Исследование взаимной регуляции экспрессии гена Pou5f1 и его генетического окружения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Ермакова Вероника Владимировна

• Ермакова Вероника Владимировна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Ермакова Вероника Владимировна

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роп5/1 в поддержании плюрипотентности

1.2. Функции Роп5/1 в соматических клетках

1.3. Характеристика локуса гена Роп5/1

1.4. Эволюционные аспекты формирования локуса Роп5/1-МИС

1.2.1 Регуляторные элементы

1.5. Регуляторные элементы гена Роп5/1

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культивирование ЭСК

2.2. Получение митотически инактивированных фибробластов

2.3 Плазмиды

2.4. Трансфекция ЭСК

2.5. Сортировка ЭСК после трансфекции

2.6 Получение мутантных линий ЭСК

2.7. Отбор клонов

2.8. Секвенирование по Сэнгеру

2.9. Приготовление препаратов метафазных хромосом

2.10. Иммуноблоттинг

2.11. Проточная цитометрия

2.12. Иммуноцитохимическое окрашивание

2.13. Выделение тотальной РНК и синтез кДНК

2.14. Полимеразная цепная реакция в реальном времени

2.15. Тератомный тест

2.16 Подготовка срезов для гистологического анализа

2.16 Статистический анализ

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Создание моделей на основе ЭСК мыши для изучения взаимовлияния Роп5/1 и его генетического окружения

3.2 Получение контрольных линий ЭСК

3.3. Свойства полученных ЭСК в сывороточных условиях

3.4. Свойства ЭСК в состоянии наивной плюрипотентности

3.5. Свойства клеток в состоянии праймированной плюрипотентности

3.6. Получение контрольных линий ЭСК с нокаутом Роп5/1

3.7. Оценка влияния промотора Роп5/1 на генное окружение в ЭСК

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Особенности разработанной модели для изучения гена Роп5/1

4.2 Регуляция экспрессии Роп5/1

4.1 Влияние транслокации гена Роп5/1

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список используемых сокращений

БЕ - дистальный энхансер

РЕ - проксимальный энхансер

20Л - зиготическая активация генома

ВКМ - внутренняя клеточная масса

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

иПСК - индуцированные плюрипотентные клетки

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МЭФ - мышиные эмбриональные фибробласты

ПААГ - полиакриламидный гель

ППК - первичные половые клетки

ПСК - плюрипотентные стволовые клетки

ТРЭ - транс-регуляторные элементы

ЦРЭ - цис-регуляторные элементы

ЭпиПК - эпибластоподобные стволовые клетки

ЭпиСК - эпибластные стволовые клетки

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование взаимной регуляции экспрессии гена Pou5f1 и его генетического окружения»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Ген Pou5f1, кодирующий транскрипционный фактор Oct4, критически необходим для поддержания плюрипотентного состояния плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) (Okamoto et al., 1990; Scholer et al., 1990). Помимо поддержания плюрипотентного состояния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), Oct4 способен переводить дифференцированные клетки в плюрипотентное состояние с образованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) (Takahashi & Yamanaka, 2006). ЭСК и иПСК способны к неограниченной пролиферации и дифференцировке в любой тип соматических клеток, что делает их перспективным инструментом для изучения ранних стадий эмбриогенеза, моделирования генетически детерминированных заболеваний и применения в области регенеративной медицины.

Несмотря на то, что Oct4 как транскрипционный фактор находится в центре внимания исследований плюрипотентных клеток, ещё не до конца ясно, в какие регуляторные взаимосвязи вовлекается ген Pou5f1, как в поддержании плюрипотентного состояния, так и в процессе перехода клеток из плюрипотентного в дифференцированное состояние. Тонкая настройка регуляции гена Pou5f1 необходима, поскольку выживание и нормальное развитие плюрипотентных клеток критически зависимы от уровня экспрессии Pou5f1. Было показано, что даже небольшие вариации уровня белка Oct4 оказывают разнообразные эффекты на судьбу плюрипотентных клеток (Niwa et al, 2000, Radzisheuskaya et al., 2013, Strebinger et al., 2019).

Ген Pou5f1 мыши имеет три канонических ^ис-регуляторных элемента (ЦРЭ) - промотор, дистальный энхансер (DE) и проксимальный энхансер (PE), которые дифференциально контролируют экспрессию Oct4 на разных стадиях эмбриогенеза (Yeom et al., 1996). Хотя Oct4 экспрессируется как в наивных,

так и в праймированных ПСК, механизм регуляции экспрессии Oct4 различается между этими типами клеток (Brons et al., 2007, Tesar et al., 2007). Наиболее полно механизмы их переключения были описаны в 2016 году Choi и соавторами, которые продемонстрировали, что DE управляет транскрипцией Pou5f1 в наивных ЭСК, тогда как в праймированном состоянии контроль экспрессии Pou5f1 осуществляется с помощью PE (Nichols and Smith, 2009, Choi, 2016).

Помимо канонических ЦРЭ, которые были обнаружены и у мыши, и у человека, с помощью методов, основанных на CRISPR/Cas9 технологии, в ЭСК человека были описаны 45 дополнительных ЦРЭ Pou5f1, причём большая часть элементов была представлена промоторами других белок-кодирующих генов (Diao et al., 2017). Для ЭСК мыши было выявлено 10 новых ЦРЭ и 12 транс-регуляторных элементов (ТРЭ) гена Pou5f1 (Canver et al., 2020). Таким образом становится ясно, что регуляция гена Pou5f1 намного сложнее, чем предполагалось ранее. На данный момент роль дополнительных элементов в регуляторной сети гена Pou5f1 не ясна. Несмотря на то, что выявленные элементы способны влиять на экспрессию Pou5f1, коллективный вклад этих элементов в регуляцию Pou5f1 и иерархия их взаимодействия в зависимости от стадии развития эмбриона остаются неопределенными.

Ген Pou5f1 расположен в участке генома, известном повышенной генной

плотностью, а именно: в кластере генов главного комплекса

гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex, MHC). Многие гены,

расположенные в данном кластере, играют важную роль в развитии и

поддержании иммунной системы, активно экспрессируются на протяжении

всего жизненного цикла клеток взрослого организма (Aoto et al., 2006).

Согласно текущей парадигме, Pou5f1 выполняет свои функции посредством

экспрессии своих белковых продуктов - изоформы Oct4A, которая играет

ключевую роль в ПСК и клетках зародышевой линии, и изоформы Oct4B,

которая, возможно, вовлечена в канцерогенез (Wu et al., 2014; Wang and Herlyn,

6

2015). Несмотря на продемонстрированное отсутствие функций гена Pou5f1 в стволовых клеток соматического ряда (Lengner et al., 2007), недавние работы опровергают эту парадигму, указывая на атеропротективную функцию Pou5f1 в гладкомышечных и эндотелиальных клетках кровеносных сосудов (Cherepanova et al., 2016, Shin et al., 2022). Все вышеупомянутые исследования использовали одну линию мышей, условно нокаутированную по гену Pou5f1, Pou5fPox (Kehler et al., 2004). Наблюдаемые эффекты действительно могут быть результатом утери белковых продуктов гена, однако, учитывая то обстоятельство, что они экспрессируются на крайне низком уровне в гладкомышечных и эндотелиальных клетках (на 2-4 порядка ниже такового в ПСК), такая возможность кажется маловероятной. В то же время наблюдаемые фенотипические проявления могут являться следствием изменений регуляторного ландшафта в локусе Pou5f1-MHC вследствие делеции промотора Pou5f1. В поддержку этой гипотезы существует ряд косвенных свидетельств. Так, полиморфизмы в регуляторных элементах гена Pou5f1 ассоциированы с аутоиммунными патологиями, которые в свою очередь часто ассоциированы с генами MHC; при этом белковые продукты этого гена в поражённых тканях не обнаруживаются (Chang et al., 2007). При делеции промотора Pou5f1 у мышей линии Pou5f^^ox в предимплантационных эмбрионах мыши, согласно данным РНК-секвенирования, происходят изменения в экспрессии многих генов, включая гены MHC (Frum et al. 2013). Изменения экспрессии генов MHC также наблюдались, но уже при указанной делеции в эндотелиальных клетках (Shin et al., 2022). Таким образом, вопрос о ^ис-регуляторном влиянии промотора Pou5f1 на экспрессию окружающих его генов, по меньшей мере в пределах MHC-кластера, заслуживает подробной экспериментальной проверки.

Целью настоящей работы стала оценка взаимной регуляции гена Pou5f1 и его генетического окружения, генов MHC-локуса.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Разработать модельную систему на основе ЭСК мыши, несущую биаллельную делецию промотора и первого экзона гена Pou5f1 и обеспечивающую сохранение плюрипотентных свойств за счет функциональной копии Pou5f1, внедренной в локус Rosa26.

2) Оценить способность полученных ЭСК с перенесенной копией гена Pou5f1 к самообновлению в различных условиях культивирования, терминальной дифференцировке в составе тератом, а также в ходе дифференцировки из наивного состояния плюрипотентности в праймированное.

3) Получить контрольные линии ЭСК, нокаутные по обоим аллелям Pou5f1, но с интактным эндогенным промотором Pou5f1 и перенесенной в локус Rosa26 копией гена Pou5f1.

4) Оценить ^ис-регуляторный эффект делеции промотора и первого экзона Pou5f1 на регуляцию соседних генов в ЭСК мыши.

Научная новизна

В работе впервые использован подход по переносу гена Pou5f1 в эктопическое генетическое окружение при помощи технологии CRISPR/Cas9. Инактивация эндогенной последовательности путём рекомбинации в области промотор-первого экзона по сайтам loxP сопровождается нацеленным внедрением последовательности Pou5f1, включающей ранее описанные регуляторные элементы - промотор, PE и DE - в «safe harbor^-локус Rosa26. Впервые ген Pou5f1 изучен вне контекста нативных регуляторных взаимосвязей с сохранением указанных регуляторных элементов. Подобный подход к генетической модификации ЭСК не только позволил сохранить их жизнеспособность и экспрессию основных факторов плюрипотентности, но и получить генетически идентичные линий ЭСК с близкой к естественной регуляцией гена Pou5f1. В работе, помимо линий ЭСК с биаллельной делецией промотора и первого экзона эндогенного Pou5f1, получены линии с

биаллельным нокаутом, где эндогенный промотор остаётся интактным, что позволило провести сравнительный анализ между двумя линиями ЭСК с полностью идентичной регуляцией экспрессии Oct4 и охарактеризовать потенциальную значимость данного ЦРЭ в экспрессии генов MHC-локуса.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные в рамках проекта данные о регуляции гена Рои5Д вносят вклад, прежде всего в понимание фундаментальных механизмов регуляции разных стадий плюрипотентного состояния. Полученная модельная система с различными контрольными линиями ЭСК позволила нам оценить последствия для клеточной судьбы, как непосредственно локализации регуляторных элементов гена, так и изменения уровня его белкового продукта.

В настоящее время одной из главных проблем клинического применения плюрипотентных стволовых клеток является их иммуногенность. Поэтому важно отметить, что научная значимость проекта также заключается в прояснении механизмов взаимной регуляции Рои5Д и окружающих его генов кластера МНС. Понимание фундаментальных принципов взаимодействия иммуногенности и плюрипотентности могут способствовать поиску более эффективных стратегий по модификации иммунных свойств иПСК и их дифференцированных производных для применения в клинических условиях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установленные ранее, критические ЦРЭ гена Рои5А недостаточны для поддержания физиологического уровня 0^4 в ЭСК клетках, культивируемых в сывороточных и «наивных» условиях.

2. Пролонгированное культивирование в «наивных» условиях способно частично «спасать» фенотип мышиных ЭСК с нарушенной регуляцией экспрессии Рои5А

3. Каноничных ЦРЭ гена Рои5/1 недостаточно для поддержания способности плюрипотентных ЭСК мыши дифференцироваться в производные трёх зародышевых листков.

4. Дополнительные регуляторные элементы гена Рои5Д играют наиболее важную роль на стадии перехода к праймированному состоянию плюрипотентности.

Личный вклад автора в исследование

Основные результаты работы были получены автором лично либо при его непосредственном участии. Личный вклад автора заключается в получении и характеристике линий ЭСК, проведении экспериментов, обработке и анализе полученных результатов, подготовке публикаций, написании текста диссертации. Тератомный тест и анализ окрашенных срезов осуществлялся совместно с Н. П. Фокиным и А. А. Кузьминым. Проточная цитометрия и сортировка клеток осуществлялись совместно с Н. Д. Аксёновым. Планы экспериментов и результаты работ обсуждались совместно с А. А. Кузьминым и А. Н. Томилиным.

Финансовая поддержка работы

Работа была поддержана грантом РФФИ № 20-34-90083 «Исследование роли гена Рои5Д в пространственной организации и функционировании генома мыши». Часть работы была поддержана грантом Министерства науки и высшего образования Российской Федерации соглашение №2 075-15-2021-1075 от 28. 09. 2021г.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и

списка литературы, который включает 156 источников. Работа изложена на 90 страницах, содержит 24 рисунка, 3 таблицы и 2 приложения.

Апробация результатов

Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на международных и отечественных конференциях:

• XXVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», секция «Фундаментальная медицина», ноябрь 2020 г.

• VIII Молодёжной школе-конференции по молекулярной биологии и генетическим технологиям Института цитологии РАН, секция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», октябрь 2022 г.

• ХХХ международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», секция «Фундаментальная медицина», апрель 2023 г.

• XIII межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Научная весна 2023», май 2023 г.

• III международной конференции "StemCellBio-2023: Трансляционная медицина - спектр возможностей", секция «Механизмы формирования и поддержания плюрипотентности», ноябрь 2023.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ: 2 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus, RSCI, а также 5 тезисов.

Статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science, Scopus, RSCI:

• Ermakova, V. V., Fokin, N. P., Aksenov, N. D., Bakhmet, E. I., Aleksandrova, E. V., Kuzmin, A. A., & Tomilin, A. N. Regulatory Elements Outside Established Pou5f1 Gene Boundaries Are Required for Multilineage Differentiation of Embryonic Stem Cells //International Journal of Molecular Sciences. - 2023. - Т. 24. - №. 20. - С. 15434.

• Кузьмин А.А.*, Ермакова В.В.*, Потапенко Е.В. Островерхова М. Г., Гурьев Н. А., Томилин А. Н. Создание клеточной модели для изучения взаимодействия промотора гена Pou5f1 (Oct4) с генетическим окружением //Онтогенез. - 2020. - Т. 51. - №2. 6. - С. 473-478. (* - равный вклад) (Англоязычная версия: Kuzmin, A. A.*, Ermakova, V. V.*, Potapenko, E. V., Ostroverkhova, M. G., Guriev, N. A., & Tomilin, A. N. Establishing a Cell Model for Studying the Interaction of the Pou5f1 (Oct4) Promoter with the Genetic Environment //Russian Journal of Developmental Biology. - 2020. - Т. 51. - С. 410-415. (* - contributed equally)

Тезисы конференций:

• Ермакова В. В. Томилин А. Н. «Исследование роли промотора гена Pou5f1 (Oct4) в регуляции экспрессии окружающих его генов» Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2020». [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2020. ISBN 978-5-317-06519-5

• Ермакова В. В., Кузьмин А. А., Томилин А. Н. «Исследование роли промоторной области гена Pou5f1 (Oct4) во взаимодействии с его генетическим окружением» // Материалы VIII молодежной школы-конференции по молекулярной биологии и генетическим технологиям Института цитологии РАН ЦИТОЛОГИЯ, 2022, Т. 64, № 7, С. 732. doi: 10.31857/s004137712207001x

• Ермакова В. В. «Клеточная модель для изучения цис-регуляторных свойств промоторной области гена Pou5f1» // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ -2023». [Электронный ресурс] - М.: МАКС Пресс, 2023. ISBN 978-5-31706952-0

• Ермакова В.В, Кузьмин А.А. Томилин А.Н. «In vitro модель для изучения цис-регуляторных элементов гена Pou5f1» // Вестник

медицинского института «РЕАВИЗ». Реабилитация, Врач и Здоровье. 2023. Т. 13, № 2, С. 41.

• Ермакова В.В, Александрова Е.В., Кузьмин А.А. Томилин А.Н. «Роль гена pou5f1 в регуляции работы генома плюрипотентных клеток» // Сборник материалов конференции и Школы-конференции «Коллекции культур клеток человека и животных: современные вызовы и сетевые решения». - СПб. : ПОЛИТЕХ-ПРЕСС, 2023. - С.28. ISBN 978-5-74228303-4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Pou5f1 в поддержании плюрипотентности

Хотя функциональное определение плюрипотентности уникально для млекопитающих, концепция плюрипотентных популяций занимает центральное место во всей биологии развития (Frankenberg and Renfree, 2013). У Eutheria (плацентарных млекопитающих) ген Pou5f1 является единственным представителем семейства генов POU-доменных белков V класса (POU5). К этому небольшому классу относятся два ортологических гена: Pou5f1 и Pou5f3, которые являются центральными регуляторами плюрипотентности как in vivo, так и in vitro (Frankenberg et al., 2014). Белковый продукт гена Pou5f1 - ТФ Oct4 критически необходим для установления и поддержания плюрипотентного состояния в клетках развивающегося эмбриона (Osorno et al., 2012).

По мере развития организма млекопитающих потенциал дифференцировки клеток снижается. Самым высоким потенциалом обладают тотипотентные клетки, к которым обычно относят зиготу и клетки эмбриона на 2- и 4-клеточной стадии. Они способны дать начало как экстраэмбриональным, так и эмбриональным тканям (Baker and Pera, 2018). Несмотря на то, что экспрессия Oct4 отмечается на самых ранних стадиях эмбриогенеза мыши, а именно на стадии 8 бластомеров (Palmieri et al.,1994), и морулы, где его экспрессия равномерна во всех бластомерах (Pesce and Schöler, 2001), его функции наиболее критичны для поддержания плюрипотентного состояния клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) до имплантации эмбриона и на более поздних стадиях развития эпибласта. На стадии бластоцисты эмбрионы мышей дефектные по Pou5f1 не способны формировать плюрипотентные клетки во внутренней клеточной массе (Nichols et al., 1998). Но удаление Pou5f1 на ранних стадиях эмбриогенеза мышей не

влияло на установление тотипотентности и развитие эмбриона до стадии бластоцисты (Wu et al., 2013).

В двух независимых исследованиях на Danio rerio было показано, что Nanog, SoxBl и Oct4 являются наиболее активно транслируемыми транскрипционными факторами перед зиготической активацией генома (ZGA, zygotic gene activation) и необходимы для инициации транскрипции >75% генов первой фазы ZGA (Lee et al., 2013; Leichsenring et al. 2013). Известно, что они активируют транскрипцию и у предимплантационных эмбрионов млекопитающих. Это позволило предположить, что они играют роль и в ZGA этой группы организмов. Oct4 экспрессируется на высоком уровне в растущих ооцитах мыши, что делает его вероятным фактором регуляции материнской РНК. Однако Pou5f1 имеет несколько разные функции у Danio rerio и Mus musculus. В эмбрионах рыб Oct4 способствует дифференцировке ЭСК, тогда как у млекопитающих Oct4 скорее необходим для её сдерживания. Эксперименты по нокауту показывают, что потеря Oct4 сама по себе не предотвращает накопление критических зиготических транскриптов в первую волну ZGA (Frum et al., 2013; Wu et al., 2013).

Кинетика Oct4 различается уже на стадиях 8- и 16-клеточного эмбриона. Клетки с более медленной кинетикой Oct4 с большей вероятностью дают начало линии плюрипотентных клеток, которая вносит вклад в образование ВКМ (Plachta et al., 2011.) Кинетика ТФ отражает доступность белка для связывания с его ДНК-мишенями, а не разницу в уровне его экспрессии. Гораздо меньший вклад кинетика Oct4 вносит в определение клеточной судьбы на стадии четырёхклеточного эмбриона (White et al., 2016).

Во время первого дифференцировочного события эмбриогенеза млекопитающих тотипотентные бластомеры специализируются на клетки ВКМ и трофэктодерму (Canon et al., 2011). Клетки ВКМ продолжают экспрессировать Oct4 на высоком уровне и дают начало примитивной

энтодерме и эпибласту бластоцисты. После имплантации эмбриона эпибласт даёт начало клеткам трёх зародышевых листков и половым клеткам, что определяет клетки ВКМ как плюрипотентные (Artus and Chazaud, 2014). Трофэктодерма, экспрессия Oct4 в которой подавляется (Niwa et al., 2000), в дальнейшем участвует в формировании плаценты.

Рис. 1. Экспрессия Oct4 на разных стадиях развития (из обзора Pan et al., 2002)

Oct4 может опосредовать дифференцировку отдельных эмбриональных линий на дозозависимый манер. Oct4 необходим для спецификации как примитивной энтодермы (PrE), так и эпибласта (Nichols et al., 1998; Le Bin et al., 2014). При формировании PrE уровень Oct4 кратковременно повышается (Palmieri et al.,1994), а затем его экспрессия подавляется (Rosner et al., 1990). На более поздних стадиях потеря Oct4 в постимплантационном эпибласте приводит к множественным аномалиям, включая общую дезорганизацию зародышевых слоев, нарушение расширения первичной полоски и апоптоз первичных половых клеток (DeVeale et al., 2013; Kehler et al., 2014; Mulas et al., 2018).

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), культивируемые in vitro,

обычно происходят из клеток эпибласта бластоцист. Они способны

16

дифференцироваться в любой тип клеток взрослого организма и обладают неограниченной способностью к пролиферации и поддержанию плюрипотентного состояния при культивировании в специальных условиях (Hackett and Surani, 2014). Чтобы сохранять плюрипотентные свойства ЭСК, культивируемые in vitro, должны экспрессировать Oct4 в определённом диапазоне. Повышение уровня экспрессии Oct4 вызывает дифференцировку ЭСК в экстраэмбриональные мезодерму или энтодерму, тогда как клетки с низким уровнем экспрессии Oct4 приобретают трофэктодермальный фенотип (Niwa et al., 2000; Niwa, 2001). Такая особенность, вероятно, связана с его способностью влиять на доступность хроматина и активацию энхансеров плюрипотентного состояния в зависимости от его концентрации (Xiong et al., 2022).

ПСК могут быть получены не только из внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты, но и из клеток эпибласта имплантированного эмбриона (Hanna et al., 2010, Nichols and Smith, 2009). Эпибласт бластоцист формирует популяцию «наивных» плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток, а клетки постимплантационного эпибласта могут дать начало «праймированным» эпибластным плюрипотентным стволовым клеткам (ЭпиСК) (Brons et al, 2007, Tesar et al, 2007). Наивные плюрипотентные стволовые клетки сохраняются в бластоцисте до 4,5 суток эмбрионального развития у мыши (7 суток у человека). После имплантации с 5,5 по 7,5 сутки эмбрион содержит ПСК уже в праймированном состоянии, в котором они становятся восприимчивы к сигналам дифференцировки (Plusa and Hadjantonakis, 2014). Оба типа ПСК можно культивировать in vitro в соответствующей среде. Праймированные ЭпиСК, в отличие от наивных, имеют ограниченный потенциал дифференцировки in vivo; они не способны дать начало линии ППК и практически не дают вклад в формирование химер после инъекции в бластоцисты. Праймированные ПСК поддерживают плюрипотентность посредством активации сигнальных путей bFGF и

Activin/Nodal (Brons et al., 2007, Vallier et al., 2009). Выделяют также и другие промежуточные стадии плюрипотентного состояния клеток, например, хорошо изучены переходные между наивной и праймированной стадиями: розетко-подобные стволовые клетки и формативные стволовые клетки (Neagu et al., 2020, Гордеев и др., 2021).

Наивные и праймированные ПСК демонстрируют различные молекулярные характеристики, но все же экспрессируют схожие маркеры. Экспрессия гена Pou5f1 характерна для всех стадий плюрипотентного состояния.

Oct4 играет центральную роль в сетях регуляции как праймированной, так и наивной плюрипотентности, однако, спектр его мишеней различен для двух стадий плюрипотентности (Buecker et al., 2014). Меняется спектр партнёров Oct4, которые позволяют ему взаимодействовать с другим набором энхансеров, характерным для той или иной стадии. В праймированных плюрипотентных клетках in vitro немедленным ответом на индуцируемое удаление Ort4 является потеря E-кадгерина (CDH1) и нарушение адгезии (Livigni et al. 2013).

Таким образом, Pou5f1 плацентарных животных необходим для регуляции плюрипотентности как в контексте поддержания самообновления, так и в контексте приобретения способности к дифференцировке.

1.2.Функции Pou5f1 в соматических клетках

Считается, что, начиная со стадии 8-суточного эмбриона мыши, экспрессия Oct4 сохраняется исключительно в первичных половых клетках, и, по мере взросления организма, продолжается в гаметах (Yeom et al., 1996).

Многие исследователи пытаются найти доказательства того, что продукт гена Pou5f1 может экспрессироваться в различных соматических тканях и клетках: соматических стволовых клетках, соматических опухолевых клетках и здоровых дифференцированных клетках (Lengner et al., 2007; Tai et al., 2005).

Однако, вероятно, обнаружение экспрессии Oct4 в соматических клетках во многих исследованиях могло быть ложноположительным результатом из-за псевдогенов Pou5f1 и загрязнения ДНК (Liedtke et al., 2007; Lengner, 2008).

Кроме того, ещё в 1992 г. были идентифицированы изоформы Oct4: Oct4A и Oct4B (Takeda et al., 1992). В большинстве исследований функций белка фигурирует именно Oct4A, который имеет ядерную локализацию и участвует в поддержании плюрипотентности. Od:4B функционирует преимущественно в цитоплазме и не может поддерживать самообновление ES-клеток, но, по всей видимости, играет роль в ответе на клеточный стресс (Lee et al., 2006; Gao et al., 2012). Неспособность различить варианты белка может также привести к путанице в отношении экспрессии Oct4 в соматических клетках (Liedtke et al., 2008). Так в 2007 году Zangrossi et al. поставили под сомнение роль Oct4 как маркера плюрипотентности, продемонстрировав, что Oct4 экспрессируется в мононуклеарных клетках периферической крови человека, которые являются терминально дифференцированными клетками. Однако позже было выявлено, что в этих клетках может экспрессироваться только форма Oct4B (Kotoula et al., 2008).

Экспрессия Od:4 была обнаружена в раковых стволовых клетках гепатоцеллюлярной карциномы, рака молочной железы, рака простаты, меланомы, остеосаркомы, рака мочевого пузыря, рака яичников и рака легких (Zeineddine et al., 2014; Wu et al., 2015; Hatefi et al., 2012). Осt4A экспрессируется в некоторых герминогенных опухолях, таких как: эмбриональная карцинома, семинома и карцинома in situ, но отсутствует в тератомах и опухолях желточного мешка (Looijenga et al. 2003; Rajpert-De Meyts et al., 2004). Также считается, что Oct4 может формировать устойчивость раковых клеток к лучевой терапии за счет улучшения процесса эпителиально-мезенхимального перехода (Shao et al., 2018). Он также может быть связан с инвазией и миграцией опухолевых клеток (Zhao et al., 2018).

В 2016 году в работе Cherepanova O.A. et al. была продемонстрирована атеропротективная функция Pou5f1 в гладкомышечных клетках сосудов. С помощью индуцируемой системы Cre/Lox рекомбинации был удалён промотор и первый экзон гена Pou5f1 в гладкомышечных клетках Apoe-/- мышей, что приводило к увеличению размера атеросклеротической бляшки и изменению её состава. Снижалась стабильность бляшки, и усиливалось внутрибляшечное кровоизлияние. Позже было дополнено, что нокаут гена Pou5f1 влияет на миграцию и рекрутирование клеток во время ангиогенеза, увеличивает гибель периваскулярных клеток, задерживает миграцию эндотелиальных клеток, а также снижает ангиогенез после ишемии задних конечностей (Hess et al., 2019). В 2022 году та же команда исследователей расширила данные о функциях Pou5f1 и для эндотелиальных клеток, в которых, как утверждают авторы, он выполняет защитную метаболическую функцию. В отсутствие Pou5f1 эндотелиальные клетки демонстрировали повышенную частоту: активации, эндотелиально-мезенхимального перехода, неоваскуляризации бляшек и митохондриальной дисфункции. С помощью РНК-секвенирования было выявлено изменение экспрессии, в том числе и генов МНС (главного комплекса гистосовместимости) (Shin et al., 2022).

Похожее исследование с нокаутом гена Pou5f1 было проведено на иммортализованных кератиноцитах кожи человека. Кератиноциты с нокаутным Pou5f1 приобретали мезенхимоподобный фенотип с увеличенным размером и формой клеток, демонстрировали ускоренное мигрирующее поведение и сниженный уровень адгезии, что связали со снижением уровня E-кадгерина, Р-катенина и ZO1 и увеличением фибронектина в межклеточных контактах. Интересно, что уровень мРНК Pou5f1 в исследуемых кератиноцитах был высоким по сравнению с клетками HeLa и С33, но белковый продукт гена с помощью иммуноблоттинга не определялся (Christofidou et al., 2023).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ермакова Вероника Владимировна, 2024 год

Список использованной литературы

1. Andersson, R., et al., An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature, 2014. 507(7493): p. 455-461.

2. Aoto, T., et al., Nuclear and chromatin reorganization in the MHC-Oct3/4 locus at developmental phases of embryonic stem cell differentiation. Developmental biology, 2006. 298(2): p. 354-367.

3. Apps, R., L. Gardner, and A. Moffett, A critical look at HLA-G. Trends in immunology, 2008. 29(7): p. 313-321.

4. Araki, R., et al., Negligible immunogenicity of terminally differentiated cells derived from induced pluripotent or embryonic stem cells. Nature, 2013. 494(7435): p. 100-104.

5. Artus, J. and C. Chazaud, A close look at the mammalian blastocyst: epiblast and primitive endoderm formation. Cellular and molecular life sciences, 2014. 71: p. 3327-3338.

6. Athanasiadou, R., et al., Targeting of de novo DNA methylation throughout the Oct-4 gene regulatory region in differentiating embryonic stem cells. PloS one, 2010. 5(4): p. e9937.

7. Baker, C.L. and M.F. Pera, Capturing totipotent stem cells. Cell stem cell, 2018. 22(1): p. 25-34.

8. Barakat, T.S., et al., Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell stem cell, 2018. 23(2): p. 276-288. e8.

9. Barrington, C., et al., Enhancer accessibility and CTCF occupancy underlie asymmetric TAD architecture and cell type specific genome topology. Nature communications, 2019. 10(1): p. 2908.

10. Bird, A., DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & development, 2002. 16(1): p. 6-21.

11. Bonev, B. and G. Cavalli, Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics, 2016. 17(11): p. 661-678.

12. Bonev, B., et al., Multiscale 3D genome rewiring during mouse neural development. Cell, 2017. 171(3): p. 557-572. e24.

13. Boyd, A.S. and K.J. Wood, Variation in MHC expression between undifferentiated mouse ES cells and ES cell derived insulin-producing cell clusters. Transplantation, 2009. 87(9): p. 1300.

14. Boyer, L.A., et al., Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. cell, 2005. 122(6): p. 947-956.

15. Bressan, R.B., et al., Efficient CRISPR/Cas9-assisted gene targeting enables rapid and precise genetic manipulation of mammalian neural stem cells. Development, 2017. 144(4): p. 635-648.

16. Brons, I.G.M., et al., Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature, 2007. 448(7150): p. 191-195.

17. Buecker, C., et al., Reorganization of enhancer patterns in transition from naive to primed pluripotency. Cell stem cell, 2014. 14(6): p. 838-853.

18. Canon, S., B. Fernandez-Tresguerres, and M. Manzanares, Pluripotency and lineages in the mammalian blastocyst: An evolutionary view. Cell Cycle, 2011. 10(11): p. 1731-1738.

19. Canver, M.C., et al., A saturating mutagenesis CRISPR-Cas9-mediated functional genomic screen identifies cis-and trans-regulatory elements of Oct4 in murine ESCs. Journal of Biological Chemistry, 2020. 295(47): p. 15797-15809.

20. Cavalheiro, G.R., T. Pollex, and E.E. Furlong, To loop or not to loop: what is the role of TADs in enhancer function and gene regulation? Current Opinion in Genetics & Development, 2021. 67: p. 119-129.

21. Chang, Y.-T., et al., The genetic polymorphisms of POU5F1 gene are associated with psoriasis vulgaris in Chinese. Journal of dermatological science, 2007. 46(2): p. 153-156.

22. Cherepanova, O.A., et al., Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature medicine, 2016. 22(6): p. 657-665.

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

Choi, H.W., et al., Distinct enhancer activity of Oct4 in naive and primed mouse pluripotency. Stem cell reports, 2016. 7(5): p. 911-926.

Christofidou, E., et al., Oct4 is a gatekeeper of epithelial identity by regulating cytoskeletal dynamics in skin keratinocytes. bioRxiv, 2023: p. 2023.05. 05.539557. Core, L.J., et al., Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature genetics, 2014. 46(12): p. 13111320.

Cremer, T. and C. Cremer, Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature reviews genetics, 2001. 2(4): p. 292-301. Dao, L., et al., Genome-wide characterization of mammalian promoters with distal enhancer functions. Nature genetics, 2017. 49(7): p. 1073-1081.

De Santa, F., et al., A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS biology, 2010. 8(5): p. e1000384.

Delarbre, C., et al., Complete mitochondrial DNA of the hagfish, Eptatretus burgeri: the comparative analysis of mitochondrial DNA sequences strongly supports the cyclostome monophyly. Molecular phylogenetics and evolution, 2002. 22(2): p. 184-192. DeVeale, B., et al., Oct4 is required^ E7. 5 for proliferation in the primitive streak. PLoS genetics, 2013. 9(11): p. e1003957.

Diao, Y., et al., A tiling-deletion-based genetic screen for cis-regulatory element identification in mammalian cells. Nature methods, 2017. 14(6): p. 629-635. Dijkstra, J.M. and T. Yamaguchi, Ancient features of the MHC class II presentation pathway, and a model for the possible origin of MHC molecules. Immunogenetics, 2019. 71: p. 233-249.

Dixon, J.R., et al., Chromatin architecture reorganization during stem cell differentiation. Nature, 2015. 518(7539): p. 331-336.

Dixon, J.R., et al., Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature, 2012. 485(7398): p. 376-380.

Drukker, M., et al., Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002. 99(15): p. 9864-9869.

Feil, R., et al., Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and biophysical research communications, 1997. 237(3): p. 752-757.

Flajnik, M.F. and M. Kasahara, Comparative genomics of the MHC: glimpses into the evolution of the adaptive immune system. Immunity, 2001. 15(3): p. 351-362. Francastel, C., et al., Nuclear compartmentalization and gene activity. Nature reviews Molecular cell biology, 2000. 1(2): p. 137-143.

Frankenberg, S. and M.B. Renfree, On the origin of POU5F1. BMC biology, 2013. 11(1): p. 1-12.

Frankenberg, S.R., et al., The POU-er of gene nomenclature. Development, 2014. 141(15): p. 2921-2923.

Frum, T., et al., Oct4 cell-autonomously promotes primitive endoderm development in the mouse blastocyst. Developmental cell, 2013. 25(6): p. 610-622.

Gao, Y., et al., The novel function of OCT4B isoform-265 in genotoxic stress. Stem Cells, 2012. 30(4): p. 665-672.

Garreta, E., et al., Roadblocks in the Path of iPSC to the Clinic. Current transplantation reports, 2018. 5(1): p. 14-18.

Hackett, J.A. and M.A. Surani, Regulatory principles of pluripotency: from the ground state up. Cell stem cell, 2014. 15(4): p. 416-430.

Hanna, J.H., K. Saha, and R. Jaenisch, Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell, 2010. 143(4): p. 508-525.

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

Hardison, R.C. and J. Taylor, Genomic approaches towards finding cis-regulatory modules in animals. Nature Reviews Genetics, 2012. 13(7): p. 469-483.

Hatefi, N., et al., Evaluating the expression of oct4 as a prognostic tumor marker in bladder cancer. Iranian journal of basic medical sciences, 2012. 15(6): p. 1154. Hayashi, K., et al., Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell, 2011. 146(4): p. 519-532.

Heintzman, N.D., et al., Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature, 2009. 459(7243): p. 108-112.

Hess, D.L., et al., Perivascular cell-specific knockout of the stem cell pluripotency gene

Oct4 inhibits angiogenesis. Nature communications, 2019. 10(1): p. 967.

Hnisz, D., et al., Convergence of developmental and oncogenic signaling pathways at

transcriptional super-enhancers. Molecular cell, 2015. 58(2): p. 362-370.

Hochedlinger, K., et al., Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation

and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell, 2005. 121(3): p. 465-477.

Hoffman, J.A., C.-I. Wu, and B.J. Merrill, Tcf7l1 prepares epiblast cells in the gastrulating

mouse embryo for lineage specification. Development, 2013. 140(8): p. 1665-1675.

Hogan, M.S., et al., Transient pairing of homologous Oct4 alleles accompanies the onset

of embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell, 2015. 16(3): p. 275-288.

Holm, S.J., et al., HLA-Cw* 0602 associates more strongly to psoriasis in the Swedish

population than variants of the novel 6p21. 3 gene PSORS1C3. Acta dermato-

venereologica, 2005. 85(1): p. 2-8.

Horton, R., et al., Gene map of the extended human MHC. Nature Reviews Genetics, 2004. 5(12): p. 889-899.

Karwacki-Neisius, V., et al., Reduced Oct4 expression directs a robust pluripotent state with distinct signaling activity and increased enhancer occupancy by Oct4 and Nanog. Cell stem cell, 2013. 12(5): p. 531-545.

Kaufman, J., Unfinished business: evolution of the MHC and the adaptive immune system of jawed vertebrates. Annual review of immunology, 2018. 36: p. 383-409. Kehler, J., et al., Oct4 is required for primordial germ cell survival. EMBO reports, 2004. 5(11): p. 1078-1083.

Kim, J.B., et al., Oct4-inducedpluripotency in adult neural stem cells. cell, 2009. 136(3): p. 411-419.

Kim, T.-K., et al., Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature, 2010. 465(7295): p. 182-187.

Kim, T.-K. and R. Shiekhattar, Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters. Cell, 2015. 162(5): p. 948-959.

Kotoula, V., S.I. Papamichos, and A.F. Lambropoulos, Revisiting OCT4 expression in peripheral blood mononuclear cells. Stem cells, 2008. 26(1): p. 290-291. Kuzmin, A.A., et al., Genetic tool for fate mapping of Oct4 (Pou5f1)-expressing cells and their progeny past the pluripotency stage. Stem Cell Research & Therapy, 2019. 10: p. 110.

Lam, M.T., et al., Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends in biochemical sciences, 2014. 39(4): p. 170-182.

Lau, K.X., et al., Unique properties of a subset of human pluripotent stem cells with high capacity for self-renewal. Nature communications, 2020. 11(1): p. 2420. Laurent, L., et al., Dynamic changes in the human methylome during differentiation. Genome research, 2010. 20(3): p. 320-331.

Le Bin, G.C., et al., Oct4 is requiredfor lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development, 2014. 141(5): p. 1001-1010. Lee, M.T., et al., Nanog, Pou5f1 and SoxB1 activate zygotic gene expression during the maternal-to-zygotic transition. Nature, 2013. 503(7476): p. 360-364.

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

Leichsenring, M., et al., Pou5f1 transcription factor controls zygotic gene activation in vertebrates. Science, 2013. 341(6149): p. 1005-1009.

Lengner, C.J., et al., Oct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal. Cell stem cell, 2007. 1(4): p. 403-415.

Lengner, C.J., G.G. Welstead, and R. Jaenisch, Thepluripotency regulator Oct4: a role in somatic stem cells? Cell cycle, 2008. 7(6): p. 725-728.

Li, W., M.T. Lam, and D. Notani, Enhancer RNAs. Cell Cycle, 2014. 13(20): p. 31513152.

Liang, J., et al., Nanog and Oct4 associate with unique transcriptional repression complexes in embryonic stem cells. Nature cell biology, 2008. 10(6): p. 731-739. Lieberman-Aiden, E., et al., Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. science, 2009. 326(5950): p. 289-293. Liedtke, S., et al., Oct4 and its pseudogenes confuse stem cell research. Cell stem cell, 2007. 1(4): p. 364-366.

Liedtke, S., M. Stephan, and G. Kögler, Oct4 expression revisited: potential pitfalls for data misinterpretation in stem cell research. 2008.

Liu, X., et al., The immunogenicity and immune tolerance of pluripotent stem cell derivatives. Frontiers in Immunology, 2017. 8: p. 645.

Liu, Y., et al., Functional assessment of human enhancer activities using whole-genome STARR-sequencing. Genome biology, 2017. 18(1): p. 1-13.

Livigni, A., et al., A conserved Oct4/POUV-dependent network links adhesion and migration to progenitor maintenance. Current biology, 2013. 23(22): p. 2233-2244. Loh, Y.-H., et al., The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nature genetics, 2006. 38(4): p. 431-440. Looijenga, L.H., et al., POU5F1 (OCT3/4) identifies cells with pluripotent potential in human germ cell tumors. Cancer research, 2003. 63(9): p. 2244-2250. Maeso, I., R.D. Acemel, and J.L. Gómez-Skarmeta, Cis-regulatory landscapes in development and evolution. Current Opinion in Genetics & Development, 2017. 43: p. 1722.

Marino, J., J. Paster, and G. Benichou, Allorecognition by T lymphocytes and allograft rejection. Frontiers in immunology, 2016. 7: p. 582.

Masui, S., et al., Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells. Nature cell biology, 2007. 9(6): p. 625-635. Mattioli, K., et al., Cis and trans effects differentially contribute to the evolution of promoters and enhancers. Genome biology, 2020. 21: p. 1-22.

Medina-Rivera, A., et al., Widespread enhancer activity from core promoters. Trends in biochemical sciences, 2018. 43(6): p. 452-468.

Meissner, A., et al., Genome-scale DNA methylation maps ofpluripotent and differentiated cells. Nature, 2008. 454(7205): p. 766-770.

Mikhaylichenko, O., et al., The degree of enhancer or promoter activity is reflected by the levels and directionality of eRNA transcription. Genes & development, 2018. 32(1): p. 4257.

Minucci, S., et al., Retinoic acid-mediated down-regulation of Oct3/4 coincides with the loss of promoter occupancy in vivo. The EMBO Journal, 1996. 15(4): p. 888-899. Mirzadeh Azad, F., M. Malakootian, and S.J. Mowla, The Regulatory Effect of lncRNA PSORS1C3 on Different Variants of OCT4 in non-Pluripotent Cells. Journal of Cell and Molecular Research, 2019. 11(1): p. 8-13.

Mirzadeh Azad, F., M. Malakootian, and S.J. Mowla, lncRNA PSORS1C3 is regulated by glucocorticoids and fine-tunes OCT4 expression in non-pluripotent cells. Scientific Reports, 2019. 9(1): p. 8370.

Mishra, A. and R.D. Hawkins, Three-dimensional genome architecture and emerging technologies: looping in disease. Genome medicine, 2017. 9(1): p. 1-14.

94. Mitchelmore, J., et al., Functional effects of variation in transcription factor binding highlight long-range gene regulation by epromoters. Nucleic Acids Research, 2020. 48(6): p. 2866-2879.

95. Moon, B.-S., et al., Long range inter-chromosomal interaction of Oct4 distal enhancer loci regulates ESCspluripotency. Cell Death Discovery, 2023. 9(1): p. 61.

96. Muerdter, F., et al., Resolving systematic errors in widely used enhancer activity assays in human cells. Nature methods, 2018. 15(2): p. 141-149.

97. Mulas, C., et al., Oct4 regulates the embryonic axis and coordinates exit from pluripotency and germ layer specification in the mouse embryo. Development, 2018. 145(12): p. dev159103.

98. Neagu, A., et al., In vitro capture and characterization of embryonic rosette-stage pluripotency between naive and primed states. Nature cell biology, 2020. 22(5): p. 534545.

99. Nichols, J. and A. Smith, Naive and primed pluripotent states. Cell stem cell, 2009. 4(6): p. 487-492.

100. Nichols, J., et al., Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell, 1998. 95(3): p. 379-391.

101. Niwa, H., Molecular mechanism to maintain stem cell renewal of ES cells. Cell structure and function, 2001. 26(3): p. 137-148.

102. Niwa, H., J.-i. Miyazaki, and A.G. Smith, Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature genetics, 2000. 24(4): p. 372-376.

103. Nordhoff, V., et al., Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences. Mammalian Genome, 2001. 12: p. 309-317.

104. Ong, C.-T. and V.G. Corces, Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics, 2011. 12(4): p. 283-293.

105. Osorno, R., et al., The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development, 2012. 139(13): p. 2288-2298.

106. Palmieri, S.L., et al., Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Developmental biology, 1994. 166(1): p. 259-267.

107. Pan, G.J., et al., Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell research, 2002. 12(5): p. 321-329.

108. Pancaldi, V., et al., Integrating epigenomic data and 3D genomic structure with a new measure of chromatin assortativity. Genome biology, 2016. 17(1): p. 1-19.

109. Pekowska, A., et al., H3K4 tri-methylation provides an epigenetic signature of active enhancers. The EMBO journal, 2011. 30(20): p. 4198-4210.

110. Pesce, M. and H.R. Schöler, Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development. Stem cells, 2001. 19(4): p. 271-278.

111. Plachta, N., et al., Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature cell biology, 2011. 13(2): p. 117-123.

112. Plusa, B. and A.-K. Hadjantonakis, Embryonic stem cell identity grounded in the embryo. Nature cell biology, 2014. 16(6): p. 502-504.

113. Rada-Iglesias, A., et al., A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature, 2011. 470(7333): p. 279-283.

114. Radzisheuskaya, A., et al., A defined Oct4 level governs cell state transitions of pluripotency entry and differentiation into all embryonic lineages. Nature cell biology, 2013. 15(6): p. 579-590.

115. Ramos-Mejía, V., et al., Phenotypic analyses ofmouse embryos with ubiquitous expression of Oct4: Effects on mid-hindbrain patterning and gene expression. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists, 2005. 232(1): p. 180-190.

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

Rang, F.J., J. Kind, and I. Guerreiro, The role of heterochromatin in 3D genome organization duringpreimplantation development. Cell Reports, 2023. Ricci, M.A., M.P. Cosma, and M. Lakadamyali, Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Current opinion in genetics & development, 2017. 46: p. 186-193.

Rosner, M.H., et al., A POU-domain transcription factor in early stem cells and germ cells of the mammalian embryo. Nature, 1990. 345(6277): p. 686-692.

Schwarzer, W., et al., Two independent modes of chromatin organization revealed by cohesin removal. Nature, 2017. 551(7678): p. 51-56.

Scruggs, B.S., et al., Bidirectional transcription arises from two distinct hubs of transcription factor binding and active chromatin. Molecular cell, 2015. 58(6): p. 11011112.

Shao, M., et al., OCT4 potentiates radio-resistance and migration activity of rectal cancer cells by improving epithelial-mesenchymal transition in a ZEB1 dependent manner. BioMed Research International, 2018. 2018.

Shen, Y., et al., A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature, 2012. 488(7409): p. 116-120.

Shiina, T., H. Inoko, and J. Kulski, An update of the HLA genomic region, locus information and disease associations: 2004. Tissue antigens, 2004. 64(6): p. 631-649. Shin, J., et al., Endothelial OCT4 is atheroprotective by preventing metabolic and phenotypic dysfunction. Cardiovascular Research, 2022. 118(11): p. 2458-2477. Simonsson, S. and J. Gurdon, DNA demethylation is necessary for the epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Nature cell biology, 2004. 6(10): p. 984-990. Sohn, E.J., et al., Regulation of the protein stability and transcriptional activity of OCT4 in stem cells. Advances in biological regulation, 2021. 79: p. 100777. Sukparangsi, W., et al., Evolutionary origin of vertebrate OCT4/POU5 functions in supporting pluripotency. Nature Communications, 2022. 13(1): p. 5537. Sznarkowska, A., S. Mikac, and M. Pilch, MHC class I regulation: the origin perspective. Cancers, 2020. 12(5): p. 1155.

Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. cell, 2006. 126(4): p. 663-676. Takeda, J., S. Seino, and G.I. Bell, Human Oct3 gene family: cDNA sequences, alternative splicing, gene organization, chromosomal location, and expression at low levels in adult tissues. Nucleic acids research, 1992. 20(17): p. 4613-4620.

Tesar, P.J., et al., New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature, 2007. 448(7150): p. 196-199.

Thurman, R.E., et al., The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature, 2012. 489(7414): p. 75-82.

Todorova, D., et al., Brief report: immune microenvironment determines the immunogenicity of induced pluripotent stem cell derivatives. Stem Cells, 2016. 34(2): p. 510-515.

Trowsdale, J., The MHC, disease and selection. Immunology letters, 2011. 137(1-2): p. 18.

Vallier, L., et al., Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one, 2009. 4(6): p. e6082.

Van Duyne, G.D., Cre recombinase. Microbiology spectrum, 2015. 3(1): p. 3.1. 10. Verloes, A., et al., HLA-G expression in human embryonic stem cells and preimplantation embryos. The journal of immunology, 2011. 186(4): p. 2663-2671.

Vernimmen, D. and W.A. Bickmore, The hierarchy of transcriptional activation: from enhancer to promoter. Trends in Genetics, 2015. 31(12): p. 696-708.

139. Villarreal, L.P., The source of self: genetic parasites and the origin of adaptive immunity. Annals of the New York Academy of Sciences, 2009. 1178(1): p. 194-232.

140. Wang, Y.-J. and M. Herlyn, The emerging roles of Oct4 in tumor-initiating cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology, 2015. 309(11): p. C709-C718.

141. Wei, Z., et al., Klf4 organizes long-range chromosomal interactions with the oct4 locus in reprogrammingand pluripotency. Cell stem cell, 2013. 13(1): p. 36-47.

142. White, M.D., et al., Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo. Cell, 2016. 165(1): p. 75-87.

143. Wu, G., et al., Establishment of totipotency does not depend on Oct4A. Nature cell biology, 2013. 15(9): p. 1089-1097.

144. Wu, G. and H.R. Schöler, Role of Oct4 in the early embryo development. Cell Regeneration, 2014. 3(1): p. 1-10.

145. Wu, G., et al., Oct4 is a reliable marker of liver tumor propagating cells in hepatocellular carcinoma. Discovery medicine, 2015. 20(110): p. 219-229.

146. Yamanaka, S., Pluripotent stem cell-based cell therapy—promise and challenges. Cell stem cell, 2020. 27(4): p. 523-531.

147. Yao, L., B.P. Berman, and P.J. Farnham, Demystifying the secret mission of enhancers: linking distal regulatory elements to target genes. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 2015. 50(6): p. 550-573.

148. Yeom, Y.I., et al., Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells. Development, 1996. 122(3): p. 881-894.

149. Young, R.A., Control of the embryonic stem cell state. Cell, 2011. 144(6): p. 940-954.

150. Zabidi, M.A., et al., Enhancer-core-promoter specificity separates developmental and housekeeping gene regulation. Nature, 2015. 518(7540): p. 556-559.

151. Zangrossi, S., et al., Oct-4 expression in adult human differentiated cells challenges its role as a pure stem cell marker. Stem cells, 2007. 25(7): p. 1675-1680.

152. Zeineddine, D., et al., The Oct4protein: more than a magic stemness marker. American journal of stem cells, 2014. 3(2): p. 74.

153. Zhang, Q., et al., The role and specific mechanism of OCT4 in cancer stem cells: a review. International journal of stem cells, 2020. 13(3): p. 312-325.

154. Zhao, L., T. Teklemariam, and B.M. Hantash, Heterelogous expression of mutated HLA-G decreases immunogenicity of human embryonic stem cells and their epidermal derivatives. Stem cell research, 2014. 13(2): p. 342-354.

155. Zhao, Y., et al., Prognostic value of association of OCT4 with LEF1 expression in esophageal squamous cell carcinoma and their impact on epithelial-mesenchymal transition, invasion, and migration. Cancer medicine, 2018. 7(8): p. 3977-3987.

156. Гордеев, М., Е. Бахмет, and А. Томилин, Динамика плюрипотентности в эмбриогенезе и в культуре. Онтогенез, 2021. 52(6): p. 429-440.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своему научному руководителю, Алексею Николаевичу Томилину за возможность работать над интересным проектом в лаборатории международного уровня, а также за чуткое руководство и формирование научного направления работы.

Автор благодарит всех сотрудников лаборатории Молекулярной биологии стволовых клеток за поддержку в выполнении работы над диссертацией. Кузьмина Андрея Анатольевича за предоставление генетических конструкций, наработок проекта, всестороннюю помощь и советы по планированию и выполнению экспериментов. Фокина Никиту Павловича за помощь с тератомным тестом и анализом гистологических срезов, Бахмета Евгения Игоревича за советы по работе с праймированными ЭСК, Старкову Татьяну Юрьевну, Зиновьеву Анну Сергеевну за обсуждение результатов, советы по работе и коррекцию текста.

Автор выражает благодарность всем сотрудникам института Цитологии, которые приняли участие в выполнении работы. Аксёнову Николаю Дмитриевичу за помощь с проточной цитофлуориметрией и сортировкой клеток, Никифорову Андрею Анатольевичу, Цимохе Анне Сергеевне.

Адамейко Игорю Игоревичу (Каролинский институт, Швеция) за обсуждение результатов, мудрые советы и поддержку в моменты, когда хотелось сдаться.

Автор также выражает признательность родителям Ермаковой Татьяне Владимировне и Ермакову Владимиру Николаевичу за поддержку в выборе профессии и жизненного пути.