Репрограммирование клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека до плюрипотентного состояния тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Мучкаева, Ирина Алексеевна

• Мучкаева, Ирина Алексеевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Мучкаева, Ирина Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности

1.1.1. Ауторегуляторная петля. Баланс между и с-Мус. Влияние локуса 1пк4/А1*

1.1.2. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в плюрипотентных стволовых клетках

1.1.3. Роль микроРНК в поддержании плюрипотентности

1.1.4. Влияние старения и иммортализации клеток на репрограммирование

1.1.5. Сложность, ступенчатость и стохастичность процесса индукции плюрипотентности

1.2. Методы репрограммирования соматических клеток

1.2.1. Новые способы репрограммированирования соматических клеток до плюрипотентного состояния

1.2.2. Использование малых молекул при репрограммировании

1.2.3. Прямое репрограммирование соматических клеток

1.3. Различия между иПСК и ЭСК. Эпигенетическая «память» иПСК

1.4. Перспективы использования иПСК в терапии

1.4.1. Подходы к клиническому применению иПСК

I.5. Общая характеристика клеток дермальной папиллы

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1. МАТЕРИАЛЫ

II. 1.1. Химические реактивы

II. 1.2. Клеточные культуры

11.2. МЕТОДЫ

П.2. 1. Выделение и культивирование эмбриональных фибробластов мыши

П.2. 2. Приготовление фидерного слоя МЭФ

П.2.3. Выделение и культивирование клеток дермальной папиллы человека

11.2.4. Культивирование фибробластов человека

11.2.5. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток человека

П.2.6. Репрограммирование клеток ДП и 160811Т

П.2.5. Отбор Тга-1 -60+ клонов

11.2.7. Тест на активность теломеразы в клетках

П.2.8. Иммуноцитохимическое исследование

11.2.9. Проточная цитофлуориметрия

11.2.10. Выявление активности щелочной фосфатазы

11.2.11. Получение и культивирование эмбриоидных телец

И.2.12. Приготовление срезов эмбриоидных телец и их окрашивание

11.2.13. Направленная дифференцировка иПСК in vitro

11.2.14. Выделение тотальной РНК из клеток

11.2.15. Синтез кДНК и ОТ - ПЦР (обратная транскрипция совмещенная с

полимеразной цепной реакцией)

II.2.15.1. Полимеразная цепная реакция

11.2.16. ПЦР в реальном времени

11.2.17. Кариотипировние

11.2.18. Тест на тератомообразование

11.2.19. Иммуногистохимия

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Инфицирование клеток ДП человека

111.2. Выделение и культивирование иПСК

111.3. Подтверждение плюрипотентного статуса полученных иПСК

111.3.1. Иммуноцитохимический анализ

111.3.2. Проточная цитофлуориметрия

111.3.3. Пролиферативная активность иПСК

111.3.4. Цитогенетический анализ

111.3.5. Определение теломеразной активности

III.3.5. ОТ-ПЦР анализ

III.3.1. ПЦР в реальном времени

III.4 Исследование дифференцировочного потенциала иПСК - ДП и иПСК -1608hT

111.4.1. Дифференцировка полученных иПСК in vitro. Образование эмбриоидных телец

111.4.2. Дифференцировка иПСК in vitro в остеогенном направлении

111.4.3. Дифференцировка иПСК in vitro в гепатоцитарном направлении

111.4.4. Дифференцировка иПСК in vitro в нейральном направлении

111.4.5. Дифференцировка иПСК in vivo

III. 5. Эффективность репрограммирования полученных иПСК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

иПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

ПСК - плюрипотентные стволовые клетки

ДП - дермальная папилла

МЭФ - эмбриональные фибробласты мыши

НСК - нейральные стволовые клетки

1608ИТ - линия фибробластов кожи человека, теломеризованных геном hTERT ЭТ - эмбриоидные тельца

иПСК - ДП - иПСК, полученные в результате репрограммирования клеток ДП иПСК - 1608hT - иПСК, полученные в результате репрограммирования 1608ИТ VPA - вальпроевая кислота, 2-пропилвалериановая кислота KMOS - набор транскрипционных факторов Klf4, с-Мус, Oct4, Sox2 миРНК, miR - микроРНК

siRNA - малые интерферирующие PHK(small interfering RNA)

FBS - фетальная бычья сыворотка (fetal bovine serum)

DAPI - 4,6-диамидино-2-фенилиндол (4,6-diamidino-2-phenylindole)

7-AAD - 7-миноактиномицин Д (7-Aminoactinomycin D)

АФП - альфафетопротеин

CK - цитокератин

FGF -фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)

HGF - фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor)

EGF - эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor)

BMP - костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Репрограммирование клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека до плюрипотентного состояния»

ВВЕДЕНИЕ

Плюрипотентные стволовые клетки способны к самообновлению и к генерации всех клеточных типов трех зародышевых листков. До недавнего времени источником плюрипотентных стволовых клеток служили культуры, полученные из клеток внутренней массы бластоцисты: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) (Evans, Kaufman, 1981; Thomson et al., 1998). Однако сам метод получения ЭСК был связан со многими практическими и этическими проблемами, которые исключали возможность клинического применения ЭСК. В связи с этим мировое научное сообщество продолжало заниматься активным поиском приемлемого метода получения клеток, подобных ЭСК по характеристикам. Определенные успехи были достигнуты в 1997 г., когда Wilmut и соавт. репрограммировали соматические клетки молочной железы, посредством переноса их ядер в ооциты второго деления мейоза (somatic cell nuclear transfer, SCNT) овцы (Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998; Campbell et al., 1996). В 2001 г. Tada и соавт. достигли подобного результата путем слияния тимоцитов мыши с ЭСК (Tada et al., 2001). Однако техническую сложность и низкую воспроизводимость этих методов устранить не удавалось. Все попытки применения данных методик для клеток приматов оказались тщетными.

Основываясь на накопленных данных, исследователи Takahashi и Yamanaka в 2006 г. предположили, что неоплодотворенная яйцеклетка и ЭСК содержат факторы, определяющие плюрипотентность (Takahashi, Yamanaka, 2006). В своих работах, выполненных на фибробластах мыши (Takahashi, Yamanaka, 2006), а затем и на клетках человека (Takahashi et al., 2007), они описали способ введения генов, играющих большую роль в раннем развитии, при помощи лентивирусных конструкций. Удалось показать, что эктопическая экспрессия генов всего четырех транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус (позже названных

«каноническим» набором генов KMOS, или «коктейлем Яманаки») достаточна для репрограммирования фибробластов до плюрипотентного состояния. Полученные таким образом клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (иПСК, induced pluripotent stem cells), а явление репрограммирования до плюрипотентного состояния - индуцированной плюрипотентностью. иПСК сходны с ЭСК по многим характеристикам, включая профили экспрессии генов, морфологию, теломеразную активность, характер метилирования ДНК и модификации гистонов. Кроме того, иПСК способны генерировать клетки тканей трех зародышевых листков in vitro, они формируют зрелые тератомы после инъекции мышам с иммунодефицитом. На основе иПСК удалось получить химерных животных, среди потомков которых были и полученные из репрограммированных клеток (Wernig et al., 2007; Okita et al., 2007). К сегодняшнему дню опубликовано большое количество работ, в которых сообщается о получении иПСК человека при помощи различных методов (Yu et al., 2007). Для потенциального клинического применения разработаны способы репрограммирования клеток, более эффективные и безопасные, чем трансфекция вирусных векторов (Park et al., 2008). Получены иПСК от пациентов с различными наследственными заболеваниями (Park et al., 2008; Soldner et al., 2009). Существуют две обширные области исследований, связанных с репрограммированием клеток: фундаментальные исследования клеточной пластичности, генетических механизмов, лежащих в основе раннего развития организма и неоплазий; и технологии репрограммирования соматических клеток с целью проведения заместительной клеточной терапии (Но et al., 2011). Клеточные технологии с использованием иПСК способны предоставлять пациент-специфические линии клеток, в том числе от носителей наследственных заболеваний. Такие линии можно использовать при моделировании различных заболеваний и испытании новых лекарственных средств.

К моменту начала нашего исследования, опубликованных работ по репрограммированию клеток ДП волосяного фолликула человека не было. Многими

авторами подтверждено, что для успешного репрограммирвания соматических клеток до плюрипотентнотого состояния, необходимо вызвать экспрессию четырех транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус в них. Higgins и сотр. (Higgins et. al., 2010) было показано, что при культивировании в клетках ДП человека начинают экспрессироваться Klf4 и с-Мус, тогда как в интактной ДП они не детекутируются, a Sox2 (Higgins et. al., 2012), наоборот, экспрессируется в интактной ДП, но не в культуре (хотя этими авторами двумя годами ранее отвергался данный факт (Higgins et. al., 2010). Принимая во внимание эти неоднозначные сведения, нам показалось интересным использовать клетки ДП в качестве альтернативного источника иПСК, а также проверить эффективность процесса репрограммирования. Мы предположили, что экспрессия в материнских клетках как минимум двух (Klf4 и с-Мус), а, возможно, и трех факторов репрограммирования (Sox2, Klf4 и с-Мус) будет способствовать репрограммированию клеток ДП. Для увеличения эффективности в экспериментах мы культивировали клетки при добавлении деметилирующего агента - вальпроевой кислоты (Medvedev et al., 2011) в условиях физиологического уровня содержания кислорода 5% (Warren et al., 2010). Таким образом, задача настоящего исследования состояла в получении иПСК из клеток ДП человека и оценки эффективности репрограммирования при подобранных условиях, а также многосторонняя характеристика полученных иПСК.

Цель настоящей работы заключалась в получении иПСК из клеток ДП волосяного фолликула человека.

Задачи:

• Репрограммировать клетки ДП человека посредством трансфекции генами транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Выделить репрограммированные до плюрипотентного состояния клоны иПСК - ДП.

• Исследовать недифференцированный статус полученных иПСК - ДП.

• Проверить плюрипотентный статус иПСК - ДП in vitro и подобрать условия для направленной дифференцировки иПСК - ДП.

• Проверить плюрипотентный статус полученных иПСК - ДП в экспериментах in vivo.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные механизмы индуцированной плюрипотентности

1.1.1. Ауторегуляторная петля. Баланс между КЖ и с-Мус. Влияние локуса

1пк4/АгГ

В настоящее время имеется много данных в пользу того, что плюрипотентность регулируется тремя транскрипционными факторами - Ос14, 8ох2 и Капо§ (№\уа, 2007). Показано (ЬоЬ е! а1., 2007; Воуег & а1., 2005), что факторы Ос14, Бох2 и Капо§ совместно активируют промоторы и собственных генов, и генов друг друга, образуя тем самым ауторегуляторную петлю. Существуют данные, указывающие на то, что ауторегуляторная петля усиливает стабильность экспрессии генов плюрипотентности (ЯовепГеИ е1 а1., 2002; А1оп, 2007). Рассматриваемые три фактора способны также запускать и регулировать каскады генов (до нескольких сотен) как транскрипционно активных, так и неактивных. Экспрессия генов Ом4, Бох2 и Nanog является основой транскрипционной сети, которая обеспечивает плюрипотентность ЭСК, усиливая транскрипцию генов плюрипотентности и, в то же время, подавляя активность генов, связанных с дифференцировкой и развитием (Нуз1ор е1 а1., 2005; Кигоёа е1 а1., 2005; КосИа е1 а1., 2005).

В своих пионерских работах ТакаЬаэЫ и Уашапака, начав с анализа 24 генов, в конечном итоге выяснили, что для перехода клеток в плюрипотентное состояние достаточно четырех генов - Ос14, 8ох2, К1/4 и с-Мус. Если первые два относятся к мастер-генам плюрипотентности, то выбор последних двух генов обусловлен иными

причинами. Транскрипционный фактор с-Мус, как известно, увеличивает темпы пролиферации (Seoane et al., 2002), что критически важно для успешного репрограммирования (Utikal et al., 2009). Вместе с тем гиперэкспрессия этого гена сказывается на повышении уровня белка р53. В некоторых работах показано, что экспрессия Klf4, с одной стороны, вызывает повышение уровня белка р21 (ингибитора циклин-зависимых киназ) (Rodda et al., 2005), что приводит к угнетению пролиферации, а с другой стороны, понижает уровень р53 в клетке, что положительно сказывается на уменьшении риска апоптоза (Rowland et al., 2005). Также имеются данные о том, что р53 ингибирует зависимые от актвации Klf4 эпителиальные гены. Было обнаружено, что р53 находится в обратной зависимости (негативной корреляцией) от эпителиального маркера Е-Кадгерина (Broch et al., 2012). Так как мезенхимно-эпителиальный переход является этапом процесса репрограммирования фибробластов (Li et al., 2010; Ono et al., 2012;), то активация p53 препятствует этому процессу. Таким образом, можно предположить, что с-Мус и Klf4 действуют разнонаправленно и взаимно дополняют друг друга. Следовательно, для успеха репрограммирования важен баланс экспрессии этих двух генов (Scheper, Copray, 2009).

Одной из важных характеристик плюрипотентных стволовых клеток является ингибирование локуса Ink4/Arf, который содержит гены Cdknla и Cdkn2b, кодирующие три сильных опухолевых супрессора - р16 (Ink4a), р19 {Arf), р15 {1пк4Ъ). В клетках мыши именно ген Arf активирует р53 и р21, в то время как в клетках человека эти функции в основном берет на себя ген 1пк4а. Показано (Li et al., 2009), что в иПСК, как и в ЭСК, локус Ink4/Arf полностью подавлен при помощи эпигенетических меток домена «бивалента» (появление репрессирующих НЗК27теЗ модификаций гистонов), однако он может вновь активироваться при дифференцировке клеток. Oct4, Sox2, Klf4 совместно подавляют данный локус, что способствует усиленной генерации иПСК, увеличивая как кинетику

репрограммирования, так и количество колоний иПСК. Также стоит отметить, что некоторые исследователи напрямую связывают активацию локуса Ink4/Arf с общим старением организма. Следовательно, сложнее репрограммировать клетки от пожилого донора, нежели от молодого. Подавление локуса Ink4/Arf в этом случае может значительно увеличить эффективность и скорость репрограммирования (Utikal et al., 2009).

1.1.2. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в плюрипотентных стволовых

клетках

ЭСК обладают несколькими эпигенетическими характеристиками, которые отличают их от дифференцированных клеток. Например, ключевые гены плюрипотентности Oct4 и Nanog деметилированы в ЭСК и могут активно транскрибироваться, в то время как дифференцировка приводит к подавлению этих генов посредством метилирования ДНК de novo. Интересно, что метки метилирования удаляются в течение процесса репрограммирования. Это позволяет реактивировать эндогенную транскрипцию этих генов (Mikkelsen et al., 2008).

Помимо метилирования ДНК, ЭСК и дифференцированные клетки различаются также паттернами модификации гистонов. Например, подавление генов, ответственных за развитие и дифференцировку ЭСК, регулируется при помощи сочетаний активирующей (НЗК4шеЗ) и репрессирующей (НЗК27шеЗ) модификаций гистонов. Регуляция транскрипции осуществляется при помощи белков группы Polycomb, которые подавляют экспрессию генов в результате связывания с гистонами, содержащими НЗК27теЗ. Такой механизм рассматривается как инструмент транскрипционной гибкости ЭСК, обусловленной стабильной репрессией генов, связанных с развитием, без необратимой их инактивации. Принимая во внимание, что «бивалентные» домены имеются практически только в

ЭСК и являются важной характеристикой плюрипотентного статуса, можно предположить, что восстановление «бивалентных» доменов представляет собой ключевой этап и в репрограммировании соматических клеток в иПСК. В ряде работ показано, что хроматин полностью репрограммированных иПСК содержит бивалентные гистоны, идентичные гистонам в ЭСК (Wernig et al., 2007; Bernstein et al., 2006).

На сегодняшний день нет ни одной работы, которая раскрывала бы полную картину взаимосвязи транскрипционных факторов, модификаций хроматина и каскадов генов плюрипотентности в процессе репрограммирования клеток. Тем не менее опубликовано много данных, посвященных анализу экспрессии транскрипционных факторов в ЭСК человека и мыши (Kunarso et al., 2010), а также в иПСК (Sridharan et al., 2009), которые могут быть основой для построения модели репрограммирования. Исходя из имеющихся данных, можно полагать, что Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 составляют центральное звено процесса репрограммирования, во время которого происходит восстановление нуклеосом, сборка деацетилаз, активация белков Polycomb и ремоделирование хроматина. В работах по слиянию ЭСК и лимфоцитов Pereira и соавт. в 2010 г. показали, что компоненты комплекса Polycomb играют важную функциональную роль в эпигенетическом ремоделировании. Дефектные по белкам группы Polycomb ЭСК утрачивали способность ремоделировать геном соматических клеток (Pereira et al., 2010).

Механизм, лежащий в основе подавления экспрессии генов дифференцировки в плюрипотентных клетках, включает связывание факторов плюрипотентности (одного или нескольких) с промоторами целевых генов (Kim et al., 2008). Связыванию факторов репрограммирования с их генами-мишенями могут способствовать комплексы, ремоделирующие нуклеосомы, такие, как Chdl (chromodomain helicase DNA binding protein 1) (Gaspar-Maia et al., 2009) и BAF (rg/Brahma-associated factors - АТР-зависимый комплекс, перестраивающий структуру хроматина) (Singhai et al., 2010). Эти комплексы усиливают

эффективность и кинетику репрограммирования. Вероятно, их регуляторная роль заключается в реактивации и поддержании экспрессии эндогенных генов плюрипотентности в отсутствие экзогенных факторов. Данное предположение основано на том, что в конце процесса репрограммирования эндогенные сигналы плюрипотентности, а также теломераза и репрессированная Х-хромосома женских клеток реактивируются, в то время как работа ретровирусных генов затухает, хотя четкого разделения и взаимосвязи этих процессов нет ^ас^еШ е! а1., 2008). Реактивация Х-хромосомы ведет за собой активацию онкогенов, закодированных в ней. В свзи с этим Ап£иега и сотр. предполагают более безопасное применение мужских иПСК, чем женских, которые менее стабильны в эпигенетическом контексте (Аг^иега е1 а1., 2012).

1.1.3. Роль микроРНК в поддержании плюрипотентности

В настоящее время активно ведутся исследования роли мироРНК(миРНК) в биологии иПСК (Sharma, Wu, 2013). Во многих работах по репрограммированию соматических клеток до плюрипотентного состояния наблюдали значительное увеличение эффективности репрограммирования при добавлении гена Lin28 в набор репрограммирующих факторов (Huangfu et al., 2008). Основной вклад Lin28 в этот процесс связывают с его участием в процессинге микроРНК. Предполагается, что в ЭСК Lin28 ингибирует процессинг миРНК let7 (Viswanathan et al., 2008), известного супрессора опухолевого роста. Он участвует в подавлении активности с-Мус. Кроме того, показано, что ключевые факторы репрограммирования Oct4, Sox2 и Nanog могут запускать семейство miR-290, члены которого в норме экспрессируются в ЭСК, принимая участие в регуляции пролиферации и самоподдержании этих клеток. Во время репрограммирования miR-290 активируется и в результате ремоделирования хроматина с помощью с-Мус (Ralston, Rossant, 2008). Одна из

мишеней транскрипционных факторов плюрипотентности Oct4, Sox2, Nanog и Rexl - промотор кластера миРНК miR-302-367. Его продукты могут опосредованно индуцировать сигнальные пути TGF-ß/Nodal/Activin (этот сигнальный путь играет существенную роль в поддержании плюрипотентного статуса ЭСК и в подавлении их дифференцировки), ингибируя некоторые регуляторы этого пути, что, в свою очередь, положительно сказывается на поддержании клеток в недифференцированном состоянии. Также известно, что miR-302 способен подавлять маркер раковых стволовых клеток BMI-1 (В lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog), что в конечном итоге приводит к усилению экспрессии опухолевых супрессоров (р16 (Ink4a), р19 (Arß). Авторы связывают активацию miR-302 в иПСК с возможностью безопасного терапевтического использования этих клеток (Lin et al., 2012).

1.1.4. Влияние старения и иммортализации клеток на репрограммирование

Представляют интерес исследования, посвященные взаимосвязи репрограммирования с процессами клеточного старения и иммортализации. В ранних работах неоднократно указывалось на то, что в соматических клетках в процессе репрограммирования росла теломеразная активность и значительно удлинялись теломерные участки ДНК. Репрограммированные клетки, таким образом, приобретали иммортальность, характерную для ЭСК (Takahashi, Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007; Mathew et al., 2010). Yehezkel и соавт. (Yehezkel et al., 2011) детально изучили длину теломер, метилирование субтеломерных областей и экспрессию РНК-компонента теломеразы (TERRA, telomeric-repeat-containing RNA) в иПСК. Помимо подтверждения известных данных об активации теломеразы и удлинении теломер в иПСК, было показано, что в процессе последующей дифференцировки происходило значительное снижение экспрессии теломеразы в

исследуемых клетках и сильное укорачивание теломерных областей. Результаты данной работы подтвердили важную роль теломеразы и состояния теломер в поддержании плюрипотентного статуса. Субтеломерные участки в иПСК были гиперметилированы по сравнению с исходными клетками, а уровень TERRA сравнительно увеличен. Предполагается, что регуляция экспрессии РНК-компонента теломеразы также может участвовать в процессах репрограммирования наряду с регуляцией экспрессии каталитического компонента теломеразы (TERT, Telomerase reverse transcriptase) (Yehezkel et al., 2011).

Существенную роль экспрессии TERRA в процессах репрограммирования подтверждают результаты работы (Agarwal et al., 2010), в которой изучали клетки больных врожденным дискератозом (dyskeratosis congenital) - генетическим заболеванием, связанным с дисфункцией теломер из-за их преждевременного укорачивания. Вопреки ожиданиям оказалось, что клетки, репрограммированные при помощи Oct4, Sox2, KL/4 и с-Мус, также удлиняют теломерные участки и восстанавливают теломеразную активность. Механизм восстановления теломеразной активности авторы связали с восстановлением экспрессии TERRA (Agarwal et al., 2010).

В работе Utikal и соавт. показано, что приобретение иммортального статуса является критически важным и лимитирующим фактором на пути репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния, что может также указывать на сходство механизмов репрограммирования и трансформации (Utikal et al., 2009).

1.1.5. Сложность, ступенчатость и стохастичность процесса индукции

плюрипотентности

Одну из проблем репрограммирования клеток с помощью введения транскрипционных факторов представляет низкая эффективность репрограммирования. В ранней методике трансфекции с использованием КМ08 репрограммированию подвергались порядка 0.01-0.1% трансфицированных клеток, что существенно ниже, чем при использовании методик клеточного слияния или ядерного переноса. Предложено несколько гипотез, объясняющих столь низкий выход репрограммированных клеток:

1) Образование иПСК требует специфически узких интервалов уровня экспрессии транскрипционных факторов. При одновременной трансфекции нескольких генов в составе лентивирусной конструкции распределение экспрессии этих генов по клеткам имеет вероятностный характер (из-за разного числа копий вируса в клетке и из-за случайной интеграции в геном). Это может быть причиной того, что только малая часть трансфицированных клеток получает «правильный» набор уровней экспрессии репрограммирующих факторов. Известно, что плюрипотентный статус ЭСК весьма чувствителен к уровням экспрессии генов плюрипотентности, например, 50%-ное изменение в уровне экспрессии 0^4 уже приводит к дифференцировке ЭСК (№ша е1 а1., 2000).

2) Популяции репрограммируемых соматических клеток гетерогенны сами по себе и содержат некоторое количество клеток, более подверженных репрограммированию, чем другие. Например, во время трансфекции часть клеток (скорее всего делящихся) содержит относительно открытый хроматин, способствующий репрограммированию.

3) Необычно высокий уровень экспрессии экзогенных репрограммирующих факторов активирует гены, ассоциированные со стрессом и подавляющие пролиферацию. Например, в трансфицированных фибробластах возрастала

экспрессия генов Cdknla и Cdkn2a, ингибиторов циклин-зависимых киназ, вовлеченных в различные пути дифференцировки и подавления пролиферации (Shi et al., 2008). Этот факт связывают с введением транскрипционных факторов, так как известно, что экспрессия Cdknla запускается фактором Klf4, a Cdkn2a активируется вследствие аберрантной экспрессии с-Мус (Wernig et al., 2008). Таким образом, в трансфицированных клетках включаются внутренние механизмы «самосохранения», которые служат супрессорами неконтролируемой пролиферации, что в результате выражается в низком процентном содержании клеток, которым выпадает шанс преодолеть барьер супрессии пролиферации и достигнуть плюрипотентного состояния.

4) Недостаточное количество репрограммирующих факторов. При использовании методик репрограммирования при помощи клеточного слияния и переносе ядерного материала соматическая клетка или ее ядро подвергаются воздействию всех компонентов сети транскрипции плюрипотентности. Данные компоненты действуют на всех уровнях, тогда как при репрограммировании с использованием лентивирусной трансфекции на клетки действует лишь ограниченное число факторов. Эти факторы могут реактивировать каскады транскрипции лишь с самого начала, что ставит процесс репрограммирования в более уязвимое положение, а также в зависимость от случайных вариаций.

На основании этих гипотез можно сделать вывод, что репрограммирование, индуцированное трансфекцией транскрипционных факторов, является низкоэффективным и ступенчатым, крайне зависящим от стохастических процессов. Важность случайных вариаций при образовании иПСК подтверждается данными о том, что получающиеся репрограммированные клетки довольно гетерогенны по общему профилю экспрессии генов плюрипотентности, эпигенетическому профилю и морфологии. Показано, что иПСК, образующиеся из одних и тех же родительских клеток, реактивируют экспрессию эндогенного Oct4 в разное время в течение всего процесса репрограммирования, что указывает на ступенчатость эпигенетических

перестроек и репрограммирования в целом (Scheper, Copray, 2009). Однако при сравнении рассматриваемого метода репрограммирования с ранее предложенными методиками переноса ядер и клеточных слияний нельзя не учитывать тот факт, что метод Takahashi и Yamanaka обладает рядом несомненных преимуществ, таких, как

относительная дешевизна и простота методики репрограммирования. Стоит также

i

отметить и универсальность подхода, так как удалось репрограммировать клетки человека, что было невозможно ранее.

1.2. Методы репрограммирования соматических клеток

1.2.1. Новые способы репрограммированирования соматических клеток до

плюрипотентиого состояния

Первоначальный метод трансфекции репрограммирующих транскрипционных факторов с использованием лентивирусных векторов обладает рядом существенных недостатков, препятствующих его применению в клинической практике. Интеграция вируса в геном хозяина (до 20 вставок за репрограммирование) увеличивает риск опухолеобразования, так как внедрение вируса в геном клетки-мишени может случайно активировать либо инактивировать гены хозяина, повышая тем самым риск мутагенеза. Проблемой является и продолжительная сверхэкспрессия трансгенов также из-за возможного неполного подавления трансгенов во время репрограммирования и при последующей дифференцировке. Присутствие даже нескольких плюрипотентных стволовых клеток в трансплантируемой ткани может стать причиной развития опухоли (Carey et al., 2009).

Одна из стратегий решения данных проблем состоит в уменьшении количества вводимых вирусных векторов, что достигается конструированием полицистронных вирусных векторов, несущих сразу несколько нужных генов. Созданы конструкции

(Carey et al., 2009; Sommer et al., 2009; Zhang et al., 2012), кодирующие четыре основных гена репрограммирования KMOS. Используя одну лентивирусную конструкцию, содержащую эти гены, удалось снизить число вирусных интеграций в геном (до 3-5 вставок на клетку) и, что немаловажно, обеспечить равномерную экспрессию всех четырех генов в одной клетке. Посредством интеграции полицистронного лентивирусного вектора, кодирующего три гена - Oct4, Sox2, Klf4 (KOS), - удалось репрограммировать мышиные фибробласты с последующим вырезанием вектора из генома. Использованный подход увеличивает привлекательность метода за счет полного удаления вирусного материала из репрограммированных клеток (Chang et al., 2009). Подобный метод применили в работе (Woltjen et al., 2009), в которой использовали специальный piggiBag-транспозон, содержащий KMOS, с последующей его элиминацией для получения свободных от вектора и трансгенов иПСК, полученных из эмбриональных фибробластов мыши. Существуют работы, в которых подобную технологию применили и для клеток человека (Mali et al., 2010). Значительным недостатком подобного подхода является сложно контролируемый процесс удаления множества транспозонов после репрограммирования, не гарантирующий стопроцентного результата.

Следующим подходом к решению проблемы вирусной интеграции в геном стал метод получения иПСК с использованием плазмидной трансфекции основных факторов плюрипотентности (KMOS или LNOS - Lin28, Nanog, Oct4, Sox2), основанной на временной экспрессии введенных генов. В целом ряде работ сообщается об успешном применении этого метода для получения иПСК из различных клеточных культур, включая гепатоциты и клетки линии НЕК293 (Okita et al., 2008; Stadtfeld et al., 2008; Kaji et al., 2009; Jia et al., 2010). В процессе усовершенствования метода удалось трансфицировать клетки единственной плазмидной конструкцией, кодирующей канонический набор генов KMOS. Эта конструкция удалялась из клеток после репрограммирования (Kaji et al., 2009).

Необходимо отметить, что к недостаткам использования плазмидных конструкций (в сравнении с методами, основанными на вирусных векторах) относится крайне низкая эффективность репрограммирования, поскольку при помощи данного метода получили в основном иПСК из эмбриональных клеток мыши и клеточных линий, известных своей лабильностью. Однако удалось увеличить эффективность репрограммирования фибробластов человека до 1%, используя эписомные плазмидные векторы riP/EBNAl, кодирующие сразу шесть генов: Oct4, Sox2, Klf4, с-Мус, Lin28 и Nanog (Yu et al., 2009).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мучкаева, Ирина Алексеевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гнедева К.Ю., Воротеляк Е.А., Терских A.B., Васильев A.B., Терских В.В. Дифференцировочный и морфогенетический потенциал клеток дермальной папиллы крысы // Известия РАН. Серия Биологическая. - 2011. - Т. 6. - С. 1-6.

2. Гнедева К.Ю. Клетки дермальной папиллы из нервного гребня в морфогенезе волосяного фолликула : автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Р. 03.03.04, 03.03.05.-М., 2012.-22 с.

3. Егоров Е.Е., Терехов С.М., Вишнякова Х.С. Караченцев Д.Н., Эльдаров М.А., Смирнова Т.Д., Мещерякова Ю.А., Зеленин A.B. Иммортализация нормальных фибробластов кожи взрослого человека путем введения гена каталитического компонента теломеразы. // Биологические мембраны. - 2002. - Т. 19. - С. 483 -490.

4. Лагарькова М.А. Молекулярная характеристика и генетические особенности плюрипотентных клеток человека и их производных, автореф. дис. ... д-ра. биол. наук. - Р. 03.02.07, 03.03.04. - М., 2010. - 37 с.

5. Лисковых М. А., Чуйкин И. А., Ранян А., Попова Е., Толкунова Е. Н., Чечик Л. Д., Малинин А. Ю., Морозова А. В., Мосиенко В., Бадер М., Аленина Н., Томилин А. Н. Проведение генетических манипуляций и исследование дифференцировочных свойств индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы. // Цитология. - 2011. - Т. 53. - № 12. - С. 946-951.

6. Минина Ю.М., Жданова Н.С., Шилов А.Г., Толкунова E.H., Лисковых М.А., Томилин А.Н. Нестабильность хромосомного состава культивируемых in vitro плюрипотентных клеток мыши. // Цитология. - 2010. - Т. 52. - № 5. - С. 420425.

7. Чермных Э.С., Радюхина Н.В., Руткевич Н.П., Шевелев А.Я., Власик Т.Н., Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Терских В.В. Культивированные клетки волосяного фолликула человека способны встраиваться в структуру кожи in vivo. // Цитология. - 2010. - Т. 52. - № 3. - С. 219 - 224.

8. Шутова М.В., Богомазова А.Н., Лагарькова М.А., Киселев С.Л.. Получение и характеристика клеток с индуцированной плюрипотентностью. // Acta Naturae. - 2012. - Т. 1. - № 2. - С. 104 - 106.

9. Aasen Т, Raya A, Barrero MJ, Garreta Е, Consiglio А, Gonzalez F, Vassena R, Bilic J, Pekarik V, Tiscornia G, Edel M, Boue S, Izpisua Belmonte JC. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. // Nat. Biotechnol. - 2008. - V. 26(11). - P. 1276 - 1284.

10.Abad M, Mosteiro L, Pantoja C, Canamero M, Rayon T, Ors I, Grana O, Megias D, Dominiguez O, Martinez M, Ortega S, Serrano M. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. // Nature. - 2013. - doi: 10.1038/naturel2586.

11.Addis R.C., Hsu F.C., Wright R.L., Dichter M.A., Coulter D.A., Gearhart J.D.. Efficient conversion of astrocytes to functional midbrain dopaminergic neurons using a single polycistronic vector. //PLoS One. 2011. - V. 6. (e28719).. - P. 1-8.

12.Agarwal S, Loh YH, McLoughlin EM, Huang J, Park IH, Miller JD, Huo H, Okuka M, Dos Reis RM, Loewer S, Ng HH, Keefe DL, Goldman FD, Klingelhutz AJ, Liu L, Daley GQ. 2010. Telomere elongation in induced pluripotent stem cells from dyskeratosis congenita patients. // Nature. - V. 464(7286). - P. 292 - 296.

13.Alon U. Network motifs: theory and experimental approaches. // Nat. Rev. Genet. 2007.-V. 8(6). - P. 450-461.

14.Anguera MC, Sadreyev R, Zhang Z, Szanto A, Payer B, Sheridan SD, Kwok S, Haggarty SJ, Sur M, Alvarez J, Gimelbrant A, Mitalipova M, Kirby JE, Lee JT. Molecular signatures of human induced pluripotent stem cells highlight sex differences and cancer genes. // Cell Stem Cell. - 2012. - V. 11(1). - P. 75 - 90.

15.Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, Fry B, Meissner A, Wernig M, Plath K, Jaenisch R, Wagschal A, Feil R, Schreiber SL, Lander ES. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.//Cell. -2006.-V. 125(2). - P. 315 -326.

lö.Bilousova G, Jun du H, King KB, De Langhe, Chick WS, Torchia EC, Chow KS, Klemm DJ, Roop DR, Majka SM. Osteoblasts derived from indused pluripotent stem cells form calcified structures in scuffolds dith in vitro and in vivo. // Stem Cells. - 2011.-V. 29(2).-P. 206-216.

17.Boy er LA, Lee TI, Cole MF, Johnstone SE, Levine SS, Zucker JP, Guenther MG, Kumar RM, Murray HL, Jenner RG, Gifford DK, Melton DA, Jaenisch R, Young RA. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. // Cell. - 2005. - V. 122(6). - P. 947 - 956.

18.Brimble SN, Sherrer ES, Uhl EW, Wang E, Kelly S, Merrill AH Jr, Robins AJ, Schulz TC. The cell surface glycosphingolipids SSEA-3 and SSEA-4 are not essential for human ESC pluripotency. // Stem Cells. - 2007. - V. 25(1). - P. 54-62.

19.Brosh R, Assia-Alroy Y, Molchadsky A, Bornstein C, Dekel E, Madar S, Shetzer Y, Rivlin N, Goldfinger N, Sarig R, Rotter V. p53 Counteracts reprogramming by inhibiting mesenchymal-to-epithelial transition. // Cell Death Differ. - 2013. - V. 20(2). - P. 312-320.

20.Byrne JA, Pedersen DA, Clepper LL, Nelson M, Sanger WG, Gokhale S, Wolf DP, Mitalipov SM. Producing primate embryonic stemm cells by somatic cell nuclear transfer. // Nature. - 2007. - V. 450(7169). - P. 497 - 502.

21.Caiazzo M, DeH'Anno MT, Dvoretskova E, Lazarevic D, Taverna S, Leo D, Sotnikova TD, Menegon A, Roncaglia P, Colciago G, Russo G, Carninci P, Pezzoli G, Gainetdinov RR, Gustincich S, Dityatev A, Broccoli V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. . // Nature. -2011. - V. 476 (7359). - P. 224-227.

22.Campbell K.H., Mcwhir J., Ritchie W.A. Et AI. Sheep Cloned By Nuclear Transfer From A Cultured Cell Line. //Nature. - 1996. -V. 380(6569). - P. 64-66.

23.Carey BW, Markoulaki S, Hanna J, Saha K, Gao Q, Mitalipova M, Jaenisch R. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. - 2009. - V. 106(1).-P. 157 - 162.

24.Chamberlein SJ, Li XJ, Lalande M. Indused pluripotent stem (iPS) cells as in vitro models of human neurogenetic disorders. // Neurogenetics. - 2008. - V. 9(4). - P. 227-235.

25.Chang CW, Lai YS, Pawlik KM, Liu K, Sun CW, Li C, Schoeb TR, Townes TM. Polycistronic lentiviral vector for "hit and run" reprogramming of adult skin fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Stem Cells. - 2009. - V. 27(5). - P. 1042- 1049.

26.Christodoulou C, Longmire TA, Shen SS, Bourdon A, Sommer CA, Gadue P, Spira A, Gouon-Evans V, Murphy GJ, Mostoslavsky G, Kotton DN. 2011. Mouse ES and iPS cells can form similar definitive endoderm despite differences in imprinted genes. // J Clin Invest. - V. 121(6). - P. 2313 - 2325.

27.Dang CV, O'Donnell KA, Zeller KI, Nguyen T, Osthus RC, Li F. The c-Myc target gene network. Semin. // Cancer Biol. - 2006. - V. 16(4). - P. 253 - 264.

28.Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK, Weisenthal LM, Mitsumoto H, Chung W, Croft GF, Saphier G, Leibel R, Goland R, Wichterle H, Henderson CE, Eggan K. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. // Science. - 2008. - V. 321(5893). - P. 1218 -1221.

29.Ebert AD, Liang P, Wu JC. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. // J Cardiovasc Pharmacol. - V. 2012. - 60(4). - P.408-416.

30.Esteban MA, Wang T, Qin B, Yang J, Qin D, Cai J, Li W, Weng Z, Chen J, Ni S, Chen K, Li Y, Liu X, Xu J, Zhang S, Li F, He W, Labuda K, Song Y, Peterbauer A, Wolbank S, Redl H, Zhong M, Cai D, Zeng L, Pei D. Vitamin C enhances the

generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. // Cell Stem Cell. -2010.-V. 6(1).-P. 71 -79.

31.Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature. - 1981.-V. 292(5819). - P. 154 - 156.

32.Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. - 2009. - V. 85(8). - P. 348 - 362.

33.Galende E, Karakikes I, Edelmann L, Desnick RJ, Kerenyi T, Khoueiry G, Lafferty J, McGinn JT, Brodman M, Fuster V, Hajjar RJ, Polgar K. Amniotic fluid cells are more efficiently reprogrammed to pluripotency than adult cells. // Cell Reprogram. 2010.-V. 12(2). - P. 117- 125.

34.Gaspar-Maia A, Alajem A, Polesso F, Sridharan R, Mason MJ, Heidersbach A, Ramalho-Santos J, McManus MT, Plath K, Meshorer E, Ramalho-Santos M. Chdl regulates open chromatin and pluripotency of embryonic stem cells. // Nature. -2009. - V. 460(7257). - P. 863 - 868.

35.Greenhough S, Medine CN, Hay DC. Pluripotent stem cell derived hrpatocyte like cells and their potential in toxicity screening. // Toxicology. - 2010. - V. 278(3). - P. 250 - 255.

36.Grinnell KL, Yang B, Eckert RL, Bickenbach JR. De-differentiation of mouse interfollicular keratinocytes by the embryonic transcription factor Oct-4. // J. Invest. Dermatol. - 2007. - V. 127(12). - P. 372 - 380.

37.Gutierrez-Aranda I, Ramos-Mejia V, Bueno C, Munoz-Lopez M, Real PJ, Macia A, Sanchez L, Ligero G, Garcia-Parez JL, Menendez P. Human induced pluripotent stem cells develop teratoma more efficiently and faster than human embryonic stemcells regardless the site of injection. // Stem Cells. - 2010. - V. 28(9). - P. 15681570.

38.Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, Sun CW, Meissner A, Cassady JP, Beard C, Brambrink T, Wu LC, Townes TM, Jaenisch R. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. // Science. - 2007. - V. 318(5858). - P. 1920- 1923.

39.Hartfield EM, Fernandes HJ, Vowles J, Cowley SA, Wade-Martins R. Cellular reprogramming: a new approach to modelling Parkinson's disease. // Biochem Soc Trans.-2012,-V. 40(5). - P. 1152 - 1157.

40.Higgins C, Ito M, Inoue K, Richardson G, Jahoda K, Cristiano A. Generation of indused pluripotent stem cells by reprogramming human dermal papilla cells. 2010. Materials of 6th World congress for hair research. Carins Convention Centre. -Cairns. Australia.

41. Higgins C, Ito M, Inoue K, Richardson G, Jahoda K, Cristiano A. Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into indused pluripotent stem cells. J. Invest. // Dermatol. - 2012. - V. 132(6). - P. 1725 - 1727.

42.Ho R, Chronis C, Plath K. Mechanistic insights into reprogramming to induced pluripotency. // J. Cell Physiol. - 2011. - V. 226(4). - P. 868 - 878.

43.Huangfu D, Maehr R, Guo W, Eijkelenboom A, Snitow M, Chen AE, Melton DA. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. //Nat Biotechnol. - 2008. - V. 26(7). - P. 795 - 797.

44.Hyslop L, Stojkovic M, Armstrong L, Walter T, Stojkovic P, Przyborski S, Herbert M, Murdoch A, Strachan T, Lako M. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. // Stem Cells. - 2005. - V. 23(8). - P. 1035 - 1043.

45Jia F, Wilson KD, Sun N, Gupta DM, Huang M, Li Z, Panetta NJ, Chen ZY, Robbins RC, Kay MA, Longaker MT, Wu JC. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. // Nat. Methods. - 2010. - V. 7(3). - P. 197 - 199.

46.Kaji K, Norrby K, Paca A, Mileikovsky M, Mohseni P, Woltjen K. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. // Nature. - 2009. - 458. - P. 771 - 775.

47.Kawamura M, Miyagawa S, Miki K, Saito A, Fukushima S, Higuchi T, Kawamura T, Kuratani T, Daimon T, Shimizu T, Okano T, Sawa Y. Feasibility, safety, and therapeutic efficacy of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte sheets in a porcine ischemic cardiomyopathy model. // Circulation. - 2012. - V. 126(7239).-P. 29 - 37.

48.Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. // Genes Dev. - 2005. - V. 19(10). - P. 1129-1155.

49.Kim D, Kim CH, Moon JI, Chung YG, Chang MY, Han BS, Ko S, Yang E, Cha KY, Lanza R, Kim KS. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. // Cell Stem Cell. - 2009. - V. 4(6). - P. 472 - 476.

50.Kim J, Chu J, Shen X, Wang J, Orkin SH. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. // Cell. - 2008. - V. 132(6). - P. 1049-1061.

51.Kim J.B., Sebastiano V., Wu G., Arauzo-Bravo M.J., Sasse P., Gentile L., Ko K., Ruau D., Ehrich M., van den Boom D., Meyer J., Hubner K., Bernemann C., Ortmeier C., Zenke M., Fleischmann B.K., Zaehres H., Scholer H.R. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. // Cell. - 2009. - V. 136(3). P. 411-419.

52.Kim JB, Zaehres H, Araüzo-Bravo MJ, Schöler HR. Generation of induced pluripotent stem cells from neural stem cells. // Nat. Protoc. - 2009. - V. 4(10). - P. 1464 - 1470.

53.Kim K, Doi A, Wen B, Ng K, Zhao R, Cahan P, Kim J, Aryee MJ, Ji H, Ehrlich LI, Yabuuchi A, Takeuchi A, Cunniff KC, Hongguang H, McKinney-Freeman S, Naveiras O, Yoon TJ, Irizarry RA, Jung N, Seita J, Hanna J, Murakami P, Jaenisch R, Weissleder R, Orkin SH, Weissman IL, Feinberg AP, Daley GQ. Epigenetic

memory in induced pluripotent stem cells. // Nature. 2010. - V. 467(7313). - P. 285 -290.

54.Krohne TU, Westenskow PD, Kurihara T, Friedlander DF, Lehmann M, Dorsey AL, Li W, Zhu S, Schultz A, Wang J, Siuzdak G, Ding S, Friedlander M.Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. // Stem Cells Transí Med. - 2012. - V. 1(2). -P. 96- 109.

55.Kunarso G, Chia NY, Jeyakani J, Hwang C, Lu X, Chan YS, Ng HH, Bourque G. Transposable elements have rewired the core regulatory network of human embryonic stem cells. //Nat. Genet. - 2010. -V. 42(7). - P. 631-634.

56.Kuroda T, Tada M, Kubota H, Kimura H, Hatano SY, Suemori H, Nakatsuji N, Tada T. Octamer and Sox elements are required for transcriptional cis regulation of Nanog gene expression. // Mol Cell Biol. - 2005. - V. 25(6). - P. 2475 - 2485.

57.Lagarkova M.A., Shutova M.V., Bogomazova A.N., Vassina E.M., Glazov E.A., Zhang P., Rizvanov A.A., Chestkov I.V., Kiselev S.L. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. // Cell Cycle. -2010. -V. 9(5).-P. 937-946.

58.Laurent LC, Ulitsky I, Slavin I, Tran H, Schork A, Morey R, Lynch C, Harness JV, Lee S, Barrero MJ, Ku S, Martynova M, Semechkin R, Galat V, Gottesfeld J, Izpisua Belmonte JC, Murry C, Keirstead HS, Park HS, Schmidt U, Laslett AL, Muller FJ, Nievergelt CM, Shamir R, Loring JF. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. // Cell Stem Cell. - 2011. - V. 8(1). - P. 106 - 118.

59.Li H, Collado M, Villasante A, Strati K, Ortega S, Cañamero M, Blasco MA, Serrano M. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. // Nature. 2009. - V. 460(7259). - P. 1136 - 1139.

60.Liu H, Zhang SC. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. // Cell Mol Life Sci. - 2011. - V. 68(24). - P. 3995 - 4008.

61.Li R, Liang J, Ni S, Zhou T, Qing X, Li H, He W, Chen J, Li F, Zhuang Q, Qin B, Xu J, Li W, Yang J, Gan Y, Qin D, Feng S, Song H, Yang D, Zhang B, Zeng L, Lai L,Esteban MA, Pei D. A mesenchymal-to-epithelial transition initiates and is required for the nuclear reprogramming ofmouse fibroblasts. // Cell Stem Cell. -2010.-V. 7(1).-P. 51 -63.

62.Li W, Zhou H, Abujarour R, Zhu S, Young Joo J, Lin T, Hao E, Scholer HR, Hayek

A, Ding S. Generation of human-induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2. // Stem Cells. - 2009. - V. 27(12). - P. 2992 - 3000.

63.Lin SL, Ying SY. Mechanism and method for generating tumor-free iPS cells using intronic microRNA miR-302 induction. // Methods Mol Biol. - 2013. - V. 936. - P. 295 - 312.

64.Lister R, Pelizzola M, Kida YS, Hawkins RD, Nery JR, Hon G, Antosiewicz-Bourget J, O'Malley R, Castanon R, Klugman S, Downes M, Yu R, Stewart R, Ren

B, Thomson JA, Evans RM, Ecker JR. Hotspots of aberrant epigenomic reprogramming in human induced pluripotent stem cells. // Nature. - 2011. - V. 471(7336). - P. 68 - 73.

65.Loh YH, Wu Q, Chew JL, Vega VB, Zhang W, Chen X, Bourque G, George J, Leong B, Liu J, Wong KY, Sung KW, Lee CW, Zhao XD, Chiu KP, Lipovich L, Kuznetsov VA, Robson P, Stanton LW, Wei CL, Ruan Y, Lim B, Ng HH. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. //Nat. Genet. - 2006. - V. 38(4). - P. 431 - 440.

66.Lopez-Gonzalez R, Velasco I. Therapeutic potential of motor neurons differentiated from embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.// Arch. Med. Res. -2012.-V. 43(1).-P. 1-10.

67.Maekawa M, Yamaguchi K, Nakamura T, Shibukawa R, Kodanaka I, Ichisaka T, Kawamura Y, Mochizuki H, Goshima N, Yamanaka S. Direct reprogramming of

somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glisl.// Nature. - 2011. -V. 474(7350). - P. 225 - 229.

68.Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, Utikal J, Cowan C, Hochedlinger K. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. // Cell Stem Cell. - 2008. - V. 11(3). - P. 340 - 345.

69.Mali P, Chou BK, Yen J, Ye Z, Zou J, Dowey S, Brodsky RA, Ohm JE, Yu W, Baylin SB, Yusa K, Bradley A, Meyers DJ, Mukherjee C, Cole PA, Cheng L. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. // Stem Cells. - 2010. - V. 28(4). - P. 713 - 720.

70.Marchetto MC, Yeo GW, Kainohana O, Marsala M, Gage FH, Muotri AR. Transcriptional signature and memory retention of human-induced pluripotent stem cells. // PLoS One. - 2009. - V. 4(9). - P. e7076.

71.Marro S., Pang Z.P., Yang N., Tsai M.C., Qu K., Chang H.Y., Südhof T.C., Wering M. Direct lineage conversion of terminally differentiated hepatocytes to functional neurons. // Cell Stem Cell. - 2011. - V. 9(4). - P. 374 - 382.

72.Mathew R, Jia W, Sharma A, Zhao Y, Clarke LE, Cheng X, Wang H, Salli U, Vrana KE, Robertson GP, Zhu J, Wang S. Robust activation of the human but not mouse telomerase gene during the induction of pluripotency. // FASEB J. - 2010. - 24. - P. 2702 -2715.

73.Medvedev SP, Grigor'eva EV, Shevchenko AI, Malakhova AA, Dementyeva EV, Shilov AA, Pokushalov EA, Zaidman AM, Aleksandrova MA, Plotnikov EY, Sukhikh GT, Zakian SM. Human induced pluripotent stem cells derived from fetal neural stem cells successfully undergo directed differentiation into cartilage. // Stem Cells Dev. - 2011. - V. 20(8). - P. 1099 - 1112.

74.Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X, Ku M, Wernig M, Schorderet P, Bernstein BE, Jaenisch R, Lander ES, Meissner A. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. //Nature. - 2008. - V. 454(7205). - P. 49 - 55.

75.Mitalipov S, Wolf D. Totipotency, pluripotency and nuclear reprogramming. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. - 2009. - V. 114. - P. 185 - 199.

76.Miura K, Okada Y, Aoi T, Okada A, Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Ohnuki M, Ogawa D, Ikeda E, Okano H, Yamanaka S. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. // Nat Biotechnol. - 2009. - V. 27(8). - P. 743-745.

77.Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. // Nat. Biotechnol. - 2008. -V. 26(1). - P. 101 - 106.

78.Narsinh KH, Sun N, Sanchez-Freire V., Lee AS, Almeida P, Hu S, Jan T, Wilson KD, Leong D, Rosenberg J, Yao M, Robbins RC, Wu JC. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. // J Clin Invest. -2011,-V. 121(3). - P. 1217-1221.

79.Niwa H. How is pluripotency determined and maintained? // Development. - 2007. -V. 134(4).-P. 635 -646.

80.Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. // Nature Genetics. -2000. -V. 24(4). - P. 372 -376.

81.0huama M, Kobayashi T, Sasaki T, Shimizu A, Amagai M. Restoration of the intrinsic properties of human dermal papilla in vitro. // J. Cell Sci. - 2012. - V. 125(Pt 17).-P. 4114-4125.

82.Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. //Nature. - 2007. - V. 448(7151). - P. 313 - 317.

83.Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. // Science. - 2008. - V. 322. - P. 949 - 953.

84.Oliver R. F. The experimental induction of whisker growth in the hooded rat by implantation of dermal papillae. // J Embryol Exp Morphol. - 1967. - V. 18(1). - P. 43-51.

85,Ono M, Hamada Y, Horiuchi Y, Matsuo-Takasaki M, Imoto Y, Satomi K, Arinami T, Hasegawa M, Fujioka T, Nakamura Y, Noguchi E. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a sendai virus vector. // PLoS One. - 2012. - V. 7(8). - P. e42855.

86.Park IH, Arora N, Huo H, Maherali N, Ahfeldt T, Shimamura A, Lensch MW, Cowan C, Hochedlinger K, Daley GQ. Disease-specific induced pluripotent stem cells. // Cell. - 2008. - V. 134(5). - P. 877-886

87.Pereira CF, Piccolo FM, Tsubouchi T, Sauer S, Ryan NK, Bruno L, Landeira D, Santos J, Banito A, Gil J, Koseki H, Merkenschlager M, Fisher AG. ESCs require PRC2 to direct the successful reprogramming of differentiated cells toward pluripotency. // Cell Stem Cell. - 2010. - V. 6(6). - P. 547 - 556.

88.Pfisterer U, Kirkeby A, Torper O, Wood J, Nelander J, Dufour A, Bjorklund A, Lindvall O, Jakobsson J, Parmar M. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2011. - V. 108(25). - P. 10343 - 10348.

89.Prokhorova, T. A., L. M. Harkness, U. Frandsen, N. Ditzel, H. D. Schroder, J. S. Burns, M. Kassem. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. // Stem Cells Dev. - 2009. -18(1).-P. 47 - 54.

90.Qin D, Gan Y, Shao K, Wang H, Li W, Wang T, He W, Xu J, Zhang Y, Kou Z, Zeng L, Sheng G, Esteban MA, Gao S, Pei D. Mouse meningiocytes express Sox2 and yield high efficiency of chimeras after nuclear reprogramming with exogenous factors. // J. Biol. Chem. - 2008. - V. 283(48). - P. 33730 - 33735.

91.Qiu D, Xiang J, Li Z, Krishnamoorthy A, Chen L, Wang R. Profiling TRA-1-81 antigen distribution on a human embryonic stem cell. // Biochem Biophys Res Commun. - 2008. - V. 369(2). - P. 735-740.

92.Racila D, Winter M, Said M, Tomanek-Chalkley A, Wiechert S, Eckert RL, Bickenbach JR. Transient expression of OCT4 is sufficient to allow human keratinocytes to change their differentiation pathway. // Gene Ther. - 2010. - V. 18(3).-P. 294 - 303.

93.Ralston A, Rossant J. The genetics of induced pluripotency. // Reproduction. - 2010. -V. 139(1). - P. 35 - 44.

94.Raya A, Rodriguez-Pizä I, Guenechea G, Vassena R, Navarro S, Barrero MJ, Consiglio A, Castellá M, Río P, Sleep E, González F, Tiscornia G, Garreta E, Aasen T, Veiga A, Verma IM, Surrallés J, Bueren J, Izpisúa Belmonte JC. Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. // Nature. - 2009. - V. 460(7251). - P. 53 - 59.

95.Rendl M., Polak L., Fuchs E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. // Genes Develop. - 2008. - V. 22. - P. 543— 557.

96.Riggs JW, Barrilleaux B, Varlakhanova N, Bush K, Chan V, Knoepfler P. Induced pluripotency and oncogenic transformation are related processes. Stem Cells Dev. 2013. -V. 22(1). - P. 37-50.

97.Rocha CR, Lerner LK, Okamoto OK, Marchetto MC, Menck CF. The role of dna repair in the pluripotency and differentiation of human stem cells. // Mutat Res. -2013. -V. 752(1). - P. 25-35.

98.Rodda DJ, Chew JL, Lim LH, Loh YH, Wang B, Ng HH, Robson P. Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280(26). - P. 24731 -24737.

99.Rosenfeld N, Elowitz MB, Alón U. Negative autoregulation speeds the response times of transcription networks. // J. Mol. Biol. - 2002. - V. 323(5). - P. 785 - 793.

100. Rowland BD, Bernards R, Peeper DS. The KLF4 tumour suppressor is a transcriptional repressor of p53 that acts as a context-dependent oncogene. // Nature Cell Biology. - 2005. - V. 7(11). - P. 1074 - 1082.

101. Scheper W, Copray S. The molecular mechanism of induced pluripotency: a two-stage switch. // Stem Cell Rev. - 2009. - V. 5(3). - P. 204 - 223.

102. Seoane J, Le HV, Massagué J. Myc suppression of the p21(Cipl) Cdk inhibitor influences the outcome of the p53 response to DNA damage. // Nature. -2002. - V. 419(6908). - P. 729 - 734.

103. Sharma A, Wu JC. MicroRNA Expression Profiling of Human-Induced Pluripotent and Embryonic Stem Cells. // Methods Mol Biol. - 2013. - V. 936. - P. 247 - 56.

104. Shi Y, Do JT, Desponts C, Hahm HS, Schôler HR, Ding S. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. // Cell Stem Cell. - 2008. - V. 2(6). - P. 525 -528.

105. Singhal N, Graumann J, Wu G, Araur Zo-Bravo MJ, Han DW, Greber B, Gentile L, Mann M, Schoë Ler HR. Chromatinremodeling components of the baf complex facilitate reprogramming. // Cell. - 2010. - V. 141(6). - P. 943-955.

106. Soda Y, Marumoto T, Friedmann-Morvinski D, Soda M, Liu F, Michiue H, Pastorino S, Yang M, Hoffman RM, Kesari S, Verma IM. Transdifferentiation of glioblastoma cells into vascular endothelial cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. -2011,-V. 108(11). - P. 4274 -4280.

107. Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, Gao Q, Bell GW, Cook EG, Hargus G, Blak A, Cooper O, Mitalipova M, Isacson O, Jaenisch R. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. // Cell. - 2009. - 136(5). - P. 964-977.

108. Sommer CA, Stadtfeld M, Murphy GJ, Hochedlinger K, Kotton DN, Mostoslavsky G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. // Stem Cells. - 2009. - V. 27(3). - P. 543 - 549.

109. Sridharan R, Tchieu J, Mason MJ, Yachechko R, Kuoy E, Horvath S, Zhou Q, Plath K. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. // Cell. - 2009. - V. 136(2). - P. 364-377.

110. Stadtfeld M, Apostolou E, Akutsu H, Fukuda A, Follett P, Natesan S, Kono T, Shioda T, Hochedlinger K. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qFl in mouse induced pluripotent stem cells. // Nature. - 2010. - V. 465(7295). -P. 175 - 181.

111. Stadtfeld M, Maherali N, Breault DT, Hochedlinger K. Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse. // Cell Stem Cell. - 2008. - V. 2(3). - P. 230 - 240.

112. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. // Science. - 2008. - V. 322(5903).-P. 945 - 349.

113. Sullivan GJ, Hay DC, Park IH, Fletcher J, Hannoun Z, Payne CM, Dalgetty D, Black JR, Ross J A, Samuel K, Wang G, Daley GQ, Lee JH, Church GM, Forbes SJ, Iredale JP, Wilmut I. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. // Hepatology. - 2010. - V. 51(1). - P. 329-335.

114. Tada M, Takahama Y, Abe K, Nakatsuji N, Tada T. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. // Curr. Biol. - 2001. - V. 11(19). - P. 1553-1558

115. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. // Cell. - 2007. - V. 131(5). - P. 861 - 872.

116. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. // Cell. - 2006. - V. 126. -P. 663 - 676.

117. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. // Science. - 1998. - V. 282(5391). - P. 1145 - 1147.

118. Tsai SY, Bouwman BA, Ang YS, Kim SJ, Lee DF, Lemischka IR, Rendl M. Stem Cells. Single transcription factor reprogramming of hair follicle dermal papilla cells to induced pluripotent stem cells. // Stem Cell Rev. - 2011. - V. 29(6). - P. -964-971.

119. Tsutsui H, Valamehr B, Hindoyan A, Qiao R, Ding X, Guo S, Witte ON, Liu X, Ho CM, Wu H. Optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. // Nat. Commun. - 2011. - V. 2. - P. 167.

120. Urbach A, Bar-Nur O, Daley GQ, Benvenisty N. Differential modeling of fragile X syndrome by human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.// Cell Stem Cell. - 2010. - V. 6(5). - P. 407 -411.

121. Utikal J, Polo JM, Stadtfeld M, Maherali N, Kulalert W, Walsh RM, Khalil A, Rheinwald JG, Hochedlinger K. Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells. // Nature. - 2009. - V. 460(7259). - P. 1145 -1148.

122. Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Stidhof TC, Wernig M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. // Nature. -2010.-V. 463(7284). - P. 1035 - 1041.

123. Viswanathan SR, Daley GQ, Gregory RI. Selective blockade of microRNA processing by Lin28. // Science. - 2008. - V. 320(5872). - P. 97-100.

124. Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. // Nature. - 1998. - V. 394(6691). - P. 369 - 374.

125. Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, Lau F, Ebina W, Mandal PK, Smith ZD, Meissner A, Daley GQ, Brack AS, Collins JJ, Cowan C, Schlaeger TM,

Rossi DJ. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. // Cell Stem Cell. -2010.-V. 7(5).-P. 618 - 630.

126. Wernig M, Meissner A, Cassady J P, Jaenisch R. c-Myc is dispensible for direct reprogramming of mouse fibroblasts. // Cell Stem Cell. - 2008. - V. 2(1). - P. 10-12.

127. Wernig M, Meissner A, Foreman R, Brambrink T, Ku M, Hochedlinger K, Bernstein BE, Jaenisch R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. //Nature. - 2007. - V. 448(7151). - P. 318 - 324.

128. Wernig M, Zhao JP, Pruszak J, Hedlund E, Fu D, Soldner F, Broccoli V, Constantine-Paton M, Isacson O, Jaenisch R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2008. - V. 105(15). - P. 5856-5861.

129. Wilmut I, Schnieke AE, Mcwhir J, Kind AJ, Campbell KH. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. // Nature. - 1997. - V. 385(6619). - P. 810 - 813.

130. Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, Desai R, Mileikovsky M, Hamalainen R, Cowling R, Wang W, Liu P, Gertsenstein M, Kaji K, Sung HK, Nagy A. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Nature. -2009. - V. 458(7239). - P. 766 - 770.

131. Yakubov E, Rechavi G, Rozenblatt S, Givol D. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors. Biochem. // Biophys. Res. Commun. - 2010. - V. 394(1). - P. 189 - 193.

132. Yehezkel S, Rebibo-Sabbah A, Segev Y, Tzukerman M, Shaked R, Huber I, Gepstein L, Skorecki K, Selig S. Reprogramming of telomeric regions during the generation of human induced pluripotent stem cells and subsequent differentiation into fibroblast-like derivatives. // Epigenetics. - 2011. - V. 6(1). - P. 63 - 75.

133. Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. // Science. - 2009. - V. 324(5928). - P. 797-801.

134. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. // Science. - 2007. - V. 318(5858). - P. 1917-1920.

135. Yuan X, Wan H, Zhao X, Zhu S, Zhou Q, Ding S. Brief Report: Combined Chemical Treatment Enables Oct4-Induced Reprogramming from Mouse Embryonic Fibroblasts. // Stem Cells. - 2011. - V. 29(3). - P. 549 - 553.

136. Zhang W.Y.; de Almeida P.E.; Wu J.C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. // StemBook. 2012.

137. Zhang Z, Gao Y, Gordon A, Wang ZZ, Qian Z, Wu WS. Efficient generation of fully reprogrammed human iPS cells via polycistronic retroviral vector and a new cocktail of chemical compounds. //PLoS One. - 2011. - V. 6(10). - P. e26592.

138. Zhao HX, Li Y, Jin HF, Xie L, Liu C, Jiang F, Luo YN, Yin GW, Li Y, Wang J, Li LS, Yao YQ, Wang XH. Rapid and efficient reprogramming of human amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT4/SOX2/NANOG. // Differentiation. - 2010. - V. 80(203). - P. 123 - 129.

139. Zhao T, Zhang ZN, Rong Z, Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. // Nature. - 2011. - V. 474(7350). - P. 212 - 215.

140. Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Scholer HR, Duan L, Ding S. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. // Cell Stem Cell. - 2009. - V. 4(5). - P. 381 -384.

141. Zhou Q, Brown J, Kanarek A, Rajagopal J, Melton DA. Nature. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to P-cells. // Nature. - 2008. - V. 455(7213). - P. 627-632.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признтельность своему научному руководителю Андрею Валентиновичу Васильеву, а также заведующему лабораторией проблем клеточной пролиферации ИБР РАН Василию Васильевичу Терских и Эрдэму Баировичу Дашинимаеву за возможность заниматься темой диссертации, ценные советы и рекомендации, как при постановке экспериментов, так и при обсуждении результатов и при подготовке публикаций. Автор выражает благодарность всему коллективу лаборатории проблем клеточной пролиферации ИБР РАН за помощь и дружескую поддержку. Отдельно хочется поблагодарить Екатерину Андреевну Воротеляк за предоставленную возможность заниматься клетками дермальной папиллы человека.

Автор благодарит Алексея Николаевича Томилина (ИЦ РАН) за предоставленные плазмиды для репрограммирования, Егора Евгеньевича Егорова (ИМБ РАН) за предоставленную линию клеток 1608ЬТ, Сергея Львовича Киселева (ИОГен РАН) за предоставленную линию эмбриональных стволовых клеток, Юлию Евгеньевну Кравченко (ИМБ РАН) за возможность работать с бестимусными животными, Аллу Викторовну Кузнецову (ИБР РАН) за помощь в гистологическом исследовании и дружескую поддержку.

Особую благодарность автор выражает своим родителям за помощь и поддержку.