика коэнзима Qi0.

2.1. Фармакокинетика CoQionpii однократном введении внутрь порошка субстанции, раствора солюбилизированного CoQio и таблеток микрокапсулированного CoQ]0.

2.2. Содержание CoQio в плазме крови и миокарде крыс Wistar при хроническом введении внутрь солюбилизированного CoQio и после его отмены.

2.3. Выводы.

ГЛАВА 3. Определение уровня гидроксильных радикалов в миокарде крысы in vivo при патологических состояниях с применением ВЭЖХ.

3.1. Разработка ВЭЖХ-методики определения гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo с использованием микродиализа.

3.2. Оценка уровня гидроксильного радикала в гипертрофированном миокарде крыс с наследственно!! артериальной гипертензией (линия SHRSP).

3.3. Динамика уровня гидроксильного радикала в миокарде крысы при ишемии-реперфузии.

3.3.1. Влияние длительности ишемического эпизода на уровень

ОН* при реперфузии.

3.3.2. Оценка уровня ОН" и размера зоны некроза в гипертрофированном миокарде крыс линии SHRSP при ишемии-реперфузии.

3.3.3. Влияние ишемического прекондиционирования на размер зоны некроза и уровни ОН* при ишемии-реперфузии.

3.3. Выводы.

ГЛАВА 4. Определение уровней коэнзимов Q при патологических состояниях с применением ВЭЖХ и кардиопротекторные эффекты CoQio.

4.1. Уровни коэнзимов Q в плазме крови, миокарде и мозге спонтанно гипертензивных крыс.

4.2. Кардиопротекторный эффект CoQio при хроническом введении спонтанно гипертензивным крысам линии SHRSP.

4.3. Содержание коэнзимов Q в постинфарктном миокарде крыс Wistar и влияние CoQio при хроническом введении на размер постинфарктной зоны некроза и степень гипертрофии миокарда.

4.4. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оценка качества и эффективности биологически активных добавок с коэнзимом Q10»

Актуальность темы

Согласно существующим международным требованиям, сформулированным в документах Международной федерации фармпроизводителей и ассоциаций (www.fip.org), любое оригинальное и воспроизведенное лекарственное средство должно соответствовать следующим критериям: эффективность, безопасность, качество. Это в равной степени следует отнести и к БАД, требования к которым в современных условиях постоянно возрастают.

Надлежащий уровень качества обеспечивается соответствующим нормативным документом, отражающим как общие подходы к контролю качества и стандартизации, так и показатели, которые определяются предполагаемым медицинским применением лекарственного средства или БАД.

Достижения молекулярной биологии и биохимии открывают новые возможности лечения заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, с учетом патофизиологических механизмов, протекающих на уровне клеточных и субклеточных структур. В основе ведущих метаболических процессов лежат окислительно-восстановительные реакции. Среди них особую роль играют свободнорадикальные реакции, ведущие к образованию перекисных соединений. Активация процессов свободнорадикального окисления вследствие дисбаланса в системе «прооксиданты-антиоксиданты» и последующие изменения в клетках, тканях и системах организма получили название окислительного стресса. Следствием окислительного стресса являются повреждения важнейших биополимеров - нуклеиновых кислот,, белков, липидов, полиненасыщенных жирных кислот. Усиление деструктивных процессов при окислительном стрессе может являться патогенетическим фактором заболевания, даже не будучи основной причиной его развития.

Однако сегодня нет единого мнения- о биологической' роли окислительных реакций с участием свободных радикалов кислорода. Большинство исследователей считают активные формы кислорода важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Развитие патологических процессов связано с изменением клеточных программ, следовательно, развитие многих заболеваний определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов. Отношение к последним в современной научной литературе варьирует от полного игнорирования и даже отрицания до ожиданий излечения от всех болезней и продления жизни [9]. В таких случаях важнейшим критерием истины должна стать практика, но пока и она не дала однозначных ответов на многие вопросы.

Среди использующихся в медицинской практике наиболее перспективным антиоксидантом является убихинон (коэнзим СЫ, СоСЬо) - вещество эндогенной природы, обязательный компонент мембран митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, плазматических мембран. Коэнзим С>ю в митохондриях участвует в синтезе АТФ как переносчик электронов, сопрягающий процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования. В то же время, убихинон -единственный липидорастворимый антиоксидант, синтезирующийся в клетках животных и человека. Еще одно уникальное свойство СоСЬо - постоянная регенерация его окисленной формы с помощью ферментных систем организма и антиоксидантов неферментной природы - аскорбата, а-токоферола (а-ТОС), возвращающая ему антиоксидантную активность.

По результатам многих клинических исследований СоС^ю рекомендован в качестве дополнительной терапии при хронической сердечной недостаточности, кардиомиопатии, стенокардии, гипертонии, инфаркте миокарда, атеросклерозе; имеются данные о его эффективности при мигрени, болезни Паркинсона, латеральном амиотрофическом склерозе, астме, диабете, почечной недостаточности. Наибольшее число клинических исследований Со(Зю посвящено сердечной недостаточности, однако окончательный вывод о его эффективности при этом заболевании еще не сделан. Большинство, но не все полученные результаты свидетельствуют об эффективности добавления СоСНо к стандартной терапии. Объектом критики является небольшое число пациентов, включенных во все (кроме одного) клинические испытания. Как правило, при их проведении не контролировались уровни Сорю в крови до и после его приема. Актуально проведение дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на выявление препаратов, обладающих максимальной биодоступностью и способных пополнить эндогенные уровни в крови и сердечной мышце, а с другой - на более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия Сорю

В Японии, где было осуществлено первое клиническое применение СоСЬо, он вошел в национальную Фармакопею. На мировом фармацевтическом рынке СоС>1о повсеместно доступен в виде биологически активных добавок к пище, и лишь в нескольких странах - как активное вещество в составе лекарственных препаратов. Российский современный фармацевтический рынок изобилует предложениями СоС^ю-содержащих БАД зарубежного и отечественного производства. Широкая и навязчивая реклама БАД к пище, проводимая средствами массовой информации, приводит к росту их неконтролируемого потребления. Эта ситуация обязывает повышать уровень требований к безопасности и качеству биологически активных добавок, которые на сегодняшний день регламентируются техническими условиями в соответствии с требованиям «Руководства по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (Руководство Р 4.1.1672-03). Данный документ устанавливает «методы контроля ингредиентного состава и показателей качества и безопасности, которые применяются на этапах экспертизы и регистрации БАД, при разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и реализации на территории Российской Федерации, при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД».

На основании требований Руководства количественный анализ СоСЬо в БАД осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием по поглощению в ультрафиолетовой области спектра. Недостаточная чувствительность определения и условия- пробоподготовки ограничивают применение этой методики образцами с высоким содержанием СоСЬо, то есть лекарственными препаратами и БАД. Безопасность БАД на, основе СоСЬо контролируется по критериям, предъявлямым к продуктам питания: содержанию токсичных элементов (тяжелых металлов), пестицидов, и радионуклидов. Между тем, содержащиеся в БАД активные компоненты могут вызывать терапевтические эффекты и иметь побочные; вещества эндогенной природы при длительном приеме могут оказывать влияние на уровень их синтеза в тканях организма, приводя к формированию небезопасного эффекта отмены. Кроме того, Руководство не предусматривает стандартизации БАД и не требует подтверждения их фармакологической эффективности, что имеет первостепенное значение в случае медицинского применения.

Целью данного исследования явилась комплексная оценка качества и эффективности БАД, содержащих CoQio, для обоснования их применения в качестве кардиопротекторов.

Достижение поставленной цели осуществлялось последовательным решением следующих задач:

1. Разработать ВЭЖХ-методики определения CoQio в препаратах БАД «Кудесан» (растворе и таблетках) для оценки их качества и стандартизации.

2. Разработать ВЭЖХ-методики определения коэнзимов Q9, Qio и а-ТОС в тканях крыс (плазме/сыворотке крови, миокарде, головном мозге) для изучения тканевого содержания коэнзимов Q и а-ТОС, a также фармакокинетики БАД при однократном и хроническом введении.

3. Провести сравнительное изучение фармакокинетики OoQio у крыс после однократного введения внутрь порошка субстанции и различных БАД серии «Кудесан» (раствора и таблеток).

4. Изучить влияние БАД «Кудесан» при хроническом введении и после его отмены на содержание коэнзимов Q и а-ТОС в плазме крови и миокарде крыс.

5. Разработать методику определения уровня гидроксильных радикалов в ткани миокарда ш vivo с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием и микродиализа миокарда для оценки интенсивности окислительных процессов.

6. Определить уровень гидроксильных радикалов в гипертрофированном миокарде, крыс с наследственной5 артериальной гипертензией ис сердечной? мышце нормотензивных крыс в условиях острой транзиторной ишемии для выяснения обоснованности патогенетической антиоксидантной терапии;

7. Оценить уровни коэнзимов; Q и а-ТОС в плазме и гипертрофированном миокарде крыс различных возрастов с наследственной артериальной гипертензией и в постинфарктном ремоделированном миокарде нормотензивных крыс для патогенетического обоснования применения CoQio в качестве кардиопротектора. 8. Оценить кардиопротекгорные эффекты CoQio у крыс с наследственной артериальной гипертензией и у крыс Wistar с инфарктом миокарда.

Научная новизна

Разработаны методики определения CoQio в БАД (растворе солюбилизированной субстанции CoQio, таблетках микрокапсулированного CoQio), плазме крови, нервной ткани и миокарде, позволяющие одновременно проводить определение C0Q9 и а-ТОС, с применением ВЭЖХ с электрохимическим детектированием.

Изучена фармакокинетика CoQio в порошке субстанции, растворе солюбилизированной субстанции и таблетках микрокапсулированной субстанции. Доказаны фармакокинетические преимущества наноразмерных субстаций CoQi0. Для раствора солюбилизированного CoQio выявлена способность при хроническом введении внутрь повышать уровни в миокарде.

Обнаружен эффект отмены CoQ]0: падение его концентраций в миокарде через 2 недели после прекращения длительного введения per os.

Впервые проведена сравнительная оценка содержания коэнзимов Q9, Qw и а-ТОС в плазме крови, гипертрофированном миокарде и головном мозге крыс с наследственной артериальной гипертензией линий SHR и SHRSP различного возраста по сравнению с тканями нормотензивных животных. Выявлена взаимосвязь плазменных и миокардиальных уровней CoQio со степенью гипертрофии левого желудочка.

Впервые выявлено снижение содержания коэнзимов Q9, Qi0 и а-ТОС в гипертрофированном постинфарктном миокарде после хронической окклюзии коронарной артерии. Обнаружена сильная отрицательная корреляционная зависимость между размером инфаркта и концентрациями коэнзимов Q в плазме крови.

Разработана ВЭЖХ-методика определения гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, обладающая наибольшей чувствительностью из приведенных в литературе аналогов. Впервые выявлены повышенные уровни гидроксильного радикала в гипертрофированном миокарде крыс линии SHRSP по сравнению с нормальным миокардом и установлена их прямая взаимосвязь со степенью гипертрофии сердечной мышцы. Доказано усиление генерации гидроксильных радикалов во время эпизодов реперфузии ишемического прекондиционирования миокарда. Показано, что ишемическое прекондиционирование сокращает продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов в миокарде крысы после 30-минутной региональной ишемии, что может являться одной из причин многократного сокращения размера зоны повреждения.

Показан кардиопротекторный эффект CoQio при длительном введении внутрь на различных экспериментальных моделях гипертрофии миокарда: спонтанно гипертензивных крысах и крысах с хронической окклюзией коронарной артерии. Обнаружено, что выраженность эффекта взаимосвязана с концентрациями CoQio в плазме крови и миокарде.

Теоретическая и практическая значимость

Методики определения CoQio на основе ВЭЖХ могут использоваться для его количественного определения в различных композициях, применяемых в качестве БАД и лекарственных препаратов. Высокая чувствительность разработанной методики определения CoQio в биологических объектах позволяет применять ее для изучения фармакокинетики при проведении доклинических и клинических испытаний.

Методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани in vivo на основе микродиализа миокарда и ВЭЖХ предоставляет возможность экспериментальной прижизненной оценки окислительного статуса тканей. Возможность мониторинга тканевых уровней гидроксильного радикала позволяет в фармакологическом эксперименте оценивать on-line эффективность мер, направленных на ограничение генерации активных форм кислорода.

Доказана патогенетическая значимость усиленной генерации активных форм кислорода и сниженных миокардиальных уровней CoQio при сердечно-сосудистых заболеваниях, сопровождающихся гипертрофией сердечной мышцы. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях.

На различных моделях гипертрофии миокарда доказана кардиопротекторная эффективность СоРю. Полученные результаты являются теоретическим основанием для проведения клинического изучения Сорю и решения вопроса о создании лекарственных средств на его основе.

Впервые выявленный для СоРю эффект отмены требует пересмотра отношения к нему как абсолютно безопасному фармакологическому агенту. Возможность резкого снижения содержания СоРю в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы СоРю и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Обоснование применения Сорю для кардиопротекции по результатам изучения прооксидантных и антиоксидантных характеристик гипертрофированного миокарда.

2. Оценка качества Б АД по содержанию Сорю методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

3. Результаты изучения фармакокинетики Сор10 в составе различных БАД серии «Кудесан»: «Кудесан» раствор, таблетках «Кудесан форте», жевательных таблетках «Кудесан для детей» для разработки эффективных и безопасных режимов дозирования.

4. Оценка эффективности СоРю как кардиопротектора при гипертрофии миокарда различного генеза.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История открытия и изучения

Коэнзим Q был выделен из печени крысы в 1955 г. в Англии группой ученых под руководством Ричарда А. Мортона и охарактеризован в дальнейшем как бензохинон, соединенный с ненасыщенной изопреноидной боковой цепью, присутствующий во всех живых клетках: «ubiquitous quinone» - «вездесущий хинон» [51]. Два года спустя, в 1957 г., в США Фредерик Крейн с сотрудниками выделили из бычьего сердца и идентифицировали новое вещество - компонент дыхательной цепи митохондрий, - хинон, функционирующий как кофермент для переноса электронов с комплексов I и II на комплекс III [34]. В 1958 г. профессор Карл Фолкерс с сотрудниками фирмы Merck, Inc. определили точную химическую структуру убихинона и впервые синтезировали его. Митохондриальный «Coenzyme quinone» Крейна (сокращенно коэнзим Q, CoQ) оказался идентичным выделенному ранее Мортоном убихинону - производному 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона (рис. 1). А О Б О

Рис. 1. Структурная формула убихинонов 6-10 (А) и коэнзима СЫ (Б).

В середине 1960-х годов в Японии Юичи Ямамура впервые применил гомолог убихинона СоСЬ в лечении заболевания человека - застойной сердечной недостаточности. В 1966-м Меллорс и Таппель доказали антиоксидантные свойства восстановленной формы СоС2б [112]. В 1972 г. Паоло Литгарру совместно с Карлом Фолкерсом выявили дефицит СоС2юУ пациентов с заболеваниями сердца [103,104]. В середине 1970-х годов в Японии была разработана технология промышленного производства СоС^о (2,3-диметокси-5-метил-6-декапренил-1,4-бензохинона) в количествах, достаточных для проведения широкомасштабных клинических испытаний.

В 1978 г. Питер Митчелл стал лауреатом Нобелевской премии за вклад в расшифровку биологических процессов превращения энергии, в том числе роли коэнзима С2ю как переносчика электронов [119].

С начала 1980-х годов, благодаря доступности чистой субстанции СоС)10, производимой фармацевтической промышленностью Японии, и возможности прямого определения Сор в крови и тканях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, значительно возросли количество и масштаб проводимых клинических испытаний СоСЬо.

Биосинтез коэнзимов

Биосинтез коэнзима С>10 происходит по так называемому мевалонатному пути: последовательности реакций, ведущих от ацетил-СоА к образованию фарнезилпирофосфата (фарнезил-РР, РРР) - субстрата для последующего синтеза холестерина, Сор, долихола, долицила и пренилирования белков (рис. 2) [59]. Конверсия ацетил-СоА до БРР - общий отрезок пути синтеза для всех конечных продуктов. При этом липиды мевалонатного пути синтезируются с высоко дифференцированными скоростями и в регламентированных количествах благодаря наличию регуляции конечных этапов, предположительно, через регуляцию РРР-утилизирующих ферментов [185].

В отличие от других изопреноидных липидов молекула убихинона содержит бензольное кольцо, происходящее из тирозина. После присоединения изопреноидной боковой цепи ароматическое кольцо модифицируется в ходе нескольких ферментативных реакций: декарбоксилирования, гидроксилирования, метилирования. Большинство этапов биосинтеза были выяснены в результате исследований, выполненных на дрожжах и бактериях, и остаются мало изученными у млекопитающих.

Так, в клетках млекопитающих транспренилтрансфераза использует в качестве субстрата не БРР, а геранил-РР [173]. У человека СоСЬо является доминирующим убихиноном, составляющим в различных тканях от 93 до 98% общего содержания СоС>; 2-7% приходится на СоС)9. У крыс и других видов грызунов преобладает СоСЬ, а Сорю присутствует в количестве 10-30% общего пула (табл. 2). Механизмы реакций, ведущих к образованию двух разных гомологичных продуктов, не выяснены.

Acetyl-CoA i

HMG-CoA I

Mevalonate I

Isopentenyl-PP Geranyl-PP I „• Famesyl-PP tram-Prenyltransferase 40H-benzoate T Squalene transferase лг у synthase

Decapi enyl-40H-benzoate Squalene

I I

Cholesterol

Tyrosine

4-OH-Benzoate Decaprenyl~PP<«

-HMG-CoA reductase

Protein prenylauon Geranylgeranyl-PP cis-Prenyltransferase

Coenzyme Q

Polyprenyl-PP ж" \

Dolichol Dolichyl-P

Рис. 2. Схема биосинтеза СоС>, холестерина и других липидов мевалонатного пути (по [39] с уточнениями [185]). Пояснения в тексте.

В начале мевалонатного пути три молекулы ацетил-СоА объединяются в 3-гидрокси-3-метил-глутарил СоА (ШуЮ-Со А), который в дальнейшем конвертируется в мевалонат с участием НМО-СоА редуктазы - главного регуляторного фермента биосинтеза холестерина [25]. Эффективные конкурентные ингибиторы этого фермента являются наиболее часто используемыми гиполипидемическими средствами - статинами [106].

Биохимические функции коэнзимов Q

Убихинон выполняет в клетках организма множество различных функций, основывающихся на его окислительно-восстановительных свойствах и растворимости в липидах. В качестве основных по мнению авторов [185] можно выделить следующие:

1. участие в качестве переносчика электронов в дыхательной цепи митохондрий;

2. участие в транспорте электронов в плазматической мембране и лизосомах (восстановление хинон редуктазой и окисление NADH оксидазой) [165];

3. антиоксидантная функция (подробнее в Экспериментальной части, Гл. 1, п. 1.2);

4. регуляция проницаемости митохондриальных пор;

5. участие в трансмембранном переносе протонов [44];

6. регуляция физико-химических свойств мембраны;

7. модуляция количества р2-интегринов (молекул адгезии) на поверхности моноцитов крови.

Физико-химические свойства коэнзимов Q

Убихиноны, в зависимости от количества изопреноидных звеньев в боковой цепи, обозначаются как убихинон-1 .10. Все изопреновые звенья в молекуле находятся в транс-положении [2]. Такая структура обеспечивает убихинону высокое сродство к клеточным мембранам. Низшие гомологи Q1-Q5 представляют собой жидкости, высшие - кристаллические вещества желтого или ярко-оранжевого цвета. Все убихиноны нерастворимы в воде, но растворяются в большинстве органических растворителей; наилучшая растворимость наблюдается в гексане, этаноле, пропаноле-1 и пропаноле-2 [190].

CoQio - кристаллический порошок от желтого до ярко-оранжевого цвета, без вкуса и запаха. Растворим в диэтиловом эфире, слабо растворим в 96% этиловом спирте и практически нерастворим в воде. Постепенно разлагается на свету; температура плавления около 48°С.

Все убихиноны имеют специфический спектр поглощения в ультрафиолетовой области с характерным максимумом при 275 нм. Инфракрасные спектры для всех соединений этого ряда содержат практически одинаковые полосы, свойственные их общему ядру.

Убихиноны бактерий содержат от шести до десяти изопреноидных звеньев, высших растений - девять, клетки млекопитающих - девять и десять изопреновых фрагментов. CoQio подобно другим гомологам существует в окисленной (убихинон) и восстановленной (убихинол, CoQH2) формах (рис. 3).

При обработке восстановителями CoQ]0 легко переходит в хинольную форму. Восстановленная форма неустойчива, и при воздействии таких окислителей, как кислород, 1,4-бензохинон, хлорид железа (III) и хлорид меди (II) превращается обратно в убихинон [66].

2Н+, 2с нзс~° щс-о chjj

Убихинон CoQ (окисленная форма)

ОН СН3

Убихинол CoQH2 (восстановленная форма)

Рис. 3. Окисленная и восстановленная формы коэнзима Q.

Обе формы - убихинон и убихинол свободно перемещаются в липидной фазе мембран митохондрий, перенося электроны с НАДН-дегидрогеназы на цитохром Ь5. Донорами электронов для убихинона служат, наряду с НАДН-дегидрогеназой, другие флавиновые дегидрогеназы и супероксидный анион-радикал. В недавно открытой окислительно-восстановительной цепи в лизосомах переносчиком электронов служит полувосстановленная форма коэнзима 0 -убисемихинон [8].

Методы определения коэнзимов Q

Для определения коэнзимов Q применяют три основные группы методов: электрохимические, спектрофотометрические и хроматографические. Наибольшее распространение получил метод ВЭЖХ в сочетании с различными вариантами детектирования.

Электрохимические методы

Наличие электрофорных групп в составе убихинона и его производных позволяет использовать для их определения электрохимические методы.

В работе [197] описан полярографический способ определения CoQio- В основе данного метода лежит образование убихиноном комплекса включения с |3-циклодекстрином в присутствии йодид-иона в 0,1 М ацетатном буфере с рН 4,7, Предел обнаружения составил 0,01 мкмоль/л. Предложенный метод позволяет определять CoQio в фармпрепаратах и биологически активных добавках.

При необходимости анализа электрохимическими методами биологических объектов мешающее влияние матрицы оказывается слишком велико. Для предварительного выделения анализируемых субстанций требуется сложная и длительная пробоподготовка, в ходе которой с большой долей вероятности может произойти изменение состава образца, в частности, изменение соотношения убихинон-убихинол в полученной пробе по сравнению с состоянием in vivo. Для предотвращения окисления убихинола возможно добавление в пробу антиоксидантов, однако доказательств эффективности их действия в литературе не обнаружено.

Спектрофотометрические методы

К преимуществам данной группы методов следует отнести доступность, быстроту проведения и низкую стоимость анализа. Высокие коэффициенты молярного поглощения рассматриваемых соединений (e275=14440 и 14020 моль"1 см" 1 для C0Q9 и C0Q10 соответственно [4] позволяют проводить прямое спектрофотометрическое определение с чувствительностью, достаточной для анализа многих биологических объектов (на уровне 100 мкг/л).

Ряд работ [83,84] посвящен анализу фармпрепаратов, в состав которых входят ретинол ацетат, токоферол ацетат и СоСЬо методом дифференциальной спектрофотометрии. Методика не требует проведения предварительных операций, таких как разделение или маскирование и может быть использована при серийном анализе. Поскольку спектры рассматриваемых соединений достаточно близки, для определения использовали спектры второго порядка. Для СоС^ю максимум в соответствующем спектре приходится на 222 нм. Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется в диапазоне 5-30 мкг/мл. Предел обнаружения составил 1,1 мкг/мл. Недостатком является узкий круг объектов, к которым применима данная методика: определение коэнзимов возможно только в препаратах, содержащих бинарные смеси активных компонентов СоСЫ - токоферол ацетат или СоСЬо -ретинол ацетат. Несмотря на это, сочетание описанного метода с жидкостной или твердофазной экстракцией позволяет выполнять определение Со<310 в плазме крови [82].

Метод колориметрического определения СоС>ю в крови и моче человека был разработан в 1973 г. [4]. Предварительно проводили реакцию нуклеофильного замещения метоксигрупп цианэтилацетатом. При этом образуется соединение, обладающее интенсивной голубой окраской. Этот же подход был использован для анализа тканей морских беспозвоночных [47]. Однако при анализе образцов с высоким содержанием жира наблюдалось значительное занижение результатов.

Для устранения матричных эффектов Хагерман предложил использовать для селективного связывания и последующего выделения убихинона искусственно синтезированный пептид, состоящий из 14 аминокислот [63]. Коэнзим С) выделяли из раствора вместе с иммобилизованным на твердом носителе пептидом и проводили количественное определение спектрофотометрически.

Главным недостатком данной группы методов является недостаточно высокая чувствительность и низкая селективность. Устранение влияния матричных компонентов на стадии пробоподготовки усложняет процедуру и может приводить к ряду негативных последствий, описанных выше.

Хроматографические методы со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием

Неполярная природа убихинона и его гомологов обусловливает использование обращенно-фазового варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии [140]. В работе [14] показано, что данный метод существенно превосходит нормально-фазовый вариант по воспроизводимости и позволяет добиться большей селективности при совместном определении СоСЬо и его аналогов. Судя по литературным данным, наиболее часто применяют спектрофотометрическое и электрохимическое детектирование.

В работе [81] описан метод совместного определения ретинола, а-ТОС и коэнзима СоСЬо в плазме крови. Разделение проводили на колонке ЫСЬтоэрИег 100 ШМ8 (4x125 мм, размер зерна 5 мкм), используя в качестве подвижной фазы смесь метанола с гексаном в объемном соотношении 72:28. Детектирование осуществляли при длине волны 276 нм. Предел обнаружения убихинона составил 0,83 мкмоль/л.

В работе [43] предложен метод определения коэнзима СЫ в мышечной ткани и плазме с использованием в качестве внутреннего стандарта ди-пропокси-СоСЬо. К гомогенизированному образцу или плазме добавляли 50 мкл внутреннего стандарта и проводили экстракцию с последующей сменой растворителя. Убихиноны детектировали при 275 нм. Градуировочный график был линеен в интервале 101000 нмоль/л, предел обнаружения 6 нмоль/л.

Авторы работы [142] для экстракции жирорастворимых изопреноидных соединений из тканей мозга и печени проводили сапонификацию 15 М КОН в метаноле. В качестве неподвижной фазы использовали колонку икгасагЬ 5 ОБ8-20 фирмы РЬепотепех. Разделение осуществлялось в градиентном режиме в смеси вода:метанол:изопропанол. Данная методика позволяет наряду с другими компонентами определять коэнзимы СЬ и Ою в интервале концентраций 1-60 мг/л.

Авторы работы [136] разработали методику определения убихинонов в биологических объектах, таких как плазма, моча и ткани органов. В качестве внутреннего стандарта использовали СоС^ц. Анализ проводили на колонке БтеРаск С18 (4,6x250 мм). В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола с гексаном (3:1). Спектрофотометрическое детектирование осуществляли при длине волны 275 нм. Предел обнаружения составил 10 нг.

Простой и достаточно экспрессный метод определения общего содержания CoQ10 в плазме описан в работе [125]. К 200 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора 1,4-бензохинона (2 мг/мл) для перевода убихинолов в окисленную форму, проводили реакцию в течение 10 минут и осаждали белки 1 мл н-пропанола. После центрифугирования надосадочную жидкость отбирали и вводили в хроматограф. Разделение проводили на колонке Supelcosil LC 18. Для изучения стабильности полученного раствора образцы хранили в течение трех суток при 25, 4 и -22°С. Было показано, что при этом суммарное содержание коэнзима в пробе не меняется. В случае спектрофотометрического детектирования (275 нм) использовали подвижную фазу, состоящую из этанола и метанола (65:35). Для совместного определения окисленной и восстановленной формы использовали кулонометрический детектор. Убихинон переводили в восстановленную форму, прикладывая к ячейке потенциал -500 мВ и в дальнейшем проводили определение при 350 мВ. Для обеспечения достаточной электропроводности раствора в подвижную фазу вводили 50 мМ перхлората натрия. Предел обнаружения при использовании кулонометрического детектора составил 5 мкг/л.

Авторам работы [172] удалось осуществить разделение окисленной и восстановленной форм C0Q9 и C0Q10 на обращенно-фазовой колонке Microsorb-MV (4,6x150 мм, размер зерна 5 мкм). Подвижная фаза состояла из смеси безводного ацетата натрия (4,2 г), 15 мл уксусной кислоты, 15 мл изопропанола, 830 мл метанола и 140 мл гексана. Кулонометрическое детектирование осуществляли по следующей схеме: в предколоночной кондиционирующей ячейке проводилось окисление электроактивных компонентов элюента, затем, после разделения веществ на колонке, элюат поступал в дополнительную защитную ячейку с потенциалом электрода 0,7 В. После этого вещества попадали в аналитическую ячейку с двумя* последовательными электродами. Потенциалы электродов устанавливали равными -1 и 0,45 В'. При этом на первом электроде, происходил предварительный перевод коэнзимов в восстановленную форму, а на втором осуществляли непосредственно детектирование. Для определения общей концентрации коэнзимов потенциал электрода в предколоночной ячейке выставляли равным 0,7 В, при индивидуальном определении убихинонов и убихинолов потенциал электрода составил -0,075 В. Стандартные растворы C0Q9H2 и C0Q10H2 готовили восстановлением соответствующих убихинонов раствором боргидрида натрия. Предел обнаружения составил 15 мкг/л.

Было показано, что раствор убихинола в н-пропаноле стабилен при хранении в течение 4 часов, в то время как для образцов тканей за этот же срок происходит окисление до 50% содержащегося в них убихинола. По мнению авторов работы [172], использование для экстракции охлажденного спирта способствует замедлению окислительных процессов.

Работа [190] посвящена разработке методики автоматизированного определения C0Q10 и CoQi0H2 в плазме крови методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Пробоподготовка образца сводилась к депротеинизации плазмы этанолом. Каждую пробу анализировали два раза: до и после обработки раствором боргидрида натрия в метаноле. Разделение осуществляли на колонке Hypersil С18 (4^125 мм, размер зерна сорбента 5 мкм) в градиентном режиме смеси перхлората натрия в метаноле:этанола:третбутанола. Добавление в подвижную фазу хлорной кислоты способствовало поддержанию постоянного уровня фоновой электропроводности. Детектирование осуществляли на амперометрическом детекторе с хлоридсеребряным электродом сравнения. В качестве рабочего использовали стеклоуглеродный электрод (потенциал электрода 700 мВ). Область линейности градуировочного графика составила 0,1-3 мкмоль/л. Предел обнаружения 2 мкг/л.

В этом же исследовании авторы оценивали стабильность растворов коэнзимов Q. Было показано, что стандартный раствор убихинона с концентрацией 1 ммоль/л сохранен в течение месяца, но при понижении концентрации хотя бы до 100 мкмоль/л раствор хранится не более недели при -80°С. При -20°С раствор стандарта стабилен не более чем 24 часа.

В' работе [13] исследовали соотношение окисленной и восстановленной форм C0Q9 и CoQio в тканях органов крыс и человека. Анализ осуществляли на колонке Hypersil ODS с диаметром зерна 3 мкм. Использование программы градиентного элюирования в смеси вода:метанол:изопропанол:гексан позволило за 50 минут осуществить разделение убихинонов-6,9 и 10, и соответствующих убихинолов (рис. 4). По данным авторов, проведение однократной экстракции образца с использованием петролейного эфира в качестве экстрагента является наиболее эффективным с позиции определения in vivo соотношения окисленной и восстановленной форм коэнзимов. 3 i-i---Vis--ft-г*8--->'а----¿г---й—

Рис. 4. Хроматограмма смеси жирорастворимых компонентов, выделенных из сердца человека. Колонка Hypersil ODS. Спектрофотометрическое детектирование при длине волны 210 нм. Идентифицированные пики: 1-холестерол, 2-CoQ6H2, 3-CoQ9H2,4-CoQ10H2, 5-CoQ10[13].

Работа [126] посвящена определению жирорастворимых антиоксидантов в плазме крови: а-ТОС, у-ТОС, ß-каротина, ликопена, убихинола, убихинона. Анализ проводили на колонке Supelcosil LC-8-DB (4,6x150 мм, Змкм) с использованием в качестве подвижной фазы 20 мкМ перхлората лития в смеси метанол:вода (96:4). Детектирование осуществляли с помощью кулонометрического детектора с двухэлектродной ячейкой (потенциалы электродов 0,01 и 0,35 В). За 35 минут удалось разделить 7 компонентов (рис. 5).

Методику определения общего содержания CoQ]0 в микропробах плазмы методом жидкостной хроматографии с кулонометрическим детектированием предложили авторы работы [53]. Потенциалы электродов в электрохимической ячейке были равны -0,15 и 0,6 В. Предел обнаружения составил 60 фмоль.

Time (min)

Рис. 5. Хроматограмма экстракта плазмы крови. Колонка Supelcosil 4,6x150 мм. Подвижная фаза: 20 мкМ LiC104 в смеси метанол:вода (96:4). Кулонометрическое детектирование. Идентифицированные соединения: у-токоферол (у-ТС), а-токоферол (а-ТС), а-каротин (а-С), ß-каротин (ß-C), убихинол-10 (UB-oI) и убихинон-10 (UB-one) [126].

Работа [113] посвящена совместному определению окисленной и восстановленной форм CoQio в плазме крови. Детектирование осуществлялось при помощи кулонометрического детектора с двухэлектродной аналитической ячейкой при потенциалах электродов -150 и 600 мВ соответственно. Авторы работы высказали предположение, что ионы металлов, находящиеся в подвижной фазе, могут влиять на первоначальное соотношение восстановленной и окисленной форм, инициируя окисление убихинолов. Частично снизить содержание ионов металлов, по мнению авторов, можно, применяя в качестве фонового электролита формиат аммония.

Уровень коэнзимов Q в митохондриях крыс исследовали в работах [100, 116]. Экстракцию проводили из 20-200 мкл гомогенизированного образца, добавляя 10 мкл 10%-го водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 750 мкл смеси гексан:этанол (5:2).

Органический слой упаривали в токе азота и перерастворяли в 100 мкл этанола. Подвижная фаза состояла из 0,7% NaC104 в смеси этанол:метанол:70%-я хлорная кислота (900:100:1). Детектирование осуществляли с помощью кулонометрического детектора при потенциалах электродов: в защитной ячейке 20 мВ, в кондиционирующей ячейке -550 мВ, аналитической 175 мВ. Данный метод позволяет определять суммарную концентрацию коэнзима в клетках на уровне до 5 пмоль.

CoQio в пищевых добавках определяли в работе [170] методом ВЭЖХ с кулонометрическим детектированием. Исходные образцы растворяли в н-пропаноле. Электроактивные составляющие матрицы окисляли в пред- и постколоночных ячейках, определение коэнзимов проводилось в двухэлектродной электрохимической ячейке. Область линейности составила 0,05-8 мкг/мл.; предел обнаружения - 5 нг/мл.

Сравнение возможностей электрохимического и спектрофотометрического детектирования при определении CoQio в плазме крови проводили в работе [58]. Для снижения мешающего влияния компонентов матрицы пробу подвергали очистке на силикагелевом картридже (Bond Elut Si). Полученный элюат пропускали через картридж Bond Elut Cl8, элюировали изопропиловым спиртом и анализировали на обращено-фазовой колонке Ultrasphere XL Cl8 (4,6x70 мм), используя в качестве элюента метанол :изопропанол (4:1) для спектрофотометрического детектирования или 50мМ ацетатный буфер:изопропанол:метанол (24:450:1435) для электрохимического. Пределы обнаружения составили 50 и 5 мкг/л для спектрофотометрического и электрохимического детекторов, соответственно.

Последовательное подключение электрохимического и спектрофотометрического детекторов в работе [95] позволило одновременно определить окисленную и восстановленную формы коэнзимов. Экстрагированные из образца ткани компоненты (а, у и Ö-TOC, CoQ9, СоС^Нг, CoQio, CoQi0H2) разделяли на обращено-фазовой колонке Ultrasphere ODS в- градиентном режиме (смесь этанол:изопропанол:20мМ LiC104 в этаноле). Детектирование осуществляли спекгрофотометрически (1=275 нм) для убихинонов и токоферолов и электрохимически для убихииолов при потенциале электрода 600 мВ. Предел обнаружения убихинона составил 1 пмоль.

В работе [109] анализировали возможность применения диодно-матричного и электрохимического детекторов при анализе пищевых продуктов на содержание CoQ9 и CoQio. Для исследования были взяты образцы говядины, сельди и ржаной муки. Элюент состоял из метанола, этанола, изопропанола и 1 М аммонийно-ацетатного буфера с pH 4,4 (53:24:21:2). Потенциалы электродов составляли -1000 и 500 мВ. В результате за 15 минут удалось добиться разделения убихинонов Q9 и Qio. В том случае, если полученные после экстракции образцы содержали коэнзимы исключительно в окисленной форме, наблюдалось хорошее соответствие между результатами, полученными на разных детекторах. Однако при наличии остаточных количеств убихинола полученные разными методами данные значительно отличались. В целом электрохимический детектор оказался намного чувствительнее (пределы обнаружения для CoQ9 и CoQio составили соответственно 0,4 и 0,6 нг/мкл при использовании диодно-матричного детектора; 0,02 и 0,03 нг/мкл с использованием'э'лектрохимического детектора).

Разделение гомологов убихинонов Q6 - Q10 в изократическом режиме осуществили на обращено-фазовой колонке Ultrasphere ODS (4,6x250 мм) в работе [140]. В качестве наиболее оптимальной подвижной фазы была выбрана смесь третбутил-метилового эфира с ацетонитрилом (29:71). Применение такого элюента позволяет достигнуть полного разделения всех 5 соединений за 3 минуты.

В подавляющем большинстве описанных ранее работ в качестве фонового электролита использовали перхлорат лития. Однако в работе [113] установлено, что его использование влечет за собой сокращение срока службы прибора в силу высокой коррозирующей способности перхлоратов. Поэтому в данной работе была рассмотрена возможность применения других фоновых электролитов. Известно, что в качестве индифферентных электролитов для спиртов наиболее часто применяют неорганические соли и оотования (NaCI04, LiGl, NH4G1 и КОН) [12]. Из органических веществ наиболее распространены тетраалкиламмониевые соли: хлорид, бромид, йодид, перхлорат и нитрат тетраметиламмония, перхлорат и тетрафенилборат тетраизоамиламмония и др. При использовании в качестве компонента подвижной фазы ацетонитрила рекомендуется применять 1ЛСЮ4,

NaC104, тетрафенилборат тетраэтиламмония, перхлорат тетрабутиламмония, а также минеральные кислоты. Оптимальным фоновым электролитом, по мнению авторов работы [113], является формиат аммония.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическнм детектированием

В последнее время широкое развитие получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Преимущества данного метода заключаются в чувствительности, сравнимой с электрохимическим детектором, а также в селективности и высочайшей достоверности при определении коэнзимов в объектах со сложным составом. Используя масс-спектрометрический детектор можно проводить одновременное определение окисленной и восстановленной форм на фоне мешающих компонентов матрицы, сведя при этом к минимуму процедуру пробоподготовки. В случае анализа различных форм убихинонов в биологических, объектах эти преимущества проявляются наиболее отчетливо.

В работе [174] для определения C0Q9 и C0Q10 в тканях органов использовали жидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием в режиме электрораспылителыюй ионизации. В работе использовали масс-спектрометр с тройным квадруполем. Таю как убихиноны являются малополярными соединениями, то использование электрораспылительной ионизации в классическом варианте не позволяет проводить определение с необходимой чувствительностью. Повышение чувствительности было достигнуто путем введения в подвижную фазу 1-алкиламинов. Хроматографическое разделение проводили на колонке YMC Pack Pro (2,0x75 мм) с использованием в качестве элюента смеси метанол:изопропанол:муравьиная кислота (45:55:0,5). Подобранный состав подвижной фазы оказался-оптимальным и позволил сократить время анализа до 6 минут. Детектирование-осуществляли в« режиме MS-MS по выделенным ионам-827 ->197, 895 ->197, 963 ->197 для C0Q9, G0Q10 и CoQn.

В* работе [56] исследовали состав ила методом ВЭЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации отрицательных ионов. Для анализа использовали обращенно-фазовую колонку Zorbax

СЮ8(4.6х250 мм). Элюент состоял из метанола и изопроиилового эфира (83:17). Детектирование осуществляли на квадрупольном масс-спектрометре Мюготаэз, снабженном источником химической ионизации с г-спреем. Такая конфигурация позволяет вводить пробу в прибор без дополнительного деления потока, что приводит к росту чувствительности. В образце удалось идентифицировать 12 менахинонов (МКП, (п=6-10); МКПН2, (п=7-10); МКПН4, (п=8-9); МК8Н6) и убихиноны (Зб - СЬо (рис. 6). Режим регистрации отрицательных ионов (предел обнаружения составил 0,02 нг/мкл и 0,5 нг/мкл для убихинонов б и 10) оказался более выигрышным по чувствительности по сравнению с режимом регистрации положительных ионов (0,04 и 0,4 нг/мкл). При использовании диодно-матричного детектора были обнаружены только убихиноны С^-С^о и 9 менахинонов, что демонстрирует недостаточную чувствительность спектрофотометрического детектирования. Детектирование велось при 275 и 270 нм для определения убихинонов и менахинонов соответственно.

ПС 1001

JQ-S мк

UQ-7

TI Г"

МК-,9(Н2) W

UQ-9

МК-' мк-7(н2) МК-®(Н4}а UQ-I0 ^ fik.-s(h2

МК-8

МК-10

МК-9(И4) if Г мк-10(н2)

WV

Time (min)

5.00 10.00

20.00

40,00

50.00

МК-9 i ■' 40.00 50,00

60.00 70.00

Ддае(тт)

60.00

70.00

Рис. 6. Хроматограмма экстракта образца ила. Колонка Zorbax-ODS 250x4,6 мм. Элюент - метанол:изопропиловый эфир (83:17). Масс-спектрометрическое детектирование в режиме регистрации отрицательных ионов [55].

Количественное определение CoQio в продуктах питания методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием описано в работе [164]. Разделение осуществляли на колонке Luna С18 (4,6x150 мм, диаметр зерна сорбента 3 мкм) с использованием подвижной фазы состоящей из этанола, диоксана и уксусной кислоты. Время удерживания коэнзима составило в данных условиях 4,1±0,1 мин. Идентификацию и количественный анализ проводили с использованием источника химической ионизации в режиме регистрации положительных ионов. Предел обнаружения в этих условиях составил 0,1 мг/кг. Степень извлечения варьировалась от 75 до 90% и зависела главным образом от содержания жира в матрице образца.

Распределение и метаболизм убихинона в организме изучали в исследовании [19] после внутрибрюшинного введения крысам СоСЫ, меченого изотопом углерода С13. Коэнзимы экстрагировали из образца мышечной ткани в смесь хлороформа, метанола и воды (1:1:0,3) в течение 60 минут при 37°С. После экстракции соотношение компонентов растворителя доводили до 3:2:1 и центрифугировали смесь. Водно-метанольный слой, содержащий метаболиты, промывали смесью хлороформа и метанола (3:1). Экстракт упаривали, перерастворяли в смеси хлороформа и метанола и вводили в прибор. На основании полученных масс-спектров была предложена структура фосфорилированного метаболита СоС^ю (рис. 7).

Рис. 7. Предложенная структура основного метаболита CoQio [19].

Работа [55] посвящена идентификации изопреноидных хинонов в Escherichia coli методом ВЭЖХ-МС с химической ионизациией при атмосферном давлении в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. В пробе были обнаружены коэнзимы Q6, Q7, Qg и CoQio. Предел обнаружения составил 5 и 40 мкг/г сухого образца для CoQ6 и CoQ10 соответственно.

ОН I

0=Р-0 I О

ОН

В работе [205] был разработан экспрессный метод определения CoQi0 в табачных листьях. Детектирование осуществляли на масс-спектрометре фирмы Finnigan с приставкой для электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов. Пробоподготовка включала в себя ультразвуковую экстракцию свежих листьев безводным этанолом в течение 15 минут и последующей экстракцией гексаном. Разделение осуществляли на колонке Symmetry Shield RP 18. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и изопропанола (8:7) с добавкой муравьиной кислоты (0,5%). Степень извлечения убихинона варьировала от 98,2 до 99,3%. Предел обнаружения составил 1,2 нг/мл.

Работа [66] посвящена определению CoQ]0 в плазме крови методами ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-ЭХ. В работе использовали масс-спектрометрический детектор, снабженный ионной ловушкой и двумя источниками ионизации: электроспреем и химической ионизации при атмосферном давлении. Авторы работы исследовали возможность применения двух вышеуказанных вариантов ионизации в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов. Наилучшие результаты были получены в режиме регистрации отрицательных ионов: в этом случае соотношение сигнал/шум было максимальным. В режиме химической ионизации при атмосферном давлении с регистрацией отрицательных ионов предел обнаружения составил 1 нг/мл.

Таким образом, по литературным данным, при ВЭЖХ-определении коэнзимов Q используются самые разнообразные детекторы, каждый из которых обладает своими достоинствами и недостатками. Краткое сравнение различных способов детектирования представлено в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение различных вариантов детектирования коэнзимов Q.

Метод Объект Определяемые соединения Предел обнаружения Условия детектирования Источник

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани Q6, Q6H2) Q9H2) 09,QioII2,Q.o • - 210 нм [13]

ВЭЖХ-СФ Пищевые продукты 09, Qio С>9-400мкг/л Qio-600 мкг/л 275нм [109]

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани, плазма крови Qio 5 мкг/л 275 нм [43]

ВЭЖХ-СФ Продукты питания 010 0,2 мг/кг 275 нм [164]

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани Qs, Q.o,Qu 10 нг/колонку 275 нм [136]

ВЭЖХ-СФ Плазма крови Qm 50 мкг/л 275 нм [58]

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани Q9, Q9H2, Q10, О10Н2 - 275 нм [95]

Таблица 1. (продолжение)

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Qio, Q10H2 2 мкг/л Амперометрическое. Потенциал электрода 700 мВ относительно хлорндсеребряного эл-да сравнения [190] вэжх-эх Плазма крови Q9, Q9H2, Q10, Q10H2 1 мкг/л Кулонометрическое. Потенциалы электродов: постколоночная ячейка: -600 мВ, аналитическая: -150 мВ, 600 мВ [113]

ВЭЖХ-ЭХ Пищевые продукты Q9, Q10 Q9 —20 мкг/л Qio-30 мкг/л Амперометрическое Потенциалы электродов: постколоночная ячейка: —1000 мВ; аналитическая 500мВ [109]

ВЭЖХ-ЭХ Митохондрии Q9, Qio 5 пмоль/кол онку Кулонометрическое. Потенциалы электродов защитная ячейка 200 мВ, постколоночная -550 мВ, аналитическая 175 мВ [100, 116]

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Q10H2, Qio 5 мкг/л Кулонометрическое Потенциалы электродов: -500 мВ 350мВ [125]

ВЭЖХ-ЭХ Биологические ткани Q6, Q9H2, QioH2, Q9, Qio 15 мкг/л Кулонометрическое. Потенциалы электродов: предколоночные ячейки: -75 мВ, 700 мВ; аналитическая ячейка -1 в, 0,45 в [172]

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Q9, Qio 5 мкг/л Амперометрическое. Потенциал электрода 600 мВ [58]

ВЭЖХ-ЭХ Биологические ткани Qg, Q9H2, Qio, Q.oH2 1 пмоль/ко лонку Амперометрическое. Потенциал электрода 600 мВ [95]

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Q9, Qio 10 пг/колонк У Кулонометрическое. Потенциалы электродов: предколоночная ячейка: ОмВ, аналитическая: -1000 мВ, 300 мВ [66]

ВЭЖХ-МС Q9, Qio, Q10H2 1 мкг/л APCI (-); m/z: Q9 795—»780 Q10H2 863—>848 Qio 863—848 вэжх-мс Биологические ткани Q9, Qio, Qu 0,5 мкг/г ESI (+); m/z: Q9 827—>197 Qio 895—»197 Qu 963—>197 [174]

ВЭЖХ-МС Ил Qe, Qt, Qs, Q9, Qio Qe- 20м кг/л Qio-40 мкг/л APCI (-); m/z: Q6- 575,4 Q,o-847.8 [56]

Qe-500 мкг/л Qio-400 APCI (+); m/z: Q6-613,4 Qio-886 мкг/л вэжх-мс Продукты питания (Зю 0,1 мкг/г АРС1 (+); т/г 863,4 [164] вэжх-мс Клетки ЕсоИ СЬ, <37, (Зв, СЬо <Зб-5 мкг/г; <3.0-50 мкг/г АРС1 (-); т/г <Зб-590 <210-863 [55]

На основании вышеизложенных данных можно сделать вывод, что спектрофотометрические детекторы во многих случаях, особенно при анализе биологических объектов, не обладают достаточной чувствительностью и селективностью. Метод, сочетающий ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, обладая чувствительностью электрохимического детектора и наибольшей селективностью, пока не получил широкого распространения из-за высокой стоимости оборудования и необходимости специализированной профессиональной подготовки персонала. В то же время, высокоэффективная жидкостная хроматография в последние десятилетия стала рутинным методом благодаря доступности хроматографического оборудования отечественного производства и простоте программного обеспечения. Использование электрохимического детектора обеспечивает наиболее высокую чувствительность и селективность определения, что является необходимым условием при анализе объектов с мультикомпонентной матрицей (лекарственных форм, биологических объектов) и позволяет одновременно оценивать в образце содержание окисленной и восстановленной форм коэнзимов <3 [174, 74, 69].

Способы пробоподготовки биологических объектов

Подготовка пробы является важнейшей и необходимой процедурой, предшествующей собственно количественному анализу и имеющая целью отделение определяемого вещества от сопутствующих мешающих компонентов матрицы. Полнота перехода определяемых веществ из образца в пробу обеспечивает правильность и воспроизводимость методики, существенно влияя и на чувствительность определения. На этой стадии возможно разведение или концентрация пробы.

Существует несколько основных подходов к выделению коэнзимов из биологических образцов. Самым распространенным способом является экстракция неполярным растворителем с дальнейшим упариванием и сменой растворителя.

При анализе плазмы крови в работах [168, 126] к образцу непосредственно добавляли смесь спирта с гексаном. Авторы работ [81, 43, 53, 58] предварительно осаждали белки спиртом с последующей экстракцией гексаном. Эту процедуру проводили несколько раз, объединенные гексановые экстракты упаривали и перерастворяли пробу в спирте или подвижной фазе.

При анализе биологических тканей экстракцию из гомогенизированного образца проводили смесью спирта с гексаном. Чтобы избежать окисления образца, в пробу вводили антиоксиданты (например, в работе [113] для этой цели использовали 2,6-ди-третбутил-п-крезол). Затем объединенные экстракты промывали водой, упаривали и перерастворяли в изопропиловом спирте [109]. В различных работах пробы гомогенизировали с 0,25 М раствором сахарозы [13], раствором додецилсульфата натрия [95], раствором NaCl [109] или дистиллированной водой [168].

Часто при пробоподготовке объектов со сложной матрицей, содержащей большое количество жиров, используют сапонификацию. Так, в работе [47] образцы тканей морских беспозвоночных сапонифицировали щелочью в метаноле в присутствии' пирогаллола как антиоксиданта, экстрагировали эфиром, полученный экстракт промывали водой и выпаривали на водяной бане. Сухой остаток растворяли в гексане и очищали на колонке с силикагелем, используя для элюирования раствор диэтилового эфира в гексане. Модификация данной методики предложена Okamoto Т., Fukui К. [136]. Перед очисткой на картридже все содержащиеся в образце коэнзимы переводили в окисленную форму гексацианоферратом(Ш) калия. После элюирования смесью бензол-ацетон элюат упаривали и сухой остаток растворяли в метаноле. В работе [56] для экстракции коэнзимов Q из ила использовали смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1. Смесь упаривали на роторном испарителе, сухой остаток экстрагировали гексаном. Полученный экстракт очищали, используя» картриджи для твердофазной экстракции. Sep-Eak Plus на основе силикагеля. Для селективного элюирования менахинонов и убихинонов применяли 10%-й раствора диэтилового эфира в гексане. Элюат упаривали в токе азота и перерастворяли в 2 мл ацетона.

В упомянутых работах стадия очистки образца на силикагеле необходима для снижения мешающего влияния компонентов матрицы, которые переходят в экстракт, в первую очередь, жирных кислот [136]. В качестве альтернативы в работе [142] предлагается после упаривания экстракта перевести жирные кислоты в соответствующие метиловые эфиры, используя для данной цели диазометан.

В ряде описанных работ пробоподготовка сводилась к экстракции образца спиртом. Наиболее часто такой подход применяется при анализе плазмы крови [190, 66, 125]. В работе [172] для выделения коэнзимов из тканей замороженные образцы гомогенизировали с 2 мл холодного пропанола-1. К гомогенизированной смеси добавляли 100 мкл холодной воды, перемешивали и центрифугировали смесь. Надосадочную жидкость отбирали и вводили в прибор. Аналогичным образом, в работе [174] навеску образца гомогенизировали в воде и добавляли метанол, после чего смесь центрифугировали и надосадочную жидкость вводили в прибор. Экстракцию спиртом также применяли при определении коэнзимов в табачных листьях [205].

Для некоторых специфических объектов, таких, как бактериальные колонии Escherichia coli, пробоподготовка может сводиться к твердофазной экстракции на картриджах Sep-Pak Plus Silica. В качестве элюента использовали гексан [55].

Необходимо отметить, что в ряде случаев на стадии пробоподготовки осуществляли перевод всех коэнзимов в окисленную форму. Для этой цели применяли 1,4-бензохинон [66, 125], гексацианоферрат калия [136], или кислород воздуха [66]. Это упрощает анализ, однако данный подход не позволяет проводить одновременное определение окисленной и восстановленной форм коэнзимов. С этой позиции оптимальным вариантом пробоподготовки является экстракция спиртом, в ходе которой с наибольшей вероятностью сохраняется исходное соотношение форм. Тем не менее, в литературе нет сведений о преимуществах такой пробоподготовки по сравнению с другими ее вариантами.

Сердечно-сосудистые заболевания и CoQ10

Известно, что сердечная, мышца содержит CoQio в максимальных по сравнению с другими тканями количествах [13, 202, 185], что обусловлено высокими энергетическими требованиями к кардиомиоцитам. Наибольшее число экспериментальных и клинических исследований CoQio .до сегодняшнего дня посвящено заболеваниям сердца: сердечной недостаточности, гипертензии, инфаркту миокарда [1, 150].

Первое терапевтическое применение CoQio было осуществлено в Японии у пациентов с застойной сердечной недостаточностью. Обоснованием использования CoQio для лечения данного заболевания является дефицит CoQio в крови и тканях миокарда больных, прямо коррелирующий со степенью нарушения функции левого желудочка [123]. В недавнем исследовании [120] группой новозеландских ученых выявлена роль CoQio как независимого предиктора смертности у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН).

Длительный регулярный прием CoQio позволяет восполнить его дефицит в крови и тканях пациентов, приводя к значительному улучшению функциональных показателей миокарда, сокращению потребности в сопутствующем лечении сердечно-сосудистыми препаратами при полном отсутствии токсичности [104, 97, 123]. Улучшение функции миокарда становилось заметным через месяц после начала приема CoQio, через 6 месяцев достигало максимума и в дальнейшем оставалось стабильным на фоне приема кофермента. После прекращения приема через 1 месяц показатели сердечной функции начинали снижаться и возвращались к прежним значениям спустя 3-6 месяцев [96, 124].

Масштабное исследование [121], продолжавшееся 1 год, включало 641 пациента с застойной сердечной недостаточностью. Половина пациентов получали 2 мг/кг в день CoQi0 в дополнение к стандартной терапии, другая- половина -плацебо. Через год у всех пациентов, принимавших CoQio, значительно уменьшилась тяжесть симптомов и частота госпитализаций по причине сердечной недостаточности при отсутствии улучшений в группе плацебо.

В 173 медицинских центрах Италии в 1994 г. было проведено открытое постмаркетинговое исследование клинической эффективности и безопасности CoQio у больных ХСН II и III функциональных классов [16]. Из 2664 опрошенных больных, принимавших CoQio, у 78% снижался цианоз, у 78,6% уменьшались отеки, у 63% - реже ощущалась,аритмия-и у 73% - головокружение.- 54% больных отметили уменьшение выраженности' трех и более сиптомов, при этом только 0,75% пациентов жаловались на побочные явления, связанные с приемом CoQio.

Однако два хорошо организованных исследования, включающих суммарно 85 пациентов с застойной сердечной недостаточностью, не выявили каких-либо признаков улучшения их состояния [86, 191].

Мета-анализ, проведенный в 2003 г. [122], оценил результаты 13 двойных слепых рандомизированных исследований эффективности применения CoQ10 при ХСН, включавших в сумме 1000 леченых пациентов. Только в 3 исследованиях, представляющих 100 леченых больных, не было выявлено признаков улучшений состояния. В остальных и по сумме всех работ были получены достоверные свидетельства:

- улучшения функционального класса больных;

- повышения толерантности к физической нагрузке;

- снижения частоты госпитализации.

Сочетание таких биохимических функций убихинона как непосредственное участие в процессах синтеза энергии в качестве переносчика электронов и его потенциал эффективного антиоксиданта, регенерируемого in vivo, в совокупности с безопасностью приема в широком диапазоне доз представляет CoQio «идеальным терапевтическим агентом для лечения ишемического-реперфузионного повреждения миокарда» [194].

Действительно, экспериментальные [5, 110] и клинические исследования в области сердечно-сосудистой хирургии выявили эффективность предварительного приема CoQio (длительного перорального по 30-150 мг/день в течение 6-14 дней или внутривенного введения) перед операциями на сердце или сосудах. После замены сердечного клапана в периоде восстановления у пациентов, получавших кофермент, реже отмечался сниженный минутный сердечный выброс [169]. Внутривенное введение 5 мг/кг CoQio за два часа до аортокоронарного шунтирования [166] повышало ударный индекс левого желудочка в постоперационном периоде. Длительный прием CoQ]0 внутрь перед предстоящей операцией' шунтирования повышал постоперационный сердечный индекс и фракцию выброса левого желудочка, сокращал время восстановления пациентов [76], снижал количество аритмий и содержание TBARS в крови венечного синуса [28]. Прием по 150 мг CoQIO в день в течение недели перед операцией на брюшной аорте уменьшал количество признаков окислительных повреждений в крови пациентов [29]. В то же время, однократный прием внутрь даже большой дозы CoQio (600 мг) за 12 часов до коронарной реваскуляризации не вызвал ни одного заметного эффекта [167].

Двойное слепое рандомизированное контролируемое исследование [158] включало 144 больных после острого инфаркта миокарда, 73 из которых получали CoQio на фоне стандартной терапии. У этих пациентов в течение года наблюдения в два раза реже случались сердечно-сосудистые события (24% против 45%, р<0,02), нефатальные повторные инфаркты (13,7% против 25%, р<0,05) и сердечная смерть.

Одним из возможных путей реализации кардиопротекторного действия CoQio является предотвращение удлинения Q-T-интервала у больных с инфарктом миокарда, которое сопряжено с большей частотой их смерти. В исследовании [91] в течение 1 года наблюдали 61 больного с острым инфарктом миокарда. Пациенты через 6 часов от начала инфаркта получали либо плацебо, либо CoQio (100 мг/день) и селен (500 мг/день) на фоне одинаковой терапии. В контольной группе у 40% больных отмечали удлинение интервала Q-T, что не наблюдалось в группе пациентов, получавших антиоксиданты. За год наблюдения среди пациентов, принимавших антиоксиданты, умер лишь один (по причине некардиального характера); в контрольной группе больных смертность составила 20% (6 человек).

Способность CoQio снижать кровяное давление у пациентов с гипертонией была показана М. Nagano еще в 1976 году. В 2007 году группой Франка Розенфельда были опубликованы результаты мета-анализа всех клинических исследований применения CoQio при гипертонии. Анализировались результаты 12 клинических исследований, включавших 362 пациента. Вывод был однозначен: CoQio способен понижать систолическое давление пациентов с гипертонией в среднем на 17 мм рт ст и диастолическое - на 10 мм рт ст без значительных побочных эффектов [147]. На этом основании- авторы высказали предположение, что CoQio может служить» альтернативой лекарственным гипотензивным препаратам или быть использован для усиления их эффекта.

У больных сахарным диабетом 2 типа показана способность CoQio контролировать не только уровень артериального давления, но и уровень гликемии, снижая содержание гликозилированного гемоглобина [70].

Таким образом, большинство данных литературы свидетельствуют об эффективности применения CoQio при сердечной недостаточности, гипертонии, инфаркте миокарда. Тем не менее, считая доказательную базу неудовлетворительной American Heart Association пока воздерживается рекомендовать CoQio в качестве терапевтического агента для лечения хронической сердечной недостаточности, стенокардии, а также для постоянного приема [http://www. americanheart. org].

Фармакокинетика коэнзима Qio

Абсорбция и транспорт

Специфических мест абсорбции CoQio в желудочно-кишечном тракте человека не описано. На модели изолированного ЖКТ крысы показано, что наибольшей проницаемостью для CoQio обладает двенадцатиперстная кишка и далее, в порядке убывания, толстая кишка, подвздошная кишка, тощая кишка [138]. Как и в случае других липидов, абсорбция CoQ10 представляется комплексным процессом, включающим механизмы активного транспорта и пассивную диффузию [20]. Возможность всасывания в толстой и подвздошной кишке свидетельствует о существовании энтерогепатической рециркуляции CoQiq.

Механизмы абсорбции CoQio, по-видимому, те же, что и для другого жирорастворимого антиоксиданта - витамина Е (а-ТОН). В тонком кишечнике желчь и секрет поджелудочной железы обеспечивают эмульгирование и образование мицелл CoQ]0, необходимые для последующей абсорбции. Подобно другим липофильным веществам, в процессе абсорбции CoQio включается в хиломикроны и транспортируется-лимфатической системой в кровь. [85]. Сразу после всасывания CoQi0 обнаруживается^ в составе мезентериальных липопротеидов, богатых триацилглицеролом. В - периферической циркуляции эти частицы под действием липопротеин-липазы превращаются в хиломикроны и быстро захватываются печенью. В клетках печени CoQio «переупаковывается» в частицы лииопротеидов и вновь высвобождается в циркулирующую кровь, аналогично а-токоферолу [45, 183]. В плазме практически весь пул CoQio распределен в липопротеидах: наибольшие количества - в ЛПНП и ЛПОНП, и малая часть - в ЛВП [185]. Как следствие, плазменные уровни CoQ]0 находятся в зависимости от содержания в плазме липопротеидов [94]. В циркулирующей крови CoQio перераспределяется между липопротеидами для защиты их от окисления [177]. Доля восстановленной формы в общем пуле CoQ)0 в крови максимальна среди тканей организма и составляет около 95-97% общего содержания CoQ10 [13].

При приеме внутрь эффективность абсорбции CoQio низка вследствие его нерастворимости в воде, ограниченной растворимости в жирах и относительно большой молекулярной массы. Определение абсолютной биодоступности CoQio на сегодня невозможно из-за отсутствия форм для внутривенного введения. Поэтому большинство исследований фармакокинетики CoQl0 проведено при пероральном и внутримышечном введении. Попытка оценить долю CoQ10, абсорбируемого при приеме per os, была осуществлена в исследовании Y. Zhang на крысах: биодоступность, по расчетам авторов, составила 2-3% [201].

У человека после приема CoQio натощак per os его- плазменные уровни начинают медленно повышаться на протяжении первых 1-2 часов [117]. Время достижения максимальной концентрации в плазме (Ттах) наблюдается в интервале 6-8 часов [114]. Кинетика процесса абсорбции носит нелинейный характер, что часто связано с механизмами активного транспорта, и была описана у здоровых добровольцев как функция нулевого порядка [180]. Нелинейность кинетики всасывания CoQio подтверждается уменьшающимся приростом концентраций в плазме при увеличении дозы. В исследовании Shults [155] показано, что увеличение ежедневного потребления в четыре раза (с 300 до 1200 мг) повысило плазменные уровни лишь в 2,5 раза (с.1,4.до 3,4 мкг/мл). Механизмы всасывания CoQio достигают насыщения при дозах 2400 мг в день и дальнейшее увеличение дозы до 3000' мг в день не вызывает увеличения концентраций в плазме. Следовательно,- абсорбция CoQ10 ограничена, и процент абсорбции падает с увеличением-дозы.

Вследствие комплексности процесса, абсорбция CoQio может зависеть от целого ряда факторов. Так, высказывается мнение, что значительное влияние на степень всасывания CoQio может оказывать одновременный его прием с пищей [20, 21]. Однако в поддержку этого постулата имеется очень мало данных. Недостаточно изучено влияние возраста, пола, диеты, лекарственной формы и некоторых других факторов на биодоступность CoQio при хроническом приеме. Межиндивидуальная вариабельность степени абсорбции CoQio по площади под кривой концентрация-время достигает 30-50% [180; 32]. Эти факты определяют необходимость мониторинга плазменных уровней CoQio при клинических исследованиях, в особенности при изучении новых препаратов.

При приеме дозированных форм степень абсорбции зависит от физического состояния и природы субстанции CoQio в составе препарата. Как жирорастворимая субстанция, CoQio лучше всасывается растворенным в маслах, чем принятым в виде сухого порошка, таблеток или капсул [193, 159]. Деление суточной дозы на два или более приемов способствует достижению более высоких уровней в плазме [159].

В последние годы были созданы высокотехнологичные наноразмерные (nanoised) субстанции CoQio (рис. 8).

Architecture of NanoSorb™ Molecule

Lipid S«lubl« Ingredient* (Nutrients ft Vitamin»)

Water Soluble Ingredients (Nutrient* ft Vitamins)

New Polar Lipid

Lipid Layer

Рисунок 8. Структура нанопродукта технологии №по8огЬ, обеспечивающей молекулярную дисперсию жирорастворимых ингредиентов.

Первые исследования фармакокинетики этих субстанций в лекарственных формах продемонстрировали, что они обладают большей биодоступностыо, чем приготовленные по стандартным технологиям [163, 32, 117, 200]. К наноразмерным продуктам относят также солюбилизированные, микрокапсулированные и липосомальные субстанции СоС>ю. Микрокапсулирование убихинона заключается в «одевании» на каждую молекулу полисахаридного октациклодекстринового кольца (рис. 9).

Рис. 9. Химическая структура микрокапсулированного в циклодекстрине коэнзима Qio (QlOVital®, USA).

Циклодекстрин - полисахарид с гидрофильной поверхностью и гидрофобной внутренней средой. Липофильные молекулы CoQio, заключенные в индивидуальные капсулы полисахарида с гидрофильной поверхностью, полностью отделены друг от друга, что предотвращает их слипание в конгломераты (рис. 10).

Солюбилизированные формы содержат CoQio в составе мицелл, способных растворяться в воде. В обоих случаях продукт представляет собой субстанцию, в которой молекула или небольшая группа молекул CoQio изолирована от других. Таким образом, достигается практически полная молекулярная дисперсия CoQio, ускоряющая и облегчающая процесс всасывания и повышающая его биодоступность [204, 187, 200, 32]. ordinary nutrient nanoized nutrient

Рис. 10. Абсорбция обычной и микрокапсулированной субстанции: слипание обычной субстанции в конгломераты, ограничивающие степень абсорбции (1) и полная дисперсия частиц микрокапсулированной субстанции (2).

Включение СоОю в липосомы также способствует увеличению его биодоступности в результате облегченной абсорбции. Для липосомальной субстанции показана способность уже через 15 минут после внутривенного введения водной суспензии повышать содержание СоСЬо в миокарде и увеличивать устойчивость к ишемическому-реперфузионному повреждению [128, 129].

Эндогенные уровни Сорю в тканях

Коэнзим О («вездесущий хинон») у животных и человека присутствует во всех тканях. Содержание его видо- и органоспецифично. У относительно короткоживущих видов животных (мыши, крысы) доминатной формой является коэнзим С>9 [202]; у долгоживущих видов млекопитающих и человека преобладает декаизопреновый гомолог - коэнзим СЬо. Тканевое распределение и редокс-статус СоС^о в различных тканях человека и крысы приведены в табл. 2. Данные таблицы демонстрируют, что наибольшие количества СоО содержатся в тканях с высокими энергетическими затратами или метаболической активностью, таких как сердце, почки, печень и мышцы. Тканеспецифичным является не только общее содержание СоС^, но и соотношение убифенол/убихинон. Как правило, большая часть Со0> присутствует в восстановленной форме, за исключением мозга и легких, что считается отражением интенсивных окислительных процессов в этих тканях.

Таблица 2. Содержание и редокс-етатуе CoQio и CoQ9 в тканях человека и крысы [13, 202, 185]

Ткань/орган Содержание СоС^о (мкг/г) Содержание Со(29 (мкг/г) Доля восстановленной формы (%)

Человек

Сердце 114 3 61

Почки 67 3 75

Печень 55 2 95

Мышцы 40 1 60

Селезенка 25 1 23

Мозг 13 1 25

Легкие 8 1 24

Поджелудочная 33 2 100 железа

Кишечник 12 1 93

Желудок 12 59

Плазма крови 1,1 [171, 115] Не 94-97 [171, 115] нмоль/мл) определялась

Крыса

Сердце 17 202 22

Печень 21 131 87

Почки 22 124 42

Мышца 3 43 40

Мозг 19 37 27

Поджелудочная 3 37 62 железа

Селезенка 9 23 18

Легкие 2 17 12

Кишечник 19 51 67

Желудок 5 56 52

Плазма крови следы 270 65,3 нг/мл) [168]

Внутриклеточное распределение Сор на примере ткани печени приведено в табл. 3.

Таблица 3. Внутриклеточное распределение коэнзимов 0 в печени крысы

202].

Фракция Со(39 (пмоль/мг белка) (пмоль/мг белка)

Гомогенат 1040 99

Митохондрии 5919 535

Лизосомы 1126 120

Везикулы аппарата 805 92

Гольджи

Плазматические мембраны 353 37

Микросомы 249 57

Ядерная фракция 188 27

Пероксисомы 121 13

Цитозоль 106 11

Максимальное количество Со<3 содержат митохондрии, минимальное -цитозольная фракция и пероксисомы. Поэтому среди клеток крови в лимфоцитах и тромбоцитах находятся значительные количества СоС>, а в бедных митохондриями красных кровяных тельцах - только следы, предположительно относящиеся к мембранному пулу [179].

Нормальный интервал концентраций СоС^ю в плазме здоровых взрослых обычно сотавляет от 0,4 до 2,0 мкг/мл с небольшими популяционными вариациями (табл. 4).

Коэнзимы 0 в плазме крови ассоциированы в основном с липопротеидами, поэтому в некоторых исследованиях содержание Со(} нормируется на общий холестерин плазмы. Так, для американской популяции приводятся нормированные по холестерину значения в интервале 0,113 - 0,329 мкмоль/моль у мужчин и 0,119 - 0,326 мкмоль/моль у женщин [162].

Табл. 4. Референсные интервалы концентраций СоСЫ в плазме крови взрослых в различных популяциях

Популяция Содержание в плазме, мкг/мл Источник мужчины женщины

Финляндия 0,4- 1,72 0,43 - 1,47 [77]

США 0,5-1,91 0,5-1,91 [115]

Великобритания 0,227-1,432 0,227- 1,432 [43]

Захват CoQ тканями

Синтез убихинона протекает во всех тканях организма, поэтому в обычных условиях они не зависят от поступления его извне. Однако, содержание CoQ в тканях может меняться под воздействием ряда физиологических и патофизиологических факторов, таких как старение и окислительный стресс [46, 137]. В этих условиях для предотвращения или замедления развития патологических изменений становится актуальным пополнение сниженных тканевых уровней за счет экзогенного CoQ.

Механизм захвата CoQio тканями до сих пор детально не изучен. Предполагается [20], что механизмы абсорбции и распределения CoQio и а-ТОС могут быть сходными. Это предположение подкрепляется наблюдением Ibrahim Н. [72]: при добавлении в корм крысам комбинации CoQio+a-TOC прирост содержания CoQio в печени увеличивался при низких дозах а-ТОС и падал при высоких.

Печень располагает специфическим связывающим белком для возврата а-ТОС в циркуляцию в составе ЛПОНП и дальнейшего его транспорта к различным органам [198]. CoQio обнаружен в различных липопротеидах плазмы крови, как следствие возможного перераспределения в циркуляции.

Из циркулирующей крови после однократного внутрибрюшинного введения CoQio способен интенсивно захватываться печенью, селезенкой, надпочечниками, яичками, моноцитами и лимфоцитами; меньший прирост наблюдается в сердце и гипофизе при неизменных уровнях в почках, мышцах и мозге [19]. Добавление CoQio и а-ТОС в различных соотношениях к стандартной диете крыс приводило к достоверному росту содержания CoQio только в тканях печени и селезенки [72].

В исследовании [201], выявившем крайне низкую степень абсорбции CoQ10 в желудочно-кишечном тракте, убихинон, растворенный в смеси соевого и рапсового масел, вводили крысам через желудочный зонд. Уровни в тканях измерялись спустя 6 часов, а также через 4 и 8 суток ежедневного введения. Был обнаружен захват CoQio из циркулирующей крови печенью и селезенкой. Прирост уровней в печени дозозависимо возрастал в интервале доз от 0,3 до 12 мкмоль/100 г веса, после чего достигал насыщения. Ни в почках, ни в сердце содержание CoQio не увеличилось. Возрастание содержания CoQio в печени не изменило уровней CoQ9, то есть не повлияло на интенсивность его биосинтеза. Эти данные согласовывались с результатами исследования биосинтеза с помощью 3Н-мевалоната, меченного in vivo, на фоне введения CoQio с пищей [106]. В дальнейшем на основании этих результатов сформировалось мнение, что введение экзогенного убихинона не подавляет биосинтез последнего [185, 20].

Замечено, что для пополнения тканевых уровней необходимо повышение содержания CoQio в крови в несколько раз. Увеличение содержания CoQio в сердце и митоходриях мозга как результат хронического введения высоких доз убихинона (150-650 мг/кг в день) было зафиксировано в единичных исследованиях: у крыс [93] и мышей [78].

Одним из посредников захвата CoQio тканями, как для холестерина и а-ТОС, может являться ЛПНП-рецегггор, которым насыщены надпочечники и яички, т.е. органы, интенсивно захватывающие CoQ]0 из крови. Этот механизм, однако, может быть не единственным, так как количество рецепторов в органе и степень захвата им CoQio не всегда согласуются. Возможно [185], что тканевой захват происходит при участии специфического рецептора для CoQ10 и/или связывающего белка.

Ограниченный захват CoQ10 тканями обусловлен особенностями его биосинтеза и внутриклеточного распределения. «Сэндвичное» расположение липида в центральной, гидрофобной зоне мембраны, между двумя слоями фосфолипидов, делает ее насыщенной, и вследствие этого отсутствует функциональная необходимость и возможность разместить дополнительную порцию экзогенного CoQio в этом ограниченном пространстве (рис. 11). Действительно, захваченный печенью меченный CoQio локализуется главным образом в лизосомах, эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, а не в митохондриях, содержащих до 80% эндогенного пула убихинона [19]. Кроме того, все типы клеток сами синтезируют CoQ.

Dolichyl-P Cholesterol

DoHchol Coenzyme Q

Рис. 11. Расположение липидов мевалонатного пути синтеза в мембране

185].

Ситуация может меняться при патологически сниженных уровнях липида. Так, у детей с генетическим дефицитом синтеза CoQio [148] наблюдалось отсутствие его в лимфобластах и фибробластах, сопровождавшееся тяжелой неврологической симптоматикой и патологией мускулатуры. Прием CoQio разительно улучшал физические и интеллектуальные способности пациентов, восстанавливая ограниченную митохондриальную функцию. При кардиомиопатии и сниженном уровне CoQio в сердечной мышце (по данным биопсий) захват его миокардом на фоне приема экзогенного липида был интенсивнее у больных в тяжелой стадии заболевания, чем у больных со средней тяжестью течения болезни [54].

Следовательно, возможность распределения экзогенного CoQio из циркулирующей крови по органам и тканям, с одной стороны, зависит от его концентраций в плазме, а с другой - обусловлена их функциональным состоянием и потребностью в этом липиде. При достаточном тканевом уровне CoQ10 может не захватываться тканью или накапливаться во внутреннем пространстве отдельных органелл.

Фармакокинетические параметры CoQio

Зависимость концентрации CoQio в крови от времени после приема у людей была удачно аппроксимирована 3-частевой моделью [180]. После достижения Стах {Ттсис ' 6 час) фаза распределения продолжалась на протяжении следующих 6 часов. Через 24 часа после приема наблюдался второй пик плазменных концентраций, который предположительно мог являться результатом энтерогепатической рециркуляции (рис. 12).

Changes of CoQIO level in the blood after intake ф

03 о Б о 0 О 1 со

О 24 48 72 96 120 144 168 hr

Рис. 12. Фармакокинетическая кривая CoQio при приеме per os.

Предложенная комплексная фармакокинетическая модель позволила ее авторам объяснить наличие дополнительного пика концентрации и длительную терминальную фазу элиминации (/ й ~ 33 часа) как следствие перераспределения CoQio из периферических тканей в плазму крови. Согласующиеся данные были получены в исследованиях [193, 117], в которых после однократного приема CoQio для возврата уровней в плазме к исходным величинам потребовалось около 5-6 суток. В исследовании [71] показано, что через 2 недели после завершения 4-недельного введения CoQio в дозах 90 и 300 мг в день плазменные уровни все еще превышали исходные на 30 и 74%, соответственно. После однократного внутривенного введения [,4C]-CoQio морским свинкам его радиоактивность регистрировалась в надпочечниках, сердце, почках и мозге на протяжении 7 дней [199].

Приведенные данные свидетельствуют о возможности захвата экзогенного СоСЬо периферическими тканями с последующим медленным перераспределением в плазму в течение минимум 2 недель, в зависимости от продолжительности предшествующего периода введения.

Результаты исследований всасывания и распределения СоС)ю позволили понять причины безопасности сверхвысоких (до 3,5 г/день) доз и обосновать режимы дозирования: до 1200 мг в день взрослым и до 10 мг/кг в день детям. Контрольные определения концентраций в плазме рекомендуется проводить через 3-4 недели постоянного приема, когда достигается равновесный уровень [114].

В исследованиях на людях продемонстрирована более высокая биодоступность субстанций СоСЬо с повышенной растворимостью -солюбилизированных и комплексов с циклодекстрином [187, 204, 114] (рис. 13-15).

Анализируя накопленные данные контролируемых клинических испытаний различных фармацевтических продуктов СоСЬо, авторы обзора [21] пришли к заключению о наибольшей биодоступности солюбилизированных форм; как несолюбилизиронный, так и солюбилизированный, убихинол обладает лучшей биодоступностью, чем убихинон.

Рис. 13. Кинетические кривые после приема равных доз CoQio (120 мг) в виде трех различных форм: Q-Gel, содержащей солюбилизированую субстанцию (технология Bio-Solv®); all-Q® с наноразмерной субстанцией (TG/P) и Q-Sorb® с несолюбилизированным CoQio [187].

Рис. 14. Концентрации CoQio в плазме крови добровольцев на протяжении 12-ти (а) и 144-х часов (Ь) после приема внутрь 180 мг CoQio в четырех различных формах: трех формах, содержащих солюбилизированную субстанцию (три верхних графика), и одной форме, содержащей несолюбилизированную субстанцию CoQio [117].

0-5 -г

Он О 2 4 6

Типе !Ы в

10

12

Рис. 15. Прирост концентраций в плазме у людей после приема внутрь, натощак 60 мг Сорю в трех различных формах: мягких гелевых капсулах с эмульсией в соевом масле (Я); водной суспензии комплекса с Р-циклодекстрином (Т1) и порошке комплекса с р-цикло декстрином (Т2) [204].

Подводя итог анализу данных научной литературы можно заключить, что СоРю является перспективным терапевтическим агентом в лечении ишемических состояний миокарда. Проведение дальнейших клинических исследований предполагает, с одной стороны, применение препаратов Сорю, обладающих максимальной биодоступностью и способных повысить его содержание в крови и сердечной мышце, а с другой - более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия. Современный фармацевтический рынок изобилует предложениями СоСЬо-содержащих биологически активных добавок и препаратов. В контроле их качества и оценке биоэквивалентности лидирующие позиции занимает ВЭЖХ с электрохимическим детектированием как аналитический метод, обладающий наибольшей чувствительностью и селективностью.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Заключение диссертации по теме «Фармацевтическая химия и фармакогнозия», Каленикова, Елена Игоревна

IV. выводы

1. Разработана ВЭЖХ-методика разделения и высокочувствительного электрохимического определения коэнзимов Q9, Qi0 и а-ТОС, применимая для анализа лекарственных форм, содержащих солюбилизированный и микрокапсулированный коэнзим Qio, а также плазмы/сыворотки крови, тканей миокарда и мозга.

2. Изучена фармакокинетика CoQ10 для порошка субстанции, раствора солюбилизированного CoQio и таблеток микрокапсулированного CoQ10. Доказаны преимущества по биодоступности наноразмерных субстанций (солюбилизированного и микрокапсулированного CoQio) относительно порошка жирорастворимой субстанции.

3. Изучено влияние длительного энтерального введения БАД «Кудесан» раствор, содержащего солюбилизированный CoQi0 и а-ТОС. на их уровни в плазме и миокарде крыс: показана возможность увеличения содержания в сердечной мышце и сопряженное повышение уровней C0Q9. Прослежено динамическое изменение взаимоотношений C0Q10, C0Q9 и а-ТОС на фоне хронического введения препарата «Кудесан» раствор и после его прекращения.

4. Выявлен эффект отмены C0Q10 после длительного применения внутрь, проявившийся через 2 недели в снижении миокардиальных уровней коэнзимов Q и и а-токоферола ниже контрольных значений.

5. Разработана ВЭЖХ-методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, базирующаяся на микродиализе миокарда раствором салицилата натрия и высокочувствительном электрохимическом детектировании в диализатах продуктов гидроксилирования салицилата. Представленная методика позволяет отслеживать уровень генерации ОН* на протяжении нескольких часов.

6. Выявлен повышенный уровень ОН* в гипертрофированном миокарде животных с наследственной артериальной гипертензией и в миокарде крыс при острой ишемии-реперфузии. При патологических состояниях миокарда интенсивность генерации ОН* в ткани положительно взаимосвязана с выраженностью патологии: при гипертрофии миокарда - с индексом массы, при ишемии-реперфузии - с размером некротического повреждения.

7. Выявлено истощение содержания антиоксидантов - коэнзимов 0 и а-ТОС в постинфарктном гипертрофированном миокарде крыс. В миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией выявлен дефицит коэнзимов С): уже в 6-недельном возрасте для обоих желудочков сердца спонтанно-гипертензивных животных характерны сниженные уровни СоС) и повышенные уровни а-ТОС; дефицит СоС^ю увеличивается с возрастом, а уровни а-ТОС снижаются до возрастной нормы к 24-й неделе жизни.

8. Выраженность патологии миокарда у молодых (6 месячных) спонтанно-гипертензивных крыс - индекс массы левого желудочка прямо коррелирует с уровнями СоС) в плазме и обратно пропорционален их содержанию в миокарде. Не выявлено взаимосвязи индекса массы гипертрофированного левого желудочка с плазменными или миокардиальными уровнями а-ТОС.

9. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» раствор у крыс с наследственной артериальной гипертензией. Хроническое введение приводит к повышению его содержания в сердечной мышце при сохранении обратной связи с индексом массы левого желудочка, что сопровождается замедлением деструктивных и активизацией регенераторных процессов в гипертрофированной ткани миокарда.

10. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» раствор при инфаркте миокарда. Хроническое предварительное и продолжающееся после инфаркта энтеральное введение БАД «Кудесан» раствор повышает уровни коэнзимов р в сердечной мышце и одновременно ограничивает размер зоны некроза и постинфарктную гипертрофию миокарда. Наличие сильной взаимосвязи плазменных концентраций коэнзимов Р с величиной зоны некроза подтверждает причинную роль повышенных тканевых уровней Сор в ограничении ишемических повреждений миокарда.

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью данной работы было проведение комплексной оценки эффективности и качества БАД на основе коэнзима СЫ для обоснования его применения в качестве кардиопротектора. В диссертации представлены результаты исследований фармацевтических, фармакокинетических, патофизиологических и фармакологических факторов, аргументирующие и доказывающие способность коэнзима СЬ как терапевтического агента оказывать защитное действие на сердечную мышцу.

Проведение исследования стало возможным благодаря широчайшим возможностям высокоэффективной жидкостной хроматографии. ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим детектором послужила основным аналитическим инструментом для изучения объектов исследования: субстанции и БАД на основе коэнзима СЬо, образцов плазмы, сыворотки крови, тканей миокарда и мозга, микродиализатов миокарда крыс.

Подобраны условия хроматографического разделения-и определения СоС)10, позволяющие одновременно проводить количественный анализ СоС^о, СоС)9 и а-ТОС с чувствительностью на уровне лучших из известных методик. Важность одновременной оценки уровня СоС>9 обусловлена преобладанием этого убихинона у таких экспериментальных животных как крысы. а-ТОС является вторым жирорастворимым антиоксидантом, работающим в мембранах в ансамбле с коэнзимом Процедура экстракции обеспечивает их воспроизводимое извлечение из биологических образцов с высокой эффективностью (92-100%).

Проведен комплексный анализ коэнзима СЫ как лекарственного вещества: количественное определение и изучение его фармакокинетики в составе нескольких БАД, оценка фармакологической- эффективности- на различных эксперименальных моделях патологии миокарда.

С помощью разработанной методики были проанализированы на соответствие заявленной дозировке БАД, содержащие СоС)|0: раствор солюбилизированного Сорю «Кудесан», таблетки микрокапсулированного СоС2ю «Кудесан форте» и «Кудесан для детей». Показано, что содержание СоСЫ в БАД

Кудесан», таблетках «Кудееан форте» и «Кудесан для детей» отвечает требованиям ТУ.

Высокая чувствительность определения дала возможность изучить фармакокинетику СоСЬо в экспериментах на крысах на протяжении 48 часов после введения внутрь. Определены и рассчитаны основные фармакокинетические параметры СоСЬо (Стач, Ттах, АиС0-485 Стах/Аис0.48) для порошка субстанции и БАД; обнаружены факты, подтверждающие наличие энтерогепатической циркуляциии. Для всех трех БАД в сравнении с порошком были достоверно выше величина максимальной концентрации Сгаах (в 1,5-3 раза) и биодоступность (264, 734 и 325% для БАД «Кудесан», «Кудесан форте» и «Кудесан для детей»). Выявленные фармакокинетические особенности БАД на основе солюбилизированного и микрокапсулированного СоС^о доказали преимущества его наноразмерных субстанций.

Доказана способность СоСЬо в составе БАД «Кудесан» раствор повышать содержание СоС^ю и СоСЬ в плазме и сердечной мышце крысы в результате длительного введения внутрь. Впервые прослежена динамика плазменных и миокардиальных концентраций коэнзимов С* не только при хроническом введении БАД «Кудесан» (через 3 и 6 недель), но и после его отмены (спустя 2 и 6 недель). Обнаружена обратная зависимость между эндогенными уровнями СоСЬо в плазме и миокарде контрольных крыс, свидетельствующая об отсутствии поступления эндогенного СоС^ю из плазмы крови в ткани миокарда. И в плазме, и в миокарде выявлена сильная положительная взаимосвязь эндогенных уровней Со(Зю и СоСЬ, СоСЬо и а-ТОС, СоСЬ и а-ТОС, что доказывает их командное функционирование как антиоксидантов. Прослежены изменения этих взаимоотношений на фоне хронического введения БАД «Кудесан» раствор и после его прекращения.

Впервые выявлен эффект отмены, проявившийся спустя« 2 недели в снижении миокардиального уровня- коэнзимов <3 ниже контрольных значений. Обнаруженный феномен требует пересмотра отношения к коэнзиму СЬо как абсолютно безопасному фармакологическому агенту даже в дозах до нескольких граммов в сутки. Возможность резкого снижения' содержания коэнзима СЬ0 в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы коэнзима СЫ и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования.

Повышенная биодоступность солюбилизированной субстанции CoQio («Кудесан» раствор), возможность точного дозирования и способность при длительном введении пополнять уровни в миокарде определили выбор этого препарата для последующей оценки кардиопротекторной эффективности.

Для оценки интенсивности генерации АФК в миокарде разработана методика определения продукта гидроксилирования салицилата - 2,3-ДГБК в микродиализатах миокарда, позволяющая количественно оценить уровень гидроксильного радикала в ткани in vivo. Анализ on line микрообразцов диализата (в объеме 15-30 мкл) дал возможность мониторировать уровень ОН" в миокарде на протяжении нескольких часов и, таким образом, оценить интенсивность генерации АФК при острых и хронических патологических состояниях миокарда.

Впервые обнаружен повышенный фоновый уровень ОН" в гипертрофированном миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией (линия SHRSP) относительно миокарда нормотензивных крыс. Зарегистрировано возрастание генерации ОН* при острой ишемии-реперфузии миокарда крыс обеих линий. Интенсивность генерации ОН* оказалась прямо пропорциональна выраженности патологических изменений миокарда: фоновый уровень генерации у крыс линии SHRSP - индексу массы левого желудочка, величина реперфузионного выброса у крыс Wistar - размеру очага некроза по окончании ишемии-реперфузии. Показано, что при ишемии-реперфузии в гипертрофированном миокарде спонтанно гипертензивных крыс генерация гидроксильных радикалов происходит интенсивнее, чем в миокарде нормотензивных крыс. Это может являться одной из основных причин большего ишемического-реперфузионного повреждения и свидетельствовать о наличии в миокарде крыс SHRSP антиоксидантного дефицита.

Впервые обнаружено, что ишемическое прекондиционирование миокарда способно сократить продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов и, возможно, поэтому приводит к многократному уменьшению размера зоны повреждения.

Выявленная взаимозависимость миокардиальных уровней ОН* и выраженности патологических изменений ткани может служить подтверждением участия процессов свободнорадикального окисления в патогенезе гипертрофии сердечной мышцы и патогенетическим обоснованием применения антиоксидантов.

ВЭЖХ-определение липофильных антиоксидантов - коэнзимов СЫ, <39 и а-ТОС в образцах плазмы, сыворотки, мозга и миокарда позволило оценить степень защищенности клеточных мембран от атаки свободных радикалов в норме и при патологических состояниях. Выявлен нарастающий с возрастом дефицит коэнзимов С) в миокарде спонтанно гипертензивных крыс. Характерно, что на раннем этапе развития гипертрофии, у 6-недельных крыс линии 8ЬЖ8Р, индекс массы ЛЖ не зависел от величин артериального давления, частоты сердечных сокращений, а был взаимосвязан с содержанием коэнзима СЬ0 в миокарде и плазме крови. Обнаружено истощение содержания коэнзимов С), а-ТОС и в гипертрофированном постинфарктном миокарде крыс Wistar.

Хроническое ежедневное введение внутрь БАД «Кудесан» (10 мг/кг) крысам с наследственной артериальной гипертензией с 6-й по 12-ю- неделю жизни повышало содержание коэнзимов С) в плазме и миокарде. Пополнение миокардиальных уровней сопровождалось замедлением деструктивных и активизацией регенераторных процессов в гипертрофированной сердечной мышце. «Кудесан» (внутрь, 10 мг/кг) в результате хронического предварительного и продолжающегося после инфаркта миокарда введения крысам \Vistar повышал плазменные и миокардиальные уровни коэнзимов С>, одновременно ограничивая размер зоны, некроза и постинфарктную гипертрофию левого желудочка. Выявленная сильная обратная взаимосвязь плазменных концентраций коэнзимов с размером зоны некроза свидетельствует о способности коэнзима СЫ уменьшать степень ишемических повреждений миокарда.

Комплексный анализ результатов проведенных исследований позволил охарактеризовать особенности окислительно-восстановительного статуса гипертрофированного миокарда. Повышенный уровень наиболее агрессивного из АФК - гидроксильного радикала и, одновременно, сниженное содержание коэнзимов С) представляются в свете полученных данных звеньями одной цепи, ведущей к развитию и прогрессированию процессов ремоделирования сердечной мышцы. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Прямая взаимосвязь индивидуальных эндогенных уровней коэнзимов <3 с а-ТОС в плазме крови и миокарде свидетельствует об их совместном функционировании как антиоксидантов. Введение экзогенного коэнзима СЬо и а-ТОС в составе БАД «Кудесан» повышает содержание этих спарринг-партнеров в миокарде, что приводит к временному нарушению равновесия между ними, на гармонизацию которого требуется несколько недель. Этот факт может отчасти объяснить отсроченное проявление эффектов коэнзима СЬо при хроническом приеме. Впервые обнаруженный эффект отмены коэнзима С2ю - снижение миокардиальных уровней убихинона ниже контрольных значений - сопровождался снижением и уровней а-токоферола. Восстановление нормального содержания и соотношения обоих антиоксидантов в сердечной мышце протекало на протяжении месяца.

Однако, и у спонтанногипертензивных, и у постинфарктных животных степень патологических изменений коррелировала с содержанием коэнзима С), но не а-токоферола. Этот факт подчеркивает уникальный терапевтический потенциал коэнзима СЬо, выполняющего двуединую фунцию: обеспечения переноса электронов для достаточного синтеза макроэргических фосфатов и детоксикации избытка свободных радикалов. Уменьшение выраженности патологии миокарда в результате повышения тканевого содержания коэнзимов доказывает наличие обратной связи и обосновывает использование коэнзима СЫ для кардиопротекции.

Список литературы диссертационного исследования доктор фармацевтических наук Каленикова, Елена Игоревна, 2009 год

1. Аронов Д.М. Что важно знать практическому врачу об убихиноне (коэнзиме Q10) / Аронов Д.М. // Русский медицинский журнал. 2006. - Т.14, №4. - С.223-230.

2. Коган Л. Определение убихинонов в бактериальных биомассах / Коган Л., Обольникова Е. // Химико-фармацевтический журнал. 1990. - № 24. - С. 76-77.

3. Коферменты / Под ред. проф. В.А. Яковлева. М.: Медицина, 1973. - 377 с.

4. Лакомкин В.Л. Защитное действие убихинона (коэнзима Q10) при ишемии и реперфузии сердца / Лакомкин В.Л., Коркина О.В., Цыпленкова В.Г. и др. // Кардиология. 2002. - №12. - С.51-55.

5. Ланкин В.З. Свободнорадикальные процессы при заболевании сердечнососудистой системы / Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. // Кардиология. -2000. Т.40, №7. - С.48-61.

6. Люсов В.А. Состояние свободнорадикального окисления у больных гипертрофической кардиомиопатией / Люсов В.А., Гомзикова Ю.А. // Тер. арх. -1997. Т.69. - С.44-49.

7. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты/ Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. М.: Фирма «Слово», 2006. - 556 с.

8. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания / Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Новосибирск: APTA, 2008. -284 с.

9. Пальцын А.А. Микроскопическая техника / Пальцын A.A. М.: Медицина, 1996. - С.253-283.

10. Петрищев Н'.Н. Ишемическая адаптация миокарда: патофизиологические механизмы и возможные перспективы практического применения / Петрищев H.H., Шляхто Е.В., Власов Т.Д., Галагудза М.М. // Рос. физиол. журн. им. И. М.

11. Сеченова. 2001. - Т.87, №5. - С.688-705.

12. Электроаналитические методы / Под ред. В.Н. Майстренко. М.: Бином, 2006. - 326 с.

13. Aberg F. Distribution and redox state of ubiquinones in rat and human tissues / Aberg F., Appelkvist E-L., Dallner G., Ernster L. // Arch Biochem Biophys. 1992. -V.295, N2. - P.230-4.

14. Andersson S. Determination of coenzyme Q by non-aqueous reversed-phase liquid chromatography / Andersson S. // J Chromatogr. 1992. - V.606, N2. - P.272-6.

15. Assem M. Pattern of superoxide dismutase enzymatic activity and RNA changes in rat heart ventricles after myocardial infarction / Assem M., Teyssier J.R., Benderitter M. et al. // Am J Pathol. 1997. - V.15, N2. - P.549-55.

16. Baines C.P. Oxygen radicals released during ischemic preconditioning contribute to cardioprotection in the rabbit myocardium / Baines C.P., Goto M., Downey J.M. // J Mol Cell Cardiol: 1997. - V.29, N1. - P.207-16.

17. Batist G. Response to ischemia-reperfusion injury in hypertrophic heart. Role of free-radical metabolic pathways / Batist G., Mersereau W., Malashenko B.A., Chiu R.C. // Circulation. 1989. - V.80, N5 (Pt 2). - P.III10-3.

18. Bentinger M. Distribution and breakdown of labeled coenzyme Q10 in rat / Bentinger M., Dallner G. // Free Radic Biol Med. 2003. - V.34, N5. - P.563-75.

19. Bhagavan H.N. Coenzyme Q10: absorption, tissue uptake, metabolism and pharmacokinetics / Bhagavan H.N., Chopra R.K. // Free Radic Res. 2006. - V.40, N5.- P.445-53.

20. Bhagavan H.N. Plasma coenzyme Q10 response to oral ingestion-of coenzyme Q10 formulations / Bhagavan H.N., Chopra R.K. // Mitochondrion. 2007. - N7 Suppl.- P.S78-88.

21. Birnbaum Y. The effect of coenzyme Q10 on infarct size in a rabbit model of ischemia/reperfusion / Birnbaum Y., Hale S.L., Kloner R.A. // Cardiovasc Res. 1996. -V.32, N5. - P.861-8.

22. Brown M.S. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis / Brown M.S., Goldstein J.L. // Science. 1986. - V.232, N4746. - P.34-47.

23. Carlos D.M. Nicardipine normalizes elevated levels of antioxidant activ ity in response to xanthine oxidase-induced oxidative stress in hypertensive rat heart / Carlos D.M., Goto S., Urata Y. et al. // Free Radic Res. 1998. - V.29, N2. - P.143-50.

24. Chello M. Protection by coenzyme Q10 from myocardial reperfusion injury during coronary artery bypass grafting / Chello M., Mastroroberto P., Romano R. et al. // Ann Thorac Surg. 1994. - V.58, N5. - P. 1427-32.

25. Chello M. Protection by coenzyme Q10 of tissue reperfusion injury during abdominal aortic cross-clamping / Chello M., Mastroroberto P., Romano R. et al. // J Cardiovasc Surg (Torino). 1996. - V.37, N3. - P.229-35.

26. Chen H. Impaired heart function and noradrenaline release after ischaemia in-stroke-prone spontaneously hypertensive rats / Chen H., Azuma M., Maeda K. et al. // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2000. - V.27, N9. - P.664-70. •

27. Chopra R.K. Relative bioavailability of coenzyme Q10 formulations in human subjects / Chopra R.K., Goldman R., Sinatra S.T., Bhagavan H.N. // Int J Vitam Nutr

28. Res. 1998. - V.68, N2. - P.109-13.

29. Coudray C. Determination of salicylate hydroxylation products as an in vivo oxidative stress marker / Coudray C., Favier A. // Free Radic Biol Med. 2000. - V.29, N11. - P.1064-70.

30. Crane F.L., Isolation of a quinone from beef heart mitochondria / Crane F.L., Hatefi Y., Lester R.L., Widmer C. // Biochim Biophys Acta. 1957. - V.25, N1. -P.220-1.

31. Crestanello J.A. Effect of coenzyme Q10 supplementation on mitochondrial function after myocardial ischemia reperfusion / Crestanello J.A., Doliba N.M., Doliba N.M. et al. // J Surg Res. 2002. - V.102, N2. - P.221-8.

32. Csonka C. Effects of oxidative stress on the expression of antioxidative defence enzymes in spontaneously hypertensive rat hearts / Csonka C., Pataki T., Kovacs P: et al. // Free Radic. Biol. Med. 2000. - V.29, N7. - P.612-619.

33. Cuzzocrea S. Antioxidant therapy: a new pharmacological approach in shock, inflamation, and ischemia/reperfusion injury / Cuzzocrea S., Riley D.P., Caputi A.P., Salvemini D. //Pharmacol. Rev. -2001. V.53, N1. - P. 135-159.

34. Dallner G. Regulation of ubiquinone metabolism / Dallner G., Sindelar P.J. // Free Radic Biol Med. 2000. - V.29, N3-4. - P.285-94.

35. Das D.K. Detection of hydroxyl radical in the mitochondria of ischemic-reperfused myocardium by trapping with salicylate / Das D.K., George A., Liu X., Rao P.S. // Biochem. Biophys. Res. Comun. 1989. - V.165, N3 - P.1004-1009.

36. Dhalla A.K. Role of oxidative stress in transition of hypertrophy to heart failure / Dhalla A.K., Hill M.F., Singal P.K. // J Am Coll CardioL 1996. - V.28, N2: - P.506-14. .

37. Dhalla N.S. Role of oxidative stress in cardiovascular diseases / Dhalla N.S., Temsah R.M., Netticadan T. // J Hypertens. 2000. - V.18, N6. - P.655-73.

38. Duncan A. Determination of coenzyme Q10 status in blood mononuclear cells, skeletal muscle, and plasma by HPLC with di-propoxy-coenzyme Q10 as an internalstandard / Duncan A., Heales S., Mills K. // Clin Chem. 2005. - V.51, N12. - P.2380-2.

39. Echtay K.S. Coenzyme Q is an obligatory cofactor for uncoupling protein function / Echtay K.S., Winkler E., Klingenberg M. // Nature. 2000. - V.408, N6812. - P.609-13.

40. Elmberger P.G. Discharge of newly-synthesized dolichol and ubiquinone with lipoproteins to rat liver perfusate and to the bile / Elmberger P.G., Kalen A., Brunk U.T., Dallner G. // Lipids. 1989. - V.24, N11.- P.919-30.

41. Ernster L. Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function / Ernster L„ Dallner G. // Biochim Biophys Acta. 1995. - V.1271, N1. - P.195-204.

42. Farbu T. Ubiquinone analyses in fish tissues and in some marine invertebrates / Farbu T., Lambertsen G. // Comp Biochem Physiol B. 1979. - V.63, N3. - P.395-7.

43. Feng J. Transient ischemia inhibits nonexocytotic release of norepinephrine following sustained ischemia in rat heart: is bradykinin involved? / Feng J., Yamaguchi N., Foucart S. et al. // Can J Physiol Pharmacol. 1997. - V.75, N6. - P.665-70.

44. Ferrari R. Oxygen-free radicals at myocardial level: effects of ischaemia and reperfusion / Ferrari R. // Adv Exp Med Biol. 1994. - V.366. - P.99-111.

45. Ferrari R. Myocardial damage during ischaemia and reperfusion / Ferrari R., Ceconi C., Curello S. et al. // Eur Heart J. 1993. - V.14, Suppl G. - P.25-30.

46. Festenstein G.N. A constituent of the unsaponifiable portion of animal tissue lipids (lambda max. 272 m mu) / Festenstein G.N., Heaton F.W., Lowe J.S., Morton R.A. // Biochem J. 1955. - V.59, N4. - P.558-66.

47. Feuerstein G.Z. Protective effects of carvedilol in the myocardium / Feuerstein G.Z., Bril A., Ruffolo R.R.Jr. // Am J Cardiol. 1997. - V.80, N11A. - P.41L-45L.

48. Folkers K. Biochemical rationale and myocardial tissue data on- the effective therapy of cardiomyopathy with coenzyme Q10 / Folkers K., Vadhanavikit S., Mortensen S.A. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1985. V.82, N3. - P.901-4.

49. Gao M. Indirect identification of isoprenoid quinones in Escherichia coli by LC

50. MS with atmospheric pressure chemical ionization in negative mode / Gao M., Liu H. // J Basic Microbiol. 2004. - V.44, N6. - P.424-9.

51. Gao M. Identification of ubiquinones and menaquinones in activated sludge by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry / Gao M., Yang M. // J Chromatogr A. 2003. - V.1007, N1-2. - P.31-7.

52. Grootveld M. Aromatic hydroxylation as a potential measure of hydroxyl-radical formation in vivo. Identification of hydroxylated derivatives of salicylate in human body fluids / Grootveld M, Halliwell B. // Biochem J. 1986. - V.237, N2. - P.499-504.

53. Grossi G. Improved high-performance liquid chromatographic method for the determination of coenzyme Q10 in plasma / Grossi G., Fiorella P., Piazzi S., Battino M. // J Chromatogr. 1992. - V.593, N1-2. - P.217-26.

54. Grunler J. Branch-point reactions in the biosynthesis of cholesterol, dolichol, ubiquinone and prenylated proteins / Grunler J., Ericsson J., Dallner G. // Biochim Biophys Acta. 1994. - V.1212, N3. - P.259-77.

55. Guarnieri C. Involvement of superoxide radicals on adrenochrome formation stimulated by arachidonic acid in bovine heart sarcolemmal vesicles / Guarnieri C., Ventura C., Georgountzos A. et al. // Biochim Biophys Acta. 1985. - V.838, N3. -P.355-60.

56. Gupta M. Reduced vulnerability of the hypertrophied rat heart to oxygen-radical injury / Gupta M., Gameiro A., Singal P.K. // Can J Physiol Pharmacol. 1987. - V.65, N6.-P. 1157-64.

57. Gutknecht J. Aspirin, acetaminophen and proton transport through phospholipid bilayers and mitochondrial membranes / Gutknecht J. // Mol Cell Biochem. 1992. -V.114, N1-2. - P.3-8.

58. Hagerman R.A. Ubiquinone binding protein used for determination of coenzyme Q / Hagerman R.A., Willis R.A., Hagerman A.E. // Anal Biochem. 2003. - V.320, N1. - P.125-8.

59. Halliwell B. Hydroxylation of salicylate as an assay for hydroxyl radicals: a cautionary note / Halliwell B., Kaur H., Ingelman-Sundberg M. // Free Radic Biol Med. -1991.-V.10, N6. -P.439-41.

60. Halliwell B. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cellculture: how should you do it and what do the results mean? / Halliwell B., Whiteman M. // Br J Pharmacol. 2004. - V. 142, N2. - P.231-55.

61. Hansen G. Sensitive and selective analysis of coenzyme Q10 in human serum by negative APCI LC-MS / Hansen G., Christensen E., Tuchsen E. // Analyst. 2004. -V.129, N1. - P.45-50.

62. Headrick J.P. Ischemic preconditioning: bioenergetic and metabolic changes and the role of endogenous adenosine / Headrick J.P. // J Mol Cell Cardiol. 1996. - V.28, N6.-P. 1227-40.

63. Hill M.F. Antioxidant and oxidative stress changes during heart failure subsequent to myocardial infarction in rats / Hill M.F., Singal P.K. // Am J Pathol. 1996. - V.148, N1. - P.291-300.

64. Hiroshima O. Electrochemical detector for high-performance liquid chromatography. Application of a twin electrochemical detector / Hiroshima O., Ikenoya S. // Chem. Pharm. Bull. 1983. - V.31, N10. - P.3571-3578.

65. Hodgson J.M. Coenzyme Q10 improves blood pressure and glycaemic control: a controlled trial in subjects with type 2 diabetes / Hodgson J.M., Watts G.F., Playford D.A. et al. // Eur J Clin Nutr. 2002. - V.56, N11.- P. 1137-42.

66. Hosoe K. Study on safety and bioavailability of ubiquinol (Kaneka QH) after single and 4-week multiple oral administration to healthy volunteers / Hosoe K., Kitano M., Kishida H. et al. // Regul Toxicol Pharmacol. 2007. - V.47, N1. - P. 19-28.

67. Ibrahim W.H. Dietary coenzyme Q10 and vitamin E alter the status of these compounds in rat tissues and mitochondria / Ibrahim W.H., Bhagavan H.N., Chopra R.K., Chow C.K. // J Nutr. 2000. - V. 130, N9. - P.2343-8.

68. Janssen M. Myocardial xanthine oxidoreductase activity in hypertensive and hypercholesterolemic rats / Janssen M., Jong J.W., Pasini E., Ferrari R. // Cardioscience. 1993. - V.4, N1. - P.25-9.

69. Jiang P. Analysis of coenzyme Q(10) in human plasma by column-switching liquid chromatography / Jiang P., Wu M. // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2004. - V.805, N2. - P.297-301.

70. Joy M.M. On the mechanism of transport of salicylate and p-hydroxybenzoic acid across human red cell membranes / Joy M.M., Cutler D.J. // J Pharm Pharmacol. 1987.- V.39, N4. P.266-71.

71. Judy W.V. Myocardial preservation by therapy with coenzyme Q10 during heart surgery / Judy W.V., Stogsdill W.W., Folkers K. // Clin Investig. 1993. - V.71, 8 Suppl.-P.S 155-61.

72. Kaikkonen J. Coenzyme Q10: absorption, antioxidative properties, determinants, and plasma levels / Kaikkonen J., Tuomainen E-P., Nyyssonen K., Salonen J.T. // Free Radic Res. 2002. - V.36, N4. - P.389-97.

73. Kamzalov S. Coenzyme Q intake elevates the mitochondrial and tissue levels of Coenzyme Q and alpha-tocopherol in young mice / Kamzalov S., Sumien N., Forster M.J., Sohal R.S. // J Nutr. 2003. - V. 133, N10. - P.3175-80.

74. Karam L.R. Biomarkers of OH radical damage in vivo / Karam L.R., Bergtold D.S., Simic M.G. // Free Radic Res Commun. 1991. - V.12-13, Pt 1. - P.l 1-6.

75. Karam L.R. Detecting irradiated foods: use of hydroxy 1 radical biomarkers / Karam L.R., Simic M.G. // Anal Chem. 1988. - V.60, N19. - P.l 117A-1119A.

76. Kaprinsca J. HPLC method for simultaneous determination of retinol, alpha-tocopherol and coenzyme Q10 in human plasma / Kaprinsca J., Mikoluc B., Motkowski R. // J Pharm Biomed Anal. 2006. - V.42, N2. - P.232-6.

77. Karpinska J. Application of derivative spectrophotometry for determination of coenzyme Q10 in pharmaceuticals and plasma / Karpinska J., Mikoluc B., Piotrowska-Jastrzebska J. // J Pharm Biomed Anal. 1998. - V.17, N8. - P.1345-50.

78. Karpinska J. Application of Tocopherol Acetate as Internal Standard in UV-Derivative Spectrophotometric analysis of coenzyme Q10 / Karpinska J., Frankowska R. // Instrumentation Science and Technology. 2004. - V.32, N3. - P.281-290.

79. Katayama K. Studies on lymphatic absorption of l',2'-( 3 H)-coenzyme Q 10 in rats / Katayama K., Fujita T. // Chem Pharm Bull (Tokyo). 1972. - V.20, N12. -P.2585-92.

80. Khatta M. The effect of coenzyme Q10 in patients with congestive heart failure /

81. Khatta M., Alexander B.S., Krichten C.M. et al. // Ann Intern Med. 2000. - V.132, N8. - P.636-40.

82. Kimoto S. Regional distribution of superoxide dismutase in the brain and myocardium of the stroke-prone spontaneously hypertensive rat / Kimoto S., Nishida S., Funasaka K. et al. // Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl. 1995. - V.22, N1. - P.S160-1.

83. Kirshenbaum L.A. Antioxidant changes in heart hypertrophy: significance during hypoxia-reoxygenation injury / Kirshenbaum L.A., Singal P.K. // Can J Physiol Pharmacol. 1992. - V.70, N10. - P. 1330-5.

84. Kondo M. Noradrenergic hyperinnervation in the heart of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) / Kondo M., Fujiwara T., Tabei R. // Hypertens Res. 1996. - V.19, N2. - P.69-73.

85. Kuklinski B. Coenzyme Q10 and antioxidants in-acute myocardial infarction / Kuklinski B., Weissenbacher E., Fahnrich A. // Mol Aspects Med. 1994. - V.15, Suppl. -P.S143-7.

86. Kuzmin A.I. Effects of preconditioning on myocardial interstitial levels of ATP and its catabolites during regional ischemia and reperfusion in the rat / Kuzmin A.I., Gourine A.V., Molosh A.I. et al. // Basic Res Cardiol. 2000. - V.95, N2. - P. 127-36.

87. Kwong L.K. Effects of coenzyme Q(10) administration on its tissue concentrations, mitochondrial oxidant generation, and oxidative stress in the rat / Kwong L.K., Kamzalov S., Rebrin I. et al. // Free Radic Biol Med. 2002. - V.33, N5. - P.627-38.

88. Laaksonen R. Serum and muscle tissue ubiquinone levels in healthy subjects / Laaksonen R., Riihimaki A., Laitila h et al. // J Lab Clin Med. 1995. - V.125, N4. -P.517-21.

89. Lang J.K. Quantitative determination of vitamin E and oxidized and reduced coenzyme Q by high-performance liquid chromatography with in-line ultraviolet and electrochemical detection / Lang J.K., Packer L. // J Chromatogr. 1987. - V.385. -P.109-17.

90. Langsjoen H.A. Usefulness of coenzyme Q10 in clinical cardiology: a long-term study / Langsjoen H.A., Langsjoen P.H., Langsjoen P.H. et al. // Mol Aspects Med. -1994. V.15, Suppl. - P.sl65-75.

91. Langsjoen P.H. Response of patients in classes III and IV of cardiomyopathy to therapy in a blind and crossover trial with coenzyme Q10 / Langsjoen P.H., Vadhanavikit S., Folkers K. // Proc Natl Acad Sei USA.- 1985. V.82, N12. - P.4240-4.

92. Lasley R.D. Effects of ischemic and adenosine preconditioning on interstitial fluid adenosine and myocardial infarct size / Lasley R.D., Konyn R.J., Hegge J.O., Mentzer R.M. // Am J Physiol. 1995. - V.269, N4 Pt 2. - P.H1460-6.

93. Lass A. Comparisons of coenzyme Q bound to mitochondrial membrane proteins among different mammalian species / Lass A., Sohal R.S. // Free Radic Biol Med. -1999. V.27, N1-2. - P.220-6.

94. Li J.M. Activation of NADPH oxidase during progression of cardiac hypertrophy to failure / Li J.M., Gall N.P., Grieve D.J. et al. // Hypertension. 2002. - V.40, N4. -P.477-84.

95. Lin L. Coenzyme Q10 content in different parts of the normal human heart / Lin L., Sotonyi P., Somogyi E. et al. // Clin Physiol. 1988. - V.8, N4. - P.391-8.

96. Littarru G.P. Deficiency of coenzyme Q 10 in human heart disease. II / Littarru G.P., Ho L., Folkers K. // Int J Vitam Nutr Res. 1972. - V.42, N3. - P.413-34.

97. Littaru G.P. Deficiency of coenzyme Q 10 in human heart disease. I / Littaru G.P., Ho L., Folkers K. // Int J Vitam Nutr Res. 1972. - V.42, N2. - P.291-305.

98. Lonnrot K. Coenzyme Q10 supplementation and recovery from ischemia in senescent rat myocardium / Lonnrot K., Tolvanen J.P., Porsti I. et al. // Life Sei. 1999. -V.64, N5. - P.315-23.

99. Low P. Effects of mevinolin treatment on tissue dolichol and ubiquinone levels in the rat / Low P., Andersson M., Edlund C., Dallner G. // Biochim Biophys Acta. 1992. -VI165, N1. — P.102-9.

100. MacCarthy P.A. Impaired endothelial regulation of ventricular relaxation in cardiac hypertrophy: role of reactive oxygen species and NADPH oxidase / MacCarthy PA., Grieve D.J., Li J.M. et al. // Circulation. 2001. - V.104, N24. - P.2967-74.

101. Maroz A. Reactivity of ubiquinone and ubiquinol with superoxide and the hydroperoxyl radical: implications for in vivo antioxidant activity / Maroz A., Anderson R.F., Smith R.A.J., Murphy M.P. // Free Radic Biol Med. 2009. - V.46, N1. - P. 105-9.

102. MaulikN. Dietary coenzyme Q(10) supplement renders swine hearts resistant to ischemia-reperfusion injury / Maulik N., Yoshida T., Engelman R.M. et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000. - V.278, N4. - P.HI084-90.

103. McCord J.M. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue injury / McCord J.M. // N Engl J Med. 1985. - V.312, N3. - P. 159-63.

104. Mellors A. Quinones and quinols as inhibitors of lipid peroxidation / Mellors A., Tappel A.L. // Lipids. 1966. - V.l, N4. - P.282-4.

105. Miles M.V. The uptake and distribution of coenzyme Q10 / Miles M.V. // Mitochondrion. 2007. - 7 Suppl. - P.S72-7.

106. Miles M.V. Plasma coenzyme Q10 reference intervals, but not redox status, are affected by gender and race in self-reported healthy adults / Miles M.V., Horn P.S., Morrison J.A. et al. // Clin Chim Acta. 2003. - V.332, N1-2. - P.123-32.

107. Miles M. Age-related changes in plasma coenzyme Q10 concentrations and redox state in apparently healthy children and adults / Miles M., Horn P. // Clin Chim Acta. -2004. V.347, N1-2. - P. 139-44.

108. Miles M.V. Bioaquivalence of coenzyme Qi0 from over-the-counter supplements / Miles M.V., Horn P., Miles L. et al. // Nutr Res. 2002. - V.22. - P.919-929.

109. Minatoguchi S. Modulation of cardiac interstitial noradrenaline levels through

110. K(ATP) channels during ischemic preconditioning in rabbits: comparison of the effect of anesthesia between pentobarbital and ketamine + xylazine / Minatoguchi S., Kariya T., Uno Y. et al. // Heart Vessels. 1997. - V. 12, N6. - P.294-9.

111. Mitchell P. Possible molecular mechanisms of the protonmotive function of cytochrome systems / Mitchell P. // J Theor Biol. 1976. - V.62, N2. - P.327-67.

112. Molyneux S.L. Coenzyme Q10: an independent predictor of mortality in chronic heart failure / Molyneux S.L., Florkowsky C.M., George P.M. et al. // J Am Coll Cardiol. 2008. - V.52, N18. - P. 1435-41.

113. Morisco C. Effect of coenzyme Q10 therapy in patients with congestive heart failure: a long-term multicenter randomized study / Morisco C., Trimarco B., Condorelli M. // Clin Investig. 1993. - V.71, 8 Suppl. - P.S 134-6.

114. Mortensen S.A. Overview on coenzyme Q10 as adjunctive therapy in chronic heart failure. Rationale, design and end-points of "Q-symbio"- a multinational trial / Mortensen S.A. // Biofactors. 2003. - V.18, N1-4. - P.79-89.

115. Mosca F. Assay of coenzyme Q(10) in plasma by a single dilution step / Mosca F., Fattorini D. // Anal Biochem. 2002: - V.305, N1. - P.49-54.

116. Motchnik P.A. Measurement of antioxidants in human blood plasma / Motchnik P.A., Frei B., Ames B.N. // Methods Enzymol. 1994. - V.234. - P.269-79.

117. Murry C.E. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium»/ Murry C.E., Jennings R.B., Reiiner K.A. // Circulation. 1986.- V.74, -N5.-P.l 124-36.

118. Niibori K. Bioenergetic effect of liposomal coenzyme Q10 on myocardial ischemia reperfusion injury / Niibori K., Wroblewski K.P.,Yokoyama H. et al. //

119. Biofactors. -1999. V.9, N2-4. - P.307-13.

120. Niibori K. Acute administration of liposomal coenzyme Q10 increases myocardial tissue levels and improves tolerance to ischemia reperfiision injury / Niibori K., Yokoyama H., Crestanello J.A., Whitman G.J.R. // J Surg Res. 1998. - V.79, N2. -P.141-5.

121. Obata T. Use of microdialysis for in-vivo monitoring of hydroxyl free-radical generation in the rat / Obata T. // J Pharm Pharmacol. 1997. - V.49, N7. - P.724-30.

122. Obata T. Protective effect of histidine on iron (Il)-induced hydroxyl radical generation in rat hearts / Obata T., Aomine M., Yamanaka Y. // J Physiol Paris. 1999. -V.93, N3. - P.213-8.

123. Obata T. Myocardial microdialysis of salicylic acid to detect hydroxyl radical generation during ischemia/ Obata T., Hosokawa H., Soeda T. et al. // Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 1995. - V.l 10, N1. - P.277-83.

124. Obata T. In vivo monitoring of norepinephrine and OH* generation on myocardial ischemic injury by dialysis technique / Obata T., Hosokawa H., Yamanaka Y. // Am J Physiol. 1994. - V.266, N3 Pt 2. - P.H903-8.

125. Obata T. Cardiac microdialysis of salicylic acid OH» generation on nonenzymatic oxidation by norepinephrine in rat heart / Obata T., Yamanaka Y. // Biochem Pharmacol. 1997. - V.53, N9. - P.1375-8.

126. Obata T. Glibenclamide, an antagonist of ATP sensitive K+ channels, blocks free radical generation in the rat myocardium / Obata T., Yamanaka Y. // Neurosci Lett. -1998. V.257, N1. - P.57-9.

127. Okamoto T. High-performance liquid chromatography of coenzyme Q-related compounds and its application to biological materials / Okamoto T., Fukui K. // J Chromatogr. 1985. - V.342, N1. - P.35-46.

128. Overvad K. Coenzyme Q10 in health and disease / Overvad K., Diamant B., Holm L. et al. // Eur J Clin Nutr. 1999. - V.53, N10. - P.764-70.

129. Palamakula A. Regional permeability of coenzyme Q10 in isolated- rat gastrointestinal tracts / Palamakula A., Soliman M., Khan M.M. // Pharmazie. 2005. -V.60, N3. - P.212-4.

130. Pauls R. Mobile-phase effects in the reversed phase liquid chromatographic separation of coenzyme Q ubiquinone. homologues / Pauls R. // J. Chromatogr. Sci. -1985. V.23, N4. - P. 181-184.

131. Pimentel D.R. Reactive oxygen species mediate amplitude-dependent hypertrophic and apoptotic responses to mechanical stretch in cardiac myocytes / Pimentel D.R., Amin J.K., Xiao L. et al. // Circ Res. 2001. - V.89, N5. - P.453-60.

132. Piretti M.V. Simultaneous reversed-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-polar isoprenoid lipids and their determination / Piretti M.V., Pagliuca G., Tarozzi G. // J Chromatogr B Biomed Appl. 1995. - V.674, N2.-P. 177-85.

133. Richmond R. Superoxide-dependent formation of hydroxyl radicals: detection of hydroxyl radicals by the hydroxyl ation of aromatic compounds / Richmond R., Halliwell B., Chauhan J., Darbre A. // Anal Biochem. 1981. - V.l 18, N2. - P.328-35.

134. Rotig A. Quinone-responsive multiple respiratory-chain dysfunction due towidespread coenzyme Q10 deficiency / Rotig A., Appelkvist E.L., Geromel V. et al. // Lancet. 2000. - V.356, N9227. - P.391-5.

135. Sanbe A. Improvement of cardiac function and myocardial energy metabolism of rats with chronic heart failure by long-term coenzyme Q10 treatment / Sanbe F., Tanonaka K., Niwano Y., Takeo S. // J Pharmacol Exp Ther. 1994. - V.269, N1. -P.51-6.

136. Sarter B. Coenzyme Q10 and cardiovascular disease: a review / Sarter B. // J. Cardiovasc. Nurs. 2002. - V.16, N4. - P.9-20.

137. Sawyer D.B. Role of oxidative stress in myocardial hypertrophy and failure / Sawyer D.B., Siwik D.A., Xiao L. et al. // J Mol Cell Cardiol. 2002. - V.34, N4. -P.379-88.

138. Schimke I. Importance of the antioxidative potential for free radical induced heart damage / Schimke I., Schimke E., Papies B., Moritz V. // Biomed Biochim Acta. 1987.- V.46, N8-9. P.S576-9.

139. Seyfarth M. Transient ischemia reduces norepinephrine release during sustained ischemia. Neural preconditioning in isolated rat heart / Seyfarth M., Richardt G., Mizsnyak A. et al. // Circ Res. 1996. - V.78, N4. - P.573-80.

140. Sharma A. Possible mechanism of cardioprotective effect of angiotensin preconditioning in isolated rat heart / Sharma A., Singh M. // Eur J Pharmacol. 2000. -V.406, N1. - P.85-92.

141. Shults C.W. Pilot trial of high dosages of coenzyme Q10 in patients with Parkinson's disease / Shults C.W., Beal M.F., Song D., Fontaine D. // Exp Neurol. -2004. V.188, N2. - P.491-4.

142. Singal P.K. Reduced myocardial injury due to exogenous oxidants in pressure induced heart hypertrophy / Singal P.K., Gupta M., Randhawa A.K. // Basic Res Cardiol.- 1991. V.86, N3. - P.273-82.

143. Singal P.K. A relative deficit in antioxidant reserve may contribute in- cardiac failure / Singal P.K., Kirshenbaum L.A. // Can J Cardiol. 1990. - V.6, N2. - P.47-9.

144. Singh R.B! Effect of coenzyme Q10 on risk of atherosclerosis in patients with recent myocardial infarction / Singh R.B., Neki N.S., Kartikey K. et al. // Mol Cell Biochem. 2003. - V.246, N1-2. - P.75-82.

145. Singh R.B. Effect on absorption and oxidative stress of different oral Coenzyme Q10 dosages and intake strategy in healthy men / Singh R.B., Niaz M.A. Kumar A. et al. // Biofactors. 2005. - V.25, N1-4. - P.219-24.

146. Somova L.I. Antioxidant status of the hypertrophic heart of Dahl hypertensive rat as a model for evaluation of antioxidants / Somova L.I., Nadar A., Gregory M., Khan N. // Methods Find Exp Clin Pharmacol. 2001. - V.23, N1. - P.5-12.

147. Spencer K.T. Transition metal chelators reduce directly measured myocardial free radical production during reperfusion / Spencer K.T., Lindower P.D., Buettner G.R., Kerber R.E. // J Cardiovasc Pharmacol. -1998. Y.32, N3. - P.343-8.

148. Steele P.E. Clinical laboratory monitoring of coenzyme Q10 use in neurologic and muscular diseases / Steele P.E., Tang P.H., DeGrauw A.J., Miles M.V. // Am J Clin Pathol. -2004. -V. 121, Suppl. P.S 113-20.

149. Storch A. Randomized, double-blind, placebo-controlled trial on symptomatic effects of coenzyme Q(10) in Parkinson disease / Storch A., Jost W.H., Vieregge P. et al. // Arch Neurol. 2007. - V.64, N7. - P.938-44.

150. Strazisar M. Quantitative determination of coenyzme Q10 by liquid chromatography and liquid chromatography/mass spectrometry in dairy products / Strazisar M., Fir M. // J AOAC Int. 2005. - V.88, N4. - P. 1020-7.

151. Sun I.L. Requirement for coenzyme Q in plasma membrane electron transport / Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L. et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1992. V.89, N23. -P.l 1126-30.

152. Sunamori M. Clinical experience of coenzyme Q10 to enhance intraoperative myocardial protection in coronary artery revascularization / Sunamori M., Tanaka H., Maruyama T. et al. // Cardiovasc Drugs Ther. 1991. - V.5, Suppl 2. - P.297-300.

153. Taggart D.P. Effects of short-term supplementation with coenzyme Q10 on myocardial protection during cardiac opérations / Taggart D.P., Jenkins M., Hooper J. et al. // Ann Thorac Surg. 1996. - V.61, N3. - P.829-33.

154. Takada M. Simultaneous determination of reduced and oxidized ubiquinones / Takada M., Ikenoya S., Yuzuriha T., Katayama K. // Methods Enzymol. 1984. - V.105. -P. 147-55:

155. Tanaka J. Coenzyme Q10: the prophylactic effect on low cardiac output following cardiac valve replacement / Tanaka J., Tominaga R., Yoshitoshi M. et al. // Ann Thorac

156. Surg. 1982. - V.33, N2. - P.145-51.

157. Tang P.H. Determination of coenzyme Q10 in over-the-counter dietary supplements by high-performance liquid chromatography with coulometric detection / Tang P.H. // J AOAC Int. 2006. - V.89, N1. - P.35-9.

158. Tang P.H. HPLC analysis of reduced and oxidized coenzyme Q(10) in human plasma / Tang P., Miles M.V., DeGrauw A. et al. // Clin Chem. 2001. - V.47, N2. -P.256-65.

159. Tang P.H. Measurement of reduced and oxidized coenzyme Q9 and coenzyme Q10 levels in mouse tissues by HPLC with coulometric detection / Tang P., Miles M., Miles M. // Clin Chim Acta. 2004. - V.341, N1-2. - P. 173-84.

160. Teclebrhan H. Biosynthesis of the side chain of ubiquinone:trans-prenyltransferase in rat liver microsomes / Teclebrhan H., Olsson J., Swiezewska E., Dallner G. // J Biol Chem. 1993. - V.268, N31. - P.23081-6.

161. Todorov L.D. Neuronal release of soluble nucleotidases and their role in neurotransmitter inactivation / Todorov L.D., Mihaylova-Todorova S., Westfall T.D. etal. //Nature. 1997. - V.387, N6628. - P.76-9.

162. Tomasetti M. Coenzyme Q10 enrichment decreases oxidative DNA damage in human lymphocytes / Tomasetti M., Littarru G.P., Stocker R., Aleva R. // Free Radic Biol Med. 1999. - V.27, N9-10. - P.1027-32.

163. Tomono Y. Pharmacokinetic study of deuterium-labelled coenzyme Q10 in man / Tomono Y., Hasegawa J., Seki T. et al. // Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol. 1986. -V.24, N10. - P.536-41.

164. Tosaki A. Effects of Ginkgo biloba extract and preconditioning on the diabetic rat myocardium / Tosaki A., Pali T., Droy-Lefaix M.T. // Diabetologia. 1996. - V.39, N11. -P. 1255-62.

165. Traber M.G. Studies on the transfer of tocopherol between lipoproteins / Traber M.G., Lne J.C., Lagmay N.R., Kayden H.J. // Lipids. 1992. - V.27, N9. - P.657-63.

166. Tritto I. Oxygen radicals can induce preconditioning in rabbit hearts / Tritto I., D'Androa D., Eramo N. et al. // Circ Res. 1997. - V.80, N5. - P.743-8.

167. Turunen M. Metabolism and function of coenzyme Q / Turunen M., Olsson J., Dallner G. //Biochim Biophys Acta. 2004. - V.1660, N1-2. - P.171-99.

168. Turunen M. Induction of endogenous coenzyme Q biosynthesis by administration of peroxisomal inducers / Turunen M., Sindelar P., Dallner G. // Biofactors. 1999. -V.9,N2-4.-P. 131-9.

169. Ulimann U. A new Coenzyme Q10 tablet-grade formulation (all-Q) is bioequivalent to Q-Gel and both have better bioavailability properties than Q-SorB / Ulimann U., Metzner J., Schulz C. et al. // J Med Food. 2005. - V.8, N3. - P.397-9. '

170. Verma D.D. Protective effect of coenzyme Q10-loaded liposomes on the myocardium in rabbits with an acute experimental myocardial infarction / Verma D.D., Hartner W.C., Thakkar V. et al. // Pharmaceutical research. 2007. - V.24, N11. -P.2131-2137.

171. Watson P.S. Lack of effect of coenzyme Q on left ventricular function in patients with congestive heart failure / Watson P.S., Scalia G.M., Galbraith A. et al. // J Am Coll Cardiol. 1999. - V.33, N6. - P.1549-52.

172. Weant K.A. The role of coenzyme Q10 in heart failure / Weant K.A., Smith K.M. // Ann Pharmacother. 2005. - V.39, N9. - P. 1522-6.

173. Weis M. Bioavailability of four oral coenzyme Q10 formulations in healthy volunteers / Weis M., Mortensen S.A., Rassing M.R. et al. // Mol Aspects Med. 1994. -V.15, Suppl. - P.s273-80.

174. Whitman G.J. The mechanisms of coenzyme Q10 as therapy for myocardial, ischemia reperfusion injury / Whitman G.J.R., Niibori K., Yokoyama H. et al. // Mol Aspects Med. 1997. - V.18, Suppl. - P.S195-203.

175. Yamori Y. Predictive and preventive pathology of cardiovascular diseases / Yamori Y. // Acta Pathol Jpn. 1989. - V.39, N11. - P.683-705.

176. Yang C.S. Increased formation of interstitial hydroxyl radical following myocardial ischemia: possible relationship to endogenous opioid peptides / Yang C.S., Tsai P.J., Chen W.Y., Kuo J.S. // Redox Rep. 1997. - V.3, N5-6. - P.295-301.

177. Yang H.Y. Fligh-sensitive determination of coenzyme Q(10) in iodinate-beta-cyclodextrin medium by inclusion reaction and catalytic polarography / Yang H.Y., Song J.F. // Anal Biochem. 2006: - V.348, N1. - P 69-74.

178. Yoshida H". Identification, purification,,and immunochemical characterization of a tocopherol-binding protein in rat liver cytosol'/ Yoshida H., Yusin M., Ren I. et al: // J Lipid Res. 1992. - V.33, N3. - P.343-50.

179. Yuzuriha T. Transport of 14C. coenzyme Q10 from the liver to other tissues after intravenous administration to guinea pigs / Yuzuriha T., Takada M., Katayama K. //

180. Biochim Biophys Acta. 1983. - V.759, N3. - P.286-91.

181. Zaghloul A.A. Bioavailability assessment of oral coenzyme Q10 formulations in dogs / Zaghloul A.A., Gurley B., Khan M. et al. // Drug Dev Ind Pharm. 2002. - V.28, N10.-P.l 195-200.

182. Zhang Y. Uptake of dietary coenzyme Q supplement is limited in rats / Zhang Y., Aberg F., Appelkvist E-L. et al. // J Nutr. 1995. - V.125, N3. - P.446-53.

183. Zhang Y., Turunen M., Appelkvist E.L. Restricted uptake of dietary coenzyme Q is in contrast to the unrestricted uptake of alpha-tocopherol into rat organs and cells / Zhang Y., Turunen M., Appelkvist E.L. // J Nutr. 1996. - V.126, N9. - P.2089-97.

184. Zheng Y.M. The relation between experimental myocardial hypertrophy and oxygen free radicals. / Zheng Y.M. // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 1993. -V.21, N6. - P.379-80, 382.

185. Zmitek J. Relative bioavailability of two forms of a novel water-soluble coenzyme Q10 / Zmitek J., Smidovnik A., Fir M. et al. // Ann Nutr Metab. 2008. - V.52, N4. -P.281-7.

186. Zu Y. A rapid and sensitive LC-MS/MS method for determination of coenzyme Q10 in tobacco (Nicotinia tabacum L.) leaves / Zu Y., Zhao C. // Clin. Chim. Acta. -2004. V.341. - P.173-184.