Метаболиты оксида азота в процессах свободнорадикального окисления в модельных системах и ткани миокарда тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Гудков, Леонид Леонидович

• Гудков, Леонид Леонидович
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Гудков, Леонид Леонидович

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Патология сердца и гибель клетки.

1.2. Формы гибели кардиомиоцитов при ишемическом/реперфузионном повреждении миокарда.

1.2.1. Гибель клетки по механизму апогггоза.

1.3. Активные формы кислорода.

1.3.1. Супероксидный анион-радикал. Физикохимические свойства, источники возникновения.

1.3.2. Пероксид водорода. Физико-химические свойства, источники возникновения.

1.3.3. Гидроксильный радикал. Физико-химические свойства, источники возникновения.

1.3.4. Взаимодействие АФК с компонентами клетки.

1.3.5. Компоненты антиоксидантной защиты клетки.

1.4. Оксид азота.

1.4.1. Синтез оксида азота в клетках.

1.4.2. Взаимодействие оксида азота с клеточными компонентами и биологическими молекулами.

1.4.3. Цитопротекторные и цитотоксические свойства доноров и метаболитов оксида азота.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы.

2.2. Моделирование региональной ишемии сердца 58 крысы in vivo.

2.3. ДНК гель электрофорез.

2.4. Получение препаратов 5-шпрозотиолов и ДНКЖ.

2.5. Методика свободнорадикального окисления 60 гомогената миокарда крыс.

2.6. Методика определение ТБК-реактивных продуктов перекисного окисления липидов.

2.7. Определение содержания коэнзимом СЬи Qio с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

ВЭЖХ).

2.8. Регистрация спектров ЭПР.

2.9. Выделение изолированных митохондрий.

2.10. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Результаты и обсуждения.

3.1. Влияние длительности ишемии на деструкцию ДНК кардиомиоцитов.

3.2. Влияние синтетических доноров оксида азота и нитроксильного аниона на образование ТБК-реактивных продуктов в процессе свободнорадикального окисления гомогената миокарда крысы индуцированного метмиоглобином и гидроперероксидом трет-бутила.

3.3. Прооксидантные и антиоксидантные свойства нитрозотиолов, динитрозильных комплексов железа и нитрит аниона.

3.4. Влияние доноров и метаболитов оксида азота на свободнорадикальную деструкцию убихинона в гомогенате миокарда крысы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метаболиты оксида азота в процессах свободнорадикального окисления в модельных системах и ткани миокарда»

Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из наиболее распространенных причин смерти людей в современном обществе. Непрерывная и эффективная работа сердечной мышцы осуществляющей кровоснабжение всего организма требуют надежного и устойчивого энергоснабжения. Основным процессом ответственным за выработку макроэргических фосфатов необходимых для работы миокарда является окислительное фосфорилирование, протекающее в митохондриях кардиомиоцитов. Для поддержания нормальной работы митохондрий и соответственно адекватной энергозатратам миокарда выработки АТФ требуется постоянное и эффективное снабжение ткани сердца кислородом и субстратами дыхания. Питание сердечной мышцы-миокарда происходит через собственные, так называемые коронарные сосуды. Временная или постоянная окклюзия коронарных сосудов прекращает кровоснабжение питаемого участка сердечной мышцы вследствие чего возникает ишемия. Ишемия характеризуется пониженным синтезом АТФ, ацидозом, снижением возбудимости клеток миокарда. Восстановление кровотока (реперфузия) ишемизированного участка миокарда является необходимым условием сохранения нормальной работы сердечной мышцы. Однако обнаружено, что следующая за длительной ишемией миокарда реперфузия сопровождается значительными тканевыми повреждениями и нарушениями сократительной способности - появлением аритмии и временной механической дисфункции. Это явление, получившее название «кислородный парадокс», обусловлено резким усилением генерации активных форм кислорода при восстановлении нормального уровня внутриклеточной концентрации молекулярного кислорода (От). Все вышеперечисленные факторы, в конечном счете, могут привести к гибели части ткани миокарда и в последствии целого организма. В настоящее время обнаружено, что существует по крайне мере две формы гибели клеток сердечной мышцы при ишемическом/реперфузионном повреждении. Классической формой гибели является некроз, или спонтанная (случайная) клеточная гибель, характеризующаяся разрушением области ткани, разрывом плазматической мембраны клетки и разрушением клеточных органелл, развитием воспаления, диффузионным разрушением ДНК, независимостью от уровня АТФ в клетке, отсутствием четкого механизма. В настоящее время все большее количество исследований свидетельствует о том, что помимо некротической гибели клеток, в формировании инфаркта миокарда участвует также апоптоз. Апоптоз, или запрограммированная клеточная гибель, представляет собой эволюционно развитый, физиологический механизм клеточной гибели играющий важную роль в формирование иммунного ответа, уничтожение мутировавших клеток, отрицательной селекции т лимфоцитов, формировании органов во время эмбриогенеза и поддержание клеточного гомеостаза. В отличие от некроза апоптическая гибель клетки не вызывает воспаления, внутриклеточное содержимое не выбрасывается во внеклеточное пространство, сам процесс имеет достаточно четкие этапы и требует затрат АТФ. В общих чертах, цепь событий заключается в инициации апоптоза приводящей к активации специфических цистеиновых протеаз - каспаз, которые в свою очередь осуществляют протеолиз белков мишеней, активируют специфические эндонуклеазы, которые в свою очередь осуществляют расщепление ДНК на фрагменты кратные 180 п.о. В конечной стадии из клетки формируются апоптические тельца, окруженные плазматической мембраной, которые в свою очередь фагоцитируются соседними клетками и клетками иммунной системы.

В качестве инициаторов апоптоза могут выступать цитокины (TNF, FAS), которые связываясь со специфическими рецепторами на поверхности плазматической мембраны, вызывают активацию каспаз. Центральное место в апоптозе занимает митохондрия, содержащая в межмембранном пространстве молекулы активирующие каспазы при попадании в цитозоль (цитохром с, AIF, SMAC). Среди причин нарушения целостности мембран и как следствия выхода цитохрома с и других проапотических веществ в цитоплазму клетки может быть повышеное образование АФК, нарушение окислительного фосфорилирования, повышенная концентрация Са2+, формирование поры во внешней мебране митохондрии при участии проапоптических белков Вах, tBid синтез которых контролируется белком р53. Таким образом, способы инициации апоптоза можно разделить на три типа: инициация апоптоза цитокинами, инициация апоптоза вследствие множественных повреждений ДНК при участии белка р53, инициация апоптоза вследствие нарушений в работе митохондрий. Как уже отмечалось выше апоптоз, в отличии от некроза, представляет собой каскад упорядоченных биохимических реакций, что дает основание предполагать, что ингибирование его на различных участках позволит спасти часть клеток и тканей от гибели при ишемическом/реперфузионном повреждении миокарда. Однако данные по исследованию влиния ингибиторов каспаз весьма противоречивы. Так при 30 минутной ишемии и 24 часовой реперфузии сердца крысы наблюдалось уменьшение зоны инфаркта на фоне введения ингибиторов каспаз. При этом, на подобной модели с более короткой 6 часовой реперфузией ингибиторы каспаз не оказывали влияния на степень ишемического/реперфузионного повреждения миокарда. Проведение гистологического анализа зоны риска показало, что большая часть TUNEL положительных клеток имела все признаки некроза. Причем характерные признаки некротической гибели проявлялись уже спустя час после ишемии. Анализ имеющихся данных говорит в пользу того, что на ранних стадиях реперфузии наиболее вероятным инициаторами апоптоза является различные нарушения в работе митохондрий. Предполагается, что на ранних этапах реперфузии ингибирование апоптоза либо не будет иметь эффекта либо вызовет увеличение зоны инфаркта, вследствие переключения типа гибели клетки на более разрушительный некроз. Нарушения в работе митохондрий, как и множественные повреждения ДНК чаще всего является фатальным для клетки, и блокирование апоптоза не спасает клетку от гибели. Для проверки подобного предположения нами была исследована возможность увеличение числа клеток миокарда с запушенным механизмом апоптоза не подвергшихся при этом характерным некротическим разрушениям путем уменьшения времени ишемии.

Являясь одним из основных факторов повреждения миокарда при ишемии и последующей реперфузии, активные кислородные метаболиты приковывают внимание исследователей длительное время. Образование активных форм кислорода (0'2~, Н202, ОН') в результате процессов жизнедеятельности является неотъемлемой составляющей аэробного метаболизма. Синтез кислородных радикалов в биологических системах происходит постоянно и является как прямым результатом функционирования некоторых специальных ферментативных систем, так и следствием побочного процесса множества окислительно-восстановительных реакций. В интактном сердце источниками свободных радикалов кислорода могут являться кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и нейтрофилы. Активные кислородные метаболиты могут образововаться в электроннотранспортной цепи митохондрии, синтезироваться ксантиноксидазой, А^Ш^Р^-оксидазой, цитохром />.ш-оксидазой и синтазой оксида азота. В кардиомиоцитах супероксидные радикалы генерируются главным образом в митохондриях. В интактных митохондриях два процента поглощенного О2 восстанавливается с образованием супероксида, за счет утечки электронов с переносчиков дыхательной цепи. Этот эффект усиливается в митохондриях, выделенных из органов, находившихся в ишемизированном состоянии. Усиленное образование 0]~ происходит по следующей причине. Во время тканевой ишемии истощается пул адениннуклеотидов и, в часности, пул АИР. При реперфузии митохондрии оказываются в состоянии дыхательного контроля, при котором поток электронов через пункты сопряжения уменьшен и соответственно увеличена степень восстановленности переносчиков дыхательной цепи. В результате вероятность прямого их взаимодействия с кислородом и образования супероксида возрастает. Отмечается также, что при гипоксии происходят нарушения в самой дыхательной цепи митохондрий, что способствует неполному восстановлению О2. При нормальном протекании реакций клеточного метаболизма появившиеся в кардиомиоцитах активные формы кислорода нейтрализуются эндогенной антиоксидантной системой клеток, представленной антиоксидантными ферментами -супероксиддисмутазой (СОД), каталазой, глутатионпероксидазой (СБН-Рх) и низкомолекулярными антиоксидантами - «-токоферолом, востановленной формой коэнзима Qlo, /^-каротином, аскорбиновой кислотой и другими. Однако, при множестве патологических процессов таких, как гипоксия, ишемия, реперфузия или химическое ингибирование митохондриального дыхания, скорость образования свободных радикалов, а также других токсичных метаболитов кислорода возрастает настолько, что антиоксидантные системы клеток не могут их нейтрализовать. Такое состояние обозначается как «окислительный стресс». Свободные радикалы кислорода инициируют цепные реакции перекисного окисления липидов, а также вызывают окислительную деструкцию и модификацию нуклеиновых кислот, белков и углеводов приводящих в конечном счете к гибели клетки.

Наряду с активными формами кислорода существенную роль в патологических процессах развивающихся при ишемии и последующей реперфузии миокарда играют активные формы азота и их метаболиты. К последним относят оксид азота (NO), нитроксильный анион (N0"), катион нитрозония (N0+), пероксинитрит (0N00"), диоксид азота (N02*), нитрит анион (N02"), и другие физиологические производные NO. In vivo N0' генерируется iVO-синтазой, которая катализирует превращение L-аргинина в L-цитруллин. Наиболее вероятной формой депонирования NO в клетке являются £-нитрозотиолы (RS-NO) и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ), обнаруживаемые в клетках и тканях животных, продуцирующих оксид азота по L-аргинин - зависимому пути. Включение N0 в RS-NO и ДНКЖ обеспечивает не только его стабилизацию, но и транспорт на значительные расстояния.

Оксид азота и его метаболиты играют важную роль в большом числе физиологических процессов, среди которых регуляция кровяного давления, регуляция образование тромбов, нейромедиаторная функция, защита организма от патогенов (участие в окислительном взрыве макрофагов), регуляция апоптоза и другие. Оксид азота и его физиологические метаболиты обладают широким спектром действия на различные метаболические процессы в клетке. Взаимодействуя с гемом гуанилатциклазы, оксид азота активирует этот фермент, что приводит к повышению синтеза цГМФ, что в свою очередь приводит к снижению внутриклеточного содержания кальция. Снижение внутриклеточного содержания кальция вызывает расслабление гладкомышечной ткани сосудов, тем самым улучшая кровоток ишемизнрованного участка и снижая степень ишемического повреждения. С другой стороны оксид азота ингибирует различные комплексы дыхательной цепи митохондрий, что ведет к снижению в клетках макроэргических фосфатов. Нитрозилирование белков приводит к нарушению работы различных ферментов.

Пероксинитрит, продукт реакции N0 с супероксидным анион радикалом служит источником сильного окислителя - гидроксильного радикала. Кроме того пероксинитрит является сильным цитотоксическим агентом способным окислять КН2 и 8Н-группы белков, индуцировать процессы перекисного окисления липидов, вызывать однонитевые разрывы ДНК и нитровать ароматические аминокислоты. Оксид азота способен эффективно связываться с органическими радикалами липидов - алкоксильными и алкилпероксильными, вследствие чего происходит обрыв цепных реакций свободнорадикального окисления и образуются нитро- и нитрозоперокси-производные липидов. Таким образом, на организменном и клеточном уровне оксид азота обладает широким спектром действия и может проявлять как цитопротекторное, так и цитотоксическое действие в различных патофизиологических процессах.

По имеющимся в литературе данным оксид азота и его физиологические метаболиты проявляют как цитопротекторные, так и цитотоксические свойства в моделях ишемического/реперфузионного и свободнорадикального стресса. Различия в экспериментальных данных могут проявляться в связи с использованием различных моделей, а также в связи с применением широкого спектра веществ являющихся донорами N0, которые сами по себе могут проявлять различные химические свойства. Некоторые из них являются физиологическими донорами/метаболитами оксида азота, например нитрозотиолы и ДНКЖ, некоторые являются синтетическими веществами, не имеющими физиологических аналогов. Кроме того, как было отмечено выше, оксид азота обладает широким спектром действия на клеточном и организменном уровне. В связи с этим, интерпретация данных из клеточных и организменных моделей ишемического/реперфузионного повреждения весьма затруднительна. По сути дела в подобных моделях можно оценить только интегральный эффект экзогенных доноров N0. Действительно, оксид азота может улучшать кровоток ишемизированного участка за счет активации гуанилатциклазы, уменьшать агрегацию тромбоцитов, уменьшать перекисное окисление липидов в реакции терминирования. При этом пероксинитрит - продукт реакции N0 с супероксидным анион радикалом способен окислять и нитрозилировать важнейшие клеточные компоненты, оксид азота и его метаболиты способны ингибировать различные клеточные ферменты. В связи с этим в данной работе была предпринята попытка изучить влияние широкого спектра метаболитов и доноров N0 на процессы перекисного окисления липидов на модели свободнорадикального окисления гомогената миокарда. Это позволило бы, с одной стороны изучить и сравнить действие широкого класса веществ на одной модели, при этом сконцентрироваться только на одном из наиболее серьезных аспектов ишемического/реперфузионного повреждения тканей. В модели свободнорадикального окисления гомогената миокарда представлен полный набор внутриклеточных компонентов, с которыми может взаимодействовать оксид азота и его метаболиты ш vivo, при этом нам удается не рассматривать физиологические аспекты действия NO, например, такие как вазодиляция. Отдельный интерес представляет исследование малоизученных в настоящее время прооксидантных и антиоксидантных свойств таких метаболитов N0 как динитрозильные комплексы железа, являющихся одними из наиболее вероятных форм депонирования оксида азота в клетке. Цель работы

Целью работы является изучение влияния длительности ишемии на баланс апоптической/некротической гибели клеток миокарда, а также выяснения закономерностей антиоксидантного и прооксндантного действия метаболитов оксида азота в системах моделирующих свободнорадикальное окисление ткани сердечной мышцы.

Задачи работы

Исходя из поставленной в диссертационной работе цели, решались следующие задачи:

1. На модели региональной ишемии/реперфузии сердца крысы определить оптимальную длительность ишемии для исследования апоптоза кардиомиоцитов на ранних этапах реперфузии.

2. Исследовать влияние синтетических доноров оксида азота и нитроксильного аниона на характеристики индуцированного гидроперекисью трет-бутила и железосодержащими белками перекисного окисления препаратов миокарда.

3. В системах, моделирующих окислительный стресс, исследовать влияние физиологических метаболитов оксида азота: динитрозильных комплексов железа, 8-нитрозоглютатиона и нитрит аниона на характеристики индуцированного гидроперекисью трет-бутила и железосодержащими белками перекисного окисления препаратов миокарда.

4. Исследовать влияние различных метаболитов оксида азота и его производных на деструкцию убихинона препаратов миокарда вызванную гидроперекисью трет-бутила и железосодержащими белками.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Гудков, Леонид Леонидович

Выводы.

1. Уменьшение длительности региональной ишемии сердца крысы in vivo приводит к смещению баланса между гибелью кардиомиоцитов по механизму некроза и апоптоза в сторону последнего.

2. Соль Ангели, являющаяся источником нитроксильного аниона и синтетический донор оксида азота PAPA/NONO эффективно ингибирует перекисное окисление липидов и деструкцию убихинонов Q9 и Q10 индуцированные гидропероксидом трет-бутила и метмиоглобином в гомогенате миокарда крысы.

3. Физиологические метаболиты N0 - нитрит натрия, S-нитрозоглютатион и S-нитрозоцистеин эффективно ингибирует свободнорадикальное окисление гомогената миокарда крысы. S-нитрозоглутатион и нитрит натрия предотвращают деструкцию убихинона Q9 и Q10 в ходе перекисного окисления гомогената миокарда крысы. г

4. Динитрозильные комплексы железа с цистеиновыми лигандами связанные с декстраном эффективно ингибируют свободнорадикальное окисление гомогената миокарда крысы.

5. Динитрозильные комплексы железа, ассоциированные с BSA, ингибируют деструкцию убихинона Q9 и Q10 в ходе перекисного окисления гомогената миокарда крысы.

6. Динитрозильные комплексы железа с цистеиновыми лигандами быстро разрушаются под действием АФК и при перекисном окислении гомогената миокарда крысы проявляют прооксидантный эффект.

Заключение.

Апоптоз, или запрограммированная клеточная гибель, как и некроз являются двумя формами гибели кардиомиоцитов вносящими вклад в формирование инфаркта миокарда при ишемии и реперфузии. Интерес к изучению гибели клеток сердечной мышцы по механизму апоптоза привлекает исследователей в связи с возможностью ингибирования запрограммированной клеточной гибели. Инициирование апоптоза кардиомиоцитов может происходить в связи с активацией иммунной системы и развитием воспаления, при множественных повреждениях ДНК, а также при различных дисфункциях митохондрий. В зависимости от типа активации, развитие процесса апоптической гибели может происходить с небольшими отличиями. Действительно, при активации апоптоза в связи с разрушением митохондрий, клетка, в конечном счете, обречена на гибель, так как инициирующее апоптоз событие само по себе является фатальным. В случае лее активации апоптоза посредством цитокинов, само инициирующее событие не является фатальным для клетки. Этим объясняется успешное уменьшение зоны гибели миокарда на поздних этапах реперфузии с помощью ингибиторов каспаз. Наиболее вероятной формой активации апоптоза на ранних этапах реперфузии являются нарушения в работе митохондрий вследствие повышенного синтеза АКФ. Можно предположить, что в подобных условиях ингибирование апоптоза не приведет к спасению клетки, а лишь изменит тип гибели на более опасный некроз. Однако для изучения ингибирования апоптоза на ранних этапах реперфузии до настоящего времени использовались модели с продолжительным периодом ишемии. Так, введение ингибитора каспаз после 30 минутной ишемии и 4 часовой реперфузии не приводила к уменьшению или увеличению зоны гибели миокарда крысы, что может объясняться доминированием гибели по механизму некроза в данных условиях. На модели региональной ишемии сердца крысы in vivo мы показали, что уменьшение ишемии до 15 минут смещает баланс между клеточной гибелью по механизму некроза и апоптоза в сторону последнего типа. Таким образом, исследование влияния ингибиторов каспаз на степень повреждения миокарда на ранних этапах реперфузии следует проводить при более короткой ишемии

В настоящее время имеется значительное число работ посвященных изучению влияния N0 и его метаболитов на свободнорадикальную окислительную модификацию биологически важных молекул. Данные, полученные в модельных системах позволяют получить кинетические параметры реакции N0 с отдельными клеточными компонентами или активными формами кислорода. Однако остается неясным интегральный эффект всего многообразия этих реакций протекающих на клеточном и организменном уровне. В исследованиях, проведенных на клеточных культурах или животных трудно оценить, какой именно механизм лежит в основе протекторного или цитотоксического эффекта. В системе свободнорадикального окисления гомогената миокарда крыс предоставлялась возможность наблюдать действие N0 и его основных метаболитов в присутствии практически полного набора внутриклеточных компонентов. При окислительном стрессе повреждение биологических мембран вследствие перекисного окисления липидов оказывает одно из самых сильных повреждающих действий, в конечном счете, приводя к гибели клетки по механизму некроза или апоптоза. Таким образом, условия наших экспериментов моделируют процессы гибели клетки в зоне ишемического поражения. С использованием данной модельной системы установлено, что сам оксид азота обладает антиоксидантным действием, тогда как наиболее вероятные формы его депонирования в живых организмах (ДНКЖ) могут, как подавлять, так и стимулировать реакции ПОЛ. Однако прооксидантный эффект ДНКЖ, по-видимому, не связан с входящим в их состав оксидом азота. Интересным является то, что антиоксидантными свойствами обладают нитроксильный анион и нитрит анион, т. е. продукты восстановления и окисления N0, соответственно. Этот факт указывает на существование в клетке редокс-системы поддерживающей равновесие между различными формами N0. Таким образом, характер влияния N0 на процессы перекисного окисления, вероятно, определяется соотношением концентраций его метаболитов, свободных радикалов кислорода и взаимодействующих с ними редокс-активных соединений. Сохранение этого баланса может играть важную роль в выживании клетки при "свободнорадикальных" патологиях. Действительно, при ишемии наблюдается усиление генерации, как активных форм кислорода, так и N0.

Считается, что повышение уровня N0 при ишемическом поражении ткани вызвано необходимостью усиления коллатерального кровотока. Последнее обусловлено сосудорасширяющим действием N0 и его способностью ингибировать агрегацию тромбоцитов. Однако именно при реперфузии ишемизированной ткани возрастает риск повреждения клетки в следствии свободнорадикального окисления. На основании полученных нами результатов можно предположить, что избыток оксида азота в этих условиях выполняет важную защитную функцию, ингибируя ПОЛ и восполняя разрушающиеся депонированные формы N0.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Гудков, Леонид Леонидович, 2008 год

1. Капелько В.И. // Кардиология. 2005; 45(9):55-61.

2. Hearse DJ, Bolli R. Reperfiision induced injury: manifestations, mechanisms, and clinical relevance.Cardiovasc Res. 1992 Feb;26(2): 101-8.

3. Chandra J., Samali A., Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress. //Free Rad. Biol. Med. 2000. V. 29 (3-4). P. 323-333.,

4. Scarabelli TM., Gottlieb RA., Functional and clinical repercussions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/reperfusion injury: old and new concepts after 10 years of contributions.Cell Death Differ. 2004 Dec; 11 Suppl 2:S144-52

5. KerrJFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26:239-57.

6. Bright J, Khar A: Apoptosis: Programmed cell death in health and disease. Biosci Reports 14: 67-82, 1994

7. Cook S.A, Poole-Wilson P.A. Cardiac myocyte apoptosis. European Heart Journal .1999 20,1619-1629

8. Nancy A. Thornberry, Yuri Lazebnik. Caspases: enemies within. Science 1998 Aug 28;281(5381):1312-6

9. Adams JM, Cory s. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 1998;281:1322-6.

10. Koseki T, Inohara N, Chen S , Nunez G. Ark, an ihibitor of apoptosis expresed in skeletal muscle and heart that interacts selectively with caspases. PNAS USA 1998; 95:5156-60.

11. Deveraux QL, Roy N, Stennicke HR et al. IAPs apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrom-c by direct inhibition of distinct caspase. EMBO 1998;17:2215-23.

12. Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors: signaling and modulation. Sciencel998 Aug 28;281(5381):1305-8

13. Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science 1998; 281: 1309-12.

14. Skulachev VP. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong". IUBMB Life. 2000 May;49(5):365-73.

15. Gill C, Mestril R, Samali A. Losing heart: the role of apoptosis in heart disease—a novel therapeutic target?FASEB J. 2002 Feb;16(2):135-46.

16. Saraste A, Pulkki K, Kallajoki M. et al. Apoptosis in human acute myocardial infarction. Circulation 1997;95:320-3.

17. Piro FR, di Gioia CR, Gallo P, et al. Is apoptosis a diagnostic marker of acute myocardial infarction? Arch Pathol Lab Med2000; 124:827-31

18. Nakamura M. et. al. Preconditioning decreases Bax expression, PMN accumulation and apoptosis in reperfused rat heart. J Cardiovasc Res 2000 Feb45:661-70.

19. Hiroyuki Yaoita, MD; Kazuei Ogawa, MD; Kazuhira Maehara, MD; Yukio Maruyama, MD. Attenuation of Ischemia/Reperfusion Injury in Rats by a Caspase Inhibitor. Circulation. 1998;97:276-281

20. Palojoki E, Saraste A,Erikson A, Pulkki K, Kallajoki M, Tikkanen I. Cardiomyocyte apoptosis and ventricular remodeling after myocardial infarction in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2001 Jun 280:H2726-31.

21. Yue TL. et al. Possible involvement of stress-activated protein kinase signaling pathway and Fas receptor expression in prevention of ischemia/reperfusion-induced cardiomyocyte apoptosis by carvedilol. Circ Res 1998 Feb 82:166-74.

22. Zhao ZQ et al. Reperfusion induces myocardial apoptotic cell death.Cardiovasc Res 2000 Feb 45:651-60

23. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. Сорос. Образоват. Журн. 2000. №. 12. С.13-19.

24. Владимиров Ю.А., Азизова О.А. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Биофизика. 1991. Т. 27. С. 1-249.

25. Murrell GA, Francis MJ, Bromley L. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals. Biochem J. 1990 Feb l;265(3):659-65.

26. Rasmussen J.T., Rasmussen M.S., Petersen Т.Е. Cysteines involved in the interconversion between dehydrogenase and oxidase forms of bovine xanthine oxidoreductase // J. Dairy Sci. 2000. V. 83. P. 499-506.

27. Terada L.S., Piermattei D., Shibao G.N., et al. Hypoxia regulates xanthine dehydrogenase activity at pre- and post-translational levels. Arch. Biochem. Biophys. 1997. V. 348. P. 163-168

28. Moriwaki Y, Yamamoto T, Suda M, Nasako Y, Takahashi S, Agbedana OE, Hada T, Higashino K. Purification and immunohistochemical tissue localization of human xanthine oxidase. Biochim Biophys Acta. 1993 Aug 7;1164(3):327-30

29. Boveris A., Oshino N., Chance B. The cellular production of hydrogen peroxide. Biochem. J. 1972. V. 128. P. 617-630.

30. Papa S., Skulachev V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging. Mol. And Cell Biochem. 1997. V.174. P.305-319.

31. Skulachev V. P. Role of uncoupled and non-coupled oxidation in maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electron reductants. Quart. Rev. of Biophys. 1996. V. 29. P. 169-202

32. Kushnareva Y, Murphy AN, Andreyev A. Complex I-mediated reactive oxygen species generation: modulation by cytochrome с and NAD(P)+ oxidation-reduction state. Biochem J. 2002 Dec l;368(Pt 2):545-53.

33. Julio F. Turrens. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol (2003), 552.2,pp. 335-344

34. Han D, Williams E, Cadenas E. Mitochondrial respiratory chain-dependent generation of superoxide anion and its release into the intermembrane space. Biochem J. 2001 Jan 15;353(Pt 2):411-6.

35. Raha S, McEachern GE, Myint AT, Robinson ВН. Superoxides from mitochondrial complex III: the role of manganese superoxide dismutase. Free Radic Biol Med. 2000 Jul 15;29(2): 170-80.

36. А.А. Ярилин. Основы иммунологии. Москва, Медицина, 1999. стр. 118-119.

37. Kobayashi Т, Seguchi Н. Novel insight into current models of NADPH oxidase regulation, assembly and localization in human polymorphonuclear leukocytes. Histol Histopathol. 1999 Oct; 14(4): 1295-308.

38. Вартанян Л.С., Садовникова И.П., Гуревич C.M., Соколова И.С. Образование супероксидных радикалов в мембранах субклеточных органелл регенерирующей печени. Биохимия.1992. Т.57, вып.5.С.671-678.

39. Gottlieb RA. Cytochrome Р450: major player in reperfusion injury. Arch Biochem Biophys. 2003 Dec 15;420(2):262-7.

40. De Duve C., Baudhuin P. Peroxisomes (microbodies and related particles). Physiol. Rev. 1966. V. 46. P. 232-357.

41. Schrader M., Fahimi H.D. Mammalian peroxisomes and reactive oxygen species.

42. Histochem. Cell Biol. 2004. Y. 122. P. 383-393. 47. Test ST, Weiss SJ.Quantitative and temporal characterization of the extracellular H202 pool generated by human neutrophils. J Biol Chem. 1984 Jan 10;259(1):399-405.

43. Roots R., Okada S. Estimation of life times and diffusion distances of radicals involved in X-rayinduced DNA strand breaks or killing of mammalian cell // Radiat. Res. 1975. V. 64. P. 306-320.

44. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art//Am. J. Med. 1991. V. 91. Suppl. 3C. P. 2-13

45. Jonas S.K., Riley P.A. Modification of the in vitro cytotoxicity of hydrogen peroxide by iron complexes // Free Radic. Res. Commun. 1992. V. 17. P. 407-419.

46. Giulivi C, Traaseth NJ, Davies KJ. Tyrosine oxidation products: analysis and biological relevance. Amino Acids. 2003 Dec;25(3-4):227-32.

47. McCord J.M., Fridovich I. The utility of superoxide dismutase in studing free radical reactions. 1. Radicals generated by the interaction of sulfite, dimethyl sulfoxide, and oxigen // J. Biol. Chem. 1969. V. 244, P. 6056-6063.

48. Landi L., Cabrini L., Sechi A.M., Pasquali P. Antioxidative effect of ubiquinones on mitochondrial membranes. //Biochem J. 1984. V. 222 (2). P. 463-466.

49. Sugiyama S., Takasawa M., Hayakawa M., Ozawa T. Changes in skeletal muscle, heart and liver mitochondria electron transport activities in rats and dogs of various ages. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993. V. 30 (5). P. 937-944

50. Inoue M, Sato EF, Park AM, Nishikawa M, Kasahara E, Miyoshi M, Ochi A, Utsumi K. Cross-talk between NO and oxyradicals, a supersystem that regulates energy metabolism and survival of animals.Free Radic Res. 2000 Dec;33(6):757-70.

51. Archer S. Measurement of nitric oxide in biological models. FASEB J. 1993 Feb l;7(2):349-60.

52. Kikuchi K, Nagano T, Hayakawa H, Hirata Y, Hirobe M. Real time measurement of nitric oxide produced ex vivo by luminol-H202 chemiluminescence method.

53. Thomas DD, Liu X, Kantrow SP, Lancaster JR Jr. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and 02. Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jan 2;98(l):355-60.

54. Sneddon JM, Vane JR. Endothelium-derived relaxing factor reduces platelet adhesion to bovine endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Apr;85(8):2800-4

55. Knowles R.G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals // Biochem. J. 1994. V. 298. P. 249-258

56. Salter M, Knowles RG, Moncada S. Widespread tissue distribution, species distribution and changes in activity of Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent nitric oxide synthases. FEBS Lett. 1991 Oct 7;291(l):145-9.

57. Проскуряков С.Я., Конопляников А.Г., Иваников А.И., Скворцов В.Г. Биология оксида азота // Успехи соврем, биологии. 1999. Т. 119. вып. 4. С. 380-395.

58. Giulivi С, Poderoso JJ, Boveris A. Production of nitric oxide by mitochondria. J Biol Chem. 1998 May 1;273(18):11038-43

59. Huie R.E., Padmaja S. The Reaction rate of NO with 02~ // Free Radic. Res. Commun. 1993. V. 18. P. 195-199.

60. Saran M., Michel С., Bors W. Reaction of NO with 02 : Implications for the action of endothelium-derived relxing factor (EDRF) // Free Radic. Res. Commun. 1990. V. 10. P. 221-226.

61. Kissner R, Nauser T, Kurz C, Koppenol WH. Peroxynitrous acid—where is the hydroxyl radical? IUBMB Life. 2003 Oct-Nov;55(10-11):567-72.

62. Maria S.S., Lee J., Groves J.T. Peroxynitrite repidly permeates phospholipid membranes //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 14243-14248.

63. Freeman B. Free radical Chemistry of nitric oxide. Looking at the dark side // Chest. 1994. V. 105. P. S79-S84.

64. Shafer F.Q., Wang P.H., Kelley, Cueno K.L., Martin S.M., Buetter G.R. Comparing beta-carotine, vitamin E and nitric oxide as membrane antioxidants // J. Biol. Chem. 2002. V. 383. P. 671-681.

65. Padmaja S., Huie R.E. The reaction of nitric oxide with organic peroxyl radicals // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 195. P. 539-544.

66. Herold S., Rehmann F.-J.K. Kinetics of the reactions of nitrogen monoxide and nitrite with ferryl hemoglobin // Free. Rad. Biol. Med. 2003. V. 34. P. 531-545.

67. Cooper C.E. Nitric oxide and iron proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1411. P. 290-309.

68. Stamler J.S., Jia L., Eu J.P. et. al. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient// Science. 1997. V. 276. P. 2034-2037.

69. Ванин А.Ф.// Биохимия. 1998 Июль;63(7):782-93.

70. Brookes PS, Salinas EP, Darley-Usmar K, Eiserich JP, Freeman BA, Darley-Usmar VM, Anderson PG. Concentration-dependent effects of nitric oxide on mitochondrial permeability transition and cytochrome c release. J Biol Chem. 2000 Jul 7;275(27):20474-9.

71. Jekabsone A, Dapkunas Z, Brown GC, Borutaite V. S-nitrosothiol-induced rapid cytochrome c release, caspase activation and mitochondrial permeability transition in perfused heart. J Neurochem. 2000 Oct;75(4): 1455-64.

72. Takano H, Tang XL, Qiu Y, Guo Y, French BA, Bolli R. Nitric oxide donors induce late preconditioning against myocardial stunning and infarction in conscious rabbits via an antioxidant-sensitive mechanism. Circ Res. 1998 Jul 13;83(l):73-84.

73. Xu Z, Ji X, Boysen PG. Exogenous nitric oxide generates ROS and induces cardioprotection: involvement of PKG, mitochondrial KATP channels, and ERK. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004 Apr;286(4):H1433-40. Epub 2003 Dec 4.

74. Borutaite V, Brown GC. S-nitrosothiol inhibition of mitochondrial complex I causes a reversible increase in mitochondrial hydrogen peroxide production. Biochim Biophys Acta. 2006 May-Jun;1757(5-6):562-6. Epub 2006 Mar 23.

75. Ma XL, Gao F, Liu GL, Lopez BL, Christopher TA, Fukuto JM, Wink DA, Feelisch M. Opposite effects of nitric oxide and nitroxyl on postischemic myocardial injury. Proc Natl Acad Sei USA. 1999 Dec 7;96(25): 14617-22.

76. Pagliaro P, Mancardi D, Rastaldo R, Penna C, Gattullo D, Miranda KM, Feelisch M, Wink DA, Kass DA, Paolocci N. Nitroxyl affords thiol-sensitive myocardialprotective effects akin to early preconditioning. Free Radic Biol Med. 2003 Jan l;34(l):33-43.

77. Joshi MS, Ponthier JL, Lancaster JR Jr. Cellular antioxidant and pro-oxidant actions of nitric oxide. Free Radic Biol Med. 1999 Dec;27(l 1-12): 1357-66.

78. Duranski MR, Elrod JW, Calvert JW, Bryan NS, Feelisch M, Lefer DJ. Genetic overexpression of eNOS attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2006 Dec;291(6):H2980-6. Epub 2006 Jul 28.

79. Hines IN, Haranda H, Flores S, Gao B, McCord JM, Grisham MB. Endothelial nitric oxide synthase protects the post-ischemic liver: potential interactions with superoxide. Biomed Pharmacother. 2005 May;59(4):183-9.

80. Schulz R, Wambolt R. Inhibition of nitric oxide synthesis protects the isolated working rabbit heart from ischaemia-reperfusion injury. Cardiovasc Res. 1995 Sep;30(3):432-9.

81. Woolfson RG, Patel VC, Neild GH, Yellon DM. Inhibition of nitric oxide synthesis reduces infarct size by an adenosine-dependent mechanism. Circulation. 1995 Mar 1;91(5):1545-51.

82. Yasmin W, Strynadka KD, Schulz R. Generation of peroxynitrite contributes to ischemia-reperfusion injury in isolated rat hearts. Cardiovasc Res. 1997 Feb;33(2):422-32.

83. Flogel U, Decking UK, Godecke A, Schrader J. Contribution of NO to ischemia-reperfusion injury in the saline-perfused heart: a study in endothelial NO synthase knockout mice. J Mol Cell Cardiol. 1999 Apr;31(4):827-36.

84. J. Beckman, W. Koppenol. Nitric oxide, super oxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and the ugly. Am. J. Physiol. 271: C1424-C1437, 1996.

85. Nossuli TO, Hayward R, Scalia R, Lefer AM. Peroxynitrite reduces myocardial infarct size and preserves coronary endothelium after ischemia and reperfusion in cats. Circulation Л 997 Oct 7;96(7):2317-24.

86. Шумаев К.Б. Петрова H.E., Заббарова И.В., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф. Панкин В.З., Рууге Э.К // Биохимия. 2004. Т. 69. С.569-574.

87. Vanin, A.F., Muller, В., Alencar, J. L., Lobysheva, I.I., Nepveu, F., Stoclet, J.-C. 2002. // Curr. Topics in Biophis. V. 26. P.101-113.

88. Kagan V.E. , Kozlov A.V., Tyurina Y.Y., Shvedova A.A., Yalowich J.C. // Antiox. & Redox Signaling. 2001. V. 3. P. 189-202.

89. Коркина O.B., Рууге Э.К. Генерация супероксидных радикалов митохондриями сердца: исследование методом спиновых ловушек в условиях непрерывной оксигенации // Биофизика. 2000. Т.45. С. 695-699.

90. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И. Образование гидроксильных радикалов при реперфузии миокарда после экспериментальной ишемии различной длительности. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, Том 131, №6. Стр. 629-632

91. Ruuge Е.К., Zabarova I.V., Korkina O.V., Khatkevich A.N., Lakomkin V.L., Timoshin A.A. // Current Topics in Biophysica (2002), V. 26, № 1, P-145-155

92. Hobbs AJ, Fukuto JM, Ignaro LJ.//Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 10992-10996, 1994

93. Schmidt H, Hofmann H, Schindler U, Shutenko ZS, Cunninghem DD, Feelisch M.//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14492-14497, 1996.

94. Herold S., RehmanF.J. //J. Biol. Inorg. Chem. 2001. V. 6. P. 543-555.

95. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Панкин В.З., Ванин А.Ф., Гомбоева С.Б., Беленков Ю.Н. Механизм ингибирования свободнорадикального окисления ß-каротина S-нитрозоглутатионом и динитрозильными комплексами железа// Докл. РАН. 2001. Т. 379. С. 702-704.

96. Alvarez В., Rubbo Н., Kirk М. et al. Peroxynitrite-dependent tryptophan nitration // Chem. Res. Toxicol. 1996. V. 9. P. 390-396.

97. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 288. P. 481-487.

98. Murphy M.E., Sies H. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 10860-19864.

99. Feelisch M., Ostrowski J., Noack E. (1989) J. Cardiovasc. Pharmacol. 14, S13-S22

100. Buyukafsar K, Nelli Silvia, Martin W. // Brithish Journal of Farmacology. 2001. V. 132. C.165-172.

101. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин A.A., Петрова Н.Э., Рууге Э.К.//Биофизика. 2004. Т. 49. С.659-665.

102. Hans Nohl, Katrin Staniek, Babak Sobhian, Soheyl Bahrami, Heinz Redl, Audrey V. Kozlov // Acta Biochimica Polonica. 2000. V.47. P. 913-921.

103. Ide Т., Tsutsui H.„ Kinugawa Sh., Utsumi H., Hang D., Hattori N, Uchida K., Arimura K., Egashira K., Takeshita A. // Circ Res. 1999;V. 85:P. 357-363.

104. Neuzil J., Witting P.K., Stocker R. a-Tocopheryl hydroquinone is an efficient multifunctional inhibitor of radical-initiated oxidation of low density lipoprotein lipids // PNAS. Biochem. 1997. V. 94. P. 7885-7890.

105. Lucas D.T. & Szweda L.I. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P.510-514.

106. Chen Q, Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278 (38). P. 36027-36031.

107. Bulkley J.B.//Br.J.Surg. 1993. V. 80. P. 684-686.

108. Millar TM, Stevens C.R., Benjamin N., Eisenthal R., Harrison R., Blake D.R. // FEBS Lett. 1998. V. 427. P. 225-228.

109. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. // Биохимия. 1998 Июль;63(7):874-84.

110. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Тихадзе

111. А.К., Цыпленкова В.Г., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.В. // Биохимия. 2004 Май;69(5):520-6.

112. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Тихадзе А.К., Каминный А.И., Цыпленкова В.Г., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.В. // Биохимия. 2005 Янв. ;70(1):79-84.

113. Писаренко О.И., Студнева И.М., Ланкин В.З. и др. // Бюл. экспер. биол. 2001, Т. 132, № 10. С. 401-403

114. Ланкин В.З., Тихадзе А.К., Беленков Ю.Н. // Кардиология . 2000. Т. 40. № 7. С. 48-63.

115. Moosmann В, Behl C.//Trends Cardiovasc. Med. 2004. Vol. 14, №7, P. 273-281.

116. Lauer, Т., Preik, M., Rassaf, Т., Strauer, В. E., Deussen, A., Feelisch, M. & Kelm, M. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,12814-12819.

117. Zweier, J. L., Wang, P., Samouilov, A. & Kuppusamy, P. (1995) Nat. Med. 1, 804809.

118. Mahesh Basireddy, T. Scott Isbell, Xinjun Teng, Rakesh P. Patel and Anupam Agarwal. Effects of sodium nitrite on ischemia-reperfusion injury in the rat kidney. Am J Physiol Renal Physiol 290: F779-F786, 2006.