Основные критерии вредного действия смеси изомеров 2 хлорэтилнитрозо Lгомоцитруллина для прогнозирования опасности здоровью работающих в условиях производства. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.04, кандидат медицинских наук Битти, Мария Александровна

• Битти, Мария Александровна
• кандидат медицинских наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Битти, Мария Александровна

1. Реакции, катализируемые основаниями, с ионизацией амидной группы и образованием диазотата и изоцианата. Изоцианат легко реагирует с нуклеофилами, такими как вода, гидроксильными, амино-сульфгидрильными группами. Гидролиз и реакция с аминами изоцианата вносит существенный вклад в превращение изоцианата в организме. Цикл же превращений с диазотатом, в конечном итоге приводит к алкилированию присутствующего в среде нуклеофила или растворителя с введением в него радикала. Важное значение имеет алкилирование воды, в результате которого образуются спирты, являющиеся нормальными метаболитами превращения некоторых НАМ и обладающие высокой биологической активностью [21,147].

2. Алкилирующие препараты вступают в реакцию с реактивом Неслера, в результате которой образуется зеленовато - желтый осадок, не растворимый в соляной кислоте [15].

3. Все НАМ склонны к разложению при ультрафиолетовом облучении и под действием видимого света (фотолиз) [147].

1.2. Параметры острой токсичности нитрозомочевин.

Среднесмертельные дозы, полученные в эксперименте на разных видах животных при однократном введении различными путями, приведены в таблице № 2 [30,88,98,137,147].

Из таблицы №2 видно, что по уровню токсичности при введении в желудок препараты группы нитрозоалкилмочевин относятся к различным классам опасности. Так, самый простой препарат этого класса — НММ относится ко 2-му классу опасности, НЭМ и араноза - к 3-му классу опасности, в то врем как, исходный продукт лизомустина — БХНМ, оказывается наиболее токсичным и причисляется к 1-му классу опасности.

Таблица

Среднесмертельные дозы, полученные при эксперименте на разных видах животных.

Название ЛД50 Способ введения.

Крысы в/ж, в/в, п/к, в/б Хомячки европейские п/к, в/в Хомячки китайские п/к Мыши в/ж, в/б, в/в, п/к

1М- нитрозо-Ы- метилмочевина, МММ 110 мг/кг 110 мг/кг 110 мг/кг 50 мг/кг 50 мг/кг 220 мг/кг 150 мг/кг 180 мг/кг 220 мг/кг

1-нитрозо-1\1-этилмочевина НЭМ 300 мг/кг 240 мг/кг 240 мг/кг 270 мг/кг 380 мг/кг 410 мг/кг 430 мг/кг

Ы-нитрорзотри Метилмочевина 250 мг/кг

1,3-бис-(2- хлорэтил)-1- нитрозмочевина 83,3 мг/кг 52,5 мг/кг

М-Нитрозо-МХ'-бис(2-хлорэтил)-мочевина (кармустин, БХНМ) 13,8 мг/кг 20 мг/кг 83,2 мг/кг 17,4 мг/кг 45,0 мг/кг 21,3 мг/кг 19,0 мг/кг 24 мг/кг

1Ы-нитрозо-М-(2-бромэтил)-Ы-циклогексил Мочевина 237 мг/кг

З-Ь- арабинопиранозил-1-метил- нитрозомочевины Араноза [59,93] 423 мг/кг 640(508-804)мг/кг 1150 мг/кг 520(420-660)мг/кг

Кумулятивная способность у различных НАМ не одинакова. Слабая кумуляция токсического эффекта и даже его частичная обратимость свойственны НЭМ, ДМНМ и НМБ. Кумулятивные свойства других препаратов - НММ, НПМ и ДЭНМ - в значительной мере зависят от способа введения. Например, побочное действие НММ сильнее кумулируется при внутривенном и внутрибрюшинном введении и в меньшей степени при подкожном и пероральном применении, когда ее токсичность почти полностью обратима. Кумуляция токсического действия существенным образом зависит также и от режима применения препарата (кратность введений) [21,143,147].

Существенные сведения об особенностях действия препарата дает наблюдение за сроками гибели животных. Так, для хлорэтилзамещенных НАМ характерна гибель животных в отдаленные сроки - через 10-14 суток [147,149,150,183,196,199]. Подобная тенденция имеет место также для НММ и ее аналогов. При применении этих веществ гибель животных наблюдается обычно с 1 по 15 сутки, однако, при введении сублетальных доз токсические свойства могут проявляться и в более поздние сроки, вплоть до 30 суток [98,147,154,171,184].

1.3. Противоопухолевая активность НАМ.

По сравнению с обычными алкилирующими препаратами НАМ обладают наиболее высокой противоопухолевой эффективностью, по-видимому, связанную с сочетанием их алкилирующих и карбамоилирующих свойств [21,41,57,58,99,138,147,193,194,195].

Первый путь воздействия на опухолевые клетки - реакции алкилирования и карбамоилирования (Таблица 3) [46,56,147]. В данном типе реакций участвуют ионы, образованные в водном растворе из НАМ при поступлении в организм, которые взаимодействуют с нуклеофильными центрами ДНК, РНК, белков. Алкилирование осуществляется прямым переносом алкильных радикалов к нуклеиновым кислотам и белкам, в основном в положении 7 (7-метилгуанин), З(З-метилгуанин), 1,3,7 (1,3-,7-метиладенин) и О6 -метилгуанин. На основании этих реакций НАМ относят к веществам алкилирующего действия, но в отличие от классических представителей они вызывают также интенсивное карбамоилирование

Таблица

Характер взаимодействия некоторых НАМ с ДНК и РНК опухолевых клеток

Препарат Ti/2, мин Алкилирующая активность Карбамоилирующая активность

НММ 3,5 100"

Лизомустин Алкилирующая активность МНМ принята за 100%. белков и липидов. Карбамоилированные основания не способны образовывать нормальные пары в цепочке ДНК, что ведет к мутациям [21,57,58,80,81,121,160,195].

Наиболее высокой алкилирующей активностью обладает 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины (БХНМ) [41,138,147]. В условиях in vivo препарат быстро метаболизиреются с образованием активных алкильных групп, которые атакуют кислород О6 в молекуле гуанина одной из цепей ДНК. Через 6-12 часов происходит связывание этого участка цитидином другой цепи — возникает межнитевая сшивка. Количество сшивок зависит от способности клетки оторвать алкильную группу от гуанина до образования сшивки (это происходит под действием фермента 06-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, (06-АГТ). Чем выше уровень фермента, тем меньше антибластическая эффективность препарата [75,80].

Продукты распада НАМ в организме - изоциановая кислота и ее эфиры реагируют с различными группами белков и аминокислот, так цианат взаимодействует с цистеиновыми и цистиновыми группами белков, с образованием нестойких S-карбамоилпроизводных. Были проведены исследования на животных —опухоленосителях с меченными НАМ, в результате которых БХНМ in vitro активно карбамоилировал клеточные белки, особенно, содержащие лизиновые гистоны, которые являются самой лабильной фракцией белка и играют роль в сохранении структуры хроматина. Введение другой НАМ — ЦГНМ (с радиоактивной меткой), показало значительное карбамоилирование белков, в сравнении, с РНК и ДНК. Кроме того, циклогексильные остатки активно связывались опухолевыми клетками [185]. Введение НММ (с радиоактивной меткой) однократно вызывало быстрое карбамоилирование макромолекул и липидов. В отличие от других НАМ здесь отмечена данная реакция в молекуле РНК. Высокий уровень реакционности в липидах свидетельствует о возможности проникновения НАМ через различные мембраны и гематоэнцефалический барьер [41,56,138,147,202,193].

Второй путь действия — нарушение работы белков, ферментов и факторов трансляции (ДНК, РНК - полимераз) белков рибосом. Часть препаратов (БХНМ, НММ) оказывает большее ингибирующее действие на ДНК, чем на РНК. Хотя НАМ вызывают серьезные нарушения и в синтезе РНК [61,80,145,147,160,182,193,195]. Значительные изменения под действием препаратов, так же были выявлены в ядрышках — основном месте синтеза РНК - это увеличение их объема, маргинация и т.д. [61,76,102,174].

Интересно отметить, что препараты взаимодействуют с молекулой ДНК и РНК только лишь при определенной концентрации, а небольшие дозы могут наоборот кратковременно активировать образование ДНК и РНК, тогда как увеличение концентрации, приводит к глубокому угнетению их синтеза. Так же имеет значение время, прошедшее с момента введения. Дополнительный вклад в торможение НАМ синтеза РНК вносит ингибирование белков цитоплазмы, регулирующих синтез РНК в ядре [21,41,138,147].

НАМ оказывают серьезное повреждающее воздействие на биосинтез белка и механизм трансляции. Действие НАМ на механизм трансляции заключается в уменьшении транслирующих рибосом и замедлении скорости трансляции [21,57,58,80,81,139,147,182,193]. В результате чего, в значительной степени тормозится образование ДНК, нарушаются физиологические функции ядер клеток [25].

На основании многих экспериментальных работ можно сделать вывод о том, что НАМ являются биологически активными веществами комплексного действия [57,58,121] и способны в незначительных дозах вносить глубокие повреждения в процессы передачи генетической информации, изменять активность белков-ферментов в опухолевых и здоровых клетках. Но можно сделать вывод, и о том, что механизм их повреждающего действия не ограничивается действием только на генетический аппарат клетки, но и включает, например, нарушение нормального энергообеспечения тканей и клеток, изменение структуры других белковых и особенно ферментативных систем (не связанных с передачей генетической информации). Это представление имеет не менее важное значение и для исследования токсического действия данных препаратов на нормальные клетки организма.

1.4. Механизм повреждающего действия нитрозоалкилмочевин на организм

До настоящего времени исчерпывающей и точной информации о механизме действия исследуемых нами препаратов нет, несмотря на имеющиеся многочисленные работы, посвященные этой теме.

Большинство исследователей, придерживаются мнения, что в основе механизма действия алкилирующих соединений, в том числе НАМ, лежит нарушение различных звеньев обмена нуклеиновых кислот, особенно ядерных нуклеопротеидов. Способность их вступать в реакцию с химическими компонентами клеток и нарушать нуклеопротеидный обмен дает возможность в определенной мере объяснить сложный процесс противоопухолевого действия этих препаратов, тем более что в активно размножающихся тканях отмечается высокий уровень обмена нуклеиновых кислот. Под влиянием НАМ, например, хлорэтиламинов и этиленаминов снижается содержание ДНК, изменяются ее физико-химические свойства, тормозится образование и в результате наступает нарушение физиологических функций ядер клеток, связанных с основными процессами жизнедеятельности. Наиболее уязвимым звеном клеточных процессов является нуклеопротеидный обмен. Предполагается, что в основе этого действия лежит реакция алкилирования активного атома водорода компонентов клетки, а точнее происходит диссоциация препарата в водном растворе с образованием карбониевых, сульфониевых, или азониевых катионов, которые активно реагируют с нуклеофильными группами нуклеиновых кислот и белков. Местами этих реакций являются различные функциональные группы: основные группы нуклеиновых кислот, а-амино-, а-карбоксильные, сульфгидрильные, сульфидные, имидазольные, амино- и фенольные группы аминокислот и пептидов, многие соединения содержащие фосфор, гетероциклические атомы пуринов и пиримидинов, азот гуанина в положении 7 [21,25,44,45,74,110,147,170,190,195].

В итоге, алкилирование молекул ДНК, образование сшивок и разрывов в её структуре приводит к нарушениям матричных функций в процессах репликации и транскрипции и, в результате - к митотическим блокам, несбалансированному росту и гибели клеток, исчезновению делящихся клеток, тканей организма (в том числе клеток опухолей). Так же происходит увеличение количества дистрофически измененных клеток, их разъединение вследствие разрушения больших комплексов клеток и появляются отдельные клетки и небольшие группы клеток [61,102,139,145,156,160,168,173,178,190].

В цитоплазме пораженных клеток наблюдаются ослабление базофилии, появление околоядерных просветлений, плазмолиз с образованием голых ядер, теней клеток, остатков хроматина. [25,33,61] Большинство авторов отмечают вакуолизацию цитоплазмы.

В результате воздействия нитрозоалкилмочевин происходят так же различные дистрофические изменения в ядре: агрегация хроматина, пикноз, фрагментация ядра, кариолиз [24,62,76,172,173]. Отмечается ослабление окраски ядра [61,76]. Установлено увеличение ядер в объеме или появление микроядер [62,156,168,178]. Иногда отмечалось образование гигантских ядер, в результате их отека, и увеличение количества ДНК [61,102,156,178]. Отмечены изменения хромосом под влиянием алкилирующих агентов (транс локации, фрагментации, слипания). У ядрышках наблюдали увеличение их количества и объема или уменьшение объема, также отмечалось образование вместо них деструктивных или вакуольных масс [24,61,76,102,156,174,178].

Имеется гипотеза о том, что в реализации антибластического эффекта алкилирующих веществ важная роль принадлежит первичному нарушению энергетического обмена в клетке, а нарушение энергетики клетки ведет к приостановке всех процессов, протекающих с использованием энергии (биосинтеза белков, нуклеиновых кислот, коэнзимов, различных форм движения цитоплазмы и активного транспорта веществ). Это подтверждается тем, что клетки подвергавшиеся воздействию алкилирующих соединений, продолжают еще некоторое время синтезировать нуклеиновые кислоты и белки, т.е. остановка клеточного деления не является результатом первичного нарушения процессов биосинтеза [25,106,195].

1.5. Общий характер токсического действия. Острая токсичность. Влияние нитрозомочевин на системы и органы.

По данным литературы, вещества из группы НАМ обладают схожими общетоксическими эффектами, которые включают: токсическое действие на систему гемопоэза, лимфоидную и другие ткани, характеризуемые быстрой сменой клеток; ингибирование синтеза белка и ядерных кислот в различных тканях; мутагенное действие; эмбриотоксический и тератогенный эффект; проникновение через плаценту; канцерогенность[30,104,180]

Самый простой препарат из группы нитрозоалкилмочевин — Ы-нитрозо- Ы-метилмочевина характеризуется отсроченной костномозговой токсичностью, как и её производные, вследствие длительной циркуляции в крови продуктов их распада. Существует точка зрения, что в отличие от других алкилирующих агентов, проникающих только в делящиеся клетки и вызывающих острую костномозговую токсичность, нитрозоалкилмочевины могут проникать и в клетки, находящиеся в состоянии покоя, повреждая те из них, которые вступают в фазу С2 клеточного цикла и таким образом отдаляют токсичность [20,153,180].

Так же нирозоалкилмочевины, как отмечалась многими авторами при исследовании на животных и в клинике, характеризуются почечной токсичностью, особенно 1 -(2-хлорэтил)-3 -циклогексил-1 -нитрозомочевин (ХЦГНМ) [14,20,177,180,184,195]. Повреждение легких и почечная токсичность описаны при воздействии БХНМ, ХЦНМ, стрептозотоцина [20,155,157,188,198].

При введении доз НММ выше 50 мг/кг происходит повреждение поджелудочной железы, что приводит к формированию диабета у китайских хомячков. Аналогичная реакция у лабораторных животных более характерна для препарата из класса НАМ — стрептозотоцина [149]. Высокие дозы вызывают гипергликемию у золотистых хомячков, крыс и мышей. При внутрижелудочном введении крысам возникают геморрагические поражения желудка, кишечника, поджелудочной железы. [30,62]. НММ и его метаболиты оказывают действие на рвотный центр головного мозга, что проявляется тошнотой, рвотой, в течение первого получаса после введения [28,74,179,180].

Многие авторы признают факт нарушения энергетического обмена в процессе канцерогенеза (Warburg, 1924; P.E. Ковецкий, 1961), в связи с этим Пудовым В.И. были изучены показатели адениловой системы в различные сроки введения НММ. Испытуемых животных забивали через 2 часа и 60-й день после однократного внутрибрюшинного введения НММ в дозе 50мкг/кг, и на 6-8 месяц после многократного введения НММ в суммарной дозе 180 мкг/кг веса. По результатам исследования в начальные сроки введения препарат вызывает уменьшение содержания АТФ в крови с последующей тенденцией к нормализации. На заключительных этапах канцерогенеза концентрация АТФ ниже, чем в контроле, однако сам процесс опухолевого роста не отражается на ее содержании [106].

В литературе имеются данные о влиянии производных нитрозомочевины на биосинтез НАД. Биосинтез поли(АДФ-рибозы), обеспечивающий восстановление повреждений структуры ДНК, лимитируется концентрацией НАД [110]. В результате синтеза поли(АДФ-рибозы) выделяется никотинамид, который снова используется для биосинтеза НАД. В связи с этим, возможно, что ингибирование использования никотинамида для биоситеза НАД приведет к снижению его концентрации и как следствие к усилению цитостатического эффекта. И задачей эксперимента стало выявление цитотоксических групп, ингибирующих использование никотинамида для биосинтеза НАД. В качестве предшественников НАД кроме никотинамида, была взята никотиновая кислота. В результате эксперимента было установлено, что производные нитрозомочевины снижают не только интенсивность использования одного или обоих предшественников для биосинтеза НАД, но и угнетают процессы, идущие с использованием НАД. Взаимодействие производных нитрозомочевины с тиогруппами нарушает их восстановление

147] и неиспользованный НАДФН2 вызывает по принципу обратной связи ингибирование использования НАД для биосинтеза НАДФ и как следствие -уменьшение интенсивности основного пути биосинтеза пуринов и пиримидинов. Таким образом, токсический и противоопухолевый эффекты препаратов этой группы связаны с ингибированием использования предшественников для биосинтеза НАД и как следствие, уменьшение концентрации НАД. Это обусловлено тем, что ингибирование одного из путей использования никотинамида для биосинтеза НАД приводит к нарушению соотношения скоростей биосинтеза ЛАД и поли(АДФ-рибозы) и в результате этого — к угнетению процессов восстановления повреждений структуры ДНК [113]. Следует отметить так же, что НАД, НАДФ являются участниками и многих других процессов.

Ы- нитрозо- N,N1- диметилмочевина действует на печень, кровеносные сосуды, канцероген в опытах на животных, слабый мутаген. При ежедневном введении по 12 мг/кг в течение 3 месяцев поражается преимущественно печень: зональная альтерация паренхимы, репаративная регенерация в виде зональной пролиферации соединительнотканных элементов и холангиол, очаговая пролиферация холангиоцеллюлярных элементов с одновременной регенераторной активацией паренхимы. Отмечается поражение кровеносных сосудов печени и других органов, частые кровоизлияния в брюшную и грудную полости. При шестимесячном введении той же дозы подавляются регенераторные и гиперпластические процессы в паренхиме печени. Гибель животных наступает с признаками недостаточности печени. В малых дозах же вызывает у млекопитающих системную стимуляцию роста и развития, повышая степень упорядоченности процессов в клетке и организме. Это приводит к повышению сопротивляемости к различным факторам стресса [27,30,147,163]. Ломустин, как и Т<Г- нитрозо- N,>1- диметилмочевина оказывает повреждающее воздействие на ткань печени [162,195].

Ы-нитрозотриметилмочевина обладает анестетическим действием в течение 2-3 часов после перорального введения, позднее появляются одышка и цианоз; гибель наступает от отека легких. При хроническом в/в и в/ж введении вызывает опухоли мозга, периферических нервов, кожи и её придатков, ЖКТ [30,62].

Изучение токсичности препарата 3-Ь-арабинопиранозил-1-метил-нитрозомочевины (аранозы) в остром и субхроническом экспериментах на экспериментальных животных (крысах б/п, мышах БНК, собаках б/п) показали, что у собак после введения (1-2сутки) наблюдались явления острой кишечной интоксикации (многократная рвота, понос, снижение массы тела). Рвоту расценивали, как проявление нейротоксичности. При вскрытии животных обнаружены кровоизлияния в париетальную и висцеральную брюшину - проявления местно-раздражающего действия, а так же наблюдалось увеличение массы сердца и почек, уменьшение массы вилочковой железы и селезенки. При изучении субхронического действия наблюдалась лейкопения и сдвиг лейкоцитарной формулы влево. У крыс наблюдалась протеинурия в течение двух месяцев введения. Исчезновение токсических проявлений препарата и нормализация функциональной деятельности наступала к концу первого месяца - крысы, мыши, к концу второго месяца- собаки [60,77,93]. При действии алкилирующих препаратов отмечено возникновение аллергических воспалительных реакций [63].

1.6.Канцерогенное действие препаратов группы нитрозоалкилмочевины.

Нитрозометилмочевина и нитрозоэтилмочевина вызывают опухоли у всех видов животных, на которых проводили исследования: мышей, крыс, хомячков, морских свинок, кроликов, собак, свиней и обезьян. При введении различными путями, в том числе и с кормом, вызывают доброкачественные и злокачественные опухоли нервной системы, желудка, пищевода, поджелудочной железы, дыхательного тракта, кишечника, молочных желез (самки), лимфоретикулярной ткани, кожи и почек [20,30,37,59,62,63,96,165,166,180,203]. Отмечена корреляция между способом введения препаратов и местом возникновения опухоли (используется для получения экспериментальных моделей опухолей) [6,29,37,68].

Были проведены эксперименты по изучению канцерогенного действия НЭМ на плод. С этой целью выделялись три группы животных, которым НЭМ вводилась за 1-3 дня до родов (1-я группа), через 3 месяца после рождения (2-я группа), и двукратно: за 1-3 дня до родов и за 3 месяца после рождения (3-я группа). В результате эксперимента в 1 группе животных часть опухолей была нейрогенного характера, во второй группе возникли новообразования различной локализации (матка, яичники, влагалище, толстая кишка), опухолей нервной системы не наблюдалось. В 3 группе обнаружены опухоли различной локализации, часть из которых были в ЦНС и ПНС. Так же, у животных 3 группы новообразования возникали в более короткие сроки, по сравнению с другими группами и имели большее разнообразие локализации. Таким образом, наблюдается взаимное усиление пре- и постнатального канцерогенного эффектов НЭМ у крыс [41,102]. При введении данного препарата (и других соединений этой группы) беременным самкам опухолевый процесс может возникать и в последующих поколениях. Опухоли различной локализации (гипофиз, молочная железа, поджелудочная железа, кожа) наблюдались и у самцов и у самок во втором и третьем поколениях [96,138]. Так же НЭМ оказывает канцерогенный эффект на экспериментальных животных (крыс), подвергшихся воздействию препарата в прогенезе [138]. При трансплацентарном введении нитрозоэтилмочевина способна вызывать опухоли нервной системы [92].

Диметилнитрозомочевина вызывает опухоли мозга, периферических нервов у крыс при парентеральном введении; вызывает опухоли при подкожном введении мышам, внутрижелудочном и внутривенном введении крысам [30,62,163,165,166].

Исследование канцерогенеза с введением НММ, ДМНМ, стрептозотоцина и аранозы у беспородных крыс в течение 21 месяца обнаружило возникновение опухолей во всех подопытных группах, с преимуществом у самок. Частота опухолей у крыс, подвергнутых воздействию аранозы и НММ, была выше, чем в других подопытных группах. У самок преобладали опухоли и предопухолевые изменения в молочной железе (мастопатии фиброзно-кистозного типа с признаками активной секреции в концевых отделах желез и выраженной внутрипротоковой пролиферацией эпителия с образованием сосочковых структур), матке, яичниках, надпочечниках. У самцов опухоли возникали чаще в области наружного слухового прохода, в различных участках кожи, встречались саркомы мягких тканей. У отдельных крыс встречались опухоли почек, гипофиза, атриума желудка, мочевого пузыря, печени, легких, фибросаркома подкожной клетчатки с метастазами в легкие. Опухоли крыс подопытных групп возникали в интервале с 3-го по 21-й месяц после введения противоопухолевых препаратов. Увеличение доз препаратов сокращало сроки возникновения опухоли. Развивавшиеся опухоли не имели существенных морфологических особенностей, которые можно было бы связать с действием того или иного производного нитрозомочевины. Это говорит о том, что все примененные препараты оказывают однотипное повреждающее действие на определенные структуры клеток мишеней, преимущественно эндокринозависимых органов, что завершается возникновением в них предопухолевых изменений и опухолей однотипного гистологического строения. В группах самок подвергнутых воздействию аранозы и ДМНМ, мастопатии и опухоли молочных желез сочетались с фолликулярными кистами яичников часто с железистой гиперплазией эндометрия матки, деформацией рогов матки. Особенный интерес вызвали опухоли почек у подопытных животных — определили 9 вариантов их гистологического строения. Все они имели злокачественный характер и характеризовались атипией, полиморфизмом, инфильтрирующим ростом. Предположительно, источником их развития послужил трансформированный эпителий проксимальных отделов извитых канальцев, из-за высокой метаболической активности, процессов реабсорбции, приводящих к повышению концентраций нитрозаминов в канальцах. У крыс всех подопытных групп были найдены морфологические признаки высокой гормональной активности коркового слоя надпочечников [37,69,200].

Проведенные исследования дали основания для предположения, что в развитии опухолевого процесса, в результате введения данных препаратов имеют значение два момента: 1) После первичной реакции клеток-мишеней с этими препаратами, которые являются супермутагенами, появляются клетки-мутанты с новыми биологическими свойствами, которые и являются источниками для развития опухолей. 2) Эндокринные нарушения — гиперфункция коркового слоя надпочечников, при которой создается иммунодепрессия, что является благоприятным фоном для возникновения и развития опухолей [111,147,164,189].

В настоящее время не существует объективных критериев для прямой экстраполяции на человека экспериментальных результатов, полученных на животных, равно как и данных экспрессных тестов. Поэтому в отсутствие достаточных эпидемиологических доказательств канцерогенности для человека, оценка канцерогенного риска для человека проводится с учетом всех имеющихся экспериментальных данных. Поэтому учитывая отсутствие эпидемиологических данных, ни одно нитрозосоединение, даже и проявившее чрезвычайно высокую канцерогенную активность в опытах на животных, не включено экспертами 1АЯС в группу 1- веществ, канцерогенных для человека. В группу 2А- веществ, вероятно канцерогенных для человека, включены следующие представители НАМ:

1,3-бис-(2-хлорэтил)-1 -нитрозомочевина (БХНМ), 1 -(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1 -нитрозомочевина, 1 -метил-1 -нитрозо-мочевина, 1 -этил-1 -нитрозомочевина [30].

1.7. Мутагенное действие препаратов группы нитроалкилзомочевины.

Препараты группы нитрозоалкилмочевин обладают нежелательным повреждающим действием в отношении нормальных делящихся клеток здоровых животных и опухоленосителей. Характер таких нарушений был исследован на примере синтеза ДНК в нормально делящихся клетках костного мозга и эпителия тонкого кишечника мышей в различные сроки (0140 часов) после однократного введения ряда нирозосоединений: НММ, нитрозодиэтилмочевины (ДНММ), стрептозотоцина, хлорозотоцина. Отмечалось глубокое, но обратимое ингибирование синтеза ДНК [41,44,45].

Введение 50 мг/кг нитрозометилмочевины внутрибрюшинно вызывает летальные мутации у мышей. В культуре фибробластов человека, мышей, гепатоцитов крыс под воздействием НММ обнаруживается необусловленный режимный синтез ДНК. В результате трансформации в культуре эмбрионов фибробластов хомячков, мышей крыс in vitro образуются клетки, которые вызывают опухоли при трансплантации экспериментальным животным [62,166,203]. Мутагенность нитрозоэтилмочевины выявлена для бактерий, низших и высших растений, дрозофил и др. [30,166]. Диметилнитрозомочевина обладает слабой мутагенной активностью [30].

1,3-Бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина взаимодействует с ДНК, вызывая мутации у бактерий, дрозофил и в клетках млекопитающих, а также хромосомные аберрации и обмен сестринских хроматид в клетках костного мозга мышей [30,198]. Хлорозотоцин обладает наименьшей мутагенной активностью [201].

1.8.Эмбриотоксическое действие препаратов группы нитрозоалкил мочевин.

При внутрибрюшинном введении 5 мг/кг нитрозометилмочевины самкам крыс на 15 день после оплодотворения у зародышей наблюдается массовая гибель клеток в эпендимном и плащевом слоях стенки больших полушарий головного мозга (выраженный цитотоксический эффект) уже через З-бч, максимум через 1-2суток после воздействия. При однократном внутрибрюшинном введении крысам по 5-10 мг/кг на 3,4 или 5 день беременности также отмечен эмбриотокстческий эффект, при введении 10-40 мг/кг на 9 день беременности — дозозависимый эмбриотоксический эффект, но и более раннее и более позднее введение также вызывало гибель эмбрионов. Ежедневное введение 3 мг/кг в первую неделю беременности вызывает тератогенные изменения, 20 мг/кг на 21 день вызывает изменения мозга у новорожденных, но не приводит впоследствии к опухолям этой локализации у крыс-потомков [5,30,62,71,166,203].

Для НММ описано трансплацентарное, бластомогенное, и эмбриотоксическое действие [1,2,5,71,95,132]. Установлена наибольшая чувствительность эмбрионов при введении препарата в первую треть эмбриогенеза (на стадиях дробления и имплантации зародыша). Были изучены и сопоставлены эмбриотоксические свойства аранозы, ДМНМ и НММ на половозрелых самках — мышах. По результатам исследования выявили - число мест имплантации на 1 мышь было одинаковым для всех групп и составляло примерно 6-8. В группе животных, получавших аранозу, в небольшом проценте случаев наблюдались лишь частично жизнеспособные плоды (уменьшенные в размерах, измененной окраски, слабо шевелящиеся, но без видимых отклонений в развитии органов). Все исследуемые препараты вызывали прерывание беременности: НММ - в 100% случаев, араноза - в 97,1%, ДМНМ - в 100% - оказывая свое токсическое действие преимущественно на ранней стадии развития плода. Для аранозы, ДМНМ характерно также отсроченное токсическое влияние на уже сформировавшиеся плоды, выражающееся в их гибели. Таким образом, эмбриотоксическое действие НММ, ДМНМ и аранозы наблюдается почти в 100% случаев, преимущественно на ранней стадии развития плода [1,2,5,68,71,189].

Чувствительность плодов крыс к нитрозоэтилмочевине оказалась многократно превышает таковую для взрослых особей. Введение крысам внутривенно на 9 или на 17 день беременности 20 мг/кг вызывало у потомства микроцефалию. При этой же дозе, введенной на 4 день беременности, погибло 40% потомства, а на 9 день - 25% . Введение на 15 день беременности однократно внутривенно по 20,60,70 и 80 мг/кг, привело к 50% гибели потомства при максимальной дозе, выжившие получили деформации конечностей; дозы 40-70 мг/кг дали дозозависимый эффект эмбриотоксического и тератогенного действия. Введение НЭМ во второй половине беременности вызывало у потомства опухоли в больших полушариях головного мозга, в том числе множественные злокачественные опухоли периферических и черепномозговых нервов. Видимых уродств, при этом не наблюдалось. Несмотря на чрезвычайно быстрый распад в организме, препарат передается потомству через материнское молоко в количествах достаточных для индукции опухолей [16,30,72,95,97]. Пре- и постнатальные канцерогенные эффекты препарата взаимно усиливаются [107]. 1,3-Бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина также обладает эмбриотоксическим и эмбриолетальным действием [30,62,165,166,198,199].

1.9. Действие препаратов группы нитрозоалкилмочевины на гемопоэз

Фармакологическое изучение НММ показало, что побочное действие препарата заключается, главным образом, в угнетении гемопоэза [25,28,74,147,203]. Препарат обладает дозозависимым миелодепрессивным действием, которое проявляется лейко- и тромбоцитопенией [28,74,179]. Степень угнетения и его длительность зависят от дозы и способа введения вещества. При десятикратном введении НММ внутрь в дозах 50-25 мг/кг/сут. большинство животных (крысы) погибает с явлениями глубокой лейкопении, тромбоцитопении и ретикулоцитопении. У погибших животных и у забитых на 20 сутки, после последнего введения препарата наблюдаются апластические процессы, развивающиеся в лимфоидной, миелоидной и, в меньшей степени, в эритробластической тканях кроветворной системы. Подкожное введение тех же доз переносится лучше - наблюдаемые при этом лейкопения и аплазия вилочковой железы и гипоплазия клеток селезенки и костного мозга носят обратимый характер. Десятикратное внутривенное и внутрибрюшинное введение препарата в дозе 20 мг/кг/сут вызывает обратимую лейкопению и гипоплазию вилочковой железы и костного мозга. При всех способах введения десятикратное применение НММ в дозе 10 мг/кг и шестикратное по 20 мг/кг/сут. не угнетает кроветворения. Патоморфолгические изменения выражаются в незначительной временной гипоплазии клеток вилочковой железы [57,58,147,180].

В максимально хорошо переносимых дозах ДМНМ не угнетает гемопоэза [27,147]. При хроническом введении животным (крысам) внутрибрюшинно на протяжении месяца в различных дозах препарат не действует на состав периферической крови.

Влияние на гемопоэз БХНМ при однократном внутрибрюшинном введении относительно невысоких доз препарата, сводится к резкому снижению числа лейкоцитов и значительному уменьшению отношения нейтрофилы/лимфоциты. Это действие препарата изучено в сравнении с его аналогом - хлорозотоцином, который в таких же дозах вызывал лишь незначительные изменения показателей гемограммы [147,159,183,198,201].

Характер токсических поражений, развивающихся у животных, получивших летальные исходы сводится, к гипоплазии костного мозга собаки, обезьяны). У выживших животных отмечаются обратимые лейкопения, тромбоцитопения и анемия. Особенность действия этих препаратов- отсроченный характер угнетения гемопоэза. Признаки миелодепресси появляются не сразу после введения препаратов, а спустя длительное время после воздействия (от 1 до 3 месяцев) [147,151,169,186,200]. В экспериментах на крупных животных обнаружены следующие особенности: у обезьян наблюдается развитие отсроченной нейтропении в форме двух «волн» уменьшения числа нейтрофилов, так же отмечена тромбоцитопения. У собак нейтропения непродолжительна, а тромбоцитопения вообще не развивается. В той или иной степени гематотоксичностью обладает араноза, которая выражается в уменьшении числа лейкоцитов, сдвиге лейкоцитарной формулы влево [60].

Препарат 1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина (ломустин) - в первую очередь угнетает миелопоэз. Гематологическая токсичность является дозообусловленной и кумулятивной, с проявлениями лейко- и тромбоцитопении [112,151,154,195].

1.10. Токсическое действие нитрозоалкилмочевин на структуры тканей различных органов.

При введении НММ в дозах 50-25 мг/кг/сутки отмечается атрофия герминативных элементов в семенных канальцах. При подкожном введении тех же доз наблюдается аплазия вилочковой железы и гипоплазия клеток селезенки, носящие обратимый характер. При всех способах введения десятикратное применение НММ в дозе 10 мг/кг и шестикратное в дозе 20 мг/кг приводит к незначительной временной гипоплазии вилочковой железы. Подкожное введение 0,3-0,7%-ого раствора НММ может вызвать в месте введения раздражение тканей вплоть до их некроза.

Длительное применение препарата в дозах 20 мг/мг/сут. вызывает развитие энтерита. При ежедневном введении НММ и ДМНМ по 12мг/кг в течение 3 месяцев поражается преимущественно печень, наблюдается: зональная альтерация паренхимы, репаративная регенерация в виде зональной пролиферации соединительнотканных элементов и холангиол, очаговая прлиферация холангиоцеллюляргных элементов с одновременной регенераторной активацией паренхимы. Отмечается поражение кровеносных сосудов печени и других органов, частые кровоизлияния в брюшную и грудную полости. При 6-ти месячном введении той же дозы подавляются регенераторные и гиперпластические процессы в паренхиме печени. Гибель животного наступает с признаками недостаточности печени [3,30,62,147,180,203].

Высокие дозы хлорэтилзамещенных НАМ оказывают повреждающее действие на костный мозг, сердечно-легочную систему, ЖКТ, почки, лимфатические ткани животных. Осложнения со стороны сердечно-легочной системы заключаются в развитии отека легких, инфаркта миокарда, субэндокардиальных и перикардиальных кровоизлияниях. В токсических дозах (Тумак. И Тмин.) препараты вызывают рвоту, повреждение слизистой оболочки кишечника и кровоизлияния в ЖКТ. Нарушение функции почек приводит у обезьян к прогрессирующей уремии, которая при применении высоких доз становится необратимой. Наблюдаются атрофические и геморрагические изменения в лимфоузлах. Токсические реакции со стороны печени и поджелудочной железы (иногда) развиваются в отдаленные сроки даже при применении минимально токсических доз [57,58,147,151,152,154,161,196].

Рядом исследований установлено, что НММ подавляет тимико-лимфатический аппарат в ранние сроки после введения [70].

Гепатотоксичность наиболее характерна для действия ЦГНМ [133,147]. Самым ранним ее проявлением служит уменьшение содержания гликогена и повышение содержания щелочной фосфатазы в ткани печени спустя 1-2 недели после приема препарата внутрь (собаки). Через 3-4 недели отмечается появление припортального фиброза, гиперплазия купферовских клеток. Эти изменения держатся в течение длительного времени (до 30 мес). В сыворотке крови спустя 2-3 недели после приема препарата наблюдается обратимое повышение активности аланинаминотрансферазы, сывороточной щелочной фосфатазы и изменение в спектре изоэнзимов лактатдегидрогеназы [147,185]. Нейротоксичность у обезьян проявляется в приступах рвоты сразу же после инфузии препарата и является результатом непосредственного действия ЦГНМ на ЦНС, в следствие быстрого проникновения препарата через гемато-энцефалический барьер [72].

1.11. Характер токсического действия лизомустина

Лизомустин (нитруллин) был синтезирован в Институте органического синтеза Уральского отделения АН СССР в середине 1980-х годов, в его молекуле хлорэтилнитрозомочевина соединена с редкой аминокислотой -гомоцитруллином. [75]

Лизомустин представляет собой смесь изомеров положения нитрозо-группы: 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитруллина (1) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-Ь-гомоцитруллина (2).

Из литературных источников известны два пути синтеза исследуемых препаратов. Первый путь синтеза нитруллина связан с карбамоилированием медного комплекса Ь-лизина (1) 2-хлорэтиллизоцианатом, не нашел своего широкого применения, т.к. компоненты не выпускались в СССР, процесс был труден и нетехнологичен, давал низкий выход продуктов, в качестве промежуточного продукта использовался фосген. В Институте органического синтеза Уральского отделения АН СССР в результате исследований была разработана технологически простая схема синтеза лизомустина с применением в качестве карбомоилирующего агента БХНМ и способ синтеза БХНМ основанного на использовании доступного сырья и исключавший применение фосгена [85,108,109].

В основу технологии получения лизомустина была положена схема синтеза, которая включала карбамоилирование медного комплекса L -лизина 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевиной, обработку образующегося медного комплекса Ы-(2-хлорэтилкарбамоил)-Ь-лизина щавелевой кислотой в кислой среде и нитрозирование Ы-(2-хлорэтилкарбамоил)- L-лизина без его выделения нитритом натрия с последующей нейтрализацией кислого раствора водным аммиаком [56,108,109].

Полученная на основании этого метода субстанция лизомустина представляет собой светло-желтый порошок, трудно растворимый в воде, мало растворимый в диметилсульфоксиде и очень мало растворимый в этиловом спирте. В кислых и щелочных средах он разлагается, как и другие соединения этого класса. По химическому составу лизомустин представляет собой многофунуциональное производное аминокислоты, содержащее в своем составе амино- и карбоксильную группы, легко гидролизуемый атом хлора, хлорофорную нитрозогруппу [131].

BCNU — сам является противоопухолевым препаратом и производится в США в качестве лекарственного средства. В США его синтезируют из этиленимина и фосгена. В Институте органического синтеза Уральского отделения АН СССР БХНМ был синтезирован из моноэтаноламина и мочевины, без процесса фосгенирования [14,75,147].

Изучение фармакокинетики и биохимических механизмов действия выявило существенные отличия препарата лизомустин по сравнению с известными нитрозоалкилмочевинами, применяемыми в клинической практике. Например, существенным отличием лизомустина от применяемых в клинике препаратов класса НАМ является то, что он представляет собой смесь изомеров положения нитрозогруппы [47,48,52,53,57,105].

В экспериментах in vitro показано, что при обработке ДНК в течение 26 часов в нейтральной среде при 37°С изомеры лизомустина действуют на вторичную структуру ДНК разнонаправлено: 1-й дестабилизирует ее в результате алкилирования оснований продуктами своего распада, а 2-й стабилизирует ДНК, благодаря межтяжевым сшивкам, образуемым хлорэтильным катионом, возникающим при его распаде. При этом действие изомеров в смеси близко к аддитивному при обработке ДНК в течение 4-х часов; при большей продолжительности аддитивность нарушается, что, по мнению авторов, объясняется взаимодействием между собой продуктов распада изомеров. При этом прослеживается связь противоопухолевой активности с количественной величиной деградационного и сшивающего эффектов. При изучении лизомустина в эксперименте in vivo и in vitro показано, что препарат в однократной терапевтической дозе через 46-96 часов после введения ингибирует синтез ДНК в опухолевых клетках на 80% и 90% соответственно [42,43,46,47,48,52,53,56,105,140]. Алкилирующая активность лизомустина значительно слабее по сравнению с НММ и BCNU (НММ - 100%, BCNU - 52%, лизомустин - 10%), карбамоилирующая активность лизомустина и НММ совпадают [46, 56,109].

Глубокое и длительное торможение синтеза ДНК при действии лизомустина может быть следствием как повреждения структуры молекулы ДНК матрицы, так и торможением активности ферментов, ответственных за синтез или репарацию ДНК. Например, ДНК полимераз. Ингибирование ДНК полимераз зарегистрировано через 48 часов после введения препарата. [42,43,48,52,53,56]

Исследование фармакокинетики фракции лизомустина 1 и 2, по радиоактивным меткам по лизину и мочевине, показали, что в начальной фазе после внутривенного введения препарата наблюдается быстрое снижение уровня радиоактивности в крови и её фракциях, которое обусловлено высокой скоростью поступления препарата в органы и ткани. Полупериоды выведения лизомустина 1 и лизомустина 2 из крови равны соответственно 9,2 и 4,5ч. Таким образом, время удерживания метаболитов лизомустина, содержащих метку по лизину, в 2 раза больше времени удерживания метаболитов препарата меченного по мочевине. Для фракций крови это соотношение возрастает в 4-6 раз, поскольку лизомустин подвергается в организме быстрым метаболическим превращениям с разрывом пептидной - ТЧН-СО- связи и образованием лозиновой и мочевинной частей молекулы [56].

Исследование механизма транспорта лизомустина в опухолевые клетки показало, что его перенос осуществляется системой активного транспорта для аминокислоты Ь-лизина, что при лечении лизомустина может стать причиной нарушения поступления лизина в клетки и вносить определённый вклад в его цитотоксическое действие [52,56,146].

При проведении экспериментов первой фазы исследования лекарственных препаратов, было показано, что основными видами токсичности лизомустина является гематологическая и гастроинтестинальная. Доз лимитирующая токсичность — тромбоцитопения [17,18,47,48,56,101].

Так уже через 24 часа после введения, лизомустин на 90% ингибирует синтез ДНК в клетках костного мозга. Восстановление синтеза ДНК в этих клетках до контрольных значений наблюдается через 48 часов после введения препарата. В то же время после введения активного изомера восстановление синтеза ДНК в клетках костного мозга идёт быстрее (30 часов). Аналогичные результаты в характере воздействия на синтез ДНК лизомустина были выявлены при изучении эпителия тонкой кишки [56].

В связи с активным началом клинических и доклинических исследований лизомустина в последнее время появилась новая информация о побочном действии препарата, которое проявляется лейкопенией, тромбоцитопенией, редко эритроцитопенией и снижением гемоглобина; так же отмечены тошнота, рвота, стоматит и анорексия; головная боль, заторможенность, вялость, разбитость и сонливость; геморрагический синдром; редко - аллергические реакции, алопеция, увеличение активности печеночных" проб, протеинурия, сосудистый коллапс. Побочные эффекты при лечении лизомустином обратимы и не лимитируют проведение химиотерапии [206 А].

Таким образом, анализируя литературные данные о биологической активности противоопухолевых лекарственных средств производных нитрозомочевины и ее производных следует отметить, что, эти соединения относительно хорошо изучены, как в плане механизма терапевтического действия на различные опухоли, так и в плане их побочных эффектов. Установлено, что одним из основных препятствий повышения эффективности специфической терапии опухолей является фенотип их множественной лекарственной устойчивости, формирующийся не только в процессе лечения, но и часто возникающий в результате индивидуальных особенностей опухолевой прогрессии у пациентов, ранее не подвергавшихся противоопухолевому лечению. Поскольку производные нитрозомочевины, как и большинство других противоопухолевых препаратов, действуют на клетки-мишени непосредственно, проникая в них, то поражают множество внутриклеточных молекулярных образований. Этот механизм проявляется при попадании веществ и в клетки здоровых тканей вызывая у больных ряд тяжелых побочных патологических явлений. В экспериментах на животных установлено, что производные >Т-алкил-1Ч-нитрозомочевины обладают мутагенной, канцерогенной активностью, воздействием на репродуктивную функцию, достаточно глубоко изучено их побочное токсическое действие на функциональное состояние различных систем и тканей организма.

Сведения об общей и специфической токсичности лизомустина-оригинального препарата из группы нитрозоалкилмочевин (НАМ), также обладающего противоопухолевой активностью, в литературе весьма ограничены. В фармакологических статьях содержатся информация, в основном, о механизме терапевтического действия на опухолевый процесс.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Физико-химические свойства исследуемых противоопухолевых препаратов.

Лизомустин — противоопухолевый препарат из класса алкилнитрозомочевин, представляющий собой смесь изомеров положения нитрозо-группы: 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитруллина и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-Ь-гомоцитруллина.

Структурная формула: а-СНг-СНг-ЫН-С-М- СН2-СН2-СН2-СН2-СН-СООН (I)

II I I

О N0 ИНг

С1-СН2-СН2-^-С-Ш- СН2-СН2-СН2-СН2-СН-СООН (И)

III I

Ж О Ш

Препарат представляет собой желто-белый порошок без запаха, с молекулярной массой 280,71 и диаметром частиц 0,1-0,7мм, плотностью 0,30,4 г/смЗ, плохо растворимый в воде (до 1,4%), рН 4,8-5,8 (водный 1% раствор), практически не растворяется в жирах, эфире, хлороформе, растворяется в 0,Ш соляной кислоте (1:15), не гидролизуется, не полимеризуется. Лизомустин термически устойчив.

БХНМ (С5Н9С12Ш02) - 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина -является одним из полупродуктов в синтезе противоопухолевого препарата лизомустина и относится к группе противоопухолевых препаратов из класса алкилнитрозомочевин.

Структурная формула:

Молекулярная масса 214,06. По внешнему виду БХНМ представляет собой бледно-желтый мелкокристаллический порошок без запаха, плотностью 0,6 г/смЗ. Не устойчив на свету и при повышенных температурах. Температура плавления 29-31°С. При комнатной температуре оплавляется, при температуре выше 40°С разлагается с выделением газообразных продуктов. Ультрафиолетовое излучение значительно ускоряет распад. БХНМ легко растворим в хлороформе (1:0,6) и эфире (1:1), легко растворим в спирте этиловом 95% (1:2), мало растворим в гексане (1:180) и спирте этиловом 10% (1:850), очень мало растворим в воде (1:200)

2.2. Организация и методическое обеспечение экспериментальных исследований.

2.2.1. Исследование параметров токсичности изучаемых препаратов.

Установление параметров токсического действия химического вещества- это часть общей проблемы исследования зависимости «доза-эффект» в токсикологии, фармакологии, радиобиологии и других областях медицины и биологии. Эта проблема уже в течение многих десятилетий заслуживает пристального внимания, как авторитетных ученых, так и начинающих исследователей [39,73,78,79,89]. Объективная и информация о зависимости «доза-эффект» на разных уровнях воздействия токсикантов (от смертельных до пороговых доз вредного действия) лежит в основе классификаций о токсичности и опасности токсических веществ, а также лежит в основе теории гигиенического регламентирования химических веществ в объектах окружающей среды.

В нашем эксперименте параметры токсичности веществ определялись при введении в брюшную полость, желудок и при поступлении через кожу.

2.2.2. Исследование раздражающего и кожно-резорбтивного действия.

В производственных условиях вторым по значимости после ингаляционного пути является поступление химических веществ через кожу. Имеющаяся информация о том, что среди нитрозосоединений спектр действия на кожу -.от полного отсутствия раздражающего действия до резких деструктивных изменений явилось предпосылкой для проведения исследований по выявлению кожно-резорбтивного действия лизомустина и БХНМ [100].

2.2.3. Исследование аллергенных свойств.

Принцип изучения аллергенного действия химических веществ (в том числе лекарственных препаратов) с целью гигиенического регламентирования изложен в методических указаниях [4,90]. Исследование аллергенных свойств лизомустина и БХНМ осуществляли методом выявления гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

2.2.4. Исследование кумулятивных свойств лизомустина проводили методом Lim et al. (1961).

Кумулятивные свойства определяли на крысах методом Lim R.K. et al (1961). Исследуемое вещество вводили в брюшную полость белых крыс ежедневно в нарастающих дозах, начиная с 0,1 DL5o и далее по схеме [64,176].

2.2.5. Исследование действия лизомустина на репродуктивную функцию.

В целях обеспечения безопасности производства и использования химических веществ и лекарственных препаратов требуется изучение не только общетоксического действия ксенобиотика, но и возможных отдаленных эффектов, в том числе и эмбриотоксического действия [128].

Для оценки репродуктивной функции в данной работе оценивалось:

- состояние потомства в антенатальном периоде развития;

- показатели массы и длины плодов потомства белых крыс, прироста массы плодов;

- внутриутробная гибель плодов; внутриутробная выживаемость, плодо-плацентарный индекс, коэффициент масса/длина плода;

- показатели средней массы плаценты у потомства;

- расщепление по полу у потомства белых крыс;

- рассчитывали показатели эмбриотоксического эффекта.

2.2.6. Исследование мутагенного действия препарата.

Для оценки мутагенного действия препарата применялся микроядерный тест in vivo, состоящий в исследовании полихроматофильных (ПХЭ) и нормохромных (НХЭ) эритроцитов на наличие микроядер. (Руководство ВОЗ 1989) [34].

2.2.7. Поиск возможных путей биотрансформации лизомустина.

Изучение основных путей биотрансформации лизомустина проводили с помощью использования ингибиторного анализа ферментных систем, потенциальной участвующих в деградации исследуемого вещества.

Участие монооксигеназ (МОГ) эндоплазматического ретикулюма исследовали путем активации ее фенобарбиталом и ингибировании четыреххлористым углеродом (СС14) [87,126].

Влияние лизомустина на состояние микросомального окисления оценивали по времени окисления гексенала [35,127].

2.2.8. Исследование характера «дозо-временной» зависимости К+, Na+-ATO-a3Hoñ активности при поступлении лизомустина в организм экспериментальных животных.

Для изучения динамики развития патологического процесса при интоксикации лизомустином мы сконцентрировали свое внимание на оценке активности К+, Na+-ATO-a3bi в динамике длительного поступления препарата в организм экспериментальных животных в нарастающих дозах. В качестве объекта исследования мы выбрали эритроциты белых беспородных крыс. Этот выбор обусловлен тем, что система энергообеспечения зрелого эритроцита более проста по сравнению с ядерными клетками: основной путь получения энергии в виде АТФ анаэробный (Эмбден-Мейргофа) через гликолиз (89%), где клеточным «топливом» являются шестиуглердные сахара (глюкоза, гликоген) [141,175,205].

В нашем эксперименте активность Na+-, К+ - АТФазы эритроцитов определяли по методу Рыбальченко В.К., Коганову М.М. (1988) [116,120].

2.2.9. Изучение состояния защитной (адаптационной) функции клеток.

Одновременно с активностью К+, Na+-AT<D-a3bi определяли состояние защитной (адаптационной) функции эритроцитов по содержанию глутатиона (по методу Ellman G.T. (1959) [158] в модификации Глушкова С.И.) и активности глутатионпероксидазы [31] с использованием в качестве субстрата третбутила. Расчет активности ферментов производили на грамм гемоглобина. Концентрацию гемоглобина определяли гемоглобинцианидным методом.

2.2.10. Экспериментальные животные и статистические методы обработки.

В качестве экспериментальных животных для проведения исследований в данной работе были использованы беспородные мыши, весом 18-20 г; белые беспородные крысы с исходным весом 180-200 г. Всего было использовано 100 белых мышей, 450 белых крыс. Все животные поступали из питомника Рапполово и содержались в виварии на стандартном рационе.

Полученные экспериментальные данные подвергалась статистической обработке с применением методов параметрической (критерий Стьюдента) и непараметрической статистики (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни, точный метод Фишера), метод корреляционного анализа. В качестве аналитических средств использованы программные продукты «Microsofb>:Windows-2010 ХР с пакетами Microsoft Word, Exsel-2010.

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование токсичности и характера действия лизомустина и БХНМ (кармустина) при однократном введении.

Параметры острой токсичности исследуемых веществ определяли на беспородных мышах и крысах при введении веществ в брюшную полость. Этот путь введения обосновывался тем, что параметры токсичности при данном поступлении близки к параметрам токсичности при поступлении через легкие. Перед введением лизомустин растворяли в 0,1N НС1. Мышам в брюшную полость препарат вводили в объеме 0,09 мл/Юг веса; крысам - 0,2 мл/100г. веса. Контрольные животные одновременно с подопытными в равных объемах получали растворитель (0,1N раствор НС1). На крысах были испытаны следующие дозы: 100; 150; 250 и 300 мг/кг; на мышах - 200; 260; 300 и 360 мг/кг. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней от момента введения препарата. При этом изучалась клиническая картина отравления, регистрировались сроки гибели животных. Параметры острой токсичности рассчитывали методом пробит-анализа в модификации В.Б.Прозоровского [103]. Клиника острого отравления через 15-20 минут после введения лизомустина в брюшную полость характеризовалась появлением клонико-тонических судорог, отеком передних и задних конечностей, парезом задних конечностей, адинамией. На 2-е сутки после введения отмечались диарея, тремор головы, сужение глазной щели. Гибель наступала на 2-7 сутки. У отдельных выживших животных через 2 недели сохранялись остаточные явления отравления в виде нарушения координации («шаткая походка»). Параметры острой токсичности лизомустина представлены в таблице 4.

Таким образом, по параметрам острой токсичности при введении в брюшную полость лизомустин относится к 4 классу токсичности (по К.К.

Сидорову, 1973) [130]; и по ЭЬ 50 при введении в желудок - к 3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76) [49].

Таблица

Параметры острой токсичности смеси изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина (лизомустина) при однократном введении

Вид животных Путь введения Доза, мг/кг

БЬ16 вь50 оь

Крысы (самцы) в брюшную полость 165 209(183,3-238,3)

Мыши (самцы) в брюшную полость 220 268 [237,2-302,8]

Крысы (самки) в желудок 1250 1650(1422-1914)

Среднесмертельные дозы предшественника лизомустина - БХНМ, определяли на крысах - самцах при введении в брюшную полость. Вещество растворяли в смеси этилового спирта с этиловым эфиром в соотношении 1:1 и вводили в брюшную полость. Контрольные животные одновременно с подопытными в равных объемах получали растворитель. Были испытаны следующие дозы: 35, 50 и 80 мг/кг. Клиника острого отравления БХНМ, в отличие от лизомустина характеризовалась вялостью, неопрятностью животных, появлением сукровичных выделений из носа, сужением глазной щели, выраженным снижением массы тела. Гибель наступала на 10-е сутки при воздействии относительно низких доз, близких к ВЬ50; на 2-3 сутки — при дозах, превышающих ОЬ50.

Рассчитанная по результатам исследования величина средне смертельной доза (ОЬ50) БХНМ, оказалась равной 40 мг/кг. Обращает на себя внимание то, что исходный продукт, используемый в клинической практике как противоопухолевый препарат почти на порядок (в 6,7 раза) токсичнее лизомустина. По-видимому, это объясняется более выраженным алкилирующей активностью БХНМ [46] и выраженным ингибиторным действием на активность глютатионредуктазы [191,197].

Таким образом, по параметрам острой токсичности при введении в брюшную полость БХНМ, в отличие от лизомустина, относится ко 2-му классу токсичности (ГОСТ 12.1.007-76) и в пять раз превосходит его по степени токсичности.

С этих позиций лизомустин, с учетом его терапевтических свойств, имеет перспективу противоопухолевого лекарственного средства с менее опасными токсическими побочными явлениями и менее опасным в условиях производства и, что не менее важно, при его использовании для персонала лечебных учреждений.

3.2. Исследование кожно-резорбтивного и местно раздражающего и аллергенного действия препаратов.

Наиболее распространенный метод изучения такого воздействия основывается на выявлении реакций организма, которые вызывает всасываемое через кожу вещество. В качестве показателей воздействия используются изменения интегральных показателей (вес, работоспособность, изменения центральной нервной системы, сердечно-сосудистой системы), а так же некоторые специфические показатели — уровень метгемоглобина, активность ферментов. Помимо регистрации резорбтивного действия, осуществляется наблюдение за кожной реакцией, которая может проявляться в виде ожогов, дерматитов, экзем и другими реакциями.

В проводимых нами экспериментах, кожно-резорбтивное действие изучали на половозрелых белых мышах. Для этого 25% мазь лизомустина на вазелиновой основе наносили на 2/3 хвоста с экспозицией 2 часа. Через 2 часа вещество смывали теплой водой с мылом, местное действие оценивали по изменению внешнего вида кожных покровов по сравнению с такими же II Ш1. II II I пиши участками кожи у контрольных животных сразу после воздействия и далее ежедневно в течение 10 дней.

Данные экспериментов показали, что лизомустин не оказывал раздражающего действия на кожу; не наблюдалось гибели животных, статистически значимого снижения массы тела и появления каких-либо других признаков интоксикации, как в момент нанесения, так и в последующий 10-дневный период наблюдения (таблица приложения №1).

Для БХНМ местное раздражающее действие исследовали на белых крысах. Из вещества и вазелинового масла готовили однородную массу (1:3) и наносили на выстриженный от шерсти участок кожи размером 2X2 см боковой поверхности туловища с экспозицией 4 часа. Через 4 часа вещество смывали теплой водой с мылом, местное действие оценивали по изменению внешнего вида кожных покровов по сравнению с такими же участками кожи у контрольных животных разу после воздействия и далее ежедневно в течение 10 дней.

Данные эксперимента показали, что БХНМ, в отличие от лизомустина, оказывал раздражающее действие на кожу в виде появления бледно-розовой эритемы с последующим появлением сухости и шелушения пораженных участков. Исследуемое вещество проникает через неповрежденную кожу, вызывая снижение массы тела и гибель животных.

Оценка раздражающего действия на слизистые оболочки проводилась при внесении в конъюнктивальный мешок глаза крыс лизомустина в вазелиновом масле (1:3) с последующей регистрацией видимых и скрытых повреждений роговицы в течение 3 суток. Скрытые повреждения роговицы выявляли с помощью 1% раствора флюоресцеина в 2% растворе ЫаНСОЗ. Через 4 часа и через сутки, признаков раздражения слизистых, а также видимых и скрытых повреждений роговицы не обнаружено.

Внесение препарата БХНМ в вазелиновом масле в соотношении 1:3 в конъюнктивальный мешок глаза крыс, не вызывало визуальных изменений слизистых и роговицы. Скрытых повреждений роговицы (тест с флюоресцеином) так же не обнаружено.

Изучение аллергенных свойств лизомустина и БХНМ проводилось в соответствии методом гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах весом 18-20г, путем введения препарата в полном адьюванте Фрейнда (ПАФ) [100].

Животных сенсибилизировали ЮОмкг лизомустина, однократно внутрикожно в основании хвоста. Сенсибилизирующая доза вещества эмульгируется в 60 мкл смеси полного адьюванта Фрейнда (ПАФ) и раствора Хенкса, рН 7,5, приготовленной в соотношении 1:1. Состав ПАФ: 1 мл ланолина, 3 мл вазелинового масла, 5 мг убитой нагреванием вакцины БЦЖ. В этот объем ПАФ добавляют 50 мкл твина и дистиллированной воды. Смесь автоклавируют. Контрольным животным вводили 60 мкл смеси без добавления изучаемого вещества. Для выявления сенсибилизации через 5 суток подопытным и контрольным животным в подушечку задней лапы вводили такое же, как и при сенсибилизации количество лизомустина, растворенного в растворе Хенкса. Через 24 часа измеряют инженерным микрометром МК-0-25 толщину обеих задних лап (величина отека -показатель ГЗТ). У контрольных животных она, как правило составляет 0,040,09 мм. Статистически достоверное превышение среднегруппового показателя ГЗТ опытных животных по сравнению с контрольными свидетельствует о наличии выраженных или умеренных сенсибилизирующих свойств у изучаемого соединения.

Полученные результаты для лизомустина и БХНМ свидетельствуют об отсутствии аллергенного действия обеих препаратов (таблица приложения № 2).

3.3 Кумулятивные свойства лизомустина.

При исследовании кумуляции (по смертельному эффекту), выявлено, что лизомустин относится к 4 классу слабо кумулирующих соединений (Ккум. > 5, по классификации Л.И.Медведя, 1965). Вместе с тем, установленное в ходе эксперимента постоянное и достоверное снижение массы животных, как интегрального показателя интоксикации, указывает на постепенное накопление токсического эффекта. Рисунок 1. я о о «Í у » -72.889Х + 272, = о OJC'V

Су ТКИ t , iÉí зза (г/кг)

Рис. 1. Динамика массы тела белых крыс при введении лизомустина в брюшную полость в зависимости от дозы, Кк0рр.= -0,91. Обозначения:---масса тела; — линия тренда

3.4. Исследование мутагенного действия лизомустина.

Микроядерный тест является краткосрочным тестом in vivo для выявления мутагенных свойств различных химических агентов (Руководство ВОЗ 1989).

Микроядра образуются из хромосомного материала, отставшего на стадии анафазы. В ходе митоза этот материал попадает лишь в одну из дочерних клеток. Он может оказаться включенным в основное ядро, или сформировать одно или несколько мелких ядер, так называемых микроядер. Легче всего их определить в клетках, лишенных основного ядра - в эритроцитах. Частоту микроядер проще определить в молодых эритроцитах после исключения основного ядра. Молодые эритроциты называются полихроматофильными (ПХЭ), тогда как зрелые - нормохромными (НХЭ). Индуцированные мутагеном микроядра, развивающиеся из хромосомных фрагментов, которые образовались в предшествующем клеточном цикле, появляются затем в ПХЭ не ранее, чем через 10 ч после экспозиции животного. Этот тест, используемый на цельном организме животного лишен недостатков, связанных с применением искусственных систем метаболической активации in vitro.

Исследования проводились на клетках костного мозга от молодых половозрелых беспородных белых мышей. Материал получен путем вымывания костного мозга из бедренной кости животного, предварительно подвергшегося декапитации. Затравка заключалась в однократном внутрибрюшинном введении тестируемого вещества - лизомустин, с последующим отбором через 30 часов. Выбор уровня доз основывался на величине максимально переносимой дозы и составил 200 мг/кг (примерно DL[6). Для подтверждения результатов эксперимента тест был проведен дважды, и вторая доза составила 100 мг/кг (примерно DL8).

Эксперимент проводился на 4 группах животных 2 контрольные группы - самки и самцы, 2 опытные группы - самки и самцы. Каждая группа составила 10 животных. Число учитываемых ПХЭ на одно животное было выбрано произвольно и составило 500 клеток. Было принято во внимание, что минимальная величина выборки планируется исходя из того, что спонтанный уровень мутаций составляет 2/1000. Обобщенные результаты исследования представлены в таблице 5.

Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке с применением непараметрического метода (Вилкоксона-Манна-Уитни) статистики (таблицы приложения №10,11,12,13).

Таблица 5.

Результаты исследования мутагенного действия лизомустина методом микроядерного теста на мышах

Пол животных Группы животных Доза 100 мг/кг Доза 200 мг/кг

ПХЭ/НХЭ Содержание ПХЭ с микроядрам и (ед./500 ПХЭ) ПХЭ/НХЭ Содержание ПХЭ с микроядрами (ед./500 ПХЭ)

Самцы контроль 0,93±0,08 0,7 1,00±0,06 0, опыт 0,83±0,09 3,5* 0,84±0,05 9,0*

Самки контроль 1,29±0,14 0,9 0,91 ±0,13 0, опыт 0,83±0,07* 3,4* 0,74±0,09 5,6*

Обозначения: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем, р<0,

Как видно из таблицы 5, различия по соотношению ПХЭ/НХЭ, отражающий цитотоксический эффект, в контрольных и опытных группах не достоверны. По количеству микроядер на 500 клеток в контроле и в опыте различия оказались достоверными. Таким образом, можно сделать вывод о том, что противоопухолевый препарат лизомустин обладает мутагенными свойствами, что является одним из важнейших механизмов его токсического действия с наличием потенциальной канцерогенной опасности (риска), проявление которой зависит от величины поступающих доз, и присущую другим цитостатикам представителям класса нитрозоалкилмочевин.

3.5. Исследование действия лизомустина на репродуктивную функцию.

При планировании исследования по выявлению опасности действия лизомустина на репродуктивную функцию мы учитывали информацию о том, что некоторые представители нитрозоалкилмочевин при однократных и повторных введениях в организм самок в различные сроки беременности вызывали дозозависимый эмбриотоксический эффект. Поэтому целью нашего исследования было установить наличия риска воздействия на репродуктивную функцию при длительном контакте женского организма с лизомустином до беременности. Исследования проводились на основании метода по ускоренной оценке потенциальной опасности химических веществ, для репродуктивной функции. Данный метод позволяет получить результаты в течение короткого срока (21 день), определяемого сроком беременности, применяется для скрининговых исследований, оценить величину суммарной химической нагрузки не только на взрослый организм, но и прогнозировать риск для популяции в целом [122].

Эксперимент проводился на половозрелых белых крысах-самках весом 180-200г., имеющих нормальный эстральный цикл, изученный за 14 дней до начала эксперимента. Препарат вводился подопытным животным ежедневно в дозе 0,013 мг/животное внутрибрюшинно, доза введения определялась на основании анализа параметров токсичности, величин терапевтических доз (МСТД, ВСТД), объема легочной вентиляции и расчетной величины ОБУВ для воздуха рабочей зоны. распространенного в фармакологии и токсикологии ингибиторного анализа [32]. Применяя индукторы и ингибиторы микросомальных ферментов можно за короткий срок выяснить степень участия микрососмальных МОГ в метаболизме, исследуемых веществ [22,122,124,125,126]. В наших исследованиях в качестве индукторов и ингибиторов микросомальных МОГ применяли фенобарбитал и четыреххлористый углерод.

Опыты проводили на половозрелых крысах-самцах. Лизомустин исследовали на животных с исходным весом 180-200г и с одинаковой способностью (скоростью) окислять гексенал. Все эксперименты проводили по следующей схеме. Первой группе в течение 3-х дней вводили в брюшную полость фенобарбитал в дозе 80 мг/кг. Через 24 часа после последнего введения фенобарбитала эти животные получали дозу исследуемого вещества, близкую к среднесмертельной. Второй группе животных за 24 часа до введения вещества (ДЛ50) в брюшную полость инъецировали СС14 в дозе 500 мг/кг. Контролем служила группа животных, получавших только исследуемое вещество в дозе ДЛ50, идентичной получаемой подопытными животными. Отравленные подобным образом животные находились под наблюдением две недели. По разнице в сроках гибели и количеству погибших подопытных и контрольных животных судили как об участии исследуемых систем в процессе метаболизма, так и о степени токсичности образующихся метаболитов. При проведении этого эксперимента соблюдались следующие условия:

- эксперимент проводился одновременно для опытных и контрольных групп;

- животные контрольных и подопытных групп были одного возраста, веса, пола (самцы), находится на одинаковом режиме питания;

- исследуемое вещество вводили из одной партии изготовления в равных объемах и одной концентрации.

3.8. Исследование характера «дозо-времеиной» зависимости состояния глутатиоиа и К+, Na+-ATФ-aзнoй активности в динамике поступлении нарастающих доз лизомустина в организм экспериментальных животных.

Известно, что при любой степени интоксикации для поддержания жизненных процессов в организме реализуются две основные задачи. Собственно детоксикация ксенобиотика (окисления, связывание, выведение) и неразрывно с нею связанная задача «изыскание» резервов для обеспечения энергией детоксицирующих процессов и покрытие возникающего энергодефицита [123,135,150].

Для изучения динамики развития патологического процесса при интоксикации лизомустином мы сконцентрировали свое внимание на оценке состояния глутатиона и активности К+, Ма+-АТФ-азы в динамике длительного поступления препарата в организм экспериментальных животных в нарастающих дозах. В качестве объекта исследования мы выбрали эритроциты белых беспородных крыс. Этот выбор обусловлен следующими обстоятельствами. Система энергообеспечения зрелого эритроцита более проста по сравнению с ядерными клетками: основной путь получения энергии в виде АТФ анаэробный (Эмбден-Мейргофа) - через гликолиз (89%), где клеточным «топливом» являются шестиуглердные сахара (глюкоза) [117,175].

С другой стороны, эритроцит обладает восстановительной системой большой мощности. Основным производителем восстановительных эквивалентов в эритроците служит пентозный путь (шунт), где происходит окисление одной молекулы глюкозы и образование 6 молекул С02 и молекул НАДФ Н2, который затем, главным образом, используется для восстановления глутатиона - основного восстановителя в эритроцитах

12,141]. Система глутатиона играет важнейшую роль в реализации физиологических процессов эритроцита: в поддержании гемоглобина эритроцитов в восстановленном состоянии, детоксикации различных ксенобиотиков, антиоксидантной защиты и т.д. Кроме того, мы учитывали, что эритроциты выполняют важнейшую функцию переноса кислорода ко всем органам и тканям. Нарушение этой функции приводит к развитию гемической и тканевой гипоксии, и как результат, к резкому падению энэргообеспечения и снижению общего функционального состояния организма. Кроме того мы имели ввиду информацию о том, что вещества с выраженными токсическими свойствами при острых отравлениях уже в относительно малых дозах (0,3 DL50) оказывают глубокие нарушения системы глутатиона [51,134].

Для моделирования интоксикации мы использовали наиболее популярный режим затравок, рекомендованный Lim R.K. et al (1961) для исследования кумулятивных свойств (Ккум.) химических веществ. Исследование кумулятивных свойств токсиканта, как обязательный этап гигиенического регламентирования промышленных ядов в объектах окружающей среды и, в равной степени, оценке вредности на этапе доклинических исследований лекарственных препаратов, является одним из важных критериев прогнозирования опасности (риска) формирования хронических отравлений.

3.8.1.Исследование динамики глутатиона

Содержание восстановленного глутатиона, определяемого по методу Ellman G.L в модификации С.И.Глушкова [51,158] и активность глутатионпероксидазы - по методу А.Н.Гавриловой и Н.Ф.Хмары [31].

В эксперименте были использованы 24 белые беспородные крысы мужского пола с исходным весом 285,9±5,5г. Препарат вводили в брюшную полость белых крыс ежедневно в нарастающих дозах, начиная с 0,1 DL50 по следующей схеме (Таблица 8).

Таблица

Дни введения 1-4 5-8 9-12 13-16 17-20 21-24 25

Ежедневно вводимая доза в долях от ОЬ50 0,10 0,15 0,22 0,34 0,50 0,75 1,

Вначале, исследуемые показатели (исходные) снимали у интактных животных, отобранных из общей группы случайным образом, перед началом введения. Затем от момента начала затравки исследовали на 4, 12 и 21 сутки при уровнях полученных животными суммарных доз 83,2мг/кг, 391мг/кг, 1402 мг/кг. Такой режим введения позволяет за относительно короткий срок проследить за динамикой исследуемых показателей на всех стадиях развития интоксикации: от недействующей и пороговой доз до выраженной интоксикации и дозы близкой к смертельной.

Расчет восстановленного глутатиона и глутатионпероксидазы производили на 1 грамм гемоглобина (в гемолизате эритроцитов), который определяли гемоглобинцианидным методом. Полученные результаты у отравленных крыс сравнивали с исходной величиной. Ход определения:

1. Получения образцов для исследования. Для получения образцов для исследований производили декапитацию лабораторных животных. Полученную кровь стабилизировали 4% цитратом в соотношении 1:9. Стабилизированную кровь подвергали центрифугированию в течение 10 мин ЗОООоб/мин, при температуре +2°С. Полученную взвесь трижды отмывали холодным физиологическим раствором, центрифугируя после каждого раза. Получение гемолизата производили с помощью добавления взвеси отмытых эритроцитов в

5мМ ТРИС-НС1 буфер с pH 7,6 в соотношении 1:9. Гемолиз происходил при температуре +4°С в течение 30 мин. 2. Непосредственное определение концентрации восстановленного глутатиона. Принцип метода заключается в образовании окрашенного продукта - 5-тио, 2-нитробензойной кислоты (ТНБ), при взаимодействии реактива Эллмана (ДТНБ - 5,5'-дитио-бис(-2-нитробензойной) кислоты) с кислоторастворимыми тиоловыми группами.

Из полученного гемолизата эритроцитов отбирали 0,6мл и добавляли 0,2мл 20% сульфосалициловой кислоты, с целью денатурации белка, после чего подвергали центрифугированию Юмин - ЗОООоб/мин. Полученный супернатант смешивали с раствором 0,1 М ТРИС-НС1 буфером с 0,01% ЭДТА pH 8,5. К полученной смеси добавляли ДТНБ (4мг коммерческого препарата ДТНБ «Boehringer Mannheim», Германия), разведенного в 1 мл абсолютного метанола. После развития желтой окраски пробы фотометрировали против дистиллированной воды при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. В работе использовали отечественный спектрофотометр СФ-121 («ЛОМО»). Формулу для расчета концентрации определяли исходя из экстинкций по калибровочному графику, построенному на основе растворов с известной концентрацией коммерческого препарата восстановленного глутатиона («Sigma») от 0,02 до 2 ммоль/л. Концентрация восстановленного глутатиона выражалась в мкмоль/г гемоглобина.

3. Непосредственное определение активности глутатионпероксидазы. Принцип метода заключается в утилизации восстановленного глутатиона ГП при инкубации гемолизата эритроцитарной взвеси с ГПТБ. Содержание ВГ в пробах до и после инкубации определяли в цветной реакции с ДТНБ, описанной выше.

Гемолизат эритроцитов, подготовленный по описанной в п. 1 методике, готовили в соотношении 1:219 с 5мМ ТРИС-НС1 буфером рН 7,6. Затем в опытные и контрольные пробы добавляли по 0,73 мл сложного 0,1 М ТРИС-НС1 буфера рН 8,5 (в 1 мл буфера содержалось 0,1 мг ЭДТА, 0,78 мг №N3 («Sigma», США) и 1 мг ВГ («Sigma», США) и инкубировали в термостате при +37°С в течение 10 мин. После этого в пробы вносили 70 мкл раствора ГПТБ, приготовленного разведением 70 % коммерческого препарата ("ICN", США) в дистиллированной воде в 500 раз. В контрольные пробы вместо раствора ГПТБ вносили 70 мкл Н20. Затем пробы инкубировали при температуре +37°С в течение 5 мин, и добавляли 0,2мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты. После центрифугирования к отобранному супернатанту добавляли ДТНБ и затем фотометрировали на СФ-121 («ЛОМО») и определяли количество ВГ (см. п. 2). Расчет активности глутатионпероксидазы производили на основании разницы количества ВГ в опытной и контрольной пробах и выражали в мкмоль/мин г гемоглобина.

На всем протяжении эксперимента регистрировалась динамика массы животных, как следует отметить, что с увеличением вводимой дозы наблюдалось практически линейное снижение веса животных (Ккорр=-0,91), что косвенно указывает на существенное в процессе воздействия общее истощение компенсаторных механизмов организма. Исследования показали, что введение лизомустина в течение первых четырех дней дозы 83,2 мг/кг вызывало повышение восстановленного глутатиона (ВГ) по отношению к исходу на 47,5 % и удерживалось на этом уровне в течение последующих восьми дней до получения суммарной дозы 391 мг/кг веса животных (величина максимально переносимой дозы, вводимой в течение одного курса лечения (14 дней) составляет 200 мг/кг), (таблица приложения №14)

Активность глутатионпероксидазы (ГПО), как видно на таблице 9, относительно исходной величины, была достоверно выше во все сроки наблюдения, постепенно нарастала с увеличением дозы и длительностью введения.

Полученные результаты свидетельствуют, с одной стороны о том, что лизомустин, как и другие алкилнитрозомочевины обладает высокой реакционной способностью, а с другой, о высокой степени защитной реакции в начале поступлении препарата в организм животных. Подобный эффект получен и при введении других цитостатиков, когда после начальной низкой дозы циклофосфамида высокая доза увеличивала содержание глутатиона в костном мозге [148].

Однако с увеличением дозы лизомустина уровень ВГ резко снижался. Так на 21 день при суммарно введенной дозе 1402 мг/кг в эритроцитах выживших животных его содержание (0,11мкМ/г Нв) было в 3,63 раза ниже исходного уровня (рисунок 2),

О 0,5 1 1,

Суммарная доза (г/кг)

Рисунок 2. Изменение содержания восстановленного глутатиона в гемолизате эритроцитов белых крыс при введении лизомустина в брюшную полость в нарастающих дозах.

Обозначения: 1. восстановленный глутатион; 2. линия тренда;* р< 0, что привело к резкому падению защитной функции эритроцитов, вызванных несоответствием количества поступающего яда и физиологического восстановительного потенциала пентозного пути.

Доказательством этого является обнаруженное нами постоянное снижение количества гемоглобина, также коррелирующего (Ккор= - 0,9) с увеличением вводимой дозы (Рисунок 3), что, по-видимому,

Таблица 9.

Активность глутатионпероксидазы при длительном введении лизомустина в организм крыс в нарастающих дозах (n=6, М±т, мкМ/мин/гНв)

Суммарная Доза (мг/кг) исход 83,2 391,0 1402,

Активность ГП 3,58±0,33 5,19±0,45 р*=0,01 6,35±0,4 р<0,01 8,23±0,43 р<0, достоверность по отношению к исходу частично связано с некоторым перераспределения потока глюкозы: снижением скорости гликолитических процессов и повышением окисления глюкозы через пентозо-фосфатный (аэробный) шунт, а также с некоторым увеличением гемолиза эритроцитов. Наши результаты вполне согласуются с результатами, полученными на эритроцитах доноров в опытах in vitro [12].

3.8.2.Исследование динамики энергетического обмена (по активности Na+, К+ - АТФ-азы).

Известно, что для обеспечения жизненно важных систем эритроцита тратится более 70% потребляемой глюкозы. Около 11% ее расходуется через пентозо-фосфатный путь (с использованием кислорода) на восстановление аденилатов, энергия которых используется на восстановление системы глутатиона, т.е. на защиту от экзогенных (в данном случае от алкилирующих метаболитов лизомустина) и высоко активных эндогенных метаболитов (перекиси водорода др.). у = 41Д7х2-91Д9х+ 123.8 К* = 0^

I I I I |1 " 1 I Ч. « Ч. | 'Т" I '"*" Ч

О 0,5 1 1,

Введенная доза (г/кг)

Рисунок 3. Со держание гемоглобина в крови при длительном введении лизомустина в организм крыс в нарастающих дозах. Изменение показателя относительно исходного достоверно во все сроки исследования, Р < 0,05.

Обозначения: 1 .Содержание гемоглобина, 2. Линия тренда

Более 60% глюкозы в виде АТФ, образующегося через систему гликолиза, расходуется АТФ-зной системой. Это относится к большинству животных клеток, особенно к некоторым эпителиальным клеткам, принимающим активное участие в процессах всасывания и секреции. Известно также, что. К+, Ыа+- активируемая АТФ-аза мембран эритроцитов обеспечивает перенос ионов натрия и калия, сопряженный с доставкой через мембрану глюкозы и аминокислот. При высокой концентрации ионов Ыа+ в клетке и ионов К+ в межклеточной среде (т.е. в условиях, обеспечивающих максимальный гидролиз АТФ) ионы натрия выходят из клетки, а ионы калия поступают в клетку по мере гидролиза АТФ [175].

Процесс трансмембранного активного транспорта лучше всего изучен в эритроцитах. Установлено, что концентрация К+ в цитозоле эритроцитов достигает примерно 110мМ, тогда как в плазме крови ЗмМ. В то же время концентрация Ыа+ в плазме крови достигает 140мМ, а в эритроцитах она равна приблизительно 4мМ. Для поддержания столь высоких трансмембранных градиентов требуется энергия АТФ. Для этого в мембране эритроцита содержится специализированный фермент - Ыа+,К+-транспортирующая - АТФ-аза, которая функционирует и как фермент и как молекулярный насос. Этот фермент катализирует превращение АТФ в АДФ, а высвобождающаяся в этом процессе свободная энергия, идет на установление физиологических концентраций Ыа+ и К+ внутри и вне клетки [174]. Перенос ионов натрия и калия через мембрану эритроцита, всегда сопряжен с доставкой через мембрану глюкозы и аминокислот.

Ыа+,К+ - АТФ-аза осуществляет перенос ионов в два этапа: 1-фосфолирирование фермента, т.е. происходит гидролиз АТФ с переносом концевой фосфатной группы на АТФ-азу, присоединение №+ и образование промежуточного фосфолирированного комплекса; 2- в присутствии ионов К+, при этом №+ освобождается во внеклеточную среду с одновременным гидролизом комплекса на свободный фермент и неорганический фосфор.

Гидролиз АТФ происходит только в том случае, если в клетке имеются ионы №+, а вне клетки ионы К+. В итоге процесса отщепляется переданный ферменту свободный фосфат и образуется АДФ. Эти продукты вновь идут на образование АТФ, за счет энергии, выделяющейся при расщеплении глюкозы.

Во всех этих процессах эритроциты могут использовать только внутриклеточный резерв АТФ, что позволяет по характеристике АТФ-азы судить о содержании АТФ [117,175]. При снижении концентрации АТФ в эритроците, происходит нарушение трансмембранного транспорта, что ведет за собой накопление ионов натрия и воды внутри клетки, в результате чего изменяется её осмотическое давление и клетка набухает. А так же происходит увеличение проницаемости мембран для гемоглобина и других цитоплазматических белков, что ведет к последующему разрушению эритроцита. Анализ кинетики К+,-Ыа+-АТФ-азы в мембранах эритроцитов и содержания в них гемоглобина, проведенный в нашем эксперименте, свидетельствует о высокой степени корреляции (Ккор = 0,93). (Таблица №10)

Таблица 10.

Динамика К+,^а+-АТФ-азы в мембранах эритроцитов и содержания гемоглобина в зависимости от введенной суммарной дозы экспериментальным животным

Суммарная доза, г/кг НЬ, г/л К+,-Ыа+-АТФ-аза, нМольРн/мг (белка/мин)

0 129,

0,08 109,

0,4 95,

1,9 75,

Ккорр - - 0,

Ккорр.= 0,

Исходя из выше изложенного определение активности Ыа+,К+ -АТФ-азы на фоне введения изучаемого препарата может быть достаточно информативным для выявления его механизма токсического действия, значительную роль в котором может играть угнетение активности макроэргических фосфатов.

Для определения активности №+,К+ - АТФ-азы нами был использован метод основанный на способности сердечного гликозида оубаина ингибировать №+,К+ - АТФ-азу. Определяли АТФ-азную активность мембранного препарата в определенной инкубационной среде и параллельно определяли АТФ-азную активность в присутствии гликозида. №+,К+ - АТФ-азная активность определяется как разница величины активности в среде с оуабаином и без него [116,120]. Метод рассчитан на АТФ-азу чувствительную к оуабаину. Роль оуабаина, заключается в том, что он ингибирует вторую стадию процесса транспортировки ионов (см. выше) -стадию калий зависимого гидролиза фосфолирированного фермента.

При исследовании динамики активности №+,К+ - АТФ-азы режим затравок был аналогичным при изучении динамики глутатиона (см. гл.3.8.1.)

Ход определения.

- Получение образцов для исследования. Для получения образцов для исследований производили декапитацию лабораторных животных Полученную кровь стабилизировали 4% цитратом в соотношении 1:9. Стабилизированную кровь подвергали центрифугированию в течение 10 мин ЗОООоб/мин, при температуре +2°С. Затем получали взвесь эритроцитов и готовили препараты мембран. Для этого Змл взвеси эритроцитов гемолизировали 15-ти кратным объемом ЮмМ ТРИС-НС1-буфером рН 7,4 и охлаждали при температуре +4°С в течение 40 минут. Затем полученную взвесь центрифугировали в течение Юмин при 15 т. об/мин с центрифуге с охлаждением (-4°С). Отбирали супернатант, осадок два раза промывали 5мМ ТРИС-НС1 рН 7,4. Мембраны переносили в мерную центрифужную пробирку, доводили до исходного объема раствором для промывания, гомогенизировали до однородности препарата. Для определения белка берут 0,2-0,4 мл, разведенного в 9 раз препарата.

- Определение активности №+,К+ - АТФ-азы. В опытные пробирки разливали по 0,9 мл инкубационной среды (в контрольные по 1мл), содержащей следующие компоненты: 5,0 мМ АТФ; 5,0 мМ MgC12; ЮОмМ ЫаС1; 20мМ КС1; 0,25мМ ЭГТА; 50мМ ТРИС-НС1 при рН=7,0. Параллельно разливали по 0,9 мл инкубационной среды, содержащей все вышеперечисленные компоненты той же концентрации, а так же оуабаин (в нашем случае строфантин) в концентрации 1мМ.

Все пробирки помещали на водяную баню и после создания в них температуры 37°С по секундомеру добавляли белок 0,1 мл (из раствора с исходной концентрацией 500-1000 мкг/мл). Инкубировали 10 мин при температуре 37°С, а затем останавливали реакцию добавлением во все пробирки по 1мл холодной 10% ТХУ. Для выявления образовавшегося неорганического фосфора производили окрашивание добавлением 0,5 мл 2,5 % -го молибдата аммония на 5н. Н2Б04 и 0,5 мл 2% свежеприготовленной аскорбиновой кислоты. Для развития окраски пробы стояли ЗОмин., затем их колориметрировали при длине волны 680 нм против пробы, не содержащей белка, на СФ-121 («ЛОМО»). В следствии того, что фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой комплексное соединение, которое легко восстанавливается различными восстановителями (метод Фиске-Суббароу). развивается окраска синего цвета — цвета молибденовой сини.

Расчет активности фермента производили по формуле: А= ЛЕ1000* 1000/ЩЗ И = нмоль (Рн)/ мг(белка)*мин.

Где АЕ - изменение экстинкции; 1000 - перерасчет на мг белка; К-калибровочный коэффициент*; 31 - молекулярная масса фосфора; ] -количество белка в пробе (мкг); 1000 — перерасчет на нмоль Рн; Ь - время инкубации (мин). *Для получения значения калибровочного коэффициента был построен калибровочный график, на основе растворов КН2РО4 известных концентраций (в 1мл содержание Рн в мкг - 7,5;10;15;20;25;50), значение калибровочного коэффициента = Е/С., в нашем случае К=0,05.

Результаты нашего исследования активности К+, -АТФ-азы в мембранах эритроцитов представлена на рисунке 4, на котором видно, что активность мембранной К+, Ыа+ -АТФ-азы сохранялась на уровне близкому к исходу (физиологическому уровню) только при введении ежедневно 0,02 г/кг лизомустина в течении 4 дней (суммарно 0,08 г/кг). Последующее резкое падение активности АТФ-азы на фоне увеличения разовых и суммарной доз указывает на необратимое истощение пула АТФ. Это может быть связано с комплексом факторов возникающих при внутриклеточном поступлении алкилирующих веществ: 1) с увеличением потока глюкозы через аэробное окисление пентозного шунта для увеличения производства восстановителей (НАДФ-Н2); 2) с ростом потребления АТФ на обеспечение внутриклеточного гомеостаза (ионных градиентов, сопряженных с доставкой глюкозы аминокислот) при постоянном увеличение токсической нагрузки и, как следствие, нарушение физиологического контроля, поддерживающего соотношение аденилатов и АТФ на постоянном уровне. у = 151.8х2-264»8х + 135,0 = 0,

О 0.4 0,8 1.

Введеннаядоча (г/кг)

Рисунок 4. Активность К- -АТФ-азы в мембранах эритроцитов при длительном введении лизомустина в организм крыс в нарастающих дозах. Обозначения:

1. Динамика К+,-Ыа+-АТФ-азы

2. Линия тренда, * р< 0,

3. Ккорр= - 0,

Итак, в эксперименте на крысах, используя в качестве объекта исследования эритроциты периферической крови, получены данные о механизме развития патологического процесса при действии лизомустина, свидетельствуют о том, что пусковым звеном развития патологического процесса является формирующийся дефицит энергии и последующее за этим падение уровня восстановленного глутатиона. Так, содержание ВГ после введения крысам суммарной дозы лизомустина 391 мг/кг было в 1,5 раза выше исходного уровня, в то время активность К+,-Ыа+-АТФ-азы в мембранах эритроцитов при получении той же дозы находилась в 2,5 раза ниже исходного уровня, содержание гемоглобина ниже исхода в 1,35 раза, а масса животных (интегральный показатель энергетического потенциала организма) была снижена по отношению к исходу на 20,8%. Падение общего энергетического потенциала организма может в значительной степени снижать скорость репарационных процессов повреждений ДНК и, таким образом, снижать терапевтическую эффективность препарата. Кроме того при попадании лизомустина в здоровый организм нарушение энергетического обмена увеличивает вероятность развития специфического повреждения ДНК с последующим развитием отдаленных последствий.

Полученные нами результаты, а также имеющиеся литературные данные научной литературы о характере неспецифического (побочного) токсического воздействия некоторых цитостатиков [50,51,66,67,94] позволяют высказать предположение о том, динамика развития патологического процесса в ядерных клеточных популяциях других тканей (печени, почках, легкие, сердце и др.) при отравлении лизомустином будет иметь характер близкий к тому, что мы наблюдали в эритроцитах.

Заключение диссертации по теме «Токсикология», Битти, Мария Александровна

ВЫВОДЫ

1) В эксперименте in vivo (на мышах) установлена мутагенная активность смеси изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина (лизомустин) относится к 1 классу опасности, чрезвычайно опасные вещества.

2) По величине острой токсичности при введении в брюшную полость смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина относится к 4 классу токсичности; БХНМ - ко 2 классу токсичности (по классификации К.К. Сидорова, 1973).

3) Смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина не обладает кожно-резорбтивным, раздражающим действием на кожу и слизистые глаз; БХНМ вызывает умеренное раздражение кожи, не раздражает слизистую глаз; проникает через неповрежденные кожные покровы, оказывая токсические эффект.

4) Смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина и БХНМ не вызывают состояние сенсибилизации.

5) Смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина принадлежит к 4 классу слабо кумулирующих соединений.

6) При поступлении в организм смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина оказывает ингибирующее действие на активность цитохром - Р450-зависимых монооксигеназ.

7) Полученные данные о механизме развития патологического процесса при действии смеси изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина в эксперименте на животных свидетельствуют о том, что важным звеном развития токсического процесса является формирующийся дефицит энергии и снижение уровня восстановленного глутатиона.

8) Смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина, вводимая ежедневно в течение 30 дней до зачатия в дозе 0,13 мг/кг (1/1538 ДЛ5о -расчетная пороговая доза по общетоксическому эффекту), не вызывала нарушений репродуктивной функции у экспериментальных животных (крыс).

9) Смесь изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина не нуждается в установлении величины гигиенического регламента для воздуха рабочей зоны (МУ 1.1.726-98 «Гигиеническое нормирование лекарственных средств в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе населенных мест и воде водных объектов»). Содержание изомеров 2-хлорэтилнитрозо-Ь-гомоцитруллина в воздухе производственных помещений не должно превышать нижний предел измерения, равный 0,001 мг/м . В условиях производства исключается любой производственный контакт с данным соединением.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с принятием решения «исключить контакт с лизомустином и 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевиной (БХНМ) при их производстве и применении» их производство необходимо осуществлять с использованием современных «барьерных технологий», обеспечивающих наиболее жесткие требования к защите персонала и качеству (чистоте) лекарственного препарата, в соответствии с требованиями нормативных документов России и Европейского Союза.

2. Специалистам больничной гигиены обеспечить безопасные условия труда медицинских работников, осуществляющих противоопухолевую специфическую терапию цитостатиками, производными >ї-нитрозалкилмочевины, в том числе лизомустином.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Битти, Мария Александровна, 2012 год

1. Александров В.А. Канцерогенный эффект ДМБА у крыс / В.А. Александров Н. П. Напалков // Вопросы онкологии. 1974. - Т.20, №12 (8). - С. 76-82.

2. Алексеева О.Г. К методике аллергенных свойств химических веществ / О.Г. Алексеева, Л.И. Петкевич // Гигиена и санитария.-1972. № 3. - С. 64-67.

3. Андрианова М.М. К механизму трансплацентарного воздействия химическими канцерогенами / М.М. Андрианова // Канцерогенные Ы-нитрозосоединения действие, образование, определение. Таллинн. - 1973. - С. 86-87.

4. Арчаков А.И. Микросомальное окисление / А.И. Арчаков. М. : Наука, 1975.- 156 с.

5. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран / А.И. Арчаков. М. : Наука, 1983.-357 с.

6. Арчаков A.M. Окислительная модификация цитохрома Р450 и других макромолекул в процессе их обновления / A.M. Арчаков,

7. B.Т. Згсда, И.И. Карузина // Вопр. мед. химии. 1997. - Т. 43, № 1.1. C. 3-27.

8. Атауллаханов Ф.И. Зависимость скорости функционирования пентозного пути от степени восстановленности глутатиона / Ф.И. Атауллаханов, A.M. Жаботинский, A.B. Пичугин // Биохимия. -1981.-Т. 46, №3.-С. 530-41.

9. Багирова B.JI. Новая лекарственная форма противоопухолевого препарата Бис-хлорэтил-нитрозомочевины (БХНМ) / B.JI. Багирова, Н.Е. Рышкова, Н.А.Оборотова // Ведомости НЦ ЭГКПС. 1999.-№1.- С. 15-19.

10. Бедняк А.Е. К анализу нитрозоалкилмочвин / А.Е. Бедняк, В.Ф. Гуськов, О.В. Морозова // Канцерогенные N-нитрозосоединения -действие, образование, определение. Таллинн. 1981. - С. 28-31.

11. Белоконь О.М. Опухоли, возникающие у мышей под действием нитрозоэтилмочевины, передаваемой через материнское молоко / О.М. Белоконь // Канцерогенные N-нитрозосоединения действие, образование, определение. Таллинн. - 1978. - С. 21-23.

12. Бесова Н.С. Результаты клинического изучения новых противоопухолевых препаратов навельбина и нитруллина при немелкоклеточном раке легкого: автореф. дис. канд.мед.наук / Н.С. Бесова-М. 1997.

13. Бесова Н.С., Горбунова В.А. Предварительные результаты изучения нитруллина на немелкоклеточном раке легкого/ Н.С. Бесова, В.А. Горбунова //Материалы юбилейной науч. конф. «Проблемы торакальной онкологии» М., 1997. - С.-36.

14. Блохин H.H. Химиотерапия злокачественных опухолей / H.H. Блохин. М. : Медицина, 1977. - 198-209 с.

15. Блохин H.H. Химиотерапия опухолевых заболеваний / H.H. Блохин, Н.И. Переводчикова. М. : Медицина, 1984. - 57-59 с.

16. Блюхтерова Н.В. Препараты класса нитрозоалкилмочевин в отечественной противоопухолевой химиотерапии / Н.В. Блюхтерова, Д.Б. Корман, Л.А. Островская // Российский биотерапевтический журнал. 2004.- № 1. - С. 24-36.

17. Болыпев В.Н. Индукторы и ингибиторы ферментов метаболизма лекарств / В.Н. Болыпев // Фармакология и токсикология. 1980. -№3. - С. 373-378.

18. Булат Ю.В. Химиотерапия диссеминированной меланомы (новые комбинации и режимы): автореф. дис. канд.мед.наук / Ю.В. Булат -М., 1991.

19. Булкина З.П. Действие новэмбитола на ультраструктурные компоненты клеток опухоли Герена / З.П. Булкина, Б.Д. Монастырская // Материалы Первой Всесоюзной конференциипо химиотерапии злокачественных опухолей. Рига. 1968. - С. 284-285.

20. Булкина 3. П. Противоопухолевые препараты / 3. П. Булкина. -Киев : Наукова думка, 1978. 12-14 с.

21. Буров Ю.В. Проблемы экологической безопасности человека в химико-фармацевтической промышленности / Ю.В. Буров. М. : Наука, 1995.- 132-140 с.

22. Вермель Е.М. О противоопухолевом действии и фармакологических свойствах 1М,.\1-диметилнитрозомочевины / Е.М. Вермель, С.А. Турсунова, Л.А. Островская // Научные труды

23. Ташкентского университета им. В.И. Ленина. 1973. - Вып. 457. -С. 77-81.

24. Вермель Е.М. Клиническое изучение противоопухолевых свойств нитрозомочевины. Применение химических мутагенов в сельском хозяйстве и медицине / Е.М. Вермель, Н.П. Корман. М. : Наука, 1973. - 77-86 с.

25. Власов H.H. Индукция нитрозометилмочевиной опухолей мочевого пузыря у крыс/ H.H. Власов, В.В. Худолей, P.M. Балански //Канцерогенные N-нитрозосоединения — действие, синтез, определение: материалы 2-го симпозиума. Таллин. 1975. - С. 3334.

26. Гадаскина И.Д. Использование фармакологических тестов для анализа механизма действия промышленных ядов / И.Д. Гадаскина, Ж.И. Абрамова // Актуальные проблемы гигиенической токсикологии. М., 1980. - С. 67-72.

27. Гершанович М. Л. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей / М. Л. Гершанович, В.А. Филов, М.А. Акимов. СПб : Сотис, 1999.-7-10 с.

28. Гигиенические критерии состояния окружающей среды // Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенныхи канцерогенных химических веществ. ВОЗ, Женева, 1989.- № 51. -С. 108-123.

29. Гиларян М.С. Новые данные к применению гексеналовой пробы в токсикологическом эксперименте /М.С. Гиларян // Гигиена труда и профзаболевания. 1976. - № 10.- С. 49-50.

30. ГН 1.1.701-98. Гигиенические критерии для обоснования необходимости разработки ПДК и ОБУВ (ОДУ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны, атмосферном воздухе населенных мест, воде водных объектов. М., 1998. - № 15. - С. 6.

31. Голиков. С.Н. Общие механизмы токсического действия / С.Н. Голиков, И.В. Саноцкий, JI.A. Тиунов. JI. : Медицина, 1986. - 279 с.

32. Голубев A.A. Кинетическая токсикология / A.A. Голубев JI. : Медицина, 1973. - 287 с.

33. Топко В.Ф. Изучение продуктов распада нитруллина в нейтральных и основных водных растворах / В.Ф. Топко, Л.Б. Радина // Химиотерапия опухолей в СССР. 1982. - Вып. 36. - С. 236-240.

34. Топко В.Ф. Получение водорастворимых солей нитруллина и изучение их противоопухолевой активности / В.Ф. Топко, Л.В.Авилушкина, Г.М. Аношина // Химиотерапия опухолей в СССР. 1983. - Вып. 38. - С. 12-18.

35. Горбачева Л.Б. Исследование механизмов лекарственной устойчивости к нируллину (лизомустину) / Л.Б. Горбачева, Л.Ю. Дедерер // Российский биотерапевтический журнал. 2005 - т. 4, № 3. - С. 42-47.

36. Горбунова В.А. Результаты 2 фазы клинического изучения нитруллина / В.А. Горбунова, Н.С. Бесова, З.Г. Кадагидзе //Мат. юбилейной науч. конф. «Проблемы торакальной онкологии». -1997. С. 36.

37. Горбунова В.А. Нитруллин новый оригинальный отечественный препарат из группы нитрозомочевины / В.А. Горбунова, Н.Ф. Орел, О.В. Семина // Вопросы онкологии. - 2001. - Вып. 6. - С. 660- 683.

38. ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. М.1976. -№579 - 5 с.

39. Глушков С.И. Состояние системы глутатиона в тканях печени крыс при острых отравлениях циклофосфаном / С.И. Глушков, С.А. Куценко, А.И. Карпищенко и др. // Токсикологический вестник. -2003.- №4. С.25-30.

40. Глушков С.И. Нарушения системы глутатиона и их роль в патогенезе острых интоксикаций ксенобиотиками с различными механизмами токсического действия: автореф. дис. док.мед.наук / С.И. Глушков СПб., 2006 - 45с.

41. Гудцова К.В. Противоопухолевая активность и механизм действия нового препарата из класса алкилнитрозомочевин / К.В. Гудцова, Г.В.Кукушкина, Л.Б. Горбачева // Хим.- фарм. Журнал. 1991. - №9. -С. 10-15.

42. Гуськова Т.А. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии доклинического изучения / Т.А. Гуськова // Хим.-фармацевт. журнал. 1990. №7.- С. 10-15.

43. Давыдов В.Ф. Вопросы медицинской токсикологии в курсе фармакологии / В.Ф. Давыдов. Горький. : ГМИ, 1982. - 341-345 с.

44. Давыдов М.И. Экспериментальная онкология на рубеже веков / М.И. Давыдов, А.Ю. Барышников. М. : Издательская группа РОЩ им. H.H. Блохина РАМН, 2003. - 147-159 с.

45. Дементьева Н.П. Нитрозометилмочевина в клинической химиотерапии злокачественных опухолей / Н.П. Дементьева // Вопросы онкологии. 1988. - том 34 - Вып. 1. - С.8-13.

46. Дементьева Н.П. Нитрозометилмочевина — 30 лет изучения и применения для лечения онкологических больных / Н.П. Дементьева, Д.Б. Корман // Вопросы онкологии. 2001. - Вып. 6. -С. 654-659.

47. Зитаре И.Я. Патоморфоз при химиотерапии опухолей / И.Я. Зитаре. Рига : Зинатне, 1984-8-12 с.1. ЯШ

48. Журавлев В.А. Индукция опухолей у крыс нитрозомочевиной и реакция тучных клеток / В.А. Журавлев // Канцерогенные N-нитрозосоединения — действие, образование, определение. -1973. -С. 47-49.

49. Каткувене Ю. И. О распределении в организме соединений из класса нитрозоалкилмочевин / Ю. И. Каткувене // Тезисы всесоюзного симпозиума «Биологический эффект канцерогенных N-нитрозосоединений». — 1980. С. 71-74.

50. Кашуро В.А. Состояние системы глутатиона и перекисного окисления липидов в тканях печени и почек крыс при острых отравлениях циклофосфаном / В.А. Кашуро, А.И. Карпищенко, С.И. Глушков // Нефрология. 2006. - Т. 10, №2. - С.81-85.

51. Клеянкина В.В. Сравнительное исследование на мышах эмбриотоксических свойств 4-х нитрозомочевин: НММ, ДМНМ,стрептозотоцина и аранозы / В.В. Клеянкина // Химиотерапия опухолей в СССР. 1979. - Вып. 30. - С. 107-111.

52. Клеянкина В.В. Отдалённые последствия применения нитрозометилмочевины, диметилнитрозомочевины, стрептозотоцина и аранозы у беспородных крыс /В.В. Клеянкина, И.К. Бухарова, С.Ф. Юшков // Химиотерапия опухолей в СССР. -1980.-Вып. 32.-С. 140-145.

53. Козлов К.Г. Изменения со стороны тимико-лимфатического аппарата в процессе бластомогенеза индуцированного нитрозометилмочевиной / К.Г. Козлов // Канцерогенные N-нитрозосоединения — действие, синтез, определение. Таллинн. -1973.-С. 88-90.

54. Копанев В.А. Метод вероятностной оценки тонического эффекта / В.А. Копанев, Э.Х. Гинзбург, В.Н. Семенова. Новосибирск: Наука, 1988.- 122 с.

55. Корман Н.П., Бычков М.Б. Клиническое изучение токсичности нитрозометилмочевины. Побочное действие лекарственных средств / Н.П. Корман, М.Б. Бычков. М. : Медицина, 1976. - 257-263 с.

56. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии / Д.Б. Корман. М. : Практическая медицина, 2008. - 64-88 с.

57. Корякина Р.Ф., Косарев В.А., Лунин Т.А. Значение цитологических исследований в оценке противоопухолевого действия химиотерапевтических препаратов / Р.Ф. Корякина, В.А. Косарев, Т.А. Лунин // Цитология. 1966. - Т 8, №3 - С. 432-435.

58. Краснова М.А. Исследование устойчивости и стабильности растворов аранозы / М.А. Краснова, П.В. Лопатин, М.М. Муралимов // Химиотерапия опухолей в СССР. 1979. - Вып. 28 -С. 136.

59. Критерии выявления ранних признаков интоксикаций при гигиеническом регламентировании: методические рекомендации. — СПб, 1996.-С 24-25.

60. Криштопенко C.B. Доза-эффект / C.B. Крипггопенко, М.С. Тихов, Е.Б. Попова. -М. : Медицина, 2008. 288с.

61. Круглякова К. Е. Модификации ДНК алкилирующими соединениями / К. Е. Круглякова // Успехи химии. 1985. - T.LIV -Вып. 9.-С. 1527-1537.

62. Купчан Д.З., Манзюк Н.В. Характеристика отдельных противоопухолевых препаратов / Д.З. Купчан, Н.В. Манзюк // Химиотерапия противоопухолевых заболеваний / под ред. Н.И. Переводчикова. М., 2000. - С. 45-84.

63. Курляндский Б.А., Филов В.А. Общая токсикология. / Б.А. Курляндский, В.А. Филов. М. : Медицина, 2002 - 608с.

64. Лагидзе Д.Р. О синтезе некоторых новых аралкилнитрозомочевин / Д.Р. Лагидзе, Э.И. Кердикошвили, Н.Г. Туркия // Канцерогенные ТчГ-нитрозосоединения действие, образование, определение. Таллинн. - 1981. - С. 41-45.

65. Лазарев Н.В. Основы промышленной токсикологии / Н.В. Лазарев. -Л. : Медгиз, 1940. 389 с.

66. Ляхович В.В. Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков / В.В. Ляхович, И.Б. Цырлов. Новосибирск : Наука, 1981. - С. 242.

67. Материалы к обоснованию ОБУВ бисхлорнитрозомочевины воздухе рабочей зоны. Медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих предприятий. Уральское отделение АН СССР. Институт химии БНЦ. 1991 г.

68. Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны. -М., 1980. 19 с.

69. Методические указания к требованиям постановки исследований по обоснованию ПДК промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы. М., 1996.

70. Методические указания к гигиеническому нормированию лекарственных средств в воздухе рабочей зоны, атмосферы населенных мест в воде водных объектов. — М.,1998. С. 4.

71. Мощевичюте-Эрингене Е. В. Изменение иммунобиологических свойств опухолей под влиянием алкилирующих препаратов / Е. В. Мощевичюте-Эрингене. -М. : Медицина, 1975. 50-51,100-105 с.

72. Муханов В.И. Новый противоопухолевый препарат араноза / В.И. Муханов, Г.Н. Платонова, Н.М. Перетолчина и др.//Химиотерапия опухолей в СССР. - 1980. - Вып. 32. - С. 133-139.

73. Островская Л.А. Противоопухолевая активность различных производных нитрозомочевины /Л.А. Островская, С.А. Кругляк, Е.М. Вермель // Вопросы онкологии. 1966 (12). - № 10. - С. 83-7.

74. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнения кожи: МУ 2102-79. М., 1980. - С 23.

75. ПетуховаИ.Н. Сравнительное клинико-фармакологическое изучение новых производных нитрозомочевины аранозы и нитруллина: автореф. дис. канд. мед. наук / И.Н. Петухова. - М., -1990.

76. Побрежайте Л.М. Действие алкилирующего агента МД-2 на митотическую активность и морфологию клеток культуры HEP 2 / Л.М. Побрежайте // Материалы Первой Всесоюзной конференции по химиотерапии злокачественных опухолей. Рига. - 1963. - С. 321322.

77. Прозоровский В.Б. Использование метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности / В.Б. Прозоровский // Фармакология и токсикология. 1962. - №1.- С. 115-120.

78. Противоопухолевая химиотерапия. Справочник / под ред. Н.И. Переводчиковой. -М.: Медицина, 1993. 13-14 с.

79. Перетолчина Н.М. Противоопухолевая активность нового препарата нитруллина (Сравнение с другими нитрозоалкилмочевинами) / Н.М. Перетолчина // Химиотерапия опухолей в СССР. 1982. - Вып. 36. - С. 228-231.

80. Пудов В.И. Макроэргические фосфаты крови в процессе канцерогенеза индуцированного нитрозометилмочевиной / В.И. Пудов // Канцерогенные N-нитрозосоединения действие, синтез, определение. Таллинн. - 1973. - С. 62-64.

81. Първанова Л.Г. Аддитивный канцерогенный эффект нитрозоэтилмочевины (НЭМ) у крыс при её воздействии в пре- и постнатальном периодах / Л.Г. Първанова // Канцерогенные N-нитрозосоединения действие, синтез, определение. Таллинн. -1978. - С. 86-88.

82. Радина Л.Б. Новый путь синтеза противоопухолевого препарата «нитруллин» / Л.Б. Радина, В.Ф. Гопко, А.И. Тарасов и др. // Химиотерапия опухолей в СССР. 1982. - Вып. 36. - С. 224-227.

83. Радина Л.Б. Способ получения смеси изомеров 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитруллина и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрорзо-Ь-гомоцитруллина / Л.Б. Радина, A.A. Беляев, В.П. Краснов // Приоритет 1989// Пат. РФ 1744946Получено 26.05.1998. Бюл. № 31, 1998.

84. Рандалу К.Х. Реакция Ы-нитрозо-Ы-метилмочевины (НММ) с гомополинуклеотидами и нуклеиновыми кислотами / К.Х. Рандалу, Тутлита В.С // Канцерогенные N — нитрозосоединения. Действие, образование, определение. Таллин. 1978. - С. 165-168.

85. Рапопорт И.А. Особенности и механизм действия супермутагенов / И.А. Рапопорт // Супермутагены М. : Наука, 1966. - 33-41 с.

86. Регистр Лекарственных Средств России® Ломустин (Lomustine):инструкция, применение и формула, 2010. URL: http://www.rlsnet.ru/mnnindexid533.htm.

87. Резцова В.В. Влияние производных нитрозомочевины на биосинтез НАД у мышей с асцитной карциномой эрлиха / В.В. Резцова, В.А. Филов, С.А. Коньков // Химиотерапия опухолей. -1992. Вып. 58,59. - С. 157-165.

88. Рожнов Г.И. Особенности гигиенического нормирования лекарственных веществ / Г.И. Рожнов // Тезисы доклада международного симпозиума «Проблемы токсикологии и прикладной токсикологии» Москва-Пермь 1991 год. Л., 1991. - С. 34-35.

89. Рыбальченко В.К. Структура и функции мембран / В.К. Рыбальченко, Коганов М.М. К. : Выща школа, 1988. - 239-242 с.

90. Рябов С.И. Основы физиологии и патологии эритропоэза / С.И. Рябов. JI. : Медицина, - 1971. - 255 с.

91. Саноцкий И.В. Пути разработки ускоренных методов установления предельно допустимых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны / И.В. Саноцкий // Гигиена труда и проф. заболевания. 1969. - № 7. - С. 4-7.

92. Саноцкий И.В. Критерии вредности в гигиене и токсикологии при оценке опасности химических соединений / И.В. Саноцкий, И.П. Уланова М. : Медицина, 1975. - 3-133 с.

93. Семенчук Д.Д. Определение АТФ-аз в эритроцитарных мембранах человека / Д.Д. Семенчук, JI.A. Шкимерская, О.В. Юренко // Врачебное дело. 1981. - № 6. - С. 89-91.

94. Серебряный A.M. Химические основы биологической активности нитрозоалкилмочевин / A.M. Серебряный // Канцерогенные N-нитрозосоединения действие, образование, определение. Таллинн. - 1978.-С. 107-109.

95. Сидорин Г.И. К вопросу о биохимической адаптации при экстремальном и хроническом действии промышленных ядов / Г.И. Сидорин // Современные проблемы профилактической токсикологии. Московский НИИ гигиены им Ф.Ф. Эрисмана. М., 1991.-С. 4-25.

96. Сидорин Г.И. Критерии выявления ранних признаков интоксикации при гигиеническом регламентировании / Г.И. Сидорин, А.Д. Фролова, Л.В. Луковникова // Методические рекомендации СПб., 1996. - 40с.

97. Сидорин Г.И. Адаптация как основа защиты организма от вредного действия химических веществ / Г.И. Сидорин, JI.B. Луковникова, А.Д. Фролова // Российский химический журнал. -2004. Вып. 2. - С. 44-50.

98. Сидоров К.К. К вопросу об унификации исследований по оценке кумулятивного действия промышленных химических соединений / К.К. Сидоров //Токсикология новых промышленных химических веществ: сб. научн. тр. М.: Медицина, 1968. - Вып. 10. - С. 9-16.

99. Скрябина C.B. Изучение стабильности нитруллина /C.B. Скрябина, В.Ф. Гопко, Л.Б. Радина // Химиотерапия опухолей в СССР. 1982. - Вып. 36. - С. 232-235.

100. Сметанин Э.Е. Трансплацентарное канцерогенное действие нитрозосоединений, изученное в опытах in vitro и in vivo / Э.Е. Сметанин // Канцерогенные N нитрозосоединения. Действие, образование, определение. Таллин. - 1978. - С. 77-80.

101. Софьина З.П. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / З.П. Софьина, А.Б. Сыркина, А. Голдина, А. Кляйна. М. : Медицина, 1980. - 54-65 с.

102. Тиунов Л.А. Роль глутатиона в процессах детоксикации / Л.А. Тиунов, В.А. Иванова // Вестник Академии медицинских наук. -1988.-№ 1.-С. 62-69.

103. Тиунов Л.А. Основные механизмы метаболизма ксенобиотиков в организме человека и животных / Л.А. Тиунов // Итоги науки и техники. Токсикология. М, 1981. - Т. 12. - С. 5-64.

104. Тиунов JI.А. Механизмы естественной детоксикации и антиоксидантной защиты / Л.А. Тиунов // Вестник РАМН. 1995. -N3. - С. 9-13.

105. Турусов B.C. Канцерогенные вещества. Справочник / B.C. Турусов. -М. : Медицина, 1987. 34-38 с.

106. Тютюнник Н.Ф. Частота опухолей у крыс, подвергшихся воздействию НЭМ в прогенезе / Н.Ф. Тютюнник // Канцерогенные N-нитрозосоединения действие, образование, определение. Таллин. - 1978.-С. 88-90.

107. Франкфурт О. С. Клеточные механизмы химиотерапии опухолей / О. С. Франкфурт. М. : Медицина, 1976. - 218-250 с.

108. Фомина М.М. Цитогенетическая характеристика противоопухолевого действия нового производного нитрозомочевины / М.М. Фомина, Л.А. Островская // Химиотерапия опухолей в СССР. 1982. - Вып. 37. - 168-172 с.

109. Чекман И.С., Цитохром Р-450: воздействие лекарств и ядов / Чекман И.С., Гриневич А.И. // Фармакология и токсикология. -1984.-Т. 47, №1.-С. 119-123.

110. Чернов В.А. Методы экспериментальной химиотерапии / В.А. Чернов. М. : Медицина, 1971. - 357 с.

111. Черняк Ю.И. Влияние стойких органических загрязнителей на биотрансформацию ксенобиотиков / Ю.И. Черняк, Д.А. Гроссман, С.И. Колесников. Новосибирск : Наука, 2007. - 12-30 с.

112. Широков Т.Г. Исследования действия некоторых противоопухолевых препаратов на опухолевые клетки / Т.Г. Широков, П.Ф. Ларионов, С.Г. Коми // Цитология. 1967. - Т.9, №4. - С. 433-436.

113. Шулепова Т.С. О механизмах транспорта нитруллина в опухолевые клетки / Т.С. Шулепова, А.К. Белоусова // Химиотерапия опухолей в СССР. 1989.- Вып. 54. - С. 141-145.

114. Эммануэль Н.М. Нитрозоалкилмочевины новый класс противоопухолевых препаратов / Н.М. Эммануэль Д.Б.Корман, Л.А. Островская - М.: Наука, 1978. - 48-89 с.

115. Adams D.J. Alter et mouse bone marrow Gluthatione and Gluthationetransferase, levels and response to cytotoxic / D J. Adams et all // Cancer research. 1985. - Vol. 45. - P. 1669-1673.

116. Anderson T. Streptozotocin diabetes: further studies on the mechanism of depression of nicotinamide / T. Anderson M.G. MeMenamin. P.S. Schein // Cancer Res. 1975. - № 35. - P. 761.

117. BockK.W. The role of conjugation reactions in detoxication / K.W. Bock, W. Lilienblum, G. Fischer, G. Schirmer, B.S. Bock-Henning // Arch Toxicol. 1987. - Vol. 60, № (1-3). - P. 22-9.

118. Broder L.E. Streptozotocin NSC-85998, l-(2-Chloroethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosourea CCNU / L.E. Broder, S.K. Carter // Clinical Brochure. Bethesda. Md., NCI. 1971. - P. 3-35.

119. Broder L.E. Pancreatic islet cell carcinoma. II. Results of therapy with streptozotocin in 52 patients / L.E. Broder, S.K. Carter // Ann Intern Med. 1973.-Vol. 79, № l.-P. 108-118.

120. Comis R.L. MeCCNU / R.L. Comis, L.E. Broder, S.K. Carter // Clinical Brochure. Bethesda. Md., NCI. 1972. - P. 14-34.

121. Carter S.K. Streptozotocin and metastatic insulinoma / S.K. Carter, L. Broder, M. Friedman // Ann. Intern. Med. 197. - Vol. 74, № 3. - P. 445-446.

122. Daskal Y. Comparative ultrastructural studies of nucleoli of tumor cells treated with adriamycin and the newer antharacyclines, carminomycin and marcellomycin / Y. Daskal, C. Woodard, S.T. Crooke // Cancer Research. 1978. - Vol. 38, № 2. - P. 467-473.

123. Durant J.R. Pulmonary toxicity associated with bischloromethyl nitrosourea (BCNU) / J.R. Durant, M.J. Norgard, T.M. Murad // Ann. Intern. Med. 1979. - № 90. - P. 191-194.

124. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups / G.L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. 1959. - Vol.82, N.l. - P. 70-77.

125. Gralla. E.J. Toxicology studies in mice, beagle dogs and rhesus monkeys given chlorozotocin (NSC 178, 248) / E.J. Gralla, R.W. Fleischman, Y.K. Luthra // Toxicology. 1979. - Vol. 12, N1. - P. 31-40.

126. Harmon W.C. Multiple Intensity Rainfall Simulator For Erosion Research on Row Sideslopes / W.C. Harmon, L.D. Meyer // Transactions of Asae. 1979. - № 22. - P. 100-103.

127. Henry M.C. Hepatotoxicity of l-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-l-nitrosourea. (CCNU) in dogs: the use of serial percutaneous liver biopsies / M.C. Henry, R.D. Davis, P.S. Schein // Toxicol and Appl. Pharmacol. 1973. - Vol. 25, № 3. - P. 410-7.

128. Hiraky S. Carcinogenic effect on N,N'-dimethylnitrosourea on Syrian hamsters / S. Hiraky // Gann. 1971. - Vol. 62, № 4 - P. 321-323.

129. Holnzer J.H., Golob E. Changes of the DNA content in cells from cervical cancer under cytostatic and radiation therapy / J.H. Holnzer, E. Golob // Acta. Citol. 1968. - Vol. 12, № 6. - P.473-477.

130. IARC Monographs. Chemicals with Sufficient Evidence of carcinogenicity in experimental animals / IARC Monographs. 1978. -Vol. 17, №78.-P. 24-31.

131. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to humans / IARC Monographs. 1987. —Vol. 1, № 42. - P. 40-45.

132. Jasiewicz M.D. Potentiating of the destructive effect of heat (42) on synchronized cancer cells in culture by cell specific antiserum / M.D. Jasiewicz, J.A. Dickson // J.Therm. Biol. 1976 - Vol. 6, № 4. - P. 221225.

133. Johnston T.P. Synthesis and biologic evaluation of major metabolites of N-(2-chloroethyl)-N'-cyclohexyl-N-nitrosourea / T.P. Johnston, G.S.

134. McCaleb, J. A. Montgomery 11J Med Chem. 1975. - Vol. 18, № 6. -P. 634-7.

135. Kase K. Differential beat response of normal and transformed human cells in tissue cultures / K. Kase, G.M. Hahn // Nature. 1975. - Vol. 255. - P. 288-230.

136. Kensler C. J. Toxicology of anti-leukemic agents with special reference to phthalanilide derivatives / C. J. Kensler, P.E. Palm, H. M. Day // Cancer Res. 1965. - Vol. 25, № 9: 1622. - P. 37.

137. Kline I. Duration of drug levels in mice as indicated by residual antileukemic efficacy / I. Kline, M. Gang, D.D. Tyrer // Chemotherapy. 1968. - Vol. 13, № 1. - P. 28-41.

138. Kupfer D. Characteristics of Guinea Ping liver and Adrenal Monooxigenase Systems / D. Kupfer, S. Orrenius // Mol. Pharmacol. -1970. Vol. 6, № 3. - P. 221-230.

139. Leaver D.D. The induction of tumours in the rat by a single oral dose of N-nitrosomethylurea / D.D. Leaver, P.F. Swann , P.N. Magee //. Brit. Cancer. 1969. - Vol. 23, № 1. - p. 177-187.

140. Lehninger A.L. Principles of biochemistry / A.L. Lehninger. — Worth Publishers. Inc. 1982. - Vol. 2. - 956 p.

141. Lim R.K. A method for the evaluation of cumulation and tolerance by the determination of acute and subchronic median effective doses/ R.K.1.m, K.G. Glass, E.A. Soaje-Echague // Arch. Intern. Pharm. Thern. -1961.-Vol.130.-P. 336-352.

142. Matrsaura M., Cytological studies and the effects of the bleomycin on tissue culture of human cervical carcinoma / M. Matrsaura, E. Yto, R.tVi

143. Kudo // In. 6 .Intern. Congress Cytol. Tokyo, Intern. Acad. Cytol. and Jap. Soc. Clin. Cytol. 1977. - P. 144.

144. Mitchel E.P., Shein Ph.S. Contribution of nitrosoureas to cancer treatment / E.P. Mitchel, Ph.S. Shein // Cancer treat. Rep. 1976. - Vol. 70-P. 31-41.

145. Montgomery J.A. Decomposition ofN-(2-chloroethyl)-N-nitrosoureas in aqueous media / J.A. Montgomery, R. James , McCaleb G.S. // J. Med. Chem. 1975. - Vol. 8, № 6. - P.568-71.

146. Mulder G. Detoxikation or toxification. Modification of the toxicity of foreign compounds by conjugation in the liver / G. Mulder // Trends Biol. Sci. 1979. - Vol. 4, № 4. - P. 86-90.

147. Nagel G. A. Systemic chemotherapy of early breast cancer (author's transl) / G. A. Nagel // Radiol Clin (Basel). 1975. - Vol. 44, №4. - P. 341-9.

148. Neil G.L. Effectiveness of antitumor agents administeredsubcutaneously to L1210 leukemic mice in silicone rubber devices /

149. G.L. Neil, L.G. Scheidt, S.L. Kunetzet // Chemotherapy. 1973. - Vol. 18, № 1. - P. 27-40.

150. Nichols W.C. Nephrotoxicity of methyl CCNU / W.C. Nichols, Moertel C.G. // N Engl J Med 301(21) 1979. - P. 1189.

151. Oliverio V.T. Toxicology and pharmacology of the nitrosoureas / V.T. Oliverio // Cancer Chemother Rep 3. 1973. - Vol. 4, № 3. - P. 13-20.

152. Paulson G. D. Xenobiotic Metabolism: In Vitro Methods / G. D. Paulson, S. Frear // American Chemical Society. ACS symposium. -1979. Series 97. - P. 5-19.

153. Rakieten N. Renal tumorigenic action of streptozotocin (NSC-85998) in rats / N. Rakieten, B.S. Gordon, D.A. Cooney // Cancer Chemoth Rep. 1968. - Vol. 52, № 5. - P. 563-567.

154. Rakieten N. Pancreatic islet cell tumors produced by the combined action of streptozotocin and nicotinamide / N. Rakieten, Gordon B.S.,

155. A. Beaty// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1971. - Vol. 137, № 1. - P. 280283.

156. Reich E. Adriamycin correlation of structure and function of its complexes with purines and DNA / E. Reich // Science. 1964. - Vol. 143, №3607. - P. 684-689.

157. Reed D.J. Cellular defense mechanisms / D.J. Reed // Anders MW, ed. Bioactivation of foreign compounds. Orlando, FL: Academic Press.1985.-P. 71-108.

158. Remmer H. The induction of the enzymic "detoxication" system in liver cells / H. Remmer // Rev. Can. Biol. - 1972. - Vol. 31, №3. - P. 193-221.

159. Sava G. Antitumor effects of GANU and other nitrosourea derivatives against transplantable leukemias and solid tumors in mice / G. Sava, T. Giraldi // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 2004. -Vol. 10, №.3.- P. - 167-169.

160. Sava G. Effects of antimetastatic, antiinvasive and cytotoxic agents on the growth and spread of transplantable leukemias in mice / G.Sava, T. Giraldi, L. Perissin, S. Zorzet // Clinical and Experimental Metastasis. 2004. - Vol. 5, № l. - p. 27-34.

161. Schaeppi U. CCNU (NSC-79037): preclinical toxicologic evaluation of a single intravenous infusion in dogs and monkeys / U. Schaeppi, R.W. Fleischman, R.S. Phelan, M.F. Ethier, Y.K. Luthra // Cancer Chemotherapy Repts. 3 1974. - Vol. 5, № 1. P. 53-64.

162. Schaeppi U. Phenester (NSC-116 785): Convulsant effects in the dog of an alkylating agent with antitumor activity / U. Schaeppi, G. R. Thompson, R. W. Fleischman, S. Stadnicki // Toxicology and Applied Pharmacology. 1971. - Vol. 18, № 4 - P 841-850.

163. Sies H. Cellular redox changes and response to drugs and toxic agents / H. Sies, R. Brigelius, H. Wefers // Fundam Appl Toxicol. 1983. -Vol. 3, № 4. - P. 200-8.

164. Shabel F.M. Appraisal 5-Fluorouracil and BCN / F.M. Shabel, S.K. Carter // Chemotherapy Conf. Chemotherapy Solid Tumors (Ed.) Bethesda. Md., NCI. - 1970. - № 16. - P. 159.

165. Shabel F.M. Nitrosourea: a review of experimental antitumor activity / F.M. Shabel // Cancer Treatment Reports. 1976. - № 60. - P. 665-698.

166. Shein P.S. Clinical antitumor activity and toxicity of streptozotocin (NSC-85998) / Shein PS et al // Cancer. 1974. - № 34. - P. 993.

167. Shein P.S. Pharmacology of chlorozotocin (Nsc-178248), a new nitrosourea antitumor agent / P.S. Shein, L. Panasci, P.V. Wooley // Cancer Treatment Repts. 1976. - Vol. 60, № 6 :801. - P. 5.

168. Swann P.F. The rate of breakdown of methyl methanesulphonate, dimethyl sulphate and N-methyl-N-nitrosourea in the rat / P.F. Swann // Biochem J. 1968. - Vol. 110, № 1. - P. 49-52.

169. Sweet D.V. Registry of Toxic Effects of chemical substances / D.V. Sweet. Washington, 1988. - 5147 p.

170. Wang R.W, A temperature-sensitive hamster mutant with altered morphology / R.W. Wang, W.P. Sheridan // Experimental Cell Research. 1978. - Vol. 84, №1/2 - P. 357-362.

171. Wood W.B. Biochemistry: A Problems Approach / W.B. Wood, J.H. Wilson, R.M. Benbow, L.E. Hood // Second edition. Benjamin, Inc. / Cummings Publishing Co. California. 1981. - P. 151-172.

172. Vesell E.S. On the significance of host factors that affect drug disposition / E.S. Vesell // Clin. Pharmacol. Ther. 1982. - Vol. 31.-P.l-7.206 А. Электронный -ресурс:

173. Уральское отделение Российской академии наук. Препарат лизомустин. 2004. URL: http://www.uran.ru/exhibitions/ste/lt.htm .