Особенности дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в первичные половые клетки in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Абдыев Вепа Керимбердыевич

• Абдыев Вепа Керимбердыевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Абдыев Вепа Керимбердыевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и современное состояние проблемы

Цель и задачи работы

Научная новизна

Практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личное участи автора

Публикации

Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Плюрипотентные стволовые клетки млекопитающих

Рисунок 2. Иллюстрация получения плюрипотентных стволовых клеток in vitro

1.2. Наивные плюрипотентные стволовые клетки

1.3. Обособление первичных половых клеток in vivo в эмбриональном развитии мыши

1.4. Молекулярные механизмы формирования первичных половых клеток

1.5. Первичные половые клетки человека их маркеры и молекулярные механизмы спецификации

Рисунок 5. Происхождение ППК в эмбриональном развитии человека и их дальнейшее развитие

1.6. Дифференцировка первичных половых клеток из плюрипотентных стволовых клеток in vitro

1.7. Методы получения первичных половых клеток из плюрипотентных стволовых клеток in vitro

1.8. Моделирование особенностей развития половых клеток с патологий 21 хромосомы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культура клеток

2.2. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток ИПСК и ЭСК XX линий и ИПСК XY человека в первичные половые клетки

2.3. Индукция ППК-подобных клеток к делению мейоза

2.4. Проточная цитофлуориметрия и сортинг клеток

2.5. Приготовление гистологических препаратов

2.6. Получение давленых препаратов клеток в процессе мейоза

2.7. Иммунофлуоресцентная окраска

2.8. Выделение РНК, синтез кДНК и ПЦР анализ в реальном времени

2.9. Исследование активности Х хромосомы

2.10. Синтез первой цепи кДНК

2.11. Подбор праймеров

2.12. ПЦР и ПЦР в реальном времени

2.13. Электрофорез в агарозном геле

2.14. Статистический анализ

2.15. Анализ транкриптома клеток

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Характеристика плюрипотентных стволовых клеток

3.2. Ступенчатый протокол получения чППК in vitro. Дифференцировка - ИПСК и ЭСК человека в чППК-подобные клетки in vitro

3.1. Анализ эффективности дифференцировки чИПСК и чЭСК в ППК-подобные клетки методом проточной цитофлуориметрии

3.1. Динамика экспрессии мРНК генов маркеров плюрипотентности и ППК при дифференцировке ИПСК и ЭСК

3.2. Дифференцировка чППК из ИПСК и ЭСК человека в эмбриоидных тельцах in vitro и их характеристика

3.3. Динамика экспрессии генов-маркеров чППК при дифференцировке чИПСК и чЭСК в эмбриоидных тельцах

3.4. Индукция ППК-подобных клеток к делению мейоза in vitro. Характеристика сфероидов, анализ мейоцитов на маркеры синаптонемального комплекса

3.5. Исследование активности Х хромосомы

3.6. Транскриптомный анализ чИПСК, ППК-подобных клеток, и мейоцито-подобных клеток

3.7. Иерархическая кластеризация и сравнение с ППК-подобными клетками,

полученными в работе Ямаширо и соавторов

3.8. Анализ транскриптомных данных при индукции мейоза

3.9. Анализ внеклеточного матрикса и цитоскелета клеток сфероидов

3.10. Дифференцировка мужских ИПСК с трисомией 21 хромосомы в первичные половые клетки

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACTA - активин А

bFGF - фактор роста фибробластов

BMP - костные морфогенетические белки

CHIR - CHIR99021 агонист Wnt сигнального пути

EGF - эпидермальный фактор роста

FDR - False discovery rate - процент ложных находок при множественном сравнении

Go6983 - ингибитор протеинкиназы С (PKC)

GSK3 - киназа гликогенсинтазы

hPGCLCs - ППК-подобные клетки человека

IM-12 - ингибитор GSK3p

IWP2 - ингибитор WNT созревания

LIF - лейкемия ингибирующий фактор

MEK - митоген-активируемая протеинкиназа

PD0325901 - ингибитор ERK1/2, ингибитор FGF2 сигнального пути

ROCKi - ингибиторы Rho-киназы

SB590885 -ингибитор B-Raf, серин/треониновая протеинкиназа

SCF - фактор стволовых клеток

scRNA-seq - РНК секвенирование единичных клеток

Т21х-ППК - ППК-подобные клетки с трисомией 21 хромосомы

2i - условия культивирования с ингибированием FGF2 и WNT сигнальных путей WH-4-023 - селективный ингибитор Lck и Src, семейство тирозинкиназ Wnt - Wingless-INT

Y-27632 - селективный ингибитор Rho-киназы (ROCK) ВКМ - клетки внутриклеточной массы бластоцисты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

ППК - первичные половые клетки

ПСК - плюрипотентные стволовые клетки

РК - ретиноевая кислота (RA)

РНК - рибонуклеиновая кислота

Т21х - трисомия 21 хромосомы

чППК-ПК: первичные половые клетки подобные клетки человека чФГСК - фетальные стромальные клетки гонад человека

ЭпиСК - стволовые клетки эпибласта мыши

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ЭТ - эмбриоидные тельца

ЭТ-ППК-пк - ППК-подобные клетки, полученные в эмбриоидных тельцах

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и современное состояние проблемы

Первичные половые клетки (ППК) - уникальный тип стволовых клеток человека, способный дать начало тотипотентным стволовым клеткам, обеспечивающий фертильность организма и перенос генетической информации следующим поколениям. Исследования ППК являются важной задачей биологии развития, позволяющей ответить на многие вопросы, касающиеся эмбриогенеза, и в перспективе предполагающие разработку новых способов лечения бесплодия у человека.

ППК человека является труднодоступным материалом для исследования. В связи с этим существует проблема изучения раннего развития половых клеток. Использование плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) позволило моделировать и изучать ранний эмбриогенез человека in vitro. Свойство плюрипотентности характеризует внутриклеточную массу бластоцисты клетки, которой способны дать начало всем типам клеток организма, а также экстраэмбриональным тканям. Дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток можно разделить на два пути: канонический - дифференцировка в производные трех зародышевых листков и неканонический, приводящий к образованию первичных половых клеток у млекопитающих. В данной работе исследуется неканонический процесс дифференцировки ПСК в первичные половые клетки. Учитывая этические ограничения работы с эмбрионами человека, в настоящей работе мы сосредоточились на получении ППК человека из индуцированных плюрипотентных клеток человека (чИПСК) in vitro, где основными методами исследования ППК человека является работа с клетками in vitro.

Бесплодие является, как правило, неизлечимой патологией, которая обусловлена либо неполным созреванием половых клеток и их неспособностью к

оплодотворению, либо нарушением развития половых клеток или полным их отсутствием. Существуют статистические оценки, в которых подсчитано, что в результате снижения качественных и количественных характеристик мужских и женских половых клеток из-за генетических и экологических причин [1-4] 1525% пар репродуктивного возраста страдают бесплодием [5,6]. Исследователи надеются, что изучение процессов развития ППК in vitro из ПСК послужит пониманию механизмов специализации и дифференцировки ППК и приведет к созданию адекватных моделей бесплодия, врожденных аномалий и т.д. С другой стороны, получение гоноцитов человека in vitro - это новое направление вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Данные технологии могут быть востребованы также в случаях, когда пациенты теряют репродуктивные способности вследствие химио- или лучевой терапии злокачественных заболеваний. К перспективам исследований ППК и их производных, полученных in vitro, следует отнести их применение в фармакологии для создания тест-систем, изучающих влияние лекарственных средств на половые клетки человека, а также возможность исследования молекулярного патогенеза таких болезней как опухоли половых клеток, анеуплоидии и аномалии половых хромосом. Подводя итог, можно сказать, что культивирование ПСК человека и их дифференцировка в ППК in vitro является быстро развивающейся областью биомедицины, развитие которой приведет к прорыву в понимании механизмов созревания половых клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в первичные половые клетки in vitro»

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы является анализ молекулярных механизмов дифференцировки первичных половых клеток человека и разработка эффективного протокола дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в первичные половые клетки.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Верифицировать плюрипотентный статус клеточной линии. Охарактеризовать женские индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека на наличие маркеров плюрипотентности. Определить состояние плюрипотентности используемых в исследовании плюрипотентных стволовых клеток.

2. Изучить процесс дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в первичные половые клетки in vitro, провести анализ значимых условий культивирования, ростовых факторов и индукторов дифференцировки.

3. Охарактеризовать дифференцированные клетки на наличие маркеров первичных половых клеток.

4. Провести анализ экспрессии регуляторных генов первичных половых клеток в сравнении с исходными индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками человека, изучить транскриптомный профиль полученных клеток. Провести биоинформатический анализ транскриптомов. Определить состояние деметилирования ДНК в дифференцированных клетках подобных первичным половым клеткам (ППК -подобным) из транскриптомных данных.

5. Индуцировать полученные аналоги ППК-подобных клеток человека к вхождению в мейоз для подтверждения идентичности первичных половых клеток и охарактеризовать мейоцито-подобные клетки.

6. Провести анализ особенностей дифференцировки мужских индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с трисомией 21 хромосомы в ППК-подобные клетки с применением разработанного протокола. Выявить молекулярные различия в их дифференцировке в сравнении с клетками нормального кариотипа. На основании полученных данных предложить возможную модель бесплодия у мужчин с трисомией 21 хромосомы.

Научная новизна

В работе впервые были получены ППК-подобные клетки из ХХ чИПСК и ХХ чЭСК и охарактеризованы для дальнейших исследований в делении мейоза. Проведен анализ транскриптома ППК-подобных клеток, полученных из ХХ чИПСК и мейоцито-подобных клеток. Сравнительный транскриптомный анализ показал схожесть в профилях экспрессии ППК-подобных клеток, полученных нами и клетками, полученными в других исследованиях.

В одной из недавних работ для инициации и прохождения делений мейоза ППК человека in vitro были применены ксеногенные соматические клетки гонады эмбриона мыши. В данной работе мы попробовали инициировать деление мейоза без ксеногенной ткани и поддерживающих соматических клеток гонады. При дифференцировке ППК-подобных клеток из ПСК в 3D культивировании имитируется гомеостаз и взаимосвязь клеток.

В работе мы показали, что деление мейоза активируется, но не прогрессирует и останавливается на ранней фазе лептотены профазы I мейоза. Полученные данные свидетельствует о том, что для деления мейоза у человека данные условия культивирования не полноценны и нужно дальше проводить исследования с целью оптимизации условий для обеспечения полного цикла деления мейоза человека in vitro.

Были получены ППК-подобные клетки из XY чИПСК и охарактеризованы. Проведена дифференцировка ППК-подобных клеток из XY чИПСК с трисомией 21 хромосомы и исследована экспрессия генов-маркеров ППК. Впервые выявлен низкий уровень экспрессии NANOS3 в XY чИПСК с трисомией 21 хромосомы.

Отработанный в данном исследовании протокол получения ППК человека (чППК) из чПСК предоставляет возможность получить высокий выход ППК-подобных клеток из чПСК и возможность изучить обособление ППК человека in vitro.

Получение ППК-подобных клеток человека in vitro предоставляет возможность исследовать генетические и эпигенетические процессы обособления ППК человека. В данной работе мы показали, что в ХХ линиях чПСК обе Х хромосомы остаются активными в период дифференцировки в ППК-подобные клетки путем исследования экспрессии XIST.

Практическая значимость работы

В исследовании мы попытались дифференцировать женские ППК-подобных клеток в мейоциты в самоорганизующихся трехмерных сфероидах. Протокол дифференцировки женских ППК-подобных клеток показал, что чПСК дифференцировались в ранние ППК-подобных клеток, экспрессирующих маркер поверхности зародышевых клеток SSEA1. Дальнейшая индукция мейоза полученных SSEA1+ половых клеток с ретиноевой кислотой в течение 20 суток выявила характеристики мейоза. Мы наблюдали, что ретиноевая кислота индуцированные ППК-подобные клетки к созреванию в клетки VASA+, окрашиваются положительно на STRA8. Транскриптомный анализ подтвердил активацию генов, связанных с ретиноевой кислотой и мейозом. Анализ генной онтологии указывает на процесс образования яичников и семенников. С другой стороны, дендрограмма кластеризации генерировала аналогичную кластеризацию групп ППК-подобные клетки и групп мейотических клеток относительно ранее опубликованных данных. Несмотря на точечную маркировку SCP3, мы не смогли обнаружить какое-либо раннее образование синаптонемных комплексов. Мы предполагаем, что одни только ППК-подобные клетки без поддерживающих клеток гонад не могут дифференцироваться в гаплоидные клетки. Для решения проблемы получения гамет in vitro необходимы дальнейшие исследования.

Мы изучили дифференцировку клеток в ППК-подобные клетки и продемонстрировали вклад NANOS3 в обособление ППК-подобных клеток с трисомией 21 хоромосомы. Мы предполагаем возможную роль NANOS3 в остановке гаметогенеза из-за дисбаланса клеточного цикла в ранних ППК-

подобных клетках и указываем на возможные альтернативные пути остановки гаметогенеза при ИПСК с трисомией 21 хромосомы. В результате клетки ИПСК с трисомией 21 хоромосомы могут быть предложены в качестве подходящей модели для исследования гаметогенеза и его возможных нарушений, вызванных трисомией 21 хоромосомы у людей.

Молекулярные особенности клеток, полученных в процессе дифференцировки чИПСК, подтверждают схожесть и подобность ППК человека. Эта работа требует дальнейших исследований для подтверждения истинности полученных ППК-подобных клеток в результате дифференцировки ПСК. Необходимо продолжить дифференцировку полученных ППК-подобных клеток в гаплоидные клетки. Деление мейоза и редукция хромосомного набора станут физиологическим доказательством полученных ППК in vitro.

Положения, выносимые на защиту

1. Определено формативное состояние плюрипотентных стволовых клеток человека, использованных в работе. Это состояние плюрипотентных стволовых клеток человека обеспечивает высокий (86%) процент получения в процессе разработанного протокола дифференцировки клеток, подобных первичным половым клеткам.

2. Реализация разработанного протокола дифференцировки в половые клетки ограничивается ранней фазой лептотены профазы I мейоза и точечной локализацией SCP3 белка в ядре мейоцитоподобных клеток. Культивирование ППК-подобных клеток в 3D условиях в среде определенного состава без поддерживающих соматических клеток гонады не достаточно для индукции вхождения клеток человека в мейоз.

3. Предлагается модель бесплодия с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с трисомией 21 хромосомы. При дифференцировке в первичные половые клетки экспрессия NANOS3

подавляется, в отличие от здоровых клеток. Низкий выход дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с трисомией по 21 хромосоме в первичные половые клетки можно объяснить низким уровнем экспрессии ИАИО^ЗЗ.

Степень достоверности и апробация результатов

Полученные результаты изложенные в диссертации были доложены в форме устных (5) и стендовых (1) докладов на российских и международных конференциях: 1) XVII Конференция-школа Актуальные проблемы биологии развития, Технопарк "Генериум", пос. Вольгинский Владимирской области, Россия, 10-14 октября 2016; 2) V Молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии института цитологии РАН, Россия, 18-21 сентября 2016; 3) КАРМ-Ш Международная конференция КРАЕУГОЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ, Россия, 29 ноября - 02 декабря 2018; 4) КАРМ-ХШ Международная конференция КРАЕУГОЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ, Россия, 02-05 июня 2022. 5) Работа была успешно апробирована на кафедре Биологии развития и эмбриологии, Биологического факультета, МГУ им. М.В. Ломносова в рамках Ломоносовских чтений 2022 года.

Личное участи автора

Автором были спланированы и выполнены все эксперименты, описанные в работе. Автор анализировал научную литературу по исследуемой теме, принимал решения, планировал исследования и выполнял эксперименты, освоил культуральные, молекулярные, биохимические и биоинформатические методы анализа материала. Провел статистические обработки и интерпретации полученных данных, подготовил и представил результаты исследования на конференциях. Выводы сформулированы на основе собственных оригинальных данных. Автор принимал непосредственное участие в написании статей и

апробации материалов диссертации. Все результаты работы получены лично автором. Соавторы указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работы, из них 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в международные реферативные базы данных и систем цитирования (WoS, Scopus) соответствующих ВАК, тезисов докладов и материалов конференций - 2.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 139 страницах, содержит 38 рисунков и 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, заключение, выводы, список сокращений, список литературы, включающий 234 цитируемых источников, и одного приложения.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Плюрипотентные стволовые клетки млекопитающих

Эмбриогенез - это комплексный и поэтапно усложняющийся процесс, который начинается из одной клетки и в результате координации различных клеточных и морфогенетических [7,8] процессов приводит к появлению функционально сбалансированного, полноценного, сложного организма [9]. Эмбриональное развитие можно рассмотреть под углом разных процессов, но мы будем концентрироваться на клеточных составляющих стадии доимплантационного раннего развития эмбриона.

Эмбриогенез начинается с процесса сингамии (Рис. 1). На этапе оплодотворения происходит интернализация гаплоидного генома отца в яйцеклетку и его слияние с материнским гаплоидным геномом с образованием диплоидной клетки - зиготы [10-12]. Зигота обладает потенциалом развития в полноценный организм. Этот потенциал клетки обозначается термином «тотипотентность» [13,14]. Геном тотипотентной клетки регулируются комбинацией сложных транскрипционных и трансляционных процессов и эпигенетических регуляторов [7,15,16]. В пространственно-временном континууме под влиянием внешних и внутренних стимулов тотипотентная клетка скатывается с вершины потентности эпигенетического ландшафта по Уоддингтону, принимая ограничения в путях развития. Первое ограничение потентности происходит на стадии морулы, когда тотипотентные клетки дифференцируются и разделяются на два клона: расположенные снаружи клетки внезародышевой эктодермы (клетки трофэктодермы) и клетки внутренней клеточной массы (ВКМ) [10,17,18]. Клетки ВКМ в дальнейшем будут дифференцироваться в три зародышевых листка с формированием первичной полоски в процессе гаструляции после имплантации [10,12,17]. Потенциал клеток ВКМ бластоцисты дифференцироваться в клетки трех зародышевых листков был определен как плюрипотентность [13,19-21].

Рисунок 1. Иллюстрация раннего развития человека. Схема преимплантационного и ранних этапов постимплантационного развития человека с указанием типов ПСК, получаемых из клеток эмбриона на различных стадиях его развития и их генов-маркеров. С зиготы по раннюю морулу клетки являются тотипотентными. В зрелой бластоцисте клетки ВКМ приобретают свойства наивной плюрипотентности. На стадии образования 3 типов клеток в преимплантационной бластоцисте клетки ВКМ дают начало эпибласту и сменяют свойства на розеточную плюрипотентность. На стадии пост-имплантации до образования

первичной полоски эмбриона эпибласт сохраняет формативное состояние плюрипотентности.

Клетки ВКМ бластоцисты были выделены и переведены в культуру получив название эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). ЭСК in vitro классифицируются как ПСК, которые являются уникальными клетками млекопитающих, способными бесконечно самообновляться в культуре и давать производные трех зародышевых листков. Эти клетки могут поддерживаться как линии клеток в искусственных условиях in vitro. ПСК-могут быть получены in

Рисунок 2. Иллюстрация получения плюрипотентных стволовых клеток in vitro. А. Из клеток внутриклеточной массы бластоцисты получают эмбриональные стволовые клетки. Б. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток путем репрограммирования соматических клеток с помощью «коктейля Яманаки».

vitro [22-25] и ex vivo путем индукции генами плюрипотентности [26,27].

Перенос ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки с последующим получением жизнеспособных организмов [28-32], работы по слиянию клеток, репрограмирование соматических клеток в ПСК привели к революции в сфере репрограммирования дифференцированных соматических клеток путем активации факторов плюрипотентности [33]. Такахаши и Яманака показали, что принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции, связанных с плюрипотентностью, инициирует процесс репрограмирования дифференцированной клетки [27,33]. Оказалось, что эктопическая экспрессия генов «коктейля Яманаки»: Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, достаточна для репрограммирования мышиных [33] и человеческих [27] фибробластов в плюрипотентное состояние и трансформации в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК).

Первые ИПСК человека были получены при помощи трансдукции лентивирусными конструкциями, несущими OCT3/4, SOX2, KLF4 и c-MYC. Однако этот метод обладает рядом существенных недостатков, которые препятствуют его применению в клинической практике. Интеграция вируса в геном соматической клетки может случайно активировать, либо подавлять экспрессию генов хозяина, что увеличивает риск мутагенеза. С другой стороны, неполноценное подавление трансгена во время репрограммирования и при последующей дифференцировке может стать причиной развития опухоли. С целью увеличения эффективности и безопасности репрограммирования были предложены новые стратегии, включающие полицистронные векторы [34], переходные или плазмидные трансфекции [26,35], аденовирусные векторы [35] и безвекторная доставка рекомбинантных белков [36]. Эти новые способы репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния проанализированы во многих обзорах [37-41].

В плане морфологии и теломеразной активности, скорости пролиферации,

активности промоторов, экспрессии поверхностных антигенов и

18

эпигенетического статуса оба типа клеток очень сходны [27,41]. Но при изучении выяснилось, что ЭСК мыши и человека отличаются по нескольким важным аспектам с точки зрения требований к культуре, профиля транскрипции и эпигенетики [27,41].

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) внешне кажутся неотличимыми от эмбриональных стволовых клетки (ЭСК). Изучение профилей экспрессии генов в ЭСК и ИПСК мыши и человека показало, что, несмотря на сходство ИПСК с ЭСК, ИПСК имеют свой уникальный профиль экспрессии генов, который появляется независимо от их происхождения или метода, с помощью которого они были получены [43]. Имеются также исследования, демонстрирующие отличия ИПСК человека на ранних пассажах и ЭСК человека на уровне транскриптома, в то время как на поздних пассажах их транскриптом приближается к ЭСК [42].

Клетки ВКМ вскоре после своего образования претерпевают следующее ограничение потентности (Рис. 1), разделяясь на клетки первичной энтодермы или гипобласта и клетки эпибласта [43]. В 2007 году были выделены первые стволовые клетки эпибласта мыши (ЭпиСК) [44,45]. Было показано, что ЭпиСК сохраняют свою плюрипотентность при культивировании в условиях для ЭСК человека, имеют ту же морфологию колоний, метаболизм, сигнальные пути и эпигенетические паттерны [46,47]. Мышиные ЭпиСК, а также ЭСК человека, полученные из бластоцисты имеют профили экспрессии, характерные для постимплантационного эпибласта, в то время как мышиные ЭСК близки к клеткам ВКМ бластоцисты [48]. Таким образом, были определены два различных состояния ПСК для описания ранних и поздних фаз онтогенеза эпибласта. «Наивное» состояние, приближенное к клеткам из преимплантационной ВКМ, и «праймированное», напоминающее постимплантационный эпибласт [49]. В обзоре Гордеева и др. (2021) детально разобраны различные состояния ПСК [50].

1.2. Наивные плюрипотентные стволовые клетки

«Наивной» плюрипотентной стволовой клеткой называют клетку, аналогичную клеткам преимплатационной ВКМ бластоцисты мыши. Для наивных ПСК мыши характерно увеличение белка JMJD2C [51], экспрессии Prdm14 [51], Klf2, Rexl [49], Esrrb, Pecaml, Tcl1,Tfcp2l1 и Nr0b1 [52], и снижение экспресии генов метилтрансфераз Dnmt3a/b, Tetl [51]. Постимплантационный эпибласт состоит из клеток, аналогом которых в культуре являются «праймированные» ПСК [53], клетки эпибласта мыши и ЭСК человека относятся к категории праймированных ПСК. Праймированные ПСК гиперметилируются подавляя гены наивности [54,55] и переключая энхансер Oct4 с дистального в проксимальный [47,56].

При культивировании в течение длительного времени наивное состояние ЭСК мыши поддерживается факторами ингибирующими дифференцировку: лейкемия ингибирующий фактор (LIF), ингибиторы MEK и GSK3 [57]. Используя этот подход исследователи стремились получить стабильную культуру наивных ПСК человека [47]. В этой же работе инъецировали наивные ИПСК человека, полученные в результате разработанной технологии, в морулы мыши и произвели межвидовые мышиные химерные эмбрионы, прошедшие органогенез [47]. Эти результаты показывают, что «наивность» как эмбриональных так и индуцированных ПСК человека - может быть использована в регенеративной медицине [58], моделировании ИПСК с пациент специфическими заболеваниями и исследованиях раннего развития человека in vitro или in vivo. Наивные ЭСК обычно растут в виде небольших, компактных куполообразных колоний, тогда как колонии праймированных ПСК большие и растут как монослой, подобно ЭСК человека. Кроме того, наивные клетки выживают лучше, чем их праймированные аналоги, при пассировании в виде одиночных клеток и имеют более короткое время удвоения [41, 42]. Другой ключевой особенностью наивного состояния в ЭСК является то, что обе Х-хромосомы активны в женских клетках и подвергаются случайной инактивации Х-хромосомы (XCI) при дифференцировке

in vitro. Напротив, XCI уже установлен в праймированных ЭСК, и эта особенность может, таким образом, использоваться в качестве надежного маркера для различения двух плюрипотентных состояний в женских стволовых клетках. Статус XCI также можно использовать для определения оптимальных условий культивирования для поддержания наивного состояния стволовых клеток и для мониторинга эпигенетической стабильности ЭСК человека [43]. Другие эпигенетические различия между двумя плюрипотентными состояниями включают глобальное гипометилирование ДНК, снижение распространенности репрессивной гистоновой метки H3K27me3 на промоторах и меньшее количество бивалентных доменов в наивных ЭСК [43]. В отличие от наивных ЭСК человека, праймированные ЭСК имеют потенциал дифференцироваться в ППК. Поэтому в данной работе мы использовали праймированные чЭСК.

Для поддержания праймированных ЭСК человека в культуре и сохранения их плюрипотентности необходимо присутствие следующих факторов: взаимодействие этих клеток с компонентами внеклеточного матрикса, межклеточные коммуникации и растворимые факторы роста FGF2 TGFP [59].

Важно отметить, что ЭСК человека, в отличие от мышиных ЭСК по своей экспрессии близки именно к праймированным клеткам и это представляет интерес для нашего исследования, так как одной из целей данной работы является получение ППК из ЭСК человека in vitro.

Были определены основные сигнальные пути BMP/SMAD, LIF/STAT3, FGF2/MEK/ERK и WNT/b-catenin, регулирующие самообновление ПСК [60,61]. Сравнение профилей глобальной экспрессии наивных ПСК и данных одноклеточного секвенирования рибонуклеиновых кислот (РНК) эмбрионов человека показало, что наивные ПСК человека, полученные в культуральных средах t2iLGo (PD03, CHIR, LIF и G06983) или 5iLAF (PD03, IM-12, LIF, WH-4-023, Y-27632, SB590885, Activin A, FGF) имеют схожий профиль экспрессий [6267]. Кроме того, среды t2iLGo и 5iLAF можно использовать для получения

наивных ЭСК непосредственно из преимплантационных бластоцист человека [48,65].

1.3. Обособление первичных половых клеток in vivo в эмбриональном развитии мыши

Все клетки организма можно условно разделить на соматические, формирующие органы и ткани и половые, обеспечивающие продолжение вида путем переноса генетической информации в следующее поколение [67]. Обособление половой линии у млекопитающих происходит de novo из клеток эпибласта изначально комметированных на развитие в соматические линии клеток. В этой связи одними из важнейших вопросов для биологии развития является понимание того как происходит репрессия соматической дифференцировки и сохранение плюрипотентного потенциала в то время как все остальные клетки эмбриона его теряют [71, 73].

Первичные половые клетки (ППК, называемые также первичными гоноцитами) у мышей возникают примерно на E 6,25 развития из небольшой группы клеток эпибласта, прилежащих к внезародышевой эктодерме и расположенных на дорсальной стороне эмбриона мыши (Рис. 3) [68,69].

К моменту появления ППК клетки эпибласта уже претерпевают «первичную» индукцию и разделяются на предшественников эктодермы и мезоэнтодермы. Интересно что ППК возникают из клеток коммитированных

Внезародышевая

Внезародышевая

V

ппк

Зародышевая мезодерма

мезодерма

Примитивная энтодерма

Е7,2

Эпибласт

Рисунок 3. Клеточное микроокружение ППК мыши на ранней стадии обособления. Схематическая иллюстрация эмбриона мыши на стадии Е7,2 и срез дорсальной стороны эмбриона с микроокружением ППК мыши ш vivo [70]. V: вентральная, D: дорсальная стороны эмбриона.

на развитие в мезодермальном направлении. Причем, как будет описано ниже, мезодермальные детерминанты, такие как Eomes и Brachyury, играют одну из ключевых ролей в процессах их обособления. С началом гаструляционных движений (Е6,5) у мыши ППК обнаруживаются в мезодерме первичной бороздки (Рис. 4), откуда они перемещаются в основание аллантоиса к Е7,0, где начинают экспрессировать тканенеспецифическую щелочную фосфатазу (TNAP) [71-73]. К Е7,75 ППК оказываются в энтодерме задней кишки [69,71]. Попадая в заднюю кишку [73], ППК мигрируют по ней к переднему концу зародыша пока не достигают мезонефрической почки, а затем, по дорсальному мезентерию и через регион аорто-гонадо-мезонефроса заселяют половые валики на Е10,5 [74-77]. В дальнейшем именно клетки с высокой активностью щелочной фосфатазы, сформированные под аллантоисом и мигрировавшие в зачаток гонады, превращаются в половые клетки, которые обеспечивают фертильность и перенос генома в следующее поколение. В период миграции ППК подвергаются общегеномному деметилированию ДНК и импринтинговому стиранию, что является подготовкой их к мейозу.

Рисунок 4. Схематическое изображение развития ППК у мышей. Схематическая иллюстрация спецификации ППК, миграции и заселение гонады у мыши. Вид поперечного среза эмбриона мыши на стадии Е9,5-10,5 [77].

Наиболее значимым механизмом в развитии половых клеток является эпигенетическое ремоделирование. Эпигенетическое перепрограммирование всего генома является главной чертой развития половых клеток, обеспечивая надлежащее генетическое наследование. Метилирование ДНК - это ковалентная модификация нуклеотида цитозина (С) путем присоединения метильной (-СН3) метки по позиции 5 пиримидина (5тС) [78]. В CpG островках 5тС метилирование промоторных регионов генов регулирует их уровень экспрессии [79]. В процессе репликации ДНК в делящихся клетках, метилирование вновь синтезируемых цепей ДНК поддерживается специальными белками метилтрансферазами ^ЫМТ), а деметилирование осуществляется при участии

белков TET-семейства [80]. В эмбриогенезе дважды происходит глобальное снятие метильных меток в геноме: в бластоцисте в клетках ВКМ и после имплантации, когда обособляются ППК [78,80]. Значительное глобальное деметилирование генома наблюдалось в ППК человека на стадии 4-недельного эмбриона [81-83]. В метилировании de novo участвуют ДНК-метилтрансферазы (DNMT). Исследования с использованием клеток человека показывают, что DNMT1 постоянно экспрессируется в ППК-подобных клетках, в то время как DNMT3B репрессируется во время их индукции in vitro, что согласуется с наблюдаемым в ППК обезьян cynomolgus [84,85]. Кроме этого в стирание родительского импринтинга в ППК вовлечены TET белки в ППК и уровни транскриптов этих белков были повышены в чППК, гоноцитах и ППК-подобных клетках мыши, но не в ППК-подобных клетках человека [82]. Большинство данных, касающихся модификации гистонов в ППК, были получены в исследованиях на мышах. Было показано, что при деметилировании геномной ДНК в ППК-подобных клетках мыши метилирование гистона 3 по 27 лизину (H3K27me3) повышается, а по 9 (H3K9me2) снижается [86,87]. BLIMP1 (PRDM1) - один из ключевых регуляторов обособления ППК, подавляет широкий диапазон регуляторных генов развития путем распространения H3K27me, что приводит к сильному Н3К27те3-зависимому супрессивному статусу в ППК-подобных клетках мыши [87]. Таким образом, обособляющиеся ППК подавляют соматическую дифференцировку и поддерживают программу развития в половые клетки. Соответственно, метилирование de novo деметилированного генома начинается после имплантации человеческого эмбриона и завершается в течение двух недель после оплодотворения. Оно происходит в половых клетках после заселения ими гонады. Характер импринтирования зависит от половой принадлежности половых клеток.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Абдыев Вепа Керимбердыевич, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Abrao M.S., Muzii L., Marana R. Anatomical causes of female infertility and their management // Int. J. Gynecol. Obstet. 2013. Vol. 123, № SUPPL. 2. P. S18-S24.

2. Anawalt B.D. Approach to male infertility and induction of spermatogenesis // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2013. Vol. 98, № 9. P. 3532-3542.

3. Rieger D. Culture systems: physiological and environmental factors that can affect the outcome of human ART. // Methods Mol. Biol. 2012. Vol. 912. P. 333-354.

4. Sharpe R.M. Environmental/lifestyle effects on spermatogenesis // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 2010. Vol. 365, № 1546. P. 1697-1712.

5. Handel M.A., Eppig J.J., Schimenti J.C. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells // Cell. Elsevier, 2014. Vol. 157, № 6. P. 1257-1261.

6. Singh K., Jaiswal D. Human Male infertility: A Complex Multifactorial Phenotype // Reproductive Sciences. 2011. Vol. 18, № 5. P. 418-425.

7. Mole M.A. et al. A single cell characterisation of human embryogenesis identifies pluripotency transitions and putative anterior hypoblast centre // Nat. Commun. 2021 121. Nature Publishing Group, 2021. Vol. 12, № 1. P. 1-12.

8. Weatherbee B.A.T., Cui T., Zernicka-Goetz M. Modeling human embryo development with embryonic and extra-embryonic stem cells // Dev. Biol. Academic Press, 2021. Vol. 474. P. 91-99.

9. Shahbazi M.N. Mechanisms of human embryo development: from cell fate to tissue shape and back. 2020.

10. Morriss-Kay G.M. Essentials of Human Embryology. By William J. Larsen. (Pp. xii+394; fully illustrated; f22 paperback; ISBN 0 443 07514 X.) Edinburgh: Churchill Livingstone. 1997. // J. Anat. Wiley-Blackwell, 1998. Vol. 192, № 3. P. 473-476.

11. Turathum B., Gao E.M., Chian R.C. The Function of Cumulus Cells in Oocyte Growth and Maturation and in Subsequent Ovulation and Fertilization // Cells 2021, Vol. 10, Page 2292. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2021. Vol. 10, № 9. P. 2292.

12. Wittemer C. et al. Zygote evaluation: an efficient tool for embryo selection // Hum. Reprod. Oxford Academic, 2000. Vol. 15, № 12. P. 2591-2597.

13. Mitalipov S., Wolf D. Totipotency, Pluripotency and Nuclear Reprogramming // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. Springer, Berlin, Heidelberg, 2009. Vol. 114. P. 185-199.

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

Maemura M. et al. Totipotency of mouse zygotes extends to single blastomeres of embryos at the four-cell stage // Sci. Reports 2021 111. Nature Publishing Group, 2021. Vol. 11, № 1. P. 1-20.

Petropoulos S. et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos // Cell. 2016. Vol. 165, № 4. P. 1012-1026.

Shahbazi M.N., Zernicka-Goetz M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo // Nat. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 20, № 8. P. 878-887.

Castrillon D.H. et al. Medical Embryology // Proc. Natl. Acad. Sci. Elsevier Inc., 2012. Vol. 21, № 9. P. 2857-2865.

Xiang L. et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos // Nat. 2019 5777791. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 577, № 7791. P. 537-542.

Nichols J. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo dependes on the POU transcription factor Oct4. // Cell. 1998. Vol. 95, № 3. P. 379-391.

Chambers I., Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells // Oncogene. 2004. Vol. 23, № 43 REV. ISS. 6. P. 7150-7160.

Stevens L.C. Origin of testicular teratomas from primordial germ cells in mice // J. Natl. Cancer Inst. 1967. Vol. 38, № 4. P. 549-552.

Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nat. 1981 2925819. Nature Publishing Group, 1981. Vol. 292, № 5819. P. 154-156.

Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. National Academy of Sciences, 1981. Vol. 78, № 12. P. 7634-7638.

Thomson J.A. et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 1998. Vol. 282, № 5391. P. 1145-1147.

Lagarkova M.A. et al. Human embryonic stem cell lines isolation, cultivation, and characterization // Vitr. Cell. Dev. Biol. 2010. Vol. 46, № 3-4. P. 284-293.

Okita K., Yamanaka S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2011. Vol. 366, № 1575. P. 2198-2207.

Takahashi K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human

Fibroblasts by Defined Factors // Cell. 2007. Vol. 131, № 5. P. 861-872.

28. Gurdon J.B. The Developmental Capacity of Nuclei taken from Intestinal Epithelium Cells of Feeding Tadpoles // Development. The Company of Biologists, 1962. Vol. 10, № 4. P. 622-640.

29. Gurdon J.B. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells // Dev. Biol. Academic Press, 1962. Vol. 4, № 2. P. 256-273.

30. Wilmut I., Clark A.J. Basic techniques for transgenesis // Printedin Gt. J. Reprod. Fert. 1991. Vol. 43. P. 265-275.

31. Wilmut I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // Nat. 1997 3856619. Nature Publishing Group, 1997. Vol. 385, № 6619. P. 810813.

32. Polejaeva I.A. 25th ANNIVERSARY OF CLONING BY SOMATIC CELL NUCLEAR TRANSFER: Generation of genetically engineered livestock using somatic cell nuclear transfer // Reproduction. Bioscientifica Ltd, 2021. Vol. 162, № 1. P. F11-F22.

33. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors // Cell. 2006. Vol. 126, № 4. P. 663-676.

34. Carey B.W. et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2009. Vol. 106, № 1. P. 157-162.

35. Stadtfeld M. et al. Induced pluripotency: history , mechanisms , and applications Induced pluripotency: history , mechanisms , and applications. 2010. P. 22392263.

36. Zhou H. et al. Cell Stem Cell Brief Report Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins // Stem Cell. Vol. 4. P. 381-384.

37. Мучкаева И.А. et al. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности. 2012. Vol. 1, № 12. P. 32-43.

38. Novosadova E. V., Grivennikov I.A. Induced pluripotent stem cells: from derivation to application in biochemical and biomedical research // Biochemistry. (Mosc). Biochemistry (Mosc), 2014. Vol. 79, № 13. P. 1425-1441.

39. Banito A., Gil J. Induced pluripotent stem cells and senescence: learning the biology to improve the technology. // EMBO Rep. 2010. Vol. 11, № 5. P. 353359.

40. Tabar V., Studer L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress // Nat Rev Genet. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 15, №

2. P. 82-92.

41. Hirschi K.K., Li S., Roy K. Induced Pluripotent Stem Cells for Regenerative Medicine // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2014. Vol. 16, № 1. P. 277-294.

42. Chin M.H. et al. Induced Pluripotent Stem Cells and Embryonic Stem Cells Are Distinguished by Gene Expression Signatures // Cell Stem Cell. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 5, № 1. P. 111-123.

43. Schrode N. et al. Anatomy of a blastocyst: Cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo // genesis. John Wiley & Sons, Ltd, 2013. Vol. 51, № 4. P. 219-233.

44. Brons I.G.M. et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos // Nature. Nature Publishing Group, 2007. Vol. 448, № 7150. P. 191195.

45. Tesar P.J. et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells // Nat. 2007 4487150. Nature Publishing Group, 2007. Vol. 448, № 7150. P. 196-199.

46. Hanna J. et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs // Proc. Natl. Acad. Sci. 2010. Vol. 107, № 20. P. 9222-9227.

47. Gafni O. et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells // Nature. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 504, № 7479. P. 282-286.

48. Guo G. et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass // Stem Cell Reports. The Authors, 2016. Vol. 6, № 4. P. 437-446.

49. Nichols J., Smith A. Naive and Primed Pluripotent States // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2009. Vol. 4, № 6. P. 487-492.

50. Gordeev M.N., Bakhmet E.I., Tomilin A.N. Pluripotency Dynamics during Embryogenesis and in Cell Culture // Russ. J. Dev. Biol. Springer, 2021. Vol. 52, № 6. P. 379-389.

51. Sim Y.-J. et al. 2i Maintains a Naive Ground State in ESCs through Two Distinct Epigenetic Mechanisms // Stem Cell Reports. 2017. Vol. 8, № 5. P. 1312-1328.

52. Ghimire S. et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background // Sci. Reports 2018 81. Nature Publishing Group, 2018. Vol. 8, № 1. P. 1-11.

53. Ware C.B. et al. Derivation of naive human embryonic stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. Vol. 111, № 12. P. 4484-4489.

54. Leitch H.G. et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation // Nat. Struct. Mol. Biol. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 20, № 3. P. 311-316.

55. Lee H.J., Hore T.A., Reik W. Reprogramming the Methylome: Erasing Memory and Creating Diversity // Cell Stem Cell. Cell Press, 2014. Vol. 14, № 6. P. 710719.

56. Choi H.W. et al. Distinct Enhancer Activity of Oct4 in Naive and Primed Mouse Pluripotency // Stem Cell Reports. Cell Press, 2016. Vol. 7, № 5. P. 911-926.

57. Ying Q.-L. et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. // Nature. 2008. Vol. 453, № May. P. 519-523.

58. Sinenko S.A., Ponomartsev S. V., Tomilin A.N. Pluripotent stem cell-based gene therapy approach: human de novo synthesized chromosomes // Cell. Mol. Life Sci. Cell Mol Life Sci, 2021. Vol. 78, № 4. P. 1207-1220.

59. Ávila-González D. et al. Unraveling the Spatiotemporal Human Pluripotency in Embryonic Development // Front. Cell Dev. Biol. Frontiers Media S.A., 2021. Vol. 9. P. 1539.

60. Zo-Bravo A. et al. Transcription Factor TFAP2C Regulates Major Programs Required for Murine Fetal Germ Cell Maintenance and Haploinsuffíciency Predisposes to Teratomas in Male Mice // PLoS One. 2013. Vol. 8, № 8. P. 71113.

61. Zimmerlin L., Park T.S., Zambidis E.T. Capturing Human Naïve Pluripotency in the Embryo and in the Dish // Stem Cells Dev. Mary Ann Liebert, Inc. 140 Huguenot Street, 3rd Floor New Rochelle, NY 10801 USA, 2017. Vol. 26, № 16. P. 1141-1161.

62. Huang K., Maruyama T., Fan G. The naive state of human pluripotent stem cells: A synthesis of stem cell and preimplantation embryo transcriptome analyses // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2014. Vol. 15, № 4. P. 410-415.

63. Nakamura T. et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans // Nature. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 537, № 7618. P. 57.

64. Takashima Y. et al. Resetting Transcription Factor Control Circuitry toward Ground-State Pluripotency in Human // Cell. Elsevier, 2015. Vol. 162, № 2. P. 452-453.

65. Theunissen T.W. et al. Systematic Identification of Culture Conditions for Induction and Maintenance of Naive Human Pluripotency // Cell Stem Cell. 2014. Vol. 15, № 4. P. 471-487.

66. Stirparo G.G. et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast // Dev. Company

of Biologists Ltd, 2018. Vol. 145, № 3.

67. Takashima Y. et al. Resetting Transcription Factor Control Circuitry toward Ground-State Pluripotency in Human // Cell. Cell Press, 2014. Vol. 158, № 6. P. 1254-1269.

68. Kurimoto K. et al. Complex genome-wide transcription dynamics orchestrated by Blimp1 for the specification of the germ cell lineage in mice // Genes Dev. 2008. Vol. 22, № 12. P. 1617-1635.

69. Tanaka S.S. et al. IFITM/mil/fragilis family proteins IFITM1 and IFITM3 play distinct roles in mouse primordial germ cell homing and repulsion // Dev. Cell. 2005. Vol. 9, № 6. P. 745-756.

70. Абдыев В.К. et al. СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ ПОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА in vitro // Биохимия. Pleiades Publishing Ltd, 2019. Vol. 84, № 3. P. 330-342.

71. Ginsburg M., Snow M.H.L., Mclaren A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation // Development. 1990. Vol. 110. P. 521-528.

72. Irie N., Tang W.W.C., Azim Surani M. Germ cell specification and pluripotency in mammals: a perspective from early embryogenesis // Reprod. Med. Biol. 2014. Vol. 13, № 4. P. 203-215.

73. Saitou M., Yamaji M. Germ cell specification in mice: Signaling, transcription regulation, and epigenetic consequences // Reproduction. 2010. Vol. 139, № 6. P. 931-942.

74. Felici M. De. Oogenesis. 2013. P. 19-38.

75. Leitch H.G., Tang W.W.C., Surani M.A. Primordial Germ-Cell Development and Epigenetic Reprogramming in Mammals // Current Topics in Developmental Biology. 1st ed. Copyright © 2013 Elsevier Inc. All rights reserved., 2013. Vol. 104. 149-187 p.

76. Кожухарь В.Г. Первичные половые клетки млекопитающих и человека. Происхождение иденцификация миграция. 2011.

77. Saitou M., Yamaji M. Primordial Germ Cells in Mice // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2012. Vol. 4, № 11. P. a008375-a008375.

78. Luo C., Hajkova P., Ecker J.R. Dynamic DNA methylation: In the right place at the right time // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 2018. Vol. 361, № 6409. P. 1336-1340.

79. Jones P.A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond // Nat. Rev. Genet. 2012 137. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 13, № 7. P. 484-492.

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

Gkountela S. et al. Resource DNA Demethylation Dynamics in the Human Prenatal DNA Demethylation Dynamics in the Human Prenatal Germline. 2015. P.1425-1436.

Anifandis G. et al. Genes and Conditions Controlling Mammalian Pre- and Postimplantation Embryo Development // Curr. Genomics. 2014.

von Meyenn F. et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In Vitro Primordial Germ Cell Specification // Dev. Cell. 2016. Vol. 39, № 1. P. 104-115.

Fernandes M.G. et al. Characterization of migratory primordial germ cells in the aorta-gonad-mesonephros of a 4.5-week-old human embryo: A toolbox to evaluate in vitro early gametogenesis // Mol. Hum. Reprod. 2018. Vol. 24, № 5. P. 233-243.

Morohaku K. et al. Complete in vitro generation of fertile oocytes from mouse primordial germ cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2016. Vol. 113, № 32. P. 201603813-201603817.

Sasaki K. et al. Robust In Vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2015. Vol. 17, № 2. P. 178-194.

Saitou M., Barton S.C., Surani M.A. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice // Nature. 2002. Vol. 418, № 6895. P. 293-300.

Kurimoto K., Saitou M. ScienceDirect Epigenome regulation during germ cell specification and development from pluripotent stem cells // Curr. Opin. Genet. Dev. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 52. P. 57-64.

Saitou M., Miyauchi H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells // Cell Stem Cell. 2016. Vol. 18, № 6. P. 721-735.

Lawson K.A. et al. mouse embryo Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo // Genes Dev. 1999. P. 424-436.

Ohinata Y. et al. A Signaling Principle for the Specification of the Germ Cell Lineage in Mice // Cell. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 137, № 3. P. 571-584.

Okamura D., Hayashi K., Matsui Y. Mouse epiblasts change responsiveness to BMP4 signal required for PGC formation through functions of extraembryonic ectoderm // Mol. Reprod. Dev. 2005. Vol. 70, № 1. P. 20-29.

Ying Y., Zhao G.Q. Cooperation of endoderm-derived BMP2 and extraembryonic ectoderm-derived BMP4 in primordial germ cell generation in the mouse // Dev. Biol. 2001. Vol. 232, № 2. P. 484-492.

Lange U.C. et al. The fragilis interferon-inducible gene family of transmembrane

proteins is associated with germ cell specification in mice. // BMC Dev. Biol. 2003. Vol. 3. P. 1.

94. Ohinata Y. et al. Blimp1 is a critical determinant of the germ cell lineage in mice. // Nature. 2005. Vol. 436, № July. P. 207-213.

95. De Felici M. Primordial germ cell biology at the beginning of the XXI Century // Int. J. Dev. Biol. 2009. Vol. 53, № 7. P. 891-894.

96. Tilgner K. et al. Isolation of primordial germ cells from differentiating human embryonic stem cells // Stem Cells. 2008. Vol. 26, № 12. P. 3075-3085.

97. Panula S. et al. Human germ cell differentiation from fetal- and adult-derived induced pluripotent stem cells // Hum. Mol. Genet. 2011. Vol. 20, № 4. P. 752762.

98. West J.A. et al. A role for Lin28 in primordial germ-cell development and germ-cell malignancy // Nature. 2009. Vol. 460, № 7257. P. 909-913.

99. Kilens S. et al. Parallel derivation of isogenic human primed and naive induced pluripotent stem cells // Nat. Commun. 2018. Vol. 9, № 1. P. 1-13.

100. Hübner K. et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. // Science. 2003. Vol. 300, № 5623. P. 1251-1256.

101. Hara K. et al. Evidence for crucial role of hindgut expansion in directing proper migration of primordial germ cells in mouse early embryogenesis // Dev. Biol. 2009. Vol. 330, № 2. P. 427-439.

102. Eguizabal C. et al. Complete meiosis from human induced pluripotent stem cells // Stem Cells. 2011. Vol. 29, № 8. P. 1186-1195.

103. Leng L. et al. Differentiation of primordial germ cells from induced pluripotent stem cells of primary ovarian insufficiency // Hum. Reprod. 2015. Vol. 30, № 3. P. 737-748.

104. Watanabe K. et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. // Nat. Biotechnol. 2007. Vol. 25, № 6. P. 681-686.

105. Tang W.W.C. et al. Resource A Unique Gene Regulatory Network Resets the Human Germline Epigenome for Development Resource A Unique Gene Regulatory Network Resets the Human Germline Epigenome for Development // Cell. The Authors, 2015. Vol. 161, № 6. P. 1453-1467.

106. Park T.S. et al. Derivation of primordial germ cells from human embryonic and induced pluripotent stem cells is significantly improved by coculture with human fetal gonadal cells // Stem Cells. 2009. Vol. 27, № 4. P. 783-795.

107. Lin I.Y. et al. Suppression of the SOX2 neural effector gene by PRDM1 promotes human germ cell fate in embryonic stem cells // Stem Cell Reports. The Authors,

129

2014. Vol. 2, № 2. P. 189-204.

108. Perrett R.M. et al. The early human germ cell lineage does not express SOX2 during in vivo development or upon in vitro culture. // Biol. Reprod. 2008. Vol. 78, № 5. P. 852-858.

109. Schrans-Stassen B.H.G.J. et al. Nature of the Spermatogenic Arrest in Dazl -/Mice // Biol. Reprod. Oxford Academic, 2001. Vol. 65, № 3. P. 771-776.

110. Onfray C. et al. Induction of Human Naïve Pluripotent Stem Cells from Somatic Cells. Humana, New York, NY, 2022. P. 39-51.

111. Yamaguchi S. et al. Conditional knockdown of Nanog induces apoptotic cell death in mouse migrating primordial germ cells. // Development. 2009. Vol. 136, № 23. P. 4011-4020.

112. Murakami K. et al. NANOG alone induces germ cells in primed epiblast in vitro by activation of enhancers // Nature. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 529, № 7586. P. 1-22.

113. Grabole N. et al. Prdm14 promotes germline fate and naive pluripotency by repressing FGF signalling and DNA methylation. // EMBO Rep. 2013. Vol. 14, № 7. P. 629-637.

114. Yamaji M. et al. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2013. Vol. 12, № 3. P. 368-382.

115. Sugawa F. et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. // EMBO J. 2015. Vol. 34, № 8. P. 10091024.

116. Irie N. et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate // Cell. The Authors, 2015. Vol. 160, № 1-2. P. 253-268.

117. Theunissen T.W. et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State // Cell Stem Cell. 2016. Vol. 19, № 4. P. 502-515.

118. Clark A.T. et al. Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro // Hum. Mol. Genet. 2004. Vol. 13, № 7. P. 727-739.

119. Gkountela S. et al. The ontogeny of cKIT+ human primordial germ cells proves to be a resource for human germ line reprogramming, imprint erasure and in vitro differentiation // Nat Cell Biol. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 15, № 1. P. 113-122.

120. Zhao Y. et al. In Vitro Modeling of Human Germ Cell Development Using Pluripotent Stem Cells // Stem Cell Reports. ElsevierCompany., 2018. Vol. 10, № 2. P. 509-523.

121. Suzuki H. et al. Nanos3 maintains the germ cell lineage in the mouse by suppressing both Bax-dependent and -independent apoptotic pathways // Dev. Biol. 2008.

122. Panula S. et al. Over Expression of NANOS3 and DAZL in Human Embryonic Stem Cells // PLoS One / ed. Cooney A.J. 2016. Vol. 11, № 10. P. e0165268.

123. Castrillon D.H. et al. The human VASA gene is specifically expressed in the germ cell lineage. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. Vol. 97, № 17. P. 9585-9590.

124. Medrano J. V. et al. Divergent RNA-binding Proteins, DAZL and VASA, Induce Meiotic Progression in Human Germ Cells Derived in Vitro // Stem Cells. 1st ed. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 30, № 3. P. 441-451.

125. Soper S.F.C. et al. Mouse Maelstrom, a Component of Nuage, Is Essential for Spermatogenesis and Transposon Repression in Meiosis // Dev. Cell. 2008. Vol. 15, № 2. P. 285-297.

126. Easley C.A. et al. Direct Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Haploid Spermatogenic Cells // Cell Rep. The Authors, 2012. Vol. 2, № 3. P. 440446.

127. Hayashi Y., Saitou M., Yamanaka S. Germline development from human pluripotent stem cells toward disease modeling of infertility // Fertil. Steril. American Society for Reproductive Medicine, 2012. Vol. 97, № 6. P. 1250-1259.

128. Liu P. et al. Requirement for Wnt3 in vertebrate axis formation // Nat. Genet. 1999. Vol. 22, № 4. P. 361-365.

129. Yoon Y. et al. Extra-embryonic Wnt3 regulates the establishment of the primitive streak in mice // Dev. Biol. 2015. Vol. 403, № 1. P. 80-88.

130. McKay D.G. et al. Histochemical observations on the germ cells of human embryos // Anat. Rec. 1953. Vol. 117, № 2. P. 201-219.

131. Kellokumpu-Lehtinen P.-L., Söderström K.-O. Occurrence of nuage in fetal human germ cells // Cell Tissue Res. 1978. Vol. 194, № 1. P. 171-177.

132. Findley S.D. et al. Maelstrom, a Drosophila spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa and RDE1/AGO1 homolog, Aubergine, in nuage. // Development. 2003. Vol. 130, № 5. P. 859-871.

133. Ishidate T. et al. ZNFX-1 Functions within Perinuclear Nuage to Balance Epigenetic Signals // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2018. Vol. 70, № 4. P. 639-649.e6.

134. Zhou Q. et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2016. Vol. 18, № 3. P. 330-340.

135. Sasaki K. et al. The Germ Cell Fate of Cynomolgus Monkeys Is Specified in the Nascent Amnion // Dev. Cell. Cell Press, 2016. Vol. 39, № 2. P. 169-185.

131

136. Jostes S., Schorle H. Signals and transcription factors for specification of human germ cells // Stem Cell Investig. 2018. Vol. 5, № 7. P. 13-13.

137. Aramaki S. et al. A mesodermal factor, T, specifies mouse germ cell fate by directly activating germline determinants // Dev. Cell. Elsevier Inc., 2013. Vol. 27, № 5. P. 516-529.

138. Kurimoto K. et al. Quantitative Dynamics of Chromatin Remodeling during Germ Cell Specification from Mouse Embryonic Stem Cells // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2015. Vol. 16, № 5. P. 517-532.

139. Kee K. et al. Bone morphogenetic proteins induce germ cell differentiation from human embryonic stem cells // Stem Cells Dev. 2006. Vol. 15, № 6. P. 831-837.

140. Chuang C.Y. et al. Meiotic competent human germ cell-like cells derived from human embryonic stem cells induced by BMP4/WNT3A signaling and OCT4/EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) selection // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 287, № 18. P. 14389-14401.

141. Bernardo A.S. et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages // Cell Stem Cell. 2011. Vol. 9, № 2. P. 144-155.

142. Chen D. et al. Modeling human infertility with pluripotent stem cells // Stem Cell Res. The Authors, 2017. Vol. 21. P. 187-192.

143. Angeles Julaton V.T., Reijo Pera R.A. NANOS3 function in human germ cell development // Hum. Mol. Genet. 2011. Vol. 20, № 11. P. 2238-2250.

144. Kehler J. et al. Oct4 is required for primordial germ cell survival. // EMBO Rep. 2004. Vol. 5, № 11. P. 1078-1083.

145. Okamura D. et al. Requirement of Oct3/4 function for germ cell specification // Dev. Biol. 2008. Vol. 317, № 2. P. 576-584.

146. Chambers I. et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development // Nature. 2007. Vol. 450, № 7173. P. 1230-1234.

147. Yamaji M. et al. Critical function of Prdm14 for the establishment of the germ cell lineage in mice // Nat. Genet. 2008. Vol. 40, № 8. P. 1016-1022.

148. Gell J.J. et al. PRDM14 is expressed in germ cell tumors with constitutive overexpression altering human germline differentiation and proliferation // Stem Cell Res. The Authors, 2018. Vol. 27. P. 46-56.

149. Weber S. et al. Critical function of AP-2 gamma/TCFAP2C in mouse embryonic germ cell maintenance. // Biol. Reprod. 2010. Vol. 82, № 1. P. 214-223.

150. Kumar D.L., Defalco T. Of Mice and Men: In Vivo and in Vitro Studies of Primordial Germ Cell Specification // Semin. Reprod. Med. 2017. Vol. 35, № 2. P.

132

139-146.

151. Vincent S.D. The zinc finger transcriptional repressor Blimp 1/Prdm1 is dispensable for early axis formation but is required for specification of primordial germ cells in the mouse // Development. 2005. Vol. 132, № 6. P. 1315-1325.

152. Tsuda M. et al. Conserved role of nanos proteins in germ cell development // Science (80-. ). 2003.

153. Tanaka S.S. et al. The mouse homolog of Drosophila Vasa is required for the development of male germ cells // Genes Dev. 2000.

154. Buehr M. et al. Proliferation and migration of primordial germ cells in We/We mouse embryos. // Dev. Dyn. 1993.

155. Kudo T. et al. Normal Embryonic and Germ Cell Development in Mice Lacking a Disappearance of Stage-Specific Embryonic Antigen 1 Normal Embryonic and Germ Cell Development in Mice Lacking ,_, 1 , 3-Fucosyltransferase IX ( Fut9 ) Which Show Disappearance of Stage-Specific E // Mol. Cell. Biol. 2004. Vol. 24, № 10. P. 4221-4228.

156. Payer B. et al. stella Is a Maternal Effect Gene Required for Normal Early Development in Mice // Curr. Biol. 2003. Vol. 13, № 23. P. 2110-2117.

157. Saitou M., Kagiwada S., Kurimoto K. Epigenetic reprogramming in mouse pre-implantation development and primordial germ cells // Development. 2012. Vol. 139, № 1. P. 15-31.

158. Magnusdottir E., Surani M.A. How to make a primordial germ cell // Development. Development, 2014. Vol. 141, № 2. P. 245-252.

159. Hayashi K. et al. Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells // Cell. Elsevier Inc., 2011. Vol. 146, № 4. P. 519-532.

160. Magnusdottir E. et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice // Nat. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 15, № 8. P. 905-915.

161. Geijsen N. et al. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. // Nature. 2004. Vol. 427, № January. P. 148-154.

162. Fujimoto T., Miyayama Y., Fuyuta M. The origin, migration and fine morphology of human primordial germ cells // Anat. Rec. 1977. Vol. 188, № 3. P. 315-329.

163. Funkuda T. Ultrastructure of primordial germ cells in human embryo. // Virchows Arch. B. Cell Pathol. 1976. Vol. 20. P. 85-89.

164. Hayashi K. et al. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice // Science (80-. ). 2012. Vol. 338, № 6109. P. 971-975.

133

165. Hackett J.A., Zylicz J.J., Surani M.A. Parallel mechanisms of epigenetic reprogramming in the germline // Trends in Genetics. 2012. Vol. 28, № 4. P. 164174.

166. Eguizabal C. et al. Characterization of the Epigenetic Changes During Human Gonadal Primordial Germ Cells Reprogramming // Stem Cells. 2016. Vol. 34, № 9. P. 2418-2428.

167. Kerr C.L. et al. Expression of pluripotent stem cell markers in the human fetal ovary. // Hum. Reprod. 2008. Vol. 23, № 3. P. 589-599.

168. Xie L. et al. Sertoli cell-mediated differentiation of male germ cell-like cells from human umbilical cord Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in an in vitro co-culture system // Eur. J. Med. Res. 2015. Vol. 20, № 1. P. 9.

169. Kobayashi T. et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 546, № 7658. P. 416-420.

170. Kojima Y. et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 21, № 4. P. 517-532.e5.

171. Okashita N. et al. PRDM14 promotes active DNA demethylation through the Teneleven translocation (TET)-mediated base excision repair pathway in embryonic stem cells // Dev. 2014.

172. Kojima Y. et al. GATA transcription factors, SOX17 and TFAP2C, drive the human germ-cell specification program // Life Sci. Alliance. Life Science Alliance LLC, 2021. Vol. 4, № 5. P. e202000974.

173. Doi A. et al. Differential methylation of tissue- and cancer-specific CpG island shores distinguishes human induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells and fibroblasts // Nat. Genet. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 41, № 12. P. 1350-1353.

174. Easley IV C.A., Simerly C.R., Schatten G. Stem cell therapeutic possibilities: Future therapeutic options for male-factor and female-factor infertility? // Reprod. Biomed. Online. Reproductive Healthcare Ltd., 2013. Vol. 27, № 1. P. 75-80.

175. Sybirna A. et al. A critical role of PRDM14 in human primordial germ cell fate revealed by inducible degrons // Nat. Commun. Nature Research, 2020. Vol. 11, № 1.

176. Hsiang Y.H.H. et al. Gonadal function in patients with Down syndrome // Am. J. Med. Genet. 1987. Vol. 27, № 2. P. 449-458.

177. Pradhan M. et al. Fertility in men with Down syndrome: a case report // Fertil. Steril. 2006. Vol. 86, № 6. P. 1765.e1-1765.e3.

178. Papavassiliou P. et al. Mosaicism for trisomy 21: A review // American Journal of Medical Genetics, Part A. 2015.

179. Chew G., Hutson J.M. Incidence of cryptorchidism and ascending testes in Trisomy 21: A 10 year retrospective review // Pediatr. Surg. Int. 2004. Vol. 20, № 10. P. 744-747.

180. Prandini P. et al. Natural Gene-Expression Variation in Down Syndrome Modulates the Outcome of Gene-Dosage Imbalance // Am. J. Hum. Genet. 2007. Vol. 81, № 2. P. 252-263.

181. Deutsch S. et al. Gene expression variation and expression quantitative trait mapping of human chromosome 21 genes // Hum. Mol. Genet. 2005.

182. Bovicelli L. et al. Reproduction in down syndrome // Obstet. Gynecol. 1982. Vol. 59, № 6. P. 13S-17S.

183. Eyman R.K., Call T.L., White J.F. Life expectancy of persons with Down syndrome // Am. J. Ment. Retard. 1991. Vol. 95, № 6. P. 603-612.

184. Shobha Rani A. et al. Reproduction in Down's syndrome // Int. J. Gynecol. Obstet. 1990.

185. H0JAGER B. et al. FOLLICULAR DEVELOPMENT IN OVARIES OF CHILDREN WITH DOWN'S SYNDROME // Acta Pœdiatrica. 1978.

186. Miki M. et al. Seminoma associated with bilateral cryptorchidism in Down's syndrome: A case report // Int. J. Urol. 1999. Vol. 6, № 7. P. 377-380.

187. Lynch M. Evolution of the mutation rate // Trends Genet. Elsevier Current Trends, 2010. Vol. 26, № 8. P. 345-352.

188. Milholland B. et al. Differences between germline and somatic mutation rates in humans and mice // Nat. Commun. 2017 81. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 8, № 1. P. 1-8.

189. Page S.L., Hawley R.S. the Genetics and Molecular Biology of the Synaptonemal Complex // Http: //Dx.Doi. Org/10.1146/Annurev.Cellbio.19.111301.155141. 2004.

190. Dashinimaev E.B. et al. Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome Reproduce Early Stages of Alzheimer's Disease Type Pathology in vitro // J. Alzheimer's Dis. 2017. Vol. 56, № 2. P. 835-847.

191. Spangenberg V. et al. Extraordinary centromeres: differences in the meiotic chromosomes of two rock lizards species Darevskia portschinskii and Darevskia raddei // PeerJ. 2019. Vol. 7. P. e6360.

192. Page J. et al. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells // Chromosom. Res. 1998.

193. Donaldson J.G. Immunofluorescence Staining // Curr. Protoc. Cell Biol. 2015. Vol. 69, № 1. P. 4.3.1-4.3.7.

194. Dobin A. et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner // Bioinformatics. Oxford Academic, 2013. Vol. 29, № 1. P. 15-21.

195. Yamashiro C. et al. Generation of human oogonia from induced pluripotent stem cells in vitro // Science (80-. ). 2018.

196. Mazid M.A. et al. Rolling back human pluripotent stem cells to an eight-cell embryo-like stage // Nat. 2022 6057909. Nature Publishing Group, 2022. Vol. 605, № 7909. P. 315-324.

197. Ramos-Ibeas P. et al. Characterisation of the deleted in azoospermia like (Dazl)-green fluorescent protein mouse model generated by a two-step embryonic stem cell-based strategy to identify pluripotent and germ cells // Reprod. Fertil. Dev. CSIRO PUBLISHING, 2016. Vol. 28, № 11. P. 1741-1752.

198. Sasaki T. et al. Identification of eight members of the Argonaute family in the human genome ☆ // Genomics. Academic Press, 2003. Vol. 82, № 3. P. 323-330.

199. Kinoshita M., Smith A. Pluripotency Deconstructed // Dev. Growth Differ. 2018. Vol. 60, № 1. P. 44-52.

200. Kinoshita M. et al. Capture of Mouse and Human Stem Cells with Features of Formative Pluripotency // Cell Stem Cell. Cell Press, 2021. Vol. 28, № 3. P. 453-471.e8.

201. Hoogland S.H.A., Marks H. Developments in pluripotency: a new formative state // Cell Res. Nature Publishing Group, 2021. Vol. 31, № 5. P. 493-494.

202. Yeh C.Y. et al. Capturing Pluripotency and Beyond // Cells 2021, Vol. 10, Page 3558. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2021. Vol. 10, № 12. P. 3558.

203. Yamashiro C. et al. Generation of human oogonia from induced pluripotent stem cells in culture // Nat. Protoc. Springer US, 2020. Vol. 15, № 4. P. 1560-1583.

204. Hackett J.A., Azim Surani M. Regulatory principles of pluripotency: From the ground state up // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2014. Vol. 15, № 4. P. 416-430.

205. Tsuneyoshi N. et al. PRDM14 suppresses expression of differentiation marker genes in human embryonic stem cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 367, № 4. P. 899-905.

206. Ohnishi Y. et al. Cell-to-cell expression variability followed by signal reinforcement progressively segregates early mouse lineages // Nat. Cell Biol. 2013 161. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 16, № 1. P. 27-37.

207. Guo G. et al. Resolution of Cell Fate Decisions Revealed by Single-Cell Gene Expression Analysis from Zygote to Blastocyst // Dev. Cell. Cell Press, 2010. Vol.

136

18, № 4. P. 675-685.

208. Boyer L.A. et al. Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells // Cell. Cell Press, 2005. Vol. 122, № 6. P. 947-956.

209. Boroviak T. et al. The ability of inner-cell-mass cells to self-renew as embryonic stem cells is acquired following epiblast specification // Nat. Cell Biol. 2014 166. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 16, № 6. P. 513-525.

210. Campolo F. et al. Essential role of Sox2 for the establishment and maintenance of the germ cell line // Stem Cells. 2013. Vol. 31, № 7. P. 1408-1421.

211. Avilion A.A. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function // Genes Dev. 2003. Vol. 17, № 1. P. 126-140.

212. Vertesy A. et al. Parental haplotype-specific single-cell transcriptomics reveal incomplete epigenetic reprogramming in human female germ cells // Nat. Commun. Springer US, 2018. P. 1-10.

213. Li L. et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis Maps Development of Human Germline Cells and Gonadal Niche Interactions // Cell Stem Cell. 2017.

214. Anderson R.A. et al. Conserved and divergent patterns of expression of DAZL, VASA and OCT4 in the germ cells of the human fetal ovary and testis // BMC Dev. Biol. BioMed Central, 2007. Vol. 7, № 1. P. 136.

215. Xu X. et al. Mouse Dazl and its novel splice variant functions in translational repression of target mRNAs in embryonic stem cells // Biochim. Biophys. Acta -Gene Regul. Mech. Elsevier B.V., 2013. Vol. 1829, № 5. P. 425-435.

216. Chen H.-H. et al. DAZL Limits Pluripotency, Differentiation, and Apoptosis in Developing Primordial Germ Cells // Stem Cell Reports. 2014. Vol. 3, № 5. P. 892-904.

217. Robinson-Bennett B., Han A. 30 Role of Immunohistochemistry in Elucidating Lung Cancer Metastatic to the Ovary from Primary Ovarian Carcinoma // Handbook of Immunohistochemistry and in Situ Hybridization of Human Carcinomas. 2005.

218. Wick M.R., Hornick J.L. Immunohistology of Soft Tissue and Osseous Neoplasms // Diagnostic Immunohistochemistry. 2010.

219. Syrjänen J.L. et al. Single-molecule observation of DNA compaction by meiotic protein SYCP3 // Elife. eLife Sciences Publications, Ltd, 2017. Vol. 6.

220. Ben-Asher H.W. et al. Expression and chromosomal organization of mouse meiotic genes // Mol. Reprod. Dev. John Wiley & Sons, Ltd, 2010. Vol. 77, № 3. P. 241-248.

221. Zickler D., Kleckner N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs

137

during Meiosis // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015. Vol. 7, № 6. P. a016626.

222. de la Fuente R. et al. Epigenetic dysregulation of mammalian male meiosis caused by interference of recombination and synapsis // Cells. MDPI, 2021. Vol. 10, № 9. P. 2311.

223. Shima J.E. et al. The murine testicular transcriptome: characterizing gene expression in the testis during the progression of spermatogenesis // Biol. Reprod. Biol Reprod, 2004. Vol. 71, № 1. P. 319-330.

224. Dominguez A.A. et al. Human germ cell formation in xenotransplants of induced pluripotent stem cells carrying X chromosome aneuploidies. // Sci. Rep. 2014. Vol. 4. P. 6432.

225. Sahakyan A. et al. Human Naive Pluripotent Stem Cells Model X Chromosome Dampening and X Inactivation // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 20, № 1. P. 87-101.

226. Chuva De Sousa Lopes S.M. et al. X chromosome activity in mouse XX primordial germ cells // PLoS Genet. 2008. Vol. 4, № 2.

227. Cortes D. et al. The asymmetry of female meiosis reduces the frequency of inheritance of unpaired chromosomes // Elife. eLife Sciences Publications Ltd, 2015. Vol. 2015, № 4.

228. Royo H. et al. Silencing of X-Linked MicroRNAs by Meiotic Sex Chromosome Inactivation // PLOS Genet. Public Library of Science, 2015. Vol. 11, № 10. P. e1005461.

229. ElInati E. et al. DNA damage response protein TOPBP1 regulates X chromosome silencing in the mammalian germ line // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2017. Vol. 114, № 47. P. 12536-12541.

230. Turner J.M.A. Meiotic Silencing in Mammals // http://dx.doi.org/10.1146/annu9rev-genet-112414-055145. Annual Reviews , 2015. Vol. 49. P. 395-412.

231. Yamaji M. et al. Functional reconstruction of NANOS3 expression in the germ cell lineage by a novel transgenic reporter reveals distinct subcellular localizations of NANOS3 // Reproduction. 2010. Vol. 139, № 2. P. 381-393.

232. Gribouval L. et al. The nanos1 gene was duplicated in early Vertebrates and the two paralogs show different gonadal expression profiles in a shark // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 1-14.

233. Deshpande G. et al. Novel functions of nanos in downregulating mitosis and transcription during the development of the Drosophila germline // Cell. 1999. Vol. 99, № 3. P. 271-281.

234. Kuliev A., Verlinsky Y. Meiotic and mitotic nondisjunction: Lessons from preimplantation genetic diagnosis // Human Reproduction Update. 2004.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

А Б

Дополнительный Рисунок 1. Характеристика чЭСК человека на наличие маркеров плюрипотентности. (А) Иммунофлуоресцентное окрашивание маркеров плюрипотентности ОСТ4, SOX2, SOX17, DAZL, STELLA, NANOG, SSEA4, TRA1-60 и TRA1-81 чЭСК. Ядра окрашивали DAPI (синий). Масштаб 50 мкм. (Б) Иммунофлуоресцентное окрашивание на ОСТ4, SOX2, РАХ6, AFP, NESTIN (зеленый) и DESMIN (красный) многолинейной дифференцировки посредством спонтанной дифференцировки структур ЭТ, полученных из чЭСК. Ядра окрашивали DAPI (синий). Масштаб 10 мкм.

Дополнительный Рисунок 2. 20-дневные РА-индуцированные ЭТ-ППК-подобные клетки. Иммунофлуоресцентное окрашивание 20-дневных РА, индуцированных ЭТ-ППК-подобных клеток линии чЭСК для 8СРЗ (1,2,3,4) и отрицательного контроля ЭТ, культивируемого в отсутствии индукторов на базальной среде (5). Масштаб 10 мкм.

(А)

Дополнительный Рисунок 3. 20-дневные РА-индуцированные ЭТ-ППК-подобные клетки линии чИПСК. Иммунофлуоресцентное окрашивание 20-дневных РА-индуцированных ЭТ-ППК-подобных клеток линии чИПСК на SCP3 (зеленый). Сигнал SCP3 был локализован в цитоплазме и ядре мейоцито-подобных клеток. Ядра окрашены DAPI (синий). Масштаб 50 мкм. (В) Иммунофлуоресцентное окрашивание ЭТ отрицательного контроля, культивируемых в отсутствие индукторов на SCP3 (зеленый). Ядра окрашены DAPI (синий). Масштаб 50 мкм.

142

Дополнительный Рисунок 4. Валидация первичных и вторичных антител на клетках дермальных фибробластов человека. (A) Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток дермальных фибробластов человека в качестве отрицательного контроля на cKIT, NANOG, DAZL, NANOS3, SOX17, STELLA, STRA8, SCP1 (красный), SOX2, OCT4, VASA, PRDM1, SSEA1 (зеленый) и ядра окрашивали DAPI (синий). Масштаб 100 мкм. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание 20-дневных РA-индуцированных ЭТ-ППК-подобных клеток линии чИПСК на вторичные антитела (1) и отрицательного контроля ЭТ, культивируемых в отсутствие индукторов на базальной среде (2). Масштаб 50 мкм.

DAPI

Дополнительный Рисунок 5. Иммунофлуоресцентная окраска семенника мыши. Иммунофлуоресцентная окраска семенника мыши на DAZL, STELLA, VASA (красный), и PRDM1 (зеленый). Клетки в канальцах окрашиваются на DAZL и VASA. STELLA локализуется в цитоплазме клеток находящихся на периферии у базальной мембраны семенных канальцев. Масштаб 100 мкм.

Сперматозоиды человека

10 (лп

\iXLL

10 рт

ПЛ/.1.

10 рт

Дополнительный Рисунок 6. Иммунофлуорецентная окраска сперматозоидов человека. Сперматозоиды человека окрашены на который локализуется у шейки и в середине головки вокруг ядра. Масштаб 10 мкм.

Дополнительный Рисунок 7. Иммунофлуорецентная окраска сперматозоидов человека. Сперматозоиды человека окрашены на VASA, который локализуется на шейке и в хвосте сперматозоида. Головки стрелок указывают на сигнал VASA. VASA находится в единичных клетках. Сигнал VASA сочетается с аномальной морфологией сперматозоидов. Масштаб 10 мкм.