Генно-инженерные подходы к изучению экспрессии гена Pou5f1 в клетках млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кузьмин Андрей Анатольевич

• Кузьмин Андрей Анатольевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Кузьмин Андрей Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плюрипотентные стволовые клетки. Общие сведения

1.2 Транскрипционный фактор Oct4

1.2.1 Общие сведения

1.2.2 Регуляция и сигнальные пути

1.2.3 Изоформы и псевдогены

1.2.4 Oct4 вне концепции плюрипотентности

1.2.5 Oct4 и клеточная пластичность

1.3 Изучение судьбы клеточных поколений

1.4 Системы геномного редактирования

1.4.1 Историческая справка

1.4.2 Основные принципы работы

1.4.3 Система CRISPR/Cas9

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Культивирование клеток

2.2 Плазмиды

2.3 Трансформация бактерий

2.4 Временная трансфекция

2.5 Геномное редактирование

2.6 Выделение и количественный анализ РНК

2.7 Упаковка вирусных частиц

2.8 Титрование вирусных частиц

2.9 Выделение первичных фибробластов из мышей линии O4S

2.10 Получение иПСК

2.119 Иммунноцитохимическое окрашивание клеток

2.12 Проточная цитофлюорометрия

2.13 Тератомный тест

2.14 Приготовление метафазных пластинок и G-бэндинг

2.15 Животные и условия содержания

2.16 Получение вазэктомированыех самцов

2.17 Получение бластоцист

2.18 Получение химер

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Разработка системы для автономной детекции экспрессии гена Pou5fl в клетках мыши

3.2 Конструирование плазмид и получение трансгенных линий ЭСК мыши, содержащих разработанную систему

3.3 Проверка работы системы in vitro. Отбор ЭСК для инъекций

3.4 Оценка плюрипотентных свойств линии O4S

3.5 Оценка способности системы активировать флуоресцентный сигнал в ответ на реактивацию гена Pou5f1

3.6 Получение химерных мышей и подтверждение передачи трансгенов через зародышевую линию (germline transmission)

3.7 Проверка работы системы O4S ex vivo

3.8 Оценка значимости нокаута Pou5f1 в клетках млекопитающих

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Потенциал использования созданной системы детекции экспрессии гена Pou5f1

4.2 Предполагаемые места поиска экспрессии гена Pou5f1

4.3 Oct4 в эндотелиальных клетках

4.4 Роль Abcg2 в атеросклерозе

4.5 Дальнейшая работа с линией мышей O4S

ВЫВОДЫ

Приложение

Список литературы

Благодарности

Список используемых сокращений

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

МЭФ - мышиные эмбриональные фибробласты

ПСК - плюрипотентные стволовые клетки

иПСК - индуцированные плюрипотентные клетки

ППК - первичные половые клетки

ВКМ - внутренняя клеточная масса

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

O4S - Oct4 сенсор

4-OHT - 4-гидрокситамоксифен

d.p.c. - days post coitum

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генно-инженерные подходы к изучению экспрессии гена Pou5f1 в клетках млекопитающих»

Актуальность работы

Транскрипционный фактор Oct4 был охарактеризован в конце 80-х -начале 90-х годов 20 века [Schôler et al., 1989; Schôler et al., 1990; Palmieri et al., 1994]. Данный октамер-связывающий белок (консенсусные последовательности связывания: ATGCAAAT или NATGCAAANN), кодируемый геном Pou5f1, содержит ДНК-связывающий POU-домен и является необходимым для поддержания плюрипотентного состояния эмбриональных стволовых клеток [Pesce & Schôler, 2001; Jin et al., 2007; Nichols et al., 1998; Pan et al., 2002]. Помимо культивируемых ЭСК и клеток эпибласта, Oct4 был также обнаружен в первичных половых клетках (ППК). Более того, Cre/Lox-зависимое блокирование полноценной экспрессии Pou5f1 за счёт удаления его промотора и первого экзона приводило к гибели ППК, что дополнило информацию о первостепенной важности его экспрессии в зародышевой линии [Kehler et al., 2004]. Таким образом, экспрессия гена Pou5f1 и наличие его продукта - белка Oct4 - представляет собой непрерывный цикл, проходящий через клетки эпибласта, ППК и ооцит [Wu and Schôler, 2014].

На фоне данных, касающихся зародышевой линии, функции Oct4 в соматических клетках являются предметом дебатов. С одной стороны, в исследовании 2007 года, ткане-специфический нокаут Pou5f1 в мышиных клетках различного типа не приводил к каким-либо отличиям по сравнению с контролем [Lengner et al., 2007], с другой стороны, более позднее исследование на аналогичной модели определило влияние нокаута Pou5f1 на фенотип атеросклеротических бляшек [Cherepanova et al., 2016].

Помимо физиологических функций, связанных с эндогенной экспрессией его гена, белок Oct4, в составе так называемого «репрограммирущего коктейля» (или «коктейля Яманаки»), а также в

одиночку, способен репрограммировать клетки с образованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), что было впервые показано в 2006 году в пионерной работе Казутоши Такахаши и Синьи Яманаки, а затем продолжено в виде различных модификаций этого метода [Takahashi & Yamanaka, 2006; Guan et al., 2022].

Кроме того, было отмечено, что Oct4 способен увеличивать клеточную пластичность терминально дифференцированных клеток без достижения плюрипотентного состояния [Mitchell et al., 2014; Lee et al., 2015]. В дополнение, Oct4 является так называемым пионер-фактором, способным связываться с участками закрытого хроматина и привлекать вторичные активаторные белки [Iwafuchi-Doi & Zaret, 2014]. Функционирование в качестве пионер-фактора частично объясняет как Oct4 влияет на переключение фенотипа дифференцированных клеток [Cherepanova et al., 2016; Zalc et al., 2021].

В целом, исследования последних лет всё больше убеждают в том, что Oct4 может быть вовлечён в различные нормальные и патологические процессы в соматических клетках, в которых функционирование Oct4 происходит в определённых временных рамках, что усложняет его детекцию.

Чтобы отследить реактивацию гена Pou5f1, мы использовали два метода генной и геномной инженерии - генный нокаут на основе технологии CRISPR/Cas9 и подход "lineage tracing". Разработанная нами для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и мышей система приводится в состояние готовности только после введении химических индукторов, что позволяет избежать ее преждевременной активации на стадии эпибласта, а затем выявлять (уже в автономном режиме) ре-активацию Pou5f1 в дифференцированных потомках этих плюрипотентных клеток.

Полученные результаты нокаута Pou5f1 в эндотелиальных клетках дополнительно обосновывают значимость целостности Pou5f1 для

соматических клеток. Полученные данные и разработанные генетические инструменты позволят выявлять в будущем новые биологические процессы, имеющие место в ходе нормального развития и в ситуации патологии, в которые вовлечена функция Oct4.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка универсального подхода для детекции экспрессии гена Pou5f1 в клетках мыши.

Задачи:

1) Разработать модель системы для детекции сложных паттернов экспрессии гена Pou5f1 в клетках мыши.

2) Создать необходимые плазмидные вектора и поместить их в линию эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши.

3) Проверить работу системы in vitro, а также отобрать подходящие клетки для инъекции в бластоцисты мышей.

4) Получить химерных мышей и подтвердить передачу трансгенов через зародышевую линию.

5) Подтвердить значимость нокаута гена Pou5f1 в клетках млекопитающих.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование генетической системы с взаимозависимой экспрессией рекомбиназ позволяет детектировать активацию экспрессию гена Pou5f1 in vitro и ex vivo, а также фиксировать такие события в дочерних клетках.

2. Созданная система не требует постоянной активации химическими индукторами.

3. Система O4S может быть интегрирована в геном мыши и быть наследована потомками полученной химеры.

4. Целостность гена Pou5f1 важна для нормального функционирования эндотелиальных клеток человека и мыши.

Научная новизна работы. Все полученные данные являются принципиально новыми. Впервые была создана генетическая система для автоматического детектирования экспрессии гена Pou5f1, продемонстрирована её работоспособность in vitro. Путём инъекции в бластоцисты были получены химерные мыши, а также происходящие от них мыши поколения F1 и F2, доказывающие передачу трансгенных элементов через зародышевую линию и отсутствие связанных с такой манипуляцией нарушений в репродуктивной системе. Был показан эффект нокаута гена Pou5f1 в эндотелиальных клетках человека и мыши.

Теоретическое и практическое значение работы.

С одной стороны, представленная работа нацелена на получение фундаментальных знаний о новых биологических функциях гена Pou5f1. С другой стороны, ранее опубликованные и полученные в этой работе данные говорят и о потенциальном практическом значении, так как продукт исследуемого гена может стать целью терапии связанных с его отсутствием (или наоборот, с его нежелательной активацией) заболеваний. Более того, с практической точки зрения, разработанный подход может оказаться полезен для поиска новых источников клеток для репрограммирования, в том числе химического, а также для тестирования препаратов, нацеленных на системное частичное репрограммирование с целью замедления развития возрастных патологий.

Личный вклад автора. Вклад автора в разработку системы O4S является определяющим. Основные результаты представленной работы получены автором лично. Тератомный тест и анализ окрашенных срезов

осуществлялся совместно с Пономарцевым С. В. Сортировка клеток и проточная цитометрия осуществлялась совместно с Аксёновым Н. Д. Получение химерных животных проводилось совместно с отделом молекулярных механизмов онтогенеза Института Цитологии и Генетики СО РАН (зав. Серов О. Л.), а также с ЦКП SPF-виварием ИЦиГ СО РАН (ответственный исполнитель - Концевая Г. В.). Цитогенетические исследования проводились совместно с лабораторией некодирующей ДНК (зав. Енукашвили Н. И., исполнитель - Белик Л. А.). Нокаут Pou5f1 в эндотелиальных клетках и связанные эксперименты были осуществлены совместно с лабораторией Черепановой О.А. (Кливленд, США). Планы экспериментов и результаты работ обсуждались совместно с А. Н. Томилиным.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на семи конференциях. Трёх российских - IV Национальный конгресс по регенеративной медицине (МГУ, 2019), V Национальный конгресс по регенеративной медицине (МГУ, 2022), 13-я Международная научная конференция Биокатализ (Суздаль, 2023), а также на четырёх международных конференциях - Cell technologies at the edge: research and practice (CTERP, Saint-Petersburg, 2016), «Saint Petersburg OPEN 2017» 4th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics Engineering and Nanostructures (Saint-Petersburg, 2017), The second international conference "Cell technologies at the edge: From research to practice» (CTERP) "Translational research in cell therapy" (Moscow, 2018), 43rd FEBS Congress (Prague, Czech, 2018).

Финансовая поддержка работы.

Работа была выполнена при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема: «Молекулярно-клеточные механизмы онкологических, иммунных, метаболических заболеваний, моделирование и экспериментальное обоснование методов репрограммирования и онкотаргетинга», соглашение № 075-15-2020-773)

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, приложения, выводов и списка литературы, содержащего 133 ссылки на первоисточники. Работа изложена на 86 страницах, содержит 19 рисунков (в том числе 6-ть в приложении) и 2 таблицы.

Список публикаций по теме работы

Статьи:

1 Kuzmin, A. A., Ermakova, V. V., Sinenko, S. A., Ponomartsev, S. V., Starkova, T. Y., Skvortsova, E. V., Cherepanova, O., & Tomilin, A. N. (2019). Genetic tool for fate mapping of Oct4 (Pou5f1)-expressing cells and their progeny past the pluripotency stage. Stem Cell Research & Therapy, 10, 1-10. Q1, IF 7.5

2 Shin, J., Tkachenko, S., Chaklader, M., Pletz, C., Singh, K., Bulut, G. B., Han, Y. M., Mitchell, K., Baylis, R. A., Kuzmin, A. A., Hu, B., Lathia J. D., Stenina-Adognravi O., Podrez E., Byzova T. V., Owens G. K., & Cherepanova, O. A. (2022). Endothelial OCT4 is atheroprotective by preventing metabolic and phenotypic dysfunction. Cardiovascular Research, 118(11), 2458-2477. Q1, IF 10.8

3 Kuzmin, A. A., & Tomilin, A. N. (2023). Building Blocks of Artificial CRISPR-Based Systems beyond Nucleases. International Journal of Molecular Sciences, 24(1), 397. Q1, IF 5.6

Тезисы:

1 Kuzmin, A.A., Sinenko, S.A., Skvortsova, E., Sytnik, E., Tomilin A.N. Searching for Oct4: still active in differentiated cells? In Book of abstracts: "CTERP 2016 International conference cell technologies at the edge: research & practice / recent achievements in stem cells research", p. 40.

2 Kuzmin, A.A., Liskovykh, M.A., Tomilin, A.N. Sensibilization methods in

the field of pluripotency and regenerative medicine. In Book of abstracts: "4th

11

International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures": p. 240.

3 Kuzmin, A., Bakhmet, E., Selenina, A., Tomilin, A. Creation of a set of DNA constructs for genome editing of Oct4 locus with applications in stem cell biology. In Book of abstracts: "The second international conference Cell technologies at the edge: From research to practice (CTERP) Translational research in cell therapy": p. 99.

4 Kuzmin, A., Tomilin, A. Creation of a sensor system for independent detection of expression of the pluripotency factor Oct4. FEBS Open Bio, 8 (Suppl. S1): 164. https://doi.org/10.1002/2211-5463.12453

5 Кузьмин, А., Ермакова, В., Томилин, А. Создание системы для автоматического детектирования экспрессии гена Oct4 in vivo и in vitro. Гены и клетки, 2019, 14 (Приложение): 130.

6 Кузьмин, А.А., Кудряшов, В.В., Томилин, А.Н. Экспрессия гена Pou5f1 в раковых клетках мыши. Гены и клетки, 2022, .17 (3): 128.

7 Кузьмин, А.А., Фокин, Н.П., Томилин, А.Н. Молекулярно-генетические сенсоры для детекции экспрессии генов in vivo и in vitro. В сборнике тезисов: 13-я Международная научная конференция "Биокатализ. Фундаментальные исследования и применения": с. 240.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Плюрипотентные стволовые клетки. Общие сведения

Первые работы по плюрипотентным стволовым клеткам (ПСК) были проведены в 1950-х годах на клетках эмбриональной карциномы мыши -опухолевых клетках, способных образовывать тестикулярные тератомы у мышей. Было показано, что такие опухоли включают в себя клетки различных зародышевых листков (нервную ткань, бокаловидные клетки, хрящ, мышцы, костную ткань и пр.) [Stevens & Little, 1954]. Это и послужило свидетельством плюрипотентных характеристик обнаруженных клеток. Позже, в 1981 году из внутренней клеточной массы бластоцист мыши были получены первые культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), установлены общие свойства клеток эмбриональной карциномы и ЭСК [Martin et al., 1981].

Основными свойствами плюрипотентных клеток являются самообновление и способность дифференцироваться в любые клетки взрослого организма. Со временем понятие плюрипотентности претерпело значительные уточнения. Так, на сегодняшний день выделяют несколько состояний плюрипотентности - наивное, формативное и праймированное. Наивное состояние соответствует преимплантационному эпибласту (3.5-4.5 d.p.c.), праймированное - позднему эпибласту после имплантации (7.25-8 d.p.c.), тогда как состояние формативной плюрипотентности является промежуточным (Рис. 1.1) [Morgani, Nichols, Hadjantonakis, 2017].

Рисунок 1.1. Три состояния плюрипотентности. ICM - внутренняя клеточная масса, TE -трофэктодерма, ExE - экстраэмбриональная эктодерма, Epi - эпибласт, VE - висцеральная энтодерма, DVE - дистальная висцеральная энтодерма, PS - первичная полоска (Hoogland, Marks, 2021, с изменениями).

Примером формативного состояния у мыши можно считать плюрипотентные клетки эпибласта в стадии розетки, хотя они по своим характеристикам всё же ближе к наивным клеткам [Neagu et al., 2020]. Описанные выше состояния были воспроизведены и in vitro. Так, наивные ЭСК мыши в культуре поддерживаются за счёт ингибирования GSK-3 киназ, и, как следствие, активации сигнального пути WNT, а также подавление MEK/ERK сигнального пути ингибиторами CHIR99021 и PD0325921, соответственно, вместе обозначаемыми как 2i [Ying et al., 2008]. Праймированное же состояние достигается в культуре за счёт удаления 2i и добавления ростовых факторов Activin A (семейство TGF-beta) и bFGF, а его стабилизация достигается за счёт ингибиторов сигнального пути WNT -XAV939, IWR-1, IWP-2 или Pyrvinium [Kim et al., 2013; Sumi et al., 2013; Sugimoto et al., 2015].

Помимо разницы в условиях культивирования, наивные и праймированные клетки также обладают набором специфичных маркеров. Так, основными маркерами наивных ПСК считаются Klf4, Stella, Rexl, а праймированных - Fgf5 и Oct6 [Morgani, Nichols, Hadjantonakis, 2017; Weinberger et al., 2016; Khoa et al., 2016]. Однако основным маркером, а также незаменимым транскрипционным фактором всех трёх состояний плюрипотентности является белок Oct4.

1.2 Транскрипционный фактор Oct4.

1.2.1 Общие сведения.

Транскрипционный фактор Oct4 относится к V классу семейства POU-доменных белков, которое берёт своё название от первых букв его представителей - Pitl, Oct4 и Unc86 (Pit-Oct-Unc). Особенностью, объединяющей эти белки является наличие двух ДНК связывающих доменов (POU-специфичного и POU-гомео), способных специфично связываться с участками ДНК и объединённых неупорядоченным линкером [Herr et al., 1988; Zeineddine et al., 2014]. Для транскрипционного фактора Oct4 специфическим мотивом связывания в ДНК является консенсусная последовательность ATGCAAAT или NATGCAAANN [Pesce & Scholer, 2001; Jin et al., 2007].

Основным партнёром Oct4 в контексте плюрипотентности является транскрипционный фактор Sox2 (SRY-related HMG box 2), относящийся к HMG (High mobility group)-доменным белкам. Sox2 играет важную роль как на ранних стадиях эмбриогенеза, так и в дифференцировочных событиях, следующих за гаструляцией, в том числе в развитии нейроэктодермы [Chew et al., 2005; Graham et al., 2003; Wakamatsu & Uchikawa, 2021]. При этом гетеродимер Oct4/Sox2 регулирует экспрессию их собственных генов - Pou5f1 и Sox2, соответственно [Chew et al., 2005]. Другой важной мишенью этого гетеродимера является ген транскрипционого фактора Nanog - другого регулятора плюрипотентного статуса ЭСК [Chew et al., 2005].

В процессе эмбрионального развития материнский Oct4 деградирует до достижения стадии двуклеточного эмбриона, после чего реактивируется и равномерно экспрессируется во всех клетках на стадии морулы. В ходе дальнейшего развития экспрессия Oct4 сохраняется в клетках внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты, причем временно повышается при образовании примитивной энтодермы (ПЭ) [Pesce & Scholer, 2001; Nichols et al., 1009; Palmieri et al., 1994; Rosner et al., 1990]. После имплантации экспрессия Oct4 сохраняется только в клетках эпибласта, а после гаструляции - только в первичных половых клетках (Рис. 1.2) [Yeom et al., 1996].

Гонадный гребень

Рисунок 1.2. Цикл экспрессии Pou5f1. Экспрессия Pou5f1 обозначена зелёным цветом (Wu and Scholer, 2014, с изменениями).

Несмотря на присутствие Oct4 почти на всех стадиях раннего

эмбрионального развития, его функции до конца не выяснены. Так, было

показано, что при условном нокауте материнского Oct4 возможно получить

здоровое потомство у мышей. При этом полное удаление экспрессии Oct4

останавливает нормальное эмбриональное развитие на предимплантационной

стадии: ВКМ таких бластоцист содержит Nanog-позитивные

16

(плюрипотентные) клетки, однако, не способна дать начало первичной энтодерме [Wu et al., 2013; Le bin et al., 2014]. Клетки, полученные из ВКМ таких эмбрионов, не являлись плюрипотентными [Wu et al., 2013; Jerabek et al., 2014]. Кроме этого, энуклеированные ооциты, не содержащие Oct4, сохраняют способность репрограммировать соматические клетки в плюрипотентное состояние [Wu et al., 2013]. Таким образом, несмотря на свою важность на преимплантационной стадии, Oct4 в ходе раннего развития не является индуктором плюрипотентного состояния клеток, однако, он важен для поддержания этого состояния в клетках эпибласта.

1.2.2 Регуляция и сигнальные пути

Регуляция экспрессии Pou5f1 в мышиных плюрипотентных клетках осуществляется с помощью трёх основных регуляторных элементов - ТАТА-независимого проксимального промотора (ПП), проксимального и дистального энхансеров (ПЭ и ДЭ, соответственно) [Yeom et al., 1996]. Эти энхансеры ответственны за экспрессию Pou5f1 на разных стадиях развития эмбриона. Так, в наивных ЭСК активным является ДЭ, тогда как в праймированном состоянии управление экспрессией Pou5f1 передаётся на ПЭ. В дополнение, у человека был охарактеризован дополнительный регуляторный элемент, находящийся в первом интроне и играющий важную роль в экспрессии Oct4 в наивных ЭСК [Pastor et al., 2018]. Метилирование перечисленных элементов отражает транскрипционный статус гена Pou5f1 и зависит от метилтрансфераз Dnmt3a и Dnmt3b [Li et al., 2007]. Их транскрипция опосредуется в процессе дифференцировки ЭСК микроРНК miR290-295, при этом привлечение Dnmt3a/b к регуляторным элементам Pou5f1 может дополнительно осуществляться рецептором GCNF (Germ Cell Nuclear Factor) [Sinkkonen et al., 2008; Sato, Kondo, Araki, 2006; Kellner & Kikyo, 2010]. Было также показано, что существует метастабильное состояние энхансеров Pou5f1, при котором их активность может быть неразличимой по установленным гистоновым меткам [Choi et al., 2016].

Основными сигнальными путями в ЭСК, в которых участвует непосредственно Oct4, являются WNT и TGFbeta/Activin/Nodal. Так, было показано, что физическое взаимодействие Oct4 и ß-catenin приводит к увеличению активности репортерной конструкции, содержащей сайт связывания Oct4 - PORE (palindromic Oct-factor recognition element), при этом одновременно усиливается экспрессия другого фактора плюрипотентности -Nanog [Kelly et al., 2011; Tomilin et al., 2000]. В дополнение, на ЭСК человека была показана важность взаимодействия Oct4 и ß-catenin в ходе дифференцировки в дефинитивную энтодерму [Ying et al., 2015]. Кроме этого, и для человеческих, и для мышиных ЭСК была показана колокализация сигналов связывания Oct4 и Smad3, в том числе в регуляторной области гена самого Oct4, а также Leftyl [Mullen et al., 2011]. Также, было показано, что взаимодействие Oct4 и Smad3 необходимо для корректной регуляции Rifl в ходе репликации и нормального ответа на генотоксический стресс [Li et al., 2015]. Интересно, что и другой сигнальный каскад, вовлечённый в пространственную организацию тканей, также непосредственно связан с белком Oct4. На ЭСК человека было показано, что OCT4 связывается с транскрипционными эффекторами сигнального пути Hippo (TAZ/YAP/TEAD), образуя макромолекулярный комплекс (TSO), супрессирующий мезентодермальную спецификацию клеток [Beyer et al., 2013].

1.2.3 Изоформы и псевдогены

С точки зрения структурной организации, ген Pou5f1 состоит из пяти экзонов. При этом и у человека, и у мыши за счёт альтернативного сплайсинга и альтернативных сайтов инициации трансляции может существовать несколько изоформ белка Oct4. Непосредственно плюрипотентная изоформа, обуславливающая его функции в ЭСК, обозначаемая как Oct4A и кодируемая всеми 5 экзонами, имеет наибольшую длину - 353 аминокислот. Изоформа Oct4B отличается от основной N-терминальным доменом, который не включает в себя последовательность, кодируемую первым экзоном, но имеет

дополнительный участок, транслируемый за счёт 1RES элемента 5' от второго экзона, и имеет длину 247 аминокислот [Guo et al., 2012]. При этом для человека было показано, что внутренний сайт связывания рибосом также обладает и криптической промоторной активностью, однако вклад этой активности в образование изоформы менее значителен [Wang et al., 2009]. Помимо основных изоформ, за счёт альтернативной трансляции возможно образование усечённых изоформ Oct4B - Oct4B-190aa, Oct4B-164aa [Guo et al., 2012; Wang et al., 2010]. Интересно, что изоформы Oct4B не только играют отличную от Oct4A роль, но и имеют различную клеточную локализацию [Guo et al., 2012].

1.2.4 Oct4 вне концепции плюрипотентности

Когда было установлено, что Oct4 является важным регулятором плюрипотентности, встал вопрос о его функциях в соматических клетках. К настоящему времени большинство данных о функциях Oct4 в соматических клетках связаны с его участием в жизнедеятельности раковых клеток. Так, экспрессия Oct4 была обнаружена в раковых клетках мочевого пузыря и клетках гепатоцеллюлярной карциномы [Atlasi et al., 2007; Wu et al., 2015]. При этом стоит отметить, что данные были получены при помощи методов вестерн-блота, ОТ-ПЦР, иммуногистохимии и репортерных конструкций. Данные способы не позволяют сделать однозначные выводы об экспрессии Oct4, т.к. могут улавливать неплюрипотентные изоформы Oct4 и его псевдогены [Warthermann et al., 2012; Mehravar, Ghaemimanesh, Poursani, 2021; Wang et al., 2010]. При этом другая часть исследований, посвящённых роли Oct4 в раковых клетках, направлена даже не на детекцию его эндогенной экспрессии, а использует результаты эктопической экспрессии в качестве свидетельства роли Oct4 в раковых клетках, в особенности, в их устойчивости к химиотерапии [Wang et al., 2010; Kumar et al., 2012].

Однако, среди множества спорных исследований есть и те, в которых использованы весьма точные методы для подтверждения влияния Oct4 на

19

раковые клетки. Так, Filipponi с соавторами показали, что в ответ на повреждения ДНК в раковых клетках, независимо от их иерархии в опухоли, могут возникнуть эпигенетические изменения, приводящие к активации гена POU5f1. При этом подобная реактивация может привести как к большей хеморезистентности раковых клеток, так и к рецидиву заболевания. Авторы использовали модель с OCT4-Cre-зависимым мечением опухолевых клеток, что гарантировало активацию именно гена интереса [Filipponi et al., 2019]. В другом исследовании Zhou с соавторами показали, что нокаут гена POU5f1 приводит к снижению способности раковых клеток к самообновлению и миграции, а также к повышенной чувствительности к антираковым препаратам. Более того, они обнаружили, что уровень экспрессии белкового продукта гена POU5f1 на три порядка меньше такового в плюрипотентных клетках, и доказали c помощью масс-спектрометрии, что изменения в поведении раковых клеток обусловлены активностью OCT4A [Zhou et al., 2018].

Помимо раковых клеток, большой интерес представляет собой экспрессия Pou5f1 в нетрансформированных, нормальных клетках организма в онтогенезе. С одной стороны, в 2007 году на мышиной модели при помощи условного нокаута Pou5f1 в различных тканях (мозг, волосяные фолликулы, кишечный эпителий, печень, костный мозг) было продемонстрировано, что Oct4 не нужен для нормального функционирования перечисленных тканей [Lengner et al., 2007]. Тем не менее, спустя почти 10 лет, Cherepanova с соавторами на похожей модели показала, что нокаут гена Pou5f1 в гладкомышечных клетках (ГМК) приводит к ухудшению атеросклеротического фенотипа сосудов. Так, бляшки становились крупнее, при этом более нестабильными, что объяснялось нарушениями дедифференцировки и миграции ГМК [Cherepanova et al., 2016]. Кроме того, была показана важность экспрессии Pou5f1 и на более раннем этапе онтогенеза - в ходе эмбрионального развития, а именно в клетках нервного гребня [Zalc

et al., 2021]. Авторы исследования показали, что реактивация Oct4 в этих клетках обуславливает их способность переходить из нейроэктодермального состояния в состояние близкое к плюрипотентному, что делает возможным их дальнейшую дифференцировку в клетки мезодермы черепно-лицевых отделов [Zalc et al., 2021]. Особенно убедительным это исследование делает комплексный подход авторов к доказательству функции Oct4. Исследовав популяцию краниальных клеток нервного гребня (англ. cranial neural crest cells) при помощи технологии секвенирования РНК одиночных клеток (англ. single-cell RNA-seq, scRNA-seq), авторы обнаружили популяцию Wnt1-позитивных клеток, в которой экспрессия Oct4 входила в категорию наиболее активно экспрессируемых генов. Более того, в этих клетках обнаруживалась экспрессия и другого фактора плюрипотентности - Nanog (а также Sox2 и Klf4, являющихся менее специфичными конкретно для плюрипотентных клеток). Помимо РНК-секвенирования, Zalc и соавторы провели успешную in situ гибридизацию на Oct4 и Nanog мРНК, а также применили методы «lineage tracing» для дополнительного доказательства именно реактивации Oct4 и вклада Oct4+-клеток в дальнейшее развитие эмбриона. Более того, при помощи условного нокаута Oct4, авторы доказали, что его экспрессия незаменима для эктомезенхимной спецификации клеток нервного гребня [Zalc et al., 2021].

1.2.5 Oct4 и клеточная пластичность

В контексте упомянутых исследований интересными представляются работы, направленные на использование транскрипционного фактора Oct4 для изменения клеточной специализации путём его эктопической экспрессии. Основным направлением подобных исследований является получение иПСК. Фундамент для этих исследований был заложен ещё в 20 веке. Одними из первых экспериментов по ре-дифференцировке клеток одного типа в другой, были эксперименты по трансдифференцировке фибробластов в мышечные клетки, при помощи форсированной экспресии гена MyoD [Graf et al., 2011; Davis, Weintraub, Lassar, 1987; Stadtfeld & Hochedlinger, 2010]. Позднее, Xie с

коллегами продемонстрировали, что В- и Т-клетки могут быть конвертированы в функциональные макрофаги с помощью эктопической экспрессии миелоидного траскрипционного фактора C/EBPa [Xie et al., 2004]. Приведённые выше исследования, а также другие работы заложили фундамент для системного и интенсивного поиска факторов, способных переводить обычные клетки в плюрипотентное состояние.

В 2006 году вышла работа, определившая на длительную перспективу вектор исследований по тематике стволовых клеток, - статья Кадзутоши Такахаши и Синьи Яманаки, которые, перебрав 24 кандидатов, отобрали 4 транскрипционных фактора (Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc), способных индуцировать плюрипотентное состояния клеток [Takahashi & Yamanaka, 2006]. В дальнейшем, данный «коктейль» репрограммирующих факторов видоизменялся, в результате чего были созданы различные его варианты, которые можно было использовать в том или ином клеточном контексте [Yu et al., 2007; Kim et al., 2008]. В том числе, было показано, что одного Oct4 достаточно для репрограммирования нейрональных стволовых клеток [Kim et al., 2009].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кузьмин Андрей Анатольевич, 2023 год

Список литературы

1) Amat F. et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data //Nature methods. - 2014. - Т. 11. - №. 9. - С. 951958.

2) Anastassiadis K. et al. Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice //Disease models & mechanisms. - 2009. - Т. 2. - №. 9-10. - С. 508-515.

3) Atlasi Y. et al. OCT-4, an embryonic stem cell marker, is highly expressed in bladder cancer //International Journal of Cancer. - 2007. - Т. 120. - №2. 7. - С. 15981602.

4) Axelrod D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization //Biophysical journal. - 1979. - Т. 26. - №. 3. - С. 557-573.

5) Beyer T. A. et al. Switch enhancers interpret TGF-ß and Hippo signaling to control cell fate in human embryonic stem cells //Cell reports. - 2013. - Т. 5. - №. 6. - С. 1611-1624.

6) Bjornson C. R. R. et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo //Science. - 1999. - Т. 283. - №. 5401. - С. 534537.

7) Bogdanove, A.J. & Voytas, D.F. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting. Science 333, 1843-1846 (2011).

8) Browder K. C. et al. In vivo partial reprogramming alters age-associated molecular changes during physiological aging in mice //Nature Aging. - 2022. - Т. 2. - №. 3. - С. 243-253.

9) Carey B.W. et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2009. - V. 106. - N. 1. - P. 157-162.

10) Chen F., Pruett-Miller S. M., Davis G. D. Gene editing using ssODNs with engineered endonucleases //Chromosomal Mutagenesis. - 2015. - С. 251-265.

11) Chen P. Y. et al. Endothelial TGF-ß signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis //Nature metabolism. - 2019. - T. 1. - №. 9. - C. 912-926.

12) Chen P. Y. et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression //The Journal of clinical investigation. - 2015. - T. 125. - №. 12. - C. 4514-4528.

13) Chen Y. et al. The chemical reprogramming of unipotent adult germ cells towards authentic pluripotency and de novo establishment of imprinting //Protein & Cell. - 2023. - T. 14. - №. 7. - C. 479-498.

14) Cherepanova O. A. et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective //Nature medicine. - 2016. - T. 22. - №. 6.

- C. 657-665.

15) Chew J. L. et al. Reciprocal transcriptional regulation of Pou5f1 and Sox2 via the Oct4/Sox2 complex in embryonic stem cells //Molecular and cellular biology. -2005. - T. 25. - №. 14. - C. 6031-6046.

16) Choi H. W. et al. Distinct enhancer activity of Oct4 in naive and primed mouse pluripotency //Stem cell reports. - 2016. - T. 7. - №. 5. - C. 911-926.

17) Clarke D. L. et al. Generalized potential of adult neural stem cells //Science.

- 2000. - T. 288. - №. 5471. - C. 1660-1663.

18) Cong L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems //Science. - 2013. - T. 339. - №. 6121. - C. 819-823.

19) Conklin E. G. The organization and cell-lineage of the ascidian egg. - 1905.

- T. 13.

20) Dang Y. et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency //Genome biology. - 2015. - T. 16. - №. 1. - C. 1-10.

21) Davis R.L., Weintraub H., Lassar A.B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts // Cell. - 1987. - V. 51. - N. 6. - P. 9871000.

22) Evrard S. M. et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability //Nature communications. - 2016. - T. 7. - №. 1. - C. 11853.

23) Fatima S., Zhou S., Sorrentino B. P. Abcg2 expression marks tissue-specific stem cells in multiple organs in a mouse progeny tracking model //Stem Cells. -2012. - T. 30. - №. 2. - C. 210-221.

24) Feil R. et al. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains //Biochemical and biophysical research communications. - 1997. - T. 237. - №. 3. - C. 752-757.

25) Fekete D. M., Cepko C. L. Retroviral infection coupled with tissue transplantation limits gene transfer in the chicken embryo //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1993. - T. 90. - №. 6. - C. 2350-2354.

26) Filipponi D. et al. DNA damage signaling-induced cancer cell reprogramming as a driver of tumor relapse //Molecular cell. - 2019. - T. 74. - №. 4. - C. 651-663. e8.

27) Forss-Petter S. et al. Transgenic mice expressing ß-galactosidase in mature neurons under neuron-specific enolase promoter control //Neuron. - 1990. - T. 5. -№. 2. - C. 187-197.

28) González F., Boué S., Izpisúa Belmonte J.C. Methods for making induced pluripotent stem cells: reprogramming á la carte // Nature reviews. Genetics. - 2011. - V. 12. - N. 4. - P. 231-242.

29) Graf T. Historical origins of transdifferentiation and reprogramming // Cell stem cell. - 2011. - V. 9. - N. 6. - P. 504-516.

30) Graham V. et al. SOX2 functions to maintain neural progenitor identity //Neuron. - 2003. - T. 39. - №. 5. - C. 749-765.

31) Greder L. V. et al. Brief report: analysis of endogenous Oct4 activation during induced pluripotent stem cell reprogramming using an inducible Oct4 lineage label //Stem cells. - 2012. - T. 30. - №. 11. - C. 2596-2601.

32) Guan J. et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells //Nature. - 2022. - T. 605. - №. 7909. - C. 325-331.

33) Guo C. et al. A novel variant of Oct3/4 gene in mouse embryonic stem cells //Stem cell research. - 2012. - T. 9. - №. 2. - C. 69-76.

34) Han J. et al. Efficient in vivo deletion of a large imprinted lncRNA by CRISPR/Cas9 //RNA biology. - 2014. - T. 11. - №. 7. - C. 829-835.

35) Herr W. et al. The POU domain: a large conserved region in the mammalian pit-1, oct-1, oct-2, and Caenorhabditis elegans unc-86 gene products //Genes & development. - 1988. - T. 2. - №. 12a. - C. 1513-1516.

36) Higashikuni, Yasutomi, et al. The ATP-binding cassette transporter BCRP1/ABCG2 plays a pivotal role in cardiac repair after myocardial infarction via modulation of microvascular endothelial cell survival and function // Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. - 2010. - T.30. - №2 3. - C. 21282135.

37) Holt C. E., Garlick N., Cornel E. Lipofection of cDNAs in the embryonic vertebrate central nervous system //Neuron. - 1990. - T. 4. - №. 2. - C. 203-214.

38) Hong Y. J. et al. In vivo generation of neural stem cells through teratoma formation //Stem cells and development. - 2016. - T. 25. - №. 17. - C. 1311-1317.

39) Hoogland S. H. A., Marks H. Developments in pluripotency: a new formative state //Cell Research. - 2021. - T. 31. - №. 5. - C. 493-494.

40) Hsu P. D., Lander E. S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering //Cell. - 2014. - T. 157. - №. 6. - C. 1262-1278.

41) Huber P. et al. Genomic structure and chromosomal mapping of the mouse VE-cadherin gene (Cdh5) //Genomics. - 1996. - T. 32. - №. 1. - C. 21-28.

42) Itasaki N., Bel-Vialar S., Krumlauf R. Shocking'developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression //Nature cell biology. -1999. - T. 1. - C. E203-E208.

43) Iwafuchi-Doi M., Zaret K. S. Pioneer transcription factors in cell reprogramming //Genes & development. - 2014. - T. 28. - №. 24. - C. 2679-2692

44) Jerabek S. et al. OCT4: dynamic DNA binding pioneers stem cell pluripotency //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. - 2014. - T. 1839. - №. 3. - C. 138-154.

45) Jin V. X. et al. Identification of an OCT4 and SRY regulatory module using integrated computational and experimental genomics approaches //Genome research. - 2007. - T. 17. - №. 6. - C. 807-817.

46) Kehler J. et al. Oct4 is required for primordial germ cell survival //EMBO reports. - 2004. - T. 5. - №. 11. - C. 1078-1083.

47) Kellner S., Kikyo N. Transcriptional regulation of the Oct4 gene, a master gene for pluripotency //Histology and histopathology. - 2010. - T. 25. - №. 3. - C. 405.

48) Kelly K. F. et al. ß-catenin enhances Oct-4 activity and reinforces pluripotency through a TCF-independent mechanism //Cell stem cell. - 2011. - T. 8. - №. 2. - C. 214-227.

49) Khoa L. T. P. et al. Visualization of the epiblast and visceral endodermal cells using Fgf5-P2A-Venus BAC transgenic mice and epiblast stem cells //PLoS One. -2016. - T. 11. - №. 7. - C. e0159246.

50) Kim H. et al. Modulation of ß-catenin function maintains mouse epiblast stem cell and human embryonic stem cell self-renewal //Nature communications. - 2013. - T. 4. - №. 1. - C. 2403.

51) Kim J. B. et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4 //nature. - 2009. - T. 461. - №. 7264. - C. 649-653.

52) Kim J. B. et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells //cell. -2009. - T. 136. - №. 3. - C. 411-419.

53) Kim J. B. et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors //nature. - 2008. - T. 454. - №. 7204. - C. 646650.

54) Kim Y. G., Cha J., Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1996. - T. 93. - №. 3. - C. 1156-1160.

55) Kina T. et al. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine

erythroid lineage //British journal of haematology. - 2000. - T. 109. - №. 2. - C. 280-287.

56) Kranz A. et al. An improved Flp deleter mouse in C57Bl/6 based on Flpo recombinase //genesis. - 2010. - T. 48. - №. 8. - C. 512-520.

57) Kumar R. et al. Induction of whole-body gene deletion via R26-regulated tamoxifen-inducible Cre recombinase activity //Frontiers in Pharmacology. - 2022. - T. 13. - C. 1018798.

58) Kumar S. M. et al. Acquired cancer stem cell phenotypes through Oct4-mediated dedifferentiation //Oncogene. - 2012. - T. 31. - №. 47. - C. 4898-4911.

59) Lander E. S. The heroes of CRISPR //Cell. - 2016. - T. 164. - №. 1. - C. 1828.

60) Le Bin G. C. et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst //Development. - 2014. - T. 141. - №. 5. - C. 1001-1010.

61) Lee J. H. et al. Single transcription factor conversion of human blood fate to NPCs with CNS and PNS developmental capacity //Cell reports. - 2015. - T. 11. -№. 9. - C. 1367-1376.

62) Lemischka I. R., Raulet D. H., Mulligan R. C. Developmental potential and dynamic behavior of hematopoietic stem cells //Cell. - 1986. - T. 45. - №. 6. - C. 917-927.

63) Lengner C. J. et al. Oct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal //Cell stem cell. - 2007. - T. 1. - №. 4. - C. 403-415.

64) Li J. Y. et al. Synergistic function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4 and Nanog //Molecular and cellular biology. -2007. - T. 27. - №. 24. - C. 8748-8759.

65) Li P. et al. A tight control of Rif1 by Oct4 and Smad3 is critical for mouse embryonic stem cell stability //Cell Death & Disease. - 2015. - T. 6. - №. 1. - C. e1588-e1588.

66) Malfait J., Wan J., Spicuglia S. Epromoters are new players in the regulatory landscape with potential pleiotropic roles //BioEssays. - 2023. - C. 2300012.

67) Martin G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1981. - T. 78. - №. 12. - C. 7634-7638.

68) Mehravar M., Ghaemimanesh F., Poursani E. M. An overview on the complexity of OCT4: at the level of DNA, RNA and protein //Stem Cell Reviews and Reports. - 2021. - C. 1-16.

69) Mitchell R. et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors //Stem Cells. - 2014b. - T. 32. - №. 8. - C. 2178-2187.

70) Mitchell R. R. et al. Activation of neural cell fate programs toward direct conversion of adult human fibroblasts into tri-potent neural progenitors using OCT-4 //Stem cells and development. - 2014. - T. 23. - №. 16. - C. 1937-1946.

71) Miyaoka Y. et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing //Scientific reports. - 2016. - T. 6. - №. 1. - C. 23549.

72) Morgani S., Nichols J., Hadjantonakis A. K. The many faces of Pluripotency: in vitro adaptations of a continuum of in vivo states //BMC developmental biology. - 2017. - T. 17. - №. 1. - C. 1-20.

73) Moscou M. J., Bogdanove A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors //Science. - 2009. - T. 326. - №. 5959. - C. 1501-1501.

74) Mullen A. C. et al. Master transcription factors determine cell-type-specific responses to TGF-ß signaling //Cell. - 2011. - T. 147. - №. 3. - C. 565-576.

75) Muzzey D., Van Oudenaarden A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells //Annual Review of Cell and Developmental. - 2009. -T. 25. - C. 301-327.

76) Nakashima Y. et al. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree //Arteriosclerosis and thrombosis: a journal of vascular biology. - 1994. - T. 14. - №. 1. - C. 133-140.

77) Neagu A. et al. In vitro capture and characterization of embryonic rosettestage pluripotency between naive and primed states //Nature cell biology. - 2020. -T. 22. - №. 5. - C. 534-545.

78) Nichols J. et al. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4 //Cell. - 1998. - T. 95. - №. 3. - C. 379-391.

79) Orban P. C., Chui D., Marth J. D. Tissue-and site-specific DNA recombination in transgenic mice //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1992. - T. 89. - №. 15. - C. 6861-6865.

80) Palmieri S. L. et al. Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation //Developmental biology. - 1994. - T. 166. - №. 1. - C. 259-267.

81) Palmieri S. L. et al. Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation //Developmental biology. - 1994. - T. 166. - №. 1. - C. 259-267.

82) Pan G. J. et al. Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4 //Cell research. - 2002. - T. 12. - №. 5. - C. 321-329.

83) Pastor W. A. et al. TFAP2C regulates transcription in human naive pluripotency by opening enhancers //Nature cell biology. - 2018. - T. 20. - №. 5. -C. 553-564.

84) Pesce M., Schöler H. R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development //Stem cells. - 2001. - T. 19. - №. 4. - C. 271-278.

85) Ran F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system //Nature protocols. - 2013. - T. 8. - №. 11. - C. 2281-2308.

86) Rosner M. H. et al. A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo //Nature. - 1990. - T. 345. - №. 6277. - C. 686-692.

87) Sander J. D., Joung J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes //Nature biotechnology. - 2014. - T. 32. - №. 4. - C. 347-355.

88) Santiago-Algarra D. et al. Epromoters function as a hub to recruit key transcription factors required for the inflammatory response //Nature communications. - 2021. - T. 12. - №. 1. - C. 6660.

89) Sato N., Kondo M., Arai K. The orphan nuclear receptor GCNF recruits DNA methyltransferase for Oct-3/4 silencing //Biochemical and biophysical research communications. - 2006. - T. 344. - №. 3. - C. 845-851.

90) Sauer B. Site-specific recombination: developments and applications //Current opinion in biotechnology. - 1994. - T. 5. - №. 5. - C. 521-527.

91) Schöler H. R. et al. A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor //The EMBO journal. - 1989. - T. 8. - №. 9. - C. 2543-2550.

92) Schöler H. R. et al. New type of POU domain in germ line-specific protein Oct-4 //Nature. - 1990. - T. 344. - №. 6265. - C. 435-439.

93) Schroeder T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells //Nature methods. - 2011. - T. 8. - №. 4. - C. S30-S35.

94) Shao L., Wu W.S. Gene-delivery systems for iPS cell generation // Expert opinion on biological therapy. - 2010. - V. 10. - N. 2. - P. 231-242.

95) Sinkkonen L. et al. MicroRNAs control de novo DNA methylation through regulation of transcriptional repressors in mouse embryonic stem cells //Nature structural & molecular biology. - 2008. - T. 15. - №. 3. - C. 259-267.

96) Smith J. et al. A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences //Nucleic acids research. - 2006. - T. 34. - №. 22. - C. e149-e149.

97) Sommer C. A. et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette //Stem cells. - 2009. - T. 27. - №. 3. - C. 543-549.

98) Stadtfeld M., Hochedlinger K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications // Genes & development. - 2010. - V. 24. - N. 20. - P. 2239-2263

99) Stevens Jr L. C., Little C. C. Spontaneous testicular teratomas in an inbred strain of mice //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1954. - T. 40.

- №. 11. - C. 1080-1087.

100) Stoddard B. L. Homing endonucleases: from microbial genetic invaders to reagents for targeted DNA modification //Structure. - 2011. - T. 19. - №. 1. - C. 715.

101) Sugimoto M. et al. A simple and robust method for establishing homogeneous mouse epiblast stem cell lines by wnt inhibition //Stem Cell Reports. - 2015. - T. 4.

- №. 4. - C. 744-757.

102) Sumi T. et al. Epiblast ground state is controlled by canonical Wnt/p-catenin signaling in the postimplantation mouse embryo and epiblast stem cells //PloS one.

- 2013. - T. 8. - №. 5. - C. e63378.

103) Szabo E. et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors //Nature. - 2010. - T. 468. - №. 7323. - C. 521-526.

104) Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors //cell. - 2006. - T. 126. -№. 4. - C. 663-676.

105) Tang B. et al. A flexible reporter system for direct observation and isolation of cancer stem cells //Stem cell reports. - 2015. - T. 4. - №. 1. - C. 155-169.

106) Tomilin A. et al. Synergism with the coactivator OBF-1 (OCA-B, BOB-1) is mediated by a specific POU dimer configuration //Cell. - 2000. - T. 103. - №. 6. -C. 853-864.

107) Urnov F. D. et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases //Nature Reviews Genetics. - 2010. - T. 11. - №. 9. - C. 636-646.

108) Wakamatsu Y., Uchikawa M. The many faces of Sox2 function in neural crest development //Development, Growth & Differentiation. - 2021. - T. 63. - №. 1. -C. 93-99.

109) Walters E. M. et al. Mutational Insertion of a ROSA26-EGFP Transgene Leads to Defects in Spermiogenesis and Male Infertility in Mice //Comparative medicine. - 2009. - T. 59. - №. 6. - C. 545-552.

110) Wang Q. T. et al. A genome-wide study of gene activity reveals developmental signaling pathways in the preimplantation mouse embryo //Developmental cell. -2004. - T. 6. - №. 1. - C. 133-144.

111) Wang X. et al. Alternative translation of OCT4 by an internal ribosome entry site and its novel function in stress response //Stem cells. - 2009. - T. 27. - №. 6. -C. 1265-1275.

112) Wang X. Q. et al. Octamer 4 (Oct4) mediates chemotherapeutic drug resistance in liver cancer cells through a potential Oct4-AKT-ATP-binding cassette G2 pathway //Hepatology. - 2010. - T. 52. - №. 2. - C. 528-539.

113) Wang X., Dai J. Concise review: isoforms of OCT4 contribute to the confusing diversity in stem cell biology //Stem cells. - 2010. - T. 28. - №. 5. - C. 885-893.

114) Warthemann R. et al. False-positive antibody signals for the pluripotency factor OCT4A (POU5F1) in testis-derived cells may lead to erroneous data and misinterpretations //Molecular human reproduction. - 2012. - T. 18. - №. 12. - C. 605-612.

115) Weinberger L. et al. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans //Nature reviews Molecular cell biology. - 2016. - T. 17. -№. 3. - C. 155-169.

116) Weisblat D. A., Sawyer R. T., Stent G. S. Cell lineage analysis by intracellular injection of a tracer enzyme //Science. - 1978. - T. 202. - №. 4374. - C. 1295-1298.

117) Wesselschmidt R. L. The teratoma assay: an in vivo assessment of pluripotency //Human Pluripotent Stem Cells: Methods and Protocols. - 2011. - C. 231-241.

118) Whetzel A. M. et al. ABCG1 deficiency in mice promotes endothelial activation and monocyte-endothelial interactions //Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. - 2010. - T. 30. - №. 4. - C. 809-817.

119) Wiedenheft B., Sternberg S. H., Doudna J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea //Nature. - 2012. - T. 482. - №. 7385. - C. 331-338.

120) Wu G. et al. Establishment of totipotency does not depend on Oct4A //Nature cell biology. - 2013. - T. 15. - №. 9. - C. 1089-1097.

121) Wu G. et al. Oct4 is a reliable marker of liver tumor propagating cells in hepatocellular carcinoma //Discovery medicine. - 2015. - T. 20. - №2. 110. - C. 219229.

122) Wu G., Schöler H. R. Role of Oct4 in the early embryo development //Cell Regeneration. - 2014. - T. 3. - №. 1. - C. 1-10.

123) Wurmser A. E. et al. Cell fusion-independent differentiation of neural stem cells to the endothelial lineage //Nature. - 2004. - T. 430. - №. 6997. - C. 350-356.

124) Xie H. et al. Stepwise reprogramming of B cells into macrophages //Cell. -2004. - T. 117. - №. 5. - C. 663-676.

125) Xu Z. et al. Wnt/ß-catenin signaling promotes self-renewal and inhibits the primed state transition in naïve human embryonic stem cells //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2016. - T. 113. - №. 42. - C. E6382-E6390.

126) Yang J. H. et al. Chemically induced reprogramming to reverse cellular aging //Aging (Albany NY). - 2023. - T. 15. - №. 13. - C. 5966.

127) Yeom Y. I. et al. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells //Development. - 1996. - T. 122. - №. 3. - C. 881-894.

128) Ying L. et al. OCT4 coordinates with WNT signaling to pre-pattern chromatin at the SOX17 locus during human ES cell differentiation into definitive endoderm //Stem Cell Reports. - 2015. - T. 5. - №. 4. - C. 490-498.

129) Ying Q. L. et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal //nature. - 2008. - T. 453. - №. 7194. - C. 519-523.

130) Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells //science. - 2007. - T. 318. - №. 5858. - C. 1917-1920.

131) Zalc A. et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest //Science. - 2021. - T. 371. - №. 6529. - C. eabb4776.

132) Zeineddine D. et al. The Oct4 protein: more than a magic stemness marker //American journal of stem cells. - 2014. - T. 3. - №. 2. - C. 74.

133) Zhou Y. et al. Endogenous authentic OCT4A proteins directly regulate FOS/AP-1 transcription in somatic cancer cells //Cell death & disease. - 2018. - T. 9. - №. 6.

Благодарности

Автор выражает благодарность ближайшим родным - Кузьминой Ольге Анатольевне и Кузьминой Тамаре Николаевне за поддержку и помощь на протяжении всей жизни.

Автор благодарен своему первому учителю биологии - Максимову Николаю Сергеевичу за первые шаги на выбранном поприще.

Автор благодарен своему научному руководителю - Томилину Алексею Николаевичу за возможность открыть для себя академическую науку, а также за всестороннюю помощь в реализации соответствующих проектов, в том числе за поддержку в работе над диссертацией.

Автор благодарен коллективу лаборатории Молекулярной биологии стволовых клеток за скрашивание рабочих будней.

Автор благодарен всем участвующим в обсуждении и улучшении настоящей работы, в том числе за терпение.

Автор благодарен всем сотрудникам института Цитологии, а также других отечественных и иностранных учреждений, с которыми удалось поработать и пообщаться за последние годы.