Модуляция экспрессии гена HIF-2α в плюрипотентных стволовых клетках человека с использованием системы CRISPR/Cas9 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Живень Мария Константиновна

• Живень Мария Константиновна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Живень Мария Константиновна

Актуальность

Цель, задачи работы

Научная новизна. Теоретическая и практическая ценность. Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту. Вклад автора. Степень достоверности и апробация результатов исследования

Апробация работы

Объем и структура диссертации

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Роль гипоксии и HIFs в процессах ангиогенеза

1.2 Структура HIFs

1.3 Механизмы регуляции активности HIF

1.3.1 Механизм кислород-зависимого регулирования активности HIF A

1.3.2 Кислород-независимый путь регуляции HIF

1.3.2.1 Роль HAF в HIF1A деградации

1.3.2.2 SUMO (малый убиквитин-подобный модификатор)

1.3.2.3 EIF3E - ключевой регулятор экспрессии HIF2A

1.3.2.4 Роль фактора инициации трансляции EIF3 в жизнедеятельности клеток многоклеточных организмов

1.3.2.5 Активация транскрипции HIF1A с помощью гистондеацетилазы

1.4 Гены-мишени, транскрипционно активируемые HIFs

1.5 Роль HIFs в регуляции генов плюрипотентности и генов-мишеней основных физиологических процессов в эмбриональных стволовых клетках

1.6 Патофизиологическая роль фактора, индуцируемого гипоксией, в ангиогенезе и ремоделировании сосудов. Способы терапевтической регуляции Н^

1.6.1 Клиническое применение активаторов и ингибиторов HIFs

1.6.1.1 PHD-ингибиторы

1.6.1.2 Аденовирусная активация HIF1A

1.6.1.3 Ингибирование HIF1A

1.6.1.4 Специфическая регуляция активности HIF2A с помощью нокаута

EIF3E

1.7 Применение системы CRISPR/Cas9 для изучения механизмов функционирования сигнального пути HIF in vitro

1.8 Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в мезодермальном и эндотелиальном направлении

1.9 Заключение к обзору литературы

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

2.2 Состав культуральных сред и условия культивирования

2.3.1 Разморозка ЭФМ

2.3.2 Пассирование ЭСК

2.3.3 Культивирование ЭСК в гипоксических и псевдогипоксических условиях

2.3.4 Замораживание ЭСК

2.3.5 Размораживание ЭСК

2.3.6 Дифференцировка ЭСК в мезодермальном и эндотелиальном направлении

2.3.7 Сортировка с помощью магнитных частиц MicroBeads (Miltenyi Biotec), конъюгированных с антителами к CD31

2.4 Методы количественной оценки жизнеспособности и характеристики клеточных популяций

2.4.1 Подсчет клеток с помощью проточной цитометрии

2.4.2 Оценка пролиферации клеток с помощью XTT-анализа

2.4.3 Оценка ангиогенного потенциала с помощью теста

в матригеле in vitro

2.5 Методы получения генетически модифицированных линий ПСК, экспрессирующих HIF2A

2.5.1 Дизайн последовательностей направляющих РНК

2.5.2 Клонирование направляющих РНК в вектор

2.5.3 Получение химически компетентных клеток E. coli штамма Stbl3

2.5.4 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.5.5 Секвенирование плазмидной ДНК

2.5.6 Доставка векторов с помощью нуклеофекции в ЭСК человека

2.5.7 Сортинг и количественная оценка GFP-позитивных клеток

2.5.8 Экспресс-метод выделения ДНК для первичного скрининга субклонов

2.5.9 Выделение геномной ДНК и РНК

2.6 Методы характеристики ЭСК человека с делецией EIF3E

2.6.1 Подбор праймеров для первичного скрининга субклонов. Первичный скрининг субклонов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием

2.6.2 Выделение ДНК из агарозного геля для секвенирования

2.6.3 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток антителами на основные маркеры плюрипотентности

2.6.4 Оценка экспрессии генов методом количественной ПЦР в режиме реального времени

2.7 Оценка экспрессии HIF с помощью цифровой ПЦР в каплях

2.8 Методы определения наличия белка EIF3E в исследуемых клеточных линиях ЭСК человека

2.8.1 Приготовление клеточных лизатов для Вестерн-блот-анализа

2.8.2 Измерение концентрации белка в клеточных лизатах исследуемых линий

2.8.3 Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.8.4 Анализ результатов Вестерн-блот-гибридизации

2.9 Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты

3.1 Получение генетически модифицированных линий ЭСК, экспрессирующих ИШ2Л

3.2 Разработка системы детекции делеции в полученных субклонах ЭСК

3.2.1 Подбор праймеров для первичного скрининга субклонов. Первичный скрининг субклонов с помощью ПЦР с последующим секвенированием

3.3 Кариотипирование полученных субклонов линий HuES9 и ESM04 с делецией участка гена ЕШ3Е

3.4 Характеристика плюрипотентности в субклонах линий HuES9 и ESM04 с делецией ЕШ3Е

3.5 Оценка пролиферации и жизнеспособности исследуемых ЭСК человека методами ХТТ-анализа и FACS с использованием йодида пропидия и аннексина V

3.6 Выбор подходящих референсных генов для цифровой ПЦР в каплях и оптимизация условий проведения реакции

3.7 Оценка уровня экспрессии генов ЕШ3Е, ШПЛ и ИШ2Л в полученных генетически модифицированных линиях ЭСК человека

3.8 Определение количества белка гена ЕШ3Е в исследуемых линиях HuES9 и ESM04

3.9 Характеристика экспрессии генов, связанных с гликолизом и окислительными процессами в митохондриях, в исследуемых линиях ЭСК человека

3.10 Получение и характеристика эндотелиальных производных исследуемых линий и генетически модифицированных линий ЭСК со сверхэкспрессией

ИШ2Л

3.11 Оценка экспрессии проангиогенных факторов в эндотелиальных производных ЭСК человека

3.12 Оценка функциональных свойств полученных эндотелиальных производных ЭСК человека

Обсуждение

Заключение

Выводы

Библиографический список

105

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДМСО - диметилсульфоксид

(И)ПСК - (индуцированные) плюрипотентные стволовые клетки

ПЦР - полимеразная цепная реакция

цПЦР - цифровая ПЦР в каплях

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭК - эндотелиальные клетки

ЭСК - эмбриональные стволовые клетки

ЭФМ - эмбриональные фибробласты мыши

ANGPT1 - ангиопоэтин 1 (angiopoietin 1)

ANGPT2 - ангиопоэтин 2 (angiopoietin 2)

bFGF - основной фактор роста фибробластов (basic fibroblast growth factor) bHLH - основная структура спираль-петля-спираль (basic helix-loop-helix)

BSA - бычий сывороточный альбумин (Bovine Serum Albumin)

СD31 - кластер дифференцировки 31 (cluster of differentiation 31)

СD34 - кластер дифференцировки 34 (cluster of differentiation 34)

C-TAD - С-концевой трансактивационный домен (С-terminal transactivation

domain)

DMOG - диметилоксалилглицин (Dimethyloxalylglycine)

EIF3E - эукариотический фактор инициации трансляции 3e (eukaryotic translation initiation factor 3 subunit e), синоним - INT6

FIH - фактор, ингибирующий HIF (factor inhibiting HIF)

HAF - гипоксия-ассоциированный фактор (hypoxia-associated factor)

HIF - фактор, индуцируемый гипоксией (hypoxia inducible factor) HREs -- гипоксия-реагирующие элементы (hypoxia responsс e elements)

IBS - сайт связывания EIF3E (INT6 binding site)

N-TAD - N-концевой трансактивационный домен (N-terminal transactivation domain)

ODD - домен, отвечающий за кислород-зависимую деградацию (oxygen-dependent degradation domain)

PAS - белковый домен, имеющий в своем составе три аминокислотные последовательности: Per, ARNT, Sim (period circadian protein, aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein, single-minded protein)

PBS - натрий-фосфатный буфер (phosphate buffered saline) PDGFB - тромбоцитарный фактор роста B (platelet-derived growth factor B) PHD - пролилгидроксилазный домен (prolyl-hydroxylase domain); ферменты пролилгидроксилазы (prolyl hydroxylase domain enzymes)

PlGF - фактор роста плаценты (placental growth factor)

pVHL - белок фон Гиппеля-Линдау (von Hippel-Lindau protein)

RIPA - буфер для радиоиммунопреципитационного анализа (radioimmunoprecipitation assay buffer)

SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)

shRNA - малые шпилечные РНК (small hairpin RNA)

SUMO - малый убиквитин-связанный модификатор (small ubiquitin-related modifier)

VEGFA - фактор роста эндотелия сосудов А (Vascular endothelial growth factor A)

VEGFR2 - рецептор 2 типа фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor receptor 2)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модуляция экспрессии гена HIF-2α в плюрипотентных стволовых клетках человека с использованием системы CRISPR/Cas9»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В процессе развития у многоклеточных организмов сформировались системы регуляции гомеостатического баланса кислорода в тканях. В результате возникли комплексы, реагирующие на гипоксические условия (пониженную концентрацию кислорода в клетках и тканях: от 1 до 5 %) (Semenza et al., 2003). Факторы, индуцируемые гипоксией (HIFs), являются ключевыми регуляторами клеточного ответа на гипоксическое воздействие у млекопитающих, которые способствуют активации ряда транскрипционных факторов, играя важную роль в управлении механизмами гликолиза, ангиогенеза, эритропоэза, поддержания сосудистого тонуса и клеточной выживаемости (Prabhakar and Semenza, 2012). По своей структуре HIFs - гетеродимеры, образованные двумя кислород-регулируемыми субъединицами HIF1A и HIF2A и конститутивно экспрессирующейся субъединицей HIF-ip (Hashimoto and Shibasaki, 2015). Стабильность HIFs регулируется кислород-зависимым и кислород-независимым путями (Hashimoto and Shibasaki, 2015). На данный момент существуют несколько направлений клинических исследований, связанных с изучением роли HIF-сигнального пути в патологических процессах. Было показано, что в клетках опухолей большинства типов рака человека детектируется повышенный уровень экспрессии HIFs (Talks et al., 2000), а также их генов-мишеней, вовлеченных в регуляцию механизмов ангиогенеза, метаболизма глюкозы, инвазию и метастазирование (Semenza et al., 2003; Mazurier, Pages et al., 2012). Таким образом, ключевой задачей в терапии при онкологических заболеваниях является снижение уровня экспрессии HIFs для ингибирования избыточного ангиогенеза в тканях опухолей. Методы терапевтической модуляции HIF-сигнального пути для лечения сердечнососудистых заболеваний являются еще одним направлением исследований на

сегодняшний день. Ключевая цель данной стратегии состоит в активации HIFs, а также факторов роста, вовлеченных в процессы ангиогенеза для эффективного лечения ишемических заболеваний (Hashimoto and Shibasaki, 2015).

В данной работе в качестве перспективного способа терапевтического ангиогенеза рассматривается активация HIF2A с помощью сайленсинга его ингибитора EIF3E в нормоксических условиях в эмбриональных стволовых клетках человека (ЭСК). Снижение уровня экспрессии EIF3E замедляет деградацию HIF2A и стабилизирует его в ядрах, что приводит к индукции экспрессии ряда генов, задействованных в механизмах пролиферации и поддержания плюрипотентных свойств ЭСК человека. Кроме того, определенный уровень сайленсинга EIF3E в эндотелиальных производных ЭСК способствует индукции процессов ангиогенеза в нормоксических условиях. Полученные эндотелиальные производные генетически модифицированных ЭСК найдут широкое применение в качестве модели для изучения механизмов HIF-сигнального пути, а также могут стать неограниченным источником эндотелиоцитов с повышенным регенеративным потенциалом для разработки методов терапевтического ангиогенеза.

Цель и задачи исследования. Получение генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток человека с повышенной экспрессией HIF2A и их дифференцированных эндотелиальных производных.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить генетически модифицированные линии ЭСК человека с нокаутом гена EIF3E (ингибитора HIF2A) посредством системы CRISPR/Cas9.

2. В полученных генетически модифицированных субклонах подтвердить сохранение плюрипотентных свойств, жизнеспособности и нормального кариотипа.

3. Проанализировать уровень экспрессии генов EIF3E, HIF1A и HIF2A в полученных генетически модифицированных линиях ЭСК.

4. Оценить экспрессию генов, связанных с гликолизом и окислительными процессами в митохондриях, в исследуемых линиях ЭСК человека.

5. Провести направленную дифференцировку ЭСК с делецией EIF3E в эндотелиальные клетки и охарактеризовать полученные клеточные популяции.

6. Оценить ангиогенные свойства полученных эндотелиальных производных в тесте in vitro.

Научная новизна работы. В данной работе впервые были получены генетически модифицированные линии ЭСК человека с CRISPR/Cas9-опосредованной делецией участка одного аллеля гена EIF3E - ингибитора HIF2A. В полученных субклонах подтверждена повышенная экспрессия гена HIF2A в нормоксических условиях. Впервые показано, что эндотелиальные производные ЭСК человека, стабильно экспрессирующие HIF2A, проявляют повышенную эффективность мезодермальной и эндотелиальной дифференцировки, а также обладают ангиогенным потенциалом в тестах in vitro.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования внесут вклад в понимание фундаментальных молекулярных механизмов HIF-зависимого ангиогенеза, расширят представления о сигнальных каскадах, вовлекаемых при активации HIFs. Кроме того, полученные данные необходимы для разработки эффективных стратегий модуляции экспрессии HIFs для терапевтического ангиогенеза и лечения ряда онкологических заболеваний.

Методология и методы исследования. Методологическую основу данного исследования составляют методы генетической инженерии, клеточной

биологии, статистики, а также анализа данных отечественной и зарубежной литературы. При выполнении исследования и оформлении материала были применены общенаучные методы: теоритический и методологический анализ источников литературы, экспериментальные методы исследования и сравнительный анализ полученных данных. Использованные методы и статистическая обработка экспериментального материала обеспечивают достоверность полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Супрессия активности гена EIF3E c помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 повышает уровень экспрессии гена HIF2A в эмбриональных стволовых клетках человека и их способность к мезодермальной и эндотелиальной дифференцировке.

2. Супрессия активности гена EIF3E в эмбриональных стволовых клетках человека повышает в эндотелиальных производных эффективность формирования трехмерных капилляроподобных структур на матригеле in vitro и экспрессию проангиогенных факторов ANG1, bFGF, VEGFR2, VEGF и CXCR4.

Вклад автора. Все основные этапы работы выполнены автором самостоятельно: получение ЭСК человека с делецией гена EIF3E с помощью системы CRISPR/Cas9, проведение анализа экспрессии целевых генов EIF3E, HIF2A, HIF1A в полученных субклонах ЭСК человека, проведение мезодермальной и эндотелиальной дифференцировки субклонов с повышенной экспрессией HIF2A и исходных линий HuES9 и ESM04. Осуществлена оценка морфологических и функциональных свойств полученных эндотелиальных производных. Анализ кариотипа субклонов H9 и Е12 выполнен в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» научно - исследовательском институте медицинской генетики

Медико-генетическом центре (Генетической клинике) врачом-цитогенетиком Тарховой Н.Б. Результаты Вестерн-блот анализа количества белка HIF2A предоставлены Ступниковой Аленой Сергеевной и Байрамовой Дарьей Олеговной.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Результаты диссертационного исследования получены современными методами исследования, которые соответствуют поставленным целям и задачам диссертации. Научные положения, выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены убедительными фактическими данными, представленные в таблицах и рисунках. Подготовка, статистический анализ и интерпретация результатов проведены с использованием современных методов обработки информации и статистического анализа.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на следующих научных мероприятиях:

1. Живень М.К., Захарова И.С., Смирнова А.М., Орищенко К.Е., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Модуляция экспрессии гена HIF-2a в плюрипотентных стволовых клетках человека с использованием системы CRISPR/Cas9 // VI Международная конференция молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов. Open Bio. 22-25 октября 2019г., Кольцово, Россия - 2019: Сборник тезисов С. 80-82.

2. Захарова И.С., Живень М.К, Ступникова А.С., Шевченко А.И., Закиян С.М. Разработка клеточных технологий для регенерации сосудов // Гены и клетки. 2019. Т. XIV. Приложение. Материалы IV Национального конгресса по регенеративной медицине. 20 - 23 Ноября 2019г., г. Москва, Россия. С. 9596.

3. Живень М.К., Захарова И.С., Смирнова А.М., Шевченко А.И., Орищенко К.Е., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. CRISPR/Cas9-опосредованное получение

генетически модифицированной линии плюрипотентных стволовых клеток человека, экспрессирующих HIF — фактор, индуцируемый гипоксией // Гены и клетки. Приложение, №2. Материалы Международного конгресса CRISPR 2018, 10-14 сентября 2018, Новосибирск. С. 30.

http://genescells.ru/article/materialyi-mezhdunarodnogo-kongressa-crispr-2018/

4. Захарова И.С., Живень М.К., Смирнова А.М., Шевченко А.И., Орищенко К.Е., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Модуляция HIF (фактора, индуцируемого гипоксией) как перспективный подход к повышению регенеративного потенциала эндотелиальных клеток // Сборник научных трудов v международной конференции "Постгеном'2018 Казань, 29 октября - 2 ноября 2018 C. 112.

ISBN 978-5-0013-065-6

5. Smirnova A.M., Zakharova I.S., Zhiven' M.K., Shevchenko A.I., Grigor'eva E. V., Elisafenko E.A., Zakian S.M. The obtaining of CRISPR/Cas 9-modified human pluripotent stem cell lines with upregulated Hypoxia Inducible Factor: a contribution to pluripotency and angiogenesis // Ontogenez 2018, V.49, №4S, p.45-46.

http://www.postgenome.org/files/uploaded/Postgenome_Abstracts_Volume151120 18.pdf

ISSN 0475-1450

6. Захарова И.С., Смирнова А.М., Живень М.К., Шевченко А.И., Григорьева Е.В., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Получение генетически-модифицированной линии плюрипотентных стволовых клеток человека, экспрессирующей HIF-фактор, индуцируемый гипоксией // Гены и клетки, 2017, Том XII, No 3 (Материалы III Национального Конгресса по Регенеративной Медицине), стр. 97-98.

eLIBRARY ID: 37096418

7. Smirnova A., Zakharova I., Jiven M., Shevchenko A., Zakian S. The studying of activation effects of HIF transcription factor in human pluripotent stem cells on the potential of endothelial angiogenic derivatives // IX international congress «Biotechnology: state of the art and perspectives». 20-22 February 2017. Moscow. P. 541.

8. Смирнова А.М., Живень М.К., Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Исследование эффектов активации фактора, индуцируемого гипоксией, на ангиогенный потенциал эндотелиальных производных плюрипотентных стволовых клеток человека // БЕЛЯЕВСКИЕ ЧТЕНИЯ Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АН СССР Д.К. Беляева. 2017. 7-10 августа 2017 г., Новосибирск, Россия, C.108.

eLIBRARY ID: 30046186

9. Smirnova A., Zakharova I., Zhiven M., Shevchenko A., Elisaphenko E., Zakian S. The study of activation effects of HIF transcription factor on the potential of endothelial angiogenic derivatives in human pluripotent stem cells // 25th Wilhelm Bernhard Workshop on the Cell Nucleus. Programme&Abstract book. 1922 June 2017. Nizhny Novgorod. P. 45.

По теме диссертации опубликованы работы:

Статьи в рецензируемых научных журналах

1. Живень М.К., Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Орищенко К.Е., Закиян С.М. Получение и характеристика эмбриональных стволовых клеток человека с повышенной экспрессией HIF2A // Гены & Клетки. - 2020. - Т. 14. - №1. - C. 29-35.

2. Zakharova I.S., Zhiven' M.K., Saaya S.B., Shevchenko A.I., Smirnova A.M., Strunov A., Karpenko A.A., Pokushalov E.A., Ivanova L.N., Makarevich P.I.,

Parfyonova Y.V., Aboian E., Zakian SM. Endothelial and smooth muscle cells derived from human cardiac explants demonstrate angiogenic potential and suitable for design of cell-containing vascular grafts // Journal of Translational Medicine. -2017. - V. 15. - № 1. - e 54.

3. Живень М.К., Захарова И.С., Шевченко А.И., Покушалов Е.А., Закиян С.М. Гетерогенность клеток эндотелия // Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2015. - Т. 19. - № 4-2. - С. 104-112.

Главы в монографии

1. Живень М. К., Захарова И. С., Смирнова А. М., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Получение делеции EIF3E/EIF3E в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 / глава ЗЗ в монографии "Редактирование генов и геномов", том З, издательство Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск. - 2018. - С. 145-161. eLIBRARY ID: 36278366 ISBN: 978-5-7692-1581-0

2. Живень М. К., Захарова И. С., Смирнова А. М., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Получение делеции ШТ6/ЕШЗЕ в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 / глава 19 в монографии "Методы редактирования генов и геномов", издательство Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск. - 2020. - С. З6З-377

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа представлена на 127 страницах и состоит из введения и четырех глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, оглавления, списка сокращений и библиографического списка из 1 70 источников. Работа проиллюстрирована 29 рисунками и содержит 11 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При длительном воздействии пониженного уровня кислорода (менее 20%) клетки выживают благодаря транскрипционной активности ряда генов, которые вовлечены в процессы ангиогенеза, метаболизма глюкозы и пролиферации клеток. В основном, клеточные ответы на гипоксические условия регулируются кислород-чувствительными факторами, обозначенными как факторы, индуцируемые гипоксией (HIFs). Субъединицы HIF1A и HIF2A постоянно экспрессируются в клетках и деградируют при нормоксических условиях, но стабилизируются в условиях гипоксии. Кроме того, было выяснено, что HIFs являются главными регуляторами ангиогенеза вне зависимости от того, является ли этот процесс физиологическим или патологическим. При этом HIFs участвуют в формировании сосудов кровеносной системы совместно с проангиогенными факторами роста, такими как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), PlGF (фактор роста плаценты) или ангиопоэтины. Принимая во внимание важную роль HIFs в процессах ангиогенеза и васкулогенеза, их можно рассматривать как многообещающую мишень для лечения онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний.

1.1 Роль гипоксии и HIFs в процессах ангиогенеза

Сердечно-сосудистая система закладывается на ранних этапах эмбрионального развития млекопитающих (Zimna and Kurpisz, 2015). На данный момент существуют две концепции механизмов формирования сосудистой сети in vivo: васкулогенез и ангиогенез (Carmeliet, 2000). Васкулогенез характеризует процесс образования кровеносных сосудов de novo: миграция недифференцированных эндотелиальных клеток-предшественников с последующей сборкой в капилляры in situ, что впоследствии способствует образованию первичной сосудистой сети (Novosel et al., 2011). Процесс ангиогенеза заключается в развитии капилляров из

существующих кровеносных сосудов в период эмбрионального развития, роста опухолей и заживления ран, который регулируется ангиогенными факторами роста. Однако механизмы, при помощи которых происходит индукция ангиогенеза и восстановления сосудистой сети, остаются до конца неизученными. Известно, что ангиогенные факторы участвуют в регуляции взаимодействия эндотелиальных клеток между собой и внеклеточным матриксом, что приводит к усилению миграции, пролиферации эндотелиоцитов и формированию кровеносных сосудов. Поскольку ангиогенез играет важную роль в физиологических и патологических процессах, понимание механизмов активации и воздействия ангиогенных факторов на эндотелиальные клетки является перспективным направлением для разработки эффективных стратегий терапевтического лечения сердечнососудистых и онкологических заболеваний.

Гипоксические условия являются главным регулятором ангиогенных факторов роста как в физиологических, так и патологических процессах. Пониженная концентрация кислорода с помощью HIF1A индуцирует экспрессию ангиогенных факторов, которые участвуют в формировании сосудистой сети в эмбриогенезе и онтогенезе. Концентрация кислорода является основным стимулирующим фактором органогенеза и васкулогенеза на протяжении всего эмбрионального развития организма. Потребности растущего эмбриона в питательных веществах и кислороде возрастают по мере его развития. До начала формирования сосудистой системы концентрация кислорода низкая и не превышает 3% (Mitchell & Yochim, 1968). Гипоксия в тканях эмбриона вызывает активацию HIF1A. Известно, что HIF1A индуцирует направленную артериальную дифференцировку из эндотелиальных предшественников за счет регуляции генов, которые ингибируют фактор венозной специализации Coup-TFII (транскрипционный фактор COUP 2) в условиях in vitro (Diez et al., 2007). Кроме того, HIF1A

участвует в определении пути миграции зрелых эндотелиальных клеток в гипоксических условиях (Ke and Costa, 2006).

Было показано, что экспрессия HIF1A в гипоксических условиях регулирует процессы ангиогенеза у взрослых организмов. Ангиогенез - это сложный многоступенчатый процесс (Carmeliet and Jain, 2011). На первых этапах HIF1A активирует VEGF-сигнальный путь. Стабильный HIFI A напрямую воздействует на VEGFA (Liu et al., 1995). Взаимодействие HIF1A и проангиогенных факторов является основой формирования сосудистой сети под воздействием гипоксических условий. Изоформы фактора роста эндотелия сосудов (VEGFA, VEGFB, VEGFC и VEGFD) регулируют большинство процессов ангиогенеза (Park et al., 1993). В свою очередь, в период гипоксии активный VEGF индуцирует экспрессию ряда ангиогенных факторов: PlGF, PDGF (тромбоцитарный фактор роста), ANGPT1, ANGPT2 (ангиопоэтин 1 и 2), а также рецепторов Flt-1, KDR, Tie 1 и Tie 2. Вовлечение данных факторов роста и рецепторов в процессы ангиогенеза обуславливает адекватное преобразование межклеточных сигналов, стимулирует миграцию эндотелиальных клеток и развитие капилляров. Известно, что HIF1A регулирует экспрессию проангиогенных факторов напрямую за счет связывания с гипоксия-реагирующим элементами (HREs) или опосредованно, активируя ряд сигнальных путей (Pugh and Ratcliffe, 2003). Исследование проангиогенных генов выявило наличие HREs в их промоторных районах (Schodel et al., 2011). На следующем этапе ангиогенеза деградирует внеклеточный матрикс в результате активности матриксных металлопротеиназ (MMP), что значительно облегчает перемещение эндотелиальных клеток к формирующимся трубчатым структурам (Ben-Yosef and Lahat, 2005). Далее интегрины ав стимулируют пролиферацию и адгезию эндотелиальных клеток в сосудистых структурах. На заключительном этапе ангиогенеза происходит вовлечение окружающих клеток (перецитов и гладкомышечных клеток) с формированием базальной мембраны. Было

показано, что на заключительной стадии ангиогенеза HIF2A стабилизирует кровеносный сосуд (Skuli et al., 2009) с помощью регуляции активности транскрипции ангиогенных генов: VEGF, PlGF, PDGFB, ANGPT1 и ANGPT2 (Greijer et al., 2005), также с помощью регуляции проангиогенных хемокиновых рецепторов (SDF-1a, CXCR4, SIPRs). Кроме того, HIF2A вовлекает пролиферирующие эндотелиальные предшественники в область формирования сосуда (Ceradini et al., 2004).

Таким образом, HIFs являются основными регуляторами процессов ангиогенеза и васкулогенеза за счет активации каскада проангиогенных факторов, источником которых могут быть тучные клетки, макрофаги, эндотелиальные клетки и др. Полученные данные применимы в разработке методов лечения на основе терапевтического ангиогенеза сердечнососудистых ишемических заболеваний (Hashimoto and Shibasaki, 2015; Loinard et al, 2009).

1.2 Структура HIFs

HIFs представляют собой гетеродимеры, состоящие из кислород-регулируемых субъединиц HIF1A или HIF2A и конститутивно экспрессирующейся субъединицы HIF-ip (Hashimoto and Shibasaki, 2015; Prabhakar and Semenza, 2012) (рис.1). HIFA существует в виде нескольких изоформ: HIF1A, HIF2A, HIF3A, все изоформы обладают различными биологическими свойствами. Функциональные домены HIF1A и HIF2A являются высоко гомологичными, однако профили экспрессии HIF1A и HIF2A сильно различаются. HIF1A экспрессируется повсеместно во всех типах клеток и тканей млекопитающих, экспрессия HIF2A ограничена рядом клеточных типов: ткани хряща и легких, клетки эндотелия (Hashimoto and Shibasaki, 2015; Wiesener et al, 2003). Кроме того, различается степень гипоксии, необходимая для активации экспрессии каждой из субъединиц HIFA. HIF2A начинает экспрессироваться при более повышенных концентрациях кислорода и при более долгосрочном воздействии, чем HIF1A.

Это обеспечивает быстрый и скоординированный транскрипционный ответ на гипоксические условия. HIF1A играет важную роль в артериальной дифференцировке предшественников эндотелия в процессах ангиогенеза (Zimna and Kurpisz, 2015). HIF-lß участвует в формировании гемангиобластов из мезодермальных предшественников (Zimna and Kurpisz, 2015). HIF2A вовлечен в формирование зрелых сосудов (Licht et al, 2006).

Рисунок 1. Структура доменов субъединиц HIF (Kenneth and Rocha, 2008)

Субъединицы HIFs имеют в своем составе специфические PAS-домены и относятся к bHLH-семейству транскрипционных регуляторов (Zimna and Kurpisz, 2015; Hashimoto and Shibasaki, 2015). PAS-домен вовлечен в формирование гетеродимера HIFs. Факторы транскрипции семейства bHLH контактируют с HRE таргетных генов в энхансере типа Е-бокс. HRE участвует в активации транскрипции за счет взаимодействия с HIFs (Arany et al., 1996). Известно, что существует три различные изоформы HIF-a, кодируемые тремя генами: HIF1A кодирует HIF1A, HIF2A (EPAS1) - HIF2A и HIF3A - HIF3A (IPAS, многочисленные варианты сплайсинга) (Hashimoto and Shibasaki, 2015; URL: https://www.genenames.org (дата обращения: 25.09.2020)). Кроме того, идентичность аминокислотной последовательности HIF1A и HIF2A составляет 48%. Идентичность bHLH доменов и PAS-регионов - 83 и 70% соответственно. ODD-домены (домены, отвечающие за кислород-зависимую деградацию) являются также высоко гомологичными (Chen et al., 2007).

Каждая из а-субъединиц HIFs содержит два трансактивационных домена: N-и C-концевой (N-, C-TAD). C-TAD высоко гомологичны у HIF1A и HIF2A, N-TAD - менее гомологичны. HIF3A не имеет C-концевого домена (Hashimoto and Shibasaki, 2015; Greer et al., 2012).

1.3. Механизмы регуляции активности HIF 1.3.1 Механизм кислород-зависимого регулирования активности HIFA

В нормоксических условиях субъединица HIFA постоянно экспрессируется в клетке, но быстро деградирует (Hashimoto and Shibasaki, 2015). Низкий уровень белкового продукта HIFA поддерживается за счет PHD-зависимого гидроксилирования. При нормоксических условиях происходит гидроксилирование пролина по одному из двух консервативных остатков в области домена ODD. Гидроксилирование катализируется семейством внутриклеточных пролилгидролаз (PHD). В клетках млекопитающих были идентифицированы три изоформы пролилгидроксилаз HIF, названные PHD1-3 (prolyl hydroxylase domain enzymes 1-3). Пролилгидроксилаза связывается с субъединицами HIF1A и HIF2A и катализирует гидроксилирование Pro-402 и Pro-564 в HIF1A, Pro-405 и Pro-531 в HIF2A. Гидроксилирование служит сигналом для распознавания а-субъединицы белком фон Гиппеля - Линдау (von Hippel-Lindau protein — pVHL). Взаимодействие белка фон Гиппеля -Линдау с а-субъединицой также опосредуется ацетилированием в положении К-532 ацетилтрансферазой ARD1. Далее происходит убиквитинирование, и образованный комплекс деградирует по протеасомному пути (рис. 2).

Рисунок 2. Кислород-зависимая регуляция активности HIFA (по Semenza et al., 2003).

Существует другой путь негативной регуляции HIFA в условиях нормоксии, который осуществляется при участии FIH (фактор, ингибирующий HIFs). FIH-1 также связывается с HIFA субъединицей и катализирует гидроксилирование остатка аспарагина Asn-803 в HIF1A и Asn-851 в HIF2A в домене С-TAD, что препятствует взаимодействию между HIF-a и коактиваторами транскрипции (Hashimoto and Shibasaki, 2015; Koh et al., 2011) в условиях нормоксии (рис. 2). Известно, что FIH и PHD имеют разный порог чувствительности к концентрации кислорода в клетках. При нормоксических условиях задействованы обе гидроксилазы, при средней гипоксии отключается PHD, но FIH все еще работает и сдерживает экспрессию HIFA. Во время хронической гипоксии FIH не работает, а HIFA взаимодействует со своим коактиватором p300/CBP и индуцирует гены-мишени, которые не экспрессировались при кратковременном гипоксическом воздействии (Hashimoto and Shibasaki, 2015).

1.3.2 Кислород-независимый путь регуляции HIF

Известны три связывающих фактора, которые участвуют в кислород-независимой регуляции HIFA: HAF (гипоксия-ассоциированный фактор), SUMO-специфические протеазы I и EIF3E (эукариотический фактор инициации трансляции 3E). Эти факторы непосредственно взаимодействуют с HIF-a и вызывают деградацию белка по протеасомному пути. Однако было отмечено, что SUMO-специфические протеазы I и HAF специфично

взаимодействуют только с HIF1A, в то время как EIF3E вызывает деградацию только HIF2A.

1.3.2.1 Роль HAF в негативной регуляции HIF1A

Гипоксия-ассоциированный фактор опосредует убиквитин-протеасомную деградацию HIF1A. HAF (также известен как SART1800) -убиквитинлигаза Е3, изначально идентифицированная как ядерный белок, экспрессирующийся в пролиферирующих клетках и различных опухолях (Shichijo et al, 1998).

HAF взаимодействует с доменом ODD у HIF1A и индуцирует убиквитинирование и протеасомную деградацию. С другой стороны, HAF связывается с участком между N-TAD и C-TAD у HIF2A, что приводит к его активации. Было отмечено, что количество данного фактора уменьшается в течение острой гипоксии, но повышается в период хронической гипоксии, обеспечивая быстрый и адекватный ответ на гипоксичекие условия. В этот процесс вовлекаются также ММР9, PAI-1 и OCT-3/4, что приводит к активному росту опухолей при продолжительной гипоксии. Недавние исследования показали, что активность сигнального пути NF-kB также регулирует HAF-опосредованное переключение экспрессии от HIF1A к HIF2A в стволовых клетках.

1.3.2.2 SUMO (малый убиквитин-связанный модификатор)

SUMO - низкомолекулярные белки, которые мало гомологичны убиквитину, но обладают структурным сходством (Carbia-Nagashima et al., 2007). SUMO после трансляции участвует в модификации многих белков, регулирует их локализацию и активацию. Таким образом, SUMO влияет на функционирование клетки, включая транскрипцию, ядерную трансляцию, реакцию на стресс, хроматиновую структуру. Модификация с помощью SUMO катализируется специфической лигазой и протеазами (SENPs). Нокаутные эмбрионы мышей по SENP1 демонстрируют нестабильность

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Живень Мария Константиновна, 2021 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Aitken C. E. and Lorsch J.R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes // Nat Struct Mol Biol. - 2012. - Vol. 19. - № 6. - P. 568-576.

2. Akiyoshi Y, Clayton J., Phan L., Yamamoto M., Hinnebusch AG, Watanabe Y and Asano K. Fission yeast homolog of murine Int-6 protein, encoded by mouse mammary tumor virus integration site, is associated with the conserved core subunits of eukaryotic translation initiation factor 3 // J Biol Chem. - 2001. - Vol. 276. - № 13. - P. 56-62.

3. Arany Z., Huang, L. E., Eckner R., Bhattacharya, S., Jiang, C., Goldberg, M. A., ... Livingston, D. M.. An essential role for p300/CBP in the cellular response to hypoxia // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1996. - Vol. 93. - № 23. - P. 69-73.

4. Asano K., Merrick W.C. and Hershey J.W. The translation initiation factor eIF3-p48 subunit is encoded by int-6, a site of frequent integration by the mouse mammary tumor virus genome // J Biol Chem. - 1997. - Vol. 272. -№ 38. - P.77-80.

5. Bakhashab S., Lary S., Ahmed F., Schulten H., Bashir A., Ahmed F., Al-Malki A., Jamal H., Gari M., Weaver J. Reference genes for expression studies in hypoxia and hyperglycemia models in human umbilical vein endothelial cells // G3 (Bethesda). - 2014. - Vol. 4. - № 11. - P. 59-65.

6. Bandyopadhyay A., Matsumoto T. and Maitra U. Fission yeast Int6 is not essential for global translation initiation, but deletion of int6(+) causes hypersensitivity to caffeine and affects spore formation // Mol Biol Cell. -2000. - Vol. 11. - № 11. - P. 4005-4018.

7. Bartoszewski R., Moszynska A., Serocki M. Primary endothelial-specific regulation of hypoxiainducible factor (HIF)-1 and HIF-2 and their target gene expression profiles during hypoxia // FASEB J. - 2019. - Vol. 33. - № 7. -P. 29-41.

8. Befani C., Liakos P. The role of hypoxia-inducible factor-2 alpha in

angiogenesis // J Cell Physiol. - 2018. - Vol. 233. - № 12. - P. 87-98.

9. Ben-Yosef Y, Miller, A., Shapiro, S., & Lahat, N. Hypoxia of endothelial cells leads to MMP-2-dependent survival and death. American Journal of Physiology // Cell Physiology. - 2005. - Vol. 289. - № 5. - P. 21-31.

10.Bertos N. R., Wang, A. H., & Yang, X. J. Class II histone deacetylases: structure, function, and regulation // Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. - 2001. - Vol. 79. - № 3. - P. 43-52.

11.Bitto A., De Caridi, G., Polito, F., Calo, M., Irrera, N., Altavilla, D., Squadrito, F. Evidence for markers of hypoxia and apoptosis in explanted human carotid atherosclerotic plaques // Journal of Vascular Surgery. -2010.

- Vol. 52. - № 4.- P. 15-21.

12. Bosch-Marce M., Okuyama H., Wesley J. B. Effects of aging and hypoxia-inducible factor-1 activity on angiogenic cell mobilization and recovery of perfusion after limb ischemia // Circ Res. - 2007. - Vol. 101. - № 12. - P. 1310-8.

13.Botusan I. R., Sunkari, V. G., Savu, O., Catrina, A. I., Grunler, J., Lindberg, S.,Catrina, S.-B. Stabilization of HIF-1alpha is critical to improve wound healing in diabetic mice // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2008. - Vol. 105. - № 49.- P. 26-31.

14.Bovill E. G., & van der Vliet, A. Venous valvular stasis-associated hypoxia and thrombosis: what is the link? // Annual Review of Physiology. - 2011. -Vol. 73. - № 1. - P. 27-45.

15.Brown J. M., & Giaccia, A. J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy // Cancer Research. - 1998.

- Vol. 58. - № 7. - P. 8-16.

16. Buttitta F., Martella C., Barassi F., Felicioni L., Salvatore S., Rosini S., D'Antuono T., Chella A., Mucilli F., Sacco R., Mezzetti A., Cuccurullo F., Callahan R., Marchetti A. EIF3E expression can predict survival in early-stage non-small cell lung cancer patients // Clin. Cancer. Res. - 2005. - Vol.

11. - № 9. - P. 198-204.

17.Carmeliet P., Jain R. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis // Nature. - 2011. - Vol. 473.- № 7347. - P. 298-307.

18.Carbia-Nagashima A., Gerez, J., Perez-Castro, C., Paez-Pereda, M., Silberstein, S., Stalla, G. K.,Arzt, E. RSUME, a small RWD-containing protein, enhances SUMO conjugation and stabilizes HIF-1alpha during hypoxia. - 2007.-Vol. 131. - № 2. - P. 9-23.

19.Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis // Nature Medicine. - 2000. - Vol.6. - № 4.- P. 89-95.

20.Cate J. H. D. Human eIF3: From 'blobology' to biological insight // Philos Trans R Soc B Biol Sci. - 2017. - Vol. 372. - № 1716. - P. 20160176.

21.Ceradini D. J., Kulkarni, A. R., Callaghan, M. J., Tepper, O. M., Bastidas, N., Kleinman, M. E.,Gurtner, G. C.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1 // Nature Medicine. -2004. - Vol. 10. - № 8. - P. 58-64.

22.Chen L., Uchida K., Endler A., Shibasaki F. Mammalian tumor suppressor INT6 specifically targets hypoxia inducible factor 2 alpha for degradation by hypoxia-and pVHL-independent regulation // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282. - № 17. - P. 7-16.

23.Christin JR, Beckert MV. Origins and Applications of CRISPR-Mediated Genome Editing // Einstein J Biol Med. - 2016. - Vol. 31. - № 1-2. - P. 2-5.

24. Chung S., Rho S., Kim G., Kim S., Baek K., Kang M., Lew H. Human umbilical cord blood mononuclear cells and chorionic plate-derived mesenchymal stem cells promote axon survival in a rat model of optic nerve crush injury // Int. J. Mol. Med. - 2016. - Vol. 37. - № 5. - P. 70-80.

25. Chen L., Endler A., Uchida K., Horiguchi S., Morizane Y., Iijima O., Toi M. and Shibasaki F. Int6/eIF3e silencing promotes functional blood vessel outgrowth and enhances wound healing by upregulating hypoxia-induced factor 2alpha expression // Circulation. - 2010. - Vol. 122. - № 9. - P. 910-

26. Chen L., Uchida K., Endler A. and Shibasaki F. Mammalian tumor suppressor Int6 specifically targets hypoxia inducible factor 2 alpha for degradation by hypoxia- and pVHL-independent regulation // J Biol Chem. -2007. - Vol. 282. - № 17. - P. 707-716.

27. Cheng J., Kang, X., Zhang, S., & Yeh, E. T. H. SUMO-specific protease 1 is essential for stabilization of HIF1alpha during hypoxia. Cell. - 2007. - Vol. 131. - № 3. - P. 84-95.

28. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. - 2013. - Vol. 339. - № 6121. - P. 19-23

29.Cooke J. P., Losordo D. W. Modulating the Vascular Response to Limb Ischemia: Angiogenic and Cell Therapies // Circ Res. - 2015. - Vol. 116. -№ 9. - P. 1561-78.

30.Cowan C., Klimanskaya I., McMahon J., Atienza J., Witmyer J., Zucker J., Wang S., Morton C., McMahon A., Powers D., Melton D. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts // The New England journal of medicine. - 2004. - Vol. 350. - № 13. - P. 53-56.

31.Creager M. A., Olin, J. W., Belch, J. J. F., Moneta, G. L., Henry, T. D., Rajagopalan, S., Hiatt, W. R.Effect of hypoxia-inducible factor-1alpha gene therapy on walking performance in patients with intermittent claudication // Circulation. - 2011. - Vol. 124. - № 16. - P. 65-73.

32.Depoix C., Flabat O., Debieve F., Hubinont C. HIF-1aplha and EPAS-1 mRNA and protein expression during in vitro culture of human primary term cytotrophoblasts and effect of oxygen tension on their expression // Reprod Biol. - 2016. - Vol. 16. - № 3. - P. 203-211.

33.Dery M. A. C., Michaud, M. D., & Richard, D. E. Hypoxia-inducible factor 1: Regulation by hypoxic and non-hypoxic activators // International Journal of Biochemistry and Cell Biology. - 2005. - Vol. 37. - № 1.- P. 35-40.

34.Diez H., Fischer A., Winkler A., Hu C., Hatzopoulos A., Breier G., Gessler M. Hypoxia- mediated activation of Dll4-Notch-Hey2 signaling in endothelial progenitor cells and adoption of arterial cell fate // Exp. Cell. Res.

- 2007. - Vol. 313. - № 1. - P. 1-9.

35.Endler A., Chen L., Li Q. Int6/eIF3e silenced HIF2a stabilization enhances migration and tube formation of HUVECs via IL-6 and IL-8 signaling // Cytokine. - 2013. - Vol. 62. - № 1. - P. 115-22.

36.Ezashi T, Das P & Roberts RM Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells // PNAS. - 2005. - Vol. 102. - P. 4783-4788

37.Forristal CE, Wright KL, Hanley NA, Oreffo RO, Houghton FD. Hypoxia inducible factors regulate pluripotency and proliferation in human embryonic stem cells cultured atreduced oxygen tensions // Reproduction. -2010. -Vol. 139. - № 1. - P. 185-97

38.Forsyth NR, Musio A, Vezzoni P, Simpson AH, Noble BS & McWhir J. Physiologic oxygen enhances human embryonic stem cell clonal recovery and reduces chromosomal abnormalities // Cloning and Stem Cells. - 2006.

- Vol. 8. - P. 16-23

39.Gao L., Chen, Q., Zhou, X., & Fan, L. The role of hypoxia-inducible factor 1 in atherosclerosis: Figure 1 // Journal of Clinical Pathology. -2012. - Vol. 65.

- № 10. - P. 72-76.

40.Gho B. C., Schoemaker, R. G., van den Doel, M. A., Duncker, D. J., & Verdouw, P. D.. Myocardial protection by brief ischemia in noncardiac tissue // Circulation. -1996. -Vol. 94.- № 9.- P. 193-200.

41.Giatromanolaki A., Arvanitidou, V., Hatzimichael A., Simopoulos C., & Sivridis, E. The HIF-2alpha/VEGF pathway activation in cutaneous capillary haemangiomas. Pathology. - 2005. - Vol. 37. - № 2. - P. 49-51.

42. Gildea D. E., Luetkemeier E. S., Bao X., Loftus S. K., Mackem S., Yang ., Pavan W.J. and Biesecker L.G. The pleiotropic mouse phenotype extra-toes spotting is caused by translation initiation factor Eif3c mutations and is

associated with disrupted sonic hedgehog signaling // FASEB. - 2011. - Vol. 25. - № 5. - P. 1596-1605.

43. Goldberg MP, Monyer H, Choi DW. Hypoxic neuronal injury in vitro depends on extracellular glutamine // Neurosci Lett. - 1988. - Vol. 94.- № 1-2. - P. 52-7

44.Gomes-Duarte A., Lacerda R., Menezes J., Romao L. eIF3: a factor for human health and disease // RNA Biol. - 2018. - Vol. 15. - № 1. - P. 26-34.

45.Greijer A., van der Groep P., Kemming D., Shvarts, A., Semenza, G., Meijer G., van der Wall, E. Up-regulation of gene expression by hypoxia is mediated predominantly by hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) // The Journal of Pathology. - 2005 - Vol. 206. - № 3. - P. 291-304

46. Grzmil M., Rzymski T., Milani M. An oncogenic role of eIF3e/INT6 in human breast cancer // Oncogene. - 2010. - Vol. 29. - № 28. - P. 4080-9.

47. Grzmil M., Whiting D., Maule J., Anastasaki C., Amatruda J. F., Kelsh R. N., Norbury C. J. and Patton E. E. The INT6 cancer gene and MEK signaling pathways converge during zebrafish development // PLoS One. - 2007. - Vol. 2. - № 9. - P. e959.

48.Gunshin H., Allerson C. R., Polycarpou-Schwarz M., Rofts A., Rogers J. Hashimoto T, Shibasaki F. Hypoxia-inducible factor as an angiogenic master switch // Front. Pediatr.- 2015. - Vol. 3.- P. 33.

49.Hashimoto T., Chen L., Kimura H. Silencing of eIF3e promotes blood perfusion recovery after limb ischemia through stabilization of hypoxia-inducible factor 2a activity // J Vasc Surg. - 2016. - Vol. 64. - № 1. - P. 219226.

50.Heinl-Green A., Radke, P. W., Munkonge, F. M., Frass, O., Zhu, J., Vincent, K., Alton, E. W. F. W. The efficacy of a "master switch gene" HIF-1alpha in a porcine model of chronic myocardial ischaemia // European Heart Journal. - 2005. - Vol. 26. - № 13. - P. 27-32.

51. Hinnebusch A. G. and Lorsch J. R. The mechanism of eukaryotic translation

initiation: new insights and challenges // Cold Spring Harb Perspect Biol. -2012. - Vol. 4. - № 10. - P. a011544.

52.Hinnebusch A. G. eIF3: a versatile scaffold for translation initiation complexes // Trends Biochem Sci. - 2006. - Vol. 31. - N. 10. - P. 553-562.

53.Hoenig M, Bianchi C, Sellke F. Hypoxia Inducible Factor-1a, Endothelial Progenitor Cells, Monocytes, Cardiovascular Risk, Wound Healing, Cobalt and Hydralazine: A Unifying Hypothesis // Curr. Drug. Targets. - 2008. - Vol. 9. - № 5. - P. 22-35.

54.Howell K., Preston R. J., McLoughlin Paul. Chronic hypoxia causes angiogenesis in addition to remodelling in the adult rat pulmonary // circulation J Physiol. - 2003. - Vol. 547. - № 1. - P. 133-45

55.Hu C., Iyer S., Sataur A., Covello K. L., Chodosh L. A., Simon M. C. Differential Regulation of the Transcriptional Activities of Hypoxia-Inducible Factor 1 Alpha (HIF-1a) and HIF-2a in Stem Cells // Mol Cell Biol.

- 2006. - Vol. 26. - № 9. - P. 14-26.

56. Iyer N. V, Kotch, L. E., Agani, F., Leung, S. W., Laughner, E., Wenger, R. H., Semenza, G. L. Cellular and developmental control of O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1 alpha // Genes & Development. - 1998. - Vol. 12.

- № 2. - P. 49-62.

57. Jackson R. J., Hellen C. U. and Pestova T.V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation // Nat Rev Mol Cell Biol.

- 2010. - Vol. 11. - № 2. - P. 113-127.

58.Kajiwara H., Luo, Z., Belanger, A. J., Urabe, A., Vincent, K. A., Akita, G. Y., ... Jiang, C. A hypoxic inducible factor-1a hybrid enhances collateral development and reduces vascular leakage in diabetic rats // The Journal of Gene Medicine. - 2009. - Vol. 11. - № 5.- P. 390-400.

59.Karuppagounder SS, Ratan RR. Hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition: robust new target or another big bust for stroke therapeutics // J Cereb Blood Flow Metab. - 2012. - Vol. 32. - № 7.- P. 47-61.

60.Ke Q., & Costa, M.Hypoxia-Inducible Factor-1 ( HIF-1 ) // Molecular Pharmacology. - 2006. - Vol.70. - № 5. - P. 1469-1480

61.Kenneth N. S., Rocha S. Regulation of gene expression by hypoxia // Biochem. J. - 2008. - Vol. 114. - № 1. - P. 19-29

62.Koh M. Y, Lemos, R., Liu, X., & Powis, G. The hypoxia-associated factor switches cells from HIF-1a- to HIF-2a-dependent signaling promoting stem cell characteristics, aggressive tumor growth and invasion // Cancer Research. - 2011. - Vol. 71. - № 11.-P. 15-27.

63. Koyanagi-Katsuta R., Akimitsu N., Hamamoto H., Arimitsu N., Hatano T. and Sekimizu K. Embryonic lethality of mutant mice deficient in the p116 gene // J Biochem. - 2002. - Vol. 131. - № 6. - P. 833-837.

64.Kütscher C., Lampert F., Kunze M., Markfeld-Erol F., Stark G., Finkenzeller G. Overexpression of hypoxia-inducible factor-1 alpha improves vasculogenesis-related functions of endothelial progenitor cells // Microvasc. Res. - 2016. - Vol. 105. - P. 85-92.

65.Larson M., Gilbert L., Wang X., Lim W., Weissman J., Qi L. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression // Nat. Protoc. - 2013. - Vol. 8. - № 11. - P. 80-96.

66.Laszkiewicz I., Wang H., Dovat S., Gans B., Madesh M., Cheung J., Miller B. Depletion of the Human Ion Channel TRPM2 in Neuroblastoma Demonstrates Its Key Role in Cell Survival through Modulation of Mitochondrial Reactive Oxygen Species and Bioenergetics // J. Biol. Chem.

- 2016. - Vol. 291. - № 47. - P. 49-64.

67.Lagarkova M. A., Volchkov P. Y, Lyakisheva A. V., Philonenko E. S., Kiselev S. L. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines // Cell Cycle. - 2006. - Vol. 5. - P. 16-20.

68.Lee A. S., Kranzusch P. J. and Cate J. H. eIF3 targets cell-proliferation messenger RNAs for translational activation or repression // Nature. - 2015.

- Vol. 522. - № 7554. - P. 111-114.

69.Lee E. S., Bauer, G. E., Caldwell, M. P., & Santilli, S. M. Association of artery

wall hypoxia and cellular proliferation at a vascular anastomosis // The Journal of Surgical Research. - 2000. - Vol. 91. - № 1.- P. 32-7.

70.Lee K., Qian, D. Z., Rey, S., Wei, H., Liu, J. O., & Semenza, G. L. Anthracycline chemotherapy inhibits HIF-1 transcriptional activity and tumor-induced mobilization of circulating angiogenic cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2009. -Vol. 106. - № 7.- P. 2353-8

71.Lee K., Zhanga H., Qiana David., Rey S., Liuc Jun O., Semenza G. Acriflavine inhibits HIF-1 dimerization, tumor growth, and vascularization // PNAS. - 2009. - Vol. 106. - № 42. - P. 10-15.

72.Li Q., Yao B., Endler A., Chen L., Shibasaki F., Cheng H. Int6/eIF3e Silencing Promotes Placenta Angiogenesis in a Rat Model of Pre-eclampsia // Sci Rep. - 2018. - Vol. 8. - №. 1.

73.Lian X.,Zhang J.,Azarin, MZhu S., Hazeltine K., BBao L., Hsiao X., Kamp C., JPalecek T. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem ce lls by modulating Wnt/ß-catenin signaling under fully defined conditions // Nature protocols. - 2013. - Vol. 8. - № 1.- P. 62-75

74.Liu X., Qi J., Xu X., Zeisberg M., Guan K., Zeisberg E. M. Differentiation of functional endothelial cells from human induced pluripotent stem cells: A novel, highly efficient and cost effective method // Differentiation. - 2016. -Vol. 92. - № 4.- P. 25-36.

75.Licht A., Müller-Holtkamp F., Flamme I., Breier G. Inhibition of hypoxiainducible factor activity in endothelial cells disrupts embryonic cardiovascular development // Blood. - 2006. - Vol. 107. - № 2. - P. 84-90.

76.Lim C. S., Kiriakidis, S., Sandison, A., Paleolog, E. M., & Davies, A. H. Hypoxia-inducible factor pathway and diseases of the vascular wall // Journal of Vascular Surgery. - 2013. - Vol. 58. - № 1.- P. 19-30.

77.Lim C. S., Qiao, X., Reslan, O. M., Xia, Y., Raffetto, J. D., Paleolog, E.,Khalil, R. A.. Prolonged mechanical stretch is associated with upregulation

of hypoxia-inducible factors and reduced contraction in rat inferior vena cava. Journal of Vascular Surgery. - 2011. - Vol. 53.- № 3.- P. 64-73

78.Liu L., Marti, G. P., Wei, X., Zhang, X., Zhang, H., Liu, Y. V, Harmon, J. W. Age-dependent impairment of HIF-lalpha expression in diabetic mice: Correction with electroporation-facilitated gene therapy increases wound healing, angiogenesis, and circulating angiogenic cells // Journal of Cellular Physiology. - 2008. - Vol. 217. - № 2. - P. 19-27.

79.Liu Y, Cox, S. R., Morita, T., & Kourembanas, S. Hypoxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelial cells. Identification of a 5' enhancer // Circulation Research. - 1995. - Vol.77- № 3. - P. 38-43.

80.Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. - 2001. - Vol. 25. - № 4. - P. 402-8.

81.Loinard C, Ginouvès A, Vilar J, Cochain C, Zouggari Y, Recalde A. Inhibition of prolyl hydroxylase domain proteins promotes therapeutic revascularization // Circulation. - 2009. - Vol. 120. - P. 9-50

82.Ludwig TE, Levenstein ME, Jones JM, Berggren WT, Mitchen ER, Frane JL, Crandall LJ, Daigh CA, Conard KR, Piekarczyk MS. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions // Nature Biotechnology. - 2006. -Vol. 24.- P. 85-87

83.Manalo DJ., Rowan A., Lavoie T., Natarajan L., Kelly BD., Ye SQ., Garcia JG., Semenza GL. Transcriptional regulation of vascular endothelial cell responses to hypoxia by HIF-1 // Blood. - 2005. - Vol. 105. - N 2. - P. 5969.

84.Mariah P., Chi V., Negi S., Krishnaswamy S., Guha. Endothelial cell biology: role in the inflammatory response // Advances in clinical chemistry. -2010. -Vol. 52.- P.109-30

85.Mazurier F., Pages G., Nieto L., Cuvillier O. Rôle de la Sphingosine Kinase 1 dans la régulation de l'hypoxie intratumorale // Thèse, l'Université Toulouse

III - Paul Sabatier. - 2012. - P. 1-245

86.Mack D. L., Boulanger C. A., Callahan R. and Smith G.H. Expression of truncated Int6/eIF3e in mammary alveolar epithelium leads to persistent hyperplasia and tumorigenesis // Breast Cancer Res. - 2007. - Vol. 9. - № 4.

- P. R42.

87.Majmundar A. J., Wong, W. J., & Simon, M. C. Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress // Molecular Cell. - 2010.-Vol. 40. - № 2.

- P. 294-309.

88. Marchetti A., Buttitta F., Miyazaki S., Gallahan D., Smith G.H. and Callahan R. Int-6, a highly conserved, widely expressed gene, is mutated by mouse mammary tumor virus in mammary preneoplasia // J Virol. - 1995. - Vol. 69.

- № 3. - P. 1932-1938.

89.Maxwell P. H., Wiesener, M. S., Chang, G.-W., Clifford, S. C., Vaux, E. C., Cockman, M. E.,Ratcliffe, P. J. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. - 1999.

- Vol. 399. - № 6733.- P. 71-75

90.Mayeur G.L. and Hershey J.W. Malignant transformation by the eukaryotic translation initiation factor 3 subunit p48 (eIF3e) // FEBS Lett. - 2002. - Vol. 514. - № 1. - P. 49-54.

91. Mitchell J. A., & Yochim, J. M.Intrauterine oxygen tension during the estrous cycle in the rat: its relation to uterine respiration and vascular activity // Endocrinology. -1968. - Vol. 83. - № 4.- P. 701-5

92.Moldovan N. I., & Asahara, T. Role of blood mononuclear cells in recanalization and vascularization of thrombi: past, present, and future // Trends in Cardiovascular Medicine. -2003 -Vol. 13. - № 7.- P. 265-9.

93.Nauta T. D., van den Broek M., Gibbs S. Identification of HIF-2a-regulated genes that play a role in human microvascular endothelial sprouting during prolonged hypoxia in vitro // Angiogenesis. - 2017. - Vol. 20. - № 1. - P. 39-54.

94.Neganova I, Zhang X, Atkinson S & Lako M. Expression and functional analysis of G1 to S regulatory components reveals an important role for CDK2 in cell cycle regulation in human embryonic stem cells // Oncogene.-2009.-Vol. 28. - P. 20-30

95.Neitemeier S., Dolga A., Honrath B., Karuppagounder S., Alim I., Ratan R., Culmsee C. Inhibition of HIF-prolyl-4-hydroxylases prevents mitochondrial impairment and cell death in a model of neuronal oxytosis // Cell Death Dis. - 2016. - Vol. 5. - № 7. - P. 2214.

96.Neusiedler J., Mocquet V., Limousin T., Ohlmann T., Morris C., Jalinot P. INT6 interacts with MIF4GD/SLIP1 and is necessary for efficient histone mRNA translation // RNA. - 2012. - Vol. 18. - № 6. - P. 1163-1177.

97.Ng I., Tan, W.-L., Ng, P.-Y., & Lim, J.Hypoxia inducible factor-1alpha and expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in cerebral arteriovenous malformations // Journal of Clinical Neuroscience : Official Journal of the Neurosurgical Society of Australasia. -2005 -Vol. 12. - № 7.-P. 794-9.

98.Novosel EC, Kleinhans C, Kluger PJ. Vascularization is the key challenge in tissue engineering // Adv Drug Deliv Rev. -2011. - Vol. 63. - № 4-5. - P. 300-11

99.Okamoto N., Tanaka A., Jung K. Silencing of int6 gene restores function of the ischaemic hindlimb in a rat model of peripheral arterial disease // Cardiovasc Res. - 2011. - Vol. 92. - № 2. - P. 209-17.

100. Olson E., Demopoulos L., Haws T. F. Short-term treatment with a novel HIF-prolyl hydroxylase inhibitor (GSK1278863) failed to improve measures of performance in subjects with claudication-limited peripheral artery disease // Vasc Med. - 2014. - Vol. 19. - № 6. - P. 73-82.

101. Park H. J., Yang F., Cho S. W. Nonviral delivery of genetic medicine for therapeutic angiogenesis // Adv Drug Deliv Rev. - 2012. - Vol. 64. - № 1. - P. 40-52.

102. Park J. E., Keller, G. A., & Ferrara, N. The vascular endothelial growth factor (VEGF) isoforms: differential deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrix-bound VEGF // Molecular Biology of the Cell. -1993. - Vol. 4. - № 12. - P. 17-26.

103. Patel T. H., Kimura H., Weiss C. R., Semenza G. L., Hofmann L. V. Constitutively active HIF-1 a improves perfusion and arterial remodeling in an endovascular model of limb ischemia // Cardiovasc Res. - 2005. - Vol. 68 - № 1. - P. 144-54.

104. Peng L., Shu X., Lang C., Yu X. Effects of hypoxia on proliferation of human cord blood-derived me senchymal stem ce lls // Cytotechnology. -2016. - Vol. 68. - № 4. - P. 15-22.

105. Peng L., Zhang L., Drysdale L., Fong G. The transcription factor EPAS-1 hyhypoxia-inducible factor 2a plays an important role in vascular remodeling // PNAS. - 2000. - Vol. 97. - № 15. - P. 86-91

106. Petruzzelli R., Christensen D. R., Parry K. L., Sanchez-Elsner T., Houghton F. D. HIF-2a Regulates NANOG Expression in Human Embryonic Stem Cells following Hypoxia and Reoxygenation through the Interaction with an Oct-Sox Cis Regulatory Element // PLoS One. - 2014. - Vol. 9. - № 10. - P. e108309.

107. Pick E., Hofmann K. and Glickman M. H. PCI complexes: beyond the proteasome, CSN, and eIF3 Troika // Mol Cell. - 2009. - Vol. 35. - № 3. - P. 260-264.

108. Prabhakar N., Semenza G., Adaptive and maladaptive cardiorespiratory responses to continuous and intermittent hypoxia mediated by hypoxiainducible factors 1 and 2 // Physiol Rev. - 2012. - Vol. 92. - № 3. -P. 967-1003.

109. Prokhorovich M. A., Lagar'kova M. A., Shilov A. G., Karamysheva T. V., Kiselyov S. L., Rubtsov N. B. Cultures of hESM human embryonic stem

cells: Chromosomal aberrations and karyotype stability // Bull. Exp. Biol. Med. - 2007. - Vol. 144. - № 1. - P. 26-29.

110. Pugh C. W., & Ratcliffe, P. J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. Nature Medicine. -2003. -Vol. 9. - № 6. - P. 77-84.

111. Rajagopalan S., Olin, J., Deitcher, S., Pieczek, A., Laird, J., Grossman, P. M., ... Chronos, N. Use of a constitutively active hypoxia-inducible factor-lalpha transgene as a therapeutic strategy in no-option critical limb ischemia patients: phase I dose-escalation experience // Circulation. -2007. - Vol. 115. - № 10. - P. 34-43.

112. Rencus-Lazar S., Amir Y, Wu J., Chien C.T., Chamovitz D.A. and Segal D. The proto-oncogene Int6 is essential for neddylation of Cul1 and Cul3 in Drosophila // PLoS One. - 2008. - Vol. 3. - № 5. - P. e2239.

113. Rufaihah A.J., Huang N.F., Kim J., Herold J., Volz K.S., Park T.S., Lee J.C., Zambidis E.T., Reijo-Pera R., Cooke J.P. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells exhibit functional heterogeneity // Am. J. Transl. Res. - 2013. - Vol. 5. - № 1. - P.21-35

114. Rufaihah A. J. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells exhibit functional heterogeneity // American journal of translational research. - 2013 - Vol. 5.- P.21-35

115. Sarkar K., Fox-Talbot, K., Steenbergen, C., Bosch-Marcé, M., & Semenza, G. L. Adenoviral transfer of HIF-1alpha enhances vascular responses to critical limb ischemia in diabetic mice // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2009. -Vol. 106. - № 44. - P. 69-74.

116. Schokrpur S., Hu J., Moughon D., Liu P., Lin L., Hermann K., Mangul S., Guan W., Pellegrini M., Xu H., Wu L. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma // Sci Rep. - 2016. - № 6. - P. 29032.

117. Schodel J., Oikonomopoulos, S., Ragoussis, J., Pugh, C. W., Ratcliffe,

P. J., & Mole, D. R. High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq // Blood. - 2011. - Vol. 11. - № 723.

118. Semenza G., Targeting HIF-1 for cancer therapy // Nat. Rev. Cancer. -2003. - Vol. 3. - № 10. - P. 21-32.

119. Semenza G. L. Oxygen Sensing, Hypoxia-Inducible Factors, and Disease Pathophysiology // Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. - 2014. - Vol. 9. - № 1. - P. 47-71.

120. Semenza G., Guan W. A Nuclear Factor Induced by Hypoxia via De Novo Protein Synthesis Binds to the Human Erythropoietin Gene Enhancer at a Site Required for Transcriptional Activation // Molecular and cellular biology. - 1992.- Vol. 12. - № 12.- P. 47-54.

121. Semenza Gregg L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine // Cell. - 2012. - Vol. 148. - №. 3. - P. 399-408.

122. Semenza Gregg L. Oxygen Sensing, Homeostasis, and Disease // N Engl J Med. - 2011. - Vol. 365. - № 6. - P. 37-47.

123. Sesen J., Casaos J., Scotland S. J., Seva C., Eisinger-Mathason, T. S. K., & Skuli, N. The bad, the good and eIF3e/INT6 // Frontiers in Bioscience - Landmark. - 2017. - Vol. 22. - P. 1-20.

124. Sesen J., Cammas A., Scotland S. J. Int6/eIF3e is essential for proliferation and survival of human glioblastoma cells // Int J Mol Sci. -2014. - Vol. 15. - № 2. - P. 72-90.

125. Shatzkes K., Teferedegne B., Murata H. A simple, inexpensive method fo r preparing cell lysates suitable for downstream reverse transcription quantitative PCR // Sci Rep. - 2014. - Vol. 4. - P. 4659

126. Shalev A., Valasek L., Pise-Masison C.A., Radonovich M., Phan L., Clayton J., He H., Brady J.N., Hinnebusch A.G. and Asano K. Saccharomyces cerevisiae protein Pci8p and human protein eIF3e/Int-6 interact with the eIF3 core complex by binding to cognate eIF3b subunits // J Biol Chem. - 2001. - Vol. 276. - № 37. - P. 48-57.

127. Shichijo S., Nakao, M., Imai, Y., Takasu, H., Kawamoto, M., Niiya, F. Itoh, K.. A gene encoding antigenic peptides of human squamous cell carcinoma recognized by cytotoxic T lymphocytes. // The Journal of Experimental Medicine.-1998. - Vol. 187.- № 3.- P. 277-88.

128. Siridechadilok B., Fraser C. S., Hall R. J., Doudna J. A. and Nogales E. Structural roles for human translation factor eIF3 in initiation of protein synthesis // Science. - 2005. - Vol. 310. - № 5753. - P. 1513-1515.

129. Skiles M. Characterizing Hypoxia and its behavioral effects in 3-Dimensional Cell.Aggregates // Doctoral dissertation. - 2013. - P. 1-172.

130. Skuli N., Liu L., Runge, A., Wang, T., Yuan, L., Patel, S., Keith, B. Endothelial deletion of hypoxia-inducible factor-2alpha (HIF-2alpha) alters vascular function and tumor angiogenesis // Blood. - 2009. - Vol. 114. - № 2. - P. 69-77

131. Skuli N., Majmundar, A. J., Krock, B. L., Mesquita, R. C., Mathew, L. K., Quinn Z. L., Simon, M. C. Endothelial HIF-2a regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes // The Journal of Clinical Investigation. - 2012. - Vol. 122. - № 4. - P. 27-43.

132. Sluimer J. C., & Daemen, M. J.. Novel concepts in atherogenesis: angiogenesis and hypoxia in atherosclerosis // The Journal of Pathology.-2009. - Vol. 218. - № 1. - P. 7-29.

133. Spilka R., Ernst C., Mehta A. K., Haybaeck J. Eukaryotic translation initiation factors in cancer development and progression // Cancer Lett. -2013. - Vol. 340. - № 1. - P. 9-21.

134. Spirina L., Usynin Y, Yurmazov Z., Slonimskaya E., Kolegova E., Kondakova I. Transcription factors NF-kB, HIF-1, HIF-2, growth factor VEGF, VEGFR2 and carboanhydrase IX mRNA and protein level in the development of kidney cancer metastasis // Mol. Biol. (Mosk). - 2017. - Vol. 51. - № 2. - P. 372-377.

135. Kishi F., Hentze M.W., Rouault T.A., Andrews N.C. and Hediger M.A.

Iron-dependent regulation of the divalent metal ion transporter. FEBS Lett. -2001. - Vol. 509. - P. 9-16.

136. Talks K., Turley H., Gatter K., Maxwell P., Pugh C., Ratcliffe P., Harris A. The expression and distribution of the hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in normal human tissues, cancers, and tumor-associated macrophages // Am. J. Pathol. - 2000. - Vol. 157. - № 2. - P. 1121.

137. Tang K., Xia F., Wagner P., Breen E. Exercise-induced VEGF transcriptional activation in brain, lung and skeletal muscle // Respir. Physiol. Neurobiol. - 2010. - V. 170. - № 1. - P. 16-22.

138. Tang N., Wang L., Esko J., Giordano F., Huang Y., Gerber H., Ferrara N., Johnson R. Loss of HIF1alpha in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis // Cancer Cell. -2004. - Vol. 6. - № 5. - P. 485-95.

139. Taniguchi C., Miao Y, Diep A., Wu C., Rankin E., Atwood T., Xing L., Giaccia A. PHD Inhibition Mitigates and Protects Against Radiation-Induced Gastrointestinal Toxicity via HIF2 // Sci Transl Med. - 2014. - Vol. 6. - № 236. - P. 36-64

140. Tu C., Das S., Baker A. B., Zoldan J., Suggs L. J. Nanoscale strategies: Treatment for peripheral vascular disease and critical limb ischemia // ACS Nano. - 2015. - Vol. 9. - № 4. - P. 36-52.

141. Tu T. C., Nagano M., Yamashita T. A chemokine receptor, CXCR4, which is regulated by hypoxia inducible factor 2a, is crucial for functional EPC migration to ischemic tissue and wound repair // Stem Cells Dev. - 2015. - Vol. 25. - № 3. - P. 266-76.

142. Uccioli L., Meloni M., Izzo V., Giurato L., Merolla S., Gandini R. Critical limb ischemia: current challenges and future prospects // Vasc Health Risk Manag. - 2018. - Vol. 14. - P. 63-74.

143. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B. Accurate

normalization of real-time quantitative RT-PCR date by geometric averaging of multiple internal control genes // Genome Biology. - 2002. -Vol. 3. - № 7. - P. 1-11.

144. Vukovic M., Guitart A., Sepulveda C., Villacreces A., O'Duibhir E., Panagopoulou T., Ivens A., Menendez-Gonzalez J., Iglesias J., Allen L., Glykofrydis F., Subramani C., Armesilla-Diaz A., Post A., Schaak K., Gezer D., So C., Holyoake T., Wood A., O'Carroll D., Ratcliffe P., Kranc K. Hif-1a and Hif-2a synergize to suppress AML development but are dispensable for disease maintenance // J. Exp. Med. - 2015. - Vol. 212. - № 13. - P. 2223.

145. Wagner S., Herrmannova A., Malik R., Peclinovska L., Valasek L. S. Functional and Biochemical Characterization of Human Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 in Living Cells // Mol Cell Biol. - 2014. - Vol. 34. - № 16. - P. 41-52.

146. Wang G. L. and Semenza G. L. General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia // The Journal of Experimental Medicine. - 1993b - Vol. 90. - P. 304-308.

147. Watanabe A., Ichiki T., Sankoda C. Suppression of abdominal aortic aneurysm formation by inhibition of prolyl hydroxylase domain protein through attenuation of inflammation and extracellular matrix disruption // Clin Sci (Lond). - 2014. - Vol. 126. - № 9. - P. 671-8.

148. Westfall S. D., Sachdev S., Das P., Hearne L. B., Hannink M., Roberts RM &Ezashi T. Identification of oxygen-sensitive transcriptional programs in human embryonic stem cells // Stem Cells and Development. - 2008.-Vol.17.- P. 69-82.

149. Wheaton W. W., Chandel N. S. Hypoxia regulates cellular metabolism // American journal of physiology. Cell physiology. - 2011. - Vol. 300. - № 3. - P. 385-93

150. Wiesener M., Jurgensen J., Rosenberger C., Scholze C., Horstrup J., Warnecke C., Mandriota S., Bechmann I., Frei U., Pugh C., Ratcliffe P.,

Bachmann S., Maxwell P., Eckardt K. Widespread hypoxia-inducible expression of HIF-2alpha in distinct cell populations of different organs // FASEB J. - 2003. - Vol. 17. - № 2. - P. 271-3.

151. Wolf D. A., Lin Y., Duan H., & Cheng, Y. EIF-Three to Tango: Emerging functions of translation initiation factor eIF3 in protein synthesis and disease // Journal of Molecular Cell Biology. Oxford University Press. -2020. - Vol. 12. - № 6. - P. 403-409.

152. Wu C., Wang X., Zhong M., Liu H., He Q., Yang X., Wen J., Feng D. Evaluation of potential reference genes for qRT-PCR studies in human hepatoma cell lines treated with TNF-a // Acta. Biochim. Biophys. Sin. -2013. - Vol. 45. - № 9. - P. 780-6.

153. Xiuying L., Qiwei Y, Jinping B., Yanyan Y., Lingzhi Z., Yimin W. Identification of optimal reference genes for quantitative PCR studies on human mesenchymal stem cells // Mol. Med. Rep. - 2014. - P. 304-311

154. Yang L., Shen L., Li G., Yuan H., Jin X., Wu X. Silencing of hypoxia inducible factor-1a gene attenuated angiotensin E -induced abdominal aortic aneurysm in apolipoprotein E-deficient mice // Atherosclerosis. - 2016. -Vol. 252. - P. 40-9.

155. Yen H. C. and Chang E. C. INT6-a link between the proteasome and tumorigenesis // Cell Cycle. - 2003. - Vol. 2. - № 2. - P. 81-83.

156. Zeng L., Wan Y, Li D., Wu J., Shao M., Chen J., Hui L., Ji H. and Zhu X. The m subunit of murine translation initiation factor eIF3 maintains the integrity of the eIF3 complex and is required for embryonic development, homeostasis, and organ size control // J Biol Chem. - 2013. - Vol. 288. - № 42. - P. 87-93.

157. Zhang Z., Christin J., Wang C., Ge K., Oktay M., Guo W. Mammary-Stem-Cell-Based Somatic Mouse Models Reveal Breast Cancer Drivers Causing Cell Fate // Cell Rep. - 2016. - Vol. 16. - № 12. - P. 3146-3156.

158. Zhang H., Qian, D. Z., Tan, Y S., Lee, K., Gao, P., Ren, Y. R.,Semenza, G. L. Digoxin and other cardiac glycosides inhibit HIF-1alpha synthesis and

block tumor growth // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2008. -Vol. 105.- № 50. - P. 19579-86.

159. Zhang X., Neganova I., Przyborski S., Yang C., Cooke M., Atkinson S. P., Anyfantis G., Fenyk S., Keith W. N., Hoare S. F . A role for NANOG in G1 to S transition in human embryonic stem cells through direct binding of CDK6 and CDC25A // Journal of Cell Biology -2009. -Vol. 184 - P. 67-82

160. Zhang X., Zhang Y., Wang P. Adipocyte Hypoxia-Inducible Factor 2a Suppresses Atherosclerosis by Promoting Adipose Ceramide Catabolism // Cell Metab. - 2019. - Vol. 30. - №. 5. - P. 37-51.

161. Zhao T., Zhang C. P, Liu Z. H, Wu L. Y, Huang X, Wu H. T, Xiong L, Wang X, Wang X. M, Zhu L. L. Hypoxia-driven proliferation of embryonic neural stem/progenitor cells-role of hypoxia-inducible transcription factor-1a // FEBS Journal. -2008. -Vol. 275. - P. 1824-1834.

162. Zhdanov A. V., Okkelman I. A., Collins F. W., Melgar S., Papkovsky D. B. A novel effect of DMOG on cell metabolism: direct inhibition of mitochondrial function precedes HIF target gene expression // Biochim Biophys Acta. - 2015. - Vol. 1847.- № 10.- P. 54-66

163. Zhou Z., Zhang J., Xia P., Wang J., Chen S., Fang X., Fan S. Selection of suitable reference genes for normalization of quantitative real-time polymerase chain reaction in human cartilage endplate of the lumbar spine // PLoS One. - 2014. - Vol. 9. - № 2. - P. 88892.

164. Zhu C., Yu J., Pan Q., Yang J., Hao G., Wang Y, Li L., Cao H. Hypoxia-inducible factor-2 alpha promotes the proliferation of human placenta-derived mesenchymal stem cells through the MAPK/ERK signaling pathway // Sci. Rep. - 2016. - Vol. 6. - P. 35489.

165. Zimna A., Kurpisz M., Hypoxia-Inducible Factor-1 in Physiological and Pathophysiological Angiogenesis: Applications and Therapies // Biomed. Res. Int. - 2015. - Vol. 2015. - P. 549-412.

166. Zudaire E., Gambardella L., Kurcz C., Vermeren S. A computational

tool for quantitative analysis of vascular networks // PLoS One. - 2011. -Vol. 6. - № 11. - P. e27385

167. Живень М.К., Захарова И.С., Смирнова А.М., Шевченко А.И., Орищенко К.Е., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. CRISPR/Cas9-опосредованное получение генетически модифицированной линии плюрипотентных стволовых клеток человека, экспрессирующих HIF — фактор, индуцируемый гипоксией // Гены и клетки. - 2018. - No 2 (приложение). Материалы Международного конгресса CRISPR-2018. С. 30.

168. Живень М.К., Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Орищенко К.Е., Закиян С.М. Получение и характеристика эмбриональных стволовых клеток человека с повышенной экспрессией HIF2A // Гены & Клетки. - 2020. - Т. 14. - № 1. - P. 29-35.

169. Захарова И.С., Смирнова А.М., Живень М.К., Шевченко А.И., Григорьева Е.В., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Получение генетически-модифицированной линии плюрипотентных стволовых клеток человека, экспрессирующей HIF-фактор, индуцируемый гипоксией // Гены и клетки. - 2017. - T. 12. - № 3. - P. 97-98

170. Медведев С., Шевченко А., Сухих Г., Закиян С. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки // 2-е изд. Новосибирск: Изд-во СО РАН. - 2014. - С. 376.