Особенности антигипоксических программ, индуцируемых ингибиторами HIF-пролилгидроксилаз тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Христиченко Анна Юрьевна

• Христиченко Анна Юрьевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Христиченко Анна Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гипоксия в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и инсульта головного мозга

1.2. Транскрипционный фактор HIF

1.2.1. HIF и нейродегенеративные заболевания

1.2.2. HIF и ишемический инсульт

1.2.3. Изоформы HIF: строение и функциональные различия

1.3. Регуляторы стабильности HIF - HIF-PHD

1.3.1. Каталитический механизм HIF-PHD

1.3.2. Субстратная специфичность HIF-PHD

1.3.3. Альтернативные пути регуляции белковой стабильности HIF

1.3.4. а-кетоглутарат- и Fe2+-зависимые диоксигеназы

1.4. Ингибиторы HIF-PHD

1.4.1. Хелаторы железа

1.4.2. Ингибиторы - конкуренты а-кетоглутарата

1.4.3. Оксихинолины и их нейропротекторный потенциал

1.5. Новые подходы к разработке лекарственных препаратов

1.5.1. Высокопроизводительный скрининг с использованием репортеров нового поколения

1.5.2. ПЦР-панели

1.5.3. Нейросфера, как in vitro модель мозга

1.5.4. Транскриптомный анализ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Работа с линией нейробластомы человека SH-SY5Y

2.1.1. Условия культивирования

2.1.2. Пассирование

2.1.3. Криоконсервация

2.1.4. Дифференцировка клеток линии нейробластомы человека SH-SY5Y

2.1.5. Формирование нейросфер из дифференцированных клеток SH-SY5Y

2.2. Скрининг пула оксихинолинов на репортерной линии HIF1 ODD-luc SH-SY5Y

2.2.1. Описание библиотеки разветвленных оксихинолинов, аналогов адаптахина

2.2.2. Инкубация клеток репортерной линии HIF1 ODD-luc SH-SY5Y с разветвленными оксихинолинами

2.2.3. Анализ люциферазной активности репортера

2.3. Анализ уровней экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени

2.3.1. Подготовка образцов и выделение тотальной РНК из клеток

2.3.2. Обратная транскрипция

2.3.3. Подбор праймеров и оценка их эффективности

2.3.4. Постановка ПЦР в реальном времени

2.4. Определение нейротоксичности соединений с помощью MTS теста

2.5. Транскриптомный анализ на платформе Affymetrix

2.5.1. Подготовка образцов и выделение тотальной РНК

2.5.2. Синтез кДНК

2.5.3. Синтез кРНК, in vitro транскрипция

2.5.4. Второй цикл синтеза одноцепочечной кДНК

2.5.5. Фрагментирование и маркировка одноцепочечной кДНК

2.5.6. Гибридизация чипов на приборе GeneChip

2.5.7. Отмывка, окраска чипов и сканирование

2.5.8. Обработка результатов транскриптомного анализа, проведенного на платформе Affymetrix

2.6. Анализ уровня экспрессии белка методом вестерн-блоттинга

2.6.1. Подготовка образцов для белкового электрофореза

2.6.2. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле

2.6.3. Вестерн-блот анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Количественный анализ действия люциферазного клеточного репортера HIF1ODD-luc

3.1.1. Внутриклеточная стационарная концентрация репортерного белка

3.1.2. Определение максимальной скорости наработки репортера ШFЮDD-82

3.2. Структурная оптимизация адаптахина, ингибитора ШF-PHD

3.2.1. Высокопроизводительный скрининг пула оксихинолинов - аналогов адаптахина на стабильной линии SH-SY5Y HIF1ODD-luc

3.2.2. Вестерн-блот анализ стабилизации полноразмерного И!Р-1 белка под воздействием HIF-PHD ингибиторов

3.3. Характеристика оптимизированных ингибиторов HIF-PHD

3.3.1. Специфичность в отношении стабилизации изоформ транскрипционного фактора - ШЕ-1 и И!Р-2

3.3.2. Токсичность отобранных оптимизированных соединений

ингибиторов HIF-PHD

3.4. Транскриптомный анализ особенностей антигипоксических программ,

запускаемых ингибиторами НШ-РНО

3.4.1. Общий анализ изменений в экспрессии генов под воздействием различных ингибиторов НШ-РНО и гипоксии

3.4.2. Сравнение сигнальных путей, регулируемых альтернативными мишенями НШ-РНО

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности антигипоксических программ, индуцируемых ингибиторами HIF-пролилгидроксилаз»

ВВЕДЕНИЕ

Головной мозг является одним из наиболее кислород-зависимых органов. Из-за его высокой метаболической активности он наиболее подвержен травмам, связанным с ишемическими процессами, основным паталогическим компонентом которых является гипоксия, пониженное содержание кислорода в тканях. В настоящее время ишемический инсульт является одной из наиболее частых причин смертности во всем мире. Несмотря на большое количество исследований, проводимых с целью разработки соединений, обладающих нейропротекторными свойствами, эффективные препараты для предотвращения ишемических инсультов, а также лечения нейродегенартивных заболеваний, в патогенез которых также входит гипоксия, отсутствуют. Одной из наиболее перспективных мишеней для нейропротекторной терапии является транскрипционный фактор, индуцируемый гипоксией, НШ.

Наиболее распространенным вариантом разработки и оптимизации структур нейропротекторных препаратов является высокопроизводительный скрининг (ВПС) групп соединений на люциферазных репортерах нового поколения, стабильно экспрессируемых в нейрональных клетках. Стоит отметить единичный, пока доклинический, успех молекулы, носящей название «адаптахин», отобранной при первичном высокопроизводительном скрининге на линии нейробластомы экспрессирующей репортер нового поколения - слитый белок кислород-чувствительного домена фактора, индуцируемого гипоксией (НШ), и люциферазы светляков. [1]. Отобранная молекула на основе оксихинолинового остова без каких-либо дополнительных исследований была использована и показала высокую эффективность в двух различных животных моделях геморрагического инсульта в США и Канаде [2]. На сегодня данное соединение - единственная молекула, которая показывает нейропротекторными свойствами в моделях геморрагического инсульта. Отбор сильных стабилизаторов НШ методом высокопроизводительного скрининга на клеточных репортерах

позволяет уже на первой стадии отобрать нетоксичные активные препараты, проникающие в клетку.

Стабилизация транскрипционного фактора HIF происходит путем ингибирования регуляторов его белковой стабильности - ферментов HIF-пролилгидроксилаз (HIF-PHD), которые являются а-кетоглутарат Fe2+-зависимыми оксигеназами. Неспецифичное ингибирование данных ферментов ведет к ингибированию большинства ферментов супер-семейства а-кетоглутарат и Fe2+-зависимых оксигеназ, таких как TET и Jmjc деметилазы, коллаген-пролилгидроксилазы и многих других, что обуславливает сложность разработки специфических стабилизаторов HIF. Ингибирование HIF-PHD ведет не только к стабилизации HIF, но также и к стабилизации других субстратов данного фермента, к числу которых относятся транскрипционные факторы NF-kB, p53, FOXO3a, центросомальный белок Cep192, и др. В связи с возможностью возникновения побочных эффектов вследствие как неспецифичного ингибирования HIF-PHD, так и стабилизации альтернативных мишеней фермента, особую актуальность приобретает доклиническое исследование особенностей антигипоксических программ, запускаемых разрабатываемыми ингибиторами. Пример подобного исследования представлен в данной диссертационной работе.

Цели и задачи исследования. Целями данной работы являлись поиск и характеристика новых специфичных ингибиторов HIF-PHD, а также исследование особенностей запускаемых ими антигипоксических программ.

Для достижения данных целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести количественный анализ механизма действия репортера HIF1ODD-luc, созданного для поиска ингибиторов HIF-PHD.

2. Провести структурную оптимизацию адаптахина, эффективного ингибитора HIF-PHD, ранее разработанного нашими коллегами, методом скрининга библиотеки структурных аналогов адаптахина с использованием клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y, конститутивно экспрессирующей репортер HIF1ODD-luc, и отобрать наиболее эффективные ингибиторы.

3. Оценить специфичность новых разработанных ингибиторов HIF-PHD к стабилизации отдельных изоформ HIF по экспрессии панели генов, специфичных для каждой изоформы HIF, методом ПЦР в реальном времени.

4. Провести оптимизацию условий получения нейрональных 3D моделей из дифференцированных клеток линии SH-SY5Y для оценки токсичности, разработанных ингибиторов HIF-PHD в условиях, приближенных к in vivo.

5. Провести сравнительный транскриптомный анализ антигипоксических программ, запускаемых разработанным в ходе диссертационной работы ингибитором, аналогом адаптахина; коммерчески доступным соединением фирмы FibroGen, FG-4592 и диметилоксалилглицином (DMOG), известным ингибитором HIF-PHD, структурным аналогом а-кетоглутарата.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые проведена структурная оптимизация адаптахина, ингибитора HIF-PHD, продемонстрировавшего нейропротекторные свойства в модели геморрагического инсульта. Также был проведен скрининг на линии нейробластомы человека SH-SY5Y, стабильно экспрессирующей репортер, содержащий фрагмент кислород-чувствительного домена транскрипционного фактора HIF и люциферазу. Произведен количественный анализ действия данного репортера и показано, что репортер достоверно отражает способность исследуемых ингибиторов стабилизировать транскрипционный фактор HIF-1. В ходе скрининга проанализировано более 60 соединений, оксихинолинов -структурных аналогов адаптахина. Отобраны новые наиболее сильные ингибиторы HIF-PHD - стабилизаторы HIF. Специфичность аналогов адаптахина к стабилизации той или иной изоформы HIF определена с помощью таргетной ПЦР панели, впервые разработанной в ходе данной диссертационной работы. Данная панель может применяться для исследования любых агентов, предположительно обладающих антигипоксическими свойствами, с целью определения их специфичности к определенной изоформе HIF и запуску соответствующей антигипоксической программы. Впервые проведена

оптимизация условий культивирования линии нейробластомы человека SH-SY5Y для создания 3D нейрональной модели с целью определения токсичности соединений в условиях приближенных к in vivo. С помощью транскрипционного анализа исследованы особенности антигипоксических программ, запускаемых оптимизированным аналогом адаптахина - соединением 4896-3249 - в сравнении с коммерчески доступными соединениями FG-4592 и DMOG.

Апробация результатов работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции Биокатализ 2017 (Россия, Истра); конференции «Ломоносов 2018» (Россия, Москва); на международном конгрессе FEBS 2018 (Чехия, Прага); на международной конференции Pittcon 2018. По результатам работы опубликовано 5 статей (все журналы входят в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК РФ) в рецензируемых научных журналах и 4 тезиса международных конференций.

Положения, выносимые на защиту.

1. Люциферазный репортер нового поколения, используемый в диссертационной работе, достоверно отражает способность исследуемых ингибиторов стабилизировать транскрипционный фактор HIF-1.

2. Методом структурной оптимизации адаптахина получены новые эффективные ингибиторы HIF-PHD.

3. Разработанная в ходе работы ПЦР-панель позволяет определять специфичность ингибиторов HIF-PHD к стабилизации одной из изоформ HIF.

4. Оптимизированы условия формирования 3D нейрональных моделей из дифференцированных клеток линии нейробластомы человека SH-SY5Y для определения токсичности ингибиторов HIF-PHD.

5. Показана неспецифичность ингибиторов HIF-PHD - FG-4592 и диметилоксалилглицина (DMOG), разработанных на основе имитирования мотива связывания а-кетоглутарат мотива.

6. Соединение 4896-3249, разработанное в ходе структурной оптимизации адаптахина, является специфичным к ферменту-мишени, обладает

высоким нейропротекторным потенциалом, демонстрирует ярко выраженные антиапоптотические свойства и способно вызывать арест клеточного цикла, позволяя тем самым клетке сохранить энергию и выжить в условиях гипоксии.

Личное участие автора в получении научных результатов. Автор принимал непосредственное участие в планировании работы, проведении экспериментов, а также анализе данных и подготовке публикаций. Основные результаты диссертационной работы получены лично автором.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, обсуждения результатов, выводов, благодарностей и списка цитируемой литературы, который содержит - 183 ссылки. Диссертация изложена на 141 странице и содержит 41 рисунок и 6 таблиц.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гипоксия в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и инсульта головного мозга

Головной мозг является одним из наиболее кислород-зависимых органов. Из-за его высокой метаболической активности он наиболее подвержен травмам, связанным с ишемическими процессами, в основе которых лежит недостаток кровоснабжения тканей. Гипоксия, недостаток кислорода, возникающий в результате уменьшения кровоснабжения ткани, является патологическим компонентом ишемии. В настоящее время повреждения мозга в следствии острого ишемического инсульта, занимают одно из лидирующих мест по смертности во всем мире. В России среди причин смертности инсульт головного мозга занимает второе место после инфаркта миокарда. Ежегодно 450 000 граждан нашей страны переносят инсульт. В США инсульт поражает более чем 500 000 человек в год и с каждым годом эта цифра продолжает расти. При этом показатели смертности в нашей стране значительно выше, чем в США и Канаде. Треть пациентов, перенесших ишемический инсульт головного мозга, умирает, и треть становятся инвалидами [3].

Кроме острых гипоксических повреждений головного мозга существуют также повреждения, вызванные хронической гипоксией. Такие состояния могут возникнуть как следствия различных сердечно-сосудистых заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, инфаркт, или же патологий дыхательной системы. Гипоксические повреждения нейронов лежат в основе таких тяжелых нейродегенеративных заболеваний как болезни Паркинсона, Хантингтона, церебральный атеросклероз. Так, было показано, что хроническая гипоксия может индуцировать образование бета-амилоидных пептидов, первичных нейротоксических элементов болезни Альцгеймера [4].

Таким образом, разработка лекарственных средств, способствующих выживанию клетки в условиях гипоксии, необходима для купирования

последствий ишемического инсульта головного мозга, а также для комплексного лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний.

1.2. Транскрипционный фактор HIF

Одной из наиболее многообещающих мишеней для разработки нейропротекторных препаратов, позволяющих клетке выживать в условиях гипоксии, является транскрипционных фактор HIF - hypoxia inducible factor, фактор, индуцируемый гипоксией.

Данный транскрипционный фактор был открыт при исследовании механизмов адаптации живых организмов к изменениям содержания кислорода в окружающей среде более двадцати лет назад. В дальнейшем был обнаружен в множестве различных клеток и тканей, подверженных гипоксии [5].

HIF представляет собой гетеродимер, содержащий две белковые субъединицы - HIFa и HIFP [6]. При этом HIFa, ДНК связывающий белок, содержащий PAS (PER-ARNT-SIM) домены, в присутствии кислорода подвергается гидроксилированию, которое влечет за собой связывание с белком фон Хиппеля-Ландау, убиквитинирование и протеасомную деградацию [7].

При снижении уровня кислорода в клетке гидроксилирования не происходит, HIFa стабилизируется и димеризуется со второй кислород-нечувствительной субъединицей траснкрипционного фактора HIF - HIFP, которая также называется ядерным трансклокатором AH-рецептора (ARNT). Получившийся комплекс транслоцируется в ядро, где связывается с гипоксия-зависимыми элементами (hypoxia response elements, HREs) и запускает генетическую программу выживания клетки в условиях нехватки кислорода, регулируя экспрессию более чем ста генов (Рис. 1.1).

Рис. 1.1. Гены, экспрессия которых регулируется транскрипционным фактором HIF.

Путем индукции экспрессии ферментов, катализирующих различные этапы гликолиза, таких как лактат дегидрогеназа А (Lactate dehydrogenase A, LDHA), пируват киназа и других, HIF активирует анаэробный гликолиз в клетке, находящейся в гипоксическом состоянии. [8]

HIF также регулирует экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), тем самым поддерживая миграцию зрелых эндотелиальных клеток к тканям, подверженным гипоксии, и стимулируя ангиогенез. HIF усиливает эритропоэз за счет регуляции экспрессии эритропоэтина (erythropetin, EPO) - гормона стимулирующего образование эритроцитов из эритроидных клеток предшественников [9]. Кроме того, HIF участвует в поддержании тонуса сосудов, индуцируя экспрессию ферментта синтазы оксида азота (NO-synthase, NOS) и вазоконстриктора эндотелина 1 (Endothelin-1, ET-1). Таким образом, HIF запускает механизмы, увеличивающие доставку кислорода в области, подверженные гипоксическому воздействию. Кроме всего вышеперечисленного HIF регулирует метаболизм железа за счет регуляции экспрессии трансферрина, рецептора трансферрина 1 и стабилизирует клеточный pH, запуская экспрессию карбоангидразы и монокарбоксилат-транспортера [10].

Широкая транскрипционная активность HIF стала причиной усиленного поиска соединений, стабилизирующих данный транскрипционный фактор, являющихся потенциальными препаратами против широкого спектра заболеваний, как тех, в патогенез которых входит гипоксия (латеральный амиотрофический склероз, бозень Альцгеймера и др.), так и тех, в чей патогенез она не входит (анемия [11], почечная недостаточность и др.). Целесообразность применения стабилизаторов HIF для лечения заболеваний, в патогенез которых не входит в гипоксия, обусловлена широкой траснкрипционной активностью данного транскрипционного фактора.

1.2.1. HIF и нейродегенеративные заболевания

Ниже представлены результаты многочисленных исследований в области влияния стабилизации HIF на патогенез основных нейродегенеративных заболеваний. Интересно отметить, что во многих из них HIF не только устраняет возможные последствия гипоксических повреждений, но также либо непосредственно, либо через регуляцию экспрессии генов-мишеней взаимодействует с белками, ассоциированными с патологией.

1.2.1.1. Болезнь Альцгеймера

У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдаются множественные повреждения и смерть нейронов, нарушение синапсов, образование внеклеточных сенильных бляшек, состоящих из агрегированного ß-амилоидного пептида, а также образование внутриклеточных нейрофибриллярных клубочков из высокофосфорилированого связанного с микротрубочками опухолевого белка TAU. [12] Формирование подобных бляшек и нейрофибриллярных клубочков - паталогические процессы, лежащие в основе болезни, которые влекут за собой нейровоспаление и нарушения в регуляции кальция.

В ходе фундаментальных и клинических исследований было выяснено, что стабилизация HIF в нейронах позволяет отсрочить развитие болезни Альцгеймера

и облегчить ее симптомы [13]. На нейрональных клеточных линиях РС12 и В12, а также на первичных нейрональных линиях, было показано что оверэкспрессия НШ-1 ведет к защите от нейротоксичности, вызываемой бета-амилоидным пептидом вероятно за счет активации ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути [14].

1.2.1.2. Болезнь Паркинсона

В основе патогенеза болезни Паркинсона лежит прогрессирующее с возрастом отмирание дофаминергических нейронов в черном веществе, влекущее за собой классические моторные симптомы брадикинезии, ригидности и тремора покоя. Предполагается, что митохондриальная дисфункция нейронов и связанный с ней окислительный стресс, являются основными механизмами, ответственными за нейродегенерацию в болезни Паркинсона [15].

Недавние исследования показали, что НШ может защищать дофаминергические нейроны за счет регуляции гомеостаза железа и, соответственно, ответа на окислительный стресс [13,16]. Кроме того, были проведены исследования, в которых был показан вклад белков, экспрессия которых индуцируется НШ-1, а именно УЕОБ и ЕРО, в защиту дофаминергических нейронов от патогенеза болезни Паркинсона. Так, было показано, что эритропоэтин оказывает нейропротекторное действие против дофаминергического нейротоксина, 6-гидрокси-дофамина, как в дофаминергической линии МЫ9В, так и в линии первичных дофаминергических нейронов [17]. На эмбриональной модели крыс было показано благотворное влияние УЕОБ на пролиферацию и дифференцировку дофаминергических нейронов [18].

1.2.1.3. Болезнь Хантингтона

В основе патогенеза болезни Хантингтона лежит генетически запрограммированная дегенерация нейронов, располагающихся преимущественно в базальных ганглиях головного мозга. Гибель нейронов при болезни

Хантингтона предположительно вызывается мутантным белком хантингтином. Мутантный белок вызывает транскрипционную репрессию многих генов, в том числе контролирующих метаболизм митохондрий, таких как пероксизомный активирующий пролиферацию рецептор у коактиватор-1а (PGC-1a) [19].

Исследование митохондриальной дисфункции, вызванной мутантным белком хантингтином, позволило выдвинуть предположение, о том, что использование альтернативных стратегий для компенсации дефицита митохондриальной энергии, может предотвратить гибель нейронов. HIF регулирует гликолиз и пентозофосфатный путь, увеличивая синтез АТФ, никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и способствует выживанию нейронов. Кроме того, HIF индуцирует экспрессию транспортеров глюкозы. Было показано, что один из стабилизаторов HIF, хелатор железа клиохинол, замедляет нейродегенерацию и препятствует накоплению мутантного белка и смерти нейронов как in vitro, так и на трансгенных мышах с моделированной болезнью Хантингтона [20].

1.2.1.4. Латеральный амиотрофических склероз

Латеральный амиотрофический склероз характеризуется отмиранием моторных нейронов, которое влечет за собой такие симптомы, как мышечная атрофия, гипо- и гиперрефлексия. Гипоксия является одним из, возможно, основных участников патогенеза данного заболевания [21]. В случае снижения кровотока в районе аксона двигательного нейрона, риск развития амиотрофического склероза возрастает вдвое. Кроме того, хроническое снижение кровотока, сопутствующее старению, может привести к дефициту глюкозы (гипокликемия) и кислорода (гипоксия). Снижение уровня кислорода и глюкозы ведет к ограничению в неспособности моторных нейронов, что и вызывает их дегенерацию и смерть [22].

Как уже было описано выше, HIF за счет индукции экспрессии таких генов, как VEGF, EPO и многих других, усиливает эритропоэз и ангиогенез, тем самым

увеличивая доставку кислорода к клеткам, находящимися в условиях гипоксии. Стабилизация HIF способствует образованию новых микрососудов вокруг зон моторных нейронов претерпевающих гипоксию [23].

1.2.2. HIF и ишемический инсульт

Ишемический инсульт приводит к нарушению гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), образованию отеков и смерти нейронов. Медикаментозная стабилизация HIF, в процессе развития данной патологии и купировании ее последствий, очевидно оказывает терапевтическое действие, активируя антигипоксическую программу, а также усиливая эритропоэз. Так, к примеру, на in vitro модели мозга, состоящей из эндотелиальных клеток мозга и первичных астроцитов, было показано, что известный ингибитор HIF-PHD, FG-4497 при моделировании ишемии с использованием комбинированной депривации кислорода и глюкозы способствует выживанию нейронов. Кроме того, было показано, что FG-4497 способен предотвращать индуцированные ишемией перестроение и деформацию белков плотных контактов, таких как окклюдин, как в культивируемых in vitro эндотелиальных клетках, так и в in vivo моделях [24]. Также стабилизация HIF, наблюдаемая при воздействии соединением адаптахин, подробно описанным в главе 2.4.3, в in vitro и in vivo моделях геморрагического инсульта приводила к нейропротекторному эффекту [2].

Таким образом, исходя из последних исследований, можно сделать вывод, что разработка соединений - стабилизаторов транскрипционного фактора HIF является крайне актуальной задачей, решение которой может привести к получению эффективных лекарств для терапии как последствий ишемических инсультов, так и нейродегенеративных заболеваний.

1.2.3. Изоформы HIF: строение и функциональные различия

На настоящий момент известно три изоформы а-субъединицы HIF. Наиболее изученными из них являются HIF1a и HIF2a. Обе изоформы содержат два трансактивационных домена - N-концевой (N-terminal transactivation domain, NTAD) и C-концевой (C-terminal transactivation domain, CTAD). На C-конце у а-субъединиц HIF располагается структурный мотив спираль-петля-спираль, позволяющий им распознавать специфические последовательности ДНК -гипоксия-зависимые элементы (hypoxia response elements, HREs). За мотивом спираль-петля-спираль идут два PAS домена. Кроме того, а-субъединицы различных изоформ HIF содержат сигнал ядерной локализации. У третьей изоформы, HIF3a, отсутствует C-концевой транскрипционной активности. К настоящему моменту также описаны сплайс-варианты данной изоформы, в которых полностью отсутствуют трансактивационные домены [25]. По-видимому, данная изоформа обладает ингибирующим воздействием по отношению к HIF-зависимой транскрипции.

Несмотря на крайне похожее строение (рис. 1.2) различные изоформы HIF кроме общих генов регулируют экспрессию генов, специфичных именно для каждой отдельной изоформы.

P402 P564 N803

298 401Y 531 Т 575 603 786 f 826

HIF-Ia

bHLH PAS | ODD TAD-N TAD-C

HIF-2a

bHLH

P405

300 402

P531

PAS

l_496 I

ODD

TAD-N

TAD-C

496

N851

HIF-3a

P492 1

297 452 454 506 581 669

bHLH PAS | ODD TAD-N

564

Рис. 1.2. Строение изоформ субъединицы HIFa

HIF-1 представляет собой двигатель метаболического ответа на гипоксию. Он индуцирует экспрессию большинства гликолитических ферментов, таких как лактат дегидрогеназа (lactate dehydrogenase, LDHA), фосфофруктокиназа (phosphofructokinase, PFKFB3) и пируват киназа (pyruvate kinase, PKM). Кроме

530

653

830

870

607

454

того, HIF-1 регулирует экспрессию генов, которые отвечают за поддержание внутриклеточного pH. Так, HIF-1 индуцирует экспрессию транспортера монокарбоксилата 4 (monocarboxylate transporter 4, MCT4) и карбонильную ангидразу 9 (carbonic anhydrase, CA-IX). Кроме того, индукция HIF-1 влечет за собой супрессию митохондриального дыхания. HIF-1 также регулирует митохондриальную субъединицу COX4 через активацию транскрипции гена, кодирующего COX4-2, и регуляцию экспрессии LONP1, митохондриальной протеазы, которая способствует деградации COX4-1. Деградация COX4-1 и стабилизация COX4-2 влечет за собой снижение активности окислительного комплекса цитохромов и приводит к снижению потребления кислорода [26].

HIF2, в свою очередь, отвечает за индукцию генов, связанных с ростовыми факторами, такими как TGFA и PDGFB, с регуляцией клеточного цикла (CCDN1), с дифференцировкой (OCT4), инвазией (MMP2 и MMP3) и эритропоэзом (EPO) [10].

Таким образом, из всего вышеперечисленного можно сделать вывод о фундаментальных различиях путей ответа на гипоксию, запускаемых изоформами транскрипционного фактора HIF - HIF-1 и HIF-2. При разработке стабилизаторов HIF, следует особое внимание уделять определению того, какая именно изоформа стабилизируется. Для наиболее быстрого ответа на гипоксию, к примеру, в случае ишемического инсульта головного мозга, в первую очередь стоит активировать изоформу HIF-1, ведь именно она запускает программу анаэробного метаболизма. В случае хронического недостатка кислорода в мозге, который может являться одним из последствии ухудшения кровоснабжения мозга в процессе старения и одной из причин развития нейродегенерации наибольшее внимание стоит уделять активации именно изоформы HIF-2. В этом ключе особую актуальность представляет разработка специфичных стабилизаторов для той или иной изоформы.

1.3. Регуляторы стабильности HIF - HIF-PHD

Основными регуляторами белковой стабильности различных изоформ HIFa являются HIF-пролилгидроксилазы (PHD) - a-кетоглутарат и Fe2+-зависимые диоксигеназы, кодируемые генами EGLN. HIF-PHD при нормальном содержании кислорода в клетке гидроксилируют один из двух или же оба высококонсервативных пролина, которые расположены вблизи N-концевого трансактивационного домена HIFa [5]. У изоформы HIFla это С-концевой Pro564 и N-концевой Pro402, у изоформы HIF2a - Pro405 и Pro531, у изоформы HIF3a всего один гидроксилируемый пролин Pro492 (Рис. 2.2).

Гидроксилирование любого из перечисленных пролинов ведет к связыванию HIFa субъединицы белком фон Хиппеля-Ландау (VHL), который входит в убиквитинлигазный комплекс. Образование данного комплекса ведет к убиквитинированию и протеасомной деградации HIFa.

Для понимания механизма работы нейропротекторных препаратов, работающих на основе ингибирования HIF-PHD в целях стабилизации HIF, рассмотрим каталитический механизм фермента

1.3.1. Каталитический механизм HIF-PHD

Механизм реакции, катализируемой HIF-PHD, включает активацию молекулярного кислорода, превращение a-кетоглутарата в сукцинат и двуокись углерода и гидрокислирование основного субстрата HIFa субъединицы, как показано на рисунке 1.3.

На первой стадии каталитического механизма происходит связывание железа в активном центре, затем координация железом a-кетоглутарата через С-1 карбоксильную группу и кислород кетоновой группы. После чего происходит связывание HIF-пептида, которое приводит к вытеснению молекулы воды из 6-го положения координационной сферы железа. Освобождение координационной сферы железа для связывания молекулы кислорода влечет за собой активацию последнего. Атом кислорода, некоординированный железом, атакует углеродный атом кетоновой группы (Стадия 2) образуя бициклический комплекс Fe(IV)-пероксигемикеталь (Стадия 3). На стадии 4 происходит декарбоксилирование и

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Христиченко Анна Юрьевна, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Smirnova N.A. et al. Utilization of an In Vivo Reporter for High Throughput Identification of Branched Small Molecule Regulators of Hypoxic Adaptation // Chem. Biol. 2010. Vol. 17, № 4. P. 380-391.

2. Karuppagounder S.S. et al. Therapeutic targeting of oxygen-sensing prolyl hydroxylases abrogates ATF4-dependent neuronal death and improves outcomes after brain hemorrhage in several rodent models // Sci. Transl. Med. 2016. Vol. 8, № 328. P. 328ra29-328ra29.

3. Markus R. et al. Hypoxic tissue in ischaemic stroke: Persistence and clinical consequences of spontaneous survival // Brain. 2004. Vol. 127, № 6. P. 14271436.

4. Peers C., Pearson H.A., Boyle J.P. Hypoxia and Alzheimer's disease // Essays Biochem. 2007. Vol. 43. P. 153 LP-164.

5. Schofield C.J., Ratcliffe P.J. Oxygen sensing by HIF hydroxylases // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 5, № 5. P. 343-354.

6. Weidemann A., Johnson R.S. Biology of HIF-1a // Cell Death Differ. Nature Publishing Group, 2008. Vol. 15. P. 621.

7. Ivan M., Kaelin W.G. The EGLN-HIF O2-Sensing System: Multiple Inputs and Feedbacks // Mol. Cell. Elsevier Inc., 2017. Vol. 66, № 6. P. 772-779.

8. Ziello J.E., Jovin I.S., Huang Y. Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-1 Regulatory Pathway and its Potential for Therapeutic Intervention in Malignancy and Ischemia // Yale J. Biol. Med. Yale Journal of Biology and Medicine, 2007. Vol. 80, № 2. P. 51-60.

9. Haase V.H. Regulation of erythropoiesis by hypoxia-inducible factors // Blood Rev. 2013. Vol. 27, № 1. P. 41-53.

10. Kaelin W.G., Ratcliffe P.J. Oxygen Sensing by Metazoans: The Central Role of

the HIF Hydroxylase Pathway // Mol. Cell. 2008. Vol. 30, № 4. P. 393-402.

11. Chen N. et al. Phase 2 studies of oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor FG-4592 for treatment of anemia in China // Nephrol. Dial. Transplant. Oxford University Press, 2017. Vol. 32, № 8. P. 1373-1386.

12. Di Paolo G., Kim T.-W. Linking Lipids to Alzheimer's Disease: Cholesterol and Beyond // Nat. Rev. Neurosci. 2011. Vol. 12, № 5. P. 284-296.

13. Zhang Z. et al. Hypoxia Inducible Factor-1 as a Target for Neurodegenerative Diseases // Curr. Med. Chem. 2011. Vol. 18, № 28. P. 4335-4343.

14. Soucek T. et al. The Regulation of Glucose Metabolism by HIF-1 Mediates a Neuroprotective Response to Amyloid Beta Peptide // Neuron. Elsevier, 2003. Vol. 39, № 1. P. 43-56.

15. Meissner W.G. et al. Priorities in Parkinson's disease research // Nat. Rev. Drug Discov. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All Rights Reserved., 2011. Vol. 10. P. 377.

16. Lee D.W. et al. Inhibition of Prolyl Hydroxylase Protects against 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Neurotoxicity: MODEL FOR THE POTENTIAL INVOLVEMENT OF THE HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR PATHWAY IN PARKINSON DISEASE // J. Biol. Chem. 9650 Rockville Pike, Bethesda, MD 20814, U.S.A.: American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2009. Vol. 284, № 42. P. 29065-29076.

17. Silverman W.F. et al. Vascular, glial and neuronal effects of vascular endothelial growth factor in mesencephalic explant cultures // Neuroscience. 1999. Vol. 90, № 4. P. 1529-1541.

18. P. S.A. et al. Erythropoietin protects against 6-hydroxydopamine-induced dopaminergic cell death // J. Neurochem. Wiley/Blackwell (10.1111), 2005. Vol. 96, № 2. P. 428-443.

19. Crook Z.R., Housman D. Huntington's Disease: Can Mice Lead the Way to Treatment? // Neuron. 2011. Vol. 69, № 3. P. 423-435.

20. Nguyen T., Hamby A., Massa S.M. Clioquinol down-regulates mutant huntingtin expression in vitro and mitigates pathology in a Huntington's disease mouse model // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2005. Vol. 102, № 33. P. 11840-11845.

21. Rowland L.P., Shneider N.A. Amyotrophic Lateral Sclerosis // N. Engl. J. Med. Massachusetts Medical Society, 2001. Vol. 344, № 22. P. 1688-1700.

22. Skene J.H.P., Cleveland D.W. Hypoxia and Lou Gehrig // Nat. Genet. Nature Publishing Group, 2001. Vol. 28. P. 107.

23. Kupershmidt L. et al. Neuroprotective and neuritogenic activities of novel multimodal iron-chelating drugs in motor-neuron-like NSC-34 cells and transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis // FASEB J. Federation of American Societies for Experimental Biology, 2009. Vol. 23, № 11. P. 37663779.

24. Reischl S. et al. Inhibition of HIF prolyl-4-hydroxylases by FG-4497 reduces brain tissue injury and edema formation during ischemic stroke // PLoS One. 2014. Vol. 9, № 1.

25. Osipyants A.I. et al. Enzyme-substrate reporters for evaluation of substrate specificity of HIF prolyl hydroxylase isoforms // Biochem. 2017. Vol. 82, № 10. P. 1207-1214.

26. Fukuda R. et al. HIF-1 Regulates Cytochrome Oxidase Subunits to Optimize Efficiency of Respiration in Hypoxic Cells // Cell. Elsevier, 2007. Vol. 129, № 1. P. 111-122.

27. Lieb M.E. et al. Mammalian EGLN genes have distinct patterns of mRNA expression and regulation. 2002. Vol. 426. P. 421-426.

28. Metzen E. et al. Intracellular localisation of human HIF-1 a hydroxylases: implications for oxygen sensing. 2003. Vol. 402.

29. Wong B.W. et al. Emerging novel functions of the oxygen-sensing prolyl hydroxylase domain enzymes // Trends Biochem. Sci. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 38, № 1. P. 3-12.

30. Pappalardi M.B. et al. Biochemical characterization of human HIF hydroxylases using HIF protein substrates that contain all three hydroxylation sites // Biochem. J. 2011. Vol. 436, № 2. P. 363 LP-369.

31. Koivunen P. et al. The Length of Peptide Substrates Has a Marked Effect on Hydroxylation by the Hypoxia-inducible Factor Prolyl 4-Hydroxylases // J. Biol. Chem. . 2006. Vol. 281, № 39. P. 28712-28720.

32. Landazuri M.O. et al. Analysis of HIF-prolyl hydroxylases binding to substrates // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. Vol. 351, № 2. P. 313-320.

33. Berra E. et al. HIF prolyl-hydroxylase 2 is the key oxygen sensor setting low steady-state levels of HIF-1 a in normoxia // EMBO J. Oxford, UK: Oxford University Press, 2003. Vol. 22, № 16. P. 4082-4090.

34. Appelhoff R.J. et al. Differential Function of the Prolyl Hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the Regulation of Hypoxia-inducible Factor // J. Biol. Chem. . 2004. Vol. 279, № 37. P. 38458-38465.

35. Koivunen P. et al. Catalytic Properties of the Asparaginyl Hydroxylase (FIH) in the Oxygen Sensing Pathway Are Distinct from Those of Its Prolyl 4-Hydroxylases // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 11. P. 9899-9904.

36. Khan M.N. et al. Factor inhibiting HIF (FIH-1) promotes renal cancer cell survival by protecting cells from HIF-1 a-mediated apoptosis // Br. J. Cancer. The Author(s), 2011. Vol. 104. P. 1151.

37. Zhang N. et al. The asparaginyl hydroxylase FIH (Factor Inhibiting HIF) is an

essential regulator of metabolism // Cell Metab. 2010. Vol. 11, № 5. P. 364-378.

38. Yang M. et al. Factor-inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) catalyses the post-translational hydroxylation of histidinyl residues within ankyrin repeat domains // The FEBS journal. 2011. Vol. 278. 1086-1097 p.

39. Bracken C.P. et al. Cell-specific Regulation of Hypoxia-inducible Factor (HIF)-1a and HIF-2a Stabilization and Transactivation in a Graded Oxygen Environment // J. Biol. Chem. . 2006. Vol. 281, № 32. P. 22575-22585.

40. Isaacs J.S. et al. Hsp90 Regulates a von Hippel Lindau-independent Hypoxia-inducible Factor-1a-degradative Pathway // J. Biol. Chem. . 2002. Vol. 277, № 33. P. 29936-29944.

41. Cheng J. et al. SUMO-specific Protease 1 is Essential for Stabilization of Hypoxia-inducible factor-1a During Hypoxia // Cell. 2007. Vol. 131, № 3. P. 584-595.

42. Tavassoli A., Hamilton A.D., Spring D.R. Small molecules in biology themed issue. 2011. № 8.

43. Loenarz C. et al. Expanding chemical biology of 2-oxoglutarate oxygenases. 2008. Vol. 4, № 3. P. 152-156.

44. Lamadema N. et al. Author ' s Accepted Manuscript by Oxygen Availability and Cellular Redox To appear in: Free Radical Biology and Medicine Dynamic Regulation of Epigenetic Demethylation by Oxygen Availability and Cellular Redox // Free Radic. Biol. Med. Elsevier B.V., 2018.

45. Martinez S., Hausinger R.P. Catalytic mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent oxygenases // J. Biol. Chem. 2015. Vol. 290, № 34. P. 20702-20711.

46. Lorsback R.B. et al. TET1, a member of a novel protein family, is fused to MLL in acute myeloid leukemia containing the t(10;11)(q22;23) [3] // Leukemia. 2003. Vol. 17, № 3. P. 637-641.

47. Nietfeld J.J., Kemp A. P r o p e r t i e s of p r o l y l 4 - h y d r o x y l a s e containing firmly-bound iron. 1980. Vol. 613. P. 349-358.

48. Kivirikko B.K.I. COLLAGEN HYDROXYLASES AND THE PROTEIN DISULFIDE ISOMERASE SUBUNIT OF PROLYL 4-HYDROXYLASES. 1998. Vol. 72.

49. Hirsilä M. et al. Characterization of the human prolyl 4-hydroxylases that modify the hypoxia-inducible factor // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 33. P. 3077230780.

50. Anta J.I.R.I.K. et al. Selective Inhibition of Hepatic Collagen Accumulation in Experimental Liver Fibrosis in Rats by a New Prolyl 4-Hydroxylase Inhibitor. 1998. P. 404-411.

51. Manresa M.C. et al. Hydroxylases regulate intestinal fibrosis through the suppression of ERK- mediated TGF- nl 1 signaling. 2016. P. 1076-1090.

52. Haruta M. et al. Generation of a large number of functional dendritic cells from human monocytes expanded by forced expression of cMYC plus BMI1 // Hum. Immunol. American Society for Histocompatibility and Immunogenetics, 2013.

53. Vasta J.D. et al. Selective Inhibition of Collagen Prolyl 4 - Hydroxylase in Human Cells. 2015. № I.

54. Woodcock C.L., Dimitrov S. Higher-order structure of chromatin and chromosomes. 2001. P. 130-135.

55. Jones P.A., Baylin S.B. Review The Epigenomics of Cancer. 2007. P. 683-692.

56. Bird A., Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory DNA methylation patterns and epigenetic memory. 2002. P. 6-21.

57. Hake S.B. et al. Expression Patterns and Post-translational Modifications Associated with Mammalian Histone H3 Variants * □. 2006. Vol. 281, № 1. P. 559-568.

58. Gardner K.E. et al. Identification of Lysine 37 of Histone H2B as a Novel Site of Methylation. 2011. Vol. 6, № 1.

59. Histones H. et al. Organismal Differences in Post-translational Modifications in. 2007.

60. Tan M. et al. Resource Identification of 67 Histone Marks and Histone Lysine Crotonylation as a New Type of Histone Modification // Cell. Elsevier Inc., 2011. Vol. 146, № 6. P. 1016-1028.

61. Islam S. et al. Oxygenases. 2018. № February. P. 1-36.

62. Tahiliani M. No Title. 2012. Vol. 930, № 2009.

63. He Y.F. et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA // Science (80-. ). 2011. Vol. 333, № 6047. P. 13031307.

64. Ito S. et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine // Science (80-. ). 2011. Vol. 333, № 6047. P. 1300-1303.

65. Bachman M. et al. 5-Formylcytosine can be a stable DNA modification in mammals. 2015. № june. P. 3-6.

66. Bachman M. et al. stable DNA modi fi cation // Nat. Chem. Nature Publishing Group, 2014. № September. P. 1-7.

67. An J., Rao A., Ko M. REVIEW TET family dioxygenases and DNA demethylation in stem cells and cancers // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2017. № December 2016.

68. Franchini D., Schmitz K. 5-Methylcytosine DNA Demethylation: More Than Losing a Methyl Group. 2012. № August. P. 417-439.

69. Pfaffeneder T. et al. in mouse embryonic stem cell DNA. 2014. № may.

70. Zheng Y. et al. A Systematic Review of Histone and Its Inhibitors. 2015. № 5. P.

1032-1071.

71. Kooistra S.M., Helin K. Molecular mechanisms and potential functions of histone demethylases // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2012. Vol. 13, № 5. P. 297-311.

72. Regulation G. et al. Chromatin and oxygen sensing in the context of JmjC histone demethylases. 2014. Vol. 395. P. 385-395.

73. Johansson C. The roles of Jumonji-type oxygenases in human disease. 2014. Vol. 6. P. 89-120.

74. Pedersen M.T., Helin K. Histone demethylases in development and disease // Trends Cell Biol. Elsevier Ltd, 2010. Vol. 20, № 11. P. 662-671.

75. Singleton R.S. et al. involved in translation control and stress granule formation. 2013. № 9.

76. Averous J. et al. The eIF2 a / ATF4 pathway is essential for stress-induced autophagy gene expression. 2013. Vol. 41, № 16. P. 7683-7699.

77. Anthony R.A., Liebman S.W. Alterations in Ribosomal Protein RPS28 can Diversely Affect Translational Accuracy in. 1995.

78. Thinnes C.C. et al. Selective Inhibitors of a Human Prolyl Hydroxylase (OGFOD1) Involved in Ribosomal Decoding // Chem. - A Eur. J. 2019. Vol. 25, № 8. P. 2019-2024.

79. Strowitzki, Cummins, Taylor. Protein Hydroxylation by Hypoxia-Inducible Factor (HIF) Hydroxylases: Unique or Ubiquitous? // Cells. 2019. Vol. 8, № 5. P. 384.

80. Cummins E.P., Keogh C.E. Respiratory gases and the regulation of transcription. 2016. Vol. 8. P. 986-1002.

81. Cummins E.P., Taylor ^.C.T. Hypoxia-responsive transcription factors. 2005. P. 363-371.

82. Taylor C.T., Cummins E.P. The Role of NF- kB in Hypoxia-Induced Gene Expression. 2009. Vol. 184. P. 178-184.

83. Koong A.C. et al. Advances in Brief Hypoxic Activation of Nuclear Factor-icB Is Mediated by a Ras and Raf Signaling Pathway and Does Not Involve MAP Kinase ( ERK1 or ERK2 ) 1. 1994. P. 5273-5280.

84. Cummins E.P. et al. Prolyl hydroxylase-1 negatively regulates I □ B kinase- nl , giving insight into hypoxia-induced NF □ B activity. 2006. P. 1-6.

85. Schaible B. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications Prolyl hydroxylase-1 regulates hepatocyte apoptosis in an NF- k B- dependent manner. 2016. Vol. 1. P. 1-8.

86. Li T. et al. Tumor Suppression in the Absence of p53-Mediated Cell-Cycle Arrest , Apoptosis , and Senescence // Cell. Elsevier Inc., 2012. Vol. 149, № 6. P. 12691283.

87. Levine A.J. p53 , the Cellular Gatekeeper for Growth and Division. 1997. Vol. 88. P. 323-331.

88. Warboys C.M. et al. via a p53-Dependent Pathway. 2014. P. 985-995.

89. Proline H. et al. PHD3 Regulates p53 Protein Stability by Article PHD3 Regulates p53 Protein Stability by Hydroxylating Proline 359 // CellReports. ElsevierCompany. Vol. 24, № 5. P. 1316-1329.

90. Hammond E.M., Giaccia A.J. The role of p53 in hypoxia-induced apoptosis. 2005. Vol. 331. P. 718-725.

91. Graeber T.G. et al. Hypoxia Induces Accumulation of p53 Protein , but Activation of a G1-Phase Checkpoint by Low-Oxygen Conditions Is Independent of p53 Statust. 1994. Vol. 14, № 9. P. 6264-6277.

92. Chen B. et al. Hypoxia downregulates p53 but induces apoptosis and enhances expression of BAD in cultures of human syncytiotrophoblasts Hypoxia

downregulates p53 but induces apoptosis and enhances expression of BAD in cultures of human syncytiotrophoblasts. 2013. № September 2010.

93. Sermeus A. et al. Differential effect of hypoxia on etoposide-induced DNA damage response and p53 regulation in different cell types f. № May 2013. P. 131.

94. Deschoemaeker S. et al. PHD 1 regulates p 53 -mediated colorectal cancer chemoresistance. 2015. Vol. 7, № 10. P. 1350-1365.

95. Ullah K. et al. Hypoxia-inducible factor prolyl- 4-hydroxylase-1 is a convergent point in the reciprocal negative regulation of NF- k B and p53 signaling pathways. 2017. № October 2016. P. 1-18.

96. Zheng X. et al. interaction with the USP9x deubiquitinase Prolyl hydroxylation by EglN2 destabilizes FOXO3a by blocking its interaction with the USP9x deubiquitinase. 2014. P. 1429-1444.

97. Schmidt M. et al. Cell Cycle Inhibition by FoxO Forkhead Transcription Factors Involves Downregulation of Cyclin D. 2002. Vol. 22, № 22. P. 7842-7852.

98. Hubbi M.E. et al. Supplementary Materials for A Nontranscriptional Role for HIF-1 a as a Direct Inhibitor of DNA Replication. 2013.

99. Louise W. et al. HIF prolyl hydroxylase inhibition augments dopamine release in the rat brain in vivo // J. Neurosci. Res. Wiley-Blackwell, 2009. Vol. 87, № 7. P. 1686-1694.

100. Culver C. et al. Mechanism of Hypoxia-Induced NF- □ B □ f. 2010. Vol. 30, № 20. P. 4901-4921.

101. Avidor-reiss T., Gopalakrishnan J. Building a centriole // Curr. Opin. Cell Biol. Elsevier Ltd, 2013. Vol. 25, № 1. P. 72-77.

102. Nigg E.A., Stearns T. The centrosome cycle : Centriole biogenesis , duplication and inherent asymmetries // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2011. Vol.

13, № 10. P. 1154-1160.

103. Moser S.C. et al. Article PHD1 Links Cell-Cycle Progression to Oxygen Sensing through Hydroxylation of the Centrosomal Protein Cep192 // Dev. Cell. The Authors, 2013. Vol. 26, № 4. P. 381-392.

104. Zhu F. et al. Report The Mammalian SPD-2 Ortholog Cep192 Regulates Centrosome Biogenesis. 2008. P. 136-141.

105. Yue X. et al. Zinc Fingers and Homeoboxes 2 Inhibits Hepatocellular Carcinoma Cell Proliferation and Represses Expression of Cyclins A and E BASIC AND. 2012. P. 1559-1570.

106. Nagel S. et al. Transcriptional deregulation of homeobox gene ZHX2 in Hodgkin lymphoma // Leuk. Res. Elsevier Ltd, 2012. Vol. 36, № 5. P. 646-655.

107. Fan J. et al. VHL substrate transcription factor ZHX2 as an oncogenic driver in clear cell renal cell carcinoma. 2018. Vol. 295, № July. P. 290-295.

108. Siddiq A., Aminova ^.L.R. Hypoxia Inducible Factor Prolyl 4-Hydroxylase Enzymes: Center Stage in the Battle Against Hypoxia , Metabolic Compromise and Oxidative Stress. 2007. P. 931-946.

109. Gallagher E. et al. The PHD motif of Map3k1 activates cytokine- dependent MAPK signaling The PHD motif of Map3k1 activates cytokine-dependent MAPK signaling. 2016. Vol. 3556, № August. P. 1-3.

110. Press D. Prolyl hydroxylase domain enzymes: important regulators of cancer metabolism. 2014. P. 127-142.

111. Luo W. et al. Pyruvate Kinase M2 Is a PHD3-Stimulated Coactivator for Hypoxia-Inducible Factor 1 // Cell. Elsevier Inc., 2011. Vol. 145, № 5. P. 732744.

112. Floyd Z.E. et al. Effects of Prolyl Hydroxylase Inhibitors on Adipogenesis and Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha Levels Under Normoxic Conditions. 2007. Vol.

1557. P. 1545-1557.

113. Ko J. et al. Oxygen-dependent ATF-4 stability is mediated by the PHD3 oxygen sensor. 2016. Vol. 110, № 10. P. 3610-3618.

114. Haase V.H. HIF-prolyl hydroxylases as therapeutic targets in erythropoiesis and iron metabolism. 2017. P. 110-124.

115. Welden S. Van, Selfridge A.C., Hindryckx P. Intestinal hypoxia and hypoxia-induced signalling as therapeutic targets for IBD // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 14, № 10. P. 596-611.

116. Guo C. et al. Deferoxamine-mediated up-regulation of HIF-1a prevents dopaminergic neuronal death via the activation of MAPK family proteins in MPTP-treated mice // Experimental Neurology. 2016. Vol. 280. 13-23 p.

117. Tan T. et al. HYPOXIA-INDUCIBLE FACTOR-1 IMPROVES THE ACTIONS OF POSITIVE INOTROPIC AGENTS IN STUNNED CARDIAC MYOCYTES. 2009. № 85. P. 904-911.

118. Rabinowitz M.H. et al. Chapter 8 - Inhibitors of HIF Prolyl Hydroxylases // Annual Reports In Medicinal Chemistry - Volume 45. Elsevier Inc., 2010. Vol. 45, № 10. 123-139 p.

119. Osipyants A.I. et al. Biochimie L-ascorbic acid: A true substrate for HIF prolyl hydroxylase ? // Biochimie. Elsevier B.V, 2018. Vol. 147. P. 46-54.

120. Linden T. et al. The antimycotic ciclopirox olamine induces HIF-1 a stability, VEGF expression, and angiogenesis. 2003. № 4.

121. Jaakkola P. et al. Targeting of HIF-a to the von Hippel-Lindau Ubiquitylation Complex by O2-Regulated Prolyl Hydroxylation // Science (80-. ). American Association for the Advancement of Science, 2001. Vol. 292, № 5516. P. 468472.

122. Baader E. et al. Inhibition of prolyl 4-hydroxylase by oxalyl amino acid

derivatives in vitro, in isolated microsomes and in embryonic chicken tissues // Biochem. J. 1994. Vol. 300, № 2. P. 525-530.

123. Yu X. et al. Journal of Molecular and Cellular Cardiology Mechanism of TNF- a autocrine effects in hypoxic cardiomyocytes : Initiated by hypoxia inducible factor 1 a , presented by exosomes. 2012. Vol. 53. P. 848-857.

124. Hamada S. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters Synthesis and activity of N -oxalylglycine and its derivatives as Jumonji C-domain-containing histone lysine demethylase inhibitors // Bioorg. Med. Chem. Lett. Elsevier Ltd, 2009. Vol. 19, № 10. P. 2852-2855.

125. Yan H. et al. Activation of the prolyl-hydroxylase oxygen-sensing signal cascade leads to AMPK activation in cardiomyocytes. 2012. Vol. 16, № 9. P. 2049-2059.

126. Winder W.W. et al. Activation of AMP-activated protein kinase increases mitochondrial enzymes in skeletal muscle. 2018. № 28. P. 2219-2226.

127. Reznick R.M., Shulman G.I. The role of AMP-activated protein kinase in mitochondrial biogenesis. 2006. Vol. 1. P. 33-39.

128. Zhdanov A. V et al. Biochimica et Biophysica Acta A novel effect of DMOG on cell metabolism : direct inhibition of mitochondrial function precedes HIF target gene expression // BBA - Bioenerg. Elsevier B.V., 2015. Vol. 1847, № 10. P. 1254-1266.

129. Provenzano R. et al. Article Oral Hypoxia - Inducible Factor Prolyl Hydroxylase Inhibitor Roxadustat ( FG-4592 ) for the Treatment of Anemia in Patients with CKD. 2016. P. 1-10.

130. Wu K. et al. Stabilization of HIF-1 a by FG-4592 promotes functional recovery and neural protection in experimental spinal cord injury // Brain Res. Elsevier, 2016. Vol. 1632, № 109. P. 19-26.

131. Li X. et al. Therapeutic Potential of a Prolyl Hydroxylase Inhibitor FG-4592 for

Parkinson's Diseases in Vitro and in Vivo: Regulation of Redox Biology and Mitochondrial Function // Front. Aging Neurosci. Frontiers Media S.A., 2018. Vol. 10. P. 121.

132. Liu B. et al. new england journal. 2019. P. 1001-1010.

133. Chang W. et al. Evidence for the Capability of Roxadustat ( FG-4592 ), an Oral HIF Prolyl-Hydroxylase Inhibitor , to Perturb Membrane Ionic Currents: An Unidentified yet Important Action.

134. Song Y. et al. 8-Hydroxyquinoline: a privileged structure with a broad-ranging pharmacological potential // Med. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry, 2015. Vol. 6, № 1. P. 61-74.

135. Zheng H. et al. Design, synthesis, and evaluation of novel bifunctional iron-chelators as potential agents for neuroprotection in Alzheimer's, Parkinson's, and other neurodegenerative diseases // Bioorg. Med. Chem. 2005. Vol. 13, № 3. P. 773-783.

136. H. Y.M.B., GALIA S., BEN S.D. Ironing Iron Out in Parkinson's Disease and Other Neurodegenerative Diseases with Iron Chelators: A Lesson from 6-Hydroxydopamine and Iron Chelators, Desferal and VK-28 // Ann. N. Y. Acad. Sci. Wiley/Blackwell (10.1111), 2006. Vol. 1012, № 1. P. 306-325.

137. Crouch P.J., Barnham K.J. Therapeutic Redistribution of Metal Ions To Treat Alzheimer's Disease // Acc. Chem. Res. American Chemical Society, 2012. Vol. 45, № 9. P. 1604-1611.

138. Zhong C. et al. Synthesis and biological evaluation of novel neuroprotective agents for paraquat-induced apoptosis in human neuronal SH-SY5Y cells // Eur. J. Med. Chem. 2013. Vol. 62. P. 187-198.

139. Smirnova N.A. et al. Utilization of an in vivo reporter for high throughput identification of branched small molecule regulators of hypoxic adaptation. // Chem. Biol. 2010. Vol. 17, № 4. P. 380-391.

140. Warshakoon N.C. et al. Design and synthesis of a series of novel pyrazolopyridines as HIF 1-a prolyl hydroxylase inhibitors // Bioorganic Med. Chem. Lett. 2006. Vol. 16, № 21. P. 5687-5690.

141. Gaisina I.N. et al. Antihypoxic activity of adaptaquin enantiomers // Russ. Chem. Bull. 2018. Vol. 67, № 12. P. 2320-2322.

142. Thorne N., Inglese J., Auld D.S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology // Chem. Biol. 2010. Vol. 17, № 6. P. 646-657.

143. Sanghavi S.K. et al. Clinical Evaluation of Multiplex Real-Time PCR Panels for Rapid Detection of Respiratory Viral Infections. 2012. Vol. 169, № June 2011. P. 162-169.

144. Weitzel T. et al. Enteric multiplex PCR panels: A new diagnostic tool for amebic liver abscess? // New Microbes New Infect. Elsevier Ltd, 2017.

145. Sjöling Â. et al. Detection of major diarrheagenic bacterial pathogens by multiplex // Microbiol. Res. Elsevier GmbH., 2014.

146. Kenan î. et al. The combination of thymoquinone and paclitaxel shows anti-tumor activity through the interplay with apoptosis network in triple-negative breast cancer. 2015.

147. Barbosa D. et al. In vitro models for neurotoxicology research // Toxicology Research. 2015.

148. Barbosa D.J. et al. In vitro models for neurotoxicology research // Toxicol. Res. 2015. Vol. 4, № 4. P. 801-842.

149. Lopes F.M. et al. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies // Brain Res. 2010. Vol. 1337. P. 85-94.

150. Dwane S., Durack E., Kiely P.A. Optimising parameters for the differentiation of

SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration // BMC Res. Notes. BioMed Central, 2013. Vol. 6. P. 366.

151. Marcusson J., Hallbeck M., Agholme L. An In Vitro Model for Neuroscience: Differentiation of SH-SY5Y Cells into Cells with Morphological and Biochemical Characteristics of Mature Neurons. 2010. Vol. 20. P. 1069-1082.

152. Innala M. et al. 3D Culturing and differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells on bacterial nanocellulose scaffolds // Artif. Cells, Nanomedicine, Biotechnol. Taylor & Francis, 2014. Vol. 42, № 5. P. 302-308.

153. Ladiwala U., Basu H., Mathur D. Assembling Neurospheres : Dynamics of Neural Progenitor / Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap Assembling Neurospheres: Dynamics of Neural Progenitor / Stem Cell Aggregation Probed Using an Optical Trap. 2012. № June.

154. Bez A. et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. 2003. Vol. 993. P. 18-29.

155. Reynolds B.A., Weiss S. Clonal and Population Analyses Demonstrate That an EGF-Responsive Mammalian Embryonic CNS Precursor Is a Stem Cell. 1996. Vol. 13, № 0090. P. 1-13.

156. Jensen J.B., Parmar M. Strengths and Limitations of the Neurosphere Culture System. 2006. Vol. 34, № 3. P. 153-161.

157. Moors M. et al. Human Neurospheres as Three-Dimensional Cellular Systems for Developmental Neurotoxicity Testing // Environ. Health Perspect. National Institute of Environmental Health Sciences, 2009. Vol. 117, № 7. P. 1131-1138.

158. Mouhieddine T.H. et al. Metformin and ara-a effectively suppress brain cancer by targeting cancer stem/progenitor cells // Front. Neurosci. 2015. Vol. 9, № NOV.

159. Garaizar J., Rementeria A., Porwollik S. MINIREVIEW DNA microarray technology: a new tool for the epidemiological typing of bacterial pathogens ?

2006.

160. Bednar M. DNA microarray technology and application. 2000. Vol. 6, № 4. P. 796-800.

161. Haas B.J., Zody M.C. news and views Advancing RNA-Seq analysis // Nat. Publ. Gr. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 28, № 5. P. 421-423.

162. Rao X. et al. An improvement of the 2~(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. // Biostat. Bioinforma. Biomath. 2013. Vol. 3, № 3. P. 71-85.

163. Gelder R.N.V.A.N. et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. 1990. Vol. 87, № March. P. 1663-1667.

164. Formento J.L. et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for pharmacological studies targeting hypoxia-inducible factor 1a // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. Vol. 12, № 5. P. 660-664.

165. Hendil K.B., Hartmann-Petersen R., Tanaka K. 26 S proteasomes function as stable entities 1 1Edited by R. Huber // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 315, № 4. P. 627636.

166. Volpe P., Eremenko-Volpe T. Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures. // Eur. J. Biochem. 1970. Vol. 12, № 1. P. 195-200.

167. Zhao L. et al. Intracellular water-specific MR of microbead-adherent cells: the HeLa cell intracellular water exchange lifetime // NMR Biomed. 2008. Vol. 21, № 2. P. 159-164.

168. Ede C. et al. Quantitative Analyses of Core Promoters Enable Precise Engineering of Regulated Gene Expression in Mammalian Cells // ACS Synth. Biol. 2016. Vol. 5, № 5. P. 395-404.

169. Article E. et al. Chemical Science Molecular and cellular mechanisms of HIF prolyl hydroxylase inhibitors in clinical trials f. 2017. P. 7651-7668.

170. Semenza G.L. et al. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1 // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, № 38. P. 23757-23763.

171. Ratcliffe P.J. HIF-1 and HIF-2 : working alone or together in hypoxia? Find the latest version: HIF-1 and HIF-2 : working alone or together in hypoxia ? // J. Clin. Invest. 2007. Vol. 117, № 4. P. 862-865.

172. Hu C. et al. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1 alpha ( HIF-1 alpha ) and HIF-2 alpha in Hypoxi1. Hu C, Wang L, Chodosh L a, Keith B, Simon MC. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1 alpha ( HIF-1 alpha ) and HIF-2 alpha in Hypoxic Gene Regulat // Mol Cell Biol. 2003. Vol. 23, № 24. P. 93619374.

173. Obach M. et al. 6-Phosphofructo-2-kinase (pfkfb3) gene promoter contains hypoxia-inducible factor-1 binding sites necessary for transactivation in response to hypoxia // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 51. P. 53562-53570.

174. Masoud G.N., Li W. HIF-1 a pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy // Acta Pharm. Sin. B. Elsevier, 2015. Vol. 5, № 5. P. 378-389.

175. Ngo J.K., Pomatto L.C.D., Davies K.J.A. Upregulation of the mitochondrial Lon Protease allows adaptation to acute oxidative stress but dysregulation is associated with chronic stress, disease, and aging$ // Redox Biol. Elsevier, 2013. Vol. 1, № 1. P. 258-264.

176. Rankin E.B. et al. Regulates Hepatic Erythropoietin in Vivo // J. Clin. Invest. 2007. Vol. 117, № 4. P. 1068-1077.

177. Pollard P.J. et al. Expression of HIF-1a, HIF-2a (EPAS1), and their target genes in paraganglioma and pheochromocytoma with VHL and SDH mutations // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2006. Vol. 91, № 11. P. 4593-4598.

178. Li N. et al. Knockdown of hypoxia inducible factor-2a inhibits cell invasion via the downregulation of MMP-2 expression in breast cancer cells // Oncol. Lett.

2016. Vol. 11, № 6. P. 3743-3748.

179. Yamano N. et al. A long-term high-fat diet changes iron distribution in the body, increasing iron accumulation specifically in the mouse spleen // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2015. Vol. 61, № 1. P. 20-27.

180. Masson N. et al. Conserved N-terminal cysteine dioxygenases transduce responses to hypoxia in animals and plants // Science (80-. ). 2019. Vol. 364, № 6448. P. 6569.

181. Peer-reviewed N.O.T. 1 * 1. 2018. № March. P. 1-34.

182. Rossi D. et al. Alteration of BIRC3 and multiple other NF-kB pathway genes in splenic marginal zone lymphoma // Blood. 2011. Vol. 118, № 18. P. 4930-4934.

183. Gimm T. et al. Hypoxia-inducible protein 2 is a novel lipid droplet protein and a specific target gene of hypoxia-inducible factor-1 // FASEB J. 2010. Vol. 24, № 11. p. 4443-4458.