Роль амилоидной трансформации a-синуклеина в нарушении гликолиза при синуклоинопатиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Мельникова Александра Кирилловна

• Мельникова Александра Кирилловна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Мельникова Александра Кирилловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. Актуальность проблемы

2. Степень разработанности темы

3. Цели и задачи

4. Объект и предмет исследования

5. Научная новизна

6. Теоретическая и практическая значимость

7. Методология исследования

8. Положения, выносимые на защиту

9. Степень достоверности данных

10. Личный вклад автора

11. Публикации по теме научно-квалификационной работы (диссертации)

12. Апробация работы

13. Структура диссертации

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. а-синуклеин и синуклеинопатии

1.1. Структура а-синуклеина

1.2. Функции а-синуклеина

1.3. Амилоидогенная трансформация а-синуклеина и ее взаимосвязь с

синуклеинопатиями

1.3.1. Классификация синуклеинопатии и роль а-синуклеина в их развитии

1.3.2. Механизм агрегации а-синуклеина

1.3.3. Токсичные формы а-синуклеина. Распространении патологии от клетки к клетке при синуклеинопатиях

1.4. Нарушения клеточного метаболизма при синуклеинопатиях

1.4.1. Нарушения митохондриального гомеостаза

1.4.2. Нарушения в метаболизме глюкозы: пентозофосфатный путь, гликолиз, цикл Кребса

2. Использование низкомолекулярных соединений для предотвращения амилоидогенной трансформации белков

2.1. Природные полифенольные соединения. Куркумин

2.2. Производные гидроксикоричных кислот

3. Соматическая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и нейродегенеративные заболевания

3.1. Структура и ферментативная активность соматической ГАФД человека

3.2. Взаимосвязь ГАФД и нейродегенеративных заболеваний. Взаимодействие а-синуклеина и ГАФД

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

МАТЕРИАЛЫ

МЕТОДЫ

1.Оптимизация процесса выделения и очистки рекомбинантного а-синуклеина человека

1.1. Получение а-синуклеина с мутациями Y136Y(TAC^TAT) и A53T для экспрессии в E. coli

1.1.1. Сайт-направленный мутагенез

1.1.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

1.1.3. Лигирование

1.1.4. Получение компетентных клеток E. coli

1.1.5. Трансформация бактериальных клеток

1.1.6. ПЦР-скрининг коллоний

1.1.7. Наращивание биомассы E. coli, содержащих плазмидную ДНК

1.1.8. Выделение плазмидной ДНК

1.2. Выделение и очистка рекомбинантного а-синуклеина человека с мутацией Y136Y(TAC^TAT) и A53T из E. Coli

1.2.1. Наработка рекомбинантного а-синуклеина в E. Coli

1.2.2. Выделение рекомбинантного а-синуклеина из E. coli

2. Выделение рекомбинантной соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека.

2.1. Наработка рекомбинантной соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (чГАФД) в E. Coli

2.2. Выделение рекомбинантной соматической глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека (чГАФД)

3. Получение и изучение различных форм а-синуклеина in vitro

3.1. Получение олигомеров а-синуклеина

3.2. Получение фибрилл а-синуклеина

3.3. Измерение флуоресценции тиофлавина Т

3.3.1. Измерение спектра флуоресценции тиофлавина Т

3.3.2. Измерение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в планшете

3.3. Спектроскопия кругового дихроизма

3.4. SDS-электрофорез

3.5. Иммуноблоттинг

3.6. Нативный электрофорез в щелочной среде

3.7. Оценка цитотоксичности мономеров и олигомеров а-синуклеина

4. Инактивация ГАФД различными формами а-синуклеина

4.1. Приготовление проб

3

4.2. Измерение активности ГАФД

4.2.1. Приготовление растворов NAD+ и Г-3-Ф

5. . Получение клеток, продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантной формы A53T на основе нейробластомы SH-SY5Y

5.1. Получение конструкций, содержащих ген а-синуклеина дикого типа или с мутацией А53Т в векторах рVax1 и pcDNA3.1/Hygro(+)

5.1.1. ПЦР-амплификация гена а-синуклеина

5.1.2. Переосаждение ПЦР-продукта

5.1.3. Рестриктная реакция

5.1.4. Выделение образцов ДНК из агарозного геля

5.1.5. Лигазная реакция

5.2. Культивирование клеток нейробластомы SH-SY5Y

5.2.1. Подсчёт клеток

5.3. Получение клеток, транзиентно экспрессирующих а-синуклеин дикого типа или с мутацией A53T

5.4. Получение клеток, стабильно экспрессирующих а-синуклеин дикого типа или с мутацией A53T

5.4.1. Получение клонов SH-SY5Y со вставкой гена а-синуклеина дикого типа или мутацией A53T

5.4.2. Анализ продукции белка клетками SH-SY5Yметодом иммуноблоттинга

6. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y

6.1. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами, специфичными к а-синуклеину

6.2. Цитохимическое окрашивание тиофлавином S

7.Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующих а-синуклеин

7.1. Измерение активности ГАФД и накопления лактата в клеточных лизатах

7.1.1. Получение клеточных лизатов

7.2.2. Запуск гликолиза в клеточных лизатах

7.2.3. Измерение активности ГАФД в клеточных лизатах

7.2.4. Измерение накопления лактата в клеточных лизатах

7.2. Измерение глюкозы и лактата в культуральной среде

7.2.1. Измерение концентрации лактата

7.2.2. Измерение концентрации глюкозы

8. Ингибирование фибриллизации а-синуклеина производными гидроксикоричных кислот

8.1. Получение производных гидроксикоричных кислоты

8.2. Расчет полумаксимальной константы ингибирования фибриллизации а-синуклеина

8.3. Докинг производных гидроксикоричных кислот и фибрилл а-синуклеина

8.5. Спектроскопия кругового дихроизма

8.6. Сканирующая ион-проводящая микроскопия

4

8.7. Индукция фибриллизации мономерного а-синуклеина добавлением фибриллярных агрегатов

8.8. Измерение цитотоксичности производных гидроксикоричных кислот

9. Статистическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оптимизация наработки и очистки рекомбинантных а-синуклеина и ГАФД человека

1.1. Получение а-синуклеина с мутациями Y136Y(TAC^TAT) и A53T для экспрессии в E.

coli

1.2. Выделение а-синуклеина дикого типа Y136Y(TAC^TAT)

1.3. Выделение рекомбинантной ГАФД человека

2. Получение и изучение различных форм а-синуклеина

2.1. Получение олигомеров а-синуклеина

2.2. Получение фибрилл а-синуклеина

3. Инактивация ГАФД различными формами а-синуклеина in vitro

4. . Получение клеток, продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму A53T на основе нейробластомы SH-SY5Y

4.1. Получение конструкций, содержащих ген а-синуклеина дикого типа или с мутацией А53Т в векторах рУах1 и pcDNA3.1/Hygro(+)

4.2. Получение стабильно продуцирующих а-синуклеин дикого типа и A53T клонов на основе нейробластомы SH-SY5Y

5. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y

5.1. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y, транзиентно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53T

5.2. Анализ амилоидной агрегации а-синуклеина в клетках нейробластомы SH-SY5Y, стабильно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53Т

6.Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующих а-синуклеин

6.1. Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, транзиентно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53Т

6.2. Измерение гликолитических параметров клеток нейробластомы SH-SY5Y, стабильно продуцирующих а-синуклеин дикого типа или мутантную форму А53Т

7. Ингибирование фибриллизации а-синуклеина производными гидроксикоричных кислот

7.1. Тестирование эффективности 9 производных гидроксикоричных кислот в предотвращении фибриллизации а-синуклеина

7.2. Предотвращение амилоидной агрегации а-синуклеина тремя производными гидроксикоричных кислот

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

АДФ аденозиндифосфат

АТФ аденозинтрифосфат

АФК активные формы кислорода

БП болезнь Паркинсона

БСА бычий сывороточный альбумин

Г-3-Ф глицеральдегид-3-фосфат

ГАФД глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ГКК гидроксикоричные кислоты

ДТТ дитиотреитол

КД круговой дихроизм

МЕ Р-меркаптоэтанол

ПААГ полиакриламидный гель

ТАЕ трис-ацетатный буфер

ТРИС трис(гидроксиметил)аминометан

ФДГ [18F]2-флуоро-2-деокси-D-глюкоза

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭТЦ электронно-транспортная цепь

ЯМР ядерный магнитный резонанс

a-synA53T а-синуклеин с мутацией A53T

a-synWT а-синуклеин дикого типа

DAPI 4',6-диамидино-2-фенилиндол

DOPAC 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота

FITC флуоресцеин изотиоцианат

ГС50 полумаксимальная ингибирующая концентрация

IPTG изопропил-Р^-1 -тиогалактопиранозид

MPP+ 1-метил-4-фенилпиридиний

MPTP 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин

NAC не-Р-амилоидный компонент амилоида

NAD+ никотинамидадениндинуклеотид (окисленный)

NADH никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)

PBS фосфатно-солевой буфер

RIPA радиоиммунопреципитация

SDS додецилсульфат натрия

SNCA ген а-синуклеина

TBST трис-солевой буфер с Tween-20

тиофлавин S

ThT тиофлавин Т

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль амилоидной трансформации a-синуклеина в нарушении гликолиза при синуклоинопатиях»

1. Актуальность проблемы

Заболевания, коллективно называемые синуклеинопатиями, которые ассоциированы с патологической агрегацией белка а-синуклеина, являются социально значимыми заболеваниями, вызывающими у пациентов серьезные моторные и когнитивные нарушения. Болезнь Паркинсона (БП), при которой патологическая агрегация а-синуклеина происходит в дофаминергических нейронах черной субстанции с формированием телец Леви [1], является вторым по распространенности нейродегенеративным заболеванием человека после болезни Альцгеймера [2].

Дофаминергические нейроны особенно подвержены повреждению из-за метаболических нарушений, что связано с большой разветвленной сетью их аксональных окончаний и повышенной продукцией активных форм кислорода из-за метаболизма дофамина, протекающего в терминалях аксонов [3]. Именно поэтому изучение причин метаболических нарушений, наблюдаемых при синуклеинопатиях, имеет большое значение. Важными участками энергетического метаболизма в нейронах являются митохондрии, генерирующие АТФ, необходимый для поддержания транспорта нейротрансмиттеров и ионного градиента на клеточной мембране, и пентозофосфатный путь, производящий NADPH и защищающий клетку от окислительного стресса [4].

В то время как нарушение энергетического метаболизма митохондрий при синуклеинопатиях широко освещено в литературе, меньше известно о нарушениях метаболизма глюкозы. При этом снижение метаболизма глюкозы в мозгу больных БП было неоднократно зафиксировано in vivo с помощью трейсера [18Р]2-флуоро-2-деокси^-глюкозы [5-8]. Более того, при воздействии токсина MPTP, мимикрирующего потерю дофаминергических нейронов при БП, в первую очередь возникает митохондриальная

недостаточность, которая компенсируется активацией гликолиза [9-11]. Депривация глюкозы приводила к амилоидной агрегации а-синуклеина у дифференцированных в нейроны клеток нейробластомы SH-SY5Y; эффект усиливался в присутствии дофамина [12].

Ограниченная способность нейронов к активации гликолиза, связанная с постоянной деградацией в протеасоме фермента-активатора гликолиза фруктозо-6-фосфат-2-киназы/фруктозо-2,6-бисфосфатазы [13], делает гликолитические ферменты потенциально интересной терапевтической мишенью при синуклеинопатиях. Так, уже выведенные на фармацевтический рынок препараты меклизин и теразозин, исходно используемые по другим показаниям, показали свою эффективность в терапии БП на клеточных и животных моделях, за счет повышения продукции фосфофруктокиназы и активности 3-фосфоглицераткиназы соответветственно [14,15].

О вовлечении гликолитического фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) в патогенез БП впервые задумались после обнаружения ко-локализации ГАФД и а-синуклеина в тельцах Леви, в том числе в периферической зоне телец Леви у пациентов с БП [16,17]. В 2018 году нашей группой было показано взаимодействие ГАФД и мономерного а-синуклеина in vitro, приводящее к снижению его активности [18], судя по всему за счет преимущественного связывания в активном центре и конкуренции за связывание с кофактором NAD+ [19]. Необходимым условием такого взаимодействия было частичное окисление Cys152 активного центра ГАФД, которое вполне вероятно реализуется при БП при нарушениях в пентозофосфатном пути и снижении уровня восстановленного глутатиона [20,21].

В связи с вышеперечисленными фактами представляется важным изучение взаимодействия ГАФД и различных форм а-синуклеина в контексте синуклеинопатий, ферментативной активности ГАФД при синуклеинопатиях, а также поиск модуляторов патологической агрегации а-синуклеина и, потенциально, его взаимодействия с ГАФД. В нашей работе в качестве

9

потенциальных ингибиторов агрегации а-синуклеина мы рассматриваем слабо изученные в этом отношении синтетические и природные производные гидроксикоричных кислот.

2. Степень разработанности темы

Хорошо изучено нарушение метаболизма глюкозы при болезни Паркинсона по данным позитронно-эмиссионной томографии, совмещенной с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ) с использованием радиоактивно меченого аналога глюкозы [18Р]2-флуоро-2-деокси-0-глюкозы. При помощи данного подхода было показано снижение метаболизма глюкозы в некоторых областях мозга, коррелирующее с прогрессией заболевания [5,7,8], а также снижение скорости первой в гликолизе реакции фосфорилирования глюкозы [6]. Множество групп изучало влияние токсина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP), вызывающего паркинсонизм, на метаболизм глюкозы. При его воздействии наблюдается падение производства АТФ в клетке, которое затем компенсируется за счет активации гликолиза [9-11,2225]. Группа профессора Р. Франко изучила также влияние токсина параквата, также вызывающего паркинсонизм, на метаболизм глюкозы [26,27]. Кроме того, была показана индукция агрегации а-синуклеина при инкубации клеток в присутствии повышенных концентраций лактата или депривации глюкозы [12,28].

Что касается производных гидроксикоричных кислот как потениальных модуляторов патологической агрегации а-синуклеина, то немногочисленные данные об их ингибирующей активности описывают действие феруловой [29] и кофейной [30,31] кислот.

3. Цели и задачи

Целью данной работы является исследование взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) с различными формами а-синуклеина, образующимися в ходе его амилоидной агрегации, возможных последствий этого взаимодействия для гликолитических процессов при синуклеинопатиях и потенциальных путей предотвращения этого взаимодействия.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1) оптимизация выделения рекомбинантного а-синуклеина дикого типа (а-synWT) и склонной к агрегации мутантной формы A53T ^-synA53T);

2) получение и характеризация олигомеров и фибрилл а-синуклеина;

3) изучение инактивации ГАФД человека различными формами а-synWT и а^упЛ53Т in vitro;

4) получение клеток нейробластомы SH-SY5Y с повышенной продукцией а-synWT или а^упЛ53Т в качестве клеточной модели синуклеинопатии;

5) изучение амилоидной агрегации а-синуклеина в полученной модели синуклеинопатии;

6) измерение гликолитических параметров (активность ГАФД, накопление лактата, поглощение глюкозы) в полученной клеточной модели синуклеинопатии;

7) сопоставление данных об амилоидной агрегации а-синуклеина и гликолитических параметрах в полученной модели синуклеинопатии с результатами, полученными об инактивации ГАФД человека различными формами а-synWT и а-synA53T in vitro;

8) изучение производных гидроксикоричных кислот как потенциальных модуляторов амилоидной агрегации а-синуклеина.

4. Объект и предмет исследования

Объектом исследования были ГАФД, а-синуклеин, его патологические формы, клеточные модели синуклеинопатии и производные ГКК.

Предметом исследования было взаимодействие ГАФД с различными патологическими формами а-синуклеина in vitro, ферментативная активность ГАФД, гликолитические параметры (накопление лактата, поглощение глюкозы) и патологическая агрегация а-синуклеина в клеточной модели синуклеинопатии, а также ингибирование фибриллизации а-синуклеина в присуствии производных гидроксикоричных кислот.

5. Научная новизна

Впервые показано, что олигомеры а-синуклеина in vitro инактивируют ГАФД, содержащую частично окисленный остаток цистеина активного центра, сильнее, чем мономеры и фибриллы а-синуклеина. Продемонстрировано, что активность ГАФД понижена в лизатах клеток нейробластомы SH-SY5Y с транзиентной продукцией а-synA53T и со стабильно повышенной продукцией а-synWT или а-synA53T, что кореллирует с наличием тиофлавин S-позитивных амилоидных агрегатов в клетках. Также впервые показано, что продукция лактата и поглощение глюкозы снижены у клеток нейробластомы SH-SY5Y со стабильно повышенной продукцией а-synWT или а-synA53T.

Впервые установлено, что производные гидроксикоричных кислот 3-метокси-4-ацетамидоксикоричная кислота и 3,4-диметоксикоричная препятствуют фибриллизации а-синуклеина. При этом продемонстрировано отсутствие связывания данных лигандов с мономерной формой а-синуклеина, то есть уточнен механизм ингибирования фибриллизации, согласно которому данные производные предотвращают фибриллизацию на этапах агрегации,

следующих за стадией мономера, стимулируя образование мелких аморфных агрегатов.

6. Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные дополняют теоретические представления о молекулярных основах гликолитической патологии при синуклеинопатиях и могут быть использованы для разработки терапевтических агентов, выборочно влияющих на взаимодействие а-синуклеина и ГАФД, таким образом увеличивая активность ГАФД и усиливая гликолиз. Информация о способности производных гидроксикоричных кислот феруловой, 3,4-диметоксикоричной и 3-метокси-4-ацетамидоксикоричной кислот ингибировать фибриллизацию а-синуклеина может быть использована для разработки биологически активных добавок на основе кофейных зерен для предотвращения патологической агрегации а-синуклеина.

7. Методология исследования

В исследовании были использованы биоинженерные, биохимические методы и методы работы с культурами клеток млекопитающих для проведения экспериментальных исследований. Все использованные методики были применены в соответствии с общепринятыми мировыми стандартами и с надлежащими контролями. Методы выделения рекомбинантного а-синуклеина и рекомбинантной ГАФД человека из E. coli, измерения активности ГАФД и накопления лактата в клеточных лизатах были разработаны и ранее апробированы коллективом лаборатории.

8. Положения, выносимые на защиту

1. Олигомеризация in vitro а-синуклеина дикого типа и мутантной формы A53T приводит к образованию частично устойчивых к SDS и содержащих Р-тяжи агрегаты с молекулярной массой 190-220 кДа, которые инактивируют глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД) с частично окисленным остатком цистеина активного центра более выраженно, чем мономеры а-синуклеина; фибриллы а-синуклеина не вызывают инактивации ГАФД in vitro.

2. В клетках нейробластомы SH-SY5Y с транзиентной продукцией а-synA53T или со стабильно повышенной продукцией а-synWT или а-synA53T формируются ThS-позитивные агрегаты; в лизатах данных клеток активность ГАФД снижена по сравнению с контрольными клетками.

3. Продукция лактата и поглощение глюкозы снижены в клетках нейробластомы SH-SY5Y со стабильно повышенной продукцией а-synWT или а^упА53Т по сравнению с контрольными клетками.

4. Производные гидроксикоричных кислот - феруловая (или 3-метокси-4-гидроксикоричная) кислота, 3-метокси-4-ацетамидоксикоричная кислота и 3,4-диметоксикоричная кислота ингибируют фибриллизацию а-синуклеина не связываясь с мономером а-синуклеина, но предотвращая его фибриллизацию на следующих этапах, формируя мелкие аморфные агрегаты.

9. Степень достоверности данных

Обзор литературы подготовлен с использованием актуальных публикаций по теме диссертации. Данные, представленные в работе, получены с использованием современных молекулярно-биологических и биохимических методик и воспроизводимы. Для выявления значимых отличий между выборками была проведена статистическая обработка

результатов с помощью программного пакета OriginPro (2015). Основные результаты опубликованы в международных рецензируемых журналах.

10. Личный вклад автора

Основные результаты работы были получены самим автором. Личный вклад заключается в анализе научной литературы, планировании и проведении экспериментов, обработке и анализе полученных данных, подготовке статей к публикации, участии в научных конференциях.

Получение клеток, стабильно продуцирующих a-synWT и a-synA53T, было проведено при участии Д.В. Поздышева; изучение ингибирования фибриллизации a-синуклеина производными гидроксикоричных кислот было проведено при участии М.В. Медведевой и К.В. Бариновой; сканирующую ион-проводящую микроскопию и анализ ее результатов проводил В. С. Колмогоров; докинг производных гидроксикоричных кислот к фибриллам а-синуклеина проводил П.И. Семенюк.

11. Публикации по теме научно-квалификационной работы (диссертации)

По материалам диссертации опубликовано 3 экспериментальных и 2 обзорных статьи в рецензируемых журналах, индексируемых в наукометрических базах данных Web of Science и/или Scopus.

Экспериментальные статьи:

А.К. Мельникова, Д.В. Поздышев, К.В. Баринова, С.С. Кудрявцева, В.И. Муронец (2020) Суперпродукция а-синуклеина в клетках нейробластомы приводит к накоплению тиофлавин S-позитивных агрегатов и уменьшению интенсивности гликолиза. Биохимия 85(5):706-717. (IF: 1,978).

M. Medvedeva, K. Barinova, A. Melnikova, P. Semenyuk, V. Kolmogorov, P. Gorelkin, A. Erofeev, V. Muronetz (2020) Naturally occurring cinnamic acid derivatives prevent amyloid transformation of alpha-synuclein. Biochimie 170: 128139. (IF: 3,413).

К.В. Баринова, A.K. Мельникова, E.B. Шмальгаузен, В.И. Муронец (2018) Рациональный подход к получению высокоспецифичных поликлональных антител против рекомбинантного а-синуклеина. Биомед. химия 64(3): 276-282.

Обзорные статьи:

В.И. Муронец, А.К. Мельникова, З.Н. Сефербекова, К.В. Баринова, Е.В. Шмальгаузен (2017) Гликирование, гликолиз и нейродегенеративные заболевания: есть ли взаимосвязь? Биохимия 82 (8): 1138-1153. (IF: 1,978).

V.I. Muronetz, K. Barinova, S. Kudryavtseva, M. Medvedeva, A. Melnikova, I. Sevostyanova, P. Semenyuk, Y. Stroylova, M. Sova (2020) Natural and synthetic derivatives of hydroxycinnamic acid modulating the pathological transformation of amyloidogenic proteins. Molecules, 25 (20): 4647. (IF: 3,267).

12. Апробация работы

Результаты работы были представлены на международных конференциях: The 43rd FEBS Congress (Чехия, Прага, 2018); "BIOMEMBRANES 2018" (Россия, Долгопрудный, 2018), 11th International Conference Structure and Stability of Biomacromolecules (Словакия, Кошице, 2019), VI Съезд физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России, IX Российский симпозиум "Белки и пептиды" (Россия, Дагомыс, 2019), Second Russian International Conference "Cryo-electron microscopy 2019: achievements and prospects" (Россия, Москва, 2019). Часть материалов была защищена в научно-квалификационной работе, подготовленной во время обучения в аспирантуре.

13. Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, основных результатов и выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 191 странице, иллюстрирована 42 рисунками и 2 таблицами. Список цитируемой литературы включает 299 наименований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. а-синуклеин и синуклеинопатии

Белок синуклеин был впервые описан вместе с другими белками, локализующимися в холинергических синапсах электрического органа ската. Затем его ген использовали для скрининга кДНК мозга крысы, где в итоге также обнаружили синуклеин [32]. Он был назван согласно обнаруженной локализации в синапсах («син») и ядерной оболочке («нуклеин»). а-синуклеин человека впервые идентифицировали спустя несколько лет как предшественник одного из пептидов, найденных в амилоидных агрегатах при болезни Альцгеймера [33]. Он оказался гомологом синуклеина ранее найденного у крыс, однако их взаимосвязь не была отмечена сразу. Затем, также независимо, был открыт фосфопротеин 14 в нейронах крысы и быка [34,35]. Наконец, взаимосвязь этих открытий установили, когда предшественник не-Р-амилоидного компонента амилоидных агрегатов и гомолог фосфопротеина быка 14 были получены из клеток мозга человека, и вследствие их локализации в пресинаптических терминалях и 60% гомологии последовательности, были соответственно названы а- и Р-синуклеинами [36]. Еще через несколько лет был очищен и охарактеризован еще один член семейства, у-синуклеин, исходно обнаруженный в раковых клетках молочной железы [37,38]. а- и Р-синуклеины филогенетически ближе друг к другу, чем к у-синуклеину, более близкому к синуклеину, обнаруженному в синапсах электрического органа ската [39]. В нашей работе мы сосредоточились на а-синуклеине, белке, механизм участия которого в развитии синуклеинопатий не до конца понятен, но его большая роль в патогенезе заболевания несомненна.

1.1. Структура а-синуклеина

а-синуклеин - это небольшой белок весом 14,4 кДа, состоящий из 140 аминокислотных остатков у человека и грызунов. В его первичной структуре выделяют три основные части: 1) N-концевой домен, содержащий 11-мерные повторы с высококонсервативным мотивом KXKEGV; 2) NAC-домен (Non-Amyloid в Component of AD amyloid), самый гидрофобный домен, впервые идентифицированный как пептид в амилоидных бляшках при болезни Альцгеймера [33]; 3) C-конец, содержащий большое количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков и остатков пролина (Рис. 1).

Рис. 1. Структура а-синуклеина человека.

а-синуклеин человека состоит из N-концевого домена (1-60 а.о.), гидрофобного NAC-домена (61-95 а.о.) (Non-Amyloid в Component of AD amyloid) и отрицательно заряженного С-концевого домена (96-140 а.о.). N-концевой и NAC-домены включают повторы длиной 11 а.о., содержащие консервативный мотив KXKEGV (заштрихованные прямоугольники 1-7). Данные последовательности участвуют в образовании а-спиралей при взаимодействии белка с клеточной мембраной (а-спираль 1 и 2). Желтые метки обозначают точечные мутации, ассоциированные с повышенной вероятностью развития болезни Паркинсона.

Важно отметить, что в первичной последовательности а-синуклеина нет остатков триптофана и только 4 остатка тирозина, что приводит к низкому молярному коэффициенту поглощения при 280 нм, равному 5960 М-1см-1 согласно расчету в программе Рго1Рагаш [40]. В стуктуре белка также нет остатков цистеина, что исключает образование цистеиновых мультимеров. Остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот, находящиеся на С-конце, определяют его отрицательный заряд и изоэлектрическую точку белка р1 = 4,7

[41].

а-синуклеин не формирует устойчивой третичной структуры и относится к так называемым естественно развернутым белкам [42]. Поскольку в данном случае исследование структуры с помощью рентгеноструктурного анализа невозможно, структуру а-синуклеина изучали с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В том числе была получена структура белка в связанном с мицеллами додецилсульфата натрия (БОБ) виде (Рис. 2) [43], где было показано, что участки У3-У37 и К45-Т92 формируют две антипараллельные спирали, соединенные линкером и связанные с мицеллой, в то время как С-конец белка остается неструктурированным.

АЗО

Рис. 2. Структура а-синуклеина, связанного с 8Б8-мицеллами, полученная с помощью ЯМР спектроскопии (РББ ГО: 1ХОБ).

Красным цветом обозначены точечные мутации, ассоциированные с развитием болезни Паркинсона. Адаптировано из [44].

В формировании связи с мембраной участвуют повторы из 11 а.о. (Рис. 1, заштрихованные прямоугольники 1-7), которые образуют алипопротеин-подобную спираль класса А2. При связывании с мембраной происходит увеличение содержания а-спиралей в белке с менее 1% до 60-70% [45]. Также было показано образование одной длинной а-спирали при связывании с мембранами с большим диаметром и меньшим изгибом [46]. В последние годы стало понятно, что при попытке определения транзиентных вторичных структур в естественно развернутых белках, склонных к агрегации, методом ЯМР спектроскопии, очень важны условия эксперимента, такие как рН, ионная сила, температура, концентрация белка, которые должны быть максимально приближены к физиологическим [47]. В связи с этим можно предположить, что точное определение структуры нативного мономера а-синуклеина и участков связывания с мембраной еще предстоит.

1.2. Функции а-синуклеина

На данный момент а-синуклеин был описан только у позвоночных [48]. У всех позвоночных К-концевой домен очень консервативен и отличается преимущественно количеством 11 -мерных повторов, в то время как С-конец менее консервативен. Сравнительное исследование последовательности и структуры а-синуклеина показало, что аминокислотные остатки 32-58 составляют критически важный участок для сохранения клеточной функции белка и замены в данном участке могут быть патогенными [49].

Экспрессия а-синуклеина наблюдается преимущественно в мозговых тканях (неокортекс, гиппокамп, стриатум, таламус, мозжечок), однако во многих других тканях (мышцы, почки, печень, легкие, сердце, кровеносные сосуды, клетки крови) его присутствие также было обнаружено [50]. В нервных клетках экспрессия а-синуклеина изменяется в течение жизненного цикла: так, у грызунов пик содержания мРНК а-синуклеина наступает через несколько недель после рождения, затем постепенно спадает [51,52]. При этом

содержание белка остается высоким и во взрослом возрасте [52]. В мозговых тканях крысы а-синуклеин составляет 0,5-1% от всех цитозольных белков [53].

В нервных клетках а-синуклеин локализуется преимущественно в пресинаптических терминалях, где входит в состав синаптических везикул. У незрелого нейрона данный белок исходно находится в соме, а затем постепенно переходит в пресинаптические терминали параллельно с синаптофизином, маркером синаптических терминалей [54,55]. Однако, во многих исследованиях была показана и альтернативная локализация а-синуклеина в митохондриях [56-58] и ядре [59,60]. Поскольку подобные описания как правило связаны с индукцией повышенной экспрессии а-синуклеина, функциональное значение подобных находок не до конца ясно.

Поскольку, как будет обсуждено в разделе 1.3 Обзора литературы, а-синуклеин участвует в патогенезе синуклеинопатий, необходимо понимать его физиологическую функцию. Возможно, потеря физиологической функции играет важную роль в развитии заболевания наряду с амилоидными превращениями и сопутствующими им процессами. Несмотря на десятки лет активных исследований, точная роль а-синуклеина до сих пор не ясна, но существует несколько предположений.

Как было отмечено ранее, К-конец а-синуклеина участвует во взаимодействии с мембранами и формировании а-спиралей. Таким образом, белок существует в клетке в виде двух пулов: связанный с мембраной частично структурированный белок и цитозольный неструктурированный [61,62]. Предположения о формировании а-синуклеином растворимых тетрамеров [63,64] были позже опровергнуты [65]. В 2014 году было показано образование а-синуклеином мультимеров при связывании с мембраной [66,67].

В КАС-домене присутствует консенсусная последовательность, состоящая преимущественно из глицина, аланина и валина (ОАУ-мотив), также присутствующая у Р-амилоидного пептида и прионного белка,

склонных к агрегации. Считается, что данный участок белка важен для процессов агрегации и фибриллизации [68].

На С-концевом домене располагается Си2+-связываюший мотив (119-124 а.о.), который относительно консервативен у ортологов а-синуклеина [49]. Предполагают, что связывание меди ускоряет процессы агрегации а-синуклеина [69]. Также С-концевой домен является мишенью многочисленных посттрансляционных модификаций [50], что потенциально регулирует взаимодействие а-синуклеина с другими белками.

Связывание а-синуклеина с мембраной и локализация в пресинаптических терминалях позволили предположить участие данного белка в транспорте синаптических везикул, их рециклинге и/или слиянии с мембраной при экзоцитозе и выбросе нейротрансмиттеров в синаптическую щель. Привлечение а-синуклеина в синапс может быть опосредовано его взаимодействием с везикулярно-ассоциированным белком синаптобревином-2, компонентом комплекса SNARE, осуществляющим некоторые стадии экзоцитоза [70], тем более что при нокауте синаптобревина-2 локализация а-синуклеина в синапсе менее выражена [71].

Предполагаемые функции а-синуклеина включают участие в регуляции транспорта и выброса дофамина, инициации фибриллизации тау-белка, нейропротекции через ингибирование экспрессии р53 и снижении активации проапоптотической каспазы 3 [72], транспорте липидов и биогенезе клеточной мембраны, проявлении шапероноподобной активности. Так, а-синуклеин ингибирует синтез дофамина, регулируя активность и экспрессию тирозингидроксилазы [73,74], а регуляция транспорта дофамина происходит через транспортер VMAT2 [74]. Было неоднократно показано, что а-синуклеин влияет на уровень фосфорилирования тау-белка, и таким образом может быть вовлечен в развитие таупатии и опосредованно регулировать стабильность микротрубочек [75,76]. В пользу участия а-синуклеина в биогенезе и регуляции липидов говорит ингибирование а-синуклеином фосфолипаз D1 и D2 [77,78] и потенциальная способность данного белка к

23

реструктурированию липидной мембраны [79]. Предположение о наличии у а-синуклеина шапероноподобной активности было высказано из-за данных о взаимодействии его свободного неструктурированного С-конца с термоагрегированными белками, приводящем к ингибированию агрегации [80], и его схожести с уже известными шаперонами: белком 14-3-3 [81] и белками малого теплового шока [82]. Более того, негативные последствия нокаута кошаперонина CSP-a, участвующего в экзоцитозе, возможно обратить с помощью повышенной экспрессии а-синуклеина [83], что еще раз подтверждает его участие в экзоцитозе и сборке белкового комплекса SNARE, ключевого для нейротрансмиссии.

Несмотря на накопленные знания о взаимодействиях а-синуклеина с другими компонентами клетки, окончательно его функция не установлена, в том числе потому, что физиологические последствия нокаута а-синуклеина не до конца ясны. Мыши с нокаутом гена а-синуклеина не имели выраженных нарушений функции центральной нервной системы, в том числе оставались в норме выброс и захват дофамина в ответ на электрический стимул [84]. Повышение выброса дофамина происходило только при дополнительной стимуляции повышенным уровнем Ca2+, подтверждая гипотезу об участии а-синуклеина в отрицательной регуляции дофаминовой нейротрансмиссии [84]. Двойной нокаут а- и в-синуклеина также не приводил к выраженным физиологическим последствиям, поддерживая предположение о вторичной роли синуклеинов в поддержании синаптической передачи [85]. Наконец, тройной нокаут (а-, в- и у-синуклеинов) привел к уменьшению размеров пресинаптических терминалей, и, как следствие, к нейродегенерации при старении [86]. Повышенная продукция а-синуклеина также имела негативные последствия: снижение выброса дофамина вследствие нарушений переработки синаптических везикул после эндоцитоза, с очевидным снижением плотности везикул в синапсе [87].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мельникова Александра Кирилловна, 2021 год

он - -

о

олигомеры

X

нет эффекта

1_-лактат

Рис. 34. Предполагаемый механизм взаимодействия ГАФД и а-синуклеина в контексте синуклеинопатии.

Мономеры и олигомеры а-синуклеина, образующиеся при его амилоидной агрегации, взаимодействуют с ГАФД, что приводит к снижению ее дегидрогеназной активности. Это взаимодействие является одним из факторов, приводящих к нарушению гликолиза, а именно к снижению продукции лактата при синуклеинопатиях. Иллюстрация адаптирована из

Таким образом, ограничения в активации гликолиза на уровне ГАФД из-за снижения ее активности могут нести серьезные последствия для энергетического метаболизма в нейронах при синуклеинопатиях.

[298].

7. Ингибирование фибриллизации а-синуклеина

2

производными гидроксикоричных кислот2

Вторая часть нашей работы была посвящена поиску соединений, ингибирующих амилоидную трансформацию а-синуклеина. Подобные соединения, в том числе, могут потенциально нарушать взаимодействие ГАФД и а-синуклеина из-за изменения конформации последнего, предотвращая нарушение гликолиза. Производные гидроксикоричных кислот были эффективны в качестве антиагрегационных соединений для прионного белка [289], а феруловая и кофейная кислоты эффективно предотвращали фибриллизацию а-синуклеина [234,241]. Подробный обзор данных о влиянии производных гидроксикоричных кислот и схожих по строению производных гидроксибензойной кислоты на амилоидную трансформацию а-синуклеина представлен в Обзоре литературы, раздел 2.2.

7.1. Тестирование эффективности 9 производных

гидроксикоричных кислот в предотвращении фибриллизации а-синуклеина

В первую очередь мы протестировали 9 синтетических и природных прозводных ГКК, часть из которых ранее показала эффективность в ингибировании амилоидной трансформации прионного белка [289], на способность к ингибированию фибриллизации а-synWT (Рис. 35). Формулы протестированных соединений представлены в Таблице 2; номера производных в Таблице 2 соответствуют номерам, используемым в дальнейшем на картинках и в тексте. Наиболее эффективно подавляли

2 При подготовке данного раздела диссертации использованы следующие публикации, выполненные автором лично или в соавторстве, в которых, согласно Положению о присуждении ученых степеней в МГУ, отражены основные результаты, положения и выводы исследования: Medvedeva, M., Barinova, K., Melnikova, A., Semenyuk, P., Kolmogorov, V., Gorelkin, P., Erofeev, A., and Muronetz, V. (2020) Naturally occurring cinnamic acid derivatives prevent amyloid transformation of alpha-synuclein. Biochimie, 170:128-139. Личный вклад автора состоит в дизайне всех экспериментов кроме молекулярного докинга и ион-проводящей микроскопии совместно с К.В. Бариновой, а также выполнении этих экспериментов совместно с М.В. Медведевой.

фибриллизацию a-synWT производные L8 (феруловая или 3-метокси-4-гидроксикоричная кислота), для которой уже была показана подобная активность [241], а также ранее неисследованные синтетическое производное ГКК L7 (3-метокси-4-ацетамидоксикоричная кислота) и встречающееся в природе L9 (3,4-ДМКК).

Рис. 35. Тестирование производных ГКК в качестве ингибиторов фибриллизации a-synWT.

а-синуклеин WT инкубировали в PBS, pH 4,0 в концентрации 28 мкМ (0,4 мг/мл) при 370С и постоянном перемешивании 300 об/мин без добавок (а-Syn) или в присутствии 280 мкМ производных ГКК L1-L9 (молярное соотношение лиганд:мономер a-synWT 1:10). Формулы производных перечислены в Таблице 2. В процессе инкубации отбирали аликвоты 5 мкл для измерения флуоресценции ThT (Материалы и методы, раздел 3.3.).

Данные представлены как среднее 3-х измерений ± стандартное отклонение.

Таблица 2. Использованные в работе производные гидроксикоричных кислот.

№

Формула

Название

3-метокси-4-этокси-коричная кислота

2

2,3,4-триметокси-коричная кислота

3

3,4,5-триметокси-коричная кислота

4

3 -этокси-4-изопропилокси-коричная кислота

3,4-метоксиленедиокси-коричная кислота

6

метил-3-этокси-4-ацетамидокси-коричная кислота

7

3-метокси-4-ацетамидокси-коричная кислота

8

3 -метокси-4-гидрокси-коричная (феруловая) кислота

9

3,4-диметокси-коричная кислота (3,4-ДМКК)

1

5

7.2. Предотвращение амилоидной агрегации а-синуклеина тремя производными гидроксикоричных кислот

Для наиболее эффективных ингибиторов фибриллизации а-Буп^Т производных Ь7, Ь8 и Ь9 были проведены дополнительные исследования кинетики ингибирования образования амилоидных структур с помощью измерения интенсивности флуоресценции ТИТ (Рис. 36, А) и агрегации по изменению мутности раствора при 400 нм (Рис. 36, Б).

1-1-I-1-1-'-1-1-1-1-I-1 —I-1-1-1-1-1-1-'-1-1-г

0 2 13 25 42 48 0 2 18 25 42 48

Время, ч Время, ч

Рис. 36. Влияние производных ДКК на амилоидную трансформацию (А) и агрегацию (Б) a-synWT.

а-синуклеин WT инкубировали в PBS, pH 4,0 в концентрации 28 мкМ (0,4 мг/мл) при 370С и постоянном перемешивании 300 об/мин без добавок (а-Syn) или в присутствии 280 мкМ производных ГКК L7 (•), L8 (♦), L9 (▲) (молярное соотношение лиганд:мономер a-synWT 1:10). Данные представлены как среднее 3-х измерений ± стандартное отклонение.

А) В процессе инкубации отбирали аликвоты 5 мкл для измерения флуоресценции (Материалы и методы, раздел 3.3). Б) Мутность образцов измеряли при 400 нм.

В то время как 10-кратный избыток производных по отношению к мономеру а-синуклеина практически полностью подавлял амилоидную трансформацию, возрастание мутности раствора исследуемые соединения предотвращали не полностью, что говорит о формировании аморфных агрегатов.

Чтобы выяснить, какое из трех производных было наиболее эффективно в предотвращении амилоидной агрегации мы измерили концентрационную зависимость флуоресценции ТИТ через 48 ч после начала фибриллизации а-синуклеина. При помощи полученных кривых ингибирования фибриллизации мы рассчитали константу полумаксимального ингибирования, которая составила 50 мкМ для Ь7, 13 мкМ для Ь8 и 251 мкМ для Ь9 (Рис. 37).

Чтобы предположить возможный механизм действия Ь7-Ь9 мы получили спектры кругового дихроизма мономера а-синуклеина без добавок и в присутствии исследуемых производных. Поскольку спектры мономерного а-синуклеина без и с Ь7-Ь9 не отличались друг от друга (данные не приведены), можно сделать вывод, что взаимодействие лигандов с мономером а-синуклеина если и есть, то кратковременное. С помощью изотермической титрационной калориметрии также не удалось обнаружить взаимодействия Ь7-Ь9 с мономером а-синуклеина. Эти результаты согласуются с данными литературы для близкого по формуле производного гидроксибензойной кислоты, галловой кислоты: в одном исследовании было показано отсутствие взаимодействия с мономерами [237], в то время как другие исследователи считают, галловая кислота вступает только в транзиентные взаимодействия с К- и С-концевыми доменами а-синуклеина [236].

Рис. 37. Дозозависимое ингибирование и расчет полумаксимальной концентрации ингибирования (IC50) фибриллизации a-synWT производными ГКК L7 (A), L8 (Б) и L9 (В).

а-синуклеин WT инкубировали в PBS, pH 4,0 в концентрации 28 мкМ (0,4 мг/мл) при 370С и постоянном перемешивании 300 об/мин без добавок (а-Syn) или в присутствии 30-25000 мкМ производных ГКК L7 (А), L8 (Б), L9 (В) в течение 2-х суток.

Данные представлены как среднее 3-х измерений ± стандартное отклонение. По оси абсцисс отложены десятичные логарифмы использованных концентраций производных ГКК. Значение IC50 рассчитывали в программе OriginPro 8.6 (OriginLab) (Материалы и методы, раздел 8.2).

При еще одной попытке понять механизм воздействия Ь7-Ь9 мы провели докинг производных к доступным структурам фибрилл а-синуклеина: полученным с помощью криоэлектронной микроскопии структурам, соответствующим вытянутой и лентообразной морфологии фибрилл (РОБ ГО 6си7, 6си8) [122] и полученной с помощью твердофазной ЯМР структуре фибрилл из полноразмерного а-синуклеина (РББ ГО 2п0а) [121]. Всего было предсказано 4 потенциальных участка связывания (Рис. 38) (данные получены П.И.Семенюком [299]).

Рис. 38. Молекулярный докинг взаимодействия фибрилл а-синуклеина с производными ГКК Ь7, Ь8 и Ь9.

На картинке представлены предполагаемые участки связывания Ь7, Ь8 и Ь9 с структурами фибрилл а-синуклеина 6си7 (А), 6си8 (Б) и 2п0а (В), а также полученные значения афинности связывания (Г) (Материалы и методы, раздел 8.3). Данные получены П.И.Семенюком [299].

Участки 1 и 1а располагаются внутри «греческого ключа» фибриллы, близко к центральной оси. Связывание в этой области с большой вероятностью может привести к нарушению формирования фибриллярной структуры. Еще три дополнительных участка, важность которых в формировании фибриллярной структуры представляется менее важной, располагаются по бокам от центральной структуры (Рис. 38, участки 3 и 4) и на границе двух протофиламентов (Рис. 38, участок 2).

Если считать, что механизм предотвращения амилоидной агрегации Ь7-Ь9 не включает взаимодействия с мономерами а-синуклеина, то необходимо проверить влияние соединений на промежуточные формы и фибриллы. С помощью спектроскопии кругового дихроизма мы оценили вторичную структуру агрегатов, образующихся в присутствии Ь7 (Рис. 39). Спектр фибрилл а-синуклеина, образованных без добавок, имеет характерную форму на 218-220 нм и 230 нм, соответствующую Р-тяжам и Р-поворотам [282] (Рис. 38, а-Буи). Спектр агрегатов, полученных в присутствии Ь7 свидетельствует об изменении вторичной структуры фибрилл (Рис. 39, +Ь7). Спектр соответствует преимущественно неструктурированному белку с небольшим количеством а-спиралей и Р-поворотов. Таким образом, предположительный механизм действия может включать образование неамилоидных агрегатов, не способных к дальнейшей фибриллизации.

Рис. 39. Спектр кругового дихроизма агрегатов, образованных а-synWT без добавок (а-Syn) и в присутствии 10-кратного молярного избытка 3-метокси-4-ацетамидоксикоричной кислоты (+L7).

а-синуклеин WT инкубировали в PBS, pH 4,0 в концентрации 28 мкМ (0,4 мг/мл) при 370С и постоянном перемешивании 300 об/мин без добавок (ша-Syn) или в присутствии 280 мкМ L7 (^+L7) в течение 2-х суток. Образованные агрегаты отделяли центрифугированием, и ресуспендировали в 10 мМ калий -фосфатном буфере, pH 4.0. Каждый спектр представляет собой усредненные данные 5 сканов (Материалы и методы, раздел 8.5).

Чтобы охарактеризовать получающиеся в присутствии Ь7-Ь9 агрегаты морфологически, мы использовали сканирующую ион-проводящую микроскопию (Рис. 40) (данные получены совместно с В. С. Колмогоровым [299]). Контрольные фибриллы, образованные из а-Буд^Т без добавок, были более чем 10 мкм в длину и до 1,6 мкм в высоту (Рис. 40, А). Длина, высота и средний объем агрегатов уменьшался в присутствии Ь7-Ь9. В присутствии производных ГКК Ь7, Ь8 и Ь9 средняя длина агрегатов составила 4, 2,2 и 2,6 мкм, высота - 0,9, 0,6 и 1,3 мкм соответственно. Средний объем контрольных фибрилл составлял 7,9 мкм3, в то время как в присутствии Ь7, Ь8 и Ь9 он снижался до 0,6, 0,16 и 0,71 мкм3 соответственно.

145

Рис. 40. Сканирующая ион-проводящая микроскопия агрегатов, образованных a-synWT без добавок (А) и в присутствии 10-кратного молярного избытка L7 (Б), L8 (В) или L9 (Г).

а-синуклеин WT инкубировали в PBS, pH 4,0 в концентрации 28 мкМ (0,4 мг/мл) при 370С и постоянном перемешивании 300 об/мин без добавок (А) или в присутствии 280мкМ L7 (Б), L8 (В) или L9(r) в течение 2-х суток. Полученные агрегаты наносили на чашки Петри, покрытые поли-Ь-лизином. Перед микроскопическим исследованием в чашки Петри добавляли 0,5 мМ ThT (Материалы и методы, раздел 8.6). Результаты получены совместно с В. С. Колмогоровым [299].

Одна из самых главных трансформаций, которую должен предотвращать ингибитор амилоидной агрегации, - агрегация мономера в смеси с префибриллярными структурами, «затравками» (так называемый «сидинг»). Для тестирования этой способности у исследуемых производных нами были получены фибриллы a-synWT и a-synA53T, которые затем

140

использовали в качестве «затравки» для амилоидной агрегации мономера. «Затравку» проводили в условиях, в которых агрегация мономера а-синуклеина без добавления фибриллярных форм не происходила (Рис. 41, кривые «мономер а-Буп»). В этих условиях, все три протестированных производных ГКК успешно предотвращали амилоидную агрегацию мономера с префибриллярной затравкой в случае как а-Буп'^Т (Рис. 41, А), так и склонного к агрегации а-БупЛ53Т (Рис. 41, Б).

Рис. 41. Предотвращение амилоидной трансформации мономеров а-synWT (А) и a-synA53T (Б) при добавлении к фибриллярной «затравке» в присутствии производных ГКК L7, L8 и L9.

«Затравку» из фибрилл a-synWT (А) или a-synA53T (Б) добавляли к 28мкМ(0,4 мг/мл) мономерного a-synWT (А) или a-synA53T (Б) в молярном соотношении 1:50 (завтравка:мономер) и инкубировали в PBS, pH 7,4 при 370С и постоянном перемешивании 300 об/мин без добавок (► + «затравка») или в присутствии 10-кратного молярного избытка по отношению к мономеру (280 мкМ) производных ГКК L7 (•+L7), L8 (++L8) или L9(A+L9). В контрольной пробе без добавления «затравки» присутствовал только мономерный a-синуклеин (■). Данные представлены как среднее 3-х измерений ± стандартное отклонение.

Подробный протокол описан в «Материалах и методах», раздел 8.7.

Интересно отметить, что, судя по данным литературы, другое производное ГКК, кофейная кислота, более эффективно предотвращала именно «сидинг», а не агрегацию мономерного а-синуклеина без добавления «затравки» [234].

Если учесть результаты об отсутствии связывания производных с мономерным а-синуклеином, уменьшении размеров получаемых агрегатов (Рис. 40) и изменение их вторичной структуры с обогащенной Р-тяжами на более развернутую (Рис. 39), то наиболее вероятным представляется механизм, согласно которому лиганды связываются с промежуточными формами в процессе агрегации, предотвращая дальнейшую амилоидную трансформацию а-синуклеина.

Для первоначального тестирования токсичности используемых соединений мы измеряли выживаемость клеток нейробластомы БИ-8У5У в присутствии 14-1400 мкМ производных Ь7-Ь9 (Рис. 42). Наибольшая использованная концентрация превышает 1С50 наименее активного соединения Ь9 в 5,6 раз. Ни одно из использованных соединений не было токсично для клеток БИ-8У5У, что подтверждает возможность их дальнейшего тестирования в качестве потенциальных анти-амилоидных соединений. Более того, два из трех охарактеризованных производных ГКК являются природными (Ь8 - феруловая кислота, L9 - 3,4-ДМКК) и обнаруживаются в плазме человека после потребления кофе [226,227].

Эпидемиологические данные об уменьшении вероятности развития БП у людей, потребляющих кофе (подробно рассмотрено в Обзоре литературы, раздел 2.2 «Производные гидроксикоричных кислот») могут свидетельствовать о синергическом эффекте производных ГКК, находящихся в кофейных экстрактах.

Рис. 42. Выживаемость клеток нейробластомы SH-SY5Y в присутствии производных ГКК L7-L9, измеренная по восстановлению красителя резазурина.

К клеткам, рассаженным накануне в 96-луночный планшет по 20 000 клеток/лунка, в свежую культуральную среду добавляли 14-1400 мкМ производных L7, L8 или L9 (7,8,9) или их растворитель PBS, pH 7,4 (контроль) на 24 ч. После инкубации к клеткам добавляли краситель резазурин и по его восстановлению определяли жизнеспособность клеток (Материалы и методы, раздел 8.8). Данные представлены как среднее 3-х измерений ± стандартное отклонение.

Потенциальное связывание исследованных производных ГКК с промежуточными формами при амилоидной агрегации потенциально может нарушать взаимодействие ГАФД и олигомеров а-синуклеина, снижающих ее активность и приводящих к нарушению гликолиза в модели синуклеинопатии (обсуждено в «Результатах и их обсуждении», раздел 6.2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Заболевания, ассоциированные с патологической агрегацией белка а-синуклеина, коллективно называемые синуклеинопатиями, являются социально значимыми заболеваниями [2], вызывающими у пациентов серьезные моторные и когнитивные нарушения. Несмотря на это, многие аспекты патологии, в частности, роль углеводного обмена в развитии синуклеинопатий, на молекулярном уровне неизвестны. Снижение метаболизма глюкозы в мозгу больных БП, зафиксированное in vivo с помощью трейсера [18Р]2-флуоро-2-деокси-0-глюкозы было обнаружено уже начиная с 90-х гг. ХХ века [5-8], однако молекулярные события, лежащие в основе этого явления до сих пор непонятны. При этом повышение концентрации лактата в цереброспинальной жидкости больных БП было зафиксировано с помощью протонной магнитной резонансной спектроскопии, в то время как данные о повышении лактата в мозговой ткани остаются под вопросом [193]. Известно, что при воздействии токсина MPTP, мимикрирующего потерю дофаминергических нейронов, в первую очередь возникает митохондриальная недостаточность, которая компенсируется активацией гликолиза [9-11]. Также известна важная роль пентозофосфатного в поддержании жизнедеятельности нейронов и продукции NADPH [28]. Мало что известно о последствии нарушений в этих метаболических путях несмотря на то, что гликолиз в условиях ограниченного окислительного фосфорилирования в митохондриях является важнейшим поставщиком ATP для клетки.

Целью нашей работы было исследование взаимодействия ГАФД с различными формами а-синуклеина, образующимися в ходе его амилоидной агрегации, возможных последствий этого взаимодействия для гликолитических процессов при синуклеинопатиях и потенциальных путей предотвращения этого взаимодействия.

На первом этапе нами была разработана методика получения рекомбинантного а-синуклеина дикого типа и вызывающего фамильную БП белка с заменой A53T. Мы получили рекомбинантные белки без мутации Y136C, происходящей из-за ошибки трансляции в E. coli. Следующим шагом стало получение и описание свойств олигомеров а-синуклеина. Нами были получены обогащенные олигомерами а-синуклеина фракции, содержащие мономеры, димеры и два высокомолекулярных вида олигомеров. Полученные олигомеры имели вторичную ß-структуру и были токсичны для клеток нейробластомы SH-SY5Y. Мы также получили фибриллы а-синуклеина по ранее разработанным в лаборатории методикам.

На следующем этапе мы протестировали взаимодействие рекомбинантной чГАФД и различных форм а-синуклеина, в результате чего стало понятно, что наибольшую инактивацию ГАФД вызывают олигомерные формы а-синуклеина, следом идут мономеры, и, наконец, фибриллы не вызывали инактивацию фермента.

Наконец, мы сопоставили данные об инактивации ГАФД различными формами а-синуклеина с данными о наличии амилоидных агрегатов, активности ГАФД, поглощении глюкозы и продукции лактата в клетках, продуцирующих а-синуклеин. Наличие корелляции между присутствием тиофлавин S-позитивных амилоидных агрегатов в клетках с инактивацией ГАФД и снижением продукции лактата позволило предположить, что наибольший вклад в инактивацию ГАФД при синуклеинопатиях вносит взаимодействие ГАФД с олигомерами а-синуклеина. Полученные данные подтверждают результаты, полученные на мышиной модели синуклеинопатии: в среднем мозгу мышей, получавших токсин паракват, была повышена концентрация субстрата ГАФД Г-3-Ф, но снижен лактат [27]. Одним из механизмов, по которому происходит снижение гликолитической активности при синуклеинопатиях может быть первичное нарушение в пентозофосфатном пути [28], который в норме поддеживает пул

восстановленного глутатиона, что приводит к частичному окислению ГАФД и ее взаимодействию с а-синуклеином.

На заключительном этапе проекта мы исследовали производные гидроксикоричных кислот, по структуре схожие с «половинкой» эффективного ингибитора фибриллизации куркумина, в качестве потенциальных ингибиторов амилоидной агрегации а-синуклеина. Выбранные в ходе первичного скрининга 3 соединения, а именно феруловую, 3-метокси-4-ацетамидоксикоричную и 3,4-диметоксикоричную кислоты, исследовали более подробно на предмет механизма ингибирования фибриллизации. Скорее всего, данные производные гироксикоричной кислоты связываются с промежуточными формами, образующимися при агрегации а-синуклеина, но не с его мономером. Подобное ингибирование агрегации с образованием неамилоидных агрегатов меньшего размера потенциально применимо и для нарушения взаимодействия ГАФД с различными формами а-синуклеина, приводящего к нарушению протекания гликолиза.

Уже одобренные для других назначений фармацевтические препараты меклизин и теразозин, показали свою эффективность в терапии болезни Паркинсона на клеточных и животных моделях, повышая продукцию фосфофруктокиназы и активность 3-фосфоглицераткиназы соответветственно [14,15]. Таким образом, важным представляется дальнейшее исследование роли еще одного фермента гликолиза - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы - в регуляции энергетического обмена при синуклеинопатиях, в частности изучение взаимодействия ГАФД с претерпевающим патологическую агрегацию а-синуклеином, и потенциальных интервенций, нарушающих это взаимодействие.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Показано, что при олигомеризации in vitro а-синуклеина дикого типа и мутантной формы A53T образуются частично устойчивые к SDS и содержащие Р-тяжи агрегаты с молекулярной массой 190-220 кДа.

2. Установлено, что олигомеры а-синуклеина инактивируют глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД), содержащую частично окисленный остаток цистеина активного центра, более выраженно, чем мономеры а-синуклеина; фибриллы а-синуклеина не вызывают инактивации ГАФД in vitro.

3. Обнаружено, что ThS-позитивные агрегаты формируются в клетках нейробластомы SH-SY5Y с транзиентной продукцией а-БупА53Т или со стабильно повышенной продукцией а-synWT или а-БупА53Т.

4. Продемонстрировано, что активность ГАФД понижена на 17-20% в лизатах клеток нейробластомы SH-SY5Y с транзиентной продукцией а^упА53Т и со стабильно повышенной продукцией а-synWT или а^упА53Т по сравнению с контрольными клетками.

5. Показано, что продукция лактата и поглощение глюкозы снижены у клеток нейробластомы SH-SY5Y со стабильно повышенной продукцией а-synWT на 15±5% и 38±12% соответственно, а при продукции а-synA53T - на 41±24% и 36±25%.

6. Установлено, что производные гидроксикоричных кислот - феруловая (или 3-метокси-4-гидроксикоричная) кислота, 3-метокси-4-ацетамидоксикоричная кислота и 3,4-диметоксикоричная кислота ингибируют фибриллизацию а-синуклеина с константой полумаксимального ингибирования 13, 50 и 250 мкМ соответственно.

7. Показано, что феруловая кислота, 3-метокси-4-ацетамидоксикоричная кислота и 3,4-диметоксикоричная кислота не связываются с мономером а-синуклеина, но предотвращают его фибриллизацию на следующих этапах, формируя мелкие аморфные агрегаты.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своему научному руководителю, заведующему отделом биохимии животной клетки, Владимиру Израилевичу Муронцу за направление исследования, ценные советы и внимательное отношение.

Автор выражает благодарность А.М. Арутюняну, Е.В. Шевалю, В. С. Колмогорову за незаменимую помощь в методических аспектах работы и консультации по интерпретации и обработке полученных данных.

Автор также выражает признательность коллективу отдела биохимии животной клетки, в особенности Д.В. Поздышеву, М.В. Медведевой, К.В. Бариновой и П.И. Семенюку за помощь в выполнении данной работы и создание комфортной атмосферы в лаборатории.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Spillantini, M.G., Schmidt, M.L., Lee, V.M.-Y., Trojanowski, J.Q., Jakes, R., and Goedert, M. (1997) a-Synuclein in Lewy bodies. Nature, 388 (6645), 839-840.

2. de Lau, L.M.L., and Breteler, M.M.B. (2006) Epidemiology of Parkinson's disease. Lancet. Neurol., 5 (6), 525-35.

3. Pacelli, C., Giguere, N., Bourque, M.-J., Levesque, M., Slack, R.S., and Trudeau, L.-E. (2015) Elevated Mitochondrial Bioenergetics and Axonal Arborization Size Are Key Contributors to the Vulnerability of Dopamine Neurons. Curr. Biol., 25 (18), 2349-2360.

4. Bolanos, J.P., and Almeida, A. (2010) The pentose-phosphate pathway in neuronal survival against nitrosative stress. IUBMB Life, 62 (1), 14-8.

5. Berding, G., Odin, P., Brooks, D.J., Nikkhah, G., Matthies, C., Peschel, T., Shing, M., Kolbe, H., van den Hoff, J., Fricke, H., Dengler, R., Samii, M., and Knapp, W.H. (2001) Resting regional cerebral glucose metabolism in advanced Parkinson's disease studied in theoff andon conditions with [18F]FDG-PET. Mov. Disord.., 16 (6), 1014-1022.

6. Piert, M., Koeppe, R.A., Giordani, B., Minoshima, S., and Kuhl, D.E. (1996) Determination of regional rate constants from dynamic FDG-PET studies in Parkinson's disease. J. Nucl. Med., 37 (7), 1115-22.

7. Ma, Y., and Eidelberg, D. (2007) Functional Imaging of Cerebral Blood Flow and Glucose Metabolism in Parkinson's Disease and Huntington's Disease. Mol. Imaging Biol., 9 (4), 223-233.

8. Huang, C., Mattis, P., Perrine, K., Brown, N., Dhawan, V., and Eidelberg, D. (2008) Metabolic abnormalities associated with mild cognitive impairment in Parkinson disease. Neurology, 70 (16 Pt 2), 1470-7.

9. Kang, D., Miyako, K., Kuribayashi, F., Hasegawa, E., Mitsumoto, A., Nagano, T., and Takeshige, K. (1997) Changes of energy metabolism induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+)-Related compounds in rat

pheochromocytoma PC12 cells. Arch. Biochem. Biophys., 337 (1), 75-80.

10. González-Polo, R.A., Soler, G., Alonso, J.C., Rodríguez-Martín, A., and Fuentes, J.M. (2003) MPP+ Causes Inhibition of Cellular Energy Supply in Cerebellar Granule Cells. Neurotoxicology, 24 (2), 219-225.

11. Koga, K., Mori, A., Ohashi, S., Kurihara, N., Kitagawa, H., Ishikawa, M., Mitsumoto, Y., and Nakai, M. (2006) H MRS identifies lactate rise in the striatum of MPTP-treated C57BL/6 mice. Eur. J. Neurosci., 23 (4), 10771081.

12. Bellucci, A., Collo, G., Sarnico, I., Battistin, L., Missale, C., and Spano, P. (2008) Alpha-synuclein aggregation and cell death triggered by energy deprivation and dopamine overload are counteracted by D2/D3 receptor activation. J. Neurochem., 106 (2), 560-577.

13. Herrero-Mendez, A., Almeida, A., Fernández, E., Maestre, C., Moneada, S., and Bolaños, J.P. (2009) The bioenergetic and antioxidant status of neurons is controlled by continuous degradation of a key glycolytic enzyme by APC/C-Cdh1. Nat. Cell Biol., 11(6) (6), 747-52.

14. Hong, C.T., Chau, K., and Schapira, A.H. V (2016) Meclizine-induced enhanced glycolysis is neuroprotective in Parkinson disease cell models. Sci. Rep., 6 (1), 25344.

15. Cai, R., Zhang, Y., Simmering, J.E., Schultz, J.L., Li, Y., Fernandez-Carasa, I., Consiglio, A., Raya, A., Polgreen, P.M., Narayanan, N.S., Yuan, Y., Chen, Z., Su, W., Han, Y., Zhao, C., Gao, L., Ji, X., Welsh, M.J., and Liu, L. (2019) Enhancing glycolysis attenuates Parkinson's disease progression in models and clinical databases. J. Clin. Invest., 129 (10), 4539-4549.

16. Tsuchiya, K., Tajima, H., Kuwae, T., Takeshima, T., Nakano, T., Tanaka, M., Sunaga, K., Fukuhara, Y., Nakashima, K., Ohama, E., Mochizuki, H., Mizuno, Y., Katsube, N., and Ishitani, R. (2005) Pro-apoptotic protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promotes the formation of Lewy body-like inclusions. Eur. J. Neurosci., 21 (2), 317-326.

17. Oláh, J., Tokési, N., Vincze, O., Horváth, I., Lehotzky, A., Erdei, A., Szájli,

156

E., Medzihradszky, K.F., Orosz, F., Kovács, G.G., and Ovádi, J. (2006) Interaction of TPPP/p25 protein with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and their co-localization in Lewy bodies. FEBSLett., 580 (25), 5807-5814.

18. Barinova, K., Khomyakova, E., Semenyuk, P., Schmalhausen, E., and Muronetz, V. (2018) Binding of alpha-synuclein to partially oxidized glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase induces subsequent inactivation of the enzyme. Arch. Biochem. Biophys., 642, 10-22.

19. Semenyuk, P., Barinova, K., and Muronetz, V. (2019) Glycation of a-synuclein amplifies the binding with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Int. J. Biol. Macromol., 127, 278-285.

20. Gómez, A., and Ferrer, I. (2009) Increased oxidation of certain glycolysis and energy metabolism enzymes in the frontal cortex in Lewy body diseases. J. Neurosci. Res., 87 (4), 1002-13.

21. Sofic, E., Lange, K.W., Jellinger, K., and Riederer, P. (1992) Reduced and oxidized glutathione in the substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Neurosci. Lett., 142 (2), 128-130.

22. Basma, A.N., Heikkila, R.E., Saporito, M.S., Philbert, M., Geller, H.M., and Nicklas, W.J. (1992) 1-Methyl-4-(2'-ethylphenyl)-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced toxicity in PC12 cells is enhanced by preventing glycolysis. J. Neurochem., 58 (3), 1052-9.

23. Chalmers-Redman, R.M., Fraser, A.D., Carlile, G.W., Pong, A., and Tatton, W.G. (1999) Glucose protection from MPP+-induced apoptosis depends on mitochondrial membrane potential and ATP synthase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 257 (2), 440-7.

24. Storch, A., Kaftan, A., Burkhardt, K., and Schwarz, J. (2000) 1 -Methyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline (salsolinol) is toxic to dopaminergic neuroblastoma SH-SY5Y cells via impairment of cellular energy metabolism. Brain Res., 855 (1), 67-75.

25. Mazzio, E., and Soliman, K.F.A. (2003) The role of glycolysis and

157

gluconeogenesis in the cytoprotection of neuroblastoma cells against 1-methyl 4-phenylpyridinium ion toxicity. Neurotoxicology, 24 (1), 137-147.

26. Lei, S., Zavala-Flores, L., Garcia-Garcia, A., Nandakumar, R., Huang, Y., Madayiputhiya, N., Stanton, R.C., Dodds, E.D., Powers, R., and Franco, R. (2014) Alterations in energy/redox metabolism induced by mitochondrial and environmental toxins: A specific role for glucose-6-phosphate-dehydrogenase and the pentose phosphate pathway in paraquat toxicity. ACS Chem. Biol., 9 (9), 2032-2048.

27. Anandhan, A., Lei, S., Levytskyy, R., Pappa, A., Panayiotidis, M.I., Cerny, R.L., Khalimonchuk, O., Powers, R., and Franco, R. (2017) Glucose Metabolism and AMPK Signaling Regulate Dopaminergic Cell Death Induced by Gene (a-Synuclein)-Environment (Paraquat) Interactions. Mol. Neurobiol, 54 (5), 3825-3842.

28. Jiang, P., Gan, M., Ebrahim, A.S., Castanedes-casey, M., Dickson, D.W., and Yen, S.C. (2013) Adenosine monophosphate-activated protein kinase overactivation leads to accumulation of a -synuclein oligomers and decrease of neurites. Neurobiol. Aging, 34 (5), 1504-1515.

29. Ono, K., and Yamada, M. (2006) Antioxidant compounds have potent anti-fibrillogenic and fibril-destabilizing effects for a-synuclein fibrils in vitro. J. Neurochem., 97 (1), 105-115.

30. Di Giovanni, S., Eleuteri, S., Paleologou, K.E., Yin, G., Zweckstetter, M., Carrupt, P.A., and Lashuel, H.A. (2010) Entacapone and tolcapone, two catechol O-methyltransferase inhibitors, block fibril formation of a-synuclein and P-amyloid and protect against amyloid-induced toxicity. J. Biol. Chem., 285 (20), 14941-14954.

31. Fazili, N.A., and Naeem, A. (2015) Anti-fibrillation potency of caffeic acid against an antidepressant induced fibrillogenesis of human a-synuclein: Implications for Parkinson's disease. Biochimie, 108, 178-185.

32. Maroteaux, L., Campanelli, J.T., and Scheller, R.H. (1988) Synuclein: A neuron-specific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve

158

terminal. J. Neurosci, 8 (8), 2804-2815.

33. Ueda, K., Fukushima, H., Masliah, E., Xia, Y.U., Iwai, A., Yoshimoto, M., Otero, D.A.C., Kondo, J., Ihara, Y., and Saitoh, T. (1993) Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease (neurodegeneration/chaperone/amyloid P/A4 protein/neuritic plaque). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11282-11286.

34. Tobe, T., Nakajo, S., Tanaka, A., Mitoya, A., Omata, K., Nakaya, K., Tomita, M., and Nakamura, Y. (1992) Cloning and characterization of the cDNA encoding a novel brain-specific 14-kDa protein. J. Neurochem., 59 (5), 1624-9.

35. Nakajo, S., Tsukada, K., Omata, K., Nakamura, Y., and Nakaya, K. (1993) A new brain-specific 14-kDa protein is a phosphoprotein. Its complete amino acid sequence and evidence for phosphorylation. Eur. J. Biochem., 217 (3), 1057-63.

36. Jakes, R., Spillantini, M.G., and Goedert, M. (1994) Identification of two distinct synucleins from human brain. FEBSLett., 345 (1), 27-32.

37. Ji, H., Liu, Y.E., Jia, T., Wang, M., Liu, J., Xiao, G., Joseph, B.K., Rosen, C., and Shi, Y.E. (1997) Identification of a breast cancer-specific gene, BCSG1, by direct differential cDNA sequencing. Cancer Res., 57 (4), 759-64.

38. Lavedan, C., Leroy, E., Dehejia, A., Buchholtz, S., Dutra, A., Nussbaum, R.L., and Polymeropoulos, M.H. (1998) Identification, localization and characterization of the human gamma-synuclein gene. Hum. Genet., 103 (1), 106-12.

39. Lavedan, C. (1998) The synuclein family. Genome Res., 8 (9), 871-80.

40. Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M.R., Appel, R.D., and Bairoch, A. (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server, in The Proteomics Protocols Handbook (eds.Walker, J.M.), Humana Press, pp. 571-607.

41. Hoyer, W., Antony, T., Cherny, D., Heim, G., Jovin, T.M., and Subramaniam, V. (2002) Dependence of a-synuclein aggregate morphology

159

on solution conditions. J. Mol. Biol., 322 (2), 383-393.

42. Weinreb, P.H., Zhen, W., Poon, A.W., Conway, K.A., and Lansbury, P.T. (1996) NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry, 35 (43), 13709-15.

43. Ulmer, T.S., Bax, A., Cole, N.B., and Nussbaum, R.L. (2005) Structure and dynamics of micelle-bound human a-synuclein. J. Biol. Chem., 280 (10), 9595-9603.

44. Kara, E., Lewis, P.A., Ling, H., Proukakis, C., Houlden, H., and Hardy, J. (2013) a-Synuclein mutations cluster around a putative protein loop. Neurosci. Lett., 546, 67-70.

45. Perrin, R.J., Woods, W.S., Clayton, D.F., and George, J.M. (2000) Interaction of human alpha-synuclein and Parkinson's disease variants with phospholipids. Structural analysis using site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 275 (44), 34393-8.

46. Trexler, A.J., and Rhoades, E. (2009) Alpha-synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry, 48 (11), 2304-6.

47. Kim, D.H., Lee, J., Mok, K.H., Lee, J.H., and Han, K.H. (2020) Salient features of monomeric alpha-synuclein revealed by NMR spectroscopy. Biomolecules, 10 (3), 1-15.

48. George, J.M. (2002) The synucleins. Genome Biol., 3 (1), REVIEWS3002.

49. Siddiqui, I.J., Pervaiz, N., and Abbasi, A.A. (2016) The Parkinson Disease gene SNCA: Evolutionary and structural insights with pathological implication. Sci. Rep., 6 (1), 24475.

50. Burre, J., Sharma, M., and Sudhof, T.C. (2018) Cell biology and pathophysiology of a-synuclein. Cold Spring Harb. Perspect. Med., 8 (3), 128.

51. Kholodilov, N.G., Neystat, M., Oo, T.F., Lo, S.E., Larsen, K.E., Sulzer, D.,

and Burke, R.E. (1999) Increased expression of rat synuclein in the

substantia nigra pars compacta identified by mRNA differential display in a

model of developmental target injury. J. Neurochem., 73 (6), 2586-99.

160

52. Petersen, K., Olesen, O.F., and Mikkelsen, J.D. (1999) Developmental expression of alpha-synuclein in rat hippocampus and cerebral cortex. Neuroscience, 91 (2), 651-9.

53. Iwai, A., Masliah, E., Yoshimoto, M., Ge, N., Flanagan, L., Rohan de Silva, H.A., Kittel, A., and Saitoh, T. (1995) The precursor protein of non-Aß component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron, 14 (2), 467-475.

54. Bayer, T.A., Jäkälä, P., Hartmann, T., Egensperger, R., Buslei, R., Falkai, P., and Beyreuther, K. (1999) Neural expression profile of alpha-synuclein in developing human cortex. Neuroreport, 10 (13), 2799-803.

55. Galvin, J.E., Schuck, T.M., Lee, V.M., and Trojanowski, J.Q. (2001) Differential expression and distribution of alpha-, beta-, and gamma-synuclein in the developing human substantia nigra. Exp. Neurol., 168 (2), 347-55.

56. Li, W.-W., Yang, R., Guo, J.-C., Ren, H.-M., Zha, X.-L., Cheng, J.-S., and Cai, D.-F. (2007) Localization of alpha-synuclein to mitochondria within midbrain of mice. Neuroreport, 18 (15), 1543-6.

57. Devi, L., Raghavendran, V., Prabhu, B.M., Avadhani, N.G., and Anandatheerthavarada, H.K. (2008) Mitochondrial import and accumulation of alpha-synuclein impair complex I in human dopaminergic neuronal cultures and Parkinson disease brain. J. Biol. Chem., 283 (14), 9089-100.

58. Nakamura, K., Nemani, V.M., Wallender, E.K., Kaehlcke, K., Ott, M., and Edwards, R.H. (2008) Optical reporters for the conformation of alpha-synuclein reveal a specific interaction with mitochondria. J. Neurosci., 28 (47), 12305-17.

59. Yu, S., Li, X., Liu, G., Han, J., Zhang, C., Li, Y., Xu, S., Liu, C., Gao, Y., Yang, H., Ueda, K., and Chan, P. (2007) Extensive nuclear localization of alpha-synuclein in normal rat brain neurons revealed by a novel monoclonal antibody. Neuroscience, 145 (2), 539-55.

60. Kontopoulos, E., Parvin, J.D., and Feany, M.B. (2006) Alpha-synuclein acts

161

in the nucleus to inhibit histone acetylation and promote neurotoxicity. Hum. Mol. Genet., 15 (20), 3012-23.

61. Kim, J. (1997) Evidence that the precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid (NACP) has an extended structure primarily composed of random-coil. Mol. Cells, 7 (1), 78-83.

62. Fauvet, B., Mbefo, M.K., Fares, M.-B., Desobry, C., Michael, S., Ardah, M.T., Tsika, E., Coune, P., Prudent, M., Lion, N., Eliezer, D., Moore, D.J., Schneider, B., Aebischer, P., El-Agnaf, O.M., Masliah, E., and Lashuel, H.A.

(2012) a-Synuclein in central nervous system and from erythrocytes, mammalian cells, and Escherichia coli exists predominantly as disordered monomer. J. Biol. Chem., 287 (19), 15345-64.

63. Bartels, T., Choi, J.G., and Selkoe, D.J. (2011) a-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature, 477 (7362), 107-10.

64. Wang, W., Perovic, I., Chittuluru, J., Kaganovich, A., Nguyen, L.T.T., Liao, J., Auclair, J.R., Johnson, D., Landeru, A., Simorellis, A.K., Ju, S., Cookson, M.R., Asturias, F.J., Agar, J.N., Webb, B.N., Kang, C., Ringe, D., Petsko, G.A., Pochapsky, T.C., and Hoang, Q.Q. (2011) A soluble a-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 108 (43), 17797-802.

65. Burre, J., Vivona, S., Diao, J., Sharma, M., Brunger, A.T., and Sudhof, T.C.

(2013) Properties of native brain a-synuclein. Nature, 498 (7453), 1-6.

66. Burre, J., Sharma, M., and Sudhof, T.C. (2014) a-Synuclein assembles into higher-order multimers upon membrane binding to promote SNARE complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 111 (40), E4274-83.

67. Wang, L., Das, U., Scott, D.A., Tang, Y., McLean, P.J., and Roy, S. (2014) a-Synuclein Multimers Cluster Synaptic Vesicles and Attenuate Recycling. Curr. Biol., 24 (19), 2319-2326.

68. Uversky, V.N., and Fink, A.L. (2002) Amino acid determinants of alpha-

synuclein aggregation: putting together pieces of the puzzle. FEBSLett., 522

162

(1-3), 9-13.

69. Breydo, L., Wu, J.W., and Uversky, V.N. (2012) A-synuclein misfolding and Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta, 1822 (2), 261-85.

70. Burre, J., Sharma, M., Tsetsenis, T., Buchman, V., Etherton, M.R., and Sudhof, T.C. (2010) Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro. Science, 329 (5999), 1663-7.

71. Burre, J., Sharma, M., and Sudhof, T.C. (2012) Systematic mutagenesis of a-synuclein reveals distinct sequence requirements for physiological and pathological activities. J. Neurosci., 32 (43), 15227-42.

72. Alves Da Costa, C., Paitel, E., Vincent, B., and Checler, F. (2002) Alpha-synuclein lowers p53-dependent apoptotic response of neuronal cells. Abolishment by 6-hydroxydopamine and implication for Parkinson's disease. J. Biol. Chem., 277 (52), 50980-4.

73. Perez, R.G., Waymire, J.C., Lin, E., Liu, J.J., Guo, F., and Zigmond, M.J. (2002) A Role for a-Synuclein in the Regulation of Dopamine Biosynthesis. J. Neurosci., 22 (8), 3090-3099.

74. Yu, S., Zuo, X., Li, Y., Zhang, C., Zhou, M., Zhang, Y.A., Ueda, K., and Chan, P. (2004) Inhibition of tyrosine hydroxylase expression in alpha-synuclein-transfected dopaminergic neuronal cells. Neurosci. Lett., 367 (1), 34-9.

75. Jensen, P.H., Hager, H., Nielsen, M.S., Hojrup, P., Gliemann, J., and Jakes, R. (1999) alpha-synuclein binds to Tau and stimulates the protein kinase A-catalyzed tau phosphorylation of serine residues 262 and 356. J. Biol. Chem., 274 (36), 25481-9.

76. Haggerty, T., Credle, J., Rodriguez, O., Wills, J., Oaks, A.W., Masliah, E., and Sidhu, A. (2011) Hyperphosphorylated Tau in an a-synuclein-overexpressing transgenic model of Parkinson's disease. Eur. J. Neurosci., 33 (9), 1598-610.

77. Ahn, B.-H., Rhim, H., Kim, S.Y., Sung, Y.-M., Lee, M.-Y., Choi, J.-Y., Wolozin, B., Chang, J.-S., Lee, Y.H., Kwon, T.K., Chung, K.C., Yoon, S.-H.,

163

Hahn, S.J., Kim, M.-S., Jo, Y.-H., and Min, D.S. (2002) alpha-Synuclein interacts with phospholipase D isozymes and inhibits pervanadate-induced phospholipase D activation in human embryonic kidney-293 cells. J. Biol. Chem., 277 (14), 12334-42.

78. Gorbatyuk, O.S., Li, S., Nguyen, F.N., Manfredsson, F.P., Kondrikova, G., Sullivan, L.F., Meyers, C., Chen, W., Mandel, R.J., and Muzyczka, N. (2010) a-Synuclein Expression in Rat Substantia Nigra Suppresses Phospholipase D2 Toxicity and Nigral Neurodegeneration. Mol. Ther., 18 (10), 1758-1768.

79. Ouberai, M.M., Wang, J., Swann, M.J., Galvagnion, C., Guilliams, T., Dobson, C.M., and Welland, M.E. (2013) a-Synuclein Senses Lipid Packing Defects and Induces Lateral Expansion of Lipids Leading to Membrane Remodeling. J. Biol. Chem., 288 (29), 20883-20895.

80. Rekas, A., Adda, C.G., Andrew Aquilina, J., Barnham, K.J., Sunde, M., Galatis, D., Williamson, N.A., Masters, C.L., Anders, R.F., Robinson, C. V, Cappai, R., and Carver, J.A. (2004) Interaction of the molecular chaperone alphaB-crystallin with alpha-synuclein: effects on amyloid fibril formation and chaperone activity. J. Mol. Biol., 340 (5), 1167-83.

81. Ostrerova, N., Petrucelli, L., Farrer, M., Mehta, N., Choi, P., Hardy, J., and Wolozin, B. (1999) a-Synuclein Shares Physical and Functional Homology with 14-3-3 Proteins. J. Neurosci., 19 (14), 5782-5791.

82. Kim, T.D., Choi, E., Rhim, H., Paik, S.R., and Yang, C.-H. (2004) Alpha-synuclein has structural and functional similarities to small heat shock proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 324 (4), 1352-9.

83. Chandra, S., Gallardo, G., Fernández-Chacón, R., Schlüter, O.M., and Südhof, T.C. (2005) Alpha-synuclein cooperates with CSPalpha in preventing neurodegeneration. Cell, 123 (3), 383-96.

84. Abeliovich, A., Schmitz, Y., Fariñas, I., Choi-Lundberg, D., Ho, W.H., Castillo, P.E., Shinsky, N., Verdugo, J.M., Armanini, M., Ryan, A., Hynes, M., Phillips, H., Sulzer, D., and Rosenthal, A. (2000) Mice lacking alpha-synuclein display functional deficits in the nigrostriatal dopamine system.

164

Neuron, 25 (1), 239-52.

85. Chandra, S., Fornai, F., Kwon, H.-B., Yazdani, U., Atasoy, D., Liu, X., Hammer, R.E., Battaglia, G., German, D.C., Castillo, P.E., and Südhof, T.C. (2004) Double-knockout mice for alpha- and beta-synucleins: effect on synaptic functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101 (41), 14966-71.

86. Greten-Harrison, B., Polydoro, M., Morimoto-Tomita, M., Diao, L., Williams, A.M., Nie, E.H., Makani, S., Tian, N., Castillo, P.E., Buchman, V.L., and Chandra, S.S. (2010) aßy-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 107 (45), 19573-8.

87. Nemani, V.M., Lu, W., Berge, V., Nakamura, K., Onoa, B., Lee, M.K., Chaudhry, F.A., Nicoll, R.A., and Edwards, R.H. (2010) Increased Expression of a-Synuclein Reduces Neurotransmitter Release by Inhibiting Synaptic Vesicle Reclustering after Endocytosis. Neuron.

88. Peng, C., Gathagan, R.G., Dustin, C., Medellin, C., Stieber, A., Robinson, J., Zhang, B., Pitkin, R., Olufemi, M., Luk, K., Trojanowski, J., and Lee, V.M.Y. (2018) Cellular Milieu Imparts Distinct Pathological a-Synuclein Strains in a-Synucleinopathies. Nature, 557 (7706), 558-563.

89. Lewy, F. (1912) Paralysis Agitans Pathologische Anatomie, in Handbuch der Neurologie, Springer- Verlag, Berlin, pp. 920-933.

90. Goedert, M., Spillantini, M.G., Del Tredici, K., and Braak, H. (2013) 100 years of Lewy pathology. Nat. Rev. Neurol., 9 (1), 13-24.

91. Roberts, H.L., and Brown, D.R. (2015) Seeking a mechanism for the toxicity of oligomeric a-synuclein. Biomolecules, 5 (2), 282-305.

92. Hamilton, R.L. (2006) Lewy Bodies in Alzheimer's Disease: A Neuropathological Review of 145 Cases Using a-Synuclein Immunohistochemistry. Brain Pathol., 10 (3), 378-384.

93. Toledo, J.B., Gopal, P., Raible, K., Irwin, D.J., Brettschneider, J., Sedor, S., Waits, K., Boluda, S., Grossman, M., Van Deerlin, V.M., Lee, E.B., Arnold, S.E., Duda, J.E., Hurtig, H., Lee, V.M.-Y., Adler, C.H., Beach, T.G., and

165

Trojanowski, J.Q. (2016) Pathological a-synuclein distribution in subjects with coincident Alzheimer's and Lewy body pathology. Acta Neuropathol., 131 (3), 393-409.

94. Larson, M.E., Sherman, M.A., Greimel, S., Kuskowski, M., Schneider, J.A., Bennett, D.A., and Lesne, S.E. (2012) Soluble -Synuclein Is a Novel Modulator of Alzheimer's Disease Pathophysiology. J. Neurosci., 32 (30), 10253-10266.

95. Parkinson, J. (1817) An essay on shaking palsy, London.

96. Fanciulli, A., and Wenning, G.K. (2015) Multiple-system atrophy. N. Engl. J. Med., 372 (3), 249-263.

97. Polymeropoulos, M.H., Lavedan, C., Leroy, E., Ide, S.E., Dehejia, A., Dutra, A., Pike, B., Root, H., Rubenstein, J., Boyer, R., Stenroos, E.S., Chandrasekharappa, S., Athanassiadou, A., Papapetropoulos, T., Johnson, W.G., Lazzarini, A.M., Duvoisin, R.C., Di lorio, G., Golbe, L.I., and Nussbaum, R.L. (1997) Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson's disease. Science, 276 (5321), 2045-7.

98. Krüger, R., Kuhn, W., Müller, T., Woitalla, D., Graeber, M., Kösel, S., Przuntek, H., Epplen, J.T., Schöls, L., and Riess, O. (1998) Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat. Genet., 18 (2), 106-8.

99. Zarranz, J.J., Alegre, J., Gómez-Esteban, J.C., Lezcano, E., Ros, R., Ampuero, I., Vidal, L., Hoenicka, J., Rodriguez, O., Atarés, B., Llorens, V., Gomez Tortosa, E., del Ser, T., Muñoz, D.G., and de Yebenes, J.G. (2004) The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia. Ann. Neurol., 55 (2), 164-73.

100. Appel-Cresswell, S., Vilarino-Guell, C., Encarnacion, M., Sherman, H., Yu, I., Shah, B., Weir, D., Thompson, C., Szu-Tu, C., Trinh, J., Aasly, J.O., Rajput, A., Rajput, A.H., Jon Stoessl, A., and Farrer, M.J. (2013) Alpha-synuclein p.H50Q, a novel pathogenic mutation for Parkinson's disease. Mov. Disord., 28 (6), 811-813.

101. Proukakis, C., Houlden, H., and Schapira, A.H. (2013) Somatic alpha-synuclein mutations in Parkinson's disease: Hypothesis and preliminary data. Mov. Disord.., 28 (6), 705-712.

102. Lesage, S., Anheim, M., Letournel, F., Bousset, L., Honoré, A., Rozas, N., Pieri, L., Madiona, K., Dürr, A., Melki, R., Verny, C., Brice, A., and French Parkinson's Disease Genetics Study Group (2013) G51D a-synuclein mutation causes a novel parkinsonian-pyramidal syndrome. Ann. Neurol., 73 (4), 459-71.

103. Hoffman-Zacharska, D., Koziorowski, D., Ross, O.A., Milewski, M., Poznanski, J., Jurek, M., Wszolek, Z.K., Soto-Ortolaza, A., Slawek, J., Janik, P., Jamrozik, Z., Potulska-Chromik, A., Jasinska-Myga, B., Opala, G., Krygowska-Wajs, A., Czyzewski, K., Dickson, D.W., Bal, J., and Friedman, A. (2013) Novel A18T and pA29S substitutions in a-synuclein may be associated with sporadic Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord.., 19 (11), 1057-1060.

104. Singleton, A.B. (2003) -Synuclein Locus Triplication Causes Parkinson's Disease. Science (80-. )., 302 (5646), 841-841.

105. Devine, M.J., Gwinn, K., Singleton, A., and Hardy, J. (2011) Parkinson's disease and a-synuclein expression. Mov. Disord.., 26 (12), 2160-2168.

106. Uversky, V.N., and Fink, A.L. (2004) Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded. Biochim. Biophys. Acta - Proteins Proteomics, 1698 (2), 131-153.

107. Uversky, V.N., Li, J., and Fink, A.L. (2001) Evidence for a Partially Folded Intermediate in a-Synuclein Fibril Formation. J. Biol. Chem., 276 (14), 10737-10744.

108. Fink, A.L. (2006) The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Acc. Chem. Res., 39 (9), 628-34.

109. Morris, A.M., Watzky, M.A., Agar, J.N., and Finke, R.G. (2008) Fitting neurological protein aggregation kinetic data via a 2-step, minimal/"Ockham's razor" model: the Finke-Watzky mechanism of

167

nucleation followed by autocatalytic surface growth. Biochemistry, 47 (8), 2413-27.

110. Conway, K.A., Harper, J.D., and Lansbury, P.T. (2000) Fibrils formed in vitro from alpha-synuclein and two mutant forms linked to Parkinson's disease are typical amyloid. Biochemistry, 39 (10), 2552-63.

111. Lashuel, H.A., Petre, B.M., Wall, J., Simon, M., Nowak, R.J., Walz, T., and Lansbury, P.T. (2002) a-Synuclein, Especially the Parkinson's Disease-associated Mutants, Forms Pore-like Annular and Tubular Protofibrils. J. Mol. Biol., 322 (5), 1089-1102.

112. Marvian, A.T., Koss, D.J., Aliakbari, F., Morshedi, D., and Outeiro, T.F. (2019) In vitro models of synucleinopathies: informing on molecular mechanisms and protective strategies. J. Neurochem., 150 (5), 535-565.

113. Kaylor, J., Bodner, N., Edridge, S., Yamin, G., Hong, D.-P., and Fink, A.L. (2005) Characterization of oligomeric intermediates in alpha-synuclein fibrillation: FRET studies of Y125W/Y133F/Y136F alpha-synuclein. J. Mol. Biol., 353 (2), 357-72.

114. Iljina, M., Garcia, G.A., Horrocks, M.H., Tosatto, L., Choi, M.L., Ganzinger, K.A., Abramov, A.Y., Gandhi, S., Wood, N.W., Cremades, N., Dobson, C.M., Knowles, T.P.J., and Klenerman, D. (2016) Kinetic model of the aggregation of alpha-synuclein provides insights into prion-like spreading. Proc. Natl. Acad. Sci., 113 (9), E1206-E1215.

115. Breydo, L., and Uversky, V.N. (2015) Structural, morphological, and functional diversity of amyloid oligomers. FEBSLett., 589 (19), 2640-2648.

116. Giehm, L., Svergun, D.I., Otzen, D.E., and Vestergaard, B. (2011) Low-resolution structure of a vesicle disrupting -synuclein oligomer that accumulates during fibrillation. Proc. Natl. Acad. Sci., 108 (8), 3246-3251.

117. Chen, S.W., Drakulic, S., Deas, E., Ouberai, M., Aprile, F.A., Arranz, R.,

Ness, S., Roodveldt, C., Guilliams, T., De-Genst, E.J., Klenerman, D., Wood,

N.W., Knowles, T.P.J., Alfonso, C., Rivas, G., Abramov, A.Y., Valpuesta,

J.M., Dobson, C.M., and Cremades, N. (2015) Structural characterization of

168

toxic oligomers that are kinetically trapped during a-synuclein fibril formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 112 (16), E1994-2003.

118. Bousset, L., Pieri, L., Ruiz-Arlandis, G., Gath, J., Jensen, P.H., Habenstein,

B., Madiona, K., Olieric, V., Böckmann, A., Meier, B.H., and Melki, R. (2013) Structural and functional characterization of two alpha-synuclein strains. Nat. Commun., 4 (1), 2575.

119. Strohäker, T., Jung, B.C., Liou, S.-H., Fernandez, C.O., Riedel, D., Becker, S., Halliday, G.M., Bennati, M., Kim, W.S., Lee, S.-J., and Zweckstetter, M. (2019) Structural heterogeneity of a-synuclein fibrils amplified from patient brain extracts. Nat. Commun., 10 (1), 5535.

120. Rodriguez, J.A., Ivanova, M.I., Sawaya, M.R., Cascio, D., Reyes, F.E., Shi, D., Sangwan, S., Guenther, E.L., Johnson, L.M., Zhang, M., Jiang, L., Arbing, M.A., Nannenga, B.L., Hattne, J., Whitelegge, J., Brewster, A.S., Messerschmidt, M., Boutet, S., Sauter, N.K., Gonen, T., and Eisenberg, D.S. (2015) Structure of the toxic core of a-synuclein from invisible crystals. Nature, 525 (7570), 486-490.

121. Tuttle, M.D., Comellas, G., Nieuwkoop, A.J., Covell, D.J., Berthold, D.A., Kloepper, K.D., Courtney, J.M., Kim, J.K., Barclay, A.M., Kendall, A., Wan, W., Stubbs, G., Schwieters, C.D., Lee, V.M.Y., George, J.M., and Rienstra,

C.M. (2016) Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human a-synuclein. Nat. Struct. Mol. Biol., 23 (5), 409-415.

122. Li, B., Ge, P., Murray, K.A., Sheth, P., Zhang, M., Nair, G., Sawaya, M.R., Shin, W.S., Boyer, D.R., Ye, S., Eisenberg, D.S., Zhou, Z.H., and Jiang, L. (2018) Cryo-EM of full-length a-synuclein reveals fibril polymorphs with a common structural kernel. Nat. Commun., 9 (1), 3609.

123. Bertoncini, C.W., Jung, Y.-S., Fernandez, C.O., Hoyer, W., Griesinger, C., Jovin, T.M., and Zweckstetter, M. (2005) From The Cover: Release of longrange tertiary interactions potentiates aggregation of natively unstructured -synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci., 102 (5), 1430-1435.

124. Crowther, R.A., Jakes, R., Spillantini, M.G., and Goedert, M. (1998)

169

Synthetic filaments assembled from C-terminally truncated a-synuclein. FEBSLett., 436 (3), 309-312.

125. Chen, L., and Feany, M.B. (2005) Alpha-synuclein phosphorylation controls neurotoxicity and inclusion formation in a Drosophila model of Parkinson disease. Nat. Neurosci., 8 (5), 657-63.

126. Fujiwara, H., Hasegawa, M., Dohmae, N., Kawashima, A., Masliah, E., Goldberg, M.S., Shen, J., Takio, K., and Iwatsubo, T. (2002) alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nat. Cell Biol., 4 (2), 160-4.

127. Anderson, J.P., Walker, D.E., Goldstein, J.M., de Laat, R., Banducci, K., Caccavello, R.J., Barbour, R., Huang, J., Kling, K., Lee, M., Diep, L., Keim, P.S., Shen, X., Chataway, T., Schlossmacher, M.G., Seubert, P., Schenk, D., Sinha, S., Gai, W.P., and Chilcote, T.J. (2006) Phosphorylation of Ser-129 Is the Dominant Pathological Modification of a-Synuclein in Familial and Sporadic Lewy Body Disease. J. Biol. Chem., 281 (40), 29739-29752.

128. Rospigliosi, C.C., McClendon, S., Schmid, A.W., Ramlall, T.F., Barré, P., Lashuel, H.A., and Eliezer, D. (2009) E46K Parkinson's-linked mutation enhances C-terminal-to-N-terminal contacts in alpha-synuclein. J. Mol. Biol., 388 (5), 1022-32.

129. Muntané, G., Ferrer, I., and Martinez-Vicente, M. (2012) a-synuclein phosphorylation and truncation are normal events in the adult human brain. Neuroscience, 200, 106-119.

130. Choi, W., Zibaee, S., Jakes, R., Serpell, L.C., Davletov, B., Anthony Crowther, R., and Goedert, M. (2004) Mutation E46K increases phospholipid binding and assembly into filaments of human a-synuclein. FEBS Lett., 576 (3), 363-368.

131. Kamiyoshihara, T., Kojima, M., Uéda, K., Tashiro, M., and Shimotakahara, S. (2007) Observation of multiple intermediates in a-synuclein fibril formation by singular value decomposition analysis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 355 (2), 398-403.

132. Conway, K.A., Lee, S.J., Rochet, J.C., Ding, T.T., Williamson, R.E., and

170

Lansbury, P.T. (2000) Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both a-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: Implications for pathogenesis and therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 97 (2), 571-576.

133. Gispert, S., Del Turco, D., Garrett, L., Chen, A., Bernard, D.J., HammClement, J., Korf, H.-W., Deller, T., Braak, H., Auburger, G., and Nussbaum, R.L. (2003) Transgenic mice expressing mutant A53T human alpha-synuclein show neuronal dysfunction in the absence of aggregate formation. Mol. Cell. Neurosci, 24 (2), 419-29.

134. Takeda, A., Hasegawa, T., Matsuzaki-Kobayashi, M., Sugeno, N., Kikuchi,

A., Itoyama, Y., and Furukawa, K. (2006) Mechanisms of neuronal death in synucleinopathy. J. Biomed. Biotechnol., 2006 (3), 19365.

135. Winner, B., Jappelli, R., Maji, S.K., Desplats, P.A., Boyer, L., Aigner, S., Hetzer, C., Loher, T., Vilar, M., Campioni, S., Tzitzilonis, C., Soragni, A., Jessberger, S., Mira, H., Consiglio, A., Pham, E., Masliah, E., Gage, F.H., and Riek, R. (2011) In vivo demonstration that -synuclein oligomers are toxic. Proc. Natl. Acad. Sci., 108 (10), 4194-4199.

136. Kostka, M., Högen, T., Danzer, K.M., Levin, J., Habeck, M., Wirth, A., Wagner, R., Glabe, C.G., Finger, S., Heinzelmann, U., Garidel, P., Duan, W., Ross, C.A., Kretzschmar, H., and Giese, A. (2008) Single Particle Characterization of Iron-induced Pore-forming a-Synuclein Oligomers. J. Biol. Chem., 283 (16), 10992-11003.

137. Lorenzen, N., Nielsen, S.B., Buell, A.K., Kaspersen, J.D., Arosio, P., Vad,

B.S., Paslawski, W., Christiansen, G., Valnickova-Hansen, Z., Andreasen, M., Enghild, J.J., Pedersen, J.S., Dobson, C.M., Knowles, T.P.J., and Otzen, D.E. (2014) The Role of Stable a-Synuclein Oligomers in the Molecular Events Underlying Amyloid Formation. J. Am. Chem. Soc., 136 (10), 38593868.

138. Cappai, R., Leck, S.-L., Tew, D.J., Williamson, N.A., Smith, D.P., Galatis, D., Sharpies, R.A., Curtain, C.C., Ali, F.E., Cherny, R.A., Culvenor, J.G.,

171

Bottomley, S.P., Masters, C.L., Barnham, K.J., and Hill, A.F. (2005) Dopamine promotes a-synuclein aggregation into SDS-resistant soluble oligomers via a distinct folding pathway. FASEB J., 19 (10), 1377-1379.

139. Tsigelny, I.F., Bar-On, P., Sharikov, Y., Crews, L., Hashimoto, M., Miller, M.A., Keller, S.H., Platoshyn, O., Yuan, J.X.-J., and Masliah, E. (2007) Dynamics of a-synuclein aggregation and inhibition of pore-like oligomer development by ß-synuclein. FEBS J., 274 (7), 1862-1877.

140. Zhang, H., Griggs, A., Rochet, J.-C., and Stanciu, L.A. (2013) In vitro study of a-synuclein protofibrils by cryo-EM suggests a Cu(2+)-dependent aggregation pathway. Biophys. J., 104 (12), 2706-13.

141. Schmidt, F., Levin, J., Kamp, F., Kretzschmar, H., Giese, A., and Bötzel, K. (2012) Single-Channel Electrophysiology Reveals a Distinct and Uniform Pore Complex Formed by a-Synuclein Oligomers in Lipid Membranes. PLoS One, 7 (8), e42545.

142. Kayed, R., Sokolov, Y., Edmonds, B., McIntire, T.M., Milton, S.C., Hall, J.E., and Glabe, C.G. (2004) Permeabilization of Lipid Bilayers Is a Common Conformation-dependent Activity of Soluble Amyloid Oligomers in Protein Misfolding Diseases. J. Biol. Chem., 279 (45), 46363-46366.

143. Butterfield, S.M., and Lashuel, H.A. (2010) Amyloidogenic ProteinMembrane Interactions: Mechanistic Insight from Model Systems. Angew. Chemie Int. Ed., 49 (33), 5628-5654.

144. Angelova, P.R., Ludtmann, M.H.R., Horrocks, M.H., Negoda, A., Cremades, N., Klenerman, D., Dobson, C.M., Wood, N.W., Pavlov, E. V, Gandhi, S., and Abramov, A.Y. (2016) Ca2+ is a key factor in a-synuclein-induced neurotoxicity. J. Cell Sci., 129 (9), 1792-801.

145. Nakamura, K. (2013) a-Synuclein and Mitochondria: Partners in Crime? Neurotherapeutics, 10 (3), 391-399.

146. Choi, D.-H., Cristovao, A.C., Guhathakurta, S., Lee, J., Joh, T.H., Beal, M.F., and Kim, Y.-S. (2012) NADPH Oxidase 1-Mediated Oxidative Stress Leads to Dopamine Neuron Death in Parkinson's Disease. Antioxid. Redox

172

Signal., 16 (10), 1033-1045.

147. Wright, J.A., Wang, X., and Brown, D.R. (2009) Unique copper-induced oligomers mediate alpha-synuclein toxicity. FASEB J., 23 (8), 2384-2393.

148. Colla, E., Coune, P., Liu, Y., Pletnikova, O., Troncoso, J.C., Iwatsubo, T., Schneider, B.L., and Lee, M.K. (2012) Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci., 32 (10), 3306-3320.

149. Castillo-Carranza, D.L., Zhang, Y., Guerrero-Muñoz, M.J., Kayed, R., Rincon-Limas, D.E., and Fernandez-Funez, P. (2012) Differential activation of the ER stress factor XBP1 by oligomeric assemblies. Neurochem. Res., 37 (8), 1707-17.

150. Emmanouilidou, E., Stefanis, L., and Vekrellis, K. (2010) Cell-produced alpha-synuclein oligomers are targeted to, and impair, the 26S proteasome. Neurobiol. Aging, 31 (6), 953-68.

151. Cremades, N., Cohen, S.I.A., Deas, E., Abramov, A.Y., Chen, A.Y., Orte, A., Sandal, M., Clarke, R.W., Dunne, P., Aprile, F.A., Bertoncini, C.W., Wood, N.W., Knowles, T.P.J., Dobson, C.M., and Klenerman, D. (2012) Direct observation of the interconversion of normal and toxic forms of a-synuclein. Cell, 149 (5), 1048-59.

152. Desplats, P., Lee, H.-J., Bae, E.-J., Patrick, C., Rockenstein, E., Crews, L., Spencer, B., Masliah, E., and Lee, S.-J. (2009) Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of -synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci., 106 (31), 13010-13015.

153. Hansen, C., Angot, E., Bergström, A.-L., Steiner, J.A., Pieri, L., Paul, G., Outeiro, T.F., Melki, R., Kallunki, P., Fog, K., Li, J.-Y., and Brundin, P. (2011) a-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J. Clin. Invest., 121 (2), 715-725.

154. Volpicelli-Daley, L.A., Luk, K.C., Patel, T.P., Tanik, S.A., Riddle, D.M., Stieber, A., Meaney, D.F., Trojanowski, J.Q., and Lee, V.M.-Y. (2011)

173

Exogenous a-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron, 72 (1), 57-71.

155. Braak, H., Del Tredici, K., Rüb, U., de Vos, R.A.I., Jansen Steur, E.N.H., and Braak, E. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging, 24 (2), 197-211.

156. Kordower, J.H., Chu, Y., Hauser, R.A., Freeman, T.B., and Olanow, C.W. (2008) Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat. Med., 14 (5), 504-6.

157. Li, J.-Y., Englund, E., Holton, J.L., Soulet, D., Hagell, P., Lees, A.J., Lashley, T., Quinn, N.P., Rehncrona, S., Björklund, A., Widner, H., Revesz, T., Lindvall, O., and Brundin, P. (2008) Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat. Med., 14 (5), 501-3.

158. Grozdanov, V., and Danzer, K.M. (2018) Release and uptake of pathologic alpha-synuclein. Cell Tissue Res., 373 (1), 175-182.

159. Emmanouilidou, E., Melachroinou, K., Roumeliotis, T., Garbis, S.D., Ntzouni, M., Margaritis, L.H., Stefanis, L., and Vekrellis, K. (2010) Cell-Produced -Synuclein Is Secreted in a Calcium-Dependent Manner by Exosomes and Impacts Neuronal Survival. J. Neurosci., 30 (20), 6838-6851.

160. Paillusson, S., Clairembault, T., Biraud, M., Neunlist, M., and Derkinderen, P. (2013) Activity-dependent secretion of alpha-synuclein by enteric neurons. J. Neurochem., 125 (4), 512-7.

161. Danzer, K.M., Ruf, W.P., Putcha, P., Joyner, D., Hashimoto, T., Glabe, C., Hyman, B.T., and McLean, P.J. (2011) Heat-shock protein 70 modulates toxic extracellular a-synuclein oligomers and rescues trans-synaptic toxicity. FASEB J., 25 (1), 326-36.

162. Sung, J.Y., Park, S.M., Lee, C.-H., Um, J.W., Lee, H.J., Kim, J., Oh, Y.J., Lee, S.-T., Paik, S.R., and Chung, K.C. (2005) Proteolytic Cleavage of Extracellular Secreted a-Synuclein via Matrix Metalloproteinases. J. Biol. Chem, 280 (26), 25216-25224.

163. Lee, H.-J., Suk, J.-E., Bae, E.-J., Lee, J.-H., Paik, S.R., and Lee, S.-J. (2008) Assembly-dependent endocytosis and clearance of extracellular a-synuclein. Int. J. Biochem. Cell Biol., 40 (9), 1835-1849.

164. Holmes, B.B., DeVos, S.L., Kfoury, N., Li, M., Jacks, R., Yanamandra, K., Ouidja, M.O., Brodsky, F.M., Marasa, J., Bagchi, D.P., Kotzbauer, P.T., Miller, T.M., Papy-Garcia, D., and Diamond, M.I. (2013) Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc. Natl. Acad. Sci., 110 (33), E3138-E3147.

165. Ahn, K.J., Paik, S.R., Chung, K.C., and Kim, J. (2006) Amino acid sequence motifs and mechanistic features of the membrane translocation of alpha-synuclein. J. Neurochem., 97 (1), 265-79.

166. Delenclos, M., Trendafilova, T., Mahesh, D., Baine, A.M., Moussaud, S., Yan, I.K., Patel, T., and McLean, P.J. (2017) Investigation of Endocytic Pathways for the Internalization of Exosome-Associated Oligomeric Alpha-Synuclein. Front. Neurosci., 11, 172.

167. Kitada, T., Asakawa, S., Hattori, N., Matsumine, H., Yamamura, Y., Minoshima, S., Yokochi, M., Mizuno, Y., and Shimizu, N. (1998) Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature, 392 (6676), 605-8.

168. Barodia, S.K., Creed, R.B., and Goldberg, M.S. (2017) Parkin and PINK1 functions in oxidative stress and neurodegeneration. Brain Res. Bull., 133, 51-59.

169. Klein, C., Pramstaller, P.P., Kis, B., Page, C.C., Kann, M., Leung, J., Woodward, H., Castellan, C.C., Scherer, M., Vieregge, P., Breakefield, X.O., Kramer, P.L., and Ozelius, L.J. (2000) Parkin deletions in a family with adult-onset, tremor-dominant parkinsonism: expanding the phenotype. Ann. Neurol., 48 (1), 65-71.

170. Valente, E.M. (2004) Hereditary Early-Onset Parkinson's Disease Caused by Mutations in PINK1. Science (80-. )., 304 (5674), 1158-1160.

171. Kawajiri, S., Saiki, S., Sato, S., and Hattori, N. (2011) Genetic mutations and

functions of PINK1. Trends Pharmacol. Sci., 32 (10), 573-580.

172. Langston, J., Ballard, P., Tetrud, J., and Irwin, I. (1983) Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science (80-.), 219 (4587), 979-980.

173. Storch, A., Ludolph, A.C., and Schwarz, J. (2004) Dopamine transporter: involvement in selective dopaminergic neurotoxicity and degeneration. J. Neural Transm., 111 (10-11), 1267-1286.

174. Desai, V.G., Feuers, R.J., Hart, R.W., and Ali, S.F. (1996) MPP(+)-induced neurotoxicity in mouse is age-dependent: evidenced by the selective inhibition of complexes of electron transport. Brain Res., 715 (1-2), 1-8.

175. Dauer, W., and Przedborski, S. (2003) Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron, 39 (6), 889-909.

176. Dauer, W., Kholodilov, N., Vila, M., Trillat, A.-C., Goodchild, R., Larsen, K.E., Staal, R., Tieu, K., Schmitz, Y., Yuan, C.A., Rocha, M., JacksonLewis, V., Hersch, S., Sulzer, D., Przedborski, S., Burke, R., and Hen, R. (2002) Resistance of -synuclein null mice to the parkinsonian neurotoxin MPTP. Proc. Natl. Acad. Sci., 99 (22), 14524-14529.

177. Sanders, L.H., and Timothy Greenamyre, J. (2013) Oxidative damage to macromolecules in human Parkinson disease and the rotenone model. Free Radic. Biol. Med., 62, 111-120.

178. Cannon, J.R., Tapias, V., Na, H.M., Honick, A.S., Drolet, R.E., and Greenamyre, J.T. (2009) A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiol. Dis., 34 (2), 279-90.

179. Zharikov, A.D., Cannon, J.R., Tapias, V., Bai, Q., Horowitz, M.P., Shah, V., El Ayadi, A., Hastings, T.G., Greenamyre, J.T., and Burton, E.A. (2015) shRNA targeting a-synuclein prevents neurodegeneration in a Parkinson's disease model. J. Clin. Invest., 125 (7), 2721-2735.

180. Cicchetti, F., Lapointe, N., Roberge-Tremblay, A., Saint-Pierre, M., Jimenez, L., Ficke, B.W., and Gross, R.E. (2005) Systemic exposure to paraquat and maneb models early Parkinson's disease in young adult rats. Neurobiol. Dis.,

176

20 (2), 360-71.

181. Manning-Bog, A.B., McCormack, A.L., Li, J., Uversky, V.N., Fink, A.L., and Di Monte, D.A. (2002) The Herbicide Paraquat Causes Up-regulation and Aggregation of a-Synuclein in Mice. J. Biol. Chem., 277 (3), 1641-1644.

182. Di Maio, R., Barrett, P.J., Hoffman, E.K., Barrett, C.W., Zharikov, A., Borah, A., Hu, X., McCoy, J., Chu, C.T., Burton, E.A., Hastings, T.G., and Greenamyre, J.T. (2016) a-Synuclein binds to TOM20 and inhibits mitochondrial protein import in Parkinson's disease. Sci. Transl. Med., 8 (342), 342ra78.

183. Liu, G., Zhang, C., Yin, J., Li, X., Cheng, F., Li, Y., Yang, H., Ueda, K., Chan, P., and Yu, S. (2009) alpha-Synuclein is differentially expressed in mitochondria from different rat brain regions and dose-dependently down-regulates complex I activity. Neurosci. Lett., 454 (3), 187-92.

184. Luth, E.S., Stavrovskaya, I.G., Bartels, T., Kristal, B.S., and Selkoe, D.J.

(2014) Soluble, Prefibrillar a-Synuclein Oligomers Promote Complex I-dependent, Ca 2+ -induced Mitochondrial Dysfunction. J. Biol. Chem., 289 (31), 21490-21507.

185. Reeve, A.K., Ludtmann, M.H.R., Angelova, P.R., Simcox, E.M., Horrocks, M.H., Klenerman, D., Gandhi, S., Turnbull, D.M., and Abramov, A.Y.

(2015) Aggregated a-synuclein and complex I deficiency: exploration of their relationship in differentiated neurons. Cell Death Dis., 6, e1820.

186. Rocha, E.M., De Miranda, B., and Sanders, L.H. (2018) Alpha-synuclein: Pathology, mitochondrial dysfunction and neuroinflammation in Parkinson's disease. Neurobiol. Dis., 109 (Pt B), 249-257.

187. Schapira, A.H.V., Cooper, J.M., Dexter, D., Jenner, P., Clark, J.B., and Marsden, C.D. (1989) Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson's disease. Lancet, 333 (8649), 1269.

188. Bindoff, L.A., Birch-Machin, M., Cartlidge, N.E.F., Parker, W.D., and Turnbull, D.M. (1989) Mitochondrial function in Parkinson's disease. Lancet, 334 (8653), 49.

189. Bender, A., Krishnan, K.J., Morris, C.M., Taylor, G.A., Reeve, A.K., Perry, R.H., Jaros, E., Hersheson, J.S., Betts, J., Klopstock, T., Taylor, R.W., and Turnbull, D.M. (2006) High levels of mitochondrial DNA deletions in substantia nigra neurons in aging and Parkinson disease. Nat. Genet., 38 (5), 515-7.

190. Anandhan, A., Jacome, M.S., Lei, S., Hernandez-Franco, P., Pappa, A., Panayiotidis, M.I., Powers, R., and Franco, R. (2017) Metabolic Dysfunction in Parkinson's Disease: Bioenergetics, Redox Homeostasis and Central Carbon Metabolism. Brain Res. Bull., 133, 12-30.

191. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G.A., and Meisel, A. (2013) Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends Neurosci., 36 (10), 587-97.

192. Phelps, M., and Mazziotta, J. (1985) Positron emission tomography: human brain function and biochemistry. Science (80-.)., 228 (4701), 799-809.

193. Henchcliffe, C., Shungu, D.C., Mao, X., Huang, C., Nirenberg, M.J., Jenkins, B.G., and Beal, M.F. (2008) Multinuclear magnetic resonance spectroscopy for in vivo assessment of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1147, 206-20.

194. Marini, A.M., and Nowak, T.S. (2000) Metabolic effects of 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP(+)) in primary neuron cultures. J. Neurosci. Res., 62 (6), 814-20.

195. Mazzio, E.A., Soliman, Y.I., and Soliman, K.F.A. (2010) Variable toxicological response to the loss of OXPHOS through 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced mitochondrial damage and anoxia in diverse neural immortal cell lines. Cell Biol. Toxicol., 26 (6), 527-39.

196. Amo, T., Oji, Y., Saiki, S., and Hattori, N. (2019) Metabolomic analysis revealed mitochondrial dysfunction and aberrant choline metabolism in MPP+-exposed SH-SY5Y cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 519 (3), 540-546.

197. Maruoka, N., Murata, T., Omata, N., Takashima, Y., Fujibayashi, Y., and

178

Wada, Y. (2007) Topological and chronological features of the impairment of glucose metabolism induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+) in rat brain slices. J. Neural Transm., 114 (9), 1155-1159.

198. Chan, P., Langston, J.W., Irwin, I., DeLanney, L.E., and Di Monte, D.A. (1993) 2-deoxyglucose enhances 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced ATP loss in the mouse brain. J. Neurochem., 61 (2), 610-6.

199. Poon, H.F., Frasier, M., Shreve, N., Calabrese, V., Wolozin, B., and Butterfield, D.A. (2005) Mitochondrial associated metabolic proteins are selectively oxidized in A30P alpha-synuclein transgenic mice--a model of familial Parkinson's disease. Neurobiol. Dis., 18 (3), 492-8.

200. Aviles-Olmos, I., Limousin, P., Lees, A., and Foltynie, T. (2013) Parkinson's disease, insulin resistance and novel agents of neuroprotection. Brain, 136 (2), 374-384.

201. Morris, J.K., Bomhoff, G.L., Stanford, J.A., and Geiger, P.C. (2010) Neurodegeneration in an animal model of Parkinson's disease is exacerbated by a high-fat diet. Am. J. Physiol. Integr. Comp. Physiol., 299 (4), R1082-R1090.

202. Cuchillo, R., and Michel, J. (2012) Mechanisms of small-molecule binding to intrinsically disordered proteins. Biochem. Soc. Trans., 40 (5), 1004-8.

203. Beghyn, T., Deprez-Poulain, R., Willand, N., Folleas, B., and Deprez, B. (2008) Natural compounds: leads or ideas? Bioinspired molecules for drug discovery. Chem. Biol. Drug Des., 72 (1), 3-15.

204. Koch, W. (2019) Dietary Polyphenols—Important Non-Nutrients in the Prevention of Chronic Noncommunicable Diseases. A Systematic Review. Nutrients, 11 (5), 1039.

205. Bhullar, K.S., and Rupasinghe, H.P.V. (2013) Polyphenols: Multipotent Therapeutic Agents in Neurodegenerative Diseases. Oxid. Med. Cell. Longev., 2013, 1-18.

206. Masuda, M., Suzuki, N., Taniguchi, S., Oikawa, T., Nonaka, T., Iwatsubo,

179

T., Hisanaga, S.I., Goedert, M., and Hasegawa, M. (2006) Small molecule inhibitors of ??-synuclein filament assembly. Biochemistry, 45 (19), 60856094.

207. Hu, Q., Uversky, V.N., Huang, M., Kang, H., Xu, F., Liu, X., Lian, L., Liang, Q., Jiang, H., Liu, A., Zhang, C., Pan-Montojo, F., and Zhu, S. (2016) Baicalein inhibits a-synuclein oligomer formation and prevents progression of a-synuclein accumulation in a rotenone mouse model of Parkinson's disease. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis., 1862 (10), 1883-1890.

208. Hung, K.-C., Huang, H.-J., Wang, Y.-T., and Lin, A.M.-Y. (2016) Baicalein attenuates a-synuclein aggregation, inflammasome activation and autophagy in the MPP+-treated nigrostriatal dopaminergic system in vivo. J. Ethnopharmacol., 194, 522-529.

209. Sowndhararajan, K., Deepa, P., Kim, M., Park, S.J., and Kim, S. (2017) Baicalein as a potent neuroprotective agent: A review. Biomed. Pharmacother., 95, 1021-1032.

210. Meng, X., Munishkina, L.A., Fink, A.L., and Uversky, V.N. (2009) Molecular Mechanisms Underlying the Flavonoid-Induced Inhibition of a-Synuclein Fibrillation. Biochemistry, 48 (34), 8206-8224.

211. Hong, D.-P., Fink, A.L., and Uversky, V.N. (2008) Structural Characteristics of a-Synuclein Oligomers Stabilized by the Flavonoid Baicalein. J. Mol. Biol., 383 (1), 214-223.

212. Bieschke, J., Russ, J., Friedrich, R.P., Ehrnhoefer, D.E., Wobst, H., Neugebauer, K., and Wanker, E.E. (2010) EGCG remodels mature a-synuclein and amyloid-P fibrils and reduces cellular toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci., 107 (17), 7710-7715.

213. Fonseca-Ornelas, L., Eisbach, S.E., Paulat, M., Giller, K., Fernández, C.O., Outeiro, T.F., Becker, S., and Zweckstetter, M. (2014) Small molecule-mediated stabilization of vesicle-associated helical a-synuclein inhibits pathogenic misfolding and aggregation. Nat. Commun., 5, 5857.

214. Chainani-Wu, N. (2003) Safety and Anti-Inflammatory Activity of

180

Curcumin: A Component of Tumeric ( Curcuma longa ). J. Altern. Complement. Med., 9 (1), 161-168.

215. Cole, G.M., Teter, B., and Frautschy, S.A. (2007) Neuroprotective effects of curcumin, in Advances in experimental medicine and biology, vol 595. (eds.Aggarwal, B.B., Surh, Y., and Shishodia, S.), Springer, Boston, MA, Boston, MA, pp. 197-212.

216. Menon, V.P., and Sudheer, A.R. (2007) Antioxidant and anti-inflammatory properties of curcumin, in Advances in experimental medicine and biology, vol 595. (eds.Aggarwal, B.B., Surh, Y.J., and Shishodia, S.), Springer, Boston, MA, pp. 105-125.

217. Boroumand, N., Samarghandian, S., and Hashemy, S.I. (2018) Immunomodulatory, anti-inflammatory, and antioxidant effects of curcumin. J. HerbmedPharmacol., 7 (4), 211-219.

218. Kasi, P.D., Tamilselvam, R., Skalicka-Wozniak, K., Nabavi, S.F., Daglia, M., Bishayee, A., Pazoki-toroudi, H., and Nabavi, S.M. (2016) Molecular targets of curcumin for cancer therapy: an updated review. Tumor Biol., 37 (10), 13017-13028.

219. Singh, P.K., Kotia, V., Ghosh, D., Mohite, G.M., Kumar, A., and Maji, S.K. (2013) Curcumin Modulates a-Synuclein Aggregation and Toxicity. ACS Chem. Neurosci., 4 (3), 393-407.

220. Ahmad, B., and Lapidus, L.J. (2012) Curcumin Prevents Aggregation in a-Synuclein by Increasing Reconfiguration Rate. J. Biol. Chem., 287 (12), 9193-9199.

221. Nelson, K.M., Dahlin, J.L., Bisson, J., Graham, J., Pauli, G.F., and Walters, M.A. (2017) The Essential Medicinal Chemistry of Curcumin. J. Med. Chem., 60 (5), 1620-1637.

222. Teixeira, J., Gaspar, A., Garrido, E.M., Garrido, J., and Borges, F. (2013) Hydroxycinnamic Acid Antioxidants: An Electrochemical Overview. Biomed Res. Int., 2013, 1-11.

223. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Rémésy, C., and Jiménez, L. (2004)

181

Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr., 79 (5), 727-747.

224. Clifford, M.N. (2000) Chlorogenic acids and other cinnamates - nature, occurrence, dietary burden, absorption and metabolism. J. Sci. Food Agric., 80 (7), 1033-1043.

225. Andrade, P.., Leitao, R., Seabra, R.., Oliveira, M.., and Ferreira, M.. (1998) 3,4-Dimethoxycinnamic acid levels as a tool for differentiation of Coffea canephora var. robusta and Coffea arabica. Food Chem., 61 (4), 511-514.

226. Farrell, T.L., Gomez-Juaristi, M., Poquet, L., Redeuil, K., Nagy, K., Renouf, M., and Williamson, G. (2012) Absorption of dimethoxycinnamic acid derivatives in vitro and pharmacokinetic profile in human plasma following coffee consumption. Mol. Nutr. Food Res., 56 (9), 1413-1423.

227. Nagy, K., Redeuil, K., Williamson, G., Rezzi, S., Dionisi, F., Longet, K., Destaillats, F., and Renouf, M. (2011) First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A, 1218 (3), 491-497.

228. Nefzger, M.D., Quadfasel, F.A., and Karl, V.C. (1968) A retrospective study of smoking in Parkinson's disease. Am. J. Epidemiol., 88 (2), 149-58.

229. Tan, E.-K., Tan, C., Fook-Chong, S.M.C., Lum, S.Y., Chai, A., Chung, H., Shen, H., Zhao, Y., Teoh, M.L., Yih, Y., Pavanni, R., Chandran, V.R., and Wong, M.C. (2003) Dose-dependent protective effect of coffee, tea, and smoking in Parkinson's disease: a study in ethnic Chinese. J. Neurol. Sci., 216 (1), 163-7.

230. Preux, P.M., Condet, A., Anglade, C., Druet-Cabanac, M., Debrock, C., Macharia, W., Couratier, P., Boutros-Toni, F., and Dumas, M. Parkinson's disease and environmental factors. Matched case-control study in the Limousin region, France. Neuroepidemiology, 19 (6), 333-7.

231. Jimeanez-Jimeanez, F.J., Mateo, D., and Gimeanez-Roldan, S. (1992) Premorbid smoking, alcohol consumption, and coffee drinking habits in

Parkinson's disease: A case-control study. Mov. Disord., 7 (4), 339-344.

182

232. Ross, G.W. (2000) Association of Coffee and Caffeine Intake With the Risk of Parkinson Disease. JAMA, 283 (20), 2674.

233. Ascherio, A., Zhang, S.M., Hernán, M.A., Kawachi, I., Colditz, G.A., Speizer, F.E., and Willett, W.C. (2001) Prospective study of caffeine consumption and risk of Parkinson's disease in men and women. Ann. Neurol., 50 (1), 56-63.