Клеточная модель болезни Альцгеймера на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток доноров с синдромом Дауна, дифференцированных в нейтральном направлении в 2D и 3D условиях in vitro» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Артюхов Александр Сергеевич

• Артюхов Александр Сергеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Артюхов Александр Сергеевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Подходы к получению ПСК

1.2. Методы получения ИПСК

1.3. Практические подходы к подтверждению плюрипотентного статуса ИПСК

1.4. Молекулярные механизмы индукции плюрипотентности

1.5. Дифференцировка в нейральном направлении

1.6. Нейрогенез во взрослом организме

1.7. Дифференцировка ПСК в нейральном направлении в 2D-условиях

1.8. Получение нейральных 3D органоидов

1.9. Общие сведения о болезни Альцгеймера

1.10. Бета-амилоидная гипотеза возникновения БА

1.11. Роль тау-белка в развитии БА

1.12. Генетические факторы риска возникновения БА

1.13. Общие сведения о синдроме Дауна

1.14. Синдром Дауна и болезнь Альцгеймера

1.15. Существующие клеточные модели синдрома Дауна и болезни Альцгеймера 51 Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реагенты и материалы исследования

2.2. Получение ИПСК

2.3. Дифференцировка ИПСК в нейральном направлении

2.4. Получение нейральных органоидов из ИПСК

2.5. Выделение тотальной РНК

2.6. Обратная транскрипция

2.7. ПЦР в реальном времени

2.8. Определение оптимального набора генов для нормировки результатов ПЦР в реальном времени

2.9. Иммуноферментный анализ

2.10. Окраска антителами

2.11. Определение апоптотирующих клеток методом TUNEL

2.12. Приготовление гистологических срезов органоидов

2.13. Измерение электрофизиологической активности нейронов методом «патч-кламп»

2.14. Вестерн-блот

2.15. Спонтанная дифференцировка ИПСК 74 Глава 3. Результаты

3.1. Получение ИПСК из клеток амниотической жидкости

3.2. Дифференцировка ИПСК в нейральном направлении в 2D условиях

3.3. Определение признаков патологических процессов БА в нейральных клетках

3.4. Определение генов, подходящих для нормировки результатов ПЦР в реальном времени

3.5. Получение нейральных 3D органоидов из ИПСК

3.6. Определение признаков патологических процессов БА в нейральных органоидах 106 Глава 4. Обсуждение результатов 110 Выводы 120 Список литературы

Список сокращений

БА — болезнь Альцгеймера,

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота,

ИПСК — индуцированные плюрипотентные столовые клетки,

кДНК — комплиментарная ДНК,

миРНК — малые интерферирующие РНК,

мРНК — матричная РНК,

НК — нормальный кариотип,

НП — нейральные предшественники,

НСК — нейральные стволовые клетки,

ПСК — плюрипотентные стволовые клетки,

ПЦР — полимеразная цепная реакция,

РНК — рибонуклеиновая кислота,

СД — синдром Дауна,

T21 — трисомия 21-ой хромосомы,

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота,

ЭСК — эмбриональные стволовые клетки,

ЭТ — эмбриоидные тельца,

ACTb — бета-актин,

AFS — стволовые клетки амниотической жидкости,

AMPK - 5' аденозин монофосфат-активируемая протеинкиназа,

APH1 — белок anterior pharynx-defective 1,

APOE — алипопротеин E,

APP — белок-предшественник амилоида, ATCC - American type culture collection,

A^40 — изоформа бета-амилоида, содержащая 40 аминокислотных остатков, A042 — изоформа бета-амилоида, содержащая 42 аминокислотных остатка,

b-catenin — бета-катенин,

B2M — бета-2-микроглобулин,

BACE1 — бета-секретаза первого типа,

BACE2 — бета-секретаза второго типа,

bFGF — основный фактор роста фибробластов,

BMP — костный морфогенетический белок,

c-ABL — протоонкоген ABL,

c-MYC — протоонкогенный белок MYC,

C1ORF43 — открытая рамка считывания 43 первой хромосомы,

CD147 — индуктор внеклеточных матриксных металлопротеаз,

CDK5 — циклин-зависимая киназа 5,

CDX2 — гомеобоксный белок CDX2,

CREB1 — CAMP регулирующий белок типа 1,

CTFa — c-концевой фрагмент APP, образующийся после расщепления APP альфа-секретазой,

CTFb — c-концевой фрагмент APP, образующийся после расщепления APP бета-секретазой,

DAPI — 4,6-диамидино-2-фенилиндол,

DCX — даблкортин,

DLX2 — гомеобоксный белок DLX2,

DMEM — среда Игла модифицированная Дульбекко,

DMEM/F12 — среда Игла модифицированная Дульбекко, смешанная со средой F12 в соотношении 1/1,

DPPA4 — ассоциированный с развитием плюрипотентности белок типа 4, DYRK1A — биспецифическая, регулируемая тирозин-фосфорилированием киназа 1A,

E-RAS — специфичный для ЭСК малый G-белок,

EGF — эпидермальный фактор роста,

ЕМС7 — субъединица 7 белкового комплекса мембраны эндоплазматического ретикулума,

ESG1 — специфичный для ЭСК ген 1,

ETS2 — протоонкоген ETS2,

FGF2 — фактор роста фибробластов второго типа,

FGFR1 — рецептор фактора роста фибробластов,

GAPDH — глицеральдегид трифосфат дегидрогеназа,

GATA4 — GATA-узнающий белок 4,

GATA6 — GATA-узнающий белок 6,

GFAP — глиальный фибриллярный кислый белок,

GPI — глюкоза-6-фосфат изомераза,

GSK3b — киназа бета-3 гликоген синтазы,

Н3К27те3 — гистон-3 лизин-27 триметилирование,

Н3К4те3 — гистон-3 лизин-4 триметилирование,

Н4К20те3 — гистон-4 лизин-20 триметилирование,

НСКЕ — высококонсервативный некодирующий элемент,

HMBS — гидроксиметилбилан синтаза,

HPRT1 — гипоксантин фосфорибозилтрансфераза первого типа,

I-CLiPs — интермембраннорасщепляющие протеазы,

KLF4 — круппел-подобный фактор 4,

let7 — семейство миРНК 1еШа17,

LIF — ингибирующий лейкимию фактор,

LIN28 — РНК-связывающий белок LIN28,

MAP2 - ассоциированный с микротрубочками белок второго типа,

MAPK — митогенактивируемая протеинкиназа,

MAPT — ассоциированный с микротрубочками тау-белок,

MBD1 — белок первого типа, связывающий метил CpG домен,

MMLV — транскриптаза вируса лейкимии мыши,

MUSASHI1 — РНК-связывающий белок MUSASHI1,

NANOG — гомеобоксный белок NANOG,

NCAM — адгезионная молекула нейральных клеток,

NCT — предшественник никастрина,

NEFH — нейрофилламентный тяжелый полипептид,

NES — нестин,

NEUN — нейрональный ядерный антиген,

NSE — нейронспецифическая анолаза,

O4 — маркер олигодендроцитов четвертого типа,

OCT4 — октамер-4 связывающий транскрипционный фактор OCT4,

OLIG2 — маркер олигодендроцитов второго типа,

PAX6 — парный боксовый белок PAX6,

PBS — фосфатносолевой буфер,

PDGF-A — субъединица А тромбоцит-ассоциированного фактора роста,

PSEN1 — пресенелин первого типа,

PSEN2 — пресенелин второго типа,

PSENEN — энхансер пресененлина,

PSMB4 — бета-субъединица протеасомы четвертого типа,

RCAN1 — регулятор кальценеринов первого типа,

REEP5 — рецептор экспрессионно-энхансерных белков пятого типа,

REST — подавляющий транскрипцию фактор RE1,

ROCKi — ингибитор ро-ассоциированной протеинкиназы,

RPL13A — рибосомный белок L13A,

sAPPa — N-концевой фрагмент APP, образующийся после расщепления APP альфа-секретазой,

sAPPb — N-концевой фрагмент APP, образующийся после расщепления APP ,

бета-секретазой,

SDHA — субъединица A сукцинат дегидрогеназного комплекса, SGZ — субгранулярная зона зубчатой извилины гиппокампа,

SNRPD3 — малый ядерный рибонуклеопротеин Sm D3, SOX2 — SRY-бокс 2 белок,

SSEA3 — стадияспецифичный эмбриональный антиген третьего типа, SSEA4 — стадияспецифичный эмбриональный антиген четвертого типа, STAT3 — трансдуктор сигналов и активатор транскрипции третьего типа, SVZ — субвентикулярная зона боковых желудочков,

SYN1 — синапсин, SYP1 — синаптофизин,

TDGF1 — тератокарциномный фактор роста первого типа, TERT — каталитический компонент теломеразы, TGFb — трансформирующий ростовой фактор бета, ТО — тирозин гидроксилаза, TMD — трансмембранный домен,

TMED10 — трансмембранный етр24-содержащий белок,

TRA1 — поверхностный антиген эмбриональной карциномы человека,

TREM2 — рецептор миелоидных клеток второго типа,

ГЦВВ3 — бета-3 тубулин,

TYROBP — тирозин-киназа ассоциированный белок,

иВС — убекветин,

VCP — валозин содержащий белок,

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов,

WNT — сигнальный путь WNT,

YWHAZ — зета-белок, активирующий тирозин-3 и триптофан-5 монооксигеназы.

Введение Общая характеристика работы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клеточная модель болезни Альцгеймера на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток доноров с синдромом Дауна, дифференцированных в нейтральном направлении в 2D и 3D условиях in vitro»»

Актуальность

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой деменции, общее количество больных в мире в настоящий момент превышает 27 млн. человек. Как правило, данное заболевание возникает у людей старше 65 лет [1]. Однако, существуют наследственные формы заболевания, развивающиеся в более раннем возрасте. Самой крупной (более 7 млн. человек) группой риска раннего развития БА являются люди с синдромом Дауна (СД). Известно, что до 80% людей с СД к 50 годам приобретают симптомы, значительно схожие с БА, в том числе образование амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков, аналогичных образованиям, возникающим при БА. Также было отмечено, что накопление бета-амилоида (изоформ А04О и А^42, содержащих 40 и 42 аминокислотных остатка соответственно) у пациентов с СД начинается в раннем возрасте и сопровождается в течение жизни аномально интенсивным образованием амилоидных бляшек в тканях мозга [2,3]. Молекулярные механизмы БА и СД до сих пор полностью не установлены, так как получение образцов тканей мозга человека затруднено. В то же время, систем, позволяющих выявлять БА на ранних этапах развития заболевания в настоящее время не существует. При СД нарушения развития головного мозга возникают еще в течение эмбрионального развития [4]. Для исследования таких нарушений необходимо использовать модельных животных или клеточные модели БА и СД. Создание модельных животных позволяет исследовать заболевание как в течение всей жизни, так и в течение эмбрионального развития. Удается получить образцы тканей, состоящие из полностью дифференцированных, зрелых клеток интересующего типа. Так же удается наблюдать влияние различных физиологических систем организма на развитие заболевания, что невозможно при использовании клеточных моделей.

Одним из способов создания модельных животных для изучения генетически обусловленных заболеваний является экспрессия генов человека (или ортологичных генов), ассоциированных с заболеванием, в организме животного. В случае БА созданы линии мышей, экспрессирующие человеческие гены APP, PSEN1 и PSEN2, несущие мутации, ассоциированные с наследственной формой БА [5]. Однако, по современным данным, в формировании патологии БА участвуют десятки генов, список которых пополняется со временем [6]. Экспрессировать такой набор генов в организме мыши технически сложно. Более того, среди генов, ассоциированных с БА, есть транскрипционные факторы. Однако, способность транскрипционных факторов человека регулировать экспрессию ортологичных генов мыши вызывает сомнения. Таким образом, с помощью такой модели не удастся исследовать сложные сигнальные пути, ассоциированные с БА. В случае СД создание животных моделей затрудняется тем фактом, что гены 21-ой хромосомы человека имеют ортологов на трех разных хромосомах мыши [7]. Так же 21-ая хромосома человека содержит более 300 генов, некоторые из которых влияют на экспрессию генов на других хромосомах, что приводит к «генному дисбалансу» всего генома в клетках людей с СД [8]. Воспроизвести такой сложный процесс в модельном организме в настоящее время невозможно. Для исследования таких сложных процессов разумнее применять клеточные модели заболеваний на основе плюрипотентных стволовых клеток (ПСК). В настоящее время разработано множество протоколов получения из ПСК различных типов клеток, в том числе нейронов коры головного мозга [9-11]. Таким образом, из ПСК людей, страдающих наследственной формой БА или СД можно получить нейроны головного мозга in vitro, которые можно использовать для исследования сложных молекулярных механизмов и сигнальных путей, связанных с БА или СД. Однако, при таком подходе возникает несколько проблем. Во-первых, сложно обеспечить полную дифференцировку и

созревание нейральных клеток in vitro. Во-вторых, мозг человека состоит из большого количества типов клеток, взаимодействующих между собой. Обеспечить подходящее клеточное соседство in vitro, полностью воспроизводящее ситуацию in vivo практически невозможно. Возможным способом преодоления этих недостатков является получение из ПСК самоорганизованных трехмерных органоидов. В настоящее время разработаны протоколы, позволяющие получить in vitro органоиды, воспроизводящие в том числе некоторые особенности цитоструктуры головного мозга человека [12]. Такие органоиды могут быть полезны для изучения молекулярных механизмов БА и СД.

Долгое время основным источником ПСК являлись эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) [13]. Получение ЭСК связано с этическими трудностями, которые сильно затрудняют возможность их клинического применения. В 2006 г. в работах Такахаси и Яманака [14,15] удалось показать, что эктопическая экспрессия генов всего четырех транскрипционных факторов OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC достаточна для репрограммирования фибробластов человека и мыши до плюрипотентного состояния. Полученные таким образом клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК). Оказалось, что ИПСК сходны с ЭСК по многим характеристикам: профили экспрессии генов, морфология, теломеразная активность, характер метилирования ДНК и модификация гистонов. Так же ИПСК способны генерировать клетки тканей трех зародышевых листков in vitro, сохраняя при этом нормальный кариотип (НК), а также формировать зрелые тератомы при инъекции иммунодефицитным мышам [16,17]. В настоящее время существуют три обширные области исследований, связанные с использованием ИПСК: фундаментальные исследования клеточной пластичности, генетические механизмы, лежащие в основе раннего развития

организма и неоплазий; технологии репрограммирования соматических клеток с целью проведения заместительной клеточной терапии [18], а также создание клеточных тест-систем для изучения молекулярных механизмов наследственных заболеваний и скрининга лекарственных препаратов.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было создание клеточной модели, воспроизводящей патологические процессы при БА и СД in vitro. В рамках выдвинутой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить ИПСК от доноров с СД.

2. Дифференцировать полученные клетки в нейральном направлении в 2D и 3D условиях.

3. Выявить признаки патологических процессов БА в полученных клетках по сравнению с клетками здоровых доноров. В качестве таких признаков рассматривался уровень апоптоза, качественная и количественная разница в накоплении и секреции различных изоформ бета-амилоида и отличие в профиле экспрессии генов, ассоциированных с БА и СД.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе была разработана 2D и 3D клеточная модель на основе ИПСК от доноров с СД. Впервые были получены и изучены самоорганизованные трехмерные нейральные органоиды из ИПСК доноров с СД. Показано, что процессинг белка-предшественника амилоида (APP) качественно и количественно отличается в органоидах с СД и здоровых доноров.

Установлено, что доля апоптотирующих клеток в органоидах с СД повышена. Обнаружены отличия в профиле экспрессии генов,

ассоциированных с БА и СД.

Практическая значимость работы заключается в усовершенствовании методов получения нейрональных культур и самоорганизованных нейральных органоидов из ИПСК доноров с СД.

Данные органоиды могут быть использованы для изучения молекулярно-генетических особенностей при БА, а также в качестве тест-системы для скрининга потенциальных лекарственных препаратов направленных на лечение данного заболевания. Определены гены домашнего хозяйства, позволяющие корректно (ошибка нормировки около 15%) интерпретировать результаты ПЦР в реальном времени при сравнении профилей экспрессии разных типов клеток (ИПСК, нейральные предшественники и зрелые нейрональные культуры).

Положения, выносимые на защиту

1. Определен набор генов «домашнего хозяйства», позволяющий корректно сравнивать результаты ПЦР в реальном времени при одновременном анализе уровня экспрессии генов разных типов клеток (индуцированных плюрипотентных стволовых клеткок, нейральных предшественников и зрелых нейронов).

2. Полученные из ИПСК доноров с синдромом Дауна (трисомия 21-й хромосомы) нейроны в 2D-условиях моделируют ранние этапы болезни Альцгеймера, а именно - гиперсекретируют и накапливают в виде гранул различные изоформы бета-амилоида, включая патологическую А042.

3. Полученные из ИПСК доноров с синдромом Дауна 3D-нейральные органоиды, воспроизводят ряд особенностей мозга людей с данной патологией, такие как: гиперсекреция различных изоформ бета-амилоида, повышенная доля глиальных клеток, повышенный уровень апоптоза, сниженная экспрессия ряда генов, отвечающих за корректную нейрональную дифференцировку и нейральную пластичность,

повышенная экспрессия ряда генов, отвечающих за гиперфосфорилирование белка MAPT. 4. Полученные 2D и 3D клеточные модели могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов ранних этапов болезни Альцгеймера и генного дисбаланса при синдроме Дауна, а также скрининга лекарственных препаратов против болезни Альцгеймера.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Дифференцированные в нейральном направлении ИПСК были получены с участием Дашинимаева Э.Б. (ИБР РАН). Нейральные органоиды были получены с участием Абдыева В.К. (МГУ). Исследование нейрофизиологической активности полученных нейральных клеток было проведено совместно с Большаковым А. П. (ИВНД РАН). Кариотипирование исследуемых клеточных культур проводилось в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова» минестерства здравоохранения Российской Федерации на коммерческой основе.

Апробация результатов работы

Список работ по теме диссертации, опубликованных в рецензируемых научных журналах:

1. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Артюхов А.С., Мягкова Е.П., Воротеляк Е.А., Егоров Е.Е., Вишнякова Х.С., Кравченко Ю.Е., Чумаков С.П., Терских В.В., Васильев А.В. Репрограммирование клеток дермальной папиллы человека до плюрипотентного состояния // Acta Naturae, Т. 6, №

1 (20), 2014, С. 48-57. https://www.ncbi.nlm .nih. gov/pubmed/24772326

2. Dashinimaev E.B., Artyuhov A.S., Bolshakov A.P., Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V. Neurons Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Patients with Down Syndrome Reproduce Early Stages of Alzheimer's Disease Type Pathology in vitro // J Alzheimers Dis., Т. 56(2), 2017 Dec 3, Р. 835-847. doi: 10.3233/JAD-160945. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28059787

3. Artyukhov A.S., Dashinimaev E.B., Tsvetkov V.O., Bolshakov A.P., Konovalova E.V., Kolbaev S.N., Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V. New genes for accurate normalization of qRT-PCR results in study of iPS and iPS-derived cells // Gene. Т. 626, 2017 Aug 30, Р. 234-240. doi: 10.1016/j.gene.2017.05.045

https://www.ncbi.nlm . nih. gov/pubmed/28546127

Тезисы докладов:

1. Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б., Артюхов А.С., Васильев А.В. Репрограммироваие клеток дермальной папиллы человека до плюрипотентного состояния // Онтогенез, Т. 44, № 4, 2013, С. 231-232.

2. Артюхов А.С., Мучкаева И.А., Дашинимаев Э.Б. Дифференцированные в нейральном направлении ИПС клетки донора с Синдромом Дауна как модель болезни Альцгеймера in vitro // Труды 55-ой научной конференции МФТИ, 2013, С. 97.

3. Артюхов А.С., Дашинимаев Э.Б., Цветков В.О., Воротеляк Е.А. Проведение точной нормировки результатов ПЦР в реальном времени при работе с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками и полученными из них дифференцированными в нейральном направлении клеточными линиями // Медицинский академический журнал. Том16, №3,

2016, С. 530-533.

4. Артюхов А.С., Дашинимаев Э.Б., Воротеляк Е.А., Васильев А.В. Накопление бета-амилоида в нейральных клетках доноров с синдромом дауна как клеточная модель болезни Альцгеймера in vitro. Сборник тезисов V молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии института цитологии РАН. 2016, С. 3.

5. Artyuhov A.S., Dashinimaev E.B., Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V. IPSC-derived neurons from patients with Down syndrome as in vitro cell model of Alzheimer's disease // Book of abstracts Biomembranes 2016: Mechanisms of aging and age-related diseases, international conference. 2016, P 75.

6. Артюхов А.С., Дашинимаев Э.Б., Воротеляк Е.А., Васильев А.В. Создание клеточной модели болезни Альцгеймера in vitro на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от доноров с синдромом Дауна // XVII Конференция-школа с международным участием «Актуальные проблемы биологии развития». 2016, С. 8-9.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах, содержит 24 рисунка и 4 таблицы.

Благодарности

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации ИБР РАН. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Дашинимаеву Э. Б. за поддержку и деятельное участие во всех этапах работы. Автор искренне благодарит Абдыева В. К. за помощь в получении трехмерных

нейральных органоидов, Большакова А. П. за помощь в проведении нейрофизиологических тестов получаемых из ИПСК нейронов. Автор выражает благодарность руководителю лаборатории проблем клеточной пролиферации Воротеляк Е. А. и всему коллективу лаборатории за дружеское участие и практическую помощь в работе.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Подходы к получению ПСК

Плюрипотентные стволовые клетки — клетки, способные к дифференцировке во все линии соматических клеток, присутствующих во взрослом организме, являются заманчивым объектом для исследования, так как они предоставляют возможность изучать механизмы клеточной дифференцировки, клеточной пластичности, а также являются потенциальным источником клеточного материала для регенеративной медицины. К настоящему времени разработано несколько подходов к получению ПСК — это выделение ПСК из эмбрионов млекопитающих на ранней стадии эмбрионального развития [19,20], получение ПСК при переносе ядра соматической клетки в энуклеированную яйцеклетку [21], слияние эмбриональной стволовой клетки с соматической клеткой [22,23], а также индукция плюрипотентных клеток из дифференцированных соматических клеток [14,15].

До появления обозначенных подходов получения ПСК, для изучения механизмов клеточной дифференцировки использовали клетки тератокарцином [24,25]. Несмотря на злокачественную природу тератокарцином, данные клетки способны дифференцироваться в доброкачественные клетки трех зародышевых листков [26]. В 1964 Кленсмит и Пирс показали, что тератокарциномы мышей обладают способностью к дифференцировке в клетки других типов, а также способны образовывать эмбриоидные тельца (ЭТ) [27]. Первая плюрипотентная линия тератокарциномы человека была получена в 1984 году [25].

Однако, уже в 1981 году были получены первые линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мыши. Исследователи Эванс и Кауфман, а также Гэил Мартин, независимо, используя различные методологические подходы, выделили ЭСК мыши из бластоцист. Полученные клетки были способны образовывать ЭТ в условиях суспензионного культивирования, а

также формировать тератомы при введении в организм мыши [13,26]. В 1992 году в работах Матсуи с соавт. и Резника с соавт. было показано, что линии плюрипотентых стволовых клеток могут быть получены из морулы мыши. Полученные клетки так же были способны к формированию ЭТ и образованию тератом [27,28].

В 1998 году группа Джеймса Томсона выделила несколько линий эмбриональных стволовых клеток человека из человеческих эмбрионов на стадии бластоцист. Плюрипотентный статус полученных клеток был подтвержден экспрессией маркеров плюрипотентных клеток, способностью оставаться в недифференцированном состоянии при продолжительном культивировании in vitro, а также способностью дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков [20]. Стоит отметить, что использование эмбрионального материала человека для получения ЭСК ограничено из-за этических трудностей (разрушение эмбриона человека), поэтому научное сообщество продолжает поиск других источников ПСК.

Другим способом получения ПСК является перенос ядра соматической клетки в энуклеированную яйцеклетку. В 1962 году Гурдон с соавт. показали, что из энуклеированной яйцеклетки лягушки, в которую было перенесено ядро соматической клетки лягушки, может быть получен жизнеспособный организм [29]. В 1997 году Ян Вилмут с соавт. успешно провел аналогичный эксперимент на клеточном материале млекопитающих. Преимуществом данного метода является возможность получения пациент-специфических плюрипотентных клеток. К недостаткам относят низкую эффективность и методологическую сложность [30]. Еще одним способом получения пациент-специфических ПСК является слияние соматической и эмбриональной стволовой клетки. Полученные результаты позволяют заключить, что в ядре соматической клетки содержится весь необходимый генетический материал для получения плюрипотентной клетки, а в цитоплазме яйцеклетки или ЭСК содержится

достаточный набор факторов для репрограммирования соматического ядра до плюрипотентного состояния [31]. Определение такого набора фактором позволило бы свободно получать плюрипотентные клетки из соматических клеток.

В начале двухтысячных годов скопилось достаточно экспериментальных данных, указывающих на важность генов OCT4, SOX2, NANOG для поддержания плюрипотентного статуса ЭСК [32-34]. Так же было установлено, что гены STAT3, E-RAS, С-MYC и B-CATENIN регулируют пролиферацию плюрипотентных клеток. В то же время был определен набор генов, экспрессирующихся только в ЭСК [35-40]. Опираясь на эти данные Яманака с соавт. определил минимальный набор генетических факторов, необходимых для репрограммирования соматической клетки до плюрипотентного состояния. Оказалось, что экзогенной экспрессии всего четырех генов OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4 достаточно для получения ПСК из фибробластов человека или мыши. Такие ПСК получили название индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а процесс их получения индукцией плюрипотентности или репрограммированием до плюрипотентного состояния [14,15]. Стоит отметить, однако, что эффективность данного процесса была достаточно низкой и составила 0,02%. Данное обстоятельство подтолкнуло исследователей по всему миру к поиску более продуктивных путей получения ПСК из соматических клеток, или усовершенствованию подхода, предложенного Яманакой, для повышения его эффективности. В своей работе Яманака использовал ретровирусные векторы, экспрессирующие OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4. Ретровирусные векторы экспрессируют гены путем их встраивания в геном инфицированной клетки, что является недостатком при потенциальном использовании ПСК для заместительной клеточной терапии. Также есть свидетельства о том, что использование векторов, встраивающихся в геном, приводит к повышению количества геномных нарушений, таких как

хромосомные аберрации, изменение копийности генов и однонуклеотидных полиморфизмов в полученных ИПСК [41-43]. Таким образом, «идеальный» метод получения ПСК из соматических клеток должен обеспечивать высокую эффективность получения ПСК без изменения генома репрограммируемых клеток.

Так же стоит отметить, что процесс клеточного репрограммирования является сложным и многоступенчатым. В ходе репрограммирования происходит реорганизация хроматина клеточного ядра, восстанавливается экспрессия транскрипционных факторов, обеспечивающих плюрипотентный статус репрограммируемых клеток, в то время как экспрессия генов, характерных для соматических клеток, прекращается [44].

Таким образом, к настоящему времени научное сообщество разработало широкий набор методов получения ПСК. Однако, наиболее удобным с технической и этической точек зрения является индукция плюрипотентных клеток. Кроме того, ИПСК позволяют получать донор-специфические ПСК для нужд регенеративной медицины.

1.2. Методы получения ИПСК

Все методы получения ИПСК можно разделить на две группы. К первой относятся методы, использующие векторы, встраивающиеся в геном. Ко второй группе относятся методы, не предполагающие манипуляций с геномом репрограммируемых клеток.

К первой группе относятся методы на основе ретро- и лентивирусных векторов, а также векторы на основе транспозонов. Вирусные векторы позволяют обеспечить эффективную доставку генетического материала в репрограммируемые клетки, однако, эффективность процесса репрограммирования остается невысокой, около 0,01% [45]. С использованием векторов на основе транспозонов удалось получить ИПСК с сопоставимой

эффективностью, однако, использование транспозонов позволяет удалить экзогенный материал из ПСК после репрограммирования [46,47]. Тем не менее, использование векторов, встраивающих генетический материал в геном репрограммируемых клеток повышает риск трансформации ПСК в злокачественные раковые клетки, что осложняет их применение в регенеративной медицине [48]. В связи с этим научное сообщество разработало методы получения ПСК, не требующие «вмешательства» в геном репрограммируемых клеток.

Процесс репрограммирования требует продолжительной экспрессии в клетке репрограммирующих факторов. Добиться этого без встраивания в геном экзогенных векторов можно несколькими способами. Можно использовать мРНК репрограммирующих факторов (эффективность получения ПСК 1,4% [49]), также можно трансфицировать репрограммируемые клетки непосредственно белками этих факторов (эффективность 0,02% [50]). Подход, основанный на использовании для репрограммирования белков примечателен тем, что позволяет полностью избежать введения нуклеиновых кислот в репрограммируемые клетки. Однако, в силу быстрой деградации мРНК и белков данные подходы могут потребовать повторных манипуляций в ходе репрограммирования. Использование 5'-гуаниного кэпа и модифицированных нуклеотидов позволяет значительно продлить время жизни синтетической РНК в репрограммируемых клетках и свести на нет внутриклеточную реакцию на такую РНК [49]. Тем не менее, технологически проще использовать плазмидные или эписомальные векторы для доставки репрограммирующих факторов (эффективность обоих методов ~0,002% [48,51]). Стоит отметить, что отказ от вирусных векторов приводит к снижению доли трансфецированных клеток, таким образом снижая эффективность всего процесса репрограммирования. В связи с этим для индукции плюрипотентных клеток было предложено использовать вирусные векторы, не встраивающие

генетический материал в геном заражаемой клетки. Удалось успешно получить ПСК из соматических клеток с помощью векторов на основе аденовирусов и вируса Сендай (эффективность 0,0005% и 0,02% соответственно [52,53]).

Таким образом, разработано довольно много разных методов получения ИПСК, основанных на экзогенной экспрессии транскрипционных факторов плюрипотентности. Возможность получить ИПСК не затрагивая геном репрограммируемых клеток так же важна для регенеративной медицины.

1.3. Практические подходы к подтверждению плюрипотентного статуса ИПСК

Ступенчатость прохождения процесса репрограммирования до плюрипотентного состояния и обилие методов получения ПСК побуждают к выработке критериев и методических тестов, подтверждающих плюрипотентный статус полученных клеток. Сейчас общепринятыми являются следующие подходы к характеризации ПСК: анализ экспрессии маркеров ПСК, окраска щелочной фосфотазой, получение тератом и ЭТ на основе ПСК, получение химерных зародышей. Все эти тесты направленны на подтверждение таких свойств ПСК, как схожесть по профилю экспрессируемых генов с ЭСК, способность к поддержанию плюрипотентного статуса, способность к дифференцировке в соматические клетки трех зародышевых листков [54].

Пожалуй, наиболее полной и технически сложной является процедура получения химерных зародышей. В ходе этой процедуры тестируемые клетки вводятся в зародыш на раннем этапе эмбрионального развития. Способность исследуемых клеток успешно включиться в процесс эмбрионального развития полностью подтверждает их плюрипотентный статус, так как успешное эмбриональное развитие предполагает пролиферацию плюрипотентных клеток с последующей дифференцировкой в клетки всех трех зародышевых листков. Однако, в виду технической сложности и дороговизны данный метод не

подходит для рутинных анализов ПСК [55]. Также, по очевидными причинам, данный метод не используется в случае человеческих ПСК.

Несколько проще провести проверку на способность исследуемых клеток к формированию ЭТ и тератом. ЭТ — это трехмерные клеточные агрегаты, получаемые в ходе суспензионного культивирования ПСК. Формирование ЭТ приводит к последующей спонтанной дифференцировке ПСК в клетки трех зародышевых листков. Тератомой называют опухолевое новообразование, состоящее из клеток различных тканей. Для получения тератом исследуемые клетки обычно вводят в организм иммунодефицитных мышей. Последующая пролиферация и спонтанная дифференцировка под действием микроокружения приводит к образованию тератом, содержащих клетки трех зародышевых листков [31].

Более простым методом подтверждения плюрипотентного статуса является сравнение профилей экспрессии уже охарактеризованной линии ПСК и исследуемых клеток. Наиболее распространенными являются маркеры ОСТ4, SOX2, NANOG (транскрипционные факторы, связанные с плюрипотентностью), ТКЛ1-60, ТИА1-81, SSEA3, SSEA4 (поверхностные антигены) [54]. С помощью ПЦР в реальном времени, иммунохимии или проточной цитометрии производят сравнительный анализ исследуемых клеток и охарактеризованной линии ПСК, что позволяет сделать вывод о близости свойств ПСК и исследуемых клеток. Стоит отметить, что ОСТ4 и SOX2 используются как репрограммирующие факторы, поэтому экспрессия этих генов может быть, как экзогенной, так и эндогенной. Бисульфитное секвенирование промоторных областей ОСТ4 и SOX2 позволяет определить, произошла ли реактивация эндогенной экспрессии этих генов в репрограммируемой клетке. Еще одним важным маркером ПСК является ген TERT, регулирующий теломеразную активность, так как удлинение теломер соматических клеток является важным этапом в процессе клеточного репрограммирования [54]. Другим маркером ПСК является щелочная

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Артюхов Александр Сергеевич, 2019 год

Список литературы

1. Brookmeyer R., Gray S., Kawas C. Projections of Alzheimer's disease in the United States and the public health impact of delaying disease onset // Am. J. Public Heal. 1998. Vol. 88, № 9. P. 1337-1342.

2. Coyle J.T., Oster-Granite M.L., Gearhart J.D. The neurobiologic consequences of Down syndrome. // Brain Res. Bull. 1986. Vol. 16, № 6. P. 773-787.

3. Rovelet-Lecrux A. et al. APP locus duplication causes autosomal dominant early-onset Alzheimer disease with cerebral amyloid angiopathy. // Nat. Genet. 2006. Vol. 38, № 1. P. 24-26.

4. Halevy T. et al. Molecular Characterization of Down Syndrome Embryonic Stem Cells Reveals a Role for RUNX1 in Neural Differentiation. // Stem cell reports. 2016. Vol. 7, № 4. P. 777-786.

5. Saraceno C. et al. Modeling Alzheimer's disease: from past to future. // Front. Pharmacol. 2013. Vol. 4, №1. P. 77.

6. Scheltens P. et al. Alzheimer's disease. // Lancet (London, England). 2016. Vol. 388, № 10043. P. 505-517.

7. Gupta M., Dhanasekaran A.R., Gardiner K.J. Mouse models of Down syndrome: gene content and consequences. // Mamm. Genome. 2016. Vol. 27, № 11-12. P. 538-555.

8. Antonarakis S.E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance // Nature Reviews Genetics. 2017. Vol. 18, № 3. P. 147-163.

9. Alsanie W.F., Niclis J.C., Petratos S. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocytes: protocols and perspectives. // Stem Cells Dev. 2013. Vol. 22, № 18. P. 2459-2476.

10. Chipman P.H., Toma J.S., Rafuse V.F. Generation of motor neurons from pluripotent stem cells. // Prog. Brain Res. 2012. Vol. 201, №1. P. 313-331.

11. Anderson S., Vanderhaeghen P. Cortical neurogenesis from pluripotent stem cells: Complexity emerging from simplicity // Curr. Opin. Neurobiol. Elsevier Ltd, 2014. Vol. 27, №1. P. 151-157.

12. Lee C.-T. et al. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. // J. Biomed. Sci. 2017. Vol. 24, № 1. P. 59.

13. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981. Vol. 292, № 5819. P. 154-156.

14. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. // Cell. 2006. Vol. 126, № 4. P. 663-676.

15. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. // Cell. 2007. Vol. 131, № 5. P. 861-872.

16. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. // Nature. 2007. Vol. 448, № 7151. P. 313-317.

17. Wernig M. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. // Nature. 2007. Vol. 448, № 7151. P. 318-324.

18. Ho R., Chronis C., Plath K. Mechanistic insights into reprogramming to induced pluripotency. // J. Cell. Physiol. 2011. Vol. 226, № 4. P. 868-878.

19. Thomson J.A. et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. Vol. 92, № 17. P. 7844-7848.

20. Thomson J.A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts // Science. 1998. Vol. 282, № 5391. P. 1145-1147.

21. Campbell K.H.S. et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line // Nature. 1996. Vol. 380, № 6569. P. 64-66.

22. Cowan C.A. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. // Science. 2005. Vol. 309, № 5739. P. 13691373.

23. Tada M. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. // Curr. Biol. 2001. Vol. 11, № 19. P. 1553-1558.

24. Andrews P.W. Human teratocarcinomas. // Biochim. Biophys. Acta. 1988. Vol. 948, № 1. P. 17-36.

25. Andrews P.W. et al. Pluripotent embryonal carcinoma clones derived from the

human teratocarcinoma cell line Tera-2. Differentiation in vivo and in vitro. // Lab. Invest. 1984. Vol. 50, № 2. P. 147-162.

26. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1981. Vol. 78, № 12. P. 7634-7638.

27. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B.L. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. // Cell. 1992. Vol. 70, № 5. P. 841-847.

28. Resnick J.L. et al. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture // Nature. 1992. Vol. 359, № 6395. P. 550-551.

29. Gurdon J.B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. // J. Embryol. Exp. Morphol. 1962. Vol. 10, № 4. P. 622-640.

30. Wilmut I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. // Nature. 1997. Vol. 385, № 6619. P. 810-813.

31. Chhabra A., Chen I.-P., Batra D. Human Dendritic Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cell Lines Are Not Immunogenic. // J. Immunol. 2017. Vol. 198, № 5. P. 1875-1886.

32. Avilion A.A. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. // Genes Dev. 2003. Vol. 17, № 1. P. 126-140.

33. Nichols J. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. // Cell. 1998. Vol. 95, № 3. P. 379-391.

34. Mitsui K. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. // Cell. 2003. Vol. 113, № 5. P. 631-642.

35. Maruyama M. et al. Differential roles for Sox15 and Sox2 in transcriptional control in mouse embryonic stem cells. // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280, № 26. P. 24371-24379.

36. Niwa H. et al. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. // Genes Dev. 1998. Vol. 12, № 13. P. 2048-2060.

37. Li Y. et al. Murine embryonic stem cell differentiation is promoted by SOCS-3 and inhibited by the zinc finger transcription factor Klf4. // Blood. 2005. Vol. 105, № 2. P. 635-637.

38. Kielman M.F. et al. Apc modulates embryonic stem-cell differentiation by controlling the dosage of beta-catenin signaling. // Nat. Genet. 2002. Vol. 32, № 4. P. 594-605.

39. Cartwright P. et al. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism. // Development. 2005. Vol. 132, № 5. P. 885896.

40. Takahashi K., Mitsui K., Yamanaka S. Role of ERas in promoting tumour-like properties in mouse embryonic stem cells. // Nature. 2003. Vol. 423, № 6939. P. 541-545.

41. Martins-Taylor K. et al. Recurrent copy number variations in human induced pluripotent stem cells. // Nat. Biotechnol. 2011. Vol. 29, № 6. P. 488-491.

42. Laurent L.C. et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. // Cell Stem Cell. 2011. Vol. 8, № 1. P. 106-118.

43. Hussein S.M. et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. // Nature. 2011. Vol. 471, № 7336. P. 58-62.

44. Turinetto V., Orlando L., Giachino C. Induced Pluripotent Stem Cells: Advances in the Quest for Genetic Stability during Reprogramming Process. // Int. J. Mol. Sci. 2017. Vol. 18, № 9. P. 10-28.

45. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. // Sci. (New York, NY). 2007. Vol. 318, № 5858. P. 1917-1920.

46. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Nature. 2009. Vol. 458, № 7239. P. 766-770.

47. Kaji K. et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. // Nature. 2009. Vol. 458, № 7239. P. 771-775.

48. Okita, Masato Nakagawa, Hong Hyenjong, Tomoko Ichisaka S.Y. Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors // Science. 2008. Vol. 322, № 1998. P. 949-953.

49. Warren L. et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA // Cell Stem Cell. 2010. Vol. 7, № 5. P. 618-630.

50. Zhou H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. // Cell Stem Cell. 2009. Vol. 4, № 5. P. 381-384.

51. Jia F. et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. // Nat. Methods. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 7, № 3. P. 197-199.

52. Stadtfeld M. et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. // Science. 2008. Vol. 322, № 5903. P. 945-949.

53. Ye L. et al. Blood cell-derived induced pluripotent stem cells free of reprogramming factors generated by Sendai viral vectors. // Stem Cells Transl. Med. 2013. Vol. 2, № 8. P. 558-566.

54. Chhabra A. Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Lines and Mechanism of Pluripotency: Historical Perspective and Recent Advances // Stem Cell Reviews and Reports. 2017. Vol. 1, № 1. P. 1-17.

55. Bradley A. et al. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. // Nature. 1984. Vol. 309, № 5965. P. 255-256.

56. Loh Y.H. et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells // Nat. Genet. 2006. Vol. 38, № 4. P. 431-440.

57. Niwa H. How is pluripotency determined and maintained? // Development. 2007. Vol. 134, № 4. P. 635-646.

58. Rosenfeld N., Elowitz M.B., Alon U. Negative autoregulation speeds the response times of transcription networks // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 323, № 5. P. 785-793.

59. Boyer L.A. et al. Core Transcriptional Regulatory Circuitry in Human Embryonic Stem Cells // Cell. 2005. Vol. 122, № 1. P. 947-956.

60. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. // Nat. Genet. 2000. Vol. 24, № 4. P. 372-376.

61. Hyslop L. et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. // Stem Cells. 2005. Vol. 23, № 8. P. 1035-1043.

62. Kim J. et al. An Extended Transcriptional Network for Pluripotency of Embryonic Stem Cells // Cell. 2008. Vol. 132, № 6. P. 1049-1061.

63. Huangfu D. et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. // Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26, № 7. P. 795-797.

64. Dang D.T., Pevsner J., Yang V.W. The biology of the mammalian Krüppel-like family of transcription factors. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. Vol. 32, № 11-12. P. 1103-1121.

65. Zhang P. et al. Kruppel-like factor 4 (Klf4) prevents embryonic stem (ES) cell differentiation by regulating Nanog gene expression. // J. Biol. Chem. 2010. Vol. 285, № 12. P. 9180-9189.

66. Dang C. V et al. The c-Myc target gene network. // Semin. Cancer Biol. 2006. Vol. 16, № 4. P. 253-264.

67. Chang T.-C. et al. Widespread microRNA repression by Myc contributes to tumorigenesis. // Nat. Genet. 2008. Vol. 40, № 1. P. 43-50.

68. Knoepfler P.S. et al. Myc influences global chromatin structure. // EMBO J. 2006. Vol. 25, № 12. P. 2723-2734.

69. Meshorer E. et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. // Dev. Cell. 2006. Vol. 10, № 1. P. 105-116.

70. Bernstein B.E. et al. A Bivalent Chromatin Structure Marks Key Developmental Genes in Embryonic Stem Cells // Cell. 2006. Vol. 125, № 2. P. 315-326.

71. Azuara V. et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines // Nat. Cell Biol. 2006. Vol. 8, № 5. P. 532-538.

72. Shi Y. et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. // Cell Stem Cell. 2008. Vol. 2, № 6. P. 525-528.

73. Shi Y. et al. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds. // Cell Stem

Cell. 2008. Vol. 3, № 5. P. 568-574.

74. Vaskova E.A. et al. "Epigenetic memory" phenomenon in induced pluripotent stem cells. // Acta Naturae. 2013. Vol. 5, № 4. P. 15-21.

75. Kim K. et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. // Nature. 2010. Vol. 467, № 7313. P. 285-290.

76. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. // Cell Cycle. 2010. Vol. 9, № 5. P. 937-946.

77. Philonenko E.S. et al. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Mesodermal and Ectodermal Derivatives Is Independent of the Type of Isogenic Reprogrammed Somatic Cells. // Acta Naturae. 2017. Vol. 9, № 1. P. 68-74.

78. Yamashiro C. et al. Generation of human oogonia from induced pluripotent stem cells in vitro. // Science. 2018. Vol. 362, № 6412. P. 356-360.

79. Zhao C., Deng W., Gage F.H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis // Cell. 2008. Vol. 132, № 4. P. 645-660.

80. Zhang S.C. et al. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. // Nat. Biotechnol. 2001. Vol. 19, № 12. P. 1129-1133.

81. Yan Y. et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. // Stem Cells. 2005. Vol. 23, № 6. P. 781-790.

82. Chambers S.M. et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. // Nat. Biotechnol. 2009. Vol. 27, № 3. P. 275-280.

83. Kindberg A.A. et al. An in vitro model of human neocortical development using pluripotent stem cells: cocaine-induced cytoarchitectural alterations. // Dis. Model. Mech. 2014. Vol. 7, № 12. P. 1397-1405.

84. Lee C.-T., Bendriem R.M., Freed W.J. A new technique for modeling neuronal connectivity using human pluripotent stem cells. // Restor. Neurol. Neurosci. 2015. Vol. 33, № 3. P. 347-356.

85. Choi S.H. et al. A three-dimensional human neural cell culture model of

Alzheimer's disease. // Nature. 2014. Vol. 515, № 7526. P. 274-278.

86. Hogberg H.T. et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. // Stem Cell Res. Ther. 2013. Vol. 4, № 1. P. 44-56.

87. Watanabe K. et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. // Nat. Neurosci. 2005. Vol. 8, № 3. P. 288-296.

88. Lancaster M.A. et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. // Nature. 2013. Vol. 501, № 7467. P. 373-379.

89. Suh H. et al. In Vivo Fate Analysis Reveals the Multipotent and Self-Renewal Capacities of Sox2+ Neural Stem Cells in the Adult Hippocampus // Cell Stem Cell. 2007. Vol. 1, № 5. P. 515-528.

90. Garcia A.D.R. et al. GFAP-expressing progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain // Nat. Neurosci. 2004. Vol. 7, № 11. P. 1233-1241.

91. Fukuda S. et al. Two distinct subpopulations of nestin-positive cells in adult mouse dentate gyrus. // J. Neurosci. 2003. Vol. 23, № 28. P. 9357-9366.

92. Doetsch F. et al. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. // Cell. 1999. Vol. 97, № 6. P. 703-716.

93. Merkle F.T., Mirzadeh Z., Alvarez-Buylla A. Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain. // Science. 2007. Vol. 317, № 5836. P. 381-384.

94. Song H., Stevens C.F., Gage F.H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells // Nature. 2002. Vol. 417, № 6884. P. 39-44.

95. Lie D.C. et al. Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis // Nature. 2005. Vol. 437, № 7063. P. 1370-1375.

96. Lim D.A. et al. Noggin antagonizes BMP signaling to create a niche for adult neurogenesis // Neuron. 2000. Vol. 28, № 3. P. 713-726.

97. Höglinger G.U. et al. Dopamine depletion impairs precursor cell proliferation in Parkinson disease // Nat. Neurosci. 2004. Vol. 7, № 7. P. 726-735.

98. Cao L. et al. VEGF links hippocampal activity with neurogenesis, learning and memory // Nat. Genet. 2004. Vol. 36, № 8. P. 827-835.

99. Doetsch F. et al. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells // Neuron. 2002. Vol. 36, № 6. P. 10211034.

100. Jin K. et al. Neurogenesis and aging: FGF-2 and HB-EGF restore neurogenesis in hippocampus and subventricular zone of aged mice // Aging Cell. 2003. Vol. 2, № 3. P. 175-183.

101. Kuhn H.G. et al. Epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2 have different effects on neural progenitors in the adult rat brain. // J. Neurosci. 1997. Vol. 17, № 15. P. 5820-5829.

102. Nizzardo M. et al. Human motor neuron generation from embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. // Cell. Mol. Life Sci. 2010. Vol. 67, № 22. P. 3837-3847.

103. Chipman P.H., Toma J.S., Rafuse V.F. Generation of motor neurons from pluripotent stem cells. // Prog. Brain Res. 2012. Vol. 201, № 1. P. 313-331.

104. Kaneko Y. et al. Musashi1: an evolutionally conserved marker for CNS progenitor cells including neural stem cells. // Dev. Neurosci. 2000. Vol. 22, № 1-2. P. 139-153.

105. Lendahl U., Zimmerman L.B., McKay R.D. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. // Cell. 1990. Vol. 60, № 4. P. 585-595.

106. Hu B.-Y. et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency // Proc. Natl. Acad. Sci. 2010. Vol. 107, № 9. P. 4335-4340.

107. Brawner A.T. et al. Generating CNS organoids from human induced pluripotent stem cells for modeling neurological disorders. // Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol. 2017. Vol. 9, № 3. P. 101-111.

108. Kim Y.H. et al. A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease. // Nat. Protoc. 2015. Vol. 10, № 7. P. 985-1006.

109. Pa§ca A.M. et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. // Nat. Methods. 2015. Vol. 12, № 7. P. 671-678.

110. Lui J.H., Hansen D. V, Kriegstein A.R. Development and evolution of the

human neocortex. // Cell. 2011. Vol. 146, № 1. P. 18-36.

111. Qian X. et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. // Cell. 2016. Vol. 165, № 5. P. 1238-1254.

112. Eiraku M. et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. // Cell Stem Cell. 2008. Vol. 3, № 5. P. 519-532.

113. Kadoshima T. et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. Vol. 110, № 50. P. 2028420289.

114. Sloan S.A. et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. // Neuron. 2017. Vol. 95, № 4. P. 779-790.

115. Lancaster M.A., Knoblich J.A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. // Nat. Protoc. 2014. Vol. 9, № 10. P. 2329-2340.

116. Kelava I., Lancaster M.A. Stem Cell Models of Human Brain Development. // Cell Stem Cell. 2016. Vol. 18, № 6. P. 736-748.

117. Camp J.G. et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015. Vol. 112, № 51. P. 15672-15677.

118. Jo J. et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. // Cell Stem Cell. 2016. Vol. 19, № 2. P. 248-257.

119. Bermejo-Pareja F. et al. Incidence and subtypes of dementia in three elderly populations of central Spain // J. Neurol. Sci. 2008. Vol. 264, № 1-2. P. 63-72.

120. van Duijn C.M. et al. Amyloid precursor protein gene mutation in early-onset Alzheimer's disease. // Lancet (London, England). 1991. Vol. 337, № 8747. P. 978-985.

121. Di Carlo A. et al. Incidence of dementia, Alzheimer's disease, and vascular dementia in Italy. The ILSA Study // J Am Geriatr Soc. 2002. Vol. 50, № 1. P. 41-48.

122. Shi Y. et al. A human stem cell model of early Alzheimer's disease pathology in Down syndrome. // Sci. Transl. Med. 2012. Vol. 4, № 124. P. 124-129.

123. Selkoe D.J. Alzheimer's disease // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2011. Vol. 3, № 7. P. 1-16.

124. Bertram L., Tanzi R.E. Thirty years of Alzheimer's disease genetics: The implications of systematic meta-analyses // Nature Reviews Neuroscience. 2008. Vol. 9, № 10. P. 768-778.

125. Ballatore C., Lee V.M.-Y., Trojanowski J.Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders // Nat. Rev. Neurosci. 2007. Vol. 8, № 9. P. 663-672.

126. Webb R.L., Murphy M.P. P-Secretases, alzheimers disease, and down syndrome // Current Gerontology and Geriatrics Research. 2012. Vol. 10, № 1, 2012.

127. Miners J.S. et al Changes with age in the activities of beta-secretase and the Abeta-degrading enzymes neprilysin, insulin-degrading enzyme and angiotensin-converting enzyme. // Brain Pathol. 2010. Vol. 20, № 4. P. 794802.

128. Fukumoto H. et al. Beta-secretase activity increases with aging in human, monkey, and mouse brain. // Am. J. Pathol. 2004. Vol. 164, № 2. P. 719-725.

129. Fukumoto H. et al. Beta-secretase protein and activity are increased in the neocortex in Alzheimer disease. // Arch. Neurol. 2002. Vol. 59, № 9. P. 13811389.

130. Stockley J.H., O'Neill C. The proteins BACE1 and BACE2 and beta-secretase activity in normal and Alzheimer's disease brain. // Biochem. Soc. Trans. 2007. Vol. 35, № 3. P. 574-576.

131. Yang L.B. et al. Elevated P-secretase expression and enzymatic activity detected in sporadic Alzheimer disease [1] // Nature Medicine. 2003. Vol. 9, № 1. P. 3-4.

132. Sannerud R., Annaert W. Trafficking, a key player in regulated intramembrane proteolysis // Seminars in Cell and Developmental Biology. 2009. Vol. 20, № 2. P. 183-190.

133. Lal M., Caplan M. Regulated Intramembrane Proteolysis: Signaling Pathways

and Biological Functions // Physiology. 2011. Vol. 26, № 1. P. 34-44.

134. Lichtenthaler S.F., Haass C., Steiner H. Regulated intramembrane proteolysis -Lessons from amyloid precursor protein processing // Journal of Neurochemistry. 2011. Vol. 117, № 5. P. 779-796.

135. Kopan R., Ilagan M.X.G. Gamma-Secretase: Proteasome of the membrane? // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2004. Vol. 5, № 6. P. 499-504.

136. De Strooper B. et al. A presenilin-1-dependent y-secretase-like protease mediates release of notch intracellular domain // Nature. 1999. Vol. 398, № 6727. P. 518-522.

137. Smolarkiewicz M., Skrzypczak T., Wojtaszek P. The very many faces of presenilins and the y-secretase complex. // Protoplasma. 2013. Vol. 250, № 5. P. 997-1011.

138. Ponting C.P. et al. Identification of a novel family of presenilin homologues. // Hum. Mol. Genet. 2002. Vol. 11, № 9. P. 1037-1044.

139. Lemberg M.K. Intramembrane proteolysis in regulated protein trafficking // Traffic. 2011. Vol. 12, № 9. P. 1109-1118.

140. Osenkowski P. et al. Cryoelectron Microscopy Structure of Purified y-Secretase at 12 Á Resolution // J. Mol. Biol. 2009. Vol. 385, № 2. P. 642-652.

141. Ahn K. et al. Activation and intrinsic gamma-secretase activity of presenilin 1. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. Vol. 107, № 50. P. 21435-21440.

142. Kuperstein I. et al. Neurotoxicity of Alzheimer's disease Aß peptides is induced by small changes in the Aß42 to Aß40 ratio. // EMBO J. 2010. Vol. 29, № 19. P. 3408-3420.

143. Hardy J., Selkoe D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. // Science. 2002. Vol. 297, № 5580. P. 353-356.

144. Sala Frigerio C., De Strooper B. Alzheimer's Disease Mechanisms and Emerging Roads to Novel Therapeutics. // Annu. Rev. Neurosci. 2016. Vol. 39, № 2. P. 57-79.

145. Goedert M., Jakes R. Mutations causing neurodegenerative tauopathies. //

Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1739, № 2-3. P. 240-250.

146. Han D. et al. Familial FTDP-17 missense mutations inhibit microtubule assembly-promoting activity of tau by increasing phosphorylation at Ser202 in vitro. // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284, № 20. P. 13422-13433.

147. Hong M. et al. Mutation-specific functional impairments in distinct tau isoforms of hereditary FTDP-17. // Science. 1998. Vol. 282, № 5395. P. 19141917.

148. Holzer M. et al. Abnormally phosphorylated tau protein in Alzheimer's disease: heterogeneity of individual regional distribution and relationship to clinical severity. // Neuroscience. 1994. Vol. 63, № 2. P. 499-516.

149. Dickson D.W. et al. Correlations of synaptic and pathological markers with cognition of the elderly. // Neurobiol. Aging. 1995. Vol. 16, № 3. P. 285-298.

150. Arriagada P. V et al. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer's disease. // Neurology. 1992. Vol. 42, № 3. P. 631-639.

151. Cárdenas A.M. et al. Role of Tau Protein in Neuronal Damage in Alzheimer's Disease and Down Syndrome // Arch. Med. Res. 2012. Vol. 43, № 8. P. 645654.

152. Goedert M. et al. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. // Neuron. 1989. Vol. 3, № 4. P. 519-526.

153. Goedert M., Jakes R. Expression of separate isoforms of human tau protein: correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulin polymerization. // EMBO J. 1990. Vol. 9, № 13. P. 4225-4230.

154. Goode B.L., Feinstein S.C. Identification of a novel microtubule binding and assembly domain in the developmentally regulated inter-repeat region of tau. // J. Cell Biol. 1994. Vol. 124, № 5. P. 769-782.

155. Kosik K.S. et al. Developmentally regulated expression of specific tau sequences. // Neuron. 1989. Vol. 2, № 4. P. 1389-1397.

156. Mavilia C., Couchie D., Nunez J. Diversity of high-molecular-weight tau proteins in different regions of the nervous system. // J. Neurochem. 1994. Vol.

63, № 6. P. 2300-2306.

157. Panda D. et al. Differential regulation of microtubule dynamics by three- and four-repeat tau: implications for the onset of neurodegenerative disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 16. P. 9548-9553.

158. Martin L., Latypova X., Terro F. Post-translational modifications of tau protein: implications for Alzheimer's disease. // Neurochem. Int. 2011. Vol. 58, № 4. P. 458-471.

159. Hanger D.P., Anderton B.H., Noble W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. // Trends Mol. Med. 2009. Vol. 15, № 3. P. 112-119.

160. Lindwall G., Cole R.D. Phosphorylation affects the ability of tau protein to promote microtubule assembly. // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, № 8. P. 53015305.

161. Biernat J. et al. Phosphorylation of Ser262 strongly reduces binding of tau to microtubules: distinction between PHF-like immunoreactivity and microtubule binding. // Neuron. 1993. Vol. 11, № 1. P. 153-163.

162. Alonso L., Fuchs E. Stem cells of the skin epithelium. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 1. P. 11830-11835.

163. Lee G. Tau and src family tyrosine kinases. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1739, № 2-3. P. 323-330.

164. Reynolds C.H. et al. Phosphorylation sites on tau identified by nanoelectrospray mass spectrometry: differences in vitro between the mitogen-activated protein kinases ERK2, c-Jun N-terminal kinase and P38, and glycogen synthase kinase-3beta. // J. Neurochem. 2000. Vol. 74, № 4. P. 1587-1595.

165. Rankin C.A., Sun Q., Gamblin T.C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. // Mol. Neurodegener. 2007. Vol. 2, №1. P. 12.

166. Pei J.J. et al. Accumulation of cyclin-dependent kinase 5 (cdk5) in neurons with early stages of Alzheimer's disease neurofibrillary degeneration. // Brain Res. 1998. Vol. 797, № 2. P. 267-277.

167. Plattner F., Angelo M., Giese K.P. The roles of cyclin-dependent kinase 5 and

glycogen synthase kinase 3 in tau hyperphosphorylation. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, № 35. P. 25457-25465.

168. Ferrer I. et al. Constitutive DyrklA is abnormally expressed in Alzheimer disease, Down syndrome, Pick disease, and related transgenic models. // Neurobiol. Dis. 2005. Vol. 20, № 2. P. 392-400.

169. Liu F. et al. Overexpression of DyrklA contributes to neurofibrillary degeneration in Down syndrome. // FASEB J. 2008. Vol. 22, № 9. P. 32243233.

170. Ryoo S.-R. et al. DYRK1A-mediated hyperphosphorylation of Tau. A functional link between Down syndrome and Alzheimer disease. // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282, № 48. P. 34850-34857.

171. Wegiel J. et al. The role of overexpressed DYRK1A protein in the early onset of neurofibrillary degeneration in Down syndrome. // Acta Neuropathol. 2008. Vol. 116, № 4. P. 391-407.

172. Wegiel J. et al. Link between DYRK1A overexpression and several-fold enhancement of neurofibrillary degeneration with 3-repeat tau protein in Down syndrome. // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2011. Vol. 70, № 1. P. 36-50.

173. Guerreiro R., Hardy J. Genetics of Alzheimer's disease. // Neurotherapeutics. 2014. Vol. 11, № 4. P. 732-737.

174. Karch C.M., Goate A.M. Alzheimer's disease risk genes and mechanisms of disease pathogenesis. // Biol. Psychiatry. 2015. Vol. 77, № 1. P. 43-51.

175. Genin E. et al. APOE and Alzheimer disease: a major gene with semi-dominant inheritance. // Mol. Psychiatry. 2011. Vol. 16, № 9. P. 903-907.

176. Castellano J.M. et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-ß peptide clearance. // Sci. Transl. Med. 2011. Vol. 3, № 89. P. 89-107.

177. Bell R.D. et al. Apolipoprotein E controls cerebrovascular integrity via cyclophilin A. // Nature. 2012. Vol. 485, № 7399. P. 512-516.

178. Mahley R.W., Huang Y. Apolipoprotein e sets the stage: response to injury triggers neuropathology. // Neuron. 2012. Vol. 76, № 5. P. 871-885.

179. Lu T. et al. Addendum: REST and stress resistance in ageing and Alzheimer's

disease. // Nature. 2016. Vol. 540, № 7633. P. 470.

180. Lu T. et al. REST and stress resistance in ageing and Alzheimer's disease. // Nature. 2014. Vol. 507, № 7493. P. 448-454.

181. Zhang B. et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer's disease. // Cell. 2013. Vol. 153, № 3. P. 707720.

182. Matarin M. et al. A genome-wide gene-expression analysis and database in transgenic mice during development of amyloid or tau pathology. // Cell Rep. 2015. Vol. 10, № 4. P. 633-644.

183. Sherman S.L. et al. Epidemiology of Down syndrome. // Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 2007. Vol. 13, № 3. P. 221-227.

184. Lemere C.A. et al. Sequence of deposition of heterogeneous amyloid beta-peptides and APO E in Down syndrome: implications for initial events in amyloid plaque formation. // Neurobiol. Dis. 1996. Vol. 3, № 1. P. 16-32.

185. Letourneau A. et al. Domains of genome-wide gene expression dysregulation in Down's syndrome // Nature. 2014. Vol. 508, № 7496. P. 345-350.

186. Hattori N. et al. Epigenetic control of mouse Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem cells. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 17. P. 17063-17069.

187. Aït Yahya-Graison E. et al. Classification of Human Chromosome 21 GeneExpression Variations in Down Syndrome: Impact on Disease Phenotypes // Am. J. Hum. Genet. 2007. Vol. 81, № 3. P. 475-491.

188. Guelen L. et al. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions // Nature. 2008. Vol. 453, № 7197. P. 948-951.

189. Kurabayashi N., Nguyen M.D., Sanada K. DYRK1A overexpression enhances STAT activity and astrogliogenesis in a Down syndrome mouse model. // EMBO Rep. 2015. Vol. 16, № 11. P. 1548-1562.

190. Kurabayashi N., Sanada K. Molecular Mechanism Underlying Abnormal Differentiation of Neural Progenitor Cells in the Developing Down Syndrome Brain. // Yakugaku Zasshi. 2017. Vol. 137, № 7. P. 795-800.

191. Muratore C.R. et al. The familial Alzheimer's disease APPV717I mutation alters APP processing and Tau expression in iPSC-derived neurons. // Hum. Mol. Genet. 2014. Vol. 23, № 13. P. 3523-3536.

192. Moreno C.L. et al. iPSC-derived familial Alzheimer's PSEN2 N141I cholinergic neurons exhibit mutation-dependent molecular pathology corrected by insulin signaling. // Mol. Neurodegener. 2018. Vol. 13, № 1. P. 33-49.

193. Woodruff G. et al. The Presenilin-1 AE9 Mutation Results in Reduced y-Secretase Activity, but Not Total Loss of PS1 Function, in Isogenic Human Stem Cells // Cell Rep. 2013. Vol. 5, № 4. P. 974-985.

194. Sproul A.A. et al. Characterization and Molecular Profiling of PSEN1 Familial Alzheimer's Disease iPSC-Derived Neural Progenitors // PLoS One / ed. Borchelt D.R. 2014. Vol. 9, № 1. P. 845-857.

195. Tong G., Izquierdo P., Raashid R.A. Human Induced Pluripotent Stem Cells and the Modelling of Alzheimer's Disease: The Human Brain Outside the Dish. // Open Neurol. J. 2017. Vol. 11, № 1. P. 27-38.

196. Israel M.A. et al. Probing sporadic and familial Alzheimer's disease using induced pluripotent stem cells // Nature. 2012. Vol. 482, № 7384. P. 216-220.

197. Qin S. et al. Regional alteration of synapsin I in the hippocampal formation of Alzheimer?s disease patients // Acta Neuropathol. 2004. Vol. 107, № 3. P. 209215.

198. Flamier A. et al. Modeling Late-Onset Sporadic Alzheimer's Disease through BMI1 Deficiency. // Cell Rep. 2018. Vol. 23, № 9. P. 2653-2666.

199. Gonzalez C. et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids // Mol. Psychiatry. 2018. Vol. 31, № 9. P. 263-269.

200. Yan Y. et al. Modeling Neurodegenerative Microenvironment Using Cortical Organoids Derived from Human Stem Cells. // Tissue Eng. Part A. 2018. Vol. 24, № 13-14. P. 1125-1137.

201. Li T. et al. Generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from an Alzheimer's disease patient carrying a M146I mutation in PSEN1. // Stem Cell Res. 2016. Vol. 16, № 2. P. 334-337.

202. Tubsuwan A. et al. Generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from

an Alzheimer's disease patient carrying a L150P mutation in PSEN-1 // Stem Cell Res. 2016. Vol. 16, № 1. P. 110-112.

203. Mizuno G.O. et al. Aberrant Calcium Signaling in Astrocytes Inhibits Neuronal Excitability in a Human Down Syndrome Stem Cell Model // Cell Rep. 2018. Vol. 24, № 2. P. 355-365.

204. Andersen C.L., Jensen J.L., 0rntoft T.F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets // Cancer Res. 2004. Vol. 64, № 15. P. 5245-5250.

205. Vandesompele J. et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. // Genome biology. 2002. Vol. 3, № 7. P. 34-49.

206. Eisenberg E., Levanon E.Y. Human housekeeping genes, revisited // Trends Genet. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 29, № 10. P. 569-574.

207. Johnson G., Nolan T., Bustin S.A. Real-Time Quantitative PCR, Pathogen Detection and MIQE. 2013. Vol. 3, № 7. P. 1-16.

208. von Bohlen Und Halbach O. Immunohistological markers for staging neurogenesis in adult hippocampus. // Cell Tissue Res. 2007. Vol. 329, № 3. P. 409-420.

209. von Bohlen und Halbach O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. // Cell Tissue Res. 2011. Vol. 345, № 1. P. 1-19.

210. Wolvetang E.J. et al. ETS2 overexpression in transgenic models and in Down syndrome predisposes to apoptosis via the p53 pathway. // Hum. Mol. Genet. 2003. Vol. 12, № 3. P. 247-255.

211. Judge M. et al. Mitosis-specific phosphorylation of amyloid precursor protein at threonine 668 leads to its altered processing and association with centrosomes. // Mol. Neurodegener. 2011. Vol. 6, № 1. P. 80-92.

212. Woods Y.L. et al. The kinase DYRK phosphorylates protein-synthesis initiation factor eIF2Bepsilon at Ser539 and the microtubule-associated protein tau at Thr212: potential role for DYRK as a glycogen synthase kinase 3-priming

kinase. // Biochem. J. 2001. Vol. 355, № 3. P. 609-615.

213. Shi J. et al. Increased dosage of DyrklA alters alternative splicing factor (ASF)-regulated alternative splicing of tau in Down syndrome. // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, № 42. P. 28660-28669.

214. Galceran J. et al. The MNB/DYRK1A protein kinase: genetic and biochemical properties. // J. Neural Transm. Suppl. 2003. Vol. 283, № 67. P. 139-148.