Роль белков hnRNP-K и Pcbp1 в плюрипотентных стволовых клетках мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Бахмет Евгений Игоревич

• Бахмет Евгений Игоревич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Бахмет Евгений Игоревич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Цель и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна

Теоретическое и практическое значение работы

Личный вклад автора

Апробация работы

Финансовая поддержка работы

Объем и структура диссертации

Список публикаций по теме работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плюрипотентные стволовые клетки

1.1.1 Плюрипотентные стволовые клетки в эмбриогенезе

1.1.2 Наивная, промежуточная и праймированная плюрипотентность

1.2 Регуляция экспрессии Oct4

1.3 KH-доменные PolyC-связывающие белки

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Культивирование клеток

2.2 Хроматин-иммунопреципитация

2.3 Генные конструкции и их модификации

2.4 Нокаут и нокдаун генов

2.5 Трансфекция и трансдукция клеток

2.6 Выделение и количественный анализ РНК

2.7 Вестерн-блоттинг

2.8 Иммуноцитохимическое окрашивание клеток

2.9 Сортировка клеток и окрашивание для проточной цитометрии

2.10 Тератомный тест

2.11 Приготовление метафазных пластинок

2.12 Биоинформатическая обработка ChIP-seq и статистический анализ

Таблица 1. Использованные в работе олигонуклеотиды

Таблица 2. Использованные в работе антитела

Таблица 3. Использованные в работе опубликованные данные ChIP-seq. . . . 39 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 PolyC-связывающие белки как потенциальные регуляторы транскрипции гена Рвы5/1

3.2 Роль ЬпК№-К в ЭСК

3.2.1 Уровень hnRNP-K не влияет на экспрессию ОС4 в ЭСК и при их дифференцировке

3.2.2 Невозможность оверэкспрессии кпКЫР-К в ЭСК

3.2.3 кпКЫР-К является маркером открытого хроматина

3.3 Роль РсЬр1 в ЭСК

3.3.1 ЭСК, нокаутные по Pcbp1 жизнеспособны и остаются плюрипотентными

3.3.2 ЭСК, нокаутные по Pcbp1 гибнут во время перехода в праймированное

состояние

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Регуляция экспрессии гена Рвы5А

4.2 Значение каК^^ для плюрипотентных стволовых клеток

4.3 Значение Pcbp1 для ПСК

ВЫВОДЫ

Список литературы

Благодарности

Список используемых сокращений

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ЭпиПК - эпибластоподобные стволовые клетки

ЭпиСК - эпибластные стволовые клетки

ПСК - плюрипотентные стволовые клетки

иПСК - индуцированные плюрипотентные клетки

ППК - первичные половые клетки

ПААГ - полиакриламидный гель

ВКМ - внутренняя клеточная масса

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль белков hnRNP-K и Pcbp1 в плюрипотентных стволовых клетках мыши»

Актуальность работы

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) впервые были успешно выделены в 1981 году двумя независимыми группами учёных [1, 2]. С тех пор ПСК активно изучаются во всём мире, накоплено множество новых фактов о фундаментальных принципах, которые лежат в основе их функционирования. Существует довольно много работ, посвящённых их прикладному значению для регенеративной медицины. Этот уникальный по своим свойствам тип клеток характеризуется способностью к самообновлению и к дифференцировке во все типы соматических клеток. В то время как в эмбриогенезе ПСК существуют в сравнительно короткий промежуток времени (3,5-7,5 сутки развития у мыши, 6-12 сутки развития у человека), при соблюдении определённых условий такие клетки можно культивировать неограниченное время in vitro. Эта возможность «удерживать» ПСК в плюрипотентном состоянии открыла огромные возможности для их изучения, для выявления функций отдельных генов в клеточной плюрипотентности.

Несмотря на популярность и всестороннее изучение темы на

протяжении нескольких десятилетий, продолжают появляться очень крупные

фундаментальные открытия, касающиеся плюрипотентных стволовых клеток,

выявляются их отдельные типы. Так, в 2007 году было обнаружено, что

существуют ранние (наивные) и поздние (праймированные) ПСК [3, 4]. Такое

разделении на типы плюрипотентности не является условным, но отражает

отличия в сигналинге, в экспрессии различных маркеров, а наивные и

праймированные ПСК представлены in vivo на разных стадиях эмбриогенеза.

ПСК обоих типов можно стабильно культивировать in vitro. При этом клетки

в состоянии наивной плюрипотентности обозначаются как эмбриональные

стволовые клетки (ЭСК), а в состоянии праймированной плюрипотентности -

как эпибластные стволовые клетки (ЭпиСК). В 2011 году был дополнительно

описан третий, промежуточный тип плюрипотентности, названный

6

формативной, а соответствующие культивируемые клетки были обозначены как эпибластоподобные стволовые клетки (ЭпиПК) [5].

Огромный прорыв в теме ПСК и в биологии в целом произошёл в 2006 году в связи открытием индуцированной плюрипотентности [6]. Эта работа наглядно продемонстрировала возможность, с помощью определённых факторов, вернуть дифференцированную клетку обратно в плюрипотентное состояние. Исследование открыло новые горизонты для регенеративной медицины, т. к. стало возможным получать ПСК из дифференцированных клеток самого пациента в обход этических проблем, связанных с их получением из эмбрионов. Кроме того, иПСК являются удобной моделью для изучения различных наследственных заболеваний - у пациента с патологией определённой ткани можно получить иПСК, in vitro дифференцировать их в нужный тип клеток и тестировать на них различные способы лечения.

Oct4 является ключевым транскрипционным фактором плюрипотентных стволовых клеток. Как повышение, так и понижение его экспрессии ведёт к дифференцировке [7]. Кодирующий Oct4 ген Pou5f1 имеет три регуляторных участка - промотор, проксимальный энхансер и дистальный энхансер. Было показано, что в зависимости от стадии развития и типа плюрипотентных клеток, активность энхансеров отличается: в ранних (наивных) ПСК работает дистальный, а в поздних (праймированных) ПСК -проксимальный энхансер [8].

В последнее время отмечается рост количества работ, в которых используются методы, связанные с большими объёмам данных - RNA-seq, ChIP-seq, ATAC-seq и т. д. Составляются глобальные паттерны экспрессии генов различных типов клеток, изучается распределение транскрипционных факторов по геному. При этом остаётся довольно мало работ, в которых исследуется, например, регуляция конкретного гена. Так, для Pou5f1 ещё в 1996 году было показано, что PolyC-сайты дистального и проксимального энхансеров ПСК оккупированы неизвестными белками [9]. В 2005 году

7

выяснилось, что эти белки присутствуют не только в плюрипотентных, но и в дифференцированных клетках [10]. Наконец, в нашей лаборатории было показано, что белки, способные in vitro связываться с PolyC-последовательностью сайта 2А дистального энхансера присутствуют в различных тканях мыши [11], и они являются представителями семейства KH-доменных PolyC-связывающих белков - hnRNP-K, Pcbp1 и Pcbp2. Эти белки принимают участие во множестве различных процессов, включая транскрипцию, процессинг мРНК, сплайсинг, регуляцию трансляции и т. д. Среди биологических функций в литературе представлена их роль в эмбриогенезе, дифференцировке, а также их онкосупрессорные и онкогенные свойства. Такой спектр функций значительно усложняет изучение их работы в каком-либо одном конкретном процессе. Настоящее исследование посвящено изучению функций белков hnRNP-K и Pcbp1 в регуляции экспрессии Oct4, равно как и их роли в плюрипотентных стволовых клетках мыши в целом.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является изучение роли белков hnRNP-K и Pcbp1 в плюрипотентных стволовых клетках мыши.

Задачи:

1. С помощью метода хроматин-иммунопреципитации проверить факт связывания исследуемыми белками регуляторных сайтов гена Pou5f1 in vivo.

2. Методами генного нокдауна и нокаута проверить значимость hnRNP-K и Pcbp1 для экспрессии Oct4, а также для плюрипотентных стволовых клеток в целом.

3. Изучить характер распределения hnRNP-K в геноме плюрипотентных клеток с помощью метода ChIP-seq.

4. Выявить значимость исследуемых белков в процессе перехода ПСК от наивного состояния плюрипотентности к праймированному.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Белки hnRNP-K и Pcbpl связывают in vivo PolyC-последовательности дистального и проксимального энхансеров (сайты 2А и 1А, соответственно).

2. Нокаут и нокдаун hnRNP-K в ЭСК не ведёт к значимым изменениям в экспрессии Oct4. Как плюрипотентные, так и дифференцированные клетки, нокаутные по hnRNP-K, погибают в течение 15 суток. Нокаут Pcbpl также не ведёт к достоверным отличиям в экспрессии Oct4, однако, приводит к значимому увеличению коэффициента вариации экспрессии этого белка внутри клеточной популяции. Нокаутные по Pcbpl ЭСК жизнеспособны и остаются плюрипотентными.

3. Белок hnRNP-K имеет около 5311 сайтов связывания в геноме ЭСК, при этом часто колокализуется с такими белками как TBP, Oct4, Sox2, Nanog и др. Кроме того, hnRNP-K колокализуется с гистоновыми метками активно транскрибируемого генома, а также открытыми участками хроматина.

4. Pcbpl необходим для перехода ПСК из состояния наивной плюрипотентности в праймированную. Так, на 4-5 сутки дифферецировки Pcbp1-/- ЭСК в ЭпиПК in vitro наблюдается массовая клеточная гибель, чему предшествует существенный всплеск экспрессии маркеров первичной энтодермы.

Научная новизна работы. Все полученные данные являются принципиально новыми. Впервые было показано, что представители KH-доменных белков связываются с дистальным и проксимальным энхансерами Pou5f1, однако их отсутствие не сказывается на уровне экспрессии этого гена. Продемонстрировано, что hnRNP-K является маркером открытого и транскрипционно активного хроматина в ЭСК. Показано, что Pcbpl необходим для нормального перехода плюрипотентных стволовых клеток из наивного в праймированное состояние. Полученные результаты частично объясняют ранний летальный фенотип эмбрионов мыши, нокаутных по hnRNP-K или по Pcbpl.

Теоретическое и практическое значение работы. Представленная работа имеет фундаментальный характер, и проливает свет на функции KH-доменных белков в плюрипотентных стволовых клетках. Полученные данные демонстрируют важную роль hnRNP-K и Pcbpl в эмбриогенезе, в регуляции «созревания» ПСК при прохождении различных стадиий плюрипотентности. Понимание фундаментальных принципов функционирования ПСК будет способствовать их применению в регенеративной медицине. Результаты работы опубликованы в международных рецензируемых научных изданиях.

Личный вклад автора. Основные результаты представленной работы получены автором лично. Пилотные работы по идентификации белков, способных связываться с сайтом 2А in vitro были проведены И. Б. Назаровым, масс-спектрометрический анализ был сделан Т. О. Артамоновой. Н. Е. Воробьёва оказывала помощь в постановке метода хроматин-иммунопреципитации, а также занималась синтезом библиотек для последующего NGS-секвенирования. А. А. Кузьмин оказывал помощь в дизайне олигонуклеотидов для нокдауна и нокаута генов, а также в постановке этих экспериментов. Тератомный тест и анализ окрашенных срезов осуществлялся совместно с С. В. Пономарцевым и с П. А. Дыбаном. Сортировка клеток и проточная цитометрия осуществлялась совместно с Н. Д.

Аксёновым. Биоинформатический анализ проводился совместно с А. Р. Газизовой. Планы экспериментов и результаты работ обсуждались совместно с А. Н. Томилиным

Апробация работы. Результаты работы были представлены на трёх российских конференциях - XVIII Зимней молодёжной школе по биофизике и молекулярной биологии (ПИЯФ, 2017), VI Молодёжной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института Цитологии РАН (ИНЦ РАН, 2018), III Национальном конгрессе по регенеративной медицине (МГУ, 2017), а также на четырёх международных конференциях - Cell technologies at the edge: research and practice (CTERP, Saint-Petersburg, 2016), «Saint Petersburg OPEN 2017» 4th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics Engineering and Nanostructures (Saint-Petersburg, 2017), CTERP (Moscow, 2018), 43rd FEBS Congress (Speed Talk, Prague, Czech, 2018).

Финансовая поддержка работы. Основная часть работы сделана в рамках гранта РНФ №17-14-01407 (Роль и механизм действия KH-доменных факторов в плюрипотентных стволовых клетках). Кроме того, часть работы была поддержана грантом РФФИ №17-00-00324.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 194 ссылки на первоисточники. Работа изложена на 90 страницах, содержит 31 рисунок и 3 таблицы.

Список публикаций по теме работы Статьи:

1) Bakhmet E.I.*, Nazarov I.B.*, Gazizova A.R., Vorobyeva N.E., Kuzmin A.A., Gordeev M.N., Sinenko S.A., Aksenov N.D., Artamonova T.O., Khodorkovskii M.A., Alenina N., Onichtchouk D., Wu G., Scholer H.R., Tomilin A.N. 2019. «hnRNP-K Targets Open Chromatin in Mouse Embryonic Stem Cells in Concert With Multiple Regulators». Stem Cells (WoS IF=5.58). doi: 10.1002/stem.3025

2) Nazarov I.B., Bakhmet E.I., Tomilin A.N. 2019. «KH-Domain Poly(C)-Binding Proteins as Versatile Regulators of Multiple Biological Processes». Biochemistry-Moscow (WoS IF=1.7). doi: 10.1134/S0006297919030039

3) Bakhmet E.I., Nazarov I.B., Artamonova T.O., Tomilin A.N. 2017. «Mass spectrometry for identification of proteins that specifically bind to a distal enhancer of the Oct4 gene». Journal of Physics: Conf. Series. doi: 10.1088/17426596/917/4/042027

Тезисы:

1) Bakhmet E., Artamonova T., Khodorkovsky M., Nazarov I., Tomilin A. 2016. «Isolation of proteins interacting specifically with the distal enhancer of Oct4 gene.». Abstracts for cell technologies at the edge: research and practice (CTERP 2016). P34

2) Бахмет Е.И., Назаров И.Б., Синенко С.А., Артамонова Т.О., Ходорковский М.А., Томилин А.Н. 2017. «Выявление белков, специфично связывающихся с сайтом 2А дистального энхансера гена Oct4» XVIII Зимняя молодежная школа по биофизике и молекулярной биологии. c.72

3) Bakhmet E.I., Nazarov I.B., Artamonova T.O., Khodorkovsky M.A., Tomilin A.N. 2017 «Mass spectrometry for identification of proteins that specifically bind to a distal enhancer of the Oct4 gene» «Saint Petersburg OPEN 2017» 4th International

School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures. P237

4) Бахмет Е.И., Назаров И.Б., Кузьмин А.А., Синенко С.А., Артамонова Т.О., Ходорковский М.А., Томилин А.Н. 2017 «Роль hnRNP-K в регуляции экспрессии Oct-4» III Национальный Конгресс по РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ. Гены & клетки Том XII, № 3

5) Бахмет Е.И., Назаров И.Б., Воробьева Н.Е., Артамонова T.O., Ходорковский М.А., Томилин А.Н. 2018 «ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИ(Ц)-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ДЛЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК» Сборник тезисов VI Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН. СПб., с.10

6) Bakhmet E.I., Nazarov I.B., Vorobyeva N.E., Artamonova T.O., Khodorkovskii M.A., Tomilin A.N. 2018 "Significance of Poly(C)-Binding Proteins for Pluripotent Stem Cells" ОНТОГЕНЕЗ, 2018, том 49, No 4 приложение, с. 4. doi: 10.1134/S0475145018010081

7) Bakhmet E., Nazarov I., Vorobyeva N., Artamonova T., Khodorkovskii M., Tomilin A.. 2018 «Significance of poly(C)-binding proteins for pluripotent stem cells» Abstract title. FEBS Open Bio, 8: Abstract number SpT.01-07. doi: 10.1002/2211-5463.12452

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плюрипотентные стволовые клетки

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) отличаются своей способностью к самообновлению и к дифференцировке во все типы соматических клеток [1]. В эмбриональном развитии мыши ПСК представлены с 3,5 по 7,5 сутки после оплодотворения и обнаруживаются во внутренней клеточной массе ранних бластоцист, а затем и в эпибласте поздних бластоцист и пост-имплантационных эмбрионов [12]. В процессе развития, комбинации сигналов представителей FGF-, BMP-, Wnt-, и Nodal-сигналинга воздействуют на клетки эпибласта, способствуя тем самым выходу из плюрипотентного состояния в различных направлениях дифференцировки [12]. Кроме того, после выделения ПСК из развивающегося эмбриона, эти клетки возможно «фиксировать» в их плюрипотентном состоянии in vitro, с помощью различных факторов, что значительно облегчает их изучение, а также делает их удобной моделью для исследования различных заболеваний [1, 3, 4, 13]. Дифференцировка ПСК в эмбриогенезе в различных направлениях является строго детерминированным последовательным процессом, который зависит поступающих на разных стадиях сигналов [2, 14, 15]. В то же время, in vitro, существует возможность дифференцировки таких клеток в том или ином направлении с использованием различных факторов, добавляемых в среду [16-19]. Ключевыми маркерами ПСК являются Oct4, Nanog, Sox2 [20, 21], но при этом существует целый ряд варьирующих характеристик ПСК в зависимости от их «зрелости», о чём пойдёт речь далее.

Важной вехой в изучении ПСК является открытие индуцированных

плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Такие клетки получили благодаря

экзогенной экспрессии четырёх факторов Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc в

эмбриональных фибробластах мыши [6]. Это открытие доказало, во-первых,

целостность всего генома у терминально-дифференцированных клеток, а во-

вторых, возможность обратного репрограммирования таких клеток в их

14

исходное плюрипотентное состояние. Хотя иПСК демонстрировали почти полную идентичность с ЭСК по профилям экспрессии генов, всё же небольшие, но статистически значимые отличия в экспрессии и фосфорилировании белков существуют [22]. Главным доказательством плюрипотентности иПСК является их способность давать начало целому организму [23, 24]. Впоследствии иПСК были получены из клеток человека [25, 26], крысы [27, 28], свиньи [29, 30], коровы [31], собаки [32] и других животных [33]. Неоспоримым преимуществом иПСК является возможность их получения из соматических клеток взрослого организма, и, как следствие, возможность получения из них любых других типов клеток, которые при этом являются аутологичными для этой особи. Таким образом, иПСК открывают огромные перспективы для регенеративной медицины [34, 35].

1.1.1 Плюрипотентные стволовые клетки в эмбриогенезе

У яйцекладущих организмов развитие эмбриона начинается непосредственно после первого деления зиготы. Направленная дифференцировка, закладка пространственной структуры эмбриона начинается сразу после оплодотворения, всё это происходит за счёт питательных веществ, которые есть в яйце. По сравнению с такими организмами, у млекопитающих в яйцеклетке сосредоточено очень небольшое количество запасенных веществ, в связи с чем им необходимо как можно быстрее «наладить связь» с утробой материнского организма [36]. Для достижения этой цели на начальных этапах развития у млекопитающих происходит развитие двух экстраэмбриональных тканей - трофэктодермы и первичной энтодермы [37]. Стоит, однако, отметить, что клетки первичной энтодермы служат не только для снабжения плода питательными веществами, но, кроме того, дают вклад в формирование энтодермы эмбриона [38]. После оплодотворения яйцеклетки происходит несколько делений, вследствие чего увеличивается количество клеток, но не размер эмбриона. На этом этапе клетки (бластомеры) называются тотипотентными, и способны давать начало

всем эмбриональным, а также экстра-эмбриональным тканям. Тотипотентность была наглядно продемонстрирована, когда один бластомер вводили в пустую блестящую оболочку (Zona pellucida), подсаживали в матку, и наблюдали нормальное развитие эмбриона с развитием экстраэмбриональных тканей [39]. При этом на стадии двух бластомеров происходит так называемая зиготическая активация генома эмбриона (ZGA, zygotic genome activation) [40, 41]. На 3 сутки внутриутробного развития мыши происходит первое разделение на разные типы клеток: внешние клетки морулы формируют трофэктодерму, внутренние - плюрипотентную внутреннюю клеточную массу (ВКМ, ICM) [42], а внутри эмбриона появляется полость - бластоцель [43]. Впоследствии из трофэктодермы формируется плацента, из ВКМ все ткани эмбриона, а также часть экстраэмбриональных тканей. Главным маркером клеток трофэктодермы является Cdx2, который также необходим для её нормального формирования [44]. Важную роль в этой дифференцировке играют трансмембранные белки PAC, aPKC, E-кадгерин, а также их распределение между клетками трофэктодермы и ВКМ [45]. Наличие у апикальных клеток белков PAC и aPKC препятствует работе Hippo-сигнального пути (запускаемого E-кадгерином), и как следствие, способствует активной работе комплекса Yap-Taz-Tead, что ведёт к усилению экспрессии Cdx2 и развитию трофэктодермы [46].

Следующим дифференцировочным событием, которое происходит уже во внутренней клеточной массе, является образование внезародышевой энтодермы (гипобласта) на 4 день развития. Эта ткань представляет собой вторую экстраэмбриональную ткань, формирующую желточный мешок [47]. Однако, важно отметить, что, кроме того, клетки этой ткани также вносят вклад в формирование кишки эмбриона [38]. Появлению внезародышевой (также называемой первичной или примитивной) энтодермы предшествует ко-экспрессия Gata6 и Nanog в ПСК на 3,25 сутки, которая затем разделяется на 3,5 сутки по принципу «соли и перца» между клетками ВКМ. К 4,5 суткам

развития, экспрессия Gata6 отмечается только в клетках внезародышевой энтодермы, которая покрывает монослоем плюрипотентный эпибласт, клетки которого характеризуются экспрессией Nanog. Ключевым в этом процессе выступает FGF-сигналинг, включающий, с одной стороны, распределение по поверхности клеток рецепторов Fgfr1 и Fgfr2, а с другой - секрецию Fgf4 [4854]. Также существует возможность получения таких клеток из ПСК in vitro с использованием ретиноевой кислоты. Показано, что этому процессу препятствует ингибирование MEK-сигнального пути [55].

Практически сразу после формирования первичной энтодермы, в период с 4,5 по 5,5 сутки развития, происходит имплантация эмбриона. Плюрипотентные стволовые клетки после имплантации обнаруживаются с 5,5 по 7,5 сутки развития мыши. В этот промежуток времени, благодаря плюрипотентным клеткам эпибласта, отмечается формирование первичных половых клеток (ППК) и гаструляция. Индукция дифференцировки ППК запускается благодаря фактору Bmp4 [56]. Появление ППК отмечается на 7,25 сутки: они представляют из себя небольшое скопление клеток в основании аллантоиса, позитивных на щелочную фосфатазу [57, 58]. Ключевыми факторами, необходимыми для этого процесса, являются Blimp1 и Prdm14 [59, 60]. В районе 6 суток развития клетки эпибласта начинают формировать первичную полоску [61]. В этом процессе важную роль играет Nodal-сигналинг [62]. Далее, благодаря сигналам от первичной энтодермы (BMP) [63] и от самого эпибласта (Nodal-SMAD2,3 и Wnt) [64, 65], клетки в районе первичной полоски начинают мигрировать в сторону первичной энтодермы -процесс получил название эпителиально-мезенхимального перехода. Таким образом, между эпибластом и первичной энтодермой формируется дополнительный слой клеток. Миграция и спецификация клеток также контролируется со стороны FGF-сигналинга. Также, в процессе такого перехода у клеток снижается уровень E-кадгерина, который отвечает за контакты клеток эпибласта. За этот переход отвечают Fgfr1, Fgf8 и репрессор

Snail [66]. Клетки, которые остаются в составе эпибласта, впоследствии становятся нейроэктодермой, ключевым маркером которой является Sox1 [12]. Мигрировавшие же клетки разделяются далее на дефинитивную энтодерму и мезодерму, главными маркерами которых являются Foxa2 и Brachyury, соответственно. В этом разделении «мезоэнтодермы» на два отдельных листка принимают участие несколько различных факторов: высокая концентрация активина (активин/нодал-сигналинг) способствует дифференцировке в дефинитивную энтодерму, а BMP-сигналинг способствует формированию мезодермы [67, 68]. Кроме того, уровень основных факторов плюрипотентности также влияет на выбор пути дифференцировки. Так, Oct4 способствует дифференцировке в мезодерму, Nanog - в энтодерму, а Sox2 - в эктодерму [69]. Таким образом, с 7,5 суток развития мыши, плюрипотентные клетки выбирают определённые пути развития, и далее в онтогенезе уже не присутствуют. Единственный способ получить ПСК на этих стадиях -искусственно индуцировать плюрипотентность в дифференцированных клетках.

1.1.2 Наивная, промежуточная и праймированная плюрипотентность

Внутренняя клеточная масса бластоцисты и эпибласт до имплантации эмбриона является источником эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [1, 2, 70]. Такие ранние «наивные» плюрипотентные стволовые клетки способны успешно приживаться во внутренней клеточной массе при их инъекции, формируя так называемые химеры [71]. После имплантации клетки эпибласта остаются плюрипотентными, однако, при их инъекции в бластоцисту уже не приживаются [15]. Такие клетки были открыты в 2007 году двумя независимыми группами учёных и называются эпибластными стволовыми клетками (ЭпиСК), и способны пролиферировать in vitro при добавлении определённых факторов [3, 4]. Эмбриональные стволовые клетки мыши (ЭСК) изучаются уже около 40 лет и являются отличным модельным объектом для

изучения клеточной плюрипотентности. Главным цитокином, который удерживает их в недифференцированном состоянии является лейкемия-ингибирующий фактор (LIF), который с соответствующей целью добавляют в среду [72, 73]. Благодаря этому фактору, а также добавлению сыворотки, стало возможным культивировать ЭСК без фидерного слоя клеток. Однако, позже выяснилось, что в таких условиях ЭСК проявляют гетерогенность -экспрессия таких факторов, как Rexl, Stella, Nanog, Esrrb, Klf4 варьирует в популяции ЭСК [74, 75]. Кроме того, в сыворотке содержатся неизвестные компоненты, что затрудняет изучение ПСК, в связи с чем стали появляться попытки создания бессывороточных сред, где известны все компоненты. Первым шагом на пути к этой цели стало добавление фактора BMP4 (представитель семейства факторов TGF-ß), который сдерживал нейрональную дифференцировку [76]. Далее было обнаружено, что блокировка пути FGF/ERK и ингибирование GSK3ß позволяет поддерживать плюрипотентный статус ЭСК без BMP4, и даже без LIF [77]. Эта среда, в которой кроме LIF добавлены ингибиторы MEK (PD0325921) и Gsk3 (CHIR99021) получила широчайшее распространение, и называется 2i-LIF. В такой среде ЭСК становятся намного более гомогенными, паттерны экспрессии таких ЭСК характеризуются наличием таких маркеров как Klf2, Klf4, Esrrb, Tbx3 [78, 79], с её использованием были получены ЭСК и иПСК крысы [28, 80]. К другим примечательным особенностям ЭСК в 2i-LIF среде можно отнести меньшую по сравнению с дифференцированными клетками гетерохроматинизацию и глобальное гипометилирование ДНК [81], которое сильно снижается после имплантации. Также отмечается снижение уровня H3K27me3-модификаций хроматина [82]. В «наивных» женских ЭСК ещё проявляют активность обе Х-хромосомы, одна из которых инактивируется в процессе дифференцировки [82]. В целом, по паттернам экспрессии такие клетки соответствуют эпибласту пре-имплантационного эмбриона 4,5 дней [70], хотя и способны дифференцироваться в клетки экстра-эмбриональной энтодермы (XEN) [83].

Эпибластные стволовые клетки (ЭпиСК) кардинально отличаются от наивных ЭСК и называются праймированными. Эти клетки можно получить из эмбриона после имплантации с 5,5 по 7,5 сутки развития [3, 4]. В культуре, по паттернам экспрессии генов, они соответствуют клеткам эпибласта 7 суток развития [84]. Плюрипотентный статус ЭпиСК поддерживается in vitro с помощью факторов ActivinA и bFGF - такое сочетание факторов было позаимствовано из состава среды для ЭСК человека (чЭСК). Хотя чЭСК получают из доимплантационной бластоцисты [85], по своим свойствам они гораздо ближе к ЭпиСК мыши, чем к ЭСК. Кроме того, сравнительный анализ транскриптомов выявил близость чЭСК к пост-имплантационному эпибласту приматов [86]. Как и в случае с ЭСК, в ранних работах по ЭпиСК, эти клетки проявляли гетерогенность в популяции отмечались клетки, экспрессирующие маркеры Brachyury, Soxl, Sox17 [87]. Преодолеть эту проблему удалось с посредством ингибирования в этих клетках Wnt-сигнального пути с помощью XAV939, IWR-1 или IWP-2 [88-90]. В целом, ЭпиСК характеризуются продолжающейся экспрессией основных факторов плюрипотентности (Oct4, Sox2, Nanog), а также появлением Otx2 и Oct6. Кроме того, у женских ЭпиСК, по сравнению с ЭСК, происходит инактивация одной из Х-хромосом. Как и наивные ЭСК, ЭпиСК плохо дифференцируются в первичные половые клетки (ППК).

В последнее время, кроме ЭСК и ЭпиСК, в отдельный класс выделяют промежуточные эпибластоподобные клетки (ЭпиПК) [91, 92]. In vivo такой тип клеток представлен до гаструляции, с 5,5 по 6,5 сутки развития [93]. В этот период происходит усиление ДНК-метилирования [94], у женских клеток начинается инактивация Х-хромосомы, усиливается экспрессия Otx2, Oct6 и Sox3, резко снижается уровень Nanog [95]. Кроме того, происходит смена сайтов связывания Oct4 в геноме этих клеток, что достигается благодаря фактору Otx2 [96, 97]. В целом, по паттернам экспрессии, ПСК на этой стадии не кластеризуются ни с ЭСК, ни с ЭпиСК [93]. Главной примечательной

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бахмет Евгений Игоревич, 2019 год

Список литературы

1. Evans, M.J. and M.H. Kaufman, Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature, 1981. 292(5819): p. 154-6.

2. Martin, G.R., Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981. 78(12): p. 7634-8.

3. Tesar, P.J., et al., New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature, 2007. 448(7150): p. 196-9.

4. Brons, I.G., et al., Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature, 2007. 448(7150): p. 191-5.

5. Hayashi, K., et al., Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell, 2011. 146(4): p. 519-32.

6. Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006. 126(4): p. 663-76.

7. Niwa, H., J.-i. Miyazaki, and A.G. Smith, Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet, 2000. 24(4): p. 372-376.

8. Choi, Hyun W., et al., Distinct Enhancer Activity of Oct4 in Naive and Primed Mouse Pluripotency. Stem Cell Reports, 2016. 7(5): p. 911-926.

9. Minucci, S., et al., Retinoic acid-mediated down-regulation of Oct3/4 coincides with the loss of promoter occupancy in vivo. The EMBO Journal, 1996. 15(4): p. 888-899.

10. Okumura-Nakanishi, S., et al., Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J Biol Chem, 2005. 280(7): p. 5307-17.

11. Nazarov, I.B., et al., Transcription regulation of Oct4 (Pou5F1) gene by its distal enhancer. Cell and Tissue Biology, 2014. 8(1): p. 27-32.

12. Arnold, S.J. and E.J. Robertson, Making a commitment: cell lineage allocation and axis patterning in the early mouse embryo. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009. 10(2): p. 91-103.

13. Kaufman-Francis, K., et al., Differential response of epiblast stem cells to Nodal and Activin signalling: a paradigm of early endoderm development in the embryo. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2014. 369(1657).

14. Beddington, R.S. and E.J. Robertson, An assessment of the developmental potential of embryonic stem cells in the midgestation mouse embryo. Development, 1989. 105(4): p. 733-7.

15. Huang, Y., et al., In Vivo differentiation potential of epiblast stem cells revealed by chimeric embryo formation. Cell Rep, 2012. 2(6): p. 1571-8.

16. Doetschman, T.C., et al., The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J Embryol Exp Morphol, 1985. 87: p. 27-45.

17. Keller, G.M., In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol, 1995. 7(6): p. 8629.

18. Leahy, A., et al., Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J Exp Zool, 1999. 284(1): p. 67-81.

19. Ying, Q.-L. and A.G. Smith, Defined Conditions for Neural Commitment and Differentiation. 2003. 365: p. 327-341.

20. Chambers, I. and A. Smith, Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells. Oncogene, 2004. 23(43): p. 7150-60.

21. Chambers, I. and S.R. Tomlinson, The transcriptional foundation of pluripotency. Development, 2009. 136(14): p. 2311-22.

22. Phanstiel, D.H., et al., Proteomic and phosphoproteomic comparison of human ES and iPS cells. Nat Methods, 2011. 8(10): p. 821-7.

23. Zhao, X.Y., et al., iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009. 461(7260): p. 86-90.

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

Boland, M.J., et al., Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature, 2009. 461(7260): p. 91-4.

Takahashi, K., et al., Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell, 2007. 131(5): p. 861-872.

Yu, J., et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007. 318(5858): p. 1917-20.

Liao, J., et al., Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell, 2009. 4(1): p. 11-5.

Liskovykh, M., et al., Derivation, characterization, and stable transfection of induced pluripotent stem cells from Fischer344 rats. PLoS One, 2011. 6(11): p. e27345.

Esteban, M.A., et al., Generation of Induced Pluripotent Stem Cell Lines from Tibetan Miniature Pig. Journal of Biological Chemistry, 2009. 284(26): p. 17634-17640.

Ezashi, T., et al., Derivation of induced pluripotent stem cells from pig somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(27).

Huang, B., et al., A virus-free poly-promoter vector induces pluripotency in quiescent bovine cells under chemically defined conditions of dual kinase inhibition. PLoS One, 2011. 6(9): p. e24501. Luo, J., et al., Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev, 2011. 20(10): p. 1669-78.

Lee, S.G., et al., Naked Mole Rat Induced Pluripotent Stem Cells and Their Contribution to Interspecific Chimera. Stem Cell Reports, 2017. 9(5): p. 1706-1720.

Rowe, R.G. and G.Q. Daley, Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Genet, 2019.

Wu, S.M. and K. Hochedlinger, Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nature Cell Biology, 2011. 13(5): p. 497-505.

Frankenberg, S., et al., Primitive endoderm differentiates via a three-step mechanism involving Nanog and RTKsignaling. Dev Cell, 2011. 21(6): p. 1005-13.

Baker, C.L. and M.F. Pera, Capturing Totipotent Stem Cells. Cell Stem Cell, 2018. 22(1): p. 25-34. Kwon, G.S., M. Viotti, and A.K. Hadjantonakis, The endoderm of the mouse embryo arises by dynamic widespread intercalation of embryonic and extraembryonic lineages. Dev Cell, 2008. 15(4): p. 509-20.

Tarkowski, A.K., Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature, 1959. 24(184): p. 1286-7.

Evsikov, A.V., et al., Cracking the egg: molecular dynamics and evolutionary aspects of the transition from the fully grown oocyte to embryo. Genes Dev, 2006. 20(19): p. 2713-27. Ko, M.S., Zygotic Genome Activation Revisited: Looking Through the Expression and Function of Zscan4. Curr Top Dev Biol, 2016. 120: p. 103-24.

Johnson, M.H. and C.A. Ziomek, Cell interactions influence the fate of mouse blastomeres undergoing the transition from the 16- to the 32-cell stage. Dev Biol, 1983. 95(1): p. 211-8. Rossant, J. and P.P.L. Tam, New Insights into Early Human Development: Lessons for Stem Cell Derivation and Differentiation. Cell Stem Cell, 2017. 20(1): p. 18-28.

Strumpf, D., et al., Cdx2 is required for correct cell fate specification and differentiation of trophectoderm in the mouse blastocyst. Development, 2005. 132(9): p. 2093-102. Stephenson, R.O., J. Rossant, and P.P. Tam, Intercellular interactions, position, and polarity in establishing blastocyst cell lineages and embryonic axes. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012. 4(11).

Hirate, Y., et al., Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Curr Biol, 2013. 23(13): p. 1181-94.

Schrode, N., et al., Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and

morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis, 2013. 51(4): p. 219-33.

Kang, M., V. Garg, and A.K. Hadjantonakis, Lineage Establishment and Progression within the Inner

Cell Mass of the Mouse Blastocyst Requires FGFR1 and FGFR2. Dev Cell, 2017. 41(5): p. 496-510

e5.

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

Bassalert, C., L. Valverde-Estrella, and C. Chazaud, Primitive Endoderm Differentiation: From Specification to Epithelialization. Curr Top Dev Biol, 2018. 128: p. 81-104.

Pijuan-Sala, B., C. Guibentif, and B. Gottgens, Single-cell transcriptional profiling: a window into embryonic cell-type specification. Nat Rev Mol Cell Biol, 2018. 19(6): p. 399-412. Saiz, N., et al., Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun, 2016. 7: p. 13463.

Schrode, N., et al., GATA6 levels modulate primitive endoderm cell fate choice and timing in the mouse blastocyst. Dev Cell, 2014. 29(4): p. 454-67.

Molotkov, A., et al., Distinct Requirements for FGFR1 and FGFR2 in Primitive Endoderm Development and Exit from Pluripotency. Dev Cell, 2017. 41(5): p. 511-526 e4. Molotkov, A. and P. Soriano, Distinct mechanisms for PDGF and FGF signaling in primitive endoderm development. Dev Biol, 2018. 442(1): p. 155-161.

Semrau, S., et al., Dynamics of lineage commitment revealed by single-cell transcriptomics of differentiating embryonic stem cells. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 1096.

Lawson, K.A., et al., Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes Dev, 1999. 13(4): p. 424-436.

Ginsburg, M., M.H. Snow, and A. McLaren, Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development, 1990. 110(2): p. 521-8.

Saitou, M., S.C. Barton, and M.A. Surani, A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice. Nature, 2002. 418(6895): p. 293-300.

Ohinata, Y., et al., Blimp1 is a critical determinant of the germ cell lineage in mice. Nature, 2005. 436(7048): p. 207-13.

Yamaji, M., et al., Critical function of Prdm14 for the establishment of the germ cell lineage in mice. Nat Genet, 2008. 40(8): p. 1016-22.

Lawson, K.A., J.J. Meneses, and R.A. Pedersen, Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Development, 1991. 113(3): p. 891-911.

Lu, C.C. and E.J. Robertson, Multiple roles for Nodal in the epiblast of the mouse embryo in the

establishment of anterior-posterior patterning. Dev Biol, 2004. 273(1): p. 149-59.

Mishina, Y., et al., Bmpr encodes a type I bone morphogenetic protein receptor that is essential for

gastrulation during mouse embryogenesis. Genes Dev, 1995. 9(15): p. 3027-37.

Conlon, F.L., et al., A primary requirement for nodal in the formation and maintenance of the

primitive streak in the mouse. Development, 1994. 120(7): p. 1919-28.

Liu, P., et al., Requirement for Wnt3 in vertebrate axis formation. Nat Genet, 1999. 22(4): p. 3615.

Batlle, E., et al., The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell Biol, 2000. 2(2): p. 84-9.

Gaarenstroom, T. and C.S. Hill, TGF-6 signaling to chromatin: How Smads regulate transcription during self-renewal and differentiation. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2014. 32: p. 107-118.

Barbaric, I., et al., Human pluripotent stem cells as tools for high-throughput and high-content screening in drug discovery. International Journal of High Throughput Screening, 2015: p. 1. Loh, K.M., B. Lim, and L.T. Ang, Ex uno plures: molecular designs for embryonic pluripotency. Physiol Rev, 2015. 95(1): p. 245-95.

Boroviak, T., et al., The ability of inner-cell-mass cells to self-renew as embryonic stem cells is acquired following epiblast specification. Nat Cell Biol, 2014. 16(6): p. 516-28. Bradley, A., et al., Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature, 1984. 309(5965): p. 255-6.

Smith, A.G. and M.L. Hooper, Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells. Dev Biol, 1987. 121(1): p. 1-9.

Smith, A.G., et al., Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature, 1988. 335(6200): p. 688-90.

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

Chambers, I., et al., Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature, 2007. 450(7173): p. 1230-4.

Hayashi, K., et al., Dynamic Equilibrium and Heterogeneity of Mouse Pluripotent Stem Cells with

Distinct Functional and Epigenetic States. Cell Stem Cell, 2008. 3(4): p. 391-401.

Ying, Q.L., et al., BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic

stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell, 2003. 115(3): p. 281-92.

Ying, Q.-L., et al., The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature, 2008. 453(7194):

p. 519-523.

Ivanova, N., et al., Dissecting self-renewal in stem cells with RNA interference. Nature, 2006. 442(7102): p. 533-8.

Martello, G. and A. Smith, The nature of embryonic stem cells. Annu Rev Cell Dev Biol, 2014. 30: p. 647-75.

Buehr, M., et al., Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell, 2008. 135(7): p. 1287-98.

Lee, H.J., T.A. Hore, and W. Reik, Reprogramming the methylome: erasing memory and creating diversity. Cell Stem Cell, 2014. 14(6): p. 710-9.

Rastan, S. and E.J. Robertson, X-chromosome deletions in embryo-derived (EK) cell lines associated with lack of X-chromosome inactivation. J Embryol Exp Morphol, 1985. 90: p. 379-88. Niakan, K.K., et al., Derivation of extraembryonic endoderm stem (XEN) cells from mouse embryos and embryonic stem cells. Nat Protoc, 2013. 8(6): p. 1028-41.

Kojima, Y., et al., The transcriptional and functional properties of mouse epiblast stem cells resemble the anterior primitive streak. Cell Stem Cell, 2014. 14(1): p. 107-20. Thomson, J.A., et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998. 282(5391): p. 1145-7.

Nakamura, T., et al., A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature, 2016. 537(7618): p. 57-62.

Tsakiridis, A., et al., Distinct Wnt-driven primitive streak-like populations reflect in vivo lineage precursors. Development, 2014. 141(6): p. 1209-21.

Kim, H., et al., Modulation of beta-catenin function maintains mouse epiblast stem cell and human embryonic stem cell self-renewal. Nat Commun, 2013. 4: p. 2403.

Sumi, T., et al., Epiblast ground state is controlled by canonical Wnt/beta-catenin signaling in the postimplantation mouse embryo and epiblast stem cells. PLoS One, 2013. 8(5): p. e63378. Sugimoto, M., et al., A simple and robust method for establishing homogeneous mouse epiblast stem cell lines by wnt inhibition. Stem Cell Reports, 2015. 4(4): p. 744-57.

Kinoshita, M. and A. Smith, Pluripotency Deconstructed. Development, Growth & Differentiation, 2018. 60(1): p. 44-52.

Morgani, S., J. Nichols, and A.K. Hadjantonakis, The many faces of Pluripotency: in vitro

adaptations of a continuum of in vivo states. BMC Dev Biol, 2017. 17(1): p. 7.

Mohammed, H., et al., Single-Cell Landscape of Transcriptional Heterogeneity and Cell Fate

Decisions during Mouse Early Gastrulation. Cell Rep, 2017. 20(5): p. 1215-1228.

Auclair, G., et al., Ontogeny of CpG island methylation and specificity of DNMT3

methyltransferases during embryonic development in the mouse. Genome Biol, 2014. 15(12): p.

545.

Hoffman, J.A., C.I. Wu, and B.J. Merrill, Tcf7l1 prepares epiblast cells in the gastrulating mouse embryo for lineage specification. Development, 2013. 140(8): p. 1665-75.

Kalkan, T., et al., Tracking the embryonic stem cell transition from ground state pluripotency. Development, 2017. 144(7): p. 1221-1234.

Buecker, C., et al., Reorganization of enhancer patterns in transition from naive to primed pluripotency. Cell Stem Cell, 2014. 14(6): p. 838-53.

Ohinata, Y., et al., A signaling principle for the specification of the germ cell lineage in mice. Cell, 2009. 137(3): p. 571-84.

99.

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

Palmieri, S.L., et al., Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol, 1994. 166(1): p. 259-67.

Pesce, M. and H.R. Scholer, Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development. Stem Cells, 2001. 19(4): p. 271-8.

Rosner, M.H., et al., A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature, 1990. 356: p. 686-692.

Scholer, H.R., et al., Oct-4: a germline-specific transcription factor mapping to the mouse t-complex. EMBO J, 1990. 9(7): p. 2185-95.

Yeom, Y.I., et al., Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells. Development, 1996. 122(3): p. 881-894.

Wu, G. and H.R. Scholer, Role of Oct4 in the early embryo development. Cell Regeneration, 2014. 3(7): p. 10.

Ding, J., et al., Oct4 links multiple epigenetic pathways to the pluripotency network. Cell Res, 2012. 22(1): p. 155-67.

van den Berg, D.L., et al., An Oct4-centered protein interaction network in embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2010. 6(4): p. 369-81.

Chen, X., et al., Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell, 2008. 133(6): p. 1106-17.

Wu, G., et al., Establishment of totipotency does not depend on Oct4A. Nat Cell Biol, 2013. 15(9): p. 1089-97.

Campbell, K.H., et al., Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature, 1996. 380(6569): p. 64-6.

Rodda, D.J., et al., Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2. J Biol Chem, 2005. 280(26): p. 24731-7.

Gu, P., et al., Orphan nuclear receptor LRH-1 is required to maintain Oct4 expression at the epiblast stage of embryonic development. Mol Cell Biol, 2005. 25(9): p. 3492-505.

Barnea, E. and Y. Bergman, Synergy of SF1 and RAR in activation of Oct-3/4 promoter. J Biol Chem, 2000. 275(9): p. 6608-19.

Pikarsky, E., et al., Retinoic acid represses Oct-3/4 gene expression through several retinoic acid-responsive elements located in the promoter-enhancer region. Mol Cell Biol, 1994. 14(2): p. 102638.

Ben-Shushan, E., et al., A dynamic balance between ARP-1/COUP-TFII, EAR-3/COUP-TFI, and retinoic acid receptor:retinoidX receptor heterodimers regulates Oct-3/4 expression in embryonal carcinoma cells. Mol Cell Biol, 1995. 15(2): p. 1034-48.

Schoorlemmer, J., et al., Characterization of a negative retinoic acid response element in the murine Oct4 promoter. Mol Cell Biol, 1994. 14(2): p. 1122-36.

Park, S.W., et al., SUMOylation of Tr2 orphan receptor involves Pml and fine-tunes Oct4 expression in stem cells. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(1): p. 68-75.

Chuang, Y.S., et al., Promyelocytic leukemia protein in retinoic acid-induced chromatin remodeling of Oct4 gene promoter. Stem Cells, 2011. 29(4): p. 660-9.

Zhang, J., et al., Sall4 modulates embryonic stem cell pluripotency and early embryonic development by the transcriptional regulation of Pou5f1. Nat Cell Biol, 2006. 8(10): p. 1114-23. Langer, D., et al., Essential role of the TFIID subunit TAF4 in murine embryogenesis and embryonic stem cell differentiation. Nat Commun, 2016. 7: p. 11063.

Kartikasari, A.E., et al., The histone demethylase Jmjd3 sequentially associates with the transcription factors Tbx3 and Eomes to drive endoderm differentiation. EMBO J, 2013. 32(10): p. 1393-408.

Young, R.A., Control of the embryonic stem cell state. Cell, 2011. 144(6): p. 940-54.

Siomi, H., et al., The pre-mRNA binding K protein contains a novel evolutionarily conserved motif.

Nucleic Acids Res, 1993. 21(5): p. 1193-8.

Valverde, R., L. Edwards, and L. Regan, Structure and function of KH domains. FEBS J, 2008. 275(11): p. 2712-26.

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

Braddock, D.T., et al., Molecular basis of sequence-specific single-stranded DNA recognition by KH domains: solution structure of a complex between hnRNP K KH3 and single-stranded DNA. EMBO J, 2002. 21(13): p. 3476-85.

Grishin, N.V., KH domain: one motif, two folds. Nucleic Acids Res, 2001. 29(3): p. 638-43. Bomsztyk, K., O. Denisenko, and J. Ostrowski, hnRNP K: one protein multiple processes. Bioessays, 2004. 26(6): p. 629-38.

Michelotti, G.A., et al., Multiple single-stranded cis elements are associated with activated chromatin of the human c-myc gene in vivo. Mol Cell Biol, 1996. 16(6): p. 2656-69. Choi, H.S., et al., A proteomics approach for identification of single strand DNA-binding proteins involved in transcriptional regulation of mouse mu opioid receptor gene. Mol Cell Proteomics, 2008. 7(8): p. 1517-29.

Rivera-Gines, A., et al., Interplay of Sps and poly(C) binding protein 1 on the mu-opioid receptor gene expression. Biochem Biophys Res Commun, 2006. 345(1): p. 530-7.

Choi, H.S., et al., Novel function of the poly(C)-binding protein alpha CP3 as a transcriptional repressor of the mu opioid receptor gene. FASEB J, 2007. 21(14): p. 3963-73. Ritchie, S.A., et al., Identification of the SRC pyrimidine-binding protein (SPy) as hnRNP K: implications in the regulation of SRC1A transcription. Nucleic Acids Research, 2003. 31(5): p. 15021513.

Thakur, S., et al., Regulation of BRCA1 Transcription by Specific Single-Stranded DNA Binding Factors. Molecular and Cellular Biology, 2003. 23(11): p. 3774-3787.

Lynch, M., et al., hnRNP K binds a core polypyrimidine element in the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) promoter, and its regulation of eIF4E contributes to neoplastic transformation. Mol Cell Biol, 2005. 25(15): p. 6436-53.

Da Silva, N., A. Bharti, and C.S. Shelley, hnRNP-K and Pur(alpha) act together to repress the

transcriptional activity of the CD43 gene promoter. Blood, 2002. 100(10): p. 3536-44.

Lau, J.S., et al., Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins as regulators of gene expression

through interactions with the human thymidine kinase promoter. J Cell Biochem, 2000. 79(3): p.

395-406.

Moumen, A., et al., ATM-dependent phosphorylation of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K promotes p53 transcriptional activation in response to DNA damage. Cell Cycle, 2013. 12(4): p. 698-704.

Kaiser, C.E., et al., Insight into the Complexity of the i-Motif and G-Quadruplex DNA Structures Formed in the KRAS Promoter and Subsequent Drug-Induced Gene Repression. J Am Chem Soc, 2017. 139(25): p. 8522-8536.

Banerjee, K., et al., Regulation of tyrosine hydroxylase transcription by hnRNP K and DNA secondary structure. Nat Commun, 2014. 5: p. 5769.

Lian, W.X., et al., THAP11, a novel binding protein of PCBP1, negatively regulates CD44 alternative splicing and cell invasion in a human hepatoma cell line. FEBS Lett, 2012. 586(10): p. 1431-8. Mikula, M., et al., Landscape of the hnRNP K protein-protein interactome. Proteomics, 2006. 6(8): p. 2395-406.

Weiss, I.M. and S.A. Liebhaber, Erythroid cell-specific mRNA stability elements in the alpha 2-globin 3'nontranslatedregion. Mol Cell Biol, 1995. 15(5): p. 2457-65.

Wang, X., et al., Detection and characterization of a 3' untranslated region ribonucleoprotein complex associated with human alpha-globin mRNA stability. Mol Cell Biol, 1995. 15(3): p. 176977.

Ren, C., et al., DNA polymerase eta is regulated by poly(rC)-binding protein 1 via mRNA stability. Biochem J, 2014. 464(3): p. 377-86.

Hwang, C.K., et al., Phosphorylation of poly(rC) binding protein 1 (PCBP1) contributes to stabilization of mu opioid receptor (MOR) mRNA via interaction with AU-rich element RNA-binding protein 1 (AUF1) and poly A binding protein (PABP). Gene, 2017. 598: p. 113-130. Ostareck, D.H., et al., mRNA silencing in erythroid differentiation: hnRNP K and hnRNP E1 regulate 15-lipoxygenase translation from the 3' end. Cell, 1997. 89(4): p. 597-606.

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

Ostareck, D.H., et al., Lipoxygenase mRNA silencing in erythroid differentiation: The 3'UTR regulatory complex controls 60S ribosomal subunit joining. Cell, 2001. 104(2): p. 281-90. Chen, X., et al., Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is associated with poor prognosis and regulates proliferation and apoptosis in bladder cancer. J Cell Mol Med, 2017. 21(7): p. 1266-1279. Kawasaki, Y., et al., MYU, a Target lncRNA for Wnt/c-Myc Signaling, Mediates Induction of CDK6 to Promote Cell Cycle Progression. Cell Rep, 2016. 16(10): p. 2554-2564.

Zhu, X.H., et al., Down-regulation of DAB2IP promotes colorectal cancer invasion and metastasis by translocating hnRNPK into nucleus to enhance the transcription of MMP2. Int J Cancer, 2017. 141(1): p. 172-183.

Shin, C.H., et al., Regulation of PLK1 through competition between hnRNPK, miR-149-3p andmiR-193b-5p. Cell Death Differ, 2017. 24(11): p. 1861-1871.

Huang, H., et al., HNRNPK inhibits gastric cancer cell proliferation through p53/p21/CCND1 pathway. Oncotarget, 2017. 8(61): p. 103364-103374.

Gallardo, M., et al., hnRNP K Is a Haploinsufficient Tumor Suppressor that Regulates Proliferation and Differentiation Programs in Hematologic Malignancies. Cancer Cell, 2015. 28(4): p. 486-99. Zhang, Y., et al., The RNA-Binding Protein PCBP1 Functions as a Tumor Suppressor in Prostate Cancer by Inhibiting Mitogen Activated Protein Kinase 1. Cell Physiol Biochem, 2018. 48(4): p. 1747-1754.

Grelet, S., et al., A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumour progression. Nat Cell Biol, 2017. 19(9): p. 1105-1115.

Tripathi, V., et al., Direct Regulation of Alternative Splicing by SMAD3 through PCBP1 Is Essential

to the Tumor-Promoting Role of TGF-beta. Mol Cell, 2016. 64(3): p. 549-564.

Zhang, P., et al., Expression and localization of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K in

mouse ovaries and preimplantation embryos. Biochem Biophys Res Commun, 2016. 471(1): p.

260-5.

Lin, N., et al., An evolutionarily conserved long noncoding RNA TUNA controls pluripotency and neural lineage commitment. Mol Cell, 2014. 53(6): p. 1005-19.

Chia, N.Y., et al., A genome-wide RNAi screen reveals determinants of human embryonic stem cell identity. Nature, 2010. 468(7321): p. 316-20.

Thompson, P.J., et al., hnRNP K coordinates transcriptional silencing by SETDB1 in embryonic stem cells. PLoS Genet, 2015. 11(1): p. e1004933.

Ding, L., et al., A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity. Cell Stem Cell, 2009. 4(5): p. 403-15.

Bao, X., et al., The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Res, 2015. 25(1): p. 80-92. Xia, M., et al., PCBP1 is required for maintenance of the transcriptionally silent state in fully grown mouse oocytes. Cell Cycle, 2012. 11(15): p. 2833-42.

Ghanem, L.R., et al., The Poly(C) Binding Protein Pcbp2 and Its Retrotransposed Derivative Pcbp1 Are Independently Essential to Mouse Development. Mol Cell Biol, 2015. 36(2): p. 304-19. Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc, 2013. 8(11): p. 2281-2308.

Liepelt, A., et al., Translation control of TAK1 mRNA by hnRNP K modulates LPS-induced macrophage activation. RNA, 2014. 20(6): p. 899-911.

Afgan, E., et al., The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res, 2016. 44(W1): p. W3-W10.

Langmead, B. and S.L. Salzberg, Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods, 2012. 9(4): p. 357-9.

Zhang, Y., et al., Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol, 2008. 9(9): p. R137. Bailey, T.L., et al., MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res, 2009. 37(Web Server issue): p. W202-8.

Heinz, S., et al., Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell, 2010. 38(4): p. 57689.

171. Oki, S., et al., ChIP-Atlas: a data-mining suite powered by full integration of public ChIP-seq data. EMBO Rep, 2018. 19(12).

172. Whyte, W.A., et al., Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell, 2013. 153(2): p. 307-19.

173. Liu, Z. and W.L. Kraus, Catalytic-Independent Functions of PARP-1 Determine Sox2 Pioneer Activity at Intractable Genomic Loci. Mol Cell, 2017. 65(4): p. 589-603 e9.

174. Vian, L., et al., The Energetics and Physiological Impact of Cohesin Extrusion. Cell, 2018. 173(5): p. 1165-1178 e20.

175. Li, Y., et al., Genome-wide analyses reveal a role of Polycomb in promoting hypomethylation of DNA methylation valleys. Genome Biol, 2018. 19(1): p. 18.

176. de Dieuleveult, M., et al., Genome-wide nucleosome specificity and function of chromatin remodellers in ES cells. Nature, 2016. 530(7588): p. 113-6.

177. Creyghton, M.P., et al., Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(50): p. 21931-6.

178. Illingworth, R.S., et al., Orphan CpG islands identify numerous conserved promoters in the mammalian genome. PLoS Genet, 2010. 6(9): p. e1001134.

179. Thomson, M., et al., Pluripotency factors in embryonic stem cells regulate differentiation into germ layers. Cell, 2011. 145(6): p. 875-89.

180. Friedrich, G. and P. Soriano, Promoter traps in embryonic stem cells: a genetic screen to identify, and mutate developmental genes m mice genes Dev, 1991. 5: p. 1513-53.

181. Wang, R., et al., Promoter-dependent EGFP expression during embryonic stem cell propagation and differentiation. Stem Cells Dev, 2008. 17(2): p. 279-89.

182. Dan, J., et al., Rif1 maintains telomere length homeostasis of ESCs by mediating heterochromatin silencing. Dev Cell, 2014. 29(1): p. 7-9.

183. Michelotti, E.F., et al., Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is a transcription factor. Molecular and Cellular Biology, 1996. 16(5): p. 2350-2360.

184. Fant, B., et al., Comprehensive interactome of Otx2 in the adult mouse neural retina. Genesis, 2015. 53(11): p. 685-94.

185. Greber, B., et al., Conserved and divergent roles of FGF signaling in mouse epiblast stem cells and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell, 2010. 6(3): p. 215-26.

186. Scholer, H.R., et al., Octamer binding proteins confer transcriptional activity in early mouse embryogenesis. EMBO J, 1989. 8(9): p. 2551-7.

187. Bakhmet, E.I., et al., hnRNP-K Targets Open Chromatin in Mouse Embryonic Stem Cells in Concert With Multiple Regulators. Stem Cells, 2019.

188. Li, Y.Q., Networks of Transcription Factors for Oct4 Expression in Mice. DNA Cell Biol, 2017. 36(9): p. 725-736.

189. Chen, C.M., et al., A comparison of exogenous promoter activity at the ROSA26 locus using a PhiiC31 integrase mediated cassette exchange approach in mouse ES cells. PLoS One, 2011. 6(8): p. e23376.

190. Smith, A., Formative pluripotency: the executive phase in a developmental continuum. Development, 2017. 144(3): p. 365-373.

191. Boroviak, T., et al., Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis. Dev Cell, 2015. 35(3): p. 366-82.

192. Chambers, I., et al., Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell, 2003. 113(5): p. 643-55.

193. Takaoka, K., H. Nishimura, and H. Hamada, Both Nodal signalling and stochasticity select for prospective distal visceral endoderm in mouse embryos. Nat Commun, 2017. 8(1): p. 1492.

194. Pauklin, S. and L. Vallier, Activin/Nodalsignalling in stem cells. Development, 2015. 142(4): p. 60719.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, Алексею Николаевичу Томилину за возможность работать на международном уровне в лаборатории, оснащённой для этого всем необходимым, возможность работать в аспирантуре, не нуждаясь при этом в подработках ради средств к существованию, а также за чуткое руководство и доверие на всех этапах работы.

Автор благодарит всех членов лаборатории Молекулярной биологии стволовых клеток за тёплую атмосферу, конструктивную критику и всестороннюю помощь в выполнении диссертации. Андрея Кузьмина за помощь и советы по использованию генных конструкций, Сергея Пономарцева и Павла Андреевича Дыбана за помощь с тератомным тестом и анализом метафазных пластинок, Игоря Борисовича Назарова за пионерные работы по КН-доменным Ро1уС-связывающим белкам в плюрипотентных стволовых клетках и помощь с биохимическими методами, Сергея Анатольевича Синенко за обучение методам работы с культурами клеток, Елену Вячеславовну Скворцову за помощь с выделением плазмид, Татьяну Юрьевну Старкову и Анну Сергеевну Цимоху за обсуждение результатов и советы по работе.

Автор благодарит Игоря Владимировича Кудрявцева (ИЭМ) за советы и помощь в постановке метода окраски клеток в суспензии для анализа на проточном цитометре.

Автор выражает признательность своим соавторам Надежде Евгеньевне Воробьёвой (ИБГ РАН, Москва) за обучение методу хроматин-иммунопреципитации, без которого эта работа была бы невозможна, а также за помощь с синтезом библиотек для КОБ-секвенирования, Адель Газизовой за помощь с биоинформатической обработкой данных, Николаю Дмитриевичу Аксёнову за помощь с проточной цитофлуориметрией и

клеточной сортировкой, Татьяне Олеговне Артамоновой и Михаилу Алексеевичу Ходорковскому (СПбГПУ) за масс-спектрометрический анализ, Гуангмингу Ву и Хансу Шолеру (Институт Макса Планка, Германия) за эксперименты на эмбрионах мыши, а также Наталье Алениной (МОС, Германия) и Дарье Онищук (Университет Фрайбурга, Германия) за обсуждение результатов и мудрые советы.

Автор выражает глубокую признательность своим родителям Ольге Николаевне Бахмет и Игорю Николаевичу Бахмету за открытие для меня этой интереснейшей профессии, постоянную моральную и финансовую поддержку и воспитание во мне качеств, способствовавших успешному выполнению этой работы. Автор благодарит свою жену Ульяну Игоревну Бахмет за тепло и моральную поддержку, а также терпение к моему постоянному отсутствию дома из-за плотного аспирантского графика.